MX2007000339A - Composicion farmaceutica conteniendo fragmentos polipeptidicos de serralisinas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta relacionada con una composicion capaz de inhibir el crecimiento de celulas tumorales de diferentes origenes histologicos y de celulas endoteliales activadas; los componentes de dicha composicion son fragmentos polipeptidicos de Serralisinas, correspondientes al fragmento C-terminal, a partir de la metionina interna de la secuencia hasta el final de la molecula, los cuales pueden combinarse entre ellos y opcionalmente con prodigiosinas que potencian el efecto anti-tumoral de la composicion; las prodigiosinas en la composicion pueden estar a una concentracion de 0.1 - 100 nM; la accion anti-proliferativa de la composicion esta mediada por mecanismos apoptoticos. Su administracion "in vivo" tiene efecto antitumoral, antiangiogenico y protector contra tumores malignos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA CONTENIENDO FRAGMENTOS POLIPEPTIDICOS DE SERRALISINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología, la industria farmacéutica y en particular con la obtención de una composición capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales. Esta composición contiene fragmentos polipéptidicos de Serralisinas, obtenidos de la degradación de la proteína integra, los cuales tienen un mayor efecto antiproliferativo que las moléculas de Serralisinas integras. Dichos fragmentos pertenecen al C-terminal de las Serralisinas, a partir de la metionina interna de la secuencia hasta el final de la molécula, y la combinación de los mismos con prodigiosinas que potencian el efecto anti-tumoral de esta composición.

TÉCNICA ANTERIOR La quimioterapia del cáncer se ha dirigido tradicionalmente a la inhibición de la proliferación de células cancerígenas. Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado el interés por los productos antitumorales inductores de apoptósis, ya que el cáncer se ha instituido como una patología relacionada con la deficiencia relativa de los mecanismos de apoptósis, en lugar de un exceso de proliferación.

El uso de bacterias o sus extractos en el tratamiento del cáncer se remonta a más de 100 años. El reporte más citado es el del físico y cirujano William B. Coley del Hospital Memorial en la ciudad de New York, ahora llamado Hospital Memorial Sloan-Kettering. Él observó que muchos de sus pacientes con varios tipos de cáncer presentaron regresión tumoral después de ser infestados por bacterias patógenas (Coley, W. B. 1991-reprinted from 1893-. Clin. Orthop. 262:3). La resistencia a los tumores en pacientes o animales infestados se atribuía a la inmunidad antitumoral concomitante mediada por células (Paglia, P. and Guzmán, C. A. 1998. Cáncer immunol. Immunother. 46:88). La idea de que la infección con bacterias o protozoos patógenos pueden activar la regresión del cáncer a través de la activación de la inmunidad innata o adaptativa ha sido cuestionada recientemente por Hunter et al. (Hunter, C. A., Yu, D., Gee, M., Ngo, C. V., Sevignani, C, Goldschmidt, M., Golovkina, T. V., Evans, S., Lee, W. F. and Thomas-Tekhonenko, A. 2001. J. Immunol. 166:5878). Ellos demostraron que los tejidos infestados con T. Gondii producen algunos factores solubles anti-angiogénicos que evitan la formación de vasos sanguíneos en los tumores, los cuales podrían ser de potencial interés terapéutico. Este proceso de formación de nuevos capilares conocido como angiogénesis, se ha convertido en un foco de atención importante para la implementación de nuevas terapias para el cáncer y sus metástasis. La búsqueda de factores anti-angiogénicos constituye la base de nuevas estrategias terapéuticas anticancerígenos (Folkman, J. 2003. Seminars in Cáncer Biology. 13:159). Recientemente, el uso de bacterias anaerobias como agentes quimioterapéuticos y anti-vasculares selectivos ha ocasionado la regresión de tumores subcutáneos (se) en ratones de manera significativa. Este tratamiento es llamado terapia bacteriolítica combinada (COBALTO) (Dang, L. H., Bettegowda, C, Huso, D.L., Klnzler, K.W. and Vogelstein, B. 2001. Proc Nati Arad Sci USA. 98: 15155). Sin embargo, las bacterias vivas producen importante toxicidad y reacciones colaterales que limitan su uso contra el cáncer humano. En los últimos años, han aparecido reportes que indican que las bacterias anaerobias liberan proteínas redox que inducen la apoptósis de células tumorales (Yamada, T., Goto, M., Punj, V., Zaborina, O. and Chen, M.L. 2002. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 99: 14088; Goto, M., Yamada, T., Kimbara, K., Horner, J., Newcomb, M., Gupta, T.K. and Chakrabarty, A. M. 2003. Mol Microbiol. 47:549). Se ha postulado que estas proteínas redox pudieran formar parte de un conjunto de proteínas solubles que eran secretadas por los antecesores de las células procariotas actuales, y cuya función pudiera haber sido la eliminación de las células eucariotas ancestrales (Punj, V. and Chakrabarty, A. M. 2003. Cellular Microbiology. 5:225). En general se conoce poco sobre la producción de factores solubles secretados por estos organismos procariotas que pudieran actuar de forma específica sobre células cancerígenas, ocasionando su muerte y de manera concomitante, la regresión del tumor.

