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PT2169066E - Ácido nucleico promotor derivado de bactérias do género corynebacterium, cassete de expressão compreendendo o promotor e vector compreendendo a cassete, célula hospedeira compreendendo o vector e método de expressão de um gene utilizando a célula - Google Patents

Ácido nucleico promotor derivado de bactérias do género corynebacterium, cassete de expressão compreendendo o promotor e vector compreendendo a cassete, célula hospedeira compreendendo o vector e método de expressão de um gene utilizando a célula Download PDF

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PT2169066E
PT2169066E PT91668335T PT09166833T PT2169066E PT 2169066 E PT2169066 E PT 2169066E PT 91668335 T PT91668335 T PT 91668335T PT 09166833 T PT09166833 T PT 09166833T PT 2169066 E PT2169066 E PT 2169066E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
promoter
vector
gene
host cell
present
Prior art date
Application number
PT91668335T
Other languages
English (en)
Inventor
Young-Hoon Park
Hyun-Soo Kim
Hye-Jin Choi
Jin-Ho Lee
Soo-Youn Hwang
Jae-Ick Sim
Won-Sik Lee
Tae-Sun Kang
Original Assignee
Cj Cheiljedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Cj Cheiljedang Corp filed Critical Cj Cheiljedang Corp
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Description

DESCRIÇÃO
ÁCIDO NUCLEICO PROMOTOR DERIVADO DE BACTÉRIAS DO GÉNERO CORYNEBACTERIUM, CASSETE DE EXPRESSÃO COMPREENDENDO O PROMOTOR E VECTOR COMPREENDENDO A CASSETE, CÉLULA HOSPEDEIRA COMPREENDENDO O VECTOR E MÉTODO DE EXPRESSÃO DE UM GENE UTILIZANDO A CÉLULA
ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um novo ácido nucleico promotor derivado de bactérias do género Corynebacterium, uma cassete de expressão que inclui o mesmo, um vector que inclui a cassete de expressão, uma célula hospedeira que inclui o vector, e um método de expressão de um gene que utiliza a célula hospedeira.
TÉCNICA ANTERIOR
As bactérias corineformes são microrganismos usados para produzir diversos materiais químicos utilizados em muitas aplicações, designadamente rações animais, medicamentos e alimentos que contêm L-lisina, L-treonina e diversos ácidos nucleicos. Através da engenharia genética e da engenharia metabólica é possível desenvolver uma estirpe de bactérias corineformes apresentando uma alta produtividade. Para obter uma estirpe deste tipo de bactérias corineformes que apresentam alta produtividade, é necessário expressar nas bactérias corineformes um gene relacionado com diversas vias metabólicas. Para este fim, é preciso desenvolver um promotor adequado.
Geralmente, nas bactérias corineformes, expressa-se um gene sob um promotor incluído inerentemente nelas (ver, por 1 exemplo, Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999). Entretanto, desconhece-se a estrutura de uma sequência promotora para a expressão de um gene de bactérias corineformes, enquanto as estruturas de outros microrganismos industriais, tais como E. coli e Bacillus subtilis, são conhecidas. Por este motivo, sugeriu-se o método seguinte para produzir promotores que permitam a expressão de um gene nas bactérias corineformes. Em primeiro lugar, elimina-se uma região promotora de um gene que é resistente a um antibiótico, tal como o cloranfenicol. Separadamente cliva-se um ADN cromossómico separado de bactérias corineformes utilizando una enzima de restrição adequada, e introduz-se o fragmento resultante no gene do qual se eliminou a região promotora. Depois, utiliza-se o gene obtido para transformar bactérias corineformes a fim de produzir uma estirpe transformada e mede-se a resistência aos antibióticos da estirpe transformada: (ver Gene 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996.) Em particular, desenvolveu-se um número muito pequeno de promotores utilizados no Corynebacterium ammoniagenes, um microrganismo produtor de ácido nucleico conhecido. Por exemplo, utiliza-se no E. coli um promotor que possui aproximadamente uma actividade 10% mais elevada do que um promotor tac (ver Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003.) No entanto, quando se utiliza o mesmo numa expressão mássica de genes, um promotor deste tipo manifesta uma baixa eficiência. A Patente U.S. 5.593.781 descreve um ADN promotor que se separa de uma estirpe de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) e apresenta maior actividade do que um promotor tac. Contudo, um ADN promotor deste tipo que é separado de um género de Brevibacterium pode não ser operativo noutras bactérias. Por conseguinte, é necessário desenvolver uma sequência promotora 2 que se derive da Corynebacterium ammoniagenes disponível no mercado e tenha actividade elevada noutras bactérias.
