PT1787653E - Composição farmacêutica contendo fragmentos de polipéptidos de serralisinas - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO FRAGMENTOS DE POLIPÉPTIDOS DE SERRALISINAS"

Campo da invenção A presente invenção está relacionada com o campo da biotecnologia, da indústria farmacêutica e, em particular, com a produção de uma composição capaz de inibir o crescimento de células tumorais. Esta composição contém polipéptidos fragmentos de Serralisinas, obtidos a partir da degradação da proteína intacta, que têm uma maior atividade anti-proliferativa do que aqueles das moléculas de serralisin inteiras. Os referidos fragmentos pertencem ao C-terminal das serralisinas, a partir da metionina interna da sequência de serralisin até à extremidade da molécula, e a combinação dos mesmos com prodigiosinas aumentando o efeito anti-tumoral da presente composição. Técnica anterior A quimioterapia para o cancro tem sido tradicionalmente dirigida para a inibição da proliferação de células de cancro. No entanto, nos últimos anos o interesse em produtos anti-tumorais que induzem a apoptose tem aumentado porque o cancro tem sido estabelecido como uma patologia relacionada com uma deficiência relativa da apoptose, em vez de um excesso de proliferação.

As bactérias ou os seus extratos têm sido utilizados para o tratamento do cancro há quase 100 anos. O relatório mais citado é o do médico e cirurgião William B. Coley de um Hospital na cidade de Nova Iorque chamado Sloan-Kettering Memorial Hospital. Ele observou que muitos de seus pacientes com vários tipos de cancro apresentavam regressão 2 do tumor após a terem sido infetados por bactérias patogénicas. (Coley, W. B. 1991- reproduzido a partir de 1893-. Clin. Orthop. 262:3). A resistência aos tumores em pacientes ou em animais infetados foi atribuído às células concomitantes mediadoras da imunidade anti-tumoral (Paglia, P. e Guzmán, CA 1998. Imunol. Câncer. Immunother. 46:88). A ideia de que a bactéria patogénica ou infeção por protozoários poderia ativar a regressão do cancro através da ativação da imunidade inata ou adaptativa tem sido recentemente questionada por Hunter et al. (Hunter, CA, Yu, D., Gee, M., Ngo, CV, Sevignani, C., Goldschmidt, M., Golovkina, TV, Evans, S., Lee, WF e Thomas-Tekhonenko, A. 2001. J. Immunol. 166:5878). Eles demonstraram que os tecidos infetados por T. Gondii produzem alguns fatores solúveis anti-angiogénicos, que evitam a formação de vasos sanguíneos nos tumores, que podem ter um potencial interesse terapêutico. Este processo de formação de novos capilares conhecido como angiogénese tornou-se um importante foco de atenção para a implementação de novas terapias para o cancro e suas metástases. A busca por fatores anti-angiogénicos é a sustentação de novas estratégias terapêuticas anticancro (Folkman, J. 2003. Seminars in Câncer Biology. 13:159). Recentemente o uso de bactérias anaeróbias como agentes quimioterapêuticos seletivos e anti-vasculares provocou uma regressão significativa de tumores subcutâneos (sc) em ratinhos. Este tratamento é chamado terapia combinada bacteriolítica (COBALTO) (Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D.L., Klnzler, K.W. and Vogelstein, B. 2001. Proc Natl Arad Sei USA. 98: 15155). No entanto, as bactérias vivas produzem toxicidade importante e reações colaterais que limitam o seu uso contra o cancro humano. 3

Nos últimos anos, foram publicados alguns relatórios que indicam que bactérias anaeróbicas libertam proteínas redox que induzem a apoptose de células dos tumores (Yamada, T., Goto, M., Punj, V., Zaborina, 0. e Chen, ML 2002. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA. 99: 14088; Goto, M., Yamada, T., Kimbara, K., Horner, J., Newcomb, M., Gupta, TK e Chakrabarty, A. M. 2003. Mol. Microbiol. 47:549). Tem sido postulado que as proteínas redox podem ser incluídas num grupo de proteínas solúveis que foram segregadas pelas células procarióticas ancestrais, e as suas funções podem ter sido a eliminação de células eucarióticas ancestrais (Punj, V. e Chakrabarty, AM 2003. Cellular Microbiology. 5:225) . Em geral, pouco se sabe sobre a produção de fatores solúveis segregados por estes organismos procariontes que pudessem agir de forma específica sobre as células do cancro, causando a sua morte e, concomitantemente, a regressão do tumor. A serratia marcescens é uma bactéria anaeróbia facultativa. De algumas das suas linhagens foram obtidas algumas preparações com propriedades anti-tumorais, as mais estudadas são:, [a] ImuVert® (Budagov, R.S. and Ulianova, L.P. 2001. Radiats Biol Radioecol Russian. 41:38), uma preparação de membranas ribossómicas que ativam o sistema imunológico do paciente; [b] a Serratia protéase Mr 56,000 (Wu, J., Akaike, T., Hayashida, K., Okamoto, T., Okuyama, A. and Maeda, H. 2001. Jpn. J. Câncer Res. 92:439), que induz a morte de células por necrose, dependendo da expressão macroglobulina do cx-2; e [c] as prodigiosinas, uma família de pigmentos que atuam como imunossupressores e anticancerígenos através da indução da apoptose ((Montaner, B and Pérez Tomas, R. 2003. Curr Câncer Drug Targets. 3:57; Pérez Tomas, R. y Montaner,B. 2003. Histol Histopathol. 18:379) . 4

Obtivemos fragmentos não proteolíticos de serralisinas com maior atividade citotóxica do que as moléculas inteiras. Isso permite que a combinação destes fragmentos com baixas doses de prodigiosina, diminuam a toxicidade relatada para o pigmento e aumente o efeito anti-proliferativo das células tumorais.

Descrição detalhada da invenção.

As composições da presente invenção são capazes de inibir o crescimento de células tumorais e são formadas por fragmentos de polipéptido serralisinas, com maior efeito anti-proliferativo do que as moléculas serralisinas inteiras, que podem ser combinadas com prodigiosinas que melhoram o seu efeito anti-tumoral.

Esta invenção descreve a preparação da composição MG2327, onde coexistem ambos os polipéptidos e os prodigiosinas, os quais têm um amplo espetro de atividade citotóxica sobre as linhas de células malignas, com efeito seletivo sobre as células tumorais transformadas e, especificamente, em células ativadas para o seu crescimento. 0 estudo de sensibilidade em diferentes linhas celulares, tumorais ou não, demonstra que as linhas de células normais são apenas ligeiramente sensiveis à preparação MG2327, enquanto que as células derivadas do melanoma, do carcinoma da laringe, do fibrosarcoma, do hepatocarcinoma, e carcinoma do colo-uterino (positivo ou não para virus do papiloma humano) são muito sensiveis. Os carcinomas de origem hematopoiética são menos sensiveis. As células HUVEC ativadas para o seu crescimento são mais sensiveis à MG2327 que aquelas não ativadas. A preparação MG2327 é capaz de agir especificamente sobre os fatores expressos ou sobre expressas durante o processo de divisão celular. Esses fatores constituem as terapêuticas alvo contra o cancro ou outras doenças de origem proliferativa. Além disso, esses 5 fatores também constituem alvos para o diagnóstico precoce de doenças originadas por um excesso de proliferação, ou pela proliferação não controlada das células diferenciadas ou não diferenciadas. As formulações de libertação controlada contendo essas moléculas podem ser dirigidas para estes alvos de proliferação que agem de forma especifica sobre elas, dado que as células normais são mais resistentes à sua ação. A fim de demonstrar a atividade anti-tumoral da preparação MG2327 ratinhos BALB/c foram infetados com uma inoculação intraperitoneal de células de tumor de CB Hep.l de origem mieloide, capazes de causar tumores asciticos de murino (Fontirrochi, G., Duenas, M. Fernández de Cossio, ME, Fuentes, P., Pérez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, JV e Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). Após 10 dias, os ratinhos foram injetados intraperitonealmente com uma preparação MG2327 ou PBS. 60% dos animais tratados com 1 mg/kg sobreviveram, enquanto que apenas 25% dos ratinhos do grupo de controlo estavam vivos 45 dias após o inicio do tratamento (Fig. 8) . A regressão tumoral total foi observada nos sobreviventes tratados, mostrando uma condição saudável, enquanto que nos de controlo, os tumores progrediram formando grandes massas sólidas e os ratos mostraram uma deterioração do estado geral.

Os ratinhos BALB/c com tumores de origem mieloide tratados com uma dose de 1 mg/kg de peso da preparação MG2327 sobreviveram com regressão total da doença. Esta mesma dose aumenta a sobrevivência, com uma redução significativa do volume do tumor em ratos BALB/c portadores de tumor originado por fibroblastos transformados de E6/E7. MG2327 protege os ratinhos BALB/c do implante de tumores mieloides. 6 A preparação MG2327 foi obtida como um resultado da otimização das condições de cultura para a produção de moléculas anti-proliferativas. A preparação MG2327 foi obtida como resultado da otimização das condições de cultivo para produzir moléculas anti-proliferativas, que constituem moléculas de um agente protetor contra o implante e desenvolvimento de tumores ou lesões malignas, deste modo, como indutor da produção de moléculas de anticorpos anti-proliferativos, antiapoptóticos e angiogénicos nas células normais e tumorais, que podem ser utilizados vantajosamente na profilaxia e na terapia do cancro, para além de em outras doenças relacionadas com estes acontecimentos. A linhagem 4202 CMIB aumenta as proteínas solúveis na gama de 45-50 e 20-30 kDa (50 e 25 kDa como determinado por SDS-PAGE, com um coeficiente de determinação de 0,984). A fração de 25 KDa, denominada p25, mostrou uma potente atividade anti-proliferativa dependentes das doses potência na experiência realizada com a incubação da linha celular HEp-2 com EDTA, enquanto que a fração 50 KDa denominada p50, não inibiu o crescimento. No entanto, a fração de p50 incubada com 5 μΜ de Zn2SC>4 mostrou atividade anti-proliferativa, mas menos potente do que a da fração p25. O IC50 do p25 e as frações p50 eram de 0,48 nM e de 16 nM, respetivamente.

