KR102770475B1 - L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산방법에 관한 것이다.

Description

L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산방법{Microorganism producing L-ornithine and L-ornithine production method using the same}

본 출원은 L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 몇몇 L-아미노산의 경우 미생물을 이용한 발효에 의해 생성되고 있다. 미생물을 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 재조합 DNA 기술을 이용한 연구들이 진행되어왔다. 예를 들어, 일부 유전자 결손 및 감쇠 발현시키거나 L-아미노산 생합성 관련 유전자를 증폭시킴으로써 미생물의 L-아미노산 생산능을 증가시킬 수 있었다. 특히, 미생물의 L-아미노산에 대한 배출능 향상은 L-아미노산의 생산능을 증가시키기 위한 주요 기술로 여겨져왔다(US 10995378 B2). 따라서, L-아미노산의 배출능이 밝혀진 유전자를 도입 및 증폭시킴으로써, 미생물 내부에 축적된 고농도의 L-아미노산을 배출해 생산능을 크게 증가시킬 수 있을 것이다.

본 출원의 하나의 목적은 쉬와넬라(Shewanella) 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체(LysE/ArgO family amino acid transporter) 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴 생산능을 가지는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 출원의 하나의 양태는 쉬와넬라(Shewanella) 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체(LysE/ArgO family amino acid transporter) 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴 생산능을 가지는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 재조합 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어, "LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체(LysE/ArgO family amino acid transporter)"는 박테리아에서 아미노산 배출자 패밀리에 속하는 LysE(lysine exporter) 및/또는 ArgO(arginine exporter) 기능을 갖는 단백질이다. 즉, LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체는 라이신 및/또는 아르기닌 배출 활성을 갖는 단백질을 의미한다.

상기 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질의 아미노산 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI의 Genebank 등에서 얻을 수 있다.

일예로, 본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 미생물로부터 유래하는 것일 수 있다.

다른 일예로, 본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하지 않는, 외래(exogenous) 단백질일 수 있다.

또 다른 일예로, 본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 미생물로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 미생물은, 구체적으로 쉬와넬라 속 미생물로부터 유래하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 쉬와넬라 코랄리이(Shewanella corallii), 쉬와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. BC20, 쉬와넬라 시아메넨시스(Shewanella xiamenensis), 쉬와넬라 데코러레이셔니스(Shewanella decolorationis), Shewanella sp. HN-41, 쉬와넬라 발티카(Shewanella baltica), Shewanella sp. ISTPL2 등으로부터 유래하는 것일 수 있으며, 보다 더욱 구체적으로 쉬와넬라 코랄리이 또는 쉬와넬라 오나이덴시스로부터 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 일예로, 본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체의 아미노산 서열은 쉬와넬라 코랄리이 유래 WP_115137742.1 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 WP_011072781.1일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 쉬와넬라 속 미생물 유래의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것은 자명하다.

본 출원에서 용어, "쉬와넬라(Shewanella) 속 미생물"은 해양 박테리아의 하나로, 산소가 있거나 없는 환경 조건에서 모두 서식할 수 있으며, 크롬, 우라늄과 같은 독성 금속의 환원을 유도해 이를 침전시키는 기능을 가진 세균으로 알려져 있다.

본 출원에 있어서, 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.

본 출원에 있어서, 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80%, 80.3%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 유전자는 lysE 및/또는 argO로 명명된 유전자일 수 있다.

일예로, lysE 유전자 및/또는 argO 유전자는 쉬와넬라 코랄리이 유래 WP_115137742.1 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 WP_011072781.1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 다양한 쉬와넬라 속 미생물 유래의 lysE 유전자 및/또는 argO 유전자를 포함하는 것은 자명하다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열로 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).

본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.

본 출원의 균주는 자연적으로 L-오르니틴 생산능을 가지고 있는 균주 또는 L-오르니틴 생산능이 없는 균주에 L-오르니틴 생산능이 부여된 미생물일 수 있다. 일예로, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 서브유닛 F(Ornithine carbamoyltransferase subunit F, ArgF) 및/또는 아르기닌 억제자(Arginine repressor, ArgR)의 활성이 약화되거나; 및 또는 내재적 LysE 단백질이 결실된 미생물일 수 있고. 다른 일예로, 본 출원의 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 L-오르니틴 배출능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 균주는 본 출원의 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 포함하지 않는 코리네박테리움 속 균주 또는 야생형 코리네박테리움 속 균주에 비하여 L-오르니틴 생산능이 증가된 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 균주는 내재적 활성에 비하여 증가된 활성을 갖는 쉬와넬라 코랄리이 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질이 도입된 재조합 미생물로서, 상기 균주는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되어 L-오르니틴 배출능이 향상됨에 따라 L-오르니틴 생산능이 향상된 것일 수 있다. 즉, 본 출원의 균주는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가된 것일 수 있다.

그 예로, 상기 L-오르니틴 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, "쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 도입하지 않은 비변형 미생물"은 내재적 ArgF의 아미노산 서열 N-말단으로부터 55번째에 위치한 세린이 종결코돈으로 치환되고, 내재적 ArgR의 아미노산 서열 N-말단으로부터 47번째에 위치한 글루타메이트가 종결코돈으로 치환된, L-오르니틴 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주; 내재적 LysE가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주;일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-오르니틴 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 18% 이상, 약 18.9% 이상, 약 19% 이상, 약 19.1% 이상, 약 19.7% 이상, 약 20% 이상 또는 약 20.3% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주, 비변형 미생물 또는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되지 않은 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 L-오르니틴 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주, 비변형 미생물 또는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되지 않은 미생물에 비하여, L-오르니틴 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.10배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.18배 이상, 약 1.189배 이상, 약 1.19배 이상, 약 1.191배 이상, 약 1.197배 이상, 약 1.20배 이상 또는 약 1.203배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 본 명세서에 기재된 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질이 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 본 출원의 비변형 미생물은 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입 외 다른 단백질 또는 다른 유전자의 도입 또는 변형을 포함하는 균주를 제외하는 것은 아니다.

본 출원에서 용어 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 출원의 미생물은 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물; 또는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되도록 유전적으로 변형된 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 출원의 다른 일예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 출원의 미생물은 본 출원의 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 도입 외에, 공지의 방법으로 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체의 활성을 강화할 수 있다.

본 출원에서 용어, 폴리펩티드(그 예로, 각 효소의 명칭으로 특정된 단백질을 포함한다.)의 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.

상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.

상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).

구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 활성의 강화는

1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;

2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;

3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;

4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;

5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);

6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;

7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;

8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는

9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로,

상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.

상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.

상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.

이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위(engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보솜 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 또 다른 일예로, 본 출원의 미생물은, L-오르니틴 생합성 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 강화되거나, L-오르니틴 분해 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 약화되어 L-오르니틴 생산능이 강화된 미생물일 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 미생물은 내재적 ArgF의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argF 유전자가 추가로 결손된 미생물, 내재적 ArgR의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argR 유전자가 추가로 결손된 미생물 및/또는 LysE의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 lysE 유전자가 추가로 결손된 미생물일 수 있다.

상기 ArgF, ArgR 또는 LysE의 아미노산 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI의 Genebank 등에서 얻을 수 있다. 일예로, 본 출원의 ArgF의 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33618.1(서열번호 5) 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, ArgR의 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33619.1(서열번호 7) 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, LysE의 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33473.1(서열번호 9) 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 다양한 유래의 ArgF, ArgR 또는 LysE 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것은 자명하다.

다만, 상기 ArgF, ArgR 및/또는 LysE 단백질 활성의 약화 또는 argF, argR 및/또는 lysE 유전자의 결손은 한 가지 예로서 이에 제한되지 않으며, 본 출원의 미생물은 다양한 공지의 L-오르니틴 생합성 경로의 단백질 활성이 강화되거나 분해 경로의 단백질 활성이 약화된 미생물일 수 있다.

본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.

상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.

이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).

구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 활성의 약화는

1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;

2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;

3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);

4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);

5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;

6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;

7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;

8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는

9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

예컨대,

상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.

또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.

상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.

또한, 상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, L-오르니틴 생산방법을 제공한다.

본 출원의 L-오르니틴 생산 방법은 본 출원의 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함되도록 유전적으로 변형된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-오르니틴은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

본 출원의 L-오르니틴 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 L-오르니틴 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 배양된 미생물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.

상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-오르니틴을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-오르니틴을 회수할 수 있다.

또한, 본 출원의 L-오르니틴 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-오르니틴 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원의 미생물은, L-오르니틴 생합성 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 강화되거나, L-오르니틴 분해 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 약화되어 L-오르니틴 생산능이 강화된 미생물일 수 있다.

일예로, 본 출원의 미생물은 내재적 ArgF의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argF 유전자가 추가로 결손된 미생물, 내재적 ArgR의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argR 유전자가 추가로 결손된 미생물 및/또는 LysE의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 lysE 유전자가 추가로 결손된 미생물일 수 있다.

본 출원의 방법에서, 쉬와넬라 속 균주, LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 미생물 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물; 이를 배양한 배지; 또는 이들의 조합을 포함하는, L-오르니틴 생산용 조성물을 제공한다.

본 출원의 조성물은 L-오르니틴 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산용 코리네박테리움 속 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, 코리네박테리움 속 재조합 미생물의 L-오르니틴 생산 용도를 제공한다.

상기 쉬와넬라 속 균주, LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질, 도입, 코리네박테리움 속 미생물 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.

본 출원의 미생물은 외래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질이 도입됨에 따라 기존 비변형 미생물에 비해 L-오르니틴 생산능이 증대될 수 있다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.

실시예 1: L-오르니틴 배출 활성을 갖는 단백질 선정 및 플라스미드 제작

L-오르니틴 배출 활성이 높은 단백질로 쉬와넬라 코랄리이(Shewanella corallii) A687 유래의 막단백질인 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체(LysE/ArgO family amino acid transporter, WP_115137742.1) (서열번호 1) 및 쉬와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis) MR-1 유래의 막단백질인 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체(LysE/ArgO family amino acid transporter, WP_011072781.1) (서열번호 3)을 선정하고, 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 증폭하기 위해 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 상기 막단백질을 코딩하는 유전자 및 주변 핵산서열에 대한 정보(NC_004347.2)를 획득하였다. 해당 서열 정보를 기반으로 DNA 합성을 수행하였다(Cosmo genetech, Korea).

상기 선정된 쉬와넬라 코랄리이 A687 유래 막단백질 및 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 막단백질을 L-오르니틴 생산주에 도입하기 위한 벡터를 각각 제작하였다. 먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869(NZ_CP016335.1) 게놈 내부에 존재하는 트랜스포사제(transposase) 중 하나인 ANU34435.1를 삽입 위치로 사용하였다. 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 11과 12의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 13과 14의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다.

쉬와넬라 코랄리이 A687 유래 막단백질을 코딩하는 유전자 단편(서열번호 2)을 확보하기 위하여 합성된 DNA를 주형으로 서열번호 15와 16의 프라이머 쌍을 이용하고, gapA 프로모터를 확보하기 위하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA(NC_006958.1)를 주형으로 서열번호 19와 20의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 1분 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. 이때, PCR에는 Solg^TM Pfu-X DNA polymerase를 사용하였다.

쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 막단백질을 코딩하는 유전자 단편(서열번호 4)을 확보하기 위하여 합성된 DNA를 주형으로 서열번호 17과 18의 프라이머 쌍을 이용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.

증폭된 gapA 프로모터 부위, 쉬와넬라 코랄리이 A687 유래 막단백질을 코딩하는 유전자 단편 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 막단백질을 코딩하는 유전자 단편, homologous recombinant arm 유전자 단편 및 SalI 및 BamHI 제한효소로 절단된 벡터 pDCM2(WO2021-187781 A1)를 깁슨 어셈블리(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 쉬와넬라 코랄리이 A687 유래 막단백질 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 막단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 21과 22의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 plasmid prep kit(QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 추출하였고, 이 플라스미드를 각각 pDCM2-PgapA-Sco 및 pDCM2-PgapA-Son으로 명명하였다.

여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	서열명	서열(5' -> 3')
11	primer 1	CGGTACCCGGGGATCCTTTTAGATTCCCAGTGCAG
12	primer 2	CGCGTGGGCTTTGGGCTGAG
13	primer 3	TGCATTGGTGGAGCTAGCTG
14	primer 4	ATGCCTGCAGGTCGACGCTATGCAGTGGAGATGTC
15	primer 5_ Sco	CTTTAGAGGAGACACAACATGCAGACAGCATTTATTC
16	primer 6_ Sco	TAGCTCCACCAATGCATCAACCTTTAATATATGGC
17	primer 5_Son	CTTTAGAGGAGACACAACATGCAAACGGCGTTTATTC
18	primer 6_Son	TAGCTCCACCAATGCATTAAATTGCGGCAAGGTAT
19	primer 7	GCCCAAAGCCCACGCGAACGACCGAGCCTATTGGG
20	primer 8	GTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG
21	primer 9	TATTACGCCAGCTGGCGAAA
22	primer 10	GCTTTACACTTTATGCTTCC

실시예 2: L-오르니틴 생산 균주 및 lysE 결손 균주 제작

L-오르니틴 생산 균주를 제작하기 위하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 ArgF(ANU33618.1) (서열번호 5)의 아미노산 서열 N-말단으로부터 55번째에 위치한 세린을 종결코돈으로 치환하는 벡터를 제작하였다. 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 23과 24의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 25와 26의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다. 이후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDCM2-argF(S55*)라고 명명하였다.

L-오르니틴 생산능이 더 향상된 균주를 제작하기 위하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 ArgR(ANU33619.1) (서열번호 7)의 아미노산 서열 N-말단으로부터 47번째에 위치한 글루타메이트를 종결코돈으로 치환하는 벡터를 제작하였다. 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 27과 28의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 29와 30의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다. 이후 상기 표기된 방법으로 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDCM2-argR(E47*)라고 명명하였다.

pDCM2-argF(S55*) 벡터를 이용하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869를 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 ArgF의 아미노산 서열 N-말단으로부터 55번째에 위치한 세린이 종결코돈으로 치환된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 23과 26의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 C. gl::argF*로 명명하였다.

C. gl::argF*에 pDCM2-argR(E47*)벡터를 형질전환하여 상기와 동일한 방법으로 ArgR의 아미노산 서열 N-말단으로부터 47번째에 위치한 글루타메이트가 종결코돈으로 치환된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 27과 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 C. gl::argF*_argR*로 명명하였다.

다음으로, LysE 결손 균주를 제작하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 LysE(ANU33473.1) (서열번호 9)의 ORF(open reading frame)를 결손하는 벡터를 제작하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈을 주형으로 서열번호 31과 32의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 33과 34의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다. Homologous recombinant arm 유전자 단편을 SalI 및 BamHI 제한효소로 절단된 벡터 pDCM2에 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 21과 22의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 plasmid prep kit (QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 추출하였고, 이 플라스미드를 pDCM2-△lysE로 명명하였다.

L-오르니틴 생산주인 C. gl::argF*_argR*에 pDCM2-△lysE 플라스미드를 전기천공법으로 형질전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 LysE를 코딩하는 유전자(lysE)가 결손된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 31과 34의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 C. gl::argF*_argR*_△lysE로 명명하였다.

여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

서열번호	서열명	서열(5' -> 3')
23	primer 11	CGGTACCCGGGGATCCTGACCCCAGGCAAGCACGG
24	primer 12	GAAGCGAGTACGAGTTTAAGTCTTATC
25	primer 13	AAACTCGTACTCGCTTCTCC
26	primer 14	ATGCCTGCAGGTCGACCGGCGCCGGCAACCTCGTC
27	primer 15	CGGTACCCGGGGATCCCTCGTGCGGAATTCGTGGAG
28	primer 16	ATCCAGCAGCAATTCAGACA
29	primer 17	CTGAATTGCTGCTGGATTAAGGCATCGATATCACCCA
30	primer 18	ATGCCTGCAGGTCGACCCTTCATTTTAAGTTCCTTG
31	primer 19	CGGTACCCGGGGATCCATTGCCTCACCAAAACCTTC
32	primer 20	CGTGACCTATGGAAGTACTTAAG
33	primer 21	GTACTTCCATAGGTCACGTTAGTTTTCGCGGGTTTTAG
34	primer 22	ATGCCTGCAGGTCGACGTTTTGGTGGTTCCCGAAAG

실시예 3: 외래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 유전자 도입 균주 제작

외래 막단백질 유전자 도입 균주를 제작하기 위해 상기 실시예 1에서 제작된 pDCM2-PgapA-Sco 벡터 및 pDCM2-PgapA-Son 벡터를 상기 실시예 2에서 제작된 L-오르니틴 생산 균주 C. gl::argF*_argR* 및 lysE 결손 균주인 C. gl::argF*_argR*_△lysE에 전기천공법으로 각각 형질전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 PgapA-Sco가 삽입된 균주 및 PgapA-Son가 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 26과 29의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 각각 C. gl::argF*_argR*_PgapA-Sco, C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Sco, C. gl::argF*_argR*_PgapA-Son 및 C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Son으로 명명하였다.