De acordo com o que foi dito, os autores da presente invenção procuraram uma sequência promotora forte na Corynebacterium ammoniagenes e verificaram que um promotor de acordo com a presente invenção pode expressar genes com actividade elevada em Corynebacterium ammoniagenes.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 mostra os resultados de um ensaio de electroforese bidimensional de uma amostra extraída de uma bactéria Corynebacterium ammoniagenes, em que os resultados do ensaio foram corados com prata e revelados para identificação; FIG. 2 ilustra um método de produção de um vector de detecção de pll7-gfp de acordo com uma forma de realização da presente invenção; e FIG. 3 ilustra um método de produção de um vector recombinante que inclui a sequência promotora pcjl a pcj7 derivada de um vector de detecção pll7-gfp de acordo com uma forma de realização da presente invenção.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
PROBLEMA TÉCNICO A presente invenção proporciona um promotor de elevada actividade em Corynebacterium. 3 A presente invenção proporciona também uma cassete de expressão que inclui o promotor e um vector que inclui a cassete de expressão. A presente invenção proporciona também uma célula hospedeira que inclui o vector. A presente invenção proporciona também um método de expressão de um gene que utiliza a célula hospedeira.
SOLUÇÃO TÉCNICA A presente invenção proporciona um promotor que compreende um polinucleótido de SEQ ID n.°: 7. 0 promotor de acordo com a presente invenção é um ácido nucleico isolado e tem actividade promotora. Nesta descrição, e termo «promotor» refere-se a uma região de ADN à qual se liga uma RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene. 0 termo «promotor tac» refere-se a um promotor obtido por fusão de uma sequência obtida a partir da região-35 de um promotor do operão triptofano de E. coli e uma sequência obtida a partir da região-10 de um promotor do operão lactose de E. coli. É sabido que o promotor tac tem uma elevada actividade promotora. Um promotor que tem pelo menos um ácido nucleico seleccionado de SEQ ID n.os: 1, 4, 5, 6 e 7 tem maior actividade em bactérias do género Corynebacterium do que o promotor tac. Em particular, um promotor que tem pelo menos um ácido nucleico seleccionado de SEQ ID n.os: 1 e 4 tem uma actividade 10 vezes maior do que o promotor tac em bactérias do género Corynebacterium. O promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção tem actividade promotora em bactérias do género 4
Escherichia, adicionalmente a bactérias do género Corynebacterium. A célula na qual pode funcionar o promotor da presente invenção pode ser qualquer bactéria do género Corynebacterium. Exemplos de bactérias do género Corynebacterium incluem as Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e ATCC 6871, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e ATCC 13060, e semelhantes. Contudo, as bactérias do género Corynebacterium não se limitam às anteriores. Exemplos de bactérias do género Escherichia nas quais pode funcionar um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção incluem E. coli. A sequência do promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção pode ser modificada facilmente por um perito da técnica mediante um processo de mutagénese conhecido, designadamente evolução dirigida e mutagénese dirigida. Assim, um ácido nucleico que tenha, por exemplo, 70% ou mais de homologia, de preferência 80% ou mais de homologia, e mais preferencialmente 90% ou mais de homologia, com a sequência isolada do promotor incluindo ao menos um ácido nucleico seleccionado de SEQ ID n.°: 7, e possa actuar como um promotor em bactérias do género Corynebacterium está incluído no âmbito da presente invenção. A presente invenção proporciona também uma cassete de expressão que inclui o promotor que está ligado operativamente a una sequência codificadora. A sequência codificadora pode ser, por exemplo, o gene inteiro ou uma sequência codificadora que codifica una região predeterminada do gene. Nesta descrição, o termo «ligado operativamente» indica que a sequência codificadora está conectada funcionalmente ao promotor de tal modo que a sequência 5 promotora pode iniciar ou mediar a transcrição da sequência codificadora. A cassete de acordo com uma realização da presente invenção pode incluir adicionalmente sequências de controlo 5' e 3' ligadas operativamente à sequência promotora. A sequência codificadora pode ser um gene associado a um produto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina e L-treonina. A presente invenção proporciona também um vector que inclui a cassete de expressão de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Neste caso, o vector não está limitado, e pode ser qualquer vector conhecido na técnica. Exemplos do vector de acordo com formas de realização da presente invenção incluem um vector pCR2.1-ΊΌΡ0 (produzido por Invitrogen Inc., EUA) e pECCG117 (KFCC-10673). No entanto, o vector não se limita a estes. Como exemplos do vector que inclui a cassete de expressão de acordo com uma forma de realização da presente invenção referem-se o pll7-cjl-gfp, pll7-cj2-gfp, pl17-cj3-gfp, pll7-cj4-gfp, pl17-cj5-gfp, pll7-cj6-gfp e pll7-cj7-gfp. A presente invenção proporciona também uma célula hospedeira que inclui o vector de acordo com uma realização da presente invenção. A célula hospedeira pode ser uma bactéria do género Corynebacterium ou uma bactéria do género Escherichia, mas não se limita a estas. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) ou E. coli. A presente invenção proporciona também um método de expressão de um gene exógeno por cultura da célula hospedeira. A cultura da célula hospedeira efectua-se em um de vários meios de cultura conhecidos e em várias condições de cultura conhecidas de acordo com a célula hospedeira seleccionada. 6
EFEITOS VANTAJOSOS
Um gene que está ligado operativamente a um promotor de acordo com a presente invenção expressa-se eficientemente em E. coli e Corynebacterium ammoniagenes. 0 promotor é adequado para desenvolver uma estirpe utilizando bactérias do género Corynebacterium.
Uma cassete de expressão que inclua o promotor de acordo com a presente invenção e um vector que inclua a cassete de expressão de acordo com a presente invenção são adequados para expressar eficientemente um gene exógeno em E. coli e
Corynebacterium ammoniagenes.
Uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode expressar eficientemente um gene exógeno.
Utilizando um método de expressão de um gene de acordo com a presente invenção pode expressar-se eficientemente um gene exógeno.
MODO ÓPTIMO A presente invenção será descrita com mais pormenor fazendo referência aos exemplos que se seguem. Estes exemplos têm meros propósitos ilustrativos, não devendo ser considerados como limitantes do âmbito da presente invenção.
Exemplos
Prepararam-se extractos bacterianos de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) em diversas etapas de cultura. Efectuou-se uma electroforese bidimensional sobre os extractos bacterianos a fim de encontrar neles proteínas sobre-expressadas, as quais foram depois clivadas para 7 analisar aas sequências peptídicas. Utilizaram-se as sequências peptídicas obtidas para identificar genes das proteínas sobre-expressados. A seguir, isolaram-se as regiões promotoras e produziram-se vectores utilizando aas regiões promotoras. Depois, mediram-se as actividades do promotor em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e E. coli.
Exemplo 1: Cultura de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e selecção da proteína de sobre-expressão de acordo com as etapas de cultura (1) Cultura de Bactérias
Efectuou-se a cultura de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) num meio contendo açúcar não refinado de melaço (mistura que contém 50% de glucose e 50% de frutose) . Nesse momento, mediu-se a concentração de células. Colheram-se amostras da estirpe cultivada de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) numa fase estacionária precoce e em fases estacionárias. Centrifugaram-se as amostras e eliminou-se a solução superior resultante. Efectuou-se, num tampão de desintegração, a lise do sedimento de células obtido para produzir aproximadamente 100 ym de um extracto bacteriano. (2) Ensaio de Electroforese Bidimensional
Diluiu-se o extracto bacteriano obtido da Secção (D utilizando- se ureia 6M, tioureia 2M, 4% CHAPS e 0, 4% DTT para obter uma mistura com um volume total de 350 μΐ.