As biomoléculas isoladas com efeito anti-proliferativo (polipéptidos e prodigiosina) foram realizadas na presente invenção por um único passo cromatográfico: permuta iónica utilizando um gradiente descontinuo de NaCl. A DEAE ou a matriz QAE Sepharosa Fast Flow foram utilizadas; equilibradas com 50 μΜ de tampão de fosfato, pH 8,00. A eluição foi realizada com um gradiente descontinuo de NaCl: 7 50mM de tampão fosfato-Ο.ΙΜ NaCl, pH 8,00; fosfato 50mM do tampão NaCl 0,2 M, pH 8,00, 50 mM de NaCl 2 M, pH 8,00 e a fração de pigmento foi, finalmente, absorvida na matriz eluida com 70% de etanol absoluto. Os resultados confirmam que a preparação do componente de proteina de 25 kDa tem uma maior capacidade do que o componente de proteina de 50 kDa da mesma preparação para inibir o crescimento de células tumorais, e os dois apresentam atividade biológica in vitro de forma independente.

Os fragmentos de vários tamanhos moleculares provocados pela degradação de p50 incluíam fragmentos de 25 kDa. O aumento da degradação de p50 foi obtida com a temperatura elevada, e a geração de p25 foi proporcional com o incremento de temperatura. Os anticorpos anti-p50 policlonais, obtidos em ovelhas, conhecidos por p25 no ensaio Western Blot, nos quais o p25 foi originado como um produto da degradação da proteina p50. Os produtos com atividade anti-proliferativa aumentaram proporcionalmente com o estado de degradação. Estes resultados confirmam que a autólise p50 é capaz de produzir fragmentos degradados com atividade anti-proliferativa mais potentes do que a molécula original (p50). Além disso, a proteína p25 também induz a regressão total dos tumores malignos de origem mieloide. Os fragmentos de p50 podem ser geneticamente conjugados com fragmentos de anticorpos, por metodologia conhecida para gerar imunotoxinas, úteis no tratamento da doença de etiologia proliferativa. Além disso, este fragmento isolado ou combinado com outras moléculas proteicas pode ser utilizado como transportador. A atividade proteolítica de p50 foi inibida com 7 mM de EDTA, a qual demonstrou que p50 é uma metaloprotease, a qual foi identificada por espetrometria de massa, e pertencem à família Serralisinas. As semelhanças importantes dos nossos fragmentos foram encontradas com as espécies identificadas como PRZN_SERSP PRZN_SERMA e no banco de dados de proteínas Swissport. A proteína p25 purificada cromatograficamente não tem atividade enzimática, e corresponde à região catalítica não carboxiterminal de Serralisinas.

Os componentes proteicos e a prodigiosina foram formulados na mesma composição que aumentam significativamente (P <0,005), o efeito inibidor no que respeita à forma independente da formulação. Esta composição foi obtida mantendo a mesma proporção de proteínas da prodigiosina que as usadas quando os componentes foram avaliados independentemente. Em tal composição a prodigiosina pode ser encontrada na concentração de 0,1 - 100 nM, e os fragmentos de Serralisin entre 0,1 - 150 mg / μ]7. É um objeto da presente invenção a obtenção de composições para uso, contendo fragmentos de polipéptidos derivados da Serralisinas com maiores efeitos anti-proliferativos do que a molécula integral de Serralisinas e a combinação destes fragmentos com Prodigiosinas que aumentam seletivamente a atividade biológica da composição.

Além disso, esses fragmentos de polipéptidos têm efeito apoptótico em células cancerosas. Este efeito apoptótico envolve as mitocôndrias, microtúbulos e a fragmentação do ADN, amplificando o sinal de programa de morte celular, usando baixas doses dessas composições. Estes eventos também foram observados com composições combinadas de polipéptidos e prodigiosina. O efeito anti-angiogénico de MG2327 e de fragmentos de polipéptidos anti-proliferativos foi avaliado pelo método de formação de estrutura tubular em matrigel. A concentração não citotóxica da MG2327 e da sua fração p25 e 9 p50 foram incubados com células microvasculares endoteliais humanas (HMEC). Os resultados foram avaliados considerando o comprimento tubular da estrutura formada e o número de interligações entre elas, utilizando-se o Pro Express 4.5 Image-programa. A diferenciação ou maturação das células endoteliais foi inibida de forma significativa (p <0,05, ANOVA), pela composição MG2327 e os seus polipéptidos anti-proliferativos), demonstrando atividade anti-angiogénica de MG2327 e dos seus polipéptidos anti-proliferativos. A atividade apoptótica, anti-angiogénico e a seletividade são umas das caracteristicas mais importantes da composição de acordo com a invenção, devido à sua potencial atividade terapêutica e ao efeito protetor contra o cancro.

Na presente invenção, descreve-se que as combinações de fragmentos de Serralisinas com os prodigisins são mais potentes e seletivas quando são utilizadas de forma independente como agentes anticancerigenos. Estes polipéptidos podem ser usados para a obtenção de toxinas ou de imunotoxinas recombinantes para a profilaxia e terapias de cancro ou outras doenças relacionadas com a proliferação de células endoteliais e de células transformadas. Estes polipéptidos e suas combinações possíveis com prodigiosinas podem ser utilizados na indústria farmacêutica para se obter preparações de vacinas, composições terapêuticas ou de reagentes de diagnóstico para uso humano ou animal, contra o cancro e outras doenças proliferativas, que sejam altamente seletivos e de grande espetro de ação.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A interação de S. marcescens com células tumorais CB Hep.l gera linhagens bacterianas com alta capacidade antiproliferativa e com a expressão de proteínas modificada. A - célula sobrevivente. Após 72 horas, a 10 sobrevivência celular foi estimada pelo método de MTT. A linhagem CMIB 4202 mostrou um efeito anti-proliferativo forte sobre as células humanas tumorais HEp-2, enquanto que o efeito da linhagem SM1995 era muito fraco. Estes resultados eram a média de três experiências independentes com quatro réplicas por amostra. B-SDS-PAGE eletroforese (coloração de prata) . CMIB 4202 proteínas solúveis sobre-expressas migrando entre cerca de 25 e 50 kDa.

Figura 2. Atividade anti-proliferativa das frações 25 e 50 kDa na linha de células HEp-2. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT e expressa como uma percentagem em relação às células de controlo. As frações foram recuperadas a partir do gel SDS (corado com zinco-imidazol) e re-naturalizadas. A fração 25kDa mostra uma forte atividade anti-proliferativa (IC50 0,35 nM / mL) , enquanto o p50 foi capaz de inibir o crescimento. Quando Zn4SC>2 5 μΜ foi adicionado à p50, foi observado um aumento da atividade anti-proliferativa (IC50 45 nM / mL) , embora inferior à do p25. As curvas foram geradas a partir dos valores médios de cinco experiências independentes e estão representadas com o correspondente desvio padrão (SD).

Figura 3. Cinética da expressão da proteína e da prodigiosina pela linhagem CBMI 4202. A expressão de prodigiosinas ao meio de cultura ocorre durante o período de transição entre a fase de crescimento e a fase estacionária, em que CBMI 4202 atinge o seu maior tempo de duplicação. A - Cinética do tempo de duplicação celular. B

- Eficácia da expressão prodigiosina (produto/biomassa). C - Cinética do efeito anti-proliferativo em células HEp-2, determinada pelo método MTT. D - Cinética do crescimento celular determinada pela densidade ótica e pela biossíntese da proteína. 11

Figura 4. Sensibilidade de células humanas tumorais e normais ao tratamento com MG2327. As células normais têm baixa sensibilidade e as de origem hematopoiética são menos sensíveis do que o resto das linhagens celulares analisadas. Entretanto as células ativadas por crescimento (HUVEC bFGF) e as células tumorais derivadas de lesões malignas são mais sensíveis.

Figura 5. Análise da sobrevivência dos ratos BALB/c que foram tratadas ou não com a preparação MG2327 e desafiados com o tumor CB-Hep.l. A - A dose de 1 mg/kg induziu uma regressão do tumor em 60% dos animais tratados, enquanto 100% dos animais não tratados morreram até ao dia 60. B -Quarenta e cinco dias após a inoculação de células de tumor, os animais não tratados mostraram um estado extremamente enfraquecido, com a presença de tumores sólidos e ascicos, enquanto que os tratados com 1 mg/kg não apresentavam evidências de tumores e sobreviveram por mais de 300 dias.

Figura 6. Efeito anti-tumoral da MG2327 no modelo tumoral 3T316. A - O gráfico das médias diárias para cada grupo, revela diferenças estatisticamente significativas entre os volumes tumorais de animais tratados e não tratados (P <0,003). A análise do crescimento do tumor ao longo do tempo não evidencia variações significativas (p = 0,109) para o grupo tratado com MG2327, enquanto que o grupo de controlo negativo apresentou um aumento significativo neste parâmetro (p = 0,04). B - sobrevivência de animais tratados e não tratados.

Figura 7. Isolamento dos princípios ativos a partir da proteína MG2327. (A) A eletroforese em SDS-PAGE (12,5% de poliacrilamida), revelada por coloração com Coomassie. A 12 linha 1 mostra a amostra correspondente à eluição com NaCl 0,2 M, pH 8,00, onde uma banda de proteína de 50 kDa correspondente pode ser apreciada. A linha 2 mostra uma banda de proteína de 25 kDa. (B) o efeito anti-proliferativo das proteínas HEp-2, p50 e p25 em células tumorais humanas. Resposta da dose relativamente à p25, p50 e MG2327 expressa em termos de concentração total de proteínas.

Figura 8. Efeitos anti-proliferativos dos princípios ativos isolados de MG2327 em células HEp-2. Os 50 e 25 kDa proteínas incluídas em MG2327 mostraram uma atividade de inibição de crescimento. A combinação destas proteínas com prodigiosinas reduziu a dose capaz de inibir o crescimento de 50% das células tumorais em comparação com o grupo de controlo (IC50) .

Figura 9. SDS-PAGE e Western Blot. (A) padrão de proteínas obtidas a partir de MG2327 utilizando gel SDS-PAGE (12%) (manchas prateadas). As bandas de proteína de cerca de 50 e 25 kDa (setas) foram cortadas a partir de um gel similar de zinco-imidazol, naturalizado de novo e executado de novo em um novo SDS-PAGE. Este foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e o Western Blot foi desenvolvido com um anticorpo policlonal anti-p50 obtido em cabras. Os anticorpos policlonais foram capazes de reconhecer a p25 e as degradações do p50 e não reconheceram as bandas de proteínas não afins (Neg C) • Figura 10. p50 autólise. A - eletroforese SDS PAGE: 1 - 24 "C, 2 - 37 "C, 3 - 45 "C , 4 - 60 °C, 5 - 4 °C. B - A análise densitométrica de p50 e p25 mostrou que, com o aumento da temperatura de incubação, a intensidade da banda p50 é reduzida enquanto que a intensidade da banda p25 é aumentada. 13

Figura 11. p50 purificada por cromatografia DEAE de fluxo rápido Sepharosa. 0 p50 (eluido com 0.2M NaCl), gerou degradações com maior atividade anti-proliferativa do que a molécula parental.