Serratia marcescens es una bacteria anaerobia facultativa. A partir de algunas de sus cepas de se han obtenido varias preparaciones con propiedades antitumorales, las más estudiadas son: [a] el ImuVert® (Budagov, R.S. and Ulianova, L.P. 2001. Radiats Biol Radioecol Russian. 41 :38), una preparación de membranas ribosomales que activan el sistema inmune de los pacientes; [b] la proteasa Serratial Mr 56,000 (Wu, J., Akaike, T., Hayashida, K., Okamoto, T., Okuyama, A. and Maeda, H. 2001. Jpn. J. Cáncer Res. 92:439), la cual induce muerte celular por necrosis dependiente de la expresión de a-2 macroglobulina; y [c] las prodigiosinas, una familia de pigmentos que actúan como inmunosupresores y anti-cancerígenos a través de la inducción de apoptósis (Montaner, B and Pérez Tomas, R. 2003. Curr Cáncer Drug Targets. 3:57; Pérez Tomas, R. y Montaner, B. 2003. Histol Histopathol. 18:379). Nosotros obtuvimos fragmentos de Serralisinas no proteolíticos con mayor actividad citotóxica que las moléculas que las moléculas integras. Esto permitió realizar la combinación de estos fragmentos con bajas dosis de prodigiosinas, disminuyendo la toxicidad reportada del pigmento y potenciando el efecto antiproliferativo sobre células tumorales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las composiciones de esta invención son capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales y están compuestas por fragmentos polipéptidicos de Serralisinas, con mayor efecto anti-proliferativo que las moléculas de Serralisinas integras, los cuales pueden combinarse con prodigiosinas que potencian su efecto anti-tumoral. En esta invención se describe la obtención del preparado MG2327, donde se encuentran presente tanto polipéptidos y prodigiositas, que tiene amplio espectro de acción citotóxica sobre líneas de células malignas, con efecto selectivo sobre células tumorales/transformadas y específicamente sobre células activadas para su crecimiento. El estudio de sensibilidad realizado en diferentes líneas celulares, cancerígenas o no, demostró que las líneas de células normales son poco sensibles a la acción del preparado MG2327, mientras que las células derivadas de melanoma, carcinoma laríngeo, fibrosarcomas, hepatocarcinomas, y carcinomas cervico-uterinos (portadores o no del virus del papiloma humano), son muy sensibles. Los carcinomas de origen hematopoyético son menos sensibles. Las células HUVEC activadas para su crecimiento son más sensibles a la preparación MG2327 que las no activadas. La preparación MG2327 es capaz de actuar específicamente sobre factores expresados o sobre-expresados durante el proceso de división celular. Estos factores constituyen blancos terapéuticos contra el cáncer u otras enfermedades de origen proliferativo. Además, estos factores también constituyen dianas para el diagnóstico temprano de enfermedades originadas por el exceso de proliferación, o la proliferación descontrolada de células diferenciadas o no diferenciadas. Formulaciones de liberación controlada que contienen estas moléculas pueden ser dirigidas a estos blancos proliferantes actuando de forma específica sobre ellos; ya que las células normales son más resistentes a su acción. Para demostrar la actividad antitumoral de la preparación MG2327 se emplearon ratones BALB/c, a los que se les implantó intraperitonealmente (i.p.) las células tumorales CB Hep.1 de origen mieloide, capaces de originar tumores ascíticos murinos (Fontirrochi, G., Dueñas, M., Fernández de Cossio, M.E., Fuentes, P., Pérez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). Después de 10 días, a los ratones se les inyectó intraperitonealmente la preparación MG2327 o solución salina PBS. El 60 % de los animales tratados con 1 mg/kg de peso sobrevivieron, mientras que solo el 25 % de los controles vivieron hasta los 45 días después de iniciado el tratamiento (Fig. 8). La regresión tumoral total fue observada en todos los animales sobrevivientes tratