PT2059521E - Pirazolo [1,5-a pirimidinas], processos, usos e composições - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PIRAZOLO [1,5-A PIRIMIDINAS], PROCESSOS, USOS E COMPOSIÇÕES

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção dirige-se a agentes com afinidade com receptores GABAa, especificamente a pirazolo [1,5-a pirimidinas] e, mais especificamente a N-{2-substituído-5-[substituído-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamidas e N-{2-substituído-5-[3-substituido-pirazolo [1,5-a]pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-metanosulfonamidas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 receptor GABAa (ácido g-aminobutirico) é uma proteína pentamérica que constitui um canal iónico de membrana. 0 receptor GABAa é implicado na regulação da sedação, ansiedade, tónus muscular, actividade epileptogénica e funções de memória. Essas acções são definidas por subunidades do receptor GABAa, particularmente subunidades al e a2 q.b. A sedação é modulada pela subunidade al. Zolpidem é caracterizada por uma elevada afinidade com os receptores al e sua acção sedativa e hipnótica é mediada por esses receptores in vivo. Da mesma forma, a acção hipnótica do zaleplon é também mediada pelos receptores al. A acção ansiolítica do diazepam é mediada pelo aumento da transmissão GABAérgica numa população de neurónios que expressam os receptores a2. Isso indica que os receptores a2 são alvos altamente específicos para o tratamento da ansiedade. 1 0 relaxamento muscular no diazepam é mediada principalmente por receptores cx2, uma vez que estes receptores apresentam uma expressão altamente específica na medula espinhal. 0 efeito anticonvulsivante de diazepam é parcialmente devido aos receptores cxl. Em diazepam, um composto que prejudica a memória, a amnésia anterógrada é mediado por receptores cxl. 0 receptor GABAa e as suas subunidades cxl e cx2 têm sido amplamente revistas por H. et al Mõhler. (J. Pharmacol. Exp. There. , 300, 2-8, 2002); Mõhler H. et al. (Curr. Opin. Pharmacol., 1, 22-25, 2001); U. Rudolph et al. (Nature, 401, 796-800, 1999) e DJ Nutt et al. (J. Psychiatry Br., 179, 390-396, 2001) .

Diazepam e outros benzodiazepínicos clássicos são amplamente usados como agentes ansiolíticos, hipnóticos, anticonvulsivantes e relaxantes musculares. Os seus efeitos colaterais incluem a amnésia anterógrada, diminuição da actividade motora e potencialização dos efeitos do etanol.

Nesse contexto, os compostos da presente invenção são os ligantes de receptor GABAa cxl-e cx2 para a sua aplicabilidade clínica em transtornos do sono, de preferência, insónia, ansiedade e epilepsia. A insónia é uma doença altamente prevalente. A sua cronicidade afecta 10% da população e 30% quando a insónia transitória é também computorizada. A insónia descreve a dificuldade em conseguir dormir ou permanecer adormecido, e está associado aos efeitos ao dia de ressaca, tais como cansaço, falta de energia, baixa concentração e irritabilidade. O impacto social e de saúde desta queixa é 2 importante e resulta em evidentes repercussões socioeconómicas. A terapia farmacológica no tratamento da insónia inclui em primeiro lugar os barbitúricos e hidrato de cloral, mas estes medicamentos provocam inúmeros efeitos adversos conhecidos, por exemplo, toxicidade de overdose, indução metabólica, e aumento de dependência e tolerância. Além disso, afectam a arquitectura do sono, diminuindo, sobretudo, a duração e o número de estágios de sono REM. Mais tarde, o uso de benzodiazepinicos significou um importante avanço terapêutico devido à sua menor toxicidade, mas mostrou ainda sérios problemas de dependência, relaxamento muscular, amnésia e insónia rebote após a interrupção da medicação. A última abordagem terapêutica conhecida foi a introdução de hipnóticos não benzodiazepinicos, como pirrolo [3,4-b] pirazinas (zopiclone), imidazo[1,2-a] piridinas (zolpidem) e, finalmente, pirazolo [1,5-a] pirimidinas (zaleplon). Posteriormente, dois novos pirazolo[1,5-a]pirimidinas] , indiplon e ocinaplon, ter entrado em desenvolvimento, este último com um pouco de acção ansiolitica. Todos estes compostos apresentam uma rápida indução do sono e tem menos dias de efeitos de, menor potencial de abuso e menor risco de insónia de rebote do que as benzodiazepinas. 0 mecanismo de acção desses compostos é a activação alostérica do receptor GABAa através da sua ligação ao sitio de ligação benzodiazepinico (C.F.P. George, The Lancet, 358, 1623-1626, 2001). Embora os benzodiazepinicos sejam ligantes inespecificos no receptor GABAa sitio de ligação, o zolpidem e o zaleplon mostram uma maior selectividade para a subunidade al. Apesar disso, esses medicamentos ainda afectam 3 a arquitectura do sono e pode induzir a dependência em tratamentos de longo prazo.

Uma grande variedade de relacionados pirazolo [1,5-a pirimidinas] foram divulgados em publicações de patentes US4178449, US4281000, US4521422 (2-piridinil[7-(4-piridinil) pirazolo [1,5-a] pirimidina- 3 - il-metanona], ocinaplon), US 4576943, US4626538 (N-{3-[3-(cianopirazol[1,5-a]pirimidina -7-il]fenil}-N-etilacetamida, zaleplon), US4654347, US6399621 (N-{3-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metil-acetamida, indiplon), W02005014596, W020050- 14597 e WO 2006136530. A investigação de novos compostos activos na gestão de insónia responde a uma necessidade de saúde subjacente, porque até recentemente os hipnóticos introduzidos ainda afectam a arquitectura do sono e pode induzir a dependência em tratamentos de longo prazo. É desejável, portanto, concentrar esforços no desenvolvimento de novos agentes hipnóticos com um menor risco de efeitos secundários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores encontram novos pirazolo [1,5-a]pirimidinas, que são activos contra GABAa e, particularmente, contra seu as suas subunidades al e a2. Consequentemente, os compostos da presente invenção são úteis no tratamento e na prevenção de todas essas doenças mediadas pelo receptor GABAa e as subunidades al e a2. Exemplos não limitativos de indicações relevantes dos compostos desta invenção são todas aquelas doenças ou condições, tais como insónia ou anestesia, em que 4 a indução do sono, uma indução da sedação ou indução de relaxamento muscular são necessários. 0 Zaleplon, o pirazolo [1,5-a]pirimidina composto de referência], é um composto estruturalmente semelhantes aos compostos da presente invenção. No entanto o zaleplon, apresenta extensa biotransformação devido a um aldeidooxidase (BG Lake et al. Metabolismo de zaleplon pelo figado humano: evidências para o envolvimento da aldeido-oxidase,