Figura 12. Atividade enzimática de p25 e p50 obtida por diferentes cromatografias. A - p25 não apresenta atividade, enquanto as p50 mostraram atividade enzimática. B - A atividade enzimática de p50 foi totalmente inibida com 7mM de EDTA.

Figura 13. MG2327 induziu a fragmentação do ADN dependente do tempo da das células tumorais P3X63Ag8. Uma vez que a 6 horas de incubação, os fragmentos oligonucleossomaticos podem ser observados e eles aumentaram com o tempo, atingindo o padrão apoptótico tipico com fragmentos oligonucleossomaticos de 180-200 pares de bases a 24 horas.

Ultra estrutura células da Fig. 2 de mieloma P3X63AG8 de murina tratadas da e não tratadas (as células de controlo) com uma preparação de MG2327 (MG) a 22μρ/πι1. (A) a micrografia eletrónica de controlo P3X63Ag8 de células de mieloma de murino mostrou citoplasma e núcleo das células com ultra estrutura tipica para as células normais e ultra estrutura mitocondrial tipica para as células normais: a matriz mitocondrial tinha uma densidade mais elevada do que o citoplasma envolvente (+).. (B) corpos vacuolizados (que em parte derivam de mitocôndrias alteradas (A)), inchaço e rutura de cristãs mitocondriais estavam presentes no citoplasma (^), com núcleo normal )( + )2 h após o tratamento com MG. (C, D) o agrupamento de cristãs mitocondriais individuais fundem-se ( + ), o que também é observado após 2 horas de tratamento em (B) . (E) 14

Eletromicrografias com morfologia apoptótica: condensação (·) marginação e fragmentação da cromatina (·) , e apoptose dos corpos (Δ) às 6 h após o tratamento com MG2327. (F)

Apoptose revelada pela cromatina compactada, o núcleo revelou manchas periféricas de cromatina condensada. Note-se que o inchamento mitocondrial e perturbação de cristãs, membranas de citoplasma inteiras estavam presentes em todos os tempos diferentes. Ampliações: χβΟΟΟ (E) , x 10 000 (A,B,D), 15 000 (C) e x40 000 (F).

Figura 15. Efeito de MG2327, p25 e p50 (purificado por cromatografia) na diferenciação de células endoteliais em Matrigel. As células HMEC foram cultivadas em condições de ativação (10 ng/mL de EGF, 1 μg/mL de hidrocortisona) na presença de concentrações semelhantes de MG2327 (A) , p50 (B) e p25 (C) , sem tratamento (E) e sem ativação (D) . No gráfico (F) os resultados de três experiências independentes são agrupados, mostrando a atividade inibitória da MG2327 e dos seus componentes na formação de redes tubulares em matrigel. Tanto o MG2327 como o p50 revertem completamente a ativação induzida ao nível de células não ativadas (ANOVA MG2327, p50 e CN p> 0,05). As células tratadas com p25 mostraram um índice líquido de formação inferior ao observado para MG2327 e p50 (desemparelhado t p = 0,0107 e p = 0,0498, respetivamente).

Figura 16. Sobrevivência de ratinhos BALB/c imunizados ou não com MG2327 e desafiados com células de mieloma X63. Usando 3 e 6 doses de 1 mg/kg de MG2327, 100% dos animais imunizados rejeitaram o tumor mieloide.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Obtenção da linhagem CMIB4202. 15 A fim de obter linhagens de bactérias produtoras de moléculas anti-tumorais, o tipo selvagem de Serratia marcescens SM1995 isolado a partir da superfície ventral de ratinhos BALB/c foi misturado com as células tumorais CB-Hep.l (Alemán, MR, Valdés, R., Pérez, M., Ibarra, N., Reyes, B., González, M., Mendoza, 0., Padilla, S., Agraz, A. e Rodriguez, MP 2000. Biopharm 13:48-52) e foram inoculados por via intraperitoneal em ratos BALB/c, previamente inoculados 10 dias antes com líquido pesado petrolato. Oito dias após a inoculação das células de misturas foram realizadas extrações de fluido ascítico a cada 2 dias. A cinética de crescimento do tumor foi analisada e o controlo microbiológico foi realizado para as ascites de cada animal que apresentavam regressão do tumor.

As bactérias isoladas foram cultivadas em diferentes meios e condições de cultura. Os sobrenadantes da cultura foram esterilizados por filtração utilizando filtros de membrana de 0,22 μπι e a sua toxicidade foi avaliada nas células CB-Hep.1. A linhagem com maior citotoxicidade, foi depositada com o número de acesso CMIB4202 na Collection of Microorganism with Biotechnological Importance of the Center of Genetic Engineering and Biotechnology, Cidade de Havana, Cuba. CMIB4202 e sua linhagem parental SM1995, foram cultivados em paralelo num fermentador 5L, num meio de peptona-glicerol a 28°C. O filtrado estéril de CMIB4202 evidência uma atividade dependente da dose, enquanto que o de SM1995 possui apenas uma pequena atividade sobre a linhagem de células de cancro humano HEp-2 (Fig.lA) no ensaio anti-proliferativo utilizando o método de MTT (Skehan, P., Storeng R., Scudiero, D., Monks, A. McMahon, J., Vistica, D., Warren, JT, Bokesch, H., Kenney, S. e Boyd, MR 1990. J. Natl. Cancro. Inst. 82:1107). 16 A linhagem CMIB4202 fez a sobre-expressão nas proteínas solúveis nas gamas de 45-50 e 20-30 kDa (50 e 25 kDa como determinado por SDS-PAGE, com um coeficiente de determinação de 0,984), Fig. 1B. A fração de p25 recuperada a partir das bandas apresentadas em géis de SDS manchados com zinco-imidazole (Hardy, E.,Santana, H., Sosa, A., Hernández, L., Fernández-Padrón, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical Biochemistry. 240:150) apresentou uma forte atividade anti-proliferativa dependente da dose em células HEp-2, enquanto que a fração de p50 não inibe o crescimento celular. No entanto, quando a p50 foi incubada com 5 μΜ Zn2S04 mostrou atividade anti-proliferativa mas inferior como o observado para p25 (Fig. 2) . O IC50 das frações p25 e p50 foi 0,48 nM e 16 nM, respetivamente.

[0027] Com o objetivo de comparar a capacidade de ambas as linhagens para expressar as proteínas, foi aplicada uma análise fatorial ANOVA. O valor da probabilidade de interação não foi significativo (p = 0,93). Por outro lado, a probabilidade de ambos os efeitos principais apresentados por ambas as proteínas são expressas em quantidade diferente significativamente (P = 0,01) e esta quantidade é altamente dependente da linhagem (P = 0,0004). Além disso, não houve diferenças significativas na expressão destas proteínas entre ambas as linhagens (P <0,001). EXEMPLO 2. Obtenção da preparação anti-proliferativa do MG2327.

Para a obtenção de uma preparação anti-proliferativa, a partir da linhagem de S. CMIB4202 marcensces, foi feito 1L de cultura de microrganismo e meios de cultura ótimos para produzir moléculas com interesse (Fig. 3). A cultura 17 CMIB4202 foi centrifugada a 12 000 g e 4°C durante 30 minutos. O sobrenadante foi recolhido e subsequentemente filtrado através de corte molecular de 0,2 μτη em condições estéreis. O volume do sobrenadante foi reduzido em 10 vezes nas mesmas condições de esterilidade. O volume do sobrenadante foi reduzido 10 vezes utilizando uma membrana com limite de exclusão de 10 kDa e dialisado contra PBS a 4°C durante 24 h, em condições fisiológicas. O material dialisado foi filtrado em condições estéreis, e foi dispensado em cristais apirogénicos em frascos de 5 mL. A preparação foi armazenada a 4°C e nomeada MG2327. A escalada para fermentadores de 5L foi realizada com as condições já estabelecidas na tela: meio de peptona glicerol a 28° C durante 14 h, 1 vvm de arejamento, 250 rpm e 0,1 de densidade ótica inicial. O meio de cultura foi ajustado para um pH fisiológico, e a fermentação foi realizada em pH neutro livre. Os passos restantes foram realizados da mesma forma como no agitador. EXEMPLO 3. Caracterização da atividade anti-proliferativa da preparação MG2327 "in vitro".

Para a caracterização da atividade anti-proliferativa de MG2327 "in vitro" foi avaliado um painel de linhas celulares humanas (Tabela 1). Um total de 2000 células, exceto para PBMC (20000), foi semeado em poços de cultura de 96 poços, e diferentes concentrações de MG2327 foram adicionadas. Após 72 horas, o número de células sobreviventes foi estimado por adição de MTT (Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S. e BOYD, M. R. 1990. J Natl Câncer Inst. 82:1107). Os produtos solúveis de formazan foram detetados a 540 nm em um leitor de varrimento múltiplo de placas. MG2327 mostrou uma ampla 18 gama de atividade citotóxica contra as linhagens de células humanas estudadas. 0 IC50 estava na gama de μg/mL.

Tabela 1. Células e meios de cultura utilizados no estudo "in vitro" FIBHUM FIBROBLASTO DO PREPÚCIO HUMANO, P3-6 DMEM15 % FBS*, INSULINA 30 μβ/ML m G/ML H82 Carcinoma Humano do Pulmão RPMI 1640, 10% FBS MDA- MB145S Adenocarcinoma Humano da Mama DMEM, 10% FBS Colo- 205 Carcinoma Humano do colon RPMI 1640, 10% FBS HT1080 Fibrosarcoma Humano DMEM, 10% FBS Hela Carcinoma Humano do colo do útero DMEM, 10% FBS HEp-2 Carcinoma Humano da laringe MEM, 10% FBS HepG2 Hepatocarcinoma Humano DMEM, 10% FBS A37 5 Melanoma Humano DMEM, 10% FBS PBMC Células periféricas mononucleares Humanas RPMI 1640, 10% FBS, IL-2 HuT7 8 Linfoma cutâneo de células T Humano RPMI 1640, 10% FBS HL60 Leucemia promielocitica humana RPMI 1640, 10% FBS K562 Eritroleucemia humana RPMI 1640, 10% FBS CRL 1682 Adenocarcinoma do pancreas Humano RPMI 1640, 10% FBS A 431 Adenocarcinoma da vulva Humano RPMI 1640, 10% FBS SiHa Carcinoma do colo do útero humano RPMI 1640, 10% FBS CaSki Carcinoma do colo do útero humano RPMI 1640, 10% FBS HUVEC Células endoteliais vasculares humanas M199 30% FBS 10 ng/mL bFGF *FBS: Soro Fetal Bovino A seletividade de MG2327 foi comparada com a droga comercial doxorrubicina (DXR) através da linha de células HT1080 (a partir de um fibrossarcoma) e de fibroblastos primários. 0 ensaio anti-proliferativo utilizado foi 19 descrito acima. Diluições em série de DXR e da preparação MG2327 foram feitas a partir de 10 μρ/ιτΛ, foi gerada uma curva de cinco pontos. A proporção de mortalidade foi calculada para cada ponto como sendo a relação entre a percentagem de mortalidade para HT1080 e a percentagem de mortalidade para os fibroblastos primários. As diferenças mais elevadas foram detetadas para as concentrações mais baixas testadas (MG2327 9:1, DXR 1,7:1). O MG2327 foi muito seletivo em concentrações abaixo de 2 μρ/ιπύ.

As células HEp-2 originadas de células de um carcinoma da laringe são muito resistentes ao anti-tumoral utilizado em clinica em comparação com as outras linhas celulares analisadas. Por esse motivo, foi utilizado um modelo para os estudos "in vitro" dos efeitos da preparação MG2327. Uma comparação das curvas de citotoxicidade geradas para células HEp-2 tratadas com drogas anti-tumorais conhecidas, mostrou resultados semelhantes (40%) de proliferação de 3 μρ/ηϋΐ para a preparação de MG2327, Cisplatina (CDDP) , Doxorrubicina (DXR), Vincristina (VC), Vinblastina (VB) e Taxol (TX) (p> 0,05, teste de ANOVA). Nas mesmas condições outros anti-tumorais como Ara C, Metotrexato (MTC), Bleomicina (Bleo) e Ciclophosfamida (CPA), não mostraram efeitos. O CDDP é um dos anti-tumorais autorizados pela FDA para o tratamento do cancro da laringe, e a análise das curvas de sobrevida para as preparações MG2327 e CDDP apresentaram valores semelhantes para o IC10, IC50 e IC90. 0 estudo de sensibilidade das diferentes linhas de células de cancros ou células não cancerosas (Fig. 4) mostrou que linhas de células normal apresentam menos sensibilidade enquanto que a de melanoma, carcinoma de laringe, fibrossarcoma, hepatocarcinoma e carcinoma do colo do útero (portador do vírus do papiloma humano), são muito 20 sensíveis. Os carcinomas de origem hematopoiética são menos sensíveis. As células HUVEC ativadas a crescer são mais sensíveis para a preparação de MG2327 do que as não ativadas.

Os resultados anteriores mostram que a preparação MG2327 tem um largo espetro de ação citotóxica sobre linhas de células malignas, com efeito seletivo sobre as células dos tumores/transformadas e ativam as células em crescimento. EXEMPLO 4 Atividade anti-tumoral da preparação MG2327.

Para demonstrar a atividade anti-tumoral da preparação MG2327 utilizamos ratinhos BALB/c, nos quais foram implantados intraperitonealmente (i.p.) células tumorais CB-Hep.l, de origem mieloide, capazes de dar origem a tumores ascíticos de murina (Fontirrochi, G., Duenas, M., Fernández de Cossio, M.E., Fuentes, P., Pérez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. e Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). Após 10 dias, os ratinhos foram injetados i.p. com MG2327 ou PBS. Sessenta por cento dos animais tratados com 1 mg/kg de peso sobreviveram, enquanto que apenas 25 por cento dos do grupo de controlo viveram 45 dias após o tratamento ter sido iniciado (Fig. 5). A regressão total do tumor foi observada em todos os animais sobreviventes tratados, que apresentam um estado saudável, enquanto que nos controlos os tumores progrediram formando grandes massas sólidas, e os animais exibiram um estado geral de falta de saúde.

Os ratinhos BALB/c portadores de um tumor de fibroblastos transformado com E6/E7 aumentaram a sobrevivência após o tratamento com a preparação MG2327, mostrando uma redução significativa do volume do tumor. 21

Além disso, para avaliar a atividade anti-tumoral de MG2327, foi usado um modelo de cancro associado ao virus do papiloma humano (HPV16), desenvolvido por Hernández et al. (Hernández, P., Merina, N., López-Ocejo, 0. e Arana, MJ 2000. Biochem Biophys Res Commun. 270:119-124). Dois grupos de ratinhos BALB/c foram inoculados subcutaneamente (s.c.) com 2xl06 células 3T316 na zona ventral esquerda. Após 48 horas, numa dose de 0,75 mg/kg de peso de PBS ou MG2327 foi administrado s.c., perto da inoculação de células primárias no grupo de controlo, as medições diárias foram realizadas com um paquímetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula V = 0,52 x a2 x b, onde a é a largura e "b" é o comprimento do perímetro horizontal do tumor (Hernández, P., Merina, N., López-Ocejo, O. e Arana, M. J. 2000. Biochem Biophys Res Commun.270:119-124) . O comportamento está mostrado na Fig. 6.

As diferenças no tempo de desenvolvimento do tumor foram estatisticamente significativas (p = 0,0054) entre os animais tratados e os animais não tratados. O estudo da relação do tempo: o tratamento com o teste ANOVA revelou que a mesma magnitude da diferença não se mantém entre os grupos tratados e não tratados, o que indica a existência de uma diferença com relação ao tratamento aplicado aos animais.

Quando um teste de Wilcoxon foi aplicado aos dados emparelhados para as medições entre os dias 21 e 45 de cada grupo, detetou-se um aumento significativo do volume do tumor para o grupo de controlo (p = 0,043), não sendo este o caso para o grupo tratado (Fig. 6A) . Para analisar a existência de diferenças significativas entre os grupos em cada momento de avaliação, foi aplicado um teste de Mann-Whitney U que detetou diferenças significativas, exceção feita ao primeiro ponto (P <0,01). Além disso, verificou-se 22 uma diferença significativa na velocidade de crescimento do tumor. As curvas de crescimento foram ajustadas para uma linha, e os declives foram calculados a partir da equação gerada pelo melhor ajuste. A comparação do declive indica que o tumor no grupo de controlo cresceu a uma velocidade significativamente mais elevada que a observada para o grupo tratado (p = 0,0088).

Os ratos do grupo de controlo morreram entre 45 e 64 dias, devido à implantação do tumor, enquanto que os animais no grupo tratado começaram a morrer no dia 52, com uma sobrevivência de 20%, mantida no tempo (170 dias), Fig. 6B.

Ajustando os dados de sobrevida a um modelo de hierarquia Bayesiana (regressão Weibull com 500 iterações) obtivemos uma diferença estatisticamente significativa (p = 0,02447), que foi confirmada quando foi demonstrado que os intervalos de confiança para o tempo médio de sobrevivência eram totalmente exclusivos. EXEMPLO 5. Frações da preparação MG2327. Isolado das biomoléculas não proteicas. A separação das frações MG2327 foi realizada para determinar a sua composição, e as frações foram avaliadas quanto à capacidade de inibir o crescimento celular do tumor da linha celular humana Hep-2. A fração de polissacarídeo (tr = 6,85 min) foi separada por cromatografia em gel Aminex HPX 87-N (dimensões: 300 x 7,8 milímetros, fluxo: 0,5 ml/min). Foram utilizados padrões de frutose tr = 13,15 min, de glicose tr = 12,12 min dissacarídeo, tr = 9,40 min., trissacarídeo tr = 8,24 min., polissacarídeo tr = 7,01 min. A fração de pigmento foi separada em uma coluna de butilo TSK da MERCK, equilibrada com fosfato 2 0 mM, pH = 7, em que permanecem retidas na 23 matriz, subsequentemente foi eluida empregando etanol absoluto. 0 espetro de absorção (etanol a 100% a pH 5,00) do produto obtido mostrou uma banda com o máximo de 470 e 4 90 nm e um pico máximo em 537 nm, que correspondem respetivamente com caracteristicas descritas para os monómeros e dímeros de, respetivamente, a relatada atividade anti-proliferativa (Pérez-Tomas, R. e Montaner, B. 2003 Histol. Histopathol. 18: 379-385; Montaner, B., and Pérez Thomas, R. 2003. Curr Câncer Drug Targets. 3:57-65). O polissacarideo isolado não mostrou efeito inibitório, enquanto que a fração correspondente à prodigiosina mostrou atividade anti-proliferativa dependente da dose. EXEMPLO 6. Frações da preparação MG2327. Isolamento das biomoléculas das proteínas com efeito antiproliferativo, que medeiam apenas um passo de cromatografia: permuta iónica com um gradiente descontinuo de NaCl. A preparação MG2327 foi aplicada a uma matriz de DEAE Sepharose Fast Flow; equilibrada com 50 mM de tampão fosfato pH 8,00. A eluição foi realizada com um gradiente de NaCl descontinuo: 50 mM de tampão de fosfato 0,1 M NaCl, pH 8,00, 50 mM de fosfato 0,2 M de tampão de NaCl, pH 8,00, 50 mM de tampão de fosfato de 2 M NaCl, pH 8,00 e finalmente, a fração de pigmento absorvido na matriz foi eluido com 70% de etanol absoluto. A fração corresponde a 0,2 M NaCl, pH 8,00 e o primeiro eluato recolhido da fração não aderente (chamada a passagem), mostrou atividade anti-proliferativa dependente da dose no teste descrito anteriormente. A eletroforese SDS-PAGE foi observada numa banda de proteína com a altura de 50 kDa e uma banda (pureza> 90%) de altura máxima de 25 kDa, respetivamente, (Fig. 7A). O peso molecular foi 24 calculado mediada a função que relaciona o peso molecular do padrão comercial com a distância de migração das bandas; r2 = 0,984. A figura 7B. Mostra o efeito anti-proliferativo de p50 e de p25 em comparação com a preparação MG2327. O p50 e p25 mostraram efeito anti-proliferativo sobre a linha celular HEp.2. A Tabela 2 mostra os resultados da comparação entre p50, p25 e a preparação MG2327, empregando a análise estatistica de variância (ANOVA) . Ela compara a resposta de cada dose utilizada. É possível observar diferenças significativas entre as atividades de três das amostras analisadas. Estas diferenças dependem das doses empregues. A elevada concentração dos componentes de preparação (9 e 18 μρ/ιπΐ,) mostra que existem diferenças significativas entre a fração de 25 e 50 kDa, onde a fração de 25 kDa foi mais ativa, não sendo deste modo para diminuir as concentrações (2,25 e 4,5 μρ/mL).

Tabela 2. Resultados comparativos entre os componentes da proteína e a preparação MG2327, utilizando o método estatístico de análise de variância (ANOVA).

Concentração ANOVA ^g/mL) Entre-amostras 25-50 25-MG2327 50-MG2327 2,25 0,0110 0,0649 0,0089 0,0958 4,5 0,0316 0,0685 0,0081 0,3728 9 0,0040 0,0318 0,0151 0,4271 18 0,0015 0,0243 0,3206 0,0243

Entre o componente de proteína 50 kDa e a preparação MG2327 existe uma diferença significativa para a dose de 18 μρ/mL em que a preparação era mais ativa, obtendo-se a inibição do crescimento de 100% das células tumorais, enquanto o 25 componente de proteína 50 kDa poderia inibir cerca de 80% do crescimento. Para as doses de 2,25, 4,5 e 9 μρ/πΛ não existe nenhuma diferença significativa entre a resposta provocada pela fração 50 kDa e a preparação MG2327.

No entanto, a atividade do componente da proteína 25 kDa foi significativamente diferente da preparação de MG2327 em doses de 2,5, 4,5 e 9 \xq/mL, em que o componente de proteína de 25 kDa mostrou atividade biológica e para as doses de 18 μρ/ιηΐ, não foi observada diferença significativa, uma vez que ambas as amostras eram capazes de inibir 100% das células tumorais.

Estes resultados evidenciaram que o componente de proteína de 25 kDa tem uma maior capacidade para inibir o crescimento das células de tumores, do que o componente de proteína 50 kDa e de que ambos os componentes apresentaram atividade biológica in vitro de uma forma independente.

Esta tabela de purificação foi repetida várias vezes com resultados homogéneos consistentes. EXEMPLO 7. Composição do polipéptido de Serralisin com prodigiosina.

Os componentes proteicos e a prodigiosina foram formulados de uma mesma composição que aumentou significativamente (P <0,005) o efeito inibidor no que diz respeito ao seu efeito independente. Na Fig. 8 o gráfico da atividade antiproliferativa da biomolécula IC50 isolada da preparação MG2327 e das suas composições. A preparação MG2327 é designada como da proteína total. A composição foi realizada mantendo a mesma relação de proteína e de prodigiosina empregue quando os componentes independentes foram avaliados. Em tal composição a prodigiosina pode 26 estar em concentrações de 0,1 - 100 nM, e os fragmentos de Serralisin de 0,1 - 150 μg/mL. EXEMPLO 8. p50 género p25.

Os anticorpos anti-p50 obtidos em carneiros foram utilizados para conhecer a relação entre p25 e p50. A MG2327 foi aplicado a um gel SDS-PAGE a 12% e com manchas de Imidazol-zinco (Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernandez, L., Fernández-Padrón, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical biochemistry. 240:150-152).

Aproximadamente, as bandas de proteínas foram cortadas em 50 e 25 kDa, (Fig. 9), naturalizadas de novo em gel e aplicadas a SDS-PAGE. Estas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose e o Western Blot foi realizado. O anticorpo policlonal anti-p50 reconhecido a p25 e os fragmentos de degradação de p50. Os tamanhos moleculares foram estimados com marcadores de pesagem molecular de pré-manchas (Bio-Rad). O Western blot mostrou ser representativo de três experiências iguais. EXEMPLO 9. A degradação da fonte de produtos p50 à temperatura são mais ativos do que o 50 em si. O p50 obtido no exemplo 6 foi incubado a diferentes temperaturas e a sua atividade anti-proliferativa foi testada em células HEp.2, utilizando o método de MTT já anteriormente descrito. O padrão de degradação produzido por cada condição (4, 37, 45 e 60 °C) foi analisado por densitornetria. A produção de fragmentos devido à degradação era diretamente proporcional com o incremento da temperatura, portanto, quando a quantidade de p50 diminuiu, p25 aumentou 27 como produto da degradação de p50 (Fig. 10). Os produtos da degradação de p50 demonstraram maior atividade anti-proliferativa do que a p50 original (Fig. 11). EXEMPLO 10. p25 induz a regressão de tumores malignos. A proteína p25 obtida por cromatografia já descrita no Exemplo 6, foi aplicada à cromatografia de fase inversa de (RP-HPLC), para verificar a sua homogeneidade e pureza. Um gradiente de acetonitrilo de 0-100 - em 100 min foi usado. Foi observado um pico de proteínas com uma pureza maior de 90%, o que demonstrou a homogeneidade do eluído purificado. A p25 foi depois injetada por via i.p. em ratinhos BALB/c após 8 dias de implantação do tumor mieloide P3X63Ag8 e de este estar perfeitamente desenvolvido. As doses de 22 μρ/]<:ρ de peso de p25 induziram a regressão total em 80% dos animais tratados. Os animais de controlo negativo morreram ao fim de 30 dias, quando já tinham desenvolvido tumores sólidos. EXEMPLO 11. A p50 é uma metaloprotease, enquanto p25 não tem atividade proteolítica. O método modificado de Anson e Mirsky (Anson, M.L., Mirsky, A.E. 1932. J. Gen. Physiol. 16: 59) utilizando caseína como substrato, foi ajustado no nosso laboratório com Tripsina (y=1.9314 x -0.682; R2 = 0,999). As frações proteicas obtidas na cromatografia descritas no Exemplo 6 foram testadas com o presente método. A p50 mostrou que a atividade proteolítica foi inibida com 7 mM de EDTA, que acabou por ser uma metaloprotease. A p25 não mostrou nenhuma atividade enzimática, Fig. 12. 28 0 método de zimografia de gel utilizando gelatina como substrato (Vacca , A., Lurlaro, M. , Ribatti, D., Minischetti, M., Nico, B., Ria, R., Pellegrino, A. e Dammacco, F. 1999. Blood. 94:4143-4155), foi utilizado para verificar a atividade proteolitica de p50 e p25. Além disso foi analisada a capacidade de degradação enzimática da p50. Neste ensaio da proteina p50 obtida por cromatografia descrita no Exemplo 6 mostrou atividade enzimática. A fração de proteina de banda do gel com a altura de 25 kDa (de MG2327) mostrou atividade proteolitica, enquanto que a p25 obtida por cromatografia não mostrou esta atividade proteolitica. EXEMPLO 12. Identificação de polipéptidos anti-proliferativos de 25 kDa a partir de MG2327.

Para a identificação de proteinas com atividade anti-proliferativa presentes na banda de 25 kDa, o gel SDS-PAGE foi clivado (descrito no Exemplo 8), utilizando MG2327. A banda foi incubada durante 5 min em 1 ml de tampão Tris/HCl (100 mM, pH 8,5) até que essa banda ficou totalmente translúcida. A banda foi clivada em pequenos cubos de cerca de 1 mm3, absorvida com acetonitrilo, re-hidratada num pequeno volume de bicarbonato de amónio (25 mM) contendo tripsina ou LEP até uma concentração de 12,5 ng/μΕ. A digestão em gel foi incubada a 37 °C durante 18 h num misturador termoestático.

Os péptidos resultantes da digestão LEP foram analisados por MALDI-MS. Os iões mono isotópicos de sinais mais intensos foram introduzidos no programa ProFound para a identificação da sequência da proteina de interesse da base de dados. Apesar de não termos realizado restrição taxonómica durante a busca na base de dados, a protéase de 29 50 kDa de Serratia marcescens EC 3.4.24.40 foi classificada como tendo a maior similaridade. Quatro péptidos (51-57, 58-66, 67-80 e 81-90) pertencem à região N-terminal e um (402-409) pertence à região C-terminal da proteina. O tamanho molecular EC 3.4.24.40 difere dos presentes no grupo analisado (cerca de 25 kDa, estimado por SDS-PAGE). Este achado sugere que a banda de 25 kDa contém dois fragmentos de 25 kDa que migram em conjunto à semelhança de 50 kDa proteina EC 3.4.24.40, pertencente à familia Serralisin.

Para confirmar esta hipótese foi desenvolvida uma digestão triptica da banda KDa 25. O espetro ESI-MS de péptidos removidos foi simplificado e os sinais mais intensos foram introduzidos no programa Profund. A saida mostrou a mesma proteina previamente identificada (EC 3.4.24.40). A sequência que cobre a digestão triptica (21%) foi maior do que antes da digestão (10%). O mapa de sequência da cobertura apresentou sete péptidos que coincidiam muito com alguns dos fragmentos tripticos PRZN_SERMA1PRZN_SERSP das proteínas. Cinco deles (28-41, 58-66, 67-80, 81-90 e 163-171) correspondentes à região N-terminal, enquanto que os restantes dois péptidos (351-373 e 374-393) eram correspondentes a região C-terminal. Estes resultados não só confirmaram a identificação prévia da proteína, mas também sugeriram que o mapa abrangia a presença de dois fragmentos que migram em conjunto de 25 kDa da proteína identificada como PRZN_SERMA/PRZN_SERSP, na faixa analisada O espetro ESI-MS/MS correspondente aos péptidos da regiões N- e C-terminal das proteínas anteriormente mencionadas foi interpretado manualmente e as sequências parciais foram extraídas para a sua identificação, Tabela 3.

Cl

Tabela 3. Interpretação inam cinco péptidos presentes na t d do espetro ESI-MS/MS dos nda de 25 kDa. Os péptidos 30 30 partir de 1 pertencem PRZN SEKMA/PRZN SERSP, região N-terminal de proteínas quanto que os péptidos -5 :orresponaem a fião C-termina! nessas mesmi proteínas. rtii Etiqueta de Sequência m2 Sequência de péptidos z m/ z esperado m/ z teórico Erro 705,47 AQENS 1235,74 28-41 2 792,91 792,89 0,02 522,28 TFSF 1004,54 58-66 2 559,29 559,28 0,01 677,38 AVN 961,58 67-80 2 692,35 692,34 0,01 730,40 EAS 1017,58 81-90 2 582,79 582,79 0,00 1117,84 GGFX 1493,08 351-373 2 1031,45 1031,48 0,03

Com os métodos utilizados e com os resultados obtidos concluiu-se que na banda 25 kDa analisada existe uma mistura de proteínas que tem fragmentos com similaridade com o N e o C-terminal das proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. EXEMPLO 13. Identificação da proteína p50.

Para identificar a proteína p50 com atividade anti- proliferativa, a fração de proteína que corresponde a proteína 50 kDa, obtida a partir do protocolo de purificação descrito no Exemplo 6, foi digerida com endoproteinase Lys-C. A identificação dos péptidos foi realizada por meio de sequência e pela Degradação de Edman automática de e um espetrómetro de massa JMS HX-110 de setor duplo, com canhão FAB. A partir dos resultados obtidos e dos alinhamentos realizados pela Software Swissprot e PIR, concluiu-se que tal proteína pertence à família Serralisinas, com 50 kDa de peso molecular. A maior similaridade foi encontrada para a espécie com identificação PRZN_SERSP e PRZN_SERMA no banco Swissprot. A massa molecular de todos os péptidos analisados por espetrometria de massa coincidiu com a quantidade teórica esperada de péptidos destas proteínas de digestão com endoproteinase Lys-C. 31 EXEMPLO 14. Identificação de p25 purificado por cromatografia.

Para identificar a proteina de 25 kDa com atividade anti-proliferativa, apoptótica e anti-angiogénica, a p25 purificada por Cromatografia em DEAE descrita no Exemplo 6 foi aplicada a SDS-PAGE. A banda de proteina foi lavada durante cinco minutos com 500 μ]0 de água, manchada com uma solução de ácido cítrico 100 mM, em seguida, foi lavada de novo com água MilliQ, cortada em pequenos cubos de aproximadamente 1 mm3. Depois, adicionou-se acetonitrilo até que a sua desidratação e o excesso foram eliminados. Os cubos de gel foram totalmente desidratados numa centrífuga de evaporação e, subsequentemente, hidratados de novo numa solução de bicarbonato de amónio (50 mM) que continha tripsina a uma concentração de 12,5 μρ/ηϋΐ. Depois disso foram incubados numa centrifugadora termostática, durante 30 minutos a 37°C durante a noite.

Os péptidos foram eluídos passivamente com adição de 20 μ]0 de solução de bicarbonato de amónio e, adicionalmente, incubados a 37°C durante 45 minutos. Os péptidos foram extraídos utilizando o ZipTipcl8 ™ e, subsequentemente, a mistura foi acidificada adicionando à reação 5 μΐ de ácido fórmico puro, e os péptidos foram novamente extraídos utilizando o ZipTpci8 ™. Os péptidos aderidos à ZipTipci8 ™ foram repetidamente lavados com uma solução de ácido fórmico a 5% e, subsequentemente, eluídos num volume de 2-3 μ]1 de uma solução de acetonitrilo a 60% contendo 1% de ácido fórmico.

Os péptidos originados durante a digestão foram carregados em agulhas capilares de borosilicato e cobertas de ouro e introduzidas na fonte de ionização do espetrómetro de massa 32 geométrico híbrido ortogonal equipado com uma fonte de nano pulverização (QTOF-2 ™). 0 espetro de massa ESI-MS foi adquirido em um intervalo amplo 350-2000 Da durante 1 segundo. Os sinais mais intensos foram selecionados para a sua sequência posterior de ESI MSMS. O gás de colisão empregue foi o árgon e foi usada energia de colisão adequada para produzir uma fragmentação extensa dos péptidos selecionados, o que irá permitir a sua identificação inequívoca nas bases de dados.

Os espetros ESI-MS foram desmontados, exportados em um formato DTA e importados no programa MASCOT para fazer a identificação das proteínas nas bases de dados SwissProt e NCBInr usando a estratégia de Peptide Mass Fingerprint (PMF). Para uma identificação exata da proteína desmontada, foi utilizada uma calibração interna usando um péptido de tripsina autofotolico para corrigir um erro de 0,05 Da para fez a pesquisa dos péptidos observados no espetro e foram selecionados os sinais que tinham uma maior intensidade de 10% da intensidade do pico de base.

Quatro péptidos presentes na banda analisada foram sequenciados por ESI-MSMS (Tabela 4). Os péptidos PRZNSERMA/PRZN-SERSP pertencem à região C-terminal (indicados a vermelho na sequência da Tabela 6) , previamente identificados nos Exemplos anteriores.

Tabela 4. Péptidos pertencem ao p25 de S. marcescens, que foram sequenciados por ESI-MSMS # Sequência de aminoácido m/z tear. m/z exp Erro SEQ NO 1D 1 DFLSTTSNSQK 1226-51 1226,58 0,07 SEQ NO ID: 10 2 SAASDSAPGASDWIR 1489,75 1489,68 0,07 SEQ NO 1D: 11 3 GGAGNDVLFGGGGADELWGGAGK 2060,96 2060,87 0,11 SEQ NO ID: 12 4 TGDTVYGFSNTGR 1488,65 1488,60 0,05 SEQ NO ID: 13 33

Da mesma forma foram encontrados outros sinais que não foram sequenciados, e os valores de massa concordam muito com os valores esperados de massa para os péptidos tripticos identificados como PRZN_SERMA/PRZN_SERSP da região C-terminal das proteínas, a Tabela 5 (observado em azul na Tabela 6) . De entre estes péptidos, aparece um sinal duplo carregado que poderia corresponder ao péptido C-terminal das proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. Não foram encontrados péptidos que pudessem ser atribuídos a cortes específicos das proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP região N-terminal.

Tabela 5. Péptidos tripticos pertencentes à proteína PRZN SERMA detetada no espetro de ESI-MS. # Sequência de Aminoácidos m/ z exp. m/ z calc. Z Erro SEQ NO 1D 1 325sfsdvgglk313 455,20 455,24 2 0.04 SEQ NO 1D: 14 2 417idlsffnk424 492,24 492,26 2 0.02 SEQ NO 1D: 15 3 475ivgqvdvatdfiv487 688,35 688,38 2 0.03 SEQ NO 1D: 16

Os métodos e os resultados expostos neste exemplo foram capazes de assegurar que a banda de 25 kDa, obtida a partir da p25 purificada por cromatografia em DEAE, é altamente anti-proliferativa, e está presente um fragmento de proteínas C-terminal-C de 25 kDa PRZN_ Serma / PRZN_SERSP.

Tabela 6. Identificação da p50 e p25 obtidas por cromatografia DEAE. Na sequência, os aminoácidos que não estão presentes na proteína madura são cruzados. Sem estes aminoácidos os pesos moleculares destas proteínas são 50293,4 Da e 50595,4 Da para PRZN_SERSP e PRZN_SERMA, respetivamente. A identificação dos péptidos tripticos que diferem entre ambas as moléculas sugere que ambas as espécies podem estar presentes e até mesmo coexistir (verde (itálico) : identificado por espetrometria de massa e maroom 34 (enfatizado): identificados por degradação Edman dentro do retângulo continuo). Os péptidos marcados foram identificados no p25 obtido por cromatografia descrito no Exemplo 6. Os péptidos marcados e sublinhados foram identificados no p50 obtido por cromatografia descrita no Exemplo 6 e o péptido em (itálico) foi identificado a partir de um fragmento de gel. { RZN SERMA MQSTKKAI-SIgSSeLAAATTGYOftVPDLmYHERGNGIOrrcGKPSrSNEQflGLFITRSNQ 1 RZN SERSP MQGTKKAISITBSNrAAATTGYDAVPDtitHYHERGNGIQINGKDSFSNEQAGLFITRBNQ ************* ********************************************* 4 _ _________________ _______________ .... 1 RZN SERMA T WNG Y KVTFGQPVKÍiT FS FPD YKF3STNVAG0OTGLSKES AEQQQQAKLSLQSWADVAMITF I RZN SERSP TWNGYKyFGQEVKETFSFPDYKFSSTNVAGDTGI.SKFSAEOOQQAKLSLQSWADVANITF * ♦* * **O''í*f*>'l* ********************* *♦******·**** ***********!* - ... ........................*.........-......» « · ................................. ....................... i S 1 R2N SERMA IEyAAGQRANITEKJNYSQDRPGHXDYaT<2AYAFI.PNTIWQGQDrGGCTWYNVNQSNVf<HP: í RZN SERSP jrEWAAGQftANITFGNYSQDaPGKYDYGTQÀYAFrPNTIWQGQDLGGQrWYNVNOSNvkÍjPÍ **'***************************4*********+*#****♦************* i RZN SERMA ÂTEDYGRÔTFfHEIGHALGLSHPGDYNAGEGNPTYNDVTYAEDTRQFSLMSYWSETNTGG 1 RZN SERSP ATEDYGRQTFTHEIGHALGLSHPGDYNAGEGNPTYRDVTYAEDTROFSLMSYHSETNTGG ft,4**** ** * ** * * **** ******* ♦ ♦ «***«At«**t*#***ir***t*** » 1 I RZN SERMA DNGGHYAAAPLLDDIAAIQHLYGANPSTftT^TVYGFNSNTGWDEXSTYSNSOKVIFAAW ! RZN SERSP DNGGHYAAAPJJL0DIAAIQHLYGANLSTÇ,ra>TVYGFNSNTGRDFL3TTSNSGÇVIEAAW + •*•+*** + **'*****'*1*** + *'**·*· + *· **4 »v>-> **·« »!»»»»*»*> »** é ****** ....... í ’i ............................ RZN SERMA DAGGNDTFDFSG YTANQRX NLNSKSFSDVGGLKGNVSIAAGVTIENAIGGSGNDVIVGNA RZN SERSP DÀGGNDT FDFSGYTANQRINLNEKSFSDVGGUCGNV5IAAGVTIENAIG- PRQRLI VGNA ******* ******** **** *****ΤϊΊΓ*^ΓτΓνΤΡ'* ************** * " ^**4#* ' £ RZN SERMA ANNVLKPGAGHDVXIPGGKSGADEÍwGGÃGKÒÍ FVFáAASDSAPGASDWtRÇiFQKG IDKSDI. £ RZN SERSP ANNVLKj3GAGNI)VLPGÔ3aADEI.WGGAGKEX FVFáAASBSAPGASDWlROPQKGIDWIDL· ******>******************************************4*******^*« i 1 1 * 'RZN SERMA SSFFNÍ Çmíssdfxhfvdhf. STAGEÃÍ.LSYNÃSSNVTÕLSVNXGGHQAPDFLVK|rVGQVE( RZN SERSP SF7M1 ÍAQS3DFIHFVDHF! GAAGEALGS YNASNNVTDLS VN IGGHQAPDFLVKjtVGQVEf ,> * ***********1 * *********** * *******-*********** ***Jt*.*Jdí Γ------- η RZN SERMA 1 VATDFjy J RZN SERSP " ”1 VATOFlV ~ EXEMPLO 15. Proteínas do N-Terminal e C-Terminal com 25 kDa.

Para determinar o tamanho molecular das proteínas que possam coexistir no nível de 25 kDa em SDS-PAGE, por degradações da. PRZN_SERMA/PRZN_SER, as suas sequências foram introduzidas no programa GenRun. Os fragmentos correspondentes ao N-Terminal e C-Terminal de 25 kDa (±2 kDa) são apresentados na Tabela 7. 35

Tabela 7. Proteínas com tamanho de 25 ± 2 kD, obtidas a partir da degradação da PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. 0 peso molecular foi determinado usando o programa GenRun, a partir das extremidades N-Terminal e C-terminal

Proteína Sequência SEQ NO ID ARAI MSYWSETNTGGDNGGHYAAAPLLDDIAAIQHLYGANPSTRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTT SNSQKVIFAAWDAGGNDT FDFSG YTANQRINLNEKS FSDVGGLKGNVSIAAGVTIENAIG GSGNDVIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELHGGAGKDIFVFSAASOSAPGASDWIR DFQKGIDKIDLSFFNKEANSSDFIHFVDHFSGTAGEALLSYNASSNVTDLSVNIGGHQAP DFLVKIVGQVDVATDFIV SEQ NO ID: 1 ARA 2 MSYWSETNTGGDNGGHYAAAPLLDDIAAIQHLYGANLSTRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTT SNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFSDVGGLKGNVSIAAGVT IENAIG FRQRLIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAGKDIFVFSAASDSAPGASOHI RD FQKGI DKIDLSFFNKEAQSSDFIHFVDH FSGAAGEALLSYNASNNVTDLSVNIGGHQAPD FLVKIVGQVDVATDFIV SEQ NO ID: 2 ARA 3 TRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTTSNSQKVIFAAHDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFS DVGGLKGNVSIAAGVTIENAIGFRQRLIVGNAANNVEKGGAGNDVLFGGGGADELHGGAG KDIFVFSAAS DSAPGASDWIRDFOKGIDKIDLSFFNKEAQSSDFIHFVDHFSGAAGEALL SYNASNNVTDLSVNIGGHQAPDFLVKIVGQVDVATDFIV SEQ NO ID: 3 ARA 4 TRTGDTVYGFNSNTGRDFLSTTSNSQKVIFAAWDAGGNDTFDFSGYTANQRINLNEKSFS DVGGLKGNVSIAAGVTIENAIGFRQRLIVGNAANNVLKGGAGNDVLFGGGGADELWGGAG KDIFVFSAAS DSAPGASDWIRDFQKGIDKIDLSFFNKEAOSSDFIHFVDHFSGAAGEAI.L SYNASNNVTDLSVNIGGUQAPDFLVKIVGQVDVATDFIV SEQ NO ID: 4 EXEMPLO 16. apoptose induzida por MG2327. MG2327 induz a apoptose em células de mieloma X63, com a fragmentação do ADN e envolvendo mitocôndrias e microtúbulos.

Para determinar o tipo de experiência de morte celular por células tumorais, as células de mieloma de murino P3X63Ag8 (2 * 107) foram tratadas in vitro com MG2327 a 22 μρ / ml. As células tratadas e não tratadas foram preparadas por estudos de microscopia eletrónica ultraestrutural de transmissão, em momentos diferentes, e ADN genómico foi extraído para o ensaio de crescimento de ADN. A fragmentação de ADN foi avaliada em eletroforese com gel de agarose a 2%. A apoptose envolve frequentemente o 36 crescimento celular de ADN de 180-200 pb, representativo das distâncias inter-nucleossomais (Soldatenkov, VA, Prasad, S., Voloshin, Y., e Dritschilo, A. 1998. Cell Death Differ. 5:307-12). Como mostrado na figura 13, um aumento significativo na formação de oligonucleossomas foi observado, e foi correlacionado com as alterações morfológicas observadas na cultura e por microscopia eletrónica. A fragmentação inter-nucleossómica foi precedida por sinais morfológicos de apoptose detetados por microscopia ótica. Além disso, a microscopia mostrou organelos citoplasmáticos alterados (mitocôndria, 2h), também precedidos de condensação de cromatina (4h) e de fragmentação inter-nucleossómica (6h). A MG2327 afeta microtúbulos e a organização ultraestrutural das mitocôndrias, aumentando a apoptose das células P3X63Ag8.

As células não tratadas mostraram uma ultra estrutura mitocondrial típica: claramente visíveis cristãs mitocondriais e uma matriz mitocondrial de maior densidade, uniformemente distribuídas por todo o citoplasma (Fig. 14A) .

As células tratadas com MG2327 mostraram aumento do tamanho das mitocôndrias, uma menor densidade da matriz e uma morfologia de cristãs fortemente afetada (Fig. 14B-E). Estas alterações ultraestruturais indicam principalmente organelos disfuncionais.

Além disso, observaram-se extensos vacúolos citoplasmáticos, também em relação ao retículo 37 endoplasmático como mitocôndrias e estrutura nuclear, 2 horas após o tratamento (Fig. 14B).

As diferentes alterações morfológicas foram observadas nos núcleos às 6 horas de tratamento (condensação da cromatina, fusão e crescimento) . Na micrografia de fase tardia de apoptose (8 h) de células P3X63Ag8 tratadas com MG2327, apareceu cromatina compacta (Fig. 14F). A formação de bolhas não foi detetada em qualquer momento.

Curiosamente, as mitocôndrias nas células tratadas com P3X63Ag8 durante 2 horas foram agrupadas em membranas micoplásmicas periféricas (Fig. 14B-E), decorrentes da quebra de microtúbulos e interferiu no transporte das mitocôndrias ao longo deste organelo. (Schatten,H., e Lewis, M.L. 2001. Acta Astronaut. 49:399-418).

As Figuras 14C e D mostram maiores mitocôndrias, tendo também estruturas condensadas ligadas às membranas mitocondriais internas. Estas estruturas teriam sido geradas por fusão de cristãs sucessivas. A MG2327 poderia gerar apoptose pela libertação do citocromo c para o citosol, após o inchamento da membrana mitocondrial externa, aumentando em tamanho, seguido de ativação da caspase e apoptose (Green, D.R. and Reed, J.C. 1998. Science 28:1309-1312. Review). descreveu

Sem aumentar de tamanho, o citocromo c poderia também ser completado e rapidamente libertado de cristãs danificadas da mitocôndria para o citosol, por meio de junções entre o espaço entre as membranas e as cristãs após fusão (Scorrano,L.., Ashiya, M., Buttle, K., Weiler, S., Oakes, S.A., Mannella, C.A. and Korsmeyer, S.J. 2002. Dev Cell. 2:55-67). O processo descreveu sinais de apoptose 38 significativamente amplificados gerados por MG2327 para o interior das células.

Exemplo 17. As proteínas p25 e p50 induzem a apoptose.

Para se saber se as proteínas p25 e p50 podem estar envolvidas nos acontecimentos apoptóticos induzidos por MG2327, foram individualmente administrados às células P3X63Ag8 em diferentes concentrações, e analisados por microscopia eletrónica. Em todos os casos, a condensação da cromatina, a danificação das cristãs das mitocôndrias e as mitocôndrias agrupadas foram detetados. Com efeito a indução da apoptose por MG2327 está relacionada com o efeito destas duas proteínas.

Exemplo 18. Efeito anti-angiogénico de MG2327 e os polipéptidos anti-proliferativos.

Desenvolvimento de estruturas tubulares em matrigel

As células Humanas microvasculares derivadas das células endoteliais humanas (HMEC) foram avaliadas quanto à formação de cordão endotelial em matrigel (Crum R, Szabo S, Folkman J. 1985. Science. 230:1375-8; Vacca, A., Ribatti, D., Presta, M., Minischettti, M., lurlaro, M, Ria, R,

Albini, A, Bussolino, F. e Dammaacco, F. 1999. Blood 93:3064) após cultura em condições não-citotóxicas MG2327, p25 e p50 concentrações (Sanz, L., Pascual, M., Munoz, A., González, M.A., Salvador CH, Álvarez-Vallina L. 2002. Microvascular Research 63:335-339). Os resultados considerando o comprimento de estruturas tubulares e o número de interligações entre eles, tal como calculado usando o conjunto do programa Image-Pro Express 4.5. Indicam uma significativa inibição (p <0,05, ANOVA) de 39 diferenciação e maturação das células endoteliais (Fig. 15) após o tratamento com a preparação MG2327 e as suas frações p25 e p50.

Exemplo 19. Efeito indireto de MG2327 em células em proliferação. MG2327 protege os ratinhos Balb/c dos implantes de tumores mieloides.

Para analisar a atividade protetora de MG2327 contra os tumores implantados, os ratinhos Balb/c foram inoculados (i.p.) com 1 mg/ml desta preparação anti-tumoral sob diferentes esquemas de imunização. Três doses foram administradas, uma dose em cada semana, e duas doses por semana, durante três semanas, com pelo menos três dias entre as doses. 0 grupo de controlo negativo foi inoculado com IX PBS. Dois milhões de células do mieloma P3X63Ag8, foram inoculados i.p. nos grupos experimentais (tratados e de controlo), 150 dias após a primeira dose (5 meses depois) . Todos os ratinhos do grupo de controlo negativo morreram durante os primeiros 25 dias, ao passo que 100% dos animais tratados sobreviveram sem tumores. (Fig. 16).

Exemplo 20. O domínio C-terminal de outros Serralisinas tem também o efeito citotóxico, sem atividade proteolítica. A linhagem ATCC14756 foi cultivada em condições semelhantes às da estirpe de acordo com o Exemplo CMIB42022 e os seus sobrenadantes de cultura foram processados tal como descrito no Exemplo 6. Em ambas as preparações foram observadas proteínas nos níveis de 50 kDa, que eluiu com 50mM de fosfato 0,2M NaCl, pH 8,00. Estas proteínas mostraram atividade enzimática que foi inibida com 10 mM de 40 EDTA e recuperadas com 5 μΜ de Zn2SC>4 · Ambas as proteínas foram digeridas quimicamente com CNBr e o padrão de digestão foi semelhante, gerando fragmentos semelhantes de cerca de 25 kDa, correspondendo ao C-terminal da p50, a partir da metionina na sequência interna para a extremidade da molécula.

Os fragmentos obtidos a partir da digestão foram renaturados com uma mudança de tampão por meio de diálise, durante 48 horas. A atividade biológica destes fragmentos foi testada no ensaio de citotoxicidade aqui descrito, utilizando-se as células HEp.2 que foram incubadas durante 72 horas na sua presença. Os fragmentos produzidos por digestão, e sem atividade proteolítica, a presença de 5 mM de EDTA, apresentaram uma maior atividade citotóxica que era dependente da dose, aproximadamente, 2,5 vezes em relação à da molécula completa p50. Estes fragmentos, uma vez que as suas sequências são conhecidas, podem também ser obtidos por síntese química ou por técnicas de recombinação.