실시예 4: 외래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 도입 균주 L-오르니틴 생산능 비교

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 및 상기 실시예 3에서 제작된 균주와 상기 실시예 2에서 제작된 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여, 균체량, 당소모능, L-오르니틴 생산능을 비교하였다.

먼저, 종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종배양액을 접종하고 33℃에서 42 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-오르니틴의 생산량을 측정하고 그 결과를 하기 표 3 및 4에 나타내었다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 22 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

원당 50 g, (NH₄)₂SO₄ 25 g, 효모추출물 1 g, KH₂PO₄ 0.55 g, Mg_SO₄·7H₂O 0.6 g, L-아르지닌 0.2 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 염산염 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO₄ 9 mg, FeSO₄ 9 mg, ZnSO₄ 0.45 mg, CuSO₄ 0.45 mg, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

균 주	OD562	소모당 (g/L)	L-오르니틴 생산량 (g/L)	L-오르니틴 수율(%)
C. glutamicum WT	95.0	50.0	0.0	0.0
C. gl::argF*_argR*	37.7	50.0	17.8	35.6
C. gl::argF*_argR*_△lysE	66.6	50.0	1.2	2.4
C. gl::argF*_argR*_PgapA-Sco	36.3	50.0	19.7	39.4
C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Sco	38.1	50.0	18.9	37.8

균 주	OD562	소모당 (g/L)	L-오르니틴 생산량 (g/L)	L-오르니틴 수율(%)
C. glutamicum WT	96.2	50.0	0.0	0.0
C. gl::argF*_argR*	37.6	50.0	17.9	35.8
C. gl::argF*_argR*_△lysE	66.5	50.0	1.3	2.6
C. gl::argF*_argR*_PgapA-Son	37.5	50.0	20.3	40.6
C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Son	38.7	50.0	19.1	38.2

상기 표 3에 나타난 바와 같이, lysE 결손주에 외래 막단백질로서 쉬와넬라 코랄리이 A687 유래의 막단백질인 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Sco 균주는 lysE 결손주 C. gl::argF*_argR*_△lysE 균주와 비교하여 L-오르니틴 생산능 및 L-오르니틴 수율이 현저히 증가되었다. 또한, 쉬와넬라 코랄리이 A687 유래 막단백질이 도입된 C. gl::argF*_argR*_PgapA-Sco 균주는 C. gl::argF*_argR*와 비교하여 증가된 L-오르니틴 생산능 및 L-오르니틴 수율을 보였다.