Xenobiotica, 2002 Oct., 32 (10) :835-47, e K. Kawashima et al. O aldeido oxidase dependente da diferença de espécies assinaladas no metabolismo hepático do zaleplon sedativo-hipnótico, entre macacos e ratos, Drug. Metab Dispôs. 1999 Mar; 27 (3) :422-8). Embora o outro pirazolo [1,5-]pirimidina com uma melhor estabilidade metabólica do que zaleplon é conhecida na técnica indiplon, este composto tem a desvantagem de ter mais efeitos toxicológicos, como mostrado através de testes de viabilidade celular. A susceptibilidade para a biotransformação de compostos está relacionada com sua estabilidade metabólica, ou seja, com a meia-vida do medicamento no corpo e se forma metabólitos. Estes são parâmetros importantes para avaliar a biodisponibilidade, toxicidade e potencial dosagem de interacção medicamento-medicamento, que, por sua vez, são parâmetros importantes na determinação do seu potencial para uso humano. Neste contexto, os compostos com a estabilidade metabólica máxima minimizam o potencial para interacções medicamento-medicamento e necessitam de menos intervalos de dosagem frequentes.

Os compostos da presente invenção mostram menos biotransformações inesperadas, ou seja, maior estabilidade 5 metabólica do que os outros conhecidos relacionadas com pirazolo[1,5-a]pirimidinas] , o que melhora o perfil farmacocinético facilitando a manutenção do efeito farmacológico e confere uma indicação insuspeita para a manutenção completa de uma noite de sono. Esta propriedade está relacionada com a substituição no anel fenila, ou seja, substituintes R3 e R4. Especialmente bons são os compostos que suportam electrão retirando os substituintes do anel fenil.

Além disso, os compostos da invenção actual, como ilustrado nos exemplos, também mostram uma boa sedação/actividade terapêutica hipnótica in vivo e baixos efeitos toxicológicos, como demonstrado em testes de viabilidade celular.

Assim, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I) :

e sais farmaceuticamente aceitáveis e seus hidratos, que são ligantes de receptor GABAa onde R e Ri representa alquilo (Ci— C6) , R2 é seleccionado do grupo que consiste em ciano, nitro e tiofeno-2-carbonil, R3 é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio e halogéneo, R4 é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, halogéneo, alquilo (Ci-C6) e alcóxi (C1-C6), R5 é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio e alquilo (C1-C6 ) , e Y é seleccionado do grupo consistindo em 6 -CO- e -SO2-, e sais f armaceuticamente aceitáveis e seus hidratos. É um outro objecto desta invenção fornecer novos métodos de tratar ou prevenir a ansiedade, a epilepsia e distúrbios do sono, incluindo a insónia, e de induzir a hipnose, sedação, anestesia, sono e relaxamento muscular através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos ditos compostos ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato dos mesmos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como dito acima, a presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I):

e sais farmaceuticamente aceitáveis e seus hidratos, onde R, Ri, R2, R3, R^ R5 e Y são como mencionado acima. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" aqui utilizado abrange qualquer sal formado a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos, tais como bromidrico, clorídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, acético, adípico, aspártico, benzenossulfónico, cítrico, etanossulfónico, fórmico, fumárico, ácido glutâmico, láctico, maleico, maleico, malónico, mandélico, metanossulfónico, 1,5- 7 naftalenodissulfónico, oxálico, piválico, propiónico, p- toluenesulfonic, succínico, ácido tartárico ácidos benzóico e assim por diante.

Os compostos específicos da fórmula (I) são seleccionados do grupo que consiste em: N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N metilacetamida; N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N metilacetamida; N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N metilacetamida; N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N metilacetamida; N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]-fenil}-N-metil metanossulfonamida; N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil metanossulfonamida; N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metilmetanossulfonamida; N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il ] fenil}-N-metil metanossulfonamida; N-{2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il] fenil}-N-metilacetamida; N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]-7pirimidina-il] fenil}-N-metilacetamida; N-{2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7- il] fenil}--N-metil metanossulfonamida; N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metil metanossulfonamida; [N-2-meti1-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-Nmetil-acetamida; 8 {N-2-meti1-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[l,5-a] pirimidina-7-il] fenil}-Nmetil-acetamida; N-{2,4 difluoro-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-Nmetil-acetamida, e N-{5-fluoro-2-metoxi-3-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo [1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida.

Os seguintes esquemas de reacção ilustram a preparação dos compostos da presente invenção.

(II) (III)

Esquema I R, Ri, R2, R3, R4, R5 e Y são como descritos acima, e Q é um apropriado grupo de deixar seleccionado a partir do grupo que consiste em N(dialquilo(Ci-C6)), alquiltio (Οι-Οε) alcóxi e (Ci-C6) . De preferência Q é seleccionado a partir do grupo consistindo em dimetilamino, metiltio ou metoxi. A reacção de aminopirazole da fórmula geral (III), com uma adequada substituição l-aril-2-propensão-l-ona (II) é realizada num material inerte polar aprótico ou solvente prótico, como o ácido acético, etanol, metanol, a Dimetilformamida ou dimetilsulfóxido a uma temperatura variando entre 50° e 130° C. Após decorrido várias horas (tempo de reacção), o solvente é removido e o resíduo obtido é dividido entre uma solução aquosa de bicarbonato de sódio e diclorometano. O petróleo bruto resultante da evaporação da 9 camada orgânica à seca pode ser purificado por um dos seguintes métodos: (a) de silica gel utilizando cromatografia em acetato de etila e diclorometano/metanol como eluente, ou (b) cristalização num solvente adequado (acetato de etila, etanol, metanol, etc.) 0 intermediário da fórmula (II), quando Q é dimetilamino [intermediário (VI)] pode ser obtido após a sequência de reacção mostrado no Esquema 2

Esquema 2 onde R, Ri, R3, R4 e Y sao como descritos acima.