Exemplo 21 Combinação de fragmentos de Serralisinas com anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

Os fragmentos de polipéptidos obtidos nos exemplos 6 e 20 foram conjugados quimicamente com o anticorpo monoclonal CB/ior-CEA.l (Tormo B et al. APMIS 97:1073-1080,1989), com as suas regiões variáveis, e com o fragmento do anticorpo obtido a partir da tecnologia a partir da sequência de ADN recombinante (anticorpos terapêuticos) (patente WO 03/093315). As biomoléculas conjugadas foram testadas nas células tumorais do ser humano em linhas de células LoVo (ATCC CCL-229), AsPC-1 (ATCC CRL-1682) e LS 174T (ATCC CL-188), todas expressando CEA em cultura, através de um 41 ensaio anti-proliferativo semelhante ao descrito no Exemplo 3. Os fragmentos conjugados foram usados em concentrações citotóxicas equivalentes às dos fragmentos não conjugados, com uma resposta dependente da dose, enquanto que com as moléculas não conjugadas nenhuma resposta anti-proliferativa foi observada. Mostrou-se que os fragmentos conjugados foram ligados ao CEA em células, utilizando-se procedimentos como célula-ELISA, e a imunofluorescência indireta (patente WO 03/093315). Estes resultados demonstram que os conjugados aqui descritos podem ser utilizados para o diagnóstico e terapia do cancro.

Listagem de Sequências.

<110> CENTRO DE ENGENHARIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> Composição farmacêutica contendo fragmentos de polipéptido serralisinas <130> Maria del Carmen <140> <141> <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(258) <223> Polipéptido ARAI: anti-proliferativo, apoptótico, antiangiogénico e protetor contra doenças que está relacionado com a proliferação celular e com a angiogénese. Sequência do C-terminal da SERMA. Serralisin 42 <400> 1

Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly Asp Asn Gly Gly His 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ala Ala Ile Gin His Leu 20 25 30 Tyr Gly Ala Asn Pro Ser Thr Arg Thr Gly Asp Thr Vai Tyr Gly Phe 35 40 4 5 Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gin 50 55 60 Lys Vai Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp 65 70 75 80 Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gin Arg Ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser 85 90 95 Phe Ser Asp Vai Gly Gly Leu Lys Gly Asn Vai Ser Ile Ala Ala Gly 100 105 110 Vai Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asp Vai Ile Vai 115 120 125 Gly Asn Ala Ala Asn Asn Vai Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Vai 130 135 140 Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys 145 150 155 160 Asp Ile Phe Vai Phe Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser 1,65 170 175 Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gin Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser 180 185 190 Phe Phe Asn Lys Glu Ala Asn Ser Ser Asp Phe i le His Phe Vai Asp 195 200 205 His Phe Ser Gly Thr Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser 210 215 220 Ser Asn Vai Thr Asp Leu Ser Vai Asn Ile Gly Gly His Gin Ala Pro 225 230 235 240 Asp Phe Leu Vai Lys Ile Vai Gly Gin Vai Asp Vai Ala Thr Asp Phe 245 250 255 Ile Vai <210> 2 43

<211> 257 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(257) <223> Polipéptido ARA2: anti-proliferativo, apoptótico, antiangiogénico e protetor contra doenças que está relacionado com a proliferação celular e da angiogénese. C-terminal da sequência SERSP.

Serralisin <400> 2

Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly Asp Asn Gly Gly His 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ala Ala Ile Gin His Leu 20 25 30 Tyr Gly Ala Asn Leu Ser Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe 35 40 45 Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gin 50 55 60 Lys Vai Ile Phe Ala Ala Trp Asp Al.a Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp 65 70 75 80 Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gin Arg Ile Asn L.eu Asn Glu Lys Ser 8.5 SO 95 Phe .Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly 100 105 1X0 Vai Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Phe Arg Gin Arg Leu lie Val Gly 11.3 120 125 Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu 130 135 140 Phe Gly Giy Gly Gly Al.a Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp 145 150 155 160 Ile Phe Val Phe Ser Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pro Gly Ala Ser Asp 165 170 175 Trp I.le Arg Asp Phe Gin Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Léu Ser Phe 180 185 190 44

Phe Asn Lys Glu Ala Gin Ser Ser Asp Phe Ile His Phe val Asp His 195 200 205 Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Asn 210 215 220 Asn Vai .Thr Asp Leu Ser Vai Asn Ile Gly Gly His Gin Ala Pro Asp 2.25 230 235 240 Phe Leu Vai Lys lie Vai Gly Gin Vai Asp Vai Ala Thr Asp Phe Ile 245 250 255

<210> 3 <211> 219 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(219) <223>: Polipéptido ARA3: anti-proliferativo, apoptótico, antiangiogénico e protetor contra doenças está relacionado com a proliferação celular e da angiogénese. C-terminal da sequência SERSP. Serralisin <400> 3

Thr Arg Thr Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 15 Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gin Lys Val lie Phe Ala Ala 20 25 30 Trp Asp Ala Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala 35 40 4 5 Asn Vjln Arg ile Asn Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly 50 55 60 Leu Lys Gly Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr lie Glu Asn Ala 65 70 75 80 lie Gly Phe Arg Gin Arg Leu lie Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val 85 90 95 Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala 100 105 110 45

Asp Glu Leu Trp Gly Gly AXs Gly Lys .Asp Ile Phe Vai Phe Ser Ala 115 120 125 Ala Ser Asp Ser Ala Pro Giy Ala Ser Asp Trp Ile Arg Asp Phe Gin 130 135 140 Lys Gly 11© Asp Lys XI© Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala Gin 145 150 155 160 Ser Ser Asp Phe Ile Bis Phe Vai Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly 165 170 175 Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Vai Thr Asp Leu Ser ISO 185 190 Vai Asn Ile Gly Gly His Gin Ala Pro Asp Phe Leu Vai Lys Ile Vai 195 200 205 Gly Gin Vai Asp Vai Ala Thr Asp Phe Ile Vai 210 215

<210> 4 <211> 220 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(220) <223> Polipéptido ARA4: anti-proliferativo, apoptótico, antiangiogénico e protetor contra doenças que estão relacionadas com a proliferação celular e da angiogénese. C-terminal da sequência SERSP. Serralisin <400> 4

Thr Arg Thr Gly Asp Thr Vai Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 15 Asp Phe Leu Ser Thr Thr Ser Asn Ser Gin Lys Vai Ile Phe .AI h Ala 20 25 30 Trp Asp AI ci Gly Gly Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala 35 40 45 Asn Gin Arg Ile Asn Leu Ash Glu LyS Ser Phe Ser Asp Vai Gly Gly 50 55 60 Leu Lys Gly Asn Vai Ser Ile Ala Ala Gly Vai Thr Ile Glu Asn Ala 65 70 75 80 46

Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asp Vai Ile Vai Gly Asn Ala Ala Asn Asn 85. 90 95 Vai Leu Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Vai Leu Phe Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ala Gly Lys Asp Ile Phe Vai Phe Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Asp Ser Ala Pr.o Gly Ala Ser .Asp Trp Ile Arg Asp Phe 130 135 14.0 Gin Lys Gly Ile Asp Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Lys Glu Ala 145 150 155 160 Asn S.er Ser Asp Phe Ile His Phe Vai Asp His Phe Ser Gly Thr Ala 165 170 175 Gly Glu Ala Leu Leu S.er Tyr Asn Ala Ser Ser Asn Vai Thr Asp Leu ISO 185 190 Sér Vai Asn Ilé Gly Gly His Gin Ala Pro Asp Phe Leu Vai Lys Ilé 195 200 205 Vai Gly Gin Vai Asp Vai Ala Thr Asp Phe Ile Vai 210 215 220

< 210 > 5 <211> 5 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(5) <223> Sequência Serralisinas <400> 5

Ala Gin Glu Asn Ser 1 5

<210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Serratia marcescens <220>

<221> PÉPTIDO 47 <222> (1)..(4) <223> Sequência Serralisinas <400> 6

Thr Phe Ser Phe 1

<210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Serratia marcescens

Lisboa, 30 de Agosto de 2012

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica caracterizada por conter um ou vários fragmentos Serralisin sendo a sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste em SEQ. No. ID. 1, SEQ. No. ID. 2, SEQ. No. ID. 3, SEQ. No. ID. 4, SEQ No. ID. 10, SEQ No. ID. 11, SEQ No. ID. 12, SEQ No. ID. 13, SEQ No. ID. 14, SEQ No. ID. 15 e SEQ No. ID. 16, para usar na indução de efeitos anti-tumorais no organismo recetor, e os referidos efeitos anti-tumorais são terapêuticos ou preventivos.

2. Uma composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos fragmentos de Serralisin são obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de células, por manipulação genética ou por sintese quimica.

3. Uma composição para utilização de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que os referidos fragmentos aparecem na composição sozinhos, conjugados ou mistos.

4. Uma composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que os referidos fragmentos de Serralisin fazem parte de moléculas quiméricas ou híbridas obtidas por manipulação genética ou por síntese química.

5. Fragmentos de Serralisin selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ. No. ID. 1-4 e SEQ. No. ID. 10-16 para utilização no tratamento de doenças proliferativas.

6. Fragmentos de Serralisin para uso de acordo com a reivindicação 5, em que os referidos fragmentos fazem parte de uma composição que contém anticorpos, fragmentos de 2 anticorpos, cadeias de ácidos nucleicos, ou moléculas de hidratos de carbono ou moléculas de proteinas, e que os ditos fragmentos encontram-se sozinhos, conjugados ou mistos.

7. Fragmentos de Serralisin para utilização de acordo com a reivindicação 5 ou 6, sozinhos ou em combinação, caracterizados por serem parte da referida composição na forma de agregados moleculares, sozinhos, em combinação entre eles ou em combinação com outra proteina ou moléculas de hidratos de carbono.

8. Um método de diagnóstico in vitro de patologias relacionadas com a sobre-expressão de recetores de fatores de crescimento e doenças inflamatórias compreendendo a utilização de fragmentos de Serralisin de acordo com as reivindicações de 5 a 7, sozinhos ou em combinação.

9. Um método de rastreio de patologias relacionadas com a sobre-expressão de recetores de fatores de crescimento e doenças inflamatórias compreendendo a utilização de fragmentos de Serralisin de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, sozinhos ou em combinação.

10. Uma composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada por conter ainda uma ou várias prodigiosinas, em que as referidas prodigiosinas aumentam a atividade anti-tumoral da composição mencionada.

11. Uma composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e 10 para uso no tratamento de condições patológicas relacionadas com a angiogénese, proliferação de células e sistema imunitário. 3

12. Uma composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e 10 para uso no tratamento de condições patológicas que podem ser tratadas através da indução de anticorpos anti-proliferativos, apoptóticos, anti-angiogénicos, imunomoduladores ou fatores de regulação diferenciais. Lisboa, 30 de Agosto de 2012