Seguidamente, adicionou-se ao anterior 7 μΐ de um tampão IPG e 3 μΐ de azul de bromofenol (BPB) a 1%. A solução resultante foi carregada numa bandeja de reidratação utilizando uma tira seca de gradiente de pH immobiline. Cobriu-se a amostra contida na bandeja de reidratação com 2 ml de um líquido de 8 cobertura para prevenir a vaporização da amostra e a cristalização da ureia, e a seguir reidratou-se à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. 0 gel em tira reidratado foi sujeito a focagem isoeléctrica a 20°C a 0-100 V durante 1 hora, a 300 V durante 1 hora, a 600 V durante 1 hora e a 8000 V durante um tempo predeterminado, que se ajustou para realizar a focagem a 43-97 kVhr (pH 4-7: 43,4 kVhr, pH 4,5-5,5, pH 5,5-6,7: 97 kVhr) utilizando um dispositivo de focagem isoeléctrica (Multiphor II: produzido por Amersham Bioscience, EUA).
Quando se completou a focagem isoeléctrica, os géis em tira respectivos foram equilibrados numa solução de pH 8,8 contendo 20 mM Tris-HCl, 6 M ureia, 2% SDS, 20% glicerol, 2,5% acrilamida e 5 mM TBP durante 15 minutos. As tiras equilibradas respectivas foram carregadas num gel bidimensional (gradiente de concentração 9-16%) e depois seladas com uma solução de SDS contendo 0,5% de agarose tendo um ponto de ebulição baixo e 0,001% de BPB. A electroforese realizou-se a 100 V durante aproximadamente 19 horas.
Uma vez completada a electroforese, imobilizou-se o gel numa solução de metanol a 45% e solução de ácido acético a 5%. O ácido acético foi lavado durante 1 hora com água destilada. Sensibilizou-se o gel com 0,02% de tiossulfato de sódio durante 2 minutos e lavou-se com água destilada. A seguir, fez-se reagir o gel com nitrato de prata a 0,1% durante 20 minutos e lavou-se com água destilada. Revelou-se o produto da reacção com uma solução contendo 2% (p/v) de carbonato de sódio e 0,04% (v/v) de formaldeido. Quando apareceu uma mancha que tinha a concentração desejada, parou-se a reacção utilizando ácido acético a 1%. Lavou-se o gel com água destilada e guardou-se numa bolsa de plástico estanque a 4°C. 9
Quando se utilizou coloração com Coomassie, depois de se ter completado aa electroforese, o gel foi fixado utilizando uma solução de metanol a 30% e uma solução de ácido acético a 10% durante 1 hora, lavou-se com água destilada, corou-se com Coomassie coloidal brilhante G-250 durante 24 horas e depois descorou-se com uma solução de metanol a 10% e uma solução de ácido acético a 7% durante 4 horas. (3) Preparação da amostra peptidica utilizada para espectrometria de massa baseada em manchas
Separou-se o péptido das manchas utilizando una versão modificada de um método conhecido (Shevchenko et al., Anal. Chem., 68 (5), 850-8, 1996.)
Em primeiro lugar, clivou-se uma mancha de proteína do gel preparado na Secção (2), descorou-se em 120 μΐ de uma solução mista de ferricianeto de potássio 30mM e 100 mM de tiossulfato de sódio, numa relação de 1:1, e lavou-se com água destilada e depois com 120 μΐ de acetonitrilo a 50%/ bicarbonato de amónio 25 mM (pH 7, 8) durante 10 minutos. Fez-se reagir o produto resultante com 50 μΐ de acetonitrilo a 100% até aparecer uma cor branca durante aproximadamente 5 minutos, depois do que se secou sob vácuo.
