[go: up one dir, main page]

KR102654301B1 - NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 - Google Patents

NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102654301B1
KR102654301B1 KR1020210081785A KR20210081785A KR102654301B1 KR 102654301 B1 KR102654301 B1 KR 102654301B1 KR 1020210081785 A KR1020210081785 A KR 1020210081785A KR 20210081785 A KR20210081785 A KR 20210081785A KR 102654301 B1 KR102654301 B1 KR 102654301B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ala
gly
val
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020210081785A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220170657A (ko
Inventor
정휘민
박혜민
심희진
이진남
Original Assignee
씨제이제일제당 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020210081785A priority Critical patent/KR102654301B1/ko
Application filed by 씨제이제일제당 주식회사 filed Critical 씨제이제일제당 주식회사
Priority to AU2022297143A priority patent/AU2022297143B2/en
Priority to CA3223970A priority patent/CA3223970A1/en
Priority to CN202280057073.7A priority patent/CN117897489A/zh
Priority to EP22828704.1A priority patent/EP4361276A4/en
Priority to BR112023027397A priority patent/BR112023027397A2/pt
Priority to US18/573,419 priority patent/US20240294955A1/en
Priority to PCT/KR2022/008745 priority patent/WO2022270857A1/ko
Priority to MX2024000244A priority patent/MX2024000244A/es
Priority to JP2023579425A priority patent/JP2024522877A/ja
Priority to TW111123466A priority patent/TWI843130B/zh
Priority to ARP220101649A priority patent/AR126213A1/es
Publication of KR20220170657A publication Critical patent/KR20220170657A/ko
Priority to ZA2024/00355A priority patent/ZA202400355B/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102654301B1 publication Critical patent/KR102654301B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99005—NADH dehydrogenase (quinone) (1.6.99.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03003—Phosphoserine phosphatase (3.1.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/05—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a quinone or similar compound as acceptor (1.6.5)
    • C12Y106/05009—NADH:ubiquinone reductase (non-electrogenic) (1.6.5.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01065—O-Phosphoserine sulfhydrylase (2.5.1.65)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법{NADH:quinone oxidoreductase expression-modulated recombinant microorganism and method for producing O-phosphoserine, cysteine and its derivatives using the same}
본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid)를 생물학적으로 전환하는 방법, 2) 대장균을 이용한 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(유럽 등록특허 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매 작용 하에 황화물과 반응시켜 L-시스테인으로 전환시키는 방법(US 2012-0190081 A1)이 공지되어 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서는 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재하였다.
본 출원의 목적은 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화되고, O-포스포세린 생산능을 가진, 에스케리키아 속 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는, NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, O-포스포세린을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, O-포스포세린 설프하이드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(US 2012-0190081 A1).
본 출원의 용어 "NADH:quinone 산화환원효소 (NADH:quinone oxidoreductase, 이하, "Nuo")"는 미생물의 전자전달계에서 NADH를 산화하여 세포내막의 quinone을 환원시키는 효소이다. 상기 효소 단백질은 NADH 탈수소화효소-1 (NADH dehydrogenase-1: NDH-1) 으로도 명명될 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 nuoABCEFGHIJKLMN 유전자 클러스터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 nuoABCEFGHIJKLMN 유전자 클러스터는 nuo 오페론을 구성하며, 상기 오페론 앞쪽의 프로모터와 리보좀 결합부위의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현이 조절될 수 있다. 본 출원에서 'nuoABCEFGHIJKLMN 유전자'는 'NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자' 및 'nuoABCEFGHIJKLMN 유전자', 'nuo 오페론', 'nuo 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 "오페론" 은 하나의 발현 조절 서열, 구체적으로는 하나의 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자군을 포함하는 DNA의 기능적 단위를 의미한다. 오페론에 의해 전사된 mRNA는 단일 mRNA 분자가 1개 이상의 단백질을 코딩하는 폴리시스트로닉(polycistronic) mRNA이거나, 단일 mRNA 분자가 1개의 단백질을 코딩하는 모노시스트로닉(monocistronic) mRNA일 수 있다.
Nuo는 13개의 아단위(subunit) 단백질의 복합체로 (NuoA, NuoB, NuoC, NuoE, NuoF, NuoG, NuoH, NuoI, NuoJ, NuoK, NuoL, NuoM, NuoN), 각 아단위 단백질의 번역은 두 종류의 오페론인 nuoABCEFGHIJKL 과 nuoMN을 주형으로 한다. 상기 nuo 오페론의 구조는 EcoCyc(www.biocyc.org)에서 확인할 수 있다(수납번호: EG12082). 상기 nuo 오페론은 구조 유전자(Structure Gene) 및 발현조절영역(regulatory region)을 포함하는 것으로 알려져 있다. 상기 nuo 오페론의 "발현조절영역"은 nuo 오페론을 구성하는 구조 유전자의 업스트림에 존재하여 구조 유전자의 발현을 조절할 수 있는 부위를 의미한다. nuo 오페론의 발현조절영역은 구조 유전자를 제외한 프로모터 (nuoA 프로모터 및/또는 nuoM 프로모터)와 오퍼레이터를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 nuo 오페론은 서열번호 26 내지 서열번호 38로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 nuo 오페론은 서열번호 26 내지 38 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지며 이에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 구조유전자 서열; 및 상기 구조유전자 서열의 발현을 조절하는 발현조절영역을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 26 내지 38의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 nuo 오페론은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 염기 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 nuo 오페론에 상응하는 기능을 나타내는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 용어 "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법을 모두 포괄한다.(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)
본 출원의 미생물은 OPS를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 에스케리키아 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB를 통해, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(ll):7 139-44.).
본 출원의 "O-포스포세린을 생산하는 미생물"이란, 자연적으로 O-포스포세린의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 O-포스포세린의 생산능이 없는 모균주에 O-포스포세린의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 Nuo 활성이 강화된, O-포스포세린을 생산하는 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 O-포스포세린을 생산하는 미생물은 본 출원에서 개시된 방법으로 Nuo 활성이 강화되어, O-포스포세린을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원에서 상기 "O-포스포세린을 생산하는 미생물"은 "O-포스포세린 생산 미생물", "O-포스포세린 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 O-포스포세린을 생산하는 미생물은 상기 Nuo의 활성이 강화되어, 목적하는 O-포스포세린 생산능이 증가된, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 단백질의 "활성 강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 모균주는 에스케리키아 콜라이 ATCC27325 일 수 있다. 다른 예로, 상기 모균주는 OPS 생산능이 증가되도록 하는 변형을 포함하는 균주일 수 있고, 예를 들어 CA07-0012 (KCCM 11212P; US2012-0190081A) 또는 CA07-4821일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 활성 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 Nuo일 수 있으나, nuo 오페론에 의해 코딩되어, NADH를 소모 또는 NADH를 소모하여 Proton motive force를 형성하는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 Nuo 활성의 강화는, Nuo 단백질 복합체를 구성하는 아단위 단백질 중 1 이상의 활성이 강화되는 것을 포함한다.
구체적으로, 본 출원의 단백질 활성 강화는,
1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가;
2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열의 변형;
3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열의 변형;
4) 단백질 활성이 강화되도록 아미노산 서열을 변형;
5) 단백질 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 활성이 강화되도록 변형된 단백질을 코딩하도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 변형);
6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 pCL, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체하거나 이를 삽입함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 뒤에 강력한 이종 프로모터를 삽입한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터 및 rmf 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 내재적 활성에 비해 강력한 프로모터로 치환하는 것은 모두 포함한다.
상기 3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환 된 세포를 선별할 수 있다.
상기 6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 단백질의 활성 강화는 상기 1) 내지 2) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는, nuo 오페론의 발현 증가일 수 있다. 전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 이를 코딩하는 유전자의 업스트림에 활성이 강화된 유전자 발현 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림은 nuoA 유전자의 업스트림일 수 있다. 일 구현예로, NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 Nuo 단백질 복합체를 코딩하는 nuo 오페론에 존재하는 하나의 발현 조절 서열을 변형함으로써 오페론에 존재하는 1 이상의 구조 유전자, 예를 들어 2 이상, 3 이상, 또는 전체 구조 유전자 서열의 발현이 강화되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 발현 조절 서열의 변형은 nuo 오페론의 내재적 프로모터와 nuoA 유전자 사이에 활성이 강화된 유전자 발현 조절 서열이 추가로 삽입되는 것일 수 있고, 예를 들어 상기 유전자 발현 조절 서열은 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 단백질의 활성 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 Nuo의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 미생물은 추가적으로 OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형을 포함하는 것일 수 있다.
OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형의 예시로, 포스포세린 포스포타아제(SerB)의 활성 약화; 포스포세린 배출단백질(YhhS) 활성 강화; 또는 이들 변형의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화" 는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원의 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 SerB는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB는 서열번호 2으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 3을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 SerB 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, SerB 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 YhhS는 OPS를 배출하는 활성을 지니므로, 상기 YhhS 활성이 강화되도록 변이된 미생물은 OPS를 배출하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 YhhS는 서열번호 4으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 YhhS는 YhhS의 활성을 나타내는 한, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 YhhS는 서열번호 4으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 YhhS 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, YhhS 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 YhhS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, OPS의 생산능 및/또는 세포 밖으로의 배출 능력을 강화하거나; OPS의 분해능 및/또는 유입 능력을 강화하는 변형을 포함하는 미생물은 CA07-0012 (KCCM 11212P; US2012-0190081A) 또는 CA07-4821 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 한국등록특허 제1381048호 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, OPS의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물의 배양은, 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 구체적으로 30℃ 내지 35℃일 수 있다. 배양물의 배양기간은 원하는 유용물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 본 출원의 방법에서 상기 배양하는 단계 이전, 배지를 준비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 배양에 따른 배지 또는 미생물로부터 OPS를 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
본 출원의 OPS를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 OPS를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 OPS는 정제된 형태 또는 OPS를 함유한 미생물 발효액일 수 있다. 또한, 상기 배양 단계의 전후, 상기 회수 단계의 전후에 당해 분야에서 공지된 적합한 방법을 추가하여, OPS의 회수를 효율적으로 수행할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a)단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
구체적으로는 Nuo의 활성이 강화된 OPS 생산 미생물을 배지에서 배양하여 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계 및 O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 단계에서 생산된 OPS 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법일 수 있다. 상기 NADH:quinone 산화환원효소 활성 강화 및 O-포스포세린을 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기 (-NH 2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 메그마틱스(Mycobacterium megmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al. J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005) 에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, US 2012-0190081 A1 및 US 9127324 B2호에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S, NaSH 및 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된, OPS를 생산하는 미생물은 OPS를 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1 : Nuo 발현조절영역이 변이된 균주의 OPS 생산능 평가
선행연구 결과, OPS 생산 호스트 균주에서 유전자 nuoA, rmf, idi의 평균 전사량은 각각 8986, 32205, 631 임을 알 수 있었으며 배양구간 별 구체적인 수치는 표 1에 나타난 바와 같다.
Gene
name		 Early Exponential Mid Exponential Late Exponential Stationary Average
idi 914 740 637 234 631
nuoA 6969 7517 8535 12922 8986
rmf 30725 28192 28109 41792 32205
rmf 전사량의 평균값은 nuoA에 비해 3.6배 수준임을 나타내고 있으며, idi 전사량의 평균값은 nuoA에 비해 0.07배 수준임을 확인할 수 있었다. 이는 nuoA의 프로모터에 대비 rmf 유전자의 프로모터는 강한 프로모터이며, idi 유전자의 프로모터는 약한 프로모터임을 나타낸다.
따라서 OPS 생산 미생물 내 nuo 오페론(서열번호 1)에 활성이 다른 rmf 프로모터와 idi 프로모터를 삽입함으로써 NADH:quinone 산화환원효소의 발현을 조절하였을 때 미생물의 OPS 생산능을 비교하고자 하였다.
1-1 : Nuo 발현조절영역을 강화시키기 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 14 및 15의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 nuo 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였고, 서열번호 18 및 19의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 프로모터의 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 16 및 17의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 rmf 유전자의 프로모터 부위를 수득하였다.
상기의 단편들을 획득하기 위해서 중합효소 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용한 PCR을 실시하였고, PCR은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
상기의 과정으로 획득된 nuo 프로모터의 업스트림 단편과 다운스트림 단편, 및 rmf 프로모터 단편은 EcoRV 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSKH130(서열번호 39, 미국 공개특허 제2020-0048619호)와 함께 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pSKH130_Prmf-nuoA 로 명명하였다.
1-2 : Nuo 발현조절영역을 약화시키기 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 14 및 20의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 nuo 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하고, 서열번호 23 및 19의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 상기 프로모터의 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가진 프라이머 쌍을 이용하여 idi 유전자의 프로모터 부위를 수득하였다.
실시예 1-1과 동일한 PCR 조건으로 PCR을 진행하여 상기 단편을 획득하였고 상기 단편을 이용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 클로닝을 진행함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였다. 이를 pSKH130_Pidi-nuoA 로 명명하였다.
실시예 1-1과 실시예 1-2에서 사용한 프라이머 서열을 표 2에 나타내었다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
14 UP F1 CTGCAGGAATTCGATCAACCACCAGAGATTCACGT
15 UP R1 GCTTCCTGACTCCAGTGCTTACTCATCAAAAGTAG
16 Prmf F TTTGATGAGTAAGCACTGGAGTCAGGAAGCCGCTT
17 Prmf R TGTTGACATACTCATGCCTCGTTTCCCTCATACTG
18 Down F1 TGAGGGAAACGAGGCATGAGTATGTCAACATCCAC
19 Down R1 ACGGTGAGAACGACCGTTACATCACGCTAGTCGAC
20 UP R2 TCATTTTTCTTCAGCTGCTTACTCATCAAAAGTAG
21 Pidi F TTTGATGAGTAAGCAGCTGAAGAAAAATGAGCATG
22 Pidi R TGTTGACATACTCATAATTTCTCACATGTAATTCTGATC
23 Down F2 TACATGTGAGAAATTATGAGTATGTCAACATCCAC
1-3 : Nuo 발현조절영역 변이 균주 제작
실시예 1-1에서 제작한 pSKH130_Prmf-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 OPS 생산능을 갖는 CA07-0012 (KCCM 11212P, 미국 공개특허 제2012-0190081호)에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 rmf 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4826를 얻었다.
구체적으로, pSKH130 벡터가 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon), SacB(Levansucrase) 유전자 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으므로, 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하여 균주를 제작하였다.
상기 CA07-4826는 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 rmf 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
같은 방식으로, 상기 실시예 1-2에서 제작한 pSKH130_Pidi-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)을 이용하여 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 idi 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4827를 얻었다. 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 상기 균주 CA07-4827에 idi 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
24 NuoP Conf F GAGAGCTACCATAATCCGTG
25 NuoP Conf R CATCTCAACGTAACAGCAGG
1-4 : 역가배지를 이용한 nuo 오페론 강화 및 약화 균주의 OPS 생산능 비교
상기 실시예 1-3에서 제작한 2종 균주 CA07-4826, CA07-4827와 대조군 CA07-0012의 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하에서 OPS로 기재) 생산능을 평가하기 위해서 하기 배지(표 4)를 이용하여 평가를 진행하였다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 1.5g/L
효모액기스 2.5g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
구체적으로, 배양은 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 표 3의 25mL 역가배지에 접종한 다음, 이를 33℃ 온도에서 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 그 결과 생산된 OPS 농도를 표 5에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-0012 1.95
CA07-4826 2.20
CA07-4827 0.40
rmf 프로모터에 의해 nuo 오페론이 강화된 CA07-4826은 모균주에 비해 약 12.8% 향상된 OPS 생산능을 보였으며, idi 프로모터에 의해 nuo 오페론이 약화된 CA07-4827는 모균주에 비해 약 79.5% 감소한 OPS 생산능을 보였다.
실시예 2 : OPS 생산능이 증가한 균주 내 nuo 오페론 강화에 따른 OPS 생산능 평가
OPS 배출능이 강화된 균주에서 Nuo 오페론을 강화하였을 때 추가로 OPS 생산능이 증가하는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여 OPS 배출능을 지닌 단백질 YhhS(서열번호 4, 미국 등록특허 10323262 B2)이 강화된 균주에서 nuo 오페론을 추가로 강화시켰을 때 OPS 생산능을 평가하였다.
2-1 : OPS 생산 균주 내 YhhS 강화를 위한 플라스미드 제작
E.coli ATCC27325 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 업스트림(Upstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였고 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 다운스트림(Downstream) 지역의 유전자 단편을 수득하였다. 또한 pCL_Ptrc-gfp(US 2017-0247727 A1)를 주형으로 서열번호 8 과 서열번호 9 프라이머 쌍을 이용하여 trc 프로모터(Ptrc)를 수득하였다. 상기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 6과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
6 yhhS UP F CTGCAGGAATTCGATGAAGGTAACCACTTTTTCCG
7 yhhS UP R GAGTTGCAGCAAGCGGAGGATCACCACATTTTTAC
8 Ptrc F AATGTGGTGATCCTCCGCTTGCTGCAACTCTCTCA
9 Ptrc R TACGGGTTCGGGCATGATAGCTCTCCTGTGTGAAA
10 yhhS Down F CACAGGAGAGCTATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA
11 yhhS Down R GTCGACTAGCGTGATAGCGGTTTGCCTTTACTGGC
상기의 단편들을 획득하기 위해서 중합효소 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
상기의 과정으로 획득된 yhhS 프로모터의 업스트림 단편과 다운스트림 단편, 및 trc 프로모터 단편은 EcoRV 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSKH130와 함께 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pSKH130_Ptrc-yhhS 로 명명하였다.
2-2 : YhhS 강화 균주 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 pSKH130_Ptrc-yhhS를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 CA07-0012에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 yhhS 유전자의 야생형 프로모터 염기서열 말단에 trc 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4821를 얻었다. 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머 쌍 (표 7) 을 이용하여 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 상기 균주 CA07-4821에 trc 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→ 3')
12 yhhSP Conf F AGTTGAGCAAAAACGCCAGT
13 yhhSP Conf R GCCATACCGTACAGCCAGAC
2-3 : 역가배지를 이용한 YhhS 강화 균주의 OPS 생산능 평가
상기 실시예 2-2에서 제작한 균주 CA07-4821 과 그 모균주인 CA07-0012의 OPS 생산능을 평가하기 위해서 배지(표 4)를 이용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 평가를 진행하였다.
그 결과, CA07-4821의 경우 CA07-0012 대비 약 26.7% 향상된 OPS 생산능을 갖는 것을 확인하였으며, 이를 표 8 에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-0012 1.95
CA07-4821 2.47
2-4 : YhhS 및 nuo 오페론이 강화된 균주 제작
실시예 1-1에서 제작한 pSKH130_Prmf-nuoA를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 을 이용하여 상기 실시예 2-3에서 제작한 CA07-4821에 형질전환 한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 nuo 유전자의 야생 프로모터 염기서열 말단에 rmf 유전자의 프로모터 염기서열이 삽입된 균주 CA07-4828을 얻었다.
상기 균주 CA07-4828는 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 게놈 시퀀싱을 통해 rmf 프로모터 염기서열이 삽입되었음을 확인하였다.
2-5 : 역가배지를 이용한 YhhS 및 nuo 오페론이 강화된 균주의 OPS 생산능 평가
상기 CA07-4828의 OPS 생산능을 평가하기 위해서 CA07-4821을 대조군으로 실시예 1-4와 동일한 방법으로 평가를 진행하였고 그 결과를 표 9에 나타내었다.
균주 이름 OPS(g/L)
CA07-4821 2.47
CA07-4828 2.53
YhhS 및 nuo 오페론이 동시 강화된 CA07-4828의 경우 YhhS만이 강화된 CA07-4821 대비 약 2.4% 향상된 OPS 생산능을 보였으며, 이로써 OPS 생산능이 강화된 균주에서도 nuo 오페론 강화가 OPS 생산능을 추가로 증가시키는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> NADH:quinone oxidoreductase expression-modulated recombinant microorganism and method for producing O-phosphoserine, cysteine and its derivatives using the same <130> KPA201455-KR <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuo operon <220> <221> misc_feature <222> (1)..(630) <223> nuoA promoter <220> <221> misc_feature <222> (631)..(633) <223> nuoA start codon <220> <221> misc_feature <222> (1090)..(1092) <223> nuoB start codon <220> <221> misc_feature <222> (1846)..(1848) <223> nuoC start codon <220> <221> misc_feature <222> (3651)..(3653) <223> nuoE start codon <220> <221> misc_feature <222> (4148)..(4150) <223> nuoF start codon <220> <221> misc_feature <222> (5532)..(5534) <223> nuoG start codon <220> <221> misc_feature <222> (8261)..(8263) <223> nuoH start codon <220> <221> misc_feature <222> (9253)..(9255) <223> nuoI start codon <220> <221> misc_feature <222> (9807)..(9809) <223> nuoJ start codon <220> <221> misc_feature <222> (10358)..(10360) <223> nuoK start codon <220> <221> misc_feature <222> (10657)..(10659) <223> nuoL start codon <220> <221> misc_feature <222> (12662)..(12664) <223> nuoM start codon <220> <221> misc_feature <222> (14378)..(14380) <223> nuoN start codon <400> 1 tcgacggacg atagataatt cctgagacaa tagtgtaaaa aacgagccgc tgggggtgtt 60 ttaaacccca gcggcttttt tttagtaaaa atccttcatc gcatagtgca gaacgtacaa 120 aactgttcat ttttcaacca ccagagattc acgtcccgaa cgcacaaata atcgcctgaa 180 aaaaatcacc tgctacaatg atgttaaaaa atacgtaaat ttgttgctgc gtttttgtta 240 tggaatgaca aaagcgtgtc acagatcaag aaaatactct cttttggggg gaggaatcga 300 cacaaattcc tgtcaaaata gacccgtatt ttttccattg cttcacaacg gacacgattc 360 aacaacatct aattatcctg gagtcgtcaa ggatctgggg tgaaagggca ttaaatgcta 420 atggtgttga tattatgtaa actaatgtga agaaactttt gttaaagttg acaaaaggtt 480 atagaaagga gtaaaaaacc acatcaatta gctgtataaa agaatttcta cagtgattgt 540 aaggtttttt ttattcctcc ccatgaatcg atgtggcgtc catctgccgt gaagagcagt 600 gaatctggcg ctacttttga tgagtaagca atgagtatgt caacatccac tgaagtcatc 660 gctcatcact gggcattcgc tatctttctt atcgttgcca ttggcctgtg ttgcctgatg 720 ctggtaggcg gttggttttt aggcggtcgc gcacgcgcga ggtcgaaaaa cgtgccgttt 780 gaatccggta tcgactcggt cggctccgcc cgcttacgcc tgtccgccaa gttttatctg 840 gtggccatgt tcttcgttat cttcgacgtt gaagcgctgt atctgttcgc atggtcaacc 900 tctatccgcg aaagcggctg ggtaggcttt gtggaagctg caatttttat ttttgtgtta 960 ctggcaggtc tggtttatct ggtgcgtatt ggcgcgctgg actggacgcc cgcgcgttca 1020 cgccgcgagc gtatgaaccc ggaaacgaac agtatcgcta atcgtcaacg ctaaccgcga 1080 ggcattaaga tggattatac gctcacccgc atagatccca acggtgagaa cgaccgttac 1140 cccctgcaaa agcaggagat cgtaaccgac cctctggagc aagaagttaa caaaaacgtg 1200 tttatgggca agctcaatga catggttaac tggggtcgta aaaactcaat ttggccgtat 1260 aacttcggtc tttcctgctg ttacgttgag atggtgactt cgtttaccgc ggtgcatgac 1320 gtggcgcgtt ttggcgcaga agtattgcgt gcttcgccgc gtcaggctga cctgatggtg 1380 gttgcaggaa cctgctttac caaaatggca ccggttattc agcgtctgta tgaccagatg 1440 ctggaaccaa aatgggttat ctcaatgggt gcctgtgcca actctggtgg tatgtacgat 1500 atttattccg ttgtgcaggg cgtcgataaa ttcatcccgg ttgatgtgta tatcccgggc 1560 tgcccgccgc gtcctgaagc gtacatgcag gcactgatgc tgttgcagga atctatcggc 1620 aaagaacgtc gtccgctctc ctgggtggtt ggcgatcagg gcgtttatcg cgccaatatg 1680 caatcagagc gcgaacgcaa gcgcggtgaa cgcattgccg taactaacct gcgtacacct 1740 gacgagattt aatttgcgcc tgtcggcaaa gggatttttc ttcgcttatt cctaaatcta 1800 tttcgcgaag cttactgcgc cgacagtcac cacggaccat ttgcaatggt gaacaatatg 1860 accgacttaa ccgcgcaaga acccgcctgg cagacccgcg atcatcttga tgatccggtg 1920 attggcgaac tgcgcaaccg ttttgggccg gatgccttta ctgttcaggc gactcgcacc 1980 ggggttcccg ttgtgtggat caagcgtgaa caattactgg aagttggcga tttcttaaag 2040 aaactgccga aaccttacgt catgctgttt gacttacacg gcatggacga acgtctgcgc 2100 acacaccgcg aagggttacc tgccgcggat ttttccgttt tctaccatct gatttctatc 2160 gatcgtaacc gcgacatcat gctgaaggtg gcgctggcag aaaacgacct gcacgtaccg 2220 accttcacca aactgttccc gaacgctaac tggtatgagc gtgaaacctg ggatctgttt 2280 ggcattactt tcgacggtca cccgaacctg cgacgcatca tgatgccgca aacctggaaa 2340 ggtcacccgc tgcgtaaaga ttatccggcg cgcgctaccg aattctcgcc gtttgagctg 2400 accaaagcca aacaggatct ggagatggaa gccctgacct tcaaaccgga agagtggggg 2460 atgaagcgcg gcaccgaaaa cgaggacttc atgttcctca acctcggtcc gaaccacccg 2520 tcggcgcacg gggctttccg tatcgttttg caactcgatg gcgaagagat tgtcgactgc 2580 gtaccagaca tcggttacca ccaccgtggt gcggagaaaa tgggcgaacg ccagtcctgg 2640 cacagctaca ttccgtatac tgaccgtatc gaatacctcg gcggctgcgt taacgaaatg 2700 ccttacgtgc tggcggtaga gaaactggcc gggatcaccg tgccggatcg cgttaacgtc 2760 attcgcgtta tgctctccga actgttccgc atcaacagtc acctgctgta tatctcgacc 2820 tttattcagg acgtcggcgc aatgacgcca gtgttcttcg cctttaccga tcgtcagaaa 2880 atttacgatc tggtggaagc aatcactggt ttccgtatgc acccggcgtg gttccgtatt 2940 ggcggcgtag cgcacgacct gccgcgcggc tgggatcgcc tgctgcgtga gttcctcgac 3000 tggatgccga aacgtctggc gtcttacgag aaagcggcgc tgcaaaacac cattctgaaa 3060 ggtcgttccc agggcgttgc cgcctatggc gcgaaagagg cgctggagtg gggcaccact 3120 ggcgcgggcc tgcgtgctac cgggatcgac ttcgacgtgc gtaaggcgcg tccttattct 3180 ggctatgaaa acttcgactt tgaaatcccg gtgggtggtg gcgtttctga ctgctacacc 3240 cgcgtaatgc ttaaagtgga agagctgcgc cagagtctgc gcattcttga gcagtgcctc 3300 aacaacatgc cggaaggccc gttcaaagcg gatcacccgc tgaccacgcc gccgccgaaa 3360 gagcgcacgc tgcaacatat cgaaaccctg atcacccact tcctgcaagt gtcgtggggt 3420 ccggtgatgc ctgccaatga atctttccag atgattgagg cgaccaaagg gatcaacagt 3480 tactacctga ccagcgacgg cagcaccatg agttaccgca cccgtgttcg taccccgagc 3540 tttgcgcatt tgcagcaaat tccggcggcg atccgcggca gcctggtgtc tgacctgatt 3600 gtttatctgg gcagtatcga ttttgttatg tcagatgtgg accgctaatt atgcacgaga 3660 atcaacaacc acaaaccgag gcttttgagc tgagtgcggc agagcgtgaa gcgatcgagc 3720 acgagatgca ccactacgaa gacccgcgtg cggcgtccat tgaagcgctg aaaatcgttc 3780 agaagcagcg tggctgggtg ccggatggtg cgatccacgc gatcgccgat gtgctgggta 3840 ttccggcaag cgacgtcgaa ggtgtggcaa cgttctacag tcagatcttc cgccagccgg 3900 ttggtcgcca tgtgatccgt tattgtgaca gcgtggtctg tcatatcaac ggttatcagg 3960 gtattcaggc ggcgctcgag aaaaagctga acatcaaacc agggcaaacg acatttgatg 4020 gccgctttac gctgctgcca acttgctgcc tggggaactg tgataaaggg ccaaacatga 4080 tgatcgatga ggacactcac gcgcatctga ccccggaagc gatccctgaa ctgctggagc 4140 ggtataaatg aaaaacatta tccgtactcc cgaaacgcat ccgctgacct ggcgtctgcg 4200 cgatgacaaa cagccagtgt ggctggacga ataccgcagc aaaaacggtt acgaaggcgc 4260 gcgtaaggcg ctgaccgggc tgtctccgga cgaaatcgtt aatcaggtaa aagacgctgg 4320 tctgaaaggg cgcggcggcg cgggcttctc gactggcctg aaatggagcc tgatgccgaa 4380 agacgaatcc atgaacatcc gttacctgct gtgtaatgcc gatgaaatgg agccgggcac 4440 ctataaagac cgcctgttga tggagcaact gccgcacctg ctggtggaag gtatgctcat 4500 ctccgcgttt gcgctgaaag cttaccgtgg ctacatcttc ctgcgtggcg aatatatcga 4560 agcggcagtt aatctgcgcc gtgccattgc cgaagccacc gaagcgggtc tgcttggcaa 4620 aaacattatg ggaacaggtt tcgatttcga actgttcgtc cataccgggg cagggcgcta 4680 catctgcggg gaagaaacag cgttaatcaa ctccctggaa ggacgtcgtg ctaacccacg 4740 ctcgaagcca cccttcccgg caacctccgg cgcatggggt aaaccgacct gtgtcaacaa 4800 cgtcgaaacc ctgtgtaacg ttccggcgat cctcgctaac ggcgtggagt ggtatcagaa 4860 catctcgaaa agtaaagatg ctggcaccaa gctgatgggc ttctccggtc gggtgaaaaa 4920 tccgggactg tgggaactgc cgttcggcac caccgcacgc gagatcctcg aagattacgc 4980 cggtggtatg cgtgatggtc tgaaatttaa agcctggcag ccaggcggcg cggggactga 5040 cttcctgacc gaagcgcacc ttgatctgcc gatggaattc gaaagtatcg gtaaagcggg 5100 cagccgtctg ggtacggcgc tggcgatggc ggttgaccat gagatcaaca tggtgtcgct 5160 ggtgcgtaac ctggaagagt ttttcgcccg tgagtcctgc ggctggtgta cgccgtgccg 5220 cgacggtctg ccgtggagcg tgaaaattct gcgtgcgctg gagcgtggtg aaggtcagcc 5280 gggcgatatc gaaacacttg agcaactgtg tcgattctta ggcccgggta aaactttctg 5340 tgcccacgca cctggtgcag tggagccgtt acagagcgcc atcaaatatt tccgcgaaga 5400 atttgaggcg ggaatcaaac agccgttcag caatacccat ttgattaatg ggattcagcc 5460 gaacctgctg aaagagcgct ggtaaccgaa tttcgattaa cgctcagtct ctgactgaga 5520 aaactggaag catgctaatg gctacaattc atgtagacgg caaagaatac gaggtcaacg 5580 gagcggacaa cctgctggaa gcttgtctgt ctctgggcct tgatattcct tacttttgct 5640 ggcatccggc gctgggaagt gtcggtgctt gccgccagtg tgcggtgaag caataccaaa 5700 acgcggaaga cacgcgtggt cgcctggtga tgtcctgtat gacaccggct tccgatggca 5760 cctttatttc cattgacgac gaagaagcga aacagttccg tgaaagcgtg gtcgagtggt 5820 tgatgaccaa ccacccgcac gactgtccgg tatgtgaaga gggcggtaac tgccatcttc 5880 aggatatgac tgtgatgacc ggacacagct tccgtcgcta ccgtttcacc aaacgtaccc 5940 accgtaatca ggatttgggg ccattcatct ctcacgaaat gaaccgctgc atcgcctgct 6000 accgctgtgt gcgttactac aaagattacg ctgacggtac agatctgggc gtttacggtg 6060 cgcacgacaa cgtctacttc ggtcgcccgg aagacggcac gctggaaagc gaattttccg 6120 gtaacctggt cgaaatttgc ccgaccggcg tatttaccga caaaacgcac tccgagcgtt 6180 acaaccgtaa atgggatatg cagtttgcgc cgagcatctg ccagcaatgt tccatcggct 6240 gtaacatcag ccccggtgaa cgttacggcg aactgcgtcg tatcgaaaac cgttacaacg 6300 gtacggtaaa ccactacttc ctctgcgacc gtggtcgttt cggttacggt tacgtcaacc 6360 tgaaggatcg tccgcgtcag ccagtacagc gtcgtggcga tgatttcatt accctcaacg 6420 ccgaacaggc aatgcagggc gcggcagata ttctgcgtca gtcgaagaaa gtgatcggta 6480 ttggttctcc gcgtgccagc gtggaaagca actttgcgct gcgtgaactg gtgggcgaag 6540 aaaacttcta caccggtatc gctcacggtg agcaggaacg tctgcaactg gcgctgaaag 6600 tgctgcgtga aggcggcatt tatactccgg ctctgcgcga aatcgaatct tacgatgcgg 6660 tactggtgct gggcgaagac gttacccaga ccggcgcgcg cgtcgcgctg gcagtgcgtc 6720 aggctgtgaa aggtaaagcg cgcgaaatgg cggcagcaca gaaagtggct gactggcaga 6780 ttgcggcaat cctcaacatc ggtcaacgtg cgaagcatcc gctgtttgtt accaacgttg 6840 atgacacccg tctggatgat atcgcggcgt ggacttaccg cgcaccggtt gaagatcagg 6900 cgcgtttagg ttttgccatc gcccatgcgc tggataactc tgcaccagcg gttgacggta 6960 tcgaacctga gctgcaaagc aaaatcgacg tcatcgtgca ggcactggca ggtgcgaaga 7020 aaccgttgat tatctccggg acgaacgccg gtagcttaga ggtgattcag gcggcggcta 7080 acgtcgcgaa agccctgaaa ggtcgcggcg ctgacgtcgg tatcaccatg attgcccgtt 7140 ccgtcaacag catggggctg ggcattatgg gtggcggttc gcttgaagaa gcgttaaccg 7200 aactggaaac cggacgcgcc gacgcggtgg tggtgttgga aaacgatctg catcgtcacg 7260 cttctgctat ccgcgtgaat gctgcgctgg ctaaagcacc gctggtgatg gtggttgatc 7320 atcaacgcac agcgattatg gaaaacgccc atctggtact ttctgctgcc agctttgctg 7380 aaagcgacgg tacggtgatc aacaacgaag gccgcgccca acgtttcttc caggtttacg 7440 atcctgctta ttacgacagc aaaactgtca tgctggaaag ctggcgctgg ttacactcgc 7500 tgcacagcac cctgctgagc cgtgaagtgg actggacgca gctcgaccat gtgattgacg 7560 ctgttgtggc gaaaatcccg gaactggcag gtatcaaaga tgctgcgccg gatgcgacat 7620 tccgtattcg tgggcagaaa ctggcccgtg aaccgcaccg ttacagcggt cgtaccgcca 7680 tgcgcgccaa tatcagcgtt catgagccgc gtcagccgca ggatattgac accatgttca 7740 ccttctcgat ggaaggtaac aaccagccga ctgcgcaccg ttcgcaagtg ccgtttgcct 7800 gggcgccggg ctggaactcc ccgcaggcgt ggaacaaatt ccaggacgaa gtgggcggca 7860 aactgcgctt tggcgatccg ggcgtgcgtc tgtttgaaac cagcgaaaat ggtctggatt 7920 acttcaccag cgtaccggca cgcttccagc cgcaggacgg gaaatggcgt atcgcgccgt 7980 attaccacct gtttggcagc gatgaattgt cacagcgtgc tccggtcttc cagagccgta 8040 tgccgcagcc gtacatcaaa ctcaacccag cggatgccgc gaagttgggt gtgaacgcag 8100 gtacacgcgt ctcctttagt tacgatggca acacggtcac gctgccggtt gaaatcgccg 8160 aaggactgac ggcagggcag gtgggcttgc cgatgggtat gtccggcatt gctccggtgc 8220 tggctggcgc gcatcttgag gatctcaagg aggcacaaca atgagttgga tatcaccgga 8280 actgattgag atcctgctga ccatcctcaa agcggtggtg atcctgctgg tggttgtcac 8340 ctgcggggca ttcatgagct ttggcgaacg tcgcctgctg ggtctgttcc agaaccgtta 8400 cggacctaac cgtgttggct ggggcggttc gctccagctg gttgcggaca tgatcaaaat 8460 gttctttaaa gaagactgga tcccgaaatt ctcggatcgc gtcatcttta ccctggcacc 8520 gatgattgcc tttacctcgc tgctgctggc ctttgcgatt gtgccagtca gtccgggttg 8580 ggtggttgcc gacctgaaca tcgggatttt gttcttcctg atgatggcag gtctggcggt 8640 ttacgcggtg ctgtttgcgg gctggtcaag taacaacaaa tactcgttgc tgggtgcgat 8700 gcgtgcttct gcgcagaccc tgagctacga agtgttcctc gggctttcct tgatgggcgt 8760 ggtggcgcag gccggttcat tcaacatgac cgacatcgtc aacagccagg cgcatgtgtg 8820 gaacgttatc ccgcaattct ttggttttat tacctttgcc atcgcgggcg tggcggtatg 8880 tcaccgtcac ccgtttgacc agccggaagc cgagcaggaa ctggcggatg gttaccacat 8940 tgaatattcc ggtatgaagt tcggtctgtt cttcgtgggt gagtacatcg ggattgtgac 9000 catctctgca ttgatggtga cgctgttctt cggtggctgg caaggcccgt tgttaccgcc 9060 attcatctgg ttcgcgctga aaaccgcgtt ctttatgatg atgttcattt tgattcgtgc 9120 gtcgttaccg cgtccgcgtt atgaccaggt aatgtccttc ggctggaaaa tctgcctgcc 9180 gctgacgctg atcaacttgc tggtaacggc ggctgtcatt ctctggcagg cgcaataagg 9240 ggcaataaga ccatgacctt aaaagaattg ttagtaggtt tcggcaccca ggttcgtagt 9300 atctggatga tcggcctgca cgcgttcgcc aaacgcgaaa cgcgaatgta cccggaagag 9360 ccggtctatc tgccgccccg ttatcgtggt cgtatcgttc tgacccgcga cccggacggc 9420 gaagagcgtt gcgtagcctg taacctctgc gcggtagcct gcccggtcgg ctgtatctcg 9480 ctgcaaaaag cagaaaccaa agacggtcgc tggtacccgg aatttttccg catcaacttc 9540 tcacgctgca ttttctgtgg tctgtgcgaa gaagcctgtc cgaccacggc gattcagtta 9600 accccggatt tcgaaatggg ggaatacaag cgccaggatc tggtttacga gaaagaggat 9660 ctgctgatct ccggtccggg caaatacccg gaatataact tctaccggat ggcaggtatg 9720 gcaatcgacg gcaaagataa gggcgaagca gagaacgaag ccaagcctat cgacgtcaag 9780 agcctgttac cgtaaggaga ggggcaatgg agttcgcttt ttatatctgt ggcctgatag 9840 ccatacttgc gaccttgcga gtgatcaccc ataccaatcc ggtacacgca ctgctgtacc 9900 tgattatttc gctgctggcg atttccgggg tgttcttctc actgggcgct tacttcgccg 9960 gtgcgctgga aattatcgtc tacgcgggtg ccattatggt gctgttcgtg ttcgtggtga 10020 tgatgctcaa cctgggcggt tcagaaatcg aacaggaacg ccagtggctg aaaccgcagg 10080 tgtggattgg tccggcaatt ttgtcggcca tcatgctggt ggtgattgtt tacgccatcc 10140 tcggtgttaa cgatcagggt atcgacggta cgccaatcag tgctaaagca gtgggtatta 10200 cgctgttcgg gccttacgta ctggcggtgg aactggcttc tatgctgctg ctcgcaggtc 10260 tggttgtggc cttccacgtc ggtcgtgaag agcgtgcggg tgaagtgctg agcaatcgta 10320 aagacgacag cgcgaaaaga aaaacggagg agcacgcatg atccccttac aacatggact 10380 gatcctcgcg gcaatcttat tcgttcttgg cttaaccggt ctggttatcc gtcgcaatct 10440 gctgtttatg ttgattggtc tggaaatcat gattaacgcc tccgcgctgg ccttcgtggt 10500 cgccggaagc tactggggcc agaccgacgg tcaggtgatg tacattctcg ccatcagcct 10560 cgcggcggca gaagcgagta tcggccttgc gctgctgctg caacttcacc gtcgtcgcca 10620 gaacctgaac atcgattcag taagtgagat gcgcggatga acatgcttgc cttaaccatt 10680 attttgccat tgattggctt cgtcctgctg gcattctccc gtgggcgctg gtctgaaaac 10740 gtctcggcga tcgtcggcgt aggctctgtg ggcctggcgg cgctggtaac cgcctttatc 10800 ggcgttgatt tcttcgctaa cggcgagcag acatacagcc agccgctgtg gacgtggatg 10860 tcggtaggcg actttaacat cggttttaac ctggtgctgg acggcctgtc gctgaccatg 10920 ctctcggtgg tcactggtgt gggtttcctt attcacatgt acgcctcctg gtatatgcgc 10980 ggtgaagagg gctactctcg cttcttcgct tacaccaacc tgttcatcgc cagcatggtg 11040 gttctggtgc ttgccgacaa cctgctgctg atgtacctcg gctgggaagg cgtgggcctg 11100 tgctcctatc tgctgatcgg gttctattac accgatccga agaatggcgc agcggcaatg 11160 aaagcgttcg tcgtgacccg tgtgggtgac gtgttcctcg ctttcgcact gttcattctt 11220 tacaacgaac tgggcaccct gaacttccgc gaaatggtgg aactggcacc agcgcacttt 11280 gctgacggca ataacatgct gatgtgggcg acgctgatgc tgctgggcgg tgcggtcggt 11340 aaatctgcgc agttgccgtt gcagacatgg cttgccgacg cgatggcggg cccgacgcct 11400 gtctccgcgc tgatccacgc cgcaaccatg gtaaccgcgg gtgtctacct gatcgcccgt 11460 acccacggcc tgttcctgat gacgccggaa gttctgcatc tggtgggtat tgtcggggcg 11520 gttacgctgc tgctggccgg ttttgccgcg ctggtacaga ccgacatcaa acgtgttctc 11580 gcttactcta ccatgagcca gattggctac atgttcctcg cgcttggcgt gcaggcatgg 11640 gatgcggcga ttttccactt gatgacccac gcgttcttta aagcgctgct gttcctggca 11700 tccggttccg tcattctggc ctgccatcac gaacagaaca tcttcaagat gggcggtctg 11760 cgtaaatcta ttccgctggt ttatctctgc ttcctggtgg gcggcgcagc actgtcggca 11820 ctaccgctgg tcactgcggg cttcttcagt aaggatgaga tcctcgcggg tgcgatggcg 11880 aatggtcata tcaatctgat ggtggcaggt ctggtcggtg cgtttatgac ctcgctctac 11940 accttccgta tgattttcat cgtcttccac ggaaaagaac aaattcacgc tcacgccgtg 12000 aaaggggtaa ctcacagcct gccgctgatt gtgctgctga tcctttccac cttcgttggc 12060 gcactgattg taccgccgct gcagggcgtg cttccgcaaa cgacggaact ggcgcacggc 12120 agcatgttga ccctggaaat tacctctggc gtggtcgcgg tggtcggcat tctgctggca 12180 gcctggctgt ggctgggtaa acgtactctg gtgacctcca tcgccaacag tgcgccgggc 12240 cgtctgctgg gcacctggtg gtacaacgcc tggggatttg actggctgta tgacaaagtg 12300 ttcgtcaagc cgttcctggg tattgcctgg ttgctgaaac gcgatccgct gaactcaatg 12360 atgaacatcc cggctgtcct ttcccgcttt gcaggtaaag gtctgctgtt aagtgagaac 12420 ggctatctgc gctggtatgt ggcatccatg agcatcggtg cggtcgtggt gctggcactg 12480 ttgatggtac tgcgttgagt taaggattgt gggattgccc ctgggcatat aagaacgtag 12540 gtcggataag ccgccttcgc ggtgcatccg acactacccc cagtccgaag agaattttct 12600 gtcgtgagaa ttcgttgaaa atccggtcct gacgggactt ttacaaggaa taaagatcgc 12660 catgttacta ccctggctaa tattaattcc ctttattggc ggcttcctgt gctggcagac 12720 cgaacgcttt ggcgtcaagg tgccacgctg gatcgcgctg atcaccatgg gattgacgct 12780 ggcgctgtcg ctgcaactgt ggttgcaggg cggttattca ctgacgcaat ccgccggaat 12840 tccgcagtgg cagtctgaat tcgacatgcc gtggatcccg cgttttggta tctctattca 12900 tctcgccatt gacgggctgt cgctgctgat ggtcgtgctg accggtctgc tcggtgtgct 12960 ggcggtacta tgttcgtgga aagagatcga aaaatatcag ggcttcttcc acctcaacct 13020 gatgtggatc ctgggcggcg ttatcggcgt gttccttgcc atcgacatgt tcctgttctt 13080 cttcttctgg gaaatgatgc tggtgccgat gtacttcctg atcgcactgt gggggcataa 13140 agcctctgac ggtaaaacgc gtatcacggc ggcaaccaag ttcttcattt acacccaggc 13200 gagtggcctg gtgatgttga ttgccatcct ggcgctggtt tttgttcact acaatgcgac 13260 cggcgtctgg accttcaact atgaagagct gctgaatacg ccaatgtcca gtggtgtgga 13320 atacctgtta atgctgggct tcttcatcgc cttcgcagtc aaaatgccgg tggttccgct 13380 gcatggctgg ctgccggatg cgcactccca ggctccgacc gccggttccg ttgacctcgc 13440 ggggatcttg ctgaaaactg ccgcttacgg tttgctgcgt ttctccctgc cgctgttccc 13500 gaacgcgtcg gcagagttcg cgccaattgc tatgtggctg ggtgttatcg gcatcttcta 13560 cggtgcgtgg atggccttcg cccagaccga tatcaaacgt ctgatcgcct acacctcggt 13620 ttcccacatg ggcttcgtgc tgattgctat ctacaccggc agccagttgg cctaccaggg 13680 cgcggtaatc cagatgattg cgcacggttt gtcggcggcg ggtctgttta ttctttgtgg 13740 tcagctttat gaacgtatcc atacccgcga catgcgcatg atgggcggtc tgtggagcaa 13800 gatgaaatgg ctgccagcac tgtcgctgtt ctttgcggtg gcaacgcttg ggatgcctgg 13860 caccggtaac ttcgtcggcg aatttatgat tctgttcggc agcttccagg ttgtaccggt 13920 gattaccgtt atctctacct ttgggctggt ctttgcatct gtttattcgc tggcgatgtt 13980 acatcgcgct tacttcggta aagcgaaaag ccagattgcc agccaggaac tgccagggat 14040 gtcgctgcgt gagctgttta tgatcctgtt gctggtggtg ctgctggtac tgctgggctt 14100 ctatccgcag ccgattctgg atacctcgca ctccgcgatt ggcaatatcc agcagtggtt 14160 tgttaattcc gttactacta caaggccgta aatcgccatg acaataactc cacaaaacct 14220 gatcgcactg ctaccgttgc tgatcgtcgg cttgacggtg gtggttgtga tgctctccat 14280 tgcgtggcga cgcaatcatt tcctcaacgc tacgctctcg gttattgggc ttaacgcggc 14340 gctggtttcg ctctggtttg ttggccaggc gggcgctatg gacgttacgc cgctgatgcg 14400 cgttgatggt ttcgccatgc tttacaccgg gctggtattg ttggcgagcc tcgccacctg 14460 tactttcgcc tacccgtggc ttgaaggcta taacgacaac aaggatgagt tctacctgtt 14520 ggtgttaatt gccgcgctgg gcgggatcct gctggcgaat gccaaccatc tggcgtctct 14580 gttcctcggt atcgaactga tctctttgcc gctgtttggc ctggtcggtt acgctttccg 14640 ccagaaacgt tcactggaag ccagtatcaa atacaccatc ctttctgccg cagcgtcttc 14700 tttcctgctg tttggtatgg cgctggtgta tgcgcagtct ggcgacctgt cgtttgtcgc 14760 gttgggtaaa aaccttggcg acggtatgct caacgagccg ctgttgctgg caggtttcgg 14820 cctgatgatt gttggcctcg gcttcaaact ctctctggtg ccgttccacc tgtggacgcc 14880 agacgtatac cagggcgcgc ctgcgccggt ttccactttc ctggcgacgg cgagcaaaat 14940 cgctatcttc ggtgtggtga tgcgtctgtt cctctacgca ccggtgggtg acagcgaagc 15000 gattcgcgtg gtgctggcga ttatcgcctt tgcctccatc atcttcggta acctgatggc 15060 gctgagccag accaatatca aacgtctgct cggttactca tctatctctc acctcggcta 15120 tctgctggta gcgctgattg cgctgcaaac cggcgagatg tcgatggaag cggtaggggt 15180 ttacctggcc ggttatctgt tcagcagcct cggcgcgttc ggcgtggtca gcctgatgtc 15240 cagcccgtat cgtggcccgg atgctgattc cctgttctct taccgcggtc tgttctggca 15300 tcgtccgatc ctcgcggcag tgatgacggt gatgatgctg tctctggccg gtatcccgat 15360 gacgctgggc tttatcggta agttctacgt gctggcggtc ggtgtccagg cacacttgtg 15420 gtggctggtg ggtgccgtgg ttgtcggttc ggcaatcggc ctctactact acctgcgcgt 15480 ggcggtgagc ctgtatcttc acgccccgga acaaccgggt cgcgatgcac catcaaactg 15540 gcagtacagc gcgggcggta tcgttgtgct gatctctgca ctgttggtac tggtgctggg 15600 tgtatggcca caaccgctga ttagcattgt gcgtttggca atgccgctga tgtaa 15655 <210> 2 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SerB <400> 2 Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp 1 5 10 15 Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp 20 25 30 Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp 35 40 45 Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val 50 55 60 Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala 65 70 75 80 Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu 85 90 95 Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu 100 105 110 Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp 115 120 125 Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser 145 150 155 160 Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val 165 170 175 Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys 180 185 190 Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr 195 200 205 Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val 210 215 220 Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile 225 230 235 240 Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu 245 250 255 Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp 260 265 270 Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala 275 280 285 Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg 290 295 300 His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn 305 310 315 320 Gln Lys <210> 3 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serB <400> 3 atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60 ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120 ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180 gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240 ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300 ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360 gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420 gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480 cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540 ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600 gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660 accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720 ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780 gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840 aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900 gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960 cagaagtaa 969 <210> 4 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YhhS <400> 4 Met Pro Glu Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Asn Gly Leu Arg Leu Asn 1 5 10 15 Leu Arg Ile Val Ser Ile Val Met Phe Asn Phe Ala Ser Tyr Leu Thr 20 25 30 Ile Gly Leu Pro Leu Ala Val Leu Pro Gly Tyr Val His Asp Val Met 35 40 45 Gly Phe Ser Ala Phe Trp Ala Gly Leu Val Ile Ser Leu Gln Tyr Phe 50 55 60 Ala Thr Leu Leu Ser Arg Pro His Ala Gly Arg Tyr Ala Asp Ser Leu 65 70 75 80 Gly Pro Lys Lys Ile Val Val Phe Gly Leu Cys Gly Cys Phe Leu Ser 85 90 95 Gly Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Ala Ser Leu Pro Val Ile 100 105 110 Ser Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Ile Leu Gly Ile Gly Gln 115 120 125 Ser Phe Ala Gly Thr Gly Ser Thr Leu Trp Gly Val Gly Val Val Gly 130 135 140 Ser Leu His Ile Gly Arg Val Ile Ser Trp Asn Gly Ile Val Thr Tyr 145 150 155 160 Gly Ala Met Ala Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Val Phe Tyr His Trp 165 170 175 Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ile Ile Met Gly Val Ala Leu Val 180 185 190 Ala Ile Leu Leu Ala Ile Pro Arg Pro Thr Val Lys Ala Ser Lys Gly 195 200 205 Lys Pro Leu Pro Phe Arg Ala Val Leu Gly Arg Val Trp Leu Tyr Gly 210 215 220 Met Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe 225 230 235 240 Ile Thr Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Gly Trp Asp Gly Ala Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Thr Leu Phe Ser Cys Ala Phe Val Gly Thr Arg Leu Leu Phe Pro 260 265 270 Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Gly Leu Asn Val Ala Met Ile Cys Phe 275 280 285 Ser Val Glu Ile Ile Gly Leu Leu Leu Val Gly Val Ala Thr Met Pro 290 295 300 Trp Met Ala Lys Ile Gly Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Phe Ser Leu 305 310 315 320 Val Phe Pro Ala Leu Gly Val Val Ala Val Lys Ala Val Pro Gln Gln 325 330 335 Asn Gln Gly Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Val Phe Met Asp Leu Ser 340 345 350 Leu Gly Val Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Ser Trp Ala Gly 355 360 365 Val Pro Val Ile Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Leu 370 375 380 Leu Leu Thr Trp Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Glu His Val Pro Glu 385 390 395 400 Ala Ala Ser Ser Ser 405 <210> 5 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS <400> 5 atgcccgaac ccgtagccga acccgcgcta aacggattgc gcctgaattt gcgcattgtc 60 tctatagtca tgtttaactt cgccagctac ctcaccatcg ggttgccgct cgctgtatta 120 ccgggctatg tccatgatgt gatgggcttt agcgccttct gggcaggatt ggttatcagc 180 ctgcaatatt tcgccacctt gctgagccgc cctcatgccg gacgttacgc cgattcgctg 240 ggacccaaaa agattgtcgt cttcggttta tgcggctgct ttttgagcgg tctggggtat 300 ctgacggcag gattaaccgc cagtctgcct gtcatcagcc tgttattact ttgcctgggg 360 cgcgtcatcc ttgggattgg gcaaagtttt gccggaacgg gatcgaccct atggggcgtt 420 ggcgtggttg gctcgctgca tatcgggcgg gtgatttcgt ggaacggcat tgtcacttac 480 ggggcgatgg cgatgggtgc gccgttaggc gtcgtgtttt atcactgggg cggcttgcag 540 gcgttagcgt taatcattat gggcgtggcg ctggtggcca ttttgttggc gatcccgcgt 600 ccgacggtaa aagccagtaa aggcaaaccg ctgccgtttc gcgcggtgct tgggcgcgtc 660 tggctgtacg gtatggcgct ggcactggct tccgccggat ttggcgtcat cgccaccttt 720 atcacgctgt tttatgacgc taaaggttgg gacggtgcgg ctttcgcgct gacgctgttt 780 agctgtgcgt ttgtcggtac gcgtttgtta ttccctaacg gcattaaccg tatcggtggc 840 ttaaacgtag cgatgatttg ctttagcgtt gagataatcg gcctgctact ggttggcgtg 900 gcgactatgc cgtggatggc gaaaatcggc gtcttactgg cgggggccgg gttttcgctg 960 gtgttcccgg cattgggtgt agtggcggta aaagcggttc cgcagcaaaa tcagggggcg 1020 gcgctggcaa cttacaccgt atttatggat ttatcgcttg gcgtgactgg accactggct 1080 gggctggtga tgagctgggc gggcgtaccg gtgatttatc tggcggcggc gggactggtc 1140 gcaatcgcgt tattactgac gtggcgatta aaaaaacggc ctccggaaca cgtccctgag 1200 gccgcctcat catcttaa 1218 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS UP F <400> 6 ctgcaggaat tcgatgaagg taaccacttt ttccg 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS UP R <400> 7 gagttgcagc aagcggagga tcaccacatt tttac 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc F <400> 8 aatgtggtga tcctccgctt gctgcaactc tctca 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptrc R <400> 9 tacgggttcg ggcatgatag ctctcctgtg tgaaa 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS Down F <400> 10 cacaggagag ctatcatgcc cgaacccgta gccga 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhS Down R <400> 11 gtcgactagc gtgatagcgg tttgccttta ctggc 35 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhSP Conf F <400> 12 agttgagcaa aaacgccagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yhhSP Conf R <400> 13 gccataccgt acagccagac 20 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP F1 <400> 14 ctgcaggaat tcgatcaacc accagagatt cacgt 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP R1 <400> 15 gcttcctgac tccagtgctt actcatcaaa agtag 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prmf F <400> 16 tttgatgagt aagcactgga gtcaggaagc cgctt 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prmf R <400> 17 tgttgacata ctcatgcctc gtttccctca tactg 35 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Down F1 <400> 18 tgagggaaac gaggcatgag tatgtcaaca tccac 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Down R1 <400> 19 acggtgagaa cgaccgttac atcacgctag tcgac 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP R2 <400> 20 tcatttttct tcagctgctt actcatcaaa agtag 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pidi F <400> 21 tttgatgagt aagcagctga agaaaaatga gcatg 35 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pidi R <400> 22 tgttgacata ctcataattt ctcacatgta attctgatc 39 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Down F2 <400> 23 tacatgtgag aaattatgag tatgtcaaca tccac 35 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoP Conf F <400> 24 gagagctacc ataatccgtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoP Conf R <400> 25 catctcaacg taacagcagg 20 <210> 26 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoA <400> 26 Met Ser Met Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Ala His His Trp Ala Phe 1 5 10 15 Ala Ile Phe Leu Ile Val Ala Ile Gly Leu Cys Cys Leu Met Leu Val 20 25 30 Gly Gly Trp Phe Leu Gly Gly Arg Ala Arg Ala Arg Ser Lys Asn Val 35 40 45 Pro Phe Glu Ser Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Ala Arg Leu Arg Leu 50 55 60 Ser Ala Lys Phe Tyr Leu Val Ala Met Phe Phe Val Ile Phe Asp Val 65 70 75 80 Glu Ala Leu Tyr Leu Phe Ala Trp Ser Thr Ser Ile Arg Glu Ser Gly 85 90 95 Trp Val Gly Phe Val Glu Ala Ala Ile Phe Ile Phe Val Leu Leu Ala 100 105 110 Gly Leu Val Tyr Leu Val Arg Ile Gly Ala Leu Asp Trp Thr Pro Ala 115 120 125 Arg Ser Arg Arg Glu Arg Met Asn Pro Glu Thr Asn Ser Ile Ala Asn 130 135 140 Arg Gln Arg 145 <210> 27 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoB <400> 27 Met Asp Tyr Thr Leu Thr Arg Ile Asp Pro Asn Gly Glu Asn Asp Arg 1 5 10 15 Tyr Pro Leu Gln Lys Gln Glu Ile Val Thr Asp Pro Leu Glu Gln Glu 20 25 30 Val Asn Lys Asn Val Phe Met Gly Lys Leu Asn Asp Met Val Asn Trp 35 40 45 Gly Arg Lys Asn Ser Ile Trp Pro Tyr Asn Phe Gly Leu Ser Cys Cys 50 55 60 Tyr Val Glu Met Val Thr Ser Phe Thr Ala Val His Asp Val Ala Arg 65 70 75 80 Phe Gly Ala Glu Val Leu Arg Ala Ser Pro Arg Gln Ala Asp Leu Met 85 90 95 Val Val Ala Gly Thr Cys Phe Thr Lys Met Ala Pro Val Ile Gln Arg 100 105 110 Leu Tyr Asp Gln Met Leu Glu Pro Lys Trp Val Ile Ser Met Gly Ala 115 120 125 Cys Ala Asn Ser Gly Gly Met Tyr Asp Ile Tyr Ser Val Val Gln Gly 130 135 140 Val Asp Lys Phe Ile Pro Val Asp Val Tyr Ile Pro Gly Cys Pro Pro 145 150 155 160 Arg Pro Glu Ala Tyr Met Gln Ala Leu Met Leu Leu Gln Glu Ser Ile 165 170 175 Gly Lys Glu Arg Arg Pro Leu Ser Trp Val Val Gly Asp Gln Gly Val 180 185 190 Tyr Arg Ala Asn Met Gln Ser Glu Arg Glu Arg Lys Arg Gly Glu Arg 195 200 205 Ile Ala Val Thr Asn Leu Arg Thr Pro Asp Glu Ile 210 215 220 <210> 28 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoC <400> 28 Met Val Asn Asn Met Thr Asp Leu Thr Ala Gln Glu Pro Ala Trp Gln 1 5 10 15 Thr Arg Asp His Leu Asp Asp Pro Val Ile Gly Glu Leu Arg Asn Arg 20 25 30 Phe Gly Pro Asp Ala Phe Thr Val Gln Ala Thr Arg Thr Gly Val Pro 35 40 45 Val Val Trp Ile Lys Arg Glu Gln Leu Leu Glu Val Gly Asp Phe Leu 50 55 60 Lys Lys Leu Pro Lys Pro Tyr Val Met Leu Phe Asp Leu His Gly Met 65 70 75 80 Asp Glu Arg Leu Arg Thr His Arg Glu Gly Leu Pro Ala Ala Asp Phe 85 90 95 Ser Val Phe Tyr His Leu Ile Ser Ile Asp Arg Asn Arg Asp Ile Met 100 105 110 Leu Lys Val Ala Leu Ala Glu Asn Asp Leu His Val Pro Thr Phe Thr 115 120 125 Lys Leu Phe Pro Asn Ala Asn Trp Tyr Glu Arg Glu Thr Trp Asp Leu 130 135 140 Phe Gly Ile Thr Phe Asp Gly His Pro Asn Leu Arg Arg Ile Met Met 145 150 155 160 Pro Gln Thr Trp Lys Gly His Pro Leu Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Arg 165 170 175 Ala Thr Glu Phe Ser Pro Phe Glu Leu Thr Lys Ala Lys Gln Asp Leu 180 185 190 Glu Met Glu Ala Leu Thr Phe Lys Pro Glu Glu Trp Gly Met Lys Arg 195 200 205 Gly Thr Glu Asn Glu Asp Phe Met Phe Leu Asn Leu Gly Pro Asn His 210 215 220 Pro Ser Ala His Gly Ala Phe Arg Ile Val Leu Gln Leu Asp Gly Glu 225 230 235 240 Glu Ile Val Asp Cys Val Pro Asp Ile Gly Tyr His His Arg Gly Ala 245 250 255 Glu Lys Met Gly Glu Arg Gln Ser Trp His Ser Tyr Ile Pro Tyr Thr 260 265 270 Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Gly Gly Cys Val Asn Glu Met Pro Tyr Val 275 280 285 Leu Ala Val Glu Lys Leu Ala Gly Ile Thr Val Pro Asp Arg Val Asn 290 295 300 Val Ile Arg Val Met Leu Ser Glu Leu Phe Arg Ile Asn Ser His Leu 305 310 315 320 Leu Tyr Ile Ser Thr Phe Ile Gln Asp Val Gly Ala Met Thr Pro Val 325 330 335 Phe Phe Ala Phe Thr Asp Arg Gln Lys Ile Tyr Asp Leu Val Glu Ala 340 345 350 Ile Thr Gly Phe Arg Met His Pro Ala Trp Phe Arg Ile Gly Gly Val 355 360 365 Ala His Asp Leu Pro Arg Gly Trp Asp Arg Leu Leu Arg Glu Phe Leu 370 375 380 Asp Trp Met Pro Lys Arg Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Gln 385 390 395 400 Asn Thr Ile Leu Lys Gly Arg Ser Gln Gly Val Ala Ala Tyr Gly Ala 405 410 415 Lys Glu Ala Leu Glu Trp Gly Thr Thr Gly Ala Gly Leu Arg Ala Thr 420 425 430 Gly Ile Asp Phe Asp Val Arg Lys Ala Arg Pro Tyr Ser Gly Tyr Glu 435 440 445 Asn Phe Asp Phe Glu Ile Pro Val Gly Gly Gly Val Ser Asp Cys Tyr 450 455 460 Thr Arg Val Met Leu Lys Val Glu Glu Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ile 465 470 475 480 Leu Glu Gln Cys Leu Asn Asn Met Pro Glu Gly Pro Phe Lys Ala Asp 485 490 495 His Pro Leu Thr Thr Pro Pro Pro Lys Glu Arg Thr Leu Gln His Ile 500 505 510 Glu Thr Leu Ile Thr His Phe Leu Gln Val Ser Trp Gly Pro Val Met 515 520 525 Pro Ala Asn Glu Ser Phe Gln Met Ile Glu Ala Thr Lys Gly Ile Asn 530 535 540 Ser Tyr Tyr Leu Thr Ser Asp Gly Ser Thr Met Ser Tyr Arg Thr Arg 545 550 555 560 Val Arg Thr Pro Ser Phe Ala His Leu Gln Gln Ile Pro Ala Ala Ile 565 570 575 Arg Gly Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile Val Tyr Leu Gly Ser Ile Asp 580 585 590 Phe Val Met Ser Asp Val Asp Arg 595 600 <210> 29 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoE <400> 29 Met His Glu Asn Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Phe Glu Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Glu Ala Ile Glu His Glu Met His His Tyr Glu Asp Pro 20 25 30 Arg Ala Ala Ser Ile Glu Ala Leu Lys Ile Val Gln Lys Gln Arg Gly 35 40 45 Trp Val Pro Asp Gly Ala Ile His Ala Ile Ala Asp Val Leu Gly Ile 50 55 60 Pro Ala Ser Asp Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Tyr Ser Gln Ile Phe 65 70 75 80 Arg Gln Pro Val Gly Arg His Val Ile Arg Tyr Cys Asp Ser Val Val 85 90 95 Cys His Ile Asn Gly Tyr Gln Gly Ile Gln Ala Ala Leu Glu Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Ile Lys Pro Gly Gln Thr Thr Phe Asp Gly Arg Phe Thr Leu 115 120 125 Leu Pro Thr Cys Cys Leu Gly Asn Cys Asp Lys Gly Pro Asn Met Met 130 135 140 Ile Asp Glu Asp Thr His Ala His Leu Thr Pro Glu Ala Ile Pro Glu 145 150 155 160 Leu Leu Glu Arg Tyr Lys 165 <210> 30 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoF <400> 30 Met Lys Asn Ile Ile Arg Thr Pro Glu Thr His Pro Leu Thr Trp Arg 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp Lys Gln Pro Val Trp Leu Asp Glu Tyr Arg Ser Lys 20 25 30 Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Arg Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Glu Ile Val Asn Gln Val Lys Asp Ala Gly Leu Lys Gly Arg Gly Gly 50 55 60 Ala Gly Phe Ser Thr Gly Leu Lys Trp Ser Leu Met Pro Lys Asp Glu 65 70 75 80 Ser Met Asn Ile Arg Tyr Leu Leu Cys Asn Ala Asp Glu Met Glu Pro 85 90 95 Gly Thr Tyr Lys Asp Arg Leu Leu Met Glu Gln Leu Pro His Leu Leu 100 105 110 Val Glu Gly Met Leu Ile Ser Ala Phe Ala Leu Lys Ala Tyr Arg Gly 115 120 125 Tyr Ile Phe Leu Arg Gly Glu Tyr Ile Glu Ala Ala Val Asn Leu Arg 130 135 140 Arg Ala Ile Ala Glu Ala Thr Glu Ala Gly Leu Leu Gly Lys Asn Ile 145 150 155 160 Met Gly Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Phe Val His Thr Gly Ala Gly 165 170 175 Arg Tyr Ile Cys Gly Glu Glu Thr Ala Leu Ile Asn Ser Leu Glu Gly 180 185 190 Arg Arg Ala Asn Pro Arg Ser Lys Pro Pro Phe Pro Ala Thr Ser Gly 195 200 205 Ala Trp Gly Lys Pro Thr Cys Val Asn Asn Val Glu Thr Leu Cys Asn 210 215 220 Val Pro Ala Ile Leu Ala Asn Gly Val Glu Trp Tyr Gln Asn Ile Ser 225 230 235 240 Lys Ser Lys Asp Ala Gly Thr Lys Leu Met Gly Phe Ser Gly Arg Val 245 250 255 Lys Asn Pro Gly Leu Trp Glu Leu Pro Phe Gly Thr Thr Ala Arg Glu 260 265 270 Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Gly Gly Met Arg Asp Gly Leu Lys Phe Lys 275 280 285 Ala Trp Gln Pro Gly Gly Ala Gly Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ala His 290 295 300 Leu Asp Leu Pro Met Glu Phe Glu Ser Ile Gly Lys Ala Gly Ser Arg 305 310 315 320 Leu Gly Thr Ala Leu Ala Met Ala Val Asp His Glu Ile Asn Met Val 325 330 335 Ser Leu Val Arg Asn Leu Glu Glu Phe Phe Ala Arg Glu Ser Cys Gly 340 345 350 Trp Cys Thr Pro Cys Arg Asp Gly Leu Pro Trp Ser Val Lys Ile Leu 355 360 365 Arg Ala Leu Glu Arg Gly Glu Gly Gln Pro Gly Asp Ile Glu Thr Leu 370 375 380 Glu Gln Leu Cys Arg Phe Leu Gly Pro Gly Lys Thr Phe Cys Ala His 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Val Glu Pro Leu Gln Ser Ala Ile Lys Tyr Phe Arg 405 410 415 Glu Glu Phe Glu Ala Gly Ile Lys Gln Pro Phe Ser Asn Thr His Leu 420 425 430 Ile Asn Gly Ile Gln Pro Asn Leu Leu Lys Glu Arg Trp 435 440 445 <210> 31 <211> 910 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoG <400> 31 Met Leu Met Ala Thr Ile His Val Asp Gly Lys Glu Tyr Glu Val Asn 1 5 10 15 Gly Ala Asp Asn Leu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Leu Gly Leu Asp Ile 20 25 30 Pro Tyr Phe Cys Trp His Pro Ala Leu Gly Ser Val Gly Ala Cys Arg 35 40 45 Gln Cys Ala Val Lys Gln Tyr Gln Asn Ala Glu Asp Thr Arg Gly Arg 50 55 60 Leu Val Met Ser Cys Met Thr Pro Ala Ser Asp Gly Thr Phe Ile Ser 65 70 75 80 Ile Asp Asp Glu Glu Ala Lys Gln Phe Arg Glu Ser Val Val Glu Trp 85 90 95 Leu Met Thr Asn His Pro His Asp Cys Pro Val Cys Glu Glu Gly Gly 100 105 110 Asn Cys His Leu Gln Asp Met Thr Val Met Thr Gly His Ser Phe Arg 115 120 125 Arg Tyr Arg Phe Thr Lys Arg Thr His Arg Asn Gln Asp Leu Gly Pro 130 135 140 Phe Ile Ser His Glu Met Asn Arg Cys Ile Ala Cys Tyr Arg Cys Val 145 150 155 160 Arg Tyr Tyr Lys Asp Tyr Ala Asp Gly Thr Asp Leu Gly Val Tyr Gly 165 170 175 Ala His Asp Asn Val Tyr Phe Gly Arg Pro Glu Asp Gly Thr Leu Glu 180 185 190 Ser Glu Phe Ser Gly Asn Leu Val Glu Ile Cys Pro Thr Gly Val Phe 195 200 205 Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Arg Tyr Asn Arg Lys Trp Asp Met Gln 210 215 220 Phe Ala Pro Ser Ile Cys Gln Gln Cys Ser Ile Gly Cys Asn Ile Ser 225 230 235 240 Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Glu Leu Arg Arg Ile Glu Asn Arg Tyr Asn 245 250 255 Gly Thr Val Asn His Tyr Phe Leu Cys Asp Arg Gly Arg Phe Gly Tyr 260 265 270 Gly Tyr Val Asn Leu Lys Asp Arg Pro Arg Gln Pro Val Gln Arg Arg 275 280 285 Gly Asp Asp Phe Ile Thr Leu Asn Ala Glu Gln Ala Met Gln Gly Ala 290 295 300 Ala Asp Ile Leu Arg Gln Ser Lys Lys Val Ile Gly Ile Gly Ser Pro 305 310 315 320 Arg Ala Ser Val Glu Ser Asn Phe Ala Leu Arg Glu Leu Val Gly Glu 325 330 335 Glu Asn Phe Tyr Thr Gly Ile Ala His Gly Glu Gln Glu Arg Leu Gln 340 345 350 Leu Ala Leu Lys Val Leu Arg Glu Gly Gly Ile Tyr Thr Pro Ala Leu 355 360 365 Arg Glu Ile Glu Ser Tyr Asp Ala Val Leu Val Leu Gly Glu Asp Val 370 375 380 Thr Gln Thr Gly Ala Arg Val Ala Leu Ala Val Arg Gln Ala Val Lys 385 390 395 400 Gly Lys Ala Arg Glu Met Ala Ala Ala Gln Lys Val Ala Asp Trp Gln 405 410 415 Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ile Gly Gln Arg Ala Lys His Pro Leu Phe 420 425 430 Val Thr Asn Val Asp Asp Thr Arg Leu Asp Asp Ile Ala Ala Trp Thr 435 440 445 Tyr Arg Ala Pro Val Glu Asp Gln Ala Arg Leu Gly Phe Ala Ile Ala 450 455 460 His Ala Leu Asp Asn Ser Ala Pro Ala Val Asp Gly Ile Glu Pro Glu 465 470 475 480 Leu Gln Ser Lys Ile Asp Val Ile Val Gln Ala Leu Ala Gly Ala Lys 485 490 495 Lys Pro Leu Ile Ile Ser Gly Thr Asn Ala Gly Ser Leu Glu Val Ile 500 505 510 Gln Ala Ala Ala Asn Val Ala Lys Ala Leu Lys Gly Arg Gly Ala Asp 515 520 525 Val Gly Ile Thr Met Ile Ala Arg Ser Val Asn Ser Met Gly Leu Gly 530 535 540 Ile Met Gly Gly Gly Ser Leu Glu Glu Ala Leu Thr Glu Leu Glu Thr 545 550 555 560 Gly Arg Ala Asp Ala Val Val Val Leu Glu Asn Asp Leu His Arg His 565 570 575 Ala Ser Ala Ile Arg Val Asn Ala Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Val 580 585 590 Met Val Val Asp His Gln Arg Thr Ala Ile Met Glu Asn Ala His Leu 595 600 605 Val Leu Ser Ala Ala Ser Phe Ala Glu Ser Asp Gly Thr Val Ile Asn 610 615 620 Asn Glu Gly Arg Ala Gln Arg Phe Phe Gln Val Tyr Asp Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Tyr Asp Ser Lys Thr Val Met Leu Glu Ser Trp Arg Trp Leu His Ser 645 650 655 Leu His Ser Thr Leu Leu Ser Arg Glu Val Asp Trp Thr Gln Leu Asp 660 665 670 His Val Ile Asp Ala Val Val Ala Lys Ile Pro Glu Leu Ala Gly Ile 675 680 685 Lys Asp Ala Ala Pro Asp Ala Thr Phe Arg Ile Arg Gly Gln Lys Leu 690 695 700 Ala Arg Glu Pro His Arg Tyr Ser Gly Arg Thr Ala Met Arg Ala Asn 705 710 715 720 Ile Ser Val His Glu Pro Arg Gln Pro Gln Asp Ile Asp Thr Met Phe 725 730 735 Thr Phe Ser Met Glu Gly Asn Asn Gln Pro Thr Ala His Arg Ser Gln 740 745 750 Val Pro Phe Ala Trp Ala Pro Gly Trp Asn Ser Pro Gln Ala Trp Asn 755 760 765 Lys Phe Gln Asp Glu Val Gly Gly Lys Leu Arg Phe Gly Asp Pro Gly 770 775 780 Val Arg Leu Phe Glu Thr Ser Glu Asn Gly Leu Asp Tyr Phe Thr Ser 785 790 795 800 Val Pro Ala Arg Phe Gln Pro Gln Asp Gly Lys Trp Arg Ile Ala Pro 805 810 815 Tyr Tyr His Leu Phe Gly Ser Asp Glu Leu Ser Gln Arg Ala Pro Val 820 825 830 Phe Gln Ser Arg Met Pro Gln Pro Tyr Ile Lys Leu Asn Pro Ala Asp 835 840 845 Ala Ala Lys Leu Gly Val Asn Ala Gly Thr Arg Val Ser Phe Ser Tyr 850 855 860 Asp Gly Asn Thr Val Thr Leu Pro Val Glu Ile Ala Glu Gly Leu Thr 865 870 875 880 Ala Gly Gln Val Gly Leu Pro Met Gly Met Ser Gly Ile Ala Pro Val 885 890 895 Leu Ala Gly Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Glu Ala Gln Gln 900 905 910 <210> 32 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoH <400> 32 Met Ser Trp Ile Ser Pro Glu Leu Ile Glu Ile Leu Leu Thr Ile Leu 1 5 10 15 Lys Ala Val Val Ile Leu Leu Val Val Val Thr Cys Gly Ala Phe Met 20 25 30 Ser Phe Gly Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu Phe Gln Asn Arg Tyr Gly 35 40 45 Pro Asn Arg Val Gly Trp Gly Gly Ser Leu Gln Leu Val Ala Asp Met 50 55 60 Ile Lys Met Phe Phe Lys Glu Asp Trp Ile Pro Lys Phe Ser Asp Arg 65 70 75 80 Val Ile Phe Thr Leu Ala Pro Met Ile Ala Phe Thr Ser Leu Leu Leu 85 90 95 Ala Phe Ala Ile Val Pro Val Ser Pro Gly Trp Val Val Ala Asp Leu 100 105 110 Asn Ile Gly Ile Leu Phe Phe Leu Met Met Ala Gly Leu Ala Val Tyr 115 120 125 Ala Val Leu Phe Ala Gly Trp Ser Ser Asn Asn Lys Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Gly Ala Met Arg Ala Ser Ala Gln Thr Leu Ser Tyr Glu Val Phe Leu 145 150 155 160 Gly Leu Ser Leu Met Gly Val Val Ala Gln Ala Gly Ser Phe Asn Met 165 170 175 Thr Asp Ile Val Asn Ser Gln Ala His Val Trp Asn Val Ile Pro Gln 180 185 190 Phe Phe Gly Phe Ile Thr Phe Ala Ile Ala Gly Val Ala Val Cys His 195 200 205 Arg His Pro Phe Asp Gln Pro Glu Ala Glu Gln Glu Leu Ala Asp Gly 210 215 220 Tyr His Ile Glu Tyr Ser Gly Met Lys Phe Gly Leu Phe Phe Val Gly 225 230 235 240 Glu Tyr Ile Gly Ile Val Thr Ile Ser Ala Leu Met Val Thr Leu Phe 245 250 255 Phe Gly Gly Trp Gln Gly Pro Leu Leu Pro Pro Phe Ile Trp Phe Ala 260 265 270 Leu Lys Thr Ala Phe Phe Met Met Met Phe Ile Leu Ile Arg Ala Ser 275 280 285 Leu Pro Arg Pro Arg Tyr Asp Gln Val Met Ser Phe Gly Trp Lys Ile 290 295 300 Cys Leu Pro Leu Thr Leu Ile Asn Leu Leu Val Thr Ala Ala Val Ile 305 310 315 320 Leu Trp Gln Ala Gln 325 <210> 33 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoI <400> 33 Met Thr Leu Lys Glu Leu Leu Val Gly Phe Gly Thr Gln Val Arg Ser 1 5 10 15 Ile Trp Met Ile Gly Leu His Ala Phe Ala Lys Arg Glu Thr Arg Met 20 25 30 Tyr Pro Glu Glu Pro Val Tyr Leu Pro Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ile 35 40 45 Val Leu Thr Arg Asp Pro Asp Gly Glu Glu Arg Cys Val Ala Cys Asn 50 55 60 Leu Cys Ala Val Ala Cys Pro Val Gly Cys Ile Ser Leu Gln Lys Ala 65 70 75 80 Glu Thr Lys Asp Gly Arg Trp Tyr Pro Glu Phe Phe Arg Ile Asn Phe 85 90 95 Ser Arg Cys Ile Phe Cys Gly Leu Cys Glu Glu Ala Cys Pro Thr Thr 100 105 110 Ala Ile Gln Leu Thr Pro Asp Phe Glu Met Gly Glu Tyr Lys Arg Gln 115 120 125 Asp Leu Val Tyr Glu Lys Glu Asp Leu Leu Ile Ser Gly Pro Gly Lys 130 135 140 Tyr Pro Glu Tyr Asn Phe Tyr Arg Met Ala Gly Met Ala Ile Asp Gly 145 150 155 160 Lys Asp Lys Gly Glu Ala Glu Asn Glu Ala Lys Pro Ile Asp Val Lys 165 170 175 Ser Leu Leu Pro 180 <210> 34 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoJ <400> 34 Met Glu Phe Ala Phe Tyr Ile Cys Gly Leu Ile Ala Ile Leu Ala Thr 1 5 10 15 Leu Arg Val Ile Thr His Thr Asn Pro Val His Ala Leu Leu Tyr Leu 20 25 30 Ile Ile Ser Leu Leu Ala Ile Ser Gly Val Phe Phe Ser Leu Gly Ala 35 40 45 Tyr Phe Ala Gly Ala Leu Glu Ile Ile Val Tyr Ala Gly Ala Ile Met 50 55 60 Val Leu Phe Val Phe Val Val Met Met Leu Asn Leu Gly Gly Ser Glu 65 70 75 80 Ile Glu Gln Glu Arg Gln Trp Leu Lys Pro Gln Val Trp Ile Gly Pro 85 90 95 Ala Ile Leu Ser Ala Ile Met Leu Val Val Ile Val Tyr Ala Ile Leu 100 105 110 Gly Val Asn Asp Gln Gly Ile Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ala Lys Ala 115 120 125 Val Gly Ile Thr Leu Phe Gly Pro Tyr Val Leu Ala Val Glu Leu Ala 130 135 140 Ser Met Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Ala Phe His Val Gly Arg 145 150 155 160 Glu Glu Arg Ala Gly Glu Val Leu Ser Asn Arg Lys Asp Asp Ser Ala 165 170 175 Lys Arg Lys Thr Glu Glu His Ala 180 <210> 35 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoK <400> 35 Met Ile Pro Leu Gln His Gly Leu Ile Leu Ala Ala Ile Leu Phe Val 1 5 10 15 Leu Gly Leu Thr Gly Leu Val Ile Arg Arg Asn Leu Leu Phe Met Leu 20 25 30 Ile Gly Leu Glu Ile Met Ile Asn Ala Ser Ala Leu Ala Phe Val Val 35 40 45 Ala Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Thr Asp Gly Gln Val Met Tyr Ile Leu 50 55 60 Ala Ile Ser Leu Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ile Gly Leu Ala Leu Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu His Arg Arg Arg Gln Asn Leu Asn Ile Asp Ser Val Ser 85 90 95 Glu Met Arg Gly 100 <210> 36 <211> 613 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoL <400> 36 Met Asn Met Leu Ala Leu Thr Ile Ile Leu Pro Leu Ile Gly Phe Val 1 5 10 15 Leu Leu Ala Phe Ser Arg Gly Arg Trp Ser Glu Asn Val Ser Ala Ile 20 25 30 Val Gly Val Gly Ser Val Gly Leu Ala Ala Leu Val Thr Ala Phe Ile 35 40 45 Gly Val Asp Phe Phe Ala Asn Gly Glu Gln Thr Tyr Ser Gln Pro Leu 50 55 60 Trp Thr Trp Met Ser Val Gly Asp Phe Asn Ile Gly Phe Asn Leu Val 65 70 75 80 Leu Asp Gly Leu Ser Leu Thr Met Leu Ser Val Val Thr Gly Val Gly 85 90 95 Phe Leu Ile His Met Tyr Ala Ser Trp Tyr Met Arg Gly Glu Glu Gly 100 105 110 Tyr Ser Arg Phe Phe Ala Tyr Thr Asn Leu Phe Ile Ala Ser Met Val 115 120 125 Val Leu Val Leu Ala Asp Asn Leu Leu Leu Met Tyr Leu Gly Trp Glu 130 135 140 Gly Val Gly Leu Cys Ser Tyr Leu Leu Ile Gly Phe Tyr Tyr Thr Asp 145 150 155 160 Pro Lys Asn Gly Ala Ala Ala Met Lys Ala Phe Val Val Thr Arg Val 165 170 175 Gly Asp Val Phe Leu Ala Phe Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Asn Glu Leu 180 185 190 Gly Thr Leu Asn Phe Arg Glu Met Val Glu Leu Ala Pro Ala His Phe 195 200 205 Ala Asp Gly Asn Asn Met Leu Met Trp Ala Thr Leu Met Leu Leu Gly 210 215 220 Gly Ala Val Gly Lys Ser Ala Gln Leu Pro Leu Gln Thr Trp Leu Ala 225 230 235 240 Asp Ala Met Ala Gly Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Ile His Ala Ala 245 250 255 Thr Met Val Thr Ala Gly Val Tyr Leu Ile Ala Arg Thr His Gly Leu 260 265 270 Phe Leu Met Thr Pro Glu Val Leu His Leu Val Gly Ile Val Gly Ala 275 280 285 Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Leu Val Gln Thr Asp Ile 290 295 300 Lys Arg Val Leu Ala Tyr Ser Thr Met Ser Gln Ile Gly Tyr Met Phe 305 310 315 320 Leu Ala Leu Gly Val Gln Ala Trp Asp Ala Ala Ile Phe His Leu Met 325 330 335 Thr His Ala Phe Phe Lys Ala Leu Leu Phe Leu Ala Ser Gly Ser Val 340 345 350 Ile Leu Ala Cys His His Glu Gln Asn Ile Phe Lys Met Gly Gly Leu 355 360 365 Arg Lys Ser Ile Pro Leu Val Tyr Leu Cys Phe Leu Val Gly Gly Ala 370 375 380 Ala Leu Ser Ala Leu Pro Leu Val Thr Ala Gly Phe Phe Ser Lys Asp 385 390 395 400 Glu Ile Leu Ala Gly Ala Met Ala Asn Gly His Ile Asn Leu Met Val 405 410 415 Ala Gly Leu Val Gly Ala Phe Met Thr Ser Leu Tyr Thr Phe Arg Met 420 425 430 Ile Phe Ile Val Phe His Gly Lys Glu Gln Ile His Ala His Ala Val 435 440 445 Lys Gly Val Thr His Ser Leu Pro Leu Ile Val Leu Leu Ile Leu Ser 450 455 460 Thr Phe Val Gly Ala Leu Ile Val Pro Pro Leu Gln Gly Val Leu Pro 465 470 475 480 Gln Thr Thr Glu Leu Ala His Gly Ser Met Leu Thr Leu Glu Ile Thr 485 490 495 Ser Gly Val Val Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Ala Ala Trp Leu Trp 500 505 510 Leu Gly Lys Arg Thr Leu Val Thr Ser Ile Ala Asn Ser Ala Pro Gly 515 520 525 Arg Leu Leu Gly Thr Trp Trp Tyr Asn Ala Trp Gly Phe Asp Trp Leu 530 535 540 Tyr Asp Lys Val Phe Val Lys Pro Phe Leu Gly Ile Ala Trp Leu Leu 545 550 555 560 Lys Arg Asp Pro Leu Asn Ser Met Met Asn Ile Pro Ala Val Leu Ser 565 570 575 Arg Phe Ala Gly Lys Gly Leu Leu Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Leu Arg 580 585 590 Trp Tyr Val Ala Ser Met Ser Ile Gly Ala Val Val Val Leu Ala Leu 595 600 605 Leu Met Val Leu Arg 610 <210> 37 <211> 509 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoM <400> 37 Met Leu Leu Pro Trp Leu Ile Leu Ile Pro Phe Ile Gly Gly Phe Leu 1 5 10 15 Cys Trp Gln Thr Glu Arg Phe Gly Val Lys Val Pro Arg Trp Ile Ala 20 25 30 Leu Ile Thr Met Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Gln Leu Trp Leu 35 40 45 Gln Gly Gly Tyr Ser Leu Thr Gln Ser Ala Gly Ile Pro Gln Trp Gln 50 55 60 Ser Glu Phe Asp Met Pro Trp Ile Pro Arg Phe Gly Ile Ser Ile His 65 70 75 80 Leu Ala Ile Asp Gly Leu Ser Leu Leu Met Val Val Leu Thr Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Val Leu Ala Val Leu Cys Ser Trp Lys Glu Ile Glu Lys Tyr 100 105 110 Gln Gly Phe Phe His Leu Asn Leu Met Trp Ile Leu Gly Gly Val Ile 115 120 125 Gly Val Phe Leu Ala Ile Asp Met Phe Leu Phe Phe Phe Phe Trp Glu 130 135 140 Met Met Leu Val Pro Met Tyr Phe Leu Ile Ala Leu Trp Gly His Lys 145 150 155 160 Ala Ser Asp Gly Lys Thr Arg Ile Thr Ala Ala Thr Lys Phe Phe Ile 165 170 175 Tyr Thr Gln Ala Ser Gly Leu Val Met Leu Ile Ala Ile Leu Ala Leu 180 185 190 Val Phe Val His Tyr Asn Ala Thr Gly Val Trp Thr Phe Asn Tyr Glu 195 200 205 Glu Leu Leu Asn Thr Pro Met Ser Ser Gly Val Glu Tyr Leu Leu Met 210 215 220 Leu Gly Phe Phe Ile Ala Phe Ala Val Lys Met Pro Val Val Pro Leu 225 230 235 240 His Gly Trp Leu Pro Asp Ala His Ser Gln Ala Pro Thr Ala Gly Ser 245 250 255 Val Asp Leu Ala Gly Ile Leu Leu Lys Thr Ala Ala Tyr Gly Leu Leu 260 265 270 Arg Phe Ser Leu Pro Leu Phe Pro Asn Ala Ser Ala Glu Phe Ala Pro 275 280 285 Ile Ala Met Trp Leu Gly Val Ile Gly Ile Phe Tyr Gly Ala Trp Met 290 295 300 Ala Phe Ala Gln Thr Asp Ile Lys Arg Leu Ile Ala Tyr Thr Ser Val 305 310 315 320 Ser His Met Gly Phe Val Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Gly Ser Gln Leu 325 330 335 Ala Tyr Gln Gly Ala Val Ile Gln Met Ile Ala His Gly Leu Ser Ala 340 345 350 Ala Gly Leu Phe Ile Leu Cys Gly Gln Leu Tyr Glu Arg Ile His Thr 355 360 365 Arg Asp Met Arg Met Met Gly Gly Leu Trp Ser Lys Met Lys Trp Leu 370 375 380 Pro Ala Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Ala Thr Leu Gly Met Pro Gly 385 390 395 400 Thr Gly Asn Phe Val Gly Glu Phe Met Ile Leu Phe Gly Ser Phe Gln 405 410 415 Val Val Pro Val Ile Thr Val Ile Ser Thr Phe Gly Leu Val Phe Ala 420 425 430 Ser Val Tyr Ser Leu Ala Met Leu His Arg Ala Tyr Phe Gly Lys Ala 435 440 445 Lys Ser Gln Ile Ala Ser Gln Glu Leu Pro Gly Met Ser Leu Arg Glu 450 455 460 Leu Phe Met Ile Leu Leu Leu Val Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Phe 465 470 475 480 Tyr Pro Gln Pro Ile Leu Asp Thr Ser His Ser Ala Ile Gly Asn Ile 485 490 495 Gln Gln Trp Phe Val Asn Ser Val Thr Thr Thr Arg Pro 500 505 <210> 38 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NuoN <400> 38 Met Asp Val Thr Pro Leu Met Arg Val Asp Gly Phe Ala Met Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Leu Val Leu Leu Ala Ser Leu Ala Thr Cys Thr Phe Ala Tyr 20 25 30 Pro Trp Leu Glu Gly Tyr Asn Asp Asn Lys Asp Glu Phe Tyr Leu Leu 35 40 45 Val Leu Ile Ala Ala Leu Gly Gly Ile Leu Leu Ala Asn Ala Asn His 50 55 60 Leu Ala Ser Leu Phe Leu Gly Ile Glu Leu Ile Ser Leu Pro Leu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Val Gly Tyr Ala Phe Arg Gln Lys Arg Ser Leu Glu Ala Ser 85 90 95 Ile Lys Tyr Thr Ile Leu Ser Ala Ala Ala Ser Ser Phe Leu Leu Phe 100 105 110 Gly Met Ala Leu Val Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Leu Ser Phe Val Ala 115 120 125 Leu Gly Lys Asn Leu Gly Asp Gly Met Leu Asn Glu Pro Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Gly Phe Gly Leu Met Ile Val Gly Leu Gly Phe Lys Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Pro Phe His Leu Trp Thr Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ala Pro Ala 165 170 175 Pro Val Ser Thr Phe Leu Ala Thr Ala Ser Lys Ile Ala Ile Phe Gly 180 185 190 Val Val Met Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Pro Val Gly Asp Ser Glu Ala 195 200 205 Ile Arg Val Val Leu Ala Ile Ile Ala Phe Ala Ser Ile Ile Phe Gly 210 215 220 Asn Leu Met Ala Leu Ser Gln Thr Asn Ile Lys Arg Leu Leu Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Ser Ile Ser His Leu Gly Tyr Leu Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu 245 250 255 Gln Thr Gly Glu Met Ser Met Glu Ala Val Gly Val Tyr Leu Ala Gly 260 265 270 Tyr Leu Phe Ser Ser Leu Gly Ala Phe Gly Val Val Ser Leu Met Ser 275 280 285 Ser Pro Tyr Arg Gly Pro Asp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Tyr Arg Gly 290 295 300 Leu Phe Trp His Arg Pro Ile Leu Ala Ala Val Met Thr Val Met Met 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ala Gly Ile Pro Met Thr Leu Gly Phe Ile Gly Lys Phe 325 330 335 Tyr Val Leu Ala Val Gly Val Gln Ala His Leu Trp Trp Leu Val Gly 340 345 350 Ala Val Val Val Gly Ser Ala Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Leu Arg Val 355 360 365 Ala Val Ser Leu Tyr Leu His Ala Pro Glu Gln Pro Gly Arg Asp Ala 370 375 380 Pro Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Ala Gly Gly Ile Val Val Leu Ile Ser 385 390 395 400 Ala Leu Leu Val Leu Val Leu Gly Val Trp Pro Gln Pro Leu Ile Ser 405 410 415 Ile Val Arg Leu Ala Met Pro Leu Met 420 425 <210> 39 <211> 4695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSKH130 <400> 39 tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 60 gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 120 gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 180 agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 240 cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 300 gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 360 ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 420 caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 480 aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 540 gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 600 ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 660 atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 720 tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 780 ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 840 gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc 900 ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca 960 cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga 1020 ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg cagacctcag cgctcaaaga 1080 tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca tccggcagtt caacagatcg 1140 ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt gatgtcattc tggtgaagaa 1200 gctcgaccgt cttggccgcg acaccgccga catgatccaa ctgataaaag agtttgatgc 1260 tcagggtgta gcggttcggt ttattgacga cgggatcagt accgacggtg atatggggca 1320 aatggtggtc accgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt 1380 ggcggccgct ctagacttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1440 cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgctagagga tcgatccttt 1500 ttaacccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgatat 1560 tttctgaatt gtgattaaaa aggcaacttt atgcccatgc aacagaaact ataaaaaata 1620 cagagaatga aaagaaacag atagattttt tagttcttta ggcccgtagt ctgcaaatcc 1680 ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc aaacgagagt 1740 ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa gcaggcaaga 1800 cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat attttaggtc 1860 tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga agaagcagac 1920 cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 1980 aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg 2040 cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat attacacgcc 2100 atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt cctgaattcg 2160 attcgtccac aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc 2220 cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat 2280 tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat caaaaagtcg 2340 gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat 2400 tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat 2460 ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa cattacggca 2520 aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct ttgaacatca 2580 acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac 2640 agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc 2700 actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact ggaactgaag 2760 atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat 2820 tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag 2880 caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga 2940 aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa 3000 tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca 3060 ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact ggcccataca 3120 agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct 3180 ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct 3240 atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcca agcttcctgc 3300 tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa caaggacaat 3360 taacagttaa caaataaaaa cgcaaaagaa aatgccgatg ggtaccgagc gaaatgaccg 3420 accaagcgac gcccaacctg ccatcggatc ccccgggctg caggaattcg atatcacgct 3480 agtcgaccta gctagcatat ggggagatct actagtaaag catgccaatt ggtattctat 3540 agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt 3600 ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg tagcatctgg cttactgaag cagaccctat 3660 catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg 3720 gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 3780 catggctaat tcccatgtca gccgttaagt gttcctgtgt cactcaaaat tgctttgaga 3840 ggctctaagg gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt tgtccacaac cgttaaacct 3900 taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt tttttcttat aaaacttaaa accttagagg 3960 ctatttaagt tgctgattta tattaatttt attgttcaaa catgagagct tagtacgtga 4020 aacatgagag cttagtacgt tagccatgag agcttagtac gttagccatg agggtttagt 4080 tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag 4140 cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcttca gatcctctac gccggacgca 4200 tcgtggccgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4260 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca ccaataactg 4320 ccttaaaaaa actagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 4380 gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 4440 ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 4500 tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 4560 cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 4620 acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 4680 cgggaaacgt cttgc 4695

Claims (11)

  1. NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화되고, O-포스포세린 생산능을 가진, 에스케리키아 속 재조합 미생물로, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 nuo 오페론의 발현 증가인, 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림에 내재적 활성에 비해 활성이 강한 유전자 발현 조절 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림에 내재적 활성에 비해 활성이 강한 프로모터를 포함하는 것인, 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 NADH:quinone 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 업스트림은 nuoA 유전자의 업스트림인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(SerB)의 활성이 약화된 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 O-포스포세린 배출 단백질(YhhS) 의 활성이 강화된 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양에 따른 배지 또는 미생물에서 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  10. a) NADH:quinone 산화환원효소의 활성이 강화된 O-포스포세린 생산 에스케리키아 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법으로,
    상기 NADH:quinone 산화환원효소의 활성 강화는 nuo 오페론의 발현 증가이고, 상기 시스테인의 유도체는 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymethylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH, (R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, 및 S-(4-Tolyl)-L-cysteine 중 선택되는 것인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
KR1020210081785A 2021-06-23 2021-06-23 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 Active KR102654301B1 (ko)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210081785A KR102654301B1 (ko) 2021-06-23 2021-06-23 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
PCT/KR2022/008745 WO2022270857A1 (ko) 2021-06-23 2022-06-21 Nadh:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
CN202280057073.7A CN117897489A (zh) 2021-06-23 2022-06-21 控制nadh：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及通过使用重组微生物生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及其衍生物的方法
EP22828704.1A EP4361276A4 (en) 2021-06-23 2022-06-21 Recombinant microorganism in which expression of nadh:quinone oxidoreductase is controlled, and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivative thereof by using same
BR112023027397A BR112023027397A2 (pt) 2021-06-23 2022-06-21 Microrganismo recombinante do gênero escherichia no qual a atividade de nadh:quinona oxidorredutase é melhorada, uso do mesmo para a produção de o-fosfosserina (ops), cisteína ou um derivado das mesmas e métodos para produzir o-fosfosserina, cisteína ou derivado da mesma e para produzir um microrganismo produtor de ops
US18/573,419 US20240294955A1 (en) 2021-06-23 2022-06-21 Recombinant microorganism in which expression of nadh:quinone oxidoreductase is controlled, and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivative thereof by using same
AU2022297143A AU2022297143B2 (en) 2021-06-23 2022-06-21 Recombinant microorganism in which expression of nadh:quinone oxidoreductase is controlled, and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivative thereof by using same
MX2024000244A MX2024000244A (es) 2021-06-23 2022-06-21 Microorganismo recombinante en el cual se controla la expresion de nadh:quinona oxidorreductasa y metodo para producir o-fosfoserina, cisteina y derivado de la misma utilizando la misma.
JP2023579425A JP2024522877A (ja) 2021-06-23 2022-06-21 ＮＡＤＨ：ｑｕｉｎｏｎｅ酸化還元酵素の発現が調節された組換え微生物、並びにそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法。
CA3223970A CA3223970A1 (en) 2021-06-23 2022-06-21 Recombinant microorganism in which expression of nadh:quinone oxidoreductase is controlled, and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivative thereof by using same
TW111123466A TWI843130B (zh) 2021-06-23 2022-06-23 Nadh:醌氧化還原酶的表現受調控的重組微生物及使用該微生物製備o-磷絲胺酸、半胱胺酸及其衍生物的方法
ARP220101649A AR126213A1 (es) 2021-06-23 2022-06-23 Microorganismo recombinante con expresión regulada de nadh:quinona oxidorreductasa y método para producir o-fosfoserina, cisteína y derivados de la misma que utiliza la misma
ZA2024/00355A ZA202400355B (en) 2021-06-23 2024-01-10 Recombinant microorganism in which expression of nadh:quinone oxidoreductase is controlled, and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivative thereof by using same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210081785A KR102654301B1 (ko) 2021-06-23 2021-06-23 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220170657A KR20220170657A (ko) 2022-12-30
KR102654301B1 true KR102654301B1 (ko) 2024-04-04

Family

ID=84538605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210081785A Active KR102654301B1 (ko) 2021-06-23 2021-06-23 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20240294955A1 (ko)
EP (1) EP4361276A4 (ko)
JP (1) JP2024522877A (ko)
KR (1) KR102654301B1 (ko)
CN (1) CN117897489A (ko)
AR (1) AR126213A1 (ko)
AU (1) AU2022297143B2 (ko)
BR (1) BR112023027397A2 (ko)
CA (1) CA3223970A1 (ko)
MX (1) MX2024000244A (ko)
TW (1) TWI843130B (ko)
WO (1) WO2022270857A1 (ko)
ZA (1) ZA202400355B (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240147868A (ko) * 2023-03-31 2024-10-10 씨제이제일제당 (주) 알킬하이드로퍼옥사이드 환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR20240147887A (ko) * 2023-03-31 2024-10-10 씨제이제일제당 (주) 망간 유입 단백질의 활성이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101381048B1 (ko) 2010-10-20 2014-04-14 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR101208267B1 (ko) 2010-10-20 2012-12-04 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체
KR101493154B1 (ko) * 2013-05-10 2015-02-13 씨제이제일제당 (주) 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법
KR101547651B1 (ko) 2014-06-03 2015-08-26 씨제이제일제당 주식회사 O-숙시닐호모세린 또는 숙신산의 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 숙신산 또는 o-숙시닐호모세린의 생산 방법
KR101677328B1 (ko) 2014-08-12 2016-11-18 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
KR101694632B1 (ko) * 2015-09-11 2017-01-10 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
CN112840028B (zh) 2018-08-07 2024-01-16 Cj第一制糖株式会社 包含变体RpoC编码序列的核酸分子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101381048B1 (ko) 2010-10-20 2014-04-14 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemistry, 1999, vol. 38, pp. 16261-16267.
Journal of Biological Chemistry, 2006, voi. 281, no. 35, pp. 25062-25075.

Also Published As

Publication number Publication date
AR126213A1 (es) 2023-09-27
ZA202400355B (en) 2025-03-26
AU2022297143A1 (en) 2024-01-18
CN117897489A (zh) 2024-04-16
JP2024522877A (ja) 2024-06-21
US20240294955A1 (en) 2024-09-05
CA3223970A1 (en) 2022-12-29
EP4361276A4 (en) 2025-03-05
KR20220170657A (ko) 2022-12-30
TWI843130B (zh) 2024-05-21
EP4361276A1 (en) 2024-05-01
AU2022297143B2 (en) 2025-11-20
BR112023027397A2 (pt) 2024-03-12
WO2022270857A1 (ko) 2022-12-29
MX2024000244A (es) 2024-01-31
TW202313963A (zh) 2023-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106795485A (zh) 生产o‑磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产o‑磷酸丝氨酸或l‑半胱氨酸的方法
EP3348567B1 (en) Novel o-phosphoserine efflux protein variant and method for producing o-phosphoserine, cysteine and derivative thereof using same
KR102654301B1 (ko) NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
JP7773641B2 (ja) 新規なＹｈｈＳ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法
JP7646816B2 (ja) 新規なｏ－ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたｏ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法
KR102287112B1 (ko) 신규한 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
RU2841386C2 (ru) Рекомбинантный микроорганизм с контролируемой экспрессией NADH:хинон оксидоредуктазы и способ получения O-фосфосерина, цистеина и его производного с использованием этого микроорганизма
KR102815526B1 (ko) O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
RU2851144C2 (ru) Новый вариант YhhS и способ получения O-фосфосерина, цистеина и производного цистеина с его использованием
KR102688937B1 (ko) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
KR102707457B1 (ko) 신규한 MdtH 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
TWI890387B (zh) 具有錳輸入蛋白質活性受調節的重組微生物及使用該微生物用以製造ｏ-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物的方法
RU2831309C1 (ru) Новый O-фосфосерин-экспортирующий белок и способы получения О-фосфосерина, цистеина и производного цистеина с его применением
RU2821317C1 (ru) Вариант белка, экспортирующего o-фосфосерин, и способ получения о-фосфосерина, цистеина и его производных с его использованием
KR20240147868A (ko) 알킬하이드로퍼옥사이드 환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR20240173254A (ko) O-포스포세린 설프하이드릴라아제 변이체 및 이를 이용한 시스테인 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

AMND Amendment
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601

X091 Application refused [patent]
T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

T13-X000 Administrative time limit extension granted

St.27 status event code: U-3-3-T10-T13-oth-X000

AMND Amendment
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PX0901 Re-examination

St.27 status event code: A-2-3-E10-E12-rex-PX0901

PX0701 Decision of registration after re-examination

St.27 status event code: A-3-4-F10-F13-rex-PX0701

X701 Decision to grant (after re-examination)
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601