Os intermediários da fórmula (IV) quando Y é um grupo sulfonila são preparados de acordo com o método descrito por Uloth RH et al. (J. Med. Chem. 9, 88-96, 1966) . A alquilação dos intermediários (IV) leva a que os intermediários de fórmula (V) sejam executados, de acordo com métodos conhecidos por especialistas em Quimica Orgânica, através da formação de um anião e subsequente reacção com um halogeneto de alquilo. 10

As enaminonas de fórmula (V') e (VI) são preparadas de acordo com procedimentos sintéticos gerais de enaminas descritos por J. M. Domagala et ai (J. Heterocyclic Chem., 26 (4), 1147-58, 1989); e K. Sawada et ai (Chem. Pharm. Buli., 49(7), 799-813, 2001) através da reacção de uma acetofenona com demetilacetal N,N-dimetilformamida (DMFDMA) ou com o reagente de Bredereck (tert-butoxibix(dimetilamino)metano).

Os intermediários de fórmula (II), quando Q é dimetilamino e R2 é metilo (VII), podem alternativamente ser preparados de acordo com o Esquema 3

Esquema 3 em que R, R3 e R4 sao como definidos acima. A conversão de (IV) em (VII) conduz à formação da enaminona e, simultaneamente, à formação da N-metil-sulfonamida como resultado da utilização das propriedades do dimetil acetal N,N-dimetilformamida como um agente de metilação.

Os intermediários da fórmula (II), quando Q é dimetilamino, e Ri é metila (X) , também pode ser preparada de acordo com o esquema 4 11

E squema 4

(IX) em que R, R3, R4 e Y sao como definidos acima. A vantagem deste processo baseia-se no facto da formulação da sulfonamida ou carboxamida ocorrer na última fase do processo. Como resultado, o número total de passos reaccionais é reduzido na preparação de amplas séries de produtos. Além disso, como ilustrado no esquema, a conversão de (VIII) em (IX) conduz às seguintes reacções num processo levado a cabo num único recipiente: (a) formação da anaminona; (b) metilação da trifluoroacetamida; e (c) desacilação conduzindo à amina N-metilada. A reacção subsequente de (IX) com o cloreto de ácido sulfónico correspondente conduz à obtenção dos intermediários (X).

Os compostos da presente invenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou hidratos podem ser usados para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças associadas à modulação do receptor GABAa ou num mamífero humano ou não humano. Mais especificamente, doenças associadas à modulação do receptor GABAa incluem doenças 12 associadas à modulação do receptor GABAa al e/ou modulação do receptor GABAa cx2. A lista não limitativa de doenças tais como a ansiedade, a epilepsia, distúrbios do sono, incluindo a insónia, e assim por diante.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a ansiedade num mamífero humano ou não-humano.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de epilepsia em mamíferos humanos ou não-humanos em caso de necessidade.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir distúrbios do sono num mamífero humano ou não-humano em caso de necessidade.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a insónia de um mamífero humano ou não-humano em caso de necessidade. 13

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para induzir a sedação, hipnose num mamífero humano ou não-humano em caso de necessidade.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para induzir a anestesia num mamífero humano ou não humano que dele necessitem.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para modular tempo necessário para induzir o sono e a sua duração num mamífero humano ou não humano que dele necessitem.

Outra forma de realização da presente invenção é proporcionar a utilização de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para a preparação de um medicamento para induzir o relaxamento muscular num mamífero humano ou não humano que dele necessitem. A presente invenção refere-se também a um método de tratamento ou prevenção de um mamífero humano ou não humano do sofrimento de doenças associadas à modulação do receptor GABAa ou num mamífero humano ou não humano, que compreende a administração a mamíferos humanos ou não humanos que dela necessitem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção ou sais farmaceuticamente 14 aceitáveis ou hidratos dos mesmos, juntamente com diluentes ou transportadores farmaceuticamente aceitável. Mais especificamente, doenças associadas à modulação do receptor GABAa que incluem doenças associadas à modulação do receptor GABAa ai e/ou modulação do receptor GABAa a2. A lista não limitativa de doenças compreende tais como a ansiedade, a epilepsia, distúrbios do sono, incluindo a insónia, e assim por diante.

Como usado aqui, o termo mamífero refere-se à classe dos mamíferos vertebrados superiores. 0 termo "mamífero" inclui, mas não está limitado ao ser humano.

Outra forma de realização da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica contendo um composto da presente invenção ou sais farmaceuticamente aceitáveis e hidratos dos mesmos, em associação com transportadoras inertes terapêuticos.

As composições incluem aquelas adequadas para administração oral, rectal e parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), apesar da via mais adequada depender da natureza e qravidade do estado a ser tratado. A via mais preferida da presente invenção é a via oral. As composições podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária, e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. 0 composto activo pode ser combinado com um veículo farmacêutico de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais. 0 veículo pode tomar uma grande variedade de formas dependendo da forma da preparação desejada para formas dependendo na forma da preparação 15 desejada para administração, por exemplo, oral ou parenteral (incluindo injecções ou infusões intravenosas). Na preparação das composições para forma de dosagem oral pode ser utilizado qualquer meio farmacêutico usual. Meios farmacêuticos usuais incluem, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes, e semelhantes no caso de preparações liquidas orais (tais como por exemplo, suspensões, soluções, emulsões ou elixires); aerossóis; ou veículos tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes desintegrantes e semelhantes, no caso de preparações sólidas orais (tais como por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos) sendo as preparações sólidas orais preferidas em relação às preparações líquidas orais.

Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma de dose unitária oral mais vantajosa, sendo neste caso utilizados veículos farmacêuticos sólidos. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos por técnicas aquosas ou não aquosas convencionais.

Uma gama de dosagem adequada para utilização é de desde cerca de 0,01 mg a cerca de 100, 00 mg de dose diária total, fornecida como uma única administração diária ou em doses divididas se tal for necessário.

Os compostos da presente invenção têm uma elevada afinidade com os receptores GABAa al e a2. Os resultados in vitro são consistentes com os resultados obtidos in vivo em testes de hipnose-sedação. 16 A actividade farmacológica dos compostos da presente invenção foi determinada como mostrado abaixo. a) Ensaios de ligação de ligante. Determinação da afinidade dos compostos teste para receptor GABAa otl e a2

Utilizaram-se ratinhos Sprague-Dawley macho com um peso de 200-250 g na altura da experiência. Após decapitação do animal, foram removidos o cerebelo (tecido que contém principalmente receptores GABAa oíi) e a medula espinal (tecido que contém principalmente receptores GABAa (¾) · As membranas foram preparadas de acordo com o método de J. Lameh et al. (Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry, 24, 979-991, 2000). Uma vez pesados os tecidos, foram suspensos em Tris.HCl a 50 mM (pH 7,7), 1:40 (v/v), homogeneizados e então centrifugados a 20000 g durante 10 min a 7aC. O sedimento resultante foi ressuspendido nas mesmas condições e de novo centrifugado. O sedimento foi finalmente ressuspendido num volume mínimo e mantido a -80°C durante a noite. No mesmo dia, o processo foi repetido até o sedimento final ser ressuspendido numa razão de 1:10 (v/v). no caso do cerebelo e na proporção de 1:5 (v /) no caso da coluna vertebral. A afinidade foi determinada por testes competitivos utilizando como ligando flumazenil marcado radioactivamente. Os testes foram conduzidos de acordo com os métodos descritos por S. Arbilla et al. (Eur. J. Pharmacol., 130, 257-263, 1986) ; e Y. Wu et al. (Eur. J. Pharmacol., 278, 125-132, 1995), utilizando placas de microtitulaçao 96. As membranas contendo os receptores de estudo, flumazenil (radiomarcação numa concentração final de 1 nM) e concentrações ascendentes de compostos de teste (num volume total de 230 yL em 50 mM [ph 7,4] tampão Tris.HCl foram incubados. Simultaneamente, as 17 membranas foram incubadas apenas com o flumazenil marcado radioactivamente (ligação total, 100%) e na presença de uma concentração elevada de flumazenil não marcado radioactivamente (ligação não especifica, estimativa da % de ligando marcado radioactivamente). As reacções foram iniciadas através da adição do ligando radioactivo seguindo-se uma incubação durante 60 minutos a 4°C. No final do periodo de incubação, 200 yL de reacção foram transferidos para uma placa multiscreen (Millipore) e filtradas através de um distribuidor de vácuo e em seguida lavadas três vezes com tampão de teste frio. As placas múltiplas foram equipadas com filtro GF/B que reteve as membranas que contêm os receptores do ligante radioactivo que tinha sido ligado aos receptores. Depois da lavagem, as placas foram deixadas a secar. Uma vez secas, liquido de cintilação foi adicionado e deixado sob agitação durante a noite. No dia seguinte, as placas foram contadas utilizando um contador de cintilação Perkin-Elmer Microbeta.

Para uma análise dos resultados da percentagem de ligação especifica para cada concentração de compostos do teste foi calculado da seguinte forma: % de ligação especifica = (X-N/T-N) x 100 onde, X: quantidade de ligante ligado para cada concentração do composto. T: total de ligação, a quantidade máxima vinculado ao ligante radioactivo. N: não especifica quantidade, a ligação do ligante radioactivo ligado numa forma não-especifica, independentemente do receptor utilizado. 18

Cada concentração dos compostos foi testada em triplicado e os seus valores médios foram utilizados para determinar os valores experimentais de % de ligação especifica versus a concentração do composto. A Afinidade dos dados é expressa em % de inibição a 10-5M e 10-7M concentrações de subunidade al e em 10-5M para subunidade cx2. Os resultados destes testes são apresentados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

Tabela 1. Afinidade para a subunidade oíi do receptor GABAa

Composto % de inibição 1(T5M % de inibição ío-™ Exemplo preparativo 5 98,2 42,3 Exemplo preparativo 6 98,1 36,4 Exemplo preparativo 11 97, 7 41,8 Exemplo preparativo 13 98, 7 39,8 Exemplo preparativo 14 97,3 31, 9 Zaleplon 97, 2 26, 1

Tabela 2. Afinidade com a subunidade oç do receptor GABAa

Composto % de inibição 1Q-5M Exemplo preparativo 5 94, 5 Exemplo preparativo 6 87, 5 Exemplo preparativo 11 95, 0 Zaleplon 77, 4 b) Determinação in vivo da acção preditiva sedativa-hipnótica

Os efeitos in vivo destes compostos foram avaliadas através de um teste de hipnose de sedação assistida em ratinhos (D.J. 19

Sanger et al. Eur. J. Pharmacol., 313, 35-42, 1996; e G.

Griebel et al. , a psicofarmacologia, 146, 205-213, 1999).

Grupos de 5-8 ratinhos CD1 machos, pesando 22-26 g no momento do teste, foram utilizados. Os compostos de ensaio foram administrados em doses intraperitoneais únicas equimoleculares, suspensas em 0,25% de agar com uma gota de Tween 80 num volume de 10 mL / kg. Duas doses foram testadas em cada rota. Os animais de controlo receberam o veiculo sozinho. Usando um sistema inteligente (Panlab, SL, Spain), a distância percorrida em cm, é registada para cada rato em intervalos de 5 minutos durante um período de 30 minutos após a dosagem intraperitoneal (ip) . A percentagem de inibição da distância percorrida de animais tratados versus animais do grupo de controlo (os primeiros 5 min foram descartados), e ED50 valores foram calculados. Os resultados deste ensaio são dadas nas Tabelas 3 e 4.

Tabela 3. Determinação da actividade sedativo-hipnótica in vivo em ratinhos

Composto % da inibição da actividade motora 98 pmol/kg Exemplo preparativo 5 89,0 Exemplo preparativo 6 76,3 Exemplo preparativo 11 83,8 Exemplo preparativo 5 95, 6 Exemplo preparativo 5 89,6 Zaleplon 84, 9 20

Tabela 4. Determinação dos valores ED50 na indução da sedação de ratinhos

Composto ED50 (pmol/kg) Exemplo preparativo 11 16.9 Exemplo 2 da WO 2005014596 30.1 Exemplo 18 da WO 2005014596 19.9

Em comparação com outros representantes pirazolo [1,5-a pirimidinas] da técnica anterior, o composto de exemplo, 11 da presente invenção apresenta claramente um menor ED50. Isto implica que o composto do exemplo 11 é mais potente in vivo desde que uma dose necessária menor para induzir o efeito terapêutico. c)Determinação in vitro da estabilidade metabólica na fracção citosólica de hepatócitos humanos

Os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido para alcançar uma concentração inicial de 10 mM. Esta solução foi então diluída com solvente e tampão para obter a concentração final do ensaio de 5μΜ. Os compostos foram testados numa única concentração de 5μΜ em duplicado incubando com 1,0 mg/mL de citosol humano plasma (obtidos a partir de Xenotech plc) a 37°C. O metabolismo foi avaliado na presença ou ausência de co-factores e medidas como a perda do composto parental por análise por LC/MS com 0, 60 e 120 minutos de de pontos de tempo. Percentagens de compostos parentais restantes foram calculadas. Os resultados são apresentados na Tabela 5. Um método LC genérico foi utilizado:

Fase móvel: A = 0,1% de ácido fórmico em água 21

Tabela 5. Estabilidade metabólica na fracção citosólica de hepatócitos humanos B = 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila HPLC Coluna: Clipius Higgins C18 05:00, 50 x 3mm Vazão: 2 ml.min -1 Gradiente: Tempo %A %B 0.00 95 5 2.00 5 95 2.50 5 95 2.60 95 5 3.00 95 5 % Parental Composto 60 min 120 min Exemplo preparativo 6 86 81 Exemplo preparativo 11 88 82 Zaleplon 79 68 Exemplo 18 da WO 2005014596 73 46

Surpreendentemente, os compostos de exemplos preparativos 6 e 11, mostram uma percentagem mais elevada (10-20%) do composto parental remanescente em comparação com zaleplon e os compostos de técnica anterior da WO 2005014596, após incubação durante um período de 60 e 120 min. Por outro lado, zaleplon tem uma percentagem inferior à do composto original remanescente, em qualquer fase do tempo e uma maior biotransformação 60-120 min. d) A determinação in vitro de toxicidade em células HepG2, CHO-K1 e células HeLa, em 24h 22

HepG2 (células de carcinoma hepatocelular) e CH0-K1 (células de ovário de hamster chinês) foram obtidos da American Type Culture Collection (ATCC). HepG2 foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM), contendo solução de sais de Earl com 1.87mM Glutamax® e suplementado com lmM de piruvato de sódio, 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais, 100000 U/L de penicilina, 100000 yg/L de estreptomicina e 10% de Soro Fetal Bovino. CH0-K1 foram mantidos em meio Ham's F-12 contendo 1 mM Glutamax® e suplementado com lmM de L-glutamina, 100000 U/L penicilina, 100000 yg/L de estreptomicina e 10% de Soro Fetal Bovino. Promega CellTiter 96® Ensaio de Viabilidade Celular de uma Solução Aquosa, contém o sal de tetrazólio (MTS), que a enzima desidrogenase encontradas em células metabolicamente activas transforma o produto formazan em solução aquosa. A quantidade de produto formazan é proporcional ao número de células vivas em cultura.

Os compostos foram dissolvidos em DMSO para alcançar uma concentração inicial de 100 mm. As diluições em serie foram feitas a partir desta solução em DMSO para atingir uma gama de concentrações de 50 a 0,25 mm. A solução e as diluições em série foram diluídas 1:100 com o meio de cultura de células respectivas. No caso de células CHO-K1, as concentrações de 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 e 2.5 yM foram preparadas para avaliar IC50, que, no caso das células HepG2, as concentrações finais de 1000, 100, 10 e yM final foram analisadas de modo a calcular a percentagem de células. A concentração final de DMSO em todas as cavidades foi de 1% v/v. As linhas celulares foram incubadas com os compostos do teste durante 24 horas. A viabilidade celular relativa foi determinada espectrofotometricamente a 490nm após a adição do 23 corante MTS e mais uma hora incubação. 0 tamoxifeno foi utilizado como controlo positivo.

Um protocolo semelhante foi utilizado para determinar a toxicidade celular em células HeLa, em 24h. Os resultados são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6. Toxicidade de célula em HepG2, CH0-K1 e células

HeLa em 24 h % de viabilidade de células IC50 Composto HepG2 a 100 μΜ HeLa a 100 μΜ CHO Exemplo preparativo 11 84.5% 83.9% 185.6 μΜ Exemplo 1 da US 6399621 (indiplon) 70% 67.9% 108.4 μΜ

Estes resultados demonstram que os compostos do exemplo 11 da presente invenção são menos tóxicos do que o indiplon composto de referência, uma vez que a sobrevivência de células de exemplo para o composto 11 é superior a indiplon (84,5% vs. 70%,) na linha celular HepG2. Estes resultados foram confirmados nas duas outras linhas de células analisadas.

Exemplo preparativo 1: N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo [1,5— a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,048 g (0,38 mmol) de 4-nitro-2H-pirazol-3 ilamina e 0,1 g (0,38 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino- acriloíla)-2-fluoro-fenil]-N-metilacetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o 24 solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15mL de diclorometano e 10 mL de solução de bicarbonato de sódio saturada. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano evaporou-se para produzir um óleo que foi cromatografado (sílica gel), utilizando acetato de etilo diclorometano como eluente, permitindo assim que 61 mg (rendimento 49%) de um sólido correspondente a N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il] fenil)-N-metil-acetamida. ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) 1 : δ 1,97 (3H, s) , 3,29 (3H, s), 7, .29 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,45 (1H, t, J = 8,4 Hz), 7,89- 8, . 02 (1H, m) , 8,07-8,09 (1H, m) , 8,83 (1H, S) , 9,0 (1H, d, J = 4,4 Hz) . MS (ES) m/z = 330 (MH+) HPLC = 95, 7% Exemplo preparativo 2: N-{2-fluoro-5- [3- -ciano-pirazolo [1, . 5- a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,041 g (0,38 mmol) de 5-amino-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,1 g (0,38 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloíla)-2-fluoro-fenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Diclorometano (15 mL) e a solução saturada de bicarbonato de sódio (10 mL) foram adicionadas ao resíduo resultante. As duas camadas foram separadas e a fase aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secas em sulfato de 25 magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etilo, deu 95 mg de N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]-7-il-pirimidina il] fenil}-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 81%) . ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) : δ 1, 96 (3H , s), 3, 28 (3H, s), 7, 18 "O \—1 J = 4,4 Hz), 7, 42 (1H, t, J = 8,8 Hz), 7,99- 8, 02 (1H, em m) 8,09-8,12 (1H , M), 8, 42 (1H,S), 8,79 (1H, d, J = 4,4 Hz) • MS (ES) m / z = 310 (MH+) HPLC = 97.8% Exemplo preparativo 3: N- - (2-cloro -5- [ 3-nitro- -pirazolo [1, . 5- a] pirimidina-7-il] fenil)-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,054 g (0,43 mmol) de 4-nitro-2.ff-pirazol-3-ilamina e 0,120 g (0,43 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino acrilo--il)-2-cloro-fenil]-N-metilacetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Diclorometano (15 mL) e a solução saturada de bicarbonato de sódio (10 mL) foram adicionadas ao resíduo resultante. As duas camadas foram separadas e a fase aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secas em sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporada para produzir um óleo que foi cromatografado (Sílica gel), utilizando acetato de etilo diclorometano como eluente, permitindo assim que 35 mg (rendimento 24%) de um sólido correspondente a N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[l,5,a]pirimidina-7-il-fenil])-N-metil-acetamida . 26 ΧΗ RMN (400 MHz , CDC13) : δ 1, 90 (3H, s) , 3, 26 (3H, s) , 7, 30 P k·. i—1 J = 4,4 Hz) , 7, 77 (1H, d, J = 8 Hz) , 7, 93 ( 1H, dd, J = 2, 4 e 8,4 Hz) , 8, 08 (1H, d, J = 2 Hz), 8, 83 (1H, s) , 9, 01 (1H, d, J = 4,8 Hz) . MS (ES) m / z = 346 (MH Ί HPLC = 91%

Exemplo preparativo 4: N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,046 g (0,43 mmol) de 5-amino-lH-pirazol-4- carbonitrila e 0,120 g (0,43 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino- acriloíla)-2-clorofenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida, o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secas em sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 108 mg de N-{2- cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 77%). XH RMN (400 MHz, CDC13) : δ 1,90 (3H, s), 3,25 (3H, s) , 7.20 (1

H, d, J = 4,4 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,94 (1H, dd, J = 2,4 e 8,4 Hz), 8,10 (1H, d, J = 2 Hz), 8,43 (1H, s) , 8,80 (1H, d, J = 4, 8 Hz) . MS (ES) m / z = 326 (MH+) HPLC = 97, 7% 27

Exemplo preparativo 5: N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-metanossulfonamida

Uma mistura de 0,043 g (0,33 mmol) de 4-nitro-2H-pirazol-3 ilamina e 0,1 g (0,33 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloíla)-2-fluoro-fenil]-N-metilmetanossulfonamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e, em seguida, o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que foi cromatografado (sílica gel), utilizando acetato de etila, diclorometano como eluente, permitindo assim que 58 mg (rendimento 48%) de um sólido corresponda a N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il] fenil)-N-metil-metanossulfonamida. ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13): δ 3,02 (3H, s), 3,39 (3H, s) , 7,29 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,38-7,42 (1H, m), 8,05-8,13 (2H , m), 8,83 (1H, s), 8,98 (1H, d, J = 4,4 Hz). MS (ES) m / z = 366 (MH+) HPLC = 97,6%

Exemplo preparativo 6: N-(2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo [1,5— a] pirimidina-7-il] fenil)-N-metil-metanossulfonamida

Uma mistura de 0,036 g (0,33 mmol) de 5-amino-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,1 g (0,33 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloíla)-2-fluoro-fenil]-N-metil-metanossulfonamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e 28 em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 ml de água e secadas sobre sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 81 mg de N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]-7-il-pirimidina] fenil)-N-metilmetanossulfonamida como um sólido (rendimento de 70%). ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) : δ 3,01 (3H, s), 3,38 (3H, s), 7,29 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,36-7,41 (1H, m), 8,08-8,15 (2H , m), 8,42 (1H, s), 8,77 (1H, d, J = 4,4 Hz). MS (ES) m / z = 346 (MH+) HPLC = 99,1%

Exemplo preparativo 7: N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-metanossulfonamida A mistura de 0,050 g (0,39 mmol) de 4-nitro-2H-pirazol-3 ilamina e 0,124 g (0,39 mmol) de N-[5 - (3-dimetilamino-acriloíla)-2-cloro-fenil ]-N-metilmetanossulfonamida em 12 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 1,5 horas e, em seguida, o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado à para produzir um óleo que, na presença de álcool etílico acetato, 29 deram 56 mg de N-([2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-metanossulfonamida como um sólido (rendimento de 77% ). ΧΗ RMN (400 MHz , CDC13) : δ 3, 08 (3H, s) , 3,38 (3H, s), 7,30 (1H, d, J = 4, 4 Hz), 7,71 (1H# d, J = 8,4 Hz) , 8,04 ( 1H, dd, J = 2 e 8, 4 Hz) , 8,14 (1H r J = : 2,4 Hz) , 8,83 (1H, s), 8,99 P p \—1 J = 4,4 Hz) . MS (ES) m / z = 382 (MH+) HPLC = 98,5%

Exemplo preparativo 8: N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-metanossulfonamida

Uma mistura de 0,042 g (0,39 mmol) de 5-amino-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,124 g (0,39 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloila)-2-clorofenil]-N-metil-metanossulfonamida em 12 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 1,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secas sobre sulfato de magnésio. A camada de diclorometano, evapora-se para produzir um óleo que, na presença do acetato de etila, deu 99 mq de N-(2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo [ 1,5-a]-7-pirimidina il] fenil)-N-metilmetanossulfonamida como um sólido (rendimento de 70%). ΧΗ RMN (400 MHz, CDCI3) : δ 3, 08 (3H, s) , 3,37 (3H, s), 7,20 (1H, d , J = 4,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8, 8 Hz) , 8,05 ( 1H, dd, J = 2, 4 e 8,8 Hz), 8,16 (1H, d, J = 1,6 Hz) , 8,42 (1H, S), 8,78 (1H, d, J = 4,4 Hz). 30 MS (ES) m / z = 362 (MH+) HPLC = 93,7%

Exemplo preparativo 9: N-{2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil- pirazolo [1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,046 g (0,38 mmol) de 5-amino-3-metil-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,1 g (0,38 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloíla)-2-fluorofenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secaa com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 92 mg de N- (2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il-fenil])-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 75%). RMN (400 MHz, CDC13) : δ 1, 98 (3H, s), 2, 61 (3H, S) , (3H, s), 7,09 (1H, d, J = 4 Hz) , 7,39-7,44 (1H, m ) , Oh 00 8,02 (1H, m), 8,08-8,11 (1H, m) , 8,70 (1H, d, J = 4,4 Hz) MS (ES) m / z = 324 (MH+) HPLC = 98,4%

Exemplo preparativo 10: N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil- pirazolo[l,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,055 g (0,43 mmol) de 5-amino-3-metil-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,120 g (0,43 mmol) de N-[5-(3- 31 dimetilamino-acriloíla)-2-clorofenil]-N-metil-acetamida em 12 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 1,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Ao resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL da solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas, e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e secas com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 106 mg de N-(2-cloro-5-[3-ciano-2-metilpirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il-fenil]-N)metilacetamida como uma sólida (rendimento de 73%). ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) : δ 1,91 (3H, s), 2,61 (1H, s), 3,25 (3H, s), 7,10 (1H, d, J = 4.8Hz), 7,73 (1H, d, J = 8.4Hz), 7,97 (1H, dd, J = 2 e J = 8 Hz), 8,08 (1H, d, J = 2,4 Hz), 8,71 (1H, d, J = 4,4 Hz). MS (ES) m / z = 340 (MH+) HPLC = 99,6%

Exemplo preparativo 11: N- {2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil- pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-metano ssulfonamida

Uma mistura de 0,041 g (0,33 mmol) de 5-amino-3-metil-lH- pirazol-4-carbonitrila e 0,1 g (0,33 mmol) de N-[5 - (3- dimetilamino-acriloíla)-2-fluorofenil]-N-metil-metanossulfonamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de 32 diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 66 mg de N-(2—fluoro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il-fenil])-N-metil-metanossulfonamida como um sólido (rendimento de 55%). ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) : δ 2,78 (3H, s), 3,17 (3H, s), 3,54 (3H, s), 7,24 (1H, d, J = 4,4 Hz), 7,51-7,56 (1H, m ), 8,25 - 8,31 (2H, m), 8,84 (1H, d J = 4,4 Hz). MS (ES) m / z = 360 (MH+) HPLC = 98,9%

Exemplo preparativo 12: N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil- pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-metanossulfo- namida

Uma mistura de 0,048 g (0,39 mmol) de 5-amino-3-metil-lH-pirazol-4-carbonitrila e 0,124 g (0,39 mmol) de N-[5-(3-dimetilamino-acriloíla)-2-clorofenil]-N-metil-metanossul-fonamida em 12 mL de ácido acético glacial foi Refluído durante 1,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 89 mg de N-(2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil) -N-metil-metanossulf onamida como um sólido (rendimento de 60,5%) . 33 ΧΗ RMN (400 ΜΗζ, CDC13) : δ 2,61 (3Η, s), 3,08 (1Η, s) , 3,66 (3H, s), 7,10 (1H, d, J = 4,8 Hz), 7,68 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,04 (1H, dd, J = 2,4 e J = 8,8 Hz), 8,15 (1H, d, J = 2,4 Hz), 8,70 (1H, d, J = 4,4 Hz). MS (ES) m / z = 376 (MH+) HPLC = 98,1%

Exemplo preparativo 13: N-{-metil-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil)-N-metilacetamida

Uma mistura de 0,074 g (0,38 mmol) de (5-amino-lH-pirazol-4-il)-tiofeno-2-metanona-il e 0,1 g (0,38 mmol) de N-[5-(3-acrilo-dimetilamino)-2-metil-fenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 132 mg de N-(2-metil-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo [1,5-a]pirimidina-7-il] fenil)-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 88%). ΧΗ RMN (400 MHz , CDC13) : δ 1,87 (3H, s) t 2,37 (3H, s) , 3,25 (3H, s) f 7, 13 (1H, d , J = 4 Hz) , 7, 18-7, 20 (1H, m ) , 7, 54 (1H, D, J = 7, 6 Hz) , 7, 70 (1H, d , J = 5, 2 Hz) , 7,94-7,98 (2H, m) , 8,0 8 (1H, d, J = 2,8 Hz), 8, 71 (1H, s) , 8, 81 (1H, d, J = 4Hz) • MS (ES) m / z = 391 (MH+) HPLC = 98 ,3% 34 Ν-{2-metoxi-5-[3-(tiofeno-2-

Exemplo preparativo 14: carbonil)-pirazolo[l,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,070 g (0,36 mmol) de (5-amino-lH-pirazol-4-il)-tiofeno-2-methanone-il e 0,1 g (0,38 mmol) de N-[5-(3-acrilo-dimetilamino)-2-metoxi-fenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluído durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o resíduo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 135 mg de N-(2-metoxi-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo [1,5 — a] pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 92%). RMN (40 0 MHz, CDC1 3) : δ 1, 90 (3H, s) , 3,23 (3H, s), 3,97 (3H, s), 7,12 (1H, d, J = 4,8 Hz ), 7,17-7, 21 (2H, m ), 7.70 (1H, d, J = 4,4 Hz) , 8,02 (1H, S) , 8,09 (1H, d, J = 4 Hz), 8, 15 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,71 (1H, s), 8 , 79 (1H, d, J = 4,4

Hz) . MS (ES) m / z = 407 (MH+) HPLC = 100%

Exemplo preparativo, 15: N-{2,4-difluoro-5-[3-(tiofeno-2- carbonil)-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida 35

Uma mistura de 0,217 g (1,12 mmol) de (5-amino-lH-pirazol-4-il)- tiofeno-2-metanona-il e 0,3 g (1,12 mmol) de N-[5-(3-acrilo-dimetilamino)-2,4-difluoro-fenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluido durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o residuo resultante foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, no presença de acetato de etila, deu 320 mg de N-( [2,4-difluoro-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo-1,5-a]pirimidina-7-il ]fenil)-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 69%). RMN (250 MHz, CDC13) : δ 1,82 (3H, s) , 3,11 (3H, s) , 6,96-7,06 (3H, m) , 7,55 (1H, d, J = 4,9 Hz), 7,76 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 1 e 3,6 Hz), 8,52 (1H, s), 8,68 (1H, d, J = 4,1 Hz) . MS (ES) m / z = 413 (MH+) HPLC = 99,0%

Exemplo preparativo 16: N-{5-fluoro-2-metoxi-3-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[l,5-a]pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-acetamida

Uma mistura de 0,180 g (0,93 mmol) de (5-amino-lH-pirazol-4-il)-tiofeno-2-metanona-il e 0,275 g (0,93 mmol) de N-[3-(3-acrilo-dimetilamino)-5-fluoro-2-metoxi-fenil]-N-metil-acetamida em 10 mL de ácido acético glacial foi refluido durante 2,5 horas e em seguida o solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida. Para o residuo resultante 36 foram adicionados 15 mL de diclorometano e 10 mL de solução saturada de bicarbonato de sódio. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com 10 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água e seca com sulfato de magnésio. A camada de diclorometano foi evaporado para produzir um óleo que, na presença de acetato de etila, deu 160 mg de Ν-5-fluoro-2-metoxi-3-[3-(tiofeno-2)carbonila[pirazolo(l,5-a]pirimidina-7-il]fenil)-N-metil-acetamida como um sólido (rendimento de 40%) . lE RMN (250 MHz, CDC13) : δ 2,04 (3H, s), 3,32 (3H, s) , 3,56 (3H, s), 7, 09-7,25 (3H, m) , 7,35 (1H, dd, J = 2,2 e J = 7,1