Adicionou-se 10 μΐ de tripsina de grau de electroforese bidimensional (0,02 pg/μΐ) às manchas secas e deixou-se reagir em gelo durante 45 minutos. A seguir, adicionou-se ao produto da reacção 50 mM de um tampão de bicarbonato de amónio (pH 7,8) e deixou-se reagir a 37°C durante 12-14 horas. O produto resultante foi tratado três vezes com ultrasons durante 10 minutos em 10 μΐ de TFA a 0,5% e acetonitrilo a 50% para extrair um péptido. 10 (4) Espectrometria de Massa] 0 péptido extraído como se descreveu acima foi analisado por HPLC-MS/MS. A HPLC-MS/MS foi realizada com um sistema HPLC série 1100 (produzido por Agilient Inc., EUA) e um dispositivo de espectrometria de massa com armadilha de iões Finnigan LCQ DECA (produzido por ThermoQuest, EUA) no qual se instalou uma fonte ionizada nanospray. A HPLC foi efectuada com uma coluna de fase inversa C18 microssonda, ácido fórmico a 0,1% (solvente A) e solução (solvente B) de acetonitrilo a 90% (v/v) e ácido fórmico a 0,1% foi fornecido num gradiente linear (caudal=l μΐ/min) para isolar um péptido. A detecção do péptido efectuou-se três vezes utilizando ionização nanospray (NSI) (voltagem de pulverização: 1,8 kV; temperatura do capilar: 200°C; voltagem do capilar: 34 V; compensação da lente do tubo: 40 V; e multiplicador electrónico: -60 V) . As medidas foram obtidas num modo centróide. Depois de se ter obtido o varrimento MS completo de 400-2000 Da, ajustou-se um valor limiar a lxlO5 contagens e os iões mais fortes foram separados por meio de um varrimento de zoom de alta resolução. A seguir, realizou-se a dissociação induzida por colisões (CID) MS/MS. Identificou-se a sequência de um espectro CID que não estava codificado utilizando software TurboQuest (produzido por Thermo Finnigan Inc., EUA). Os resultados de uma busca SEQUEST foram identificados por correlação cruzada e ACn (correlação normalizada delta). A sequência de um aminoácido do péptido foi confirmada e identificada utilizando Q-star Pulsar LC MS/MS (produzido por Applied Biosystems Inc., EUA). 11
Como resultado, encontraram-se 50 proteínas, tendo-se seleccionado sete proteínas sobre-expressadas das 50 proteínas. A FIG. 1 mostra os resultados do ensaio de electroforese bidimensional de uma amostra extraída de uma estirpe de Corynebacterium ammoniagenes, em que os resultados do ensaio foram corados com prata e revelados para identificação. Na FIG. 1, identificaram-se sete manchas sobre-expressadas, designadas por CJ1 a CJ7. As funções destas sete proteínas sobre-expressadas estão indicadas no Quadro 1. As funções destas proteínas foram identificadas por comparação da sequência do péptido com uma sequência de aminoácidos contida na base de dados do banco de genes NCBI.
Quadro 1
Nome da Mancha Proteína Acesso ao banco de genes n. 0 Proteína de choque térmico hsp60 AE 008903.1 5-carboximetil-2-hidroximuconato semialdeído desidrogenase NC-006461.1 Homoprotocateculato 2,3-dioxigenase NC-005835.1 Factor de extensão de tradução temporária EF-Tu YP-145957 Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase AAA6 9094 Cisteína sintase AAV89445 Manganês superóxido dismutase NP-940564
Assumiu-se uma sequência génica a partir das sete proteínas sobre-expressadas e analisou-se para seleccionar uma região promotora. Como resultado, assumiu-se que os oligonucleótidos de SEQ ID n.os: 1 a 7 separados da sequência génica correspondente às proteínas designadas por CJ1 a CJ7 possuem actividade promotora. 12
Exemplo 2: Fabrico do vector recombinante p!17-cjl~7-gfp que tem sequência promotora e confirmação da actividade promotora em Corynebacterium ammoniagenes (1) Amplificação da sequência promotora do genoma de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
Separaram-se 50 0 yg de ADN cromossómico de 25 ml de uma cultura de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 incubado durante 1 dia, utilizando um método sugerido por Eikmann et al. (Gene, 102, 93-98, 1991). O ADN cromossómico separado foi utilizado como modelo. Realizaram-se PCRs utilizando conjuntos de iniciadores (SEQ ID n.os: 10 e 11, 12 e 13, 14 e 15, 16 e 17, 18 e 19, 20 e 21, e 22 e 23) para amplificar os promotores de CJ1 a CJ7 durante 30 segundos a 94°C, a 55°C e a 72°C, repetidos 30 vezes, respectivamente. Como resultado, amplificaram-se as sequências promotoras respectivas pcjl a PC j 7. (2) Fabrico do vector de detecção
Em primeiro lugar, realizaram-se PCRs utilizando um vector pGFuv (produzido por Clontech Inc., EUA) como modelo e utilizando SEQ ID n.os: 8 e 9 como iniciador a 94°C durante 30 segundos, a 55°C durante 30 segundos, e a 12° C durante 1 minuto, respectivamente. A PCR realizou-se trinta vezes a cada temperatura. Como resultado, amplificou-se um gene de proteína verde fluorescente (GFP) que não incluía una região promotora. A seguir, o gene GFP obtido que não incluía uma região promotora foi clonado em vectores pCR2.1-TOPO (produzidos por Invitrogen, EUA), que foram depois clivados por PstI e EcoRI e introduzidos no sítio PstI e EcoRI de pECCGl17 (KFCC-10673/KFCC-10674) , que é um vector transportador e pode expressar-se em E. coli e bactérias 13 corineformes. Utilizou-se o resultado como vector de detecção (pll7-gfp) para separar o promotor. A FIG. 2 ilustra um método de produção do vector de detecção de pll7-gfp de acordo com uma forma de realização da presente invenção. (3) Introdução da sequência promotora no vector de detecção e identificação da actividade promotora em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100
Clivou-se o vector de detecção obtido na Secção (2) com uma enzima de restrição de Kpnl/EcoRV e a seguir ligou-se às sequências promotoras de pcjl a pcj7 que haviam sido clivadas pela mesma enzima de restrição a fim de produzir vectores recombinantes de pll7-cjl-7-gfp nos quais os oligonucleótidos de pcjl a pcj7, que se separaram de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 e possuíam actividade promotora assumida, se ligaram à GFP. A FIG. 3 ilustra um método de produção de um vector recombinante que inclui as SEQ ID n.os: pcjl a pcj7 a partir do vector de detecção pll7-gfp de acordo com uma forma de realização da presente invenção. 0 vector recombinante obtido foi introduzido em
Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) pronta para transformação por um método introduzido por van der Rest et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999). A estirpe transformada resultante foi semeada num meio CM (1% peptona, 1% caldo, 0,25% cloreto de sódio, 1% extracto de levedura, 100 mg/ml adenina, 100 mg/ml guanina, 2% agar (pH 7,2)) que continha 10 yg/ml de kanamicina e posta em cultura a 32°C durante 3 dias. Separou-se, por detecção, das colónias uma estirpe viável que exibia crescimento. A seguir, irradiou-se luz ultravioleta sobre a estirpe detectada e seleccionaram-se estirpes que apresentavam fluorescência. 14 A detecção das estirpes que apresentavam fluorescência indica que os promotores de pcjl a pcj7 exibem actividade promotora numa bactéria corineforme.
Entretanto, mediu-se quantitativamente a actividade promotora. 0 vector recombinante de pll7-cjl-7-gfp foi introduzido em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e cultivado do mesmo modo que se descreveu acima. A cultura foi centrifugada para obter um sedimento de bactérias. A seguir, suspendeu-se o sedimento bacteriano num tampão de extracto proteico (EDTA 1 mM de PBS, 3% glicerol, solução Triton-X-100 a 1%, pH-7,5) e fez-se a sua lise por tratamento com ultrasons. Centrifugou-se o lisado e separou-se a solução superior resultante que continha um extracto bacteriano. Mediu-se a quantidade da proteína contida no extracto bacteriano com um método de ensaio de Bradfrod. Subsequentemente irradiou-se luz de 488 nm sobre um extracto bacteriano igual em quantidade ao extracto bacteriano acima descrito utilizando um método introduzido por Laure Gor et al. (FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001) e mediu-se a luz emitida utilizando um espectrofotómetro LS-50B (Perkin-Elmer) para encontrar um grau de expressão do gene GFP, tendo-se verificado que tinha um comprimento de onda de 511 nm.
Os resultados estão apresentados no Quadro 2. Como mostra o Quadro 2, o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção dirige una expressão eficiente de um gene GFP. Mais particularmente, os promotores de pcjl e pcj4 exibiam a eficiência mais elevada em comparação com os outros promotores. 15 QUADRO 2
Promotor pcjl pcj2 pcj3 Pc j 4 pc j 5 pc j 6 PC j 7 12309 437 479 11790 1363 5651 2493
Exemplo 3: Comparação entre as actividades do promotor tac e do promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção na Corynebacterium ammoniagenes
Na presente experiência, compararam-se as actividades de um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção e um promotor tac que se utiliza convencionalmente na Corynebacterium ammoniagenes. (1) Fabrico do vector que contém a sequência do promotor tac e o gene GFP combinados
Em primeiro lugar, realizou-se uma PCR utilizando um vector pKK223-2 (produzido por Pharmacia Biotech, EUA) como modelo e utilizando a SEQ ID n.os: 24 e 25 como iniciador do mesmo modo que no Exemplo 1 para amplificar a sequência do promotor tac. Clonou-se o produto amplificado num vector pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, EUA) . A seguir, a sequência do promotor tac obtida foi clivada com as enzimas de restrição de Kpnl e McoRV e ligada ao pll7gfp que se havia clivado com as mesmas enzimas de restrição para obter um vector de expressão recombinante (pll7-tac-gfp.)
Utilizou-se o vector recombinante para transformar a Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 da mesma maneira que no Exemplo 1 e mediu-se a actividade de um gene GFP. Comparou-se a actividade do gene GFP devida ao promotor tac com a actividade do gene GFP devida ao promotor seleccionado de 16 acordo com o Exemplo 2. Os resultados estão apresentados no Quadro 3.
Quadro 3
Promotor pcjl pcj2 pc j3 pc j 4 pcj5 pc j6 Pc j 7 ptac 1140% 40% 44% 1092% 126% 523% 231% 100%
Como mostra o Quadro 3, verificou-se que um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção expressava eficientemente um gene GFP. Além disso, quando se compara a actividade dos promotores de acordo com uma forma de realização da presente invenção em Corynebacterium ammoniagenes com a actividade do promotor tac na Corynebacterium ammoniagenes, os promotores pcjl, pcj4, pcj5, pcj6 e pcj 7 apresentavam intensidades mais elevadas do que o promotor tac. Em particular, os promotores de pcjl e pcj4 exibiam 10 vezes a actividade do promotor tac.
Exemplo 4: Confirmação da actividade do promotor de acordo com a presente invenção em E. coli
Confirmou-se que o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção apresentava actividade em E. coli para além das bactérias corineformes. Transformou-se a E. coli com o vector de expressão recombinante utilizado nos Exemplos 1 e 2.
Determinou-se se o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção permite uma expressão eficiente do gene GFP em E. coli medindo a actividade do gene GFP do mesmo modo que no Exemplo 1. Um vector de referência era um vector recombinante contendo o promotor tac de pll7-tac-gfp. O Quadro 4 mostra a actividade promotora dos 17 promotores de acordo com formas de realização da presente invenção em E. coli.
Quadro 4
Promotor pcjl pcj2 pc j3 pc j 4 pc j5 pc j6 PC j 7 ptac 296% 15% 20% 17% 19% 24% 24% 100%
Como mostra o Quadro 4, verificou-se que o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção expressava eficientemente o gene GFP em E. coli. Mais particularmente, o promotor pcjl exibia actividade elevada tanto nas bactérias corineformes como em E. coli.
Exemplo 5: Efeitos de IPTG sobre a actividade do promotor de acordo com a presente invenção É sabido que um promotor tac é um promotor representativo pelo qual a expressão génica pode ser induzida por IPTG (isopropiltio-13-D-galactosido) em E. coli. Por outras palavras, em E. coli, a quantidade de um gene expressada pelo promotor tac varia de acordo com a presença ou ausência de IPTG.
Na presente experiência, mediram-se os efeitos de IPTG sobre a expressão de um gene GFP por um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Para este fim, um vector recombinante que continha o promotor pcjl que tem actividade mais elevada do que os outros promotores de pll7-cjl-gfp foi introduzido em E. coli e Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) da mesma maneira que nos Exemplos 1 e 2, e mediu-se a quantidade do gene GFP expressada de este modo. A referência era um vector recombinante contendo o promotor tac de pll7tac-gfp.
Os resultados estão apresentados no Quadro 5. 18
Quadro 5 Célula hospedeira Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 E. coli Indução Indução por IPTG Sem indução Indução por IPTG Sem indução Promotor ptac pcjl ptac pcjl ptac pcjl ptac Intensidade fluorescência 2089 5530 1959 5048 6480 7165 2314
Como mostra o Quadro 5, um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção expressava mais eficientemente um gene GFP em E. coli e Corynebacterium ammoniagenes do que um promotor tac, independentemente da presença de IPTG.
Os promotores de pCJl, pCJ2, pCJ3, pCJ4, pCJ5, pCJ6 e pCJ7 obtidos nos exemplos acima descritos foram inseridos em pECCG117. Utilizaram-se os vectores obtidos para transformar E. coli DH5. Depositaram-se os transformantes resultantes no Centro de Cultura de Microorganismos Coreano (KCCM), que é uma organização de depósito internacional de acordo com o tratado de Budapeste, em 11 de Junho de 2004 (números de depósito: KCCM-10611, KCCM-10612, KCCM-10613, KCCM-10614, KCCM-10615, KCCM-10616, y KCCM-10617). <110> CJ Corporation <120> Novo ácido nucleico promotor derivado de bactérias do género Corynebacterium, cassete de expressão que compreende o promotor e vector que compreende a cassete, célula hospedeira que compreende o vector e método para expressão de um gene utilizando a célula <130> PN05941 19 < 16Ο> 24 <17Ο> Kopatentln 1.71
<210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <40 0> 1 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg a ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 301 300 <210> 2
<211> 285 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 2 aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60 atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120 cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180 atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240 aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285
<210> 3 <211> 291 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 3 20 gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60 gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120 gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180 caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240 aactaattct ccctcatcca < cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291 <210> 4 <211> 312 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 4 actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60 ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120 cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180 gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240 caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300 ggaggacata ca 312 <210> 5 <211> 249 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 5 tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60 ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120 gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180 ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240 acaactacc 249
<210> 6 <211> 332 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 21 < 4 Ο Ο > 6 ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60 aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120 acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180 cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240 gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300 aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332 <210> 7 <211> 318 <212> DNA Λ 00 \—1 CM V Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 7 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318
<210> 8 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 8 acgcgatatc atgagtaaag gagaagatct t 31 <210> 9 22 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 9 aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t 31 <210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 10 cggggtacca ccgcgggctt attccattac at 32 <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 11 acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc 32 <210> 12 23 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 12 cggggtacca attccaccag acgttgttta gta 33 <210> 13 <211> 32 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 13 acgcgatatc tgtgcactcc ttgttcttcg tg 32 <210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 14 cggggtaccg ctgcctacat ctggacttct gac 33 <210> 15 <211> 31 24
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 15 acgcgatatc gatgactcct agtgaggtta a 31 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 16 cggggtacca ctgggagggt aggggtcac 29 <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 17 acgcgatatc tgtatgtcct cctggacttc 30
<210> 18 <211> 32 <212> ADN 25 <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 18 cggggtacct cggacatata cggatttacc tg 32 <210> 19 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 19 acgcgatatc gttgtctcct aaaaagttgg g 31 <210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 20 cggggtaccg gcttcatcgt cgtct 25
<210> 21 <211> 30 <212> ADN 26 <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador <400> 21 acgcgatatc atggcctcct cttaatagac 30 <210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 22 cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata 33 <210> 23 <211> 29 <212> ADN <213> <220> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 23 acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg 29 <210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial 27 <220> <223> iniciador <400> 24 cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg 29 25-03-2013 28

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Promotor que compreende um polinucleótido de SEQ ID n.°: 7.
  2. 2. Cassete de expressão, que compreende o promotor da reivindicação 1 e está operativamente ligada a una sequência codificadora.
  3. 3. Vector que compreende a cassete de expressão da reivindicação 2.
  4. 4. Célula hospedeira que compreende o vector da reivindicação 3.
  5. 5. Célula hospedeira da reivindicação 4, que é uma célula bacteriana pertencente a um género Corynebacterium ou a um género Escherichia.
  6. 6. Método de expressão de um gene exógeno que compreende a cultura da célula hospedeira da reivindicação 4 ou da reivindicação 5. 25-03-2013 1
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