또한, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, lysE 결손주에 외래 막단백질로서 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래의 막단백질인 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 C. gl::argF*_argR*_△lysE_PgapA-Son 균주는 lysE 결손주 C. gl::argF*_argR*_△lysE 균주와 비교하여 L-오르니틴 생산능 및 L-오르니틴 수율이 현저히 증가되었다. 또한, 쉬와넬라 오나이덴시스 MR-1 유래 막단백질이 도입된 C. gl::argF*_argR*_PgapA-Son 균주는 C. gl::argF*_argR*와 비교하여 증가된 L-오르니틴 생산능 및 L-오르니틴 수율을 보였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism producing L-ornithine and L-ornithine production method using the same <130> KPA211809-KR <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Shewanella corallii A687 LysE/ArgO family amino acid transporter AA <400> 1 Met Gln Thr Ala Phe Ile Gln Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ile 1 5 10 15 Met Ala Val Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Lys Gln Gly Ile Lys 20 25 30 Arg Ser Tyr Pro Leu Pro Ile Ala Ile Leu Cys Ser Ile Ile Asp Ala 35 40 45 Leu Met Ile Thr Ala Gly Val Met Gly Leu Gly His Leu Ile Thr Ser 50 55 60 Met Pro Met Ile Lys His Leu Ala Ser Phe Gly Gly Ala Ile Phe Leu 65 70 75 80 Ile Trp Tyr Gly Ala Asn Ala Leu Arg Asp Ser Phe Arg Ser Lys Gly 85 90 95 Leu Asp Leu His Gln Glu Gln Gly Ala Asp Thr Leu Arg Lys Ala Val 100 105 110 Leu Thr Thr Leu Gly Ile Ser Leu Leu Asn Pro His Leu Tyr Leu Asp 115 120 125 Thr Val Val Leu Leu Gly Ser Ile Ser Thr Gln Phe Asp Asp Thr Val 130 135 140 Arg Pro Trp Phe Gly Ala Gly Ala Ile Leu Ala Ser Phe Leu Trp Phe 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Leu Leu Gly Pro Leu Phe Glu Lys 165 170 175 Pro Val Ala Trp Arg Ile Leu Asp Arg Phe Ile Cys Leu Thr Met Trp 180 185 190 Ser Ile Ala Val Ala Leu Met Trp Pro Tyr Ile Lys Gly 195 200 205 <210> 2 <211> 618 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Shewanella corallii A687 LysE/ArgO family amino acid transporter NT <400> 2 atgcagacag catttattca aggtataggt ataggtggca gcctgatcat ggctgttggt 60 gcgcagaacg cgttcgtgct caaacagggg attaaacgca gctatccgct gcccattgcc 120 attttgtgtt caatcataga cgcattgatg attactgccg gtgtgatggg cctcgggcat 180 ttgatcacca gtatgcccat gattaagcat ctggccagct ttggtggtgc catattcctt 240 atctggtatg gggctaatgc acttagagac tccttcagga gcaaaggcct ggatctgcac 300 caggagcagg gggctgatac cttgagaaaa gcggtattga ctacgcttgg gatcagtttg 360 ctgaatccgc atctgtatct ggatactgtg gtgctgctgg gcagtatcag tactcagttt 420 gatgacacag tgcgtccctg gtttggtgcc ggggctatat tggcgtcctt cctgtggttc 480 tttagcctga gctttggtgc acgcttgttg ggacctttat ttgaaaagcc ggtcgcgtgg 540 cggatattgg acaggtttat ctgtctgacc atgtggagta tcgcagtggc cctgatgtgg 600 ccatatatta aaggttga 618 <210> 3 <211> 206 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Shewanella oneidensis MR-1 LysE/ArgO family amino acid transporter AA <400> 3 Met Gln Thr Ala Phe Ile Gln Gly Met Gly Ile Gly Gly Ser Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ala Val Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Lys Gln Gly Ile Lys 20 25 30 Arg Ala Tyr Pro Leu Pro Ile Ala Leu Leu Cys Ser Ile Ile Asp Ala 35 40 45 Leu Met Ile Thr Ala Gly Val Ala Gly Leu Gly His Ile Ile Glu Thr 50 55 60 Phe Pro Thr Ile Lys His Val Ala Ser Phe Gly Gly Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Trp Tyr Gly Ala Asn Ala Leu Lys Ala Ser Phe Val Thr Lys Gly 85 90 95 Met Glu Met Asp His Ala Gln Asn Ala Asp Thr Leu Arg Lys Ala Ile 100 105 110 Leu Thr Thr Leu Gly Ile Ser Leu Leu Asn Pro His Leu Tyr Leu Asp 115 120 125 Thr Val Val Leu Leu Gly Ser Ile Ser Thr Gln Phe Glu Asp Ala His 130 135 140 Arg Pro Trp Phe Gly Ala Gly Ala Val Leu Ala Ser Phe Ile Trp Phe 145 150 155 160 Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Leu Leu Ala Pro Ile Phe Ser Arg 165 170 175 Pro Ala Ala Trp Arg Tyr Leu Asp Arg Phe Ile Trp Leu Thr Met Trp 180 185 190 Ser Ile Ala Ala Ala Ile Ile Trp Pro Tyr Leu Ala Ala Ile 195 200 205 <210> 4 <211> 621 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Shewanella oneidensis MR-1 LysE/ArgO family amino acid transporter NT <400> 4 atgcaaacgg cgtttattca aggtatgggc attggtggta gtttgattat tgccgtaggg 60 gcgcaaaatg ctttcgtgct aaagcaaggg attaagcgtg cttacccttt gccgattgcg 120 ctgctttgtt cgattatcga tgccttgatg attaccgcgg gtgtggcagg gcttgggcat 180 attattgaga cctttccgac cattaagcac gtggcgagtt ttggtggtgc ggcttttttg 240 atttggtacg gtgccaatgc gcttaaggcc tcttttgtta ccaaggggat ggagatggat 300 cacgcgcaaa atgctgatac tctgcgtaaa gccatcttga ccaccctagg cataagtcta 360 ctcaatccac acctttattt agatactgtg gtgttgcttg gtagtatcag tactcagttt 420 gaagatgctc accgtccttg gtttggcgcc ggtgcagtat tggcttcttt tatttggttc 480 tttagcctaa gttttggtgc acgtttgttg gcgcctattt ttagtcgtcc agcggcatgg 540 cgttatttag accgctttat ttggctgacg atgtggagca ttgctgcggc cattatctgg 600 ccataccttg ccgcaattta a 621 <210> 5 <211> 319 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ArgF WT AA <400> 5 Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu 1 5 10 15 Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys 20 25 30 Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala 35 40 45 Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu 85 90 95 Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn 100 105 110 Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu 115 120 125 Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile 130 135 140 Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys 145 150 155 160 Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr 165 170 175 Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro 180 185 190 Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu 210 215 220 Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly 225 230 235 240 Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln 245 250 255 Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu 260 265 270 His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile 275 280 285 Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His 290 295 300 Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala His Gln Pro Arg 305 310 315 <210> 6 <211> 960 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> argF WT NT <400> 6 atgacttcac aaccacaggt tcgccatttc ctggctgatg atgatctcac ccctgcagag 60 caggcagagg ttttgaccct agccgcaaag ctcaaggcag cgccgttttc ggagcgtcca 120 ctcgagggac caaagtccgt tgcagttctt tttgataaga cttcaactcg tactcgcttc 180 tccttcgacg cgggcatcgc tcatttgggt ggacatgcca tcgtcgtgga ttccggcagc 240 tcacagatgg gtaagggcga gaccctgcag gacaccgcag ctgtattgtc ccgctacgtg 300 gaagcaattg tgtggcgcac ctacgcacac agcaatttcc acgccatggc ggagacgtcc 360 actgtgccac tggtgaactc cttgtccgat gatctgcacc catgccagat tctggctgat 420 ctgcagacca tcgtggaaaa cctcagccct gaagaaggcc cagcaggcct taagggtaag 480 aaggctgtgt acctgggcga tggcgacaac aacatggcca actcctacat gattggcttt 540 gccaccgcgg gcatggatat ctccatcatc gctcctgaag ggttccagcc tcgtgcggaa 600 ttcgtggagc gcgcggaaaa gcgtggccag gaaaccggcg cgaaggttgt tgtcaccgac 660 agcctcgacg aggttgccgg cgccgatgtt gtcatcaccg atacctgggt atccatgggt 720 atggaaaacg acggcatcga tcgcaccaca cctttcgttc cctaccaggt caacgatgag 780 gtcatggcga aagctaacga cggcgccatc ttcctgcact gccttcctgc ctaccgcggc 840 aaagaagtgg cagcctccgt gattgatgga ccagcgtcca aagttttcga tgaagcagaa 900 aaccgcctcc acgctcagaa agcactgctg gtgtggctgc tggcccacca gccgaggtaa 960 960 <210> 7 <211> 171 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ArgR WT AA <400> 7 Met Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val 1 5 10 15 Thr Arg Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln 20 25 30 Lys Val Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly 35 40 45 Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly 50 55 60 Ala Arg Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly 65 70 75 80 Pro Val Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys 85 90 95 Leu Arg Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly 100 105 110 Asn Ile Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala 115 120 125 Ser Phe Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala 130 135 140 Gly Asp Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys 145 150 155 160 Glu Leu Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr 165 170 <210> 8 <211> 516 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> argR WT NT <400> 8 atgtcccttg gctcaacccc gtcaacaccg gaaaacttaa atcccgtgac tcgcactgca 60 cgccaagctc tcattttgca gattttggac aaacaaaaag tcaccagcca ggtacaactg 120 tctgaattgc tgctggatga aggcatcgat atcacccagg ccaccttgtc ccgagatctc 180 gatgaactcg gtgcacgcaa ggttcgcccc gatgggggac gcgcctacta cgcggtcggc 240 ccagtagata gcatcgcccg cgaagatctc cggggtccgt cggagaagct gcgccgcatg 300 cttgatgaac tgctggtttc tacagatcat tccggcaaca tcgcgatgct gcgcaccccg 360 ccgggagctg cccagtacct ggcaagtttc atcgataggg tggggctgaa agaagtcgtt 420 ggcaccatcg ctggcgatga caccgttttc gttctcgccc gtgatccgct cacaggtaaa 480 gaactaggtg aattactcag cgggcgcacc acttaa 516 <210> 9 <211> 236 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> LysE WT AA <400> 9 Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly 20 25 30 Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser 35 40 45 Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser 50 55 60 Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn 85 90 95 Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro 100 105 110 Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn 115 120 125 Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys 130 135 140 Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp 165 170 175 Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile 180 185 190 Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val 210 215 220 Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 235 <210> 10 <211> 711 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> lysE WT NT <400> 10 ctaacccatc aacatcagtt tgatggccaa tgcggtcatc acaactgcca cgacgacgtt 60 gatccagcgc cacaccttgg ggctggacag cgggcgtgac aatgctgctg cgccgaaacc 120 caccagcggg aaccagatca ggcttgccgc gaacgcgcca gcggcgaaaa tccaccgtcc 180 ggtgtcgccg tattgcgcgc cgacgccgcc gataaacaca aacgcgtcca aatacgcatt 240 cgggttcaac caggtcagca cgattgccat caacatgggc ttcacccaaa cccgctgctt 300 atcgacgctc acctccaccc gcacccggtt gcgcgtgtca gtggccaccg ccgaaccgcc 360 caaaggcgtg tcatcgggca cggttggttc tgtttcttca atgatctgtg gcgcttccac 420 cttgtttgtc atggcgtctt tcgctgccat gacggcaaac cataacaggt aagcgatgcc 480 accccagcgc ataatatcga gcacgatcgg cgcggcattg gacaaaagat caacgcccaa 540 ggtgccggcg atgaacaaaa agacgtcaga aattaaacac acgagaagaa ccgcaatgag 600 tccttcgcgc ttaattcctt gtttaatcac cagtacattc tgcggtccga tggacagcaa 660 aagactggcc cccaaaagca gacctgtaat gaagatttcc atgatcacca t 711 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 11 cggtacccgg ggatcctttt agattcccag tgcag 35 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 12 cgcgtgggct ttgggctgag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 13 tgcattggtg gagctagctg 20 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 14 atgcctgcag gtcgacgcta tgcagtggag atgtc 35 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5_ Sco <400> 15 ctttagagga gacacaacat gcagacagca tttattc 37 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6_ Sco <400> 16 tagctccacc aatgcatcaa cctttaatat atggc 35 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5_Son <400> 17 ctttagagga gacacaacat gcaaacggcg tttattc 37 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6_Son <400> 18 tagctccacc aatgcattaa attgcggcaa ggtat 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 19 gcccaaagcc cacgcgaacg accgagccta ttggg 35 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 20 gttgtgtctc ctctaaagat tg 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 21 tattacgcca gctggcgaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 22 gctttacact ttatgcttcc 20 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 23 cggtacccgg ggatcctgac cccaggcaag cacgg 35 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 24 gaagcgagta cgagtttaag tcttatc 27 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 25 aaactcgtac tcgcttctcc 20 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 26 atgcctgcag gtcgaccggc gccggcaacc tcgtc 35 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 27 cggtacccgg ggatccctcg tgcggaattc gtggag 36 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16 <400> 28 atccagcagc aattcagaca 20 <210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17 <400> 29 ctgaattgct gctggattaa ggcatcgata tcaccca 37 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18 <400> 30 atgcctgcag gtcgaccctt cattttaagt tccttg 36 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 19 <400> 31 cggtacccgg ggatccattg cctcaccaaa accttc 36 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 20 <400> 32 cgtgacctat ggaagtactt aag 23 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 21 <400> 33 gtacttccat aggtcacgtt agttttcgcg ggttttag 38 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 22 <400> 34 atgcctgcag gtcgacgttt tggtggttcc cgaaag 36

Claims (12)

1. 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴을 생산능을 가지는, 코리네박테리움 글루타미쿰 재조합 미생물로서,
   상기 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 쉬와넬라 속 균주는 쉬와넬라 코랄리이 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 균주인, 미생물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 서브유닛 F의 활성이 약화된 것인, 미생물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 아르기닌 억제자의 활성이 약화된 것인, 미생물.
   
6. 삭제
7. 쉬와넬라 속 균주 유래 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 또는 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, L-오르니틴 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, L-오르니틴 생산방법으로서,
   상기 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖고 LysE/ArgO 패밀리 아미노산 수송체 단백질 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, L-오르니틴 생산방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 쉬와넬라 속 균주는 쉬와넬라 코랄리이 또는 쉬와넬라 오나이덴시스 균주인, 방법.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 서브유닛 F의 활성이 약화된 것인, 방법.
    
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 아르기닌 억제자의 활성이 약화된 것인, 방법.
    
12. 삭제