Hz), 7,72 (1H, d, J = 4,9 Hz), 8,12 (1H, d, J = 3,8 Hz), 8,68 (1H, s), 8,85 (1H, d, J = 4 Hz). MS (ES) m / z = 425 (MH+) HPLC = 98,4%

Composto do Exemplo 1: comprimidos de 5 mg

Ingrediente activo 5.0 mg Dióxido de silício coloidal 0.6 mg Croscarmelose sódica 12.0 mg Talco 4.0 mg Estearato de magnésio 1.5 mg Polissorbato 80 1.0 mg Lactose 75.0 mg Hidroxipropilmetilcelulose 3.0 mg Polietilenoglicol 4000 0.5 mg Dióxido de titânio E171 celulose microcristalina 1.5 mg q.b. para 125.0 mg 37

Composto do Exemplo 2: cápsulas de 10 mg

Ingrediente activo 10,0 mg Dióxido de silício coloidal 0.6 mg Crospovidona 12.0 mg Talco 4.0 mg Estearato de magnésio 1.5 mg Lauril sulfato de sódio 1.5 mg Lactose 77.0 mg Gelatina 28.5 mg Dióxido de titânio E171 1.5 mg Indigotina E132 0.02 mg Celulose microcristalina q.b. para 155 . C i mg

Composto de Exemplo 3: gotas orais

Ingrediente activo 0.5 g Propilenoglicol 10.0 g Glicerina 5.0 g Sacarina sódica 0.1 g Polissorbato 80 1.0 g Sabor a limão 0.2 g Etanol 25, 00 mL Água purificada q.b. para 100.0 mL 38

Composto de Exemplo 4: Comprimidos de 2,5 mg

Ingrediente activo 2.5 mg Dióxido de silício coloidal 0.6 mg Croscaramellose sódio 12.0 mg Talco 4.0 mg Estearato de magnésio 1.5 mg Polissorbato 80 1.0 mg Lactose 75.0 mg Hidroxipropilmetilcelulose 3.0 mg Polietilenoglicol 4000 0.5 mg Dióxido de titânio E171 Celulose microcristalina q.b. 1.5 mg para 125.0 mg Composto de Exemplo 5: cápsulas de 5 mg Ingrediente activo 5.0 mg Dióxido de silício coloidal 0.6 mg Crospovidona 12.0 mg Talco 4.0 mg Estearato de magnésio 1.5 mg Lauril sulfato de sódio 1.5 mg Lactose 77.0 mg Gelatina 28.5 mg Dióxido de titânio E171 1.5 mg Indigotina E132 0.02 mg Microcristalina q.b. para 155.0 mg 39

Composto de Exemplo 6 : gotas orais

Ingrediente activo 0.25 g Propilenoglicol 10.0 g Glicerina 5.0 g Sacarina sódica 0.1 g Polissorbato 80 1.0 g Sabor de limão 0.2 g Etanol 25, 00 mL Água purificada g.b. para 100.0 mL 19-08-2010 40

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado do grupo constituído por: a) N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilacetamida; b) N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilacetamida; c) N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N metilacetamida; d) N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilacetamida; e) N-{2-fluoro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; f) N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; g) N-{2-cloro-5-[3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; h) N-[2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; i) N-{2-fluoro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7- il] fenil}-N-metilacetamida; j) N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7- il]fenil}-N-metilacetamida; k) N-{2-fluoro-5[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7- il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; l) N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7- il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; m) N-{2-metil-5-[3 2 - (tiofeno-2-carbonil)-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il] fenil)-Nmetil-acetamida; η)N-{-metoxi-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il]fenil}-N-metil-acetamida; 1 ο)Ν-{2,4-difluoro-5-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo[1,5-a] pirimidina-7-il] fenil}-N-metil-acetamida, e P) N-{5-fluoro-2-metoxi-3-[3-(tiofeno-2-carbonil)-pirazolo [1,5-a] pirimidina-7-il]fenil-}-N-metil-acetamida; e a sais farmaceuticamente aceitáveis e os hidratos dos mesmos.
2. 2. Composto da reivindicação 1 seleccionado do grupo constituído por: f) N-{2-fluoro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; h) N-{2-cloro-5-[3-ciano-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7-il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; k)N-{2-fluoro-5-[3-ciano-meti1-2-pirazolo[1,5-a]-7 pirimidina-il]fenilO}-N-metilmetanossulfonamida e i) N-{2-cloro-5-[3-ciano-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidina-7 il] fenil}-N-metilmetanossulfonamida; e sais farmaceuticamente aceitáveis e seus hidratos.
3. 3. Uso de um composto de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças associados à modulação do receptor GABAa num mamífero humano ou não humano que dele necessitem.
4. 4. Utilização da reivindicação 3 onde o receptor GABAa é o receptor GABAa-oí1 .
5. 5. Utilização da reivindicação 3 onde o receptor GABAa é o receptor GABAA-a2. 2
6. 6. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a ansiedade num mamífero humano ou não-humano conforme a necessidade do mesmo.
7. 7. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de epilepsia em mamíferos humanos ou não-humanos que dele necessitam.
8. 8. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir distúrbios do sono num mamífero humano ou não-humano que dele necessitem.
9. 9. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a insónia em mamíferos humanos ou de não-humanos que dele necessitem.
10. 10. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para induzir hipnose de sedação num mamífero humano ou não-humano que dele necessitem.
11. 11. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para induzir a anestesia num mamífero humano ou não-humano que dele necessitem.
12. 12. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para modular o tempo necessário para induzir o sono e sua duração num mamífero ou humano ou não-humano que dele necessitem.
13. 13. Uso de um composto da reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para induzir o relaxamento muscular num mamífero humano ou não-humano que dele necessitem. 3
14. 14. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto tal como definido na reivindicação 1, juntamente com quantidades adequadas de excipientes ou transportadoras farmacêuticos.
15. 15. Composto da reivindicação 1 para tratar ou prevenir uma doença seleccionada do qrupo consistindo em ansiedade, epilepsia, distúrbios do sono e insónia em mamíferos humanos ou não-humanos que deles necessitem, ou para induzir a hipnose, sedação, anestesia ou relaxamento muscular em mamíferos humanos e não-humanos: ou para modulação do tempo necessário para induzir o sono e sua duração em mamíferos humanos ou não-humanos que deles necessitem. 19-08-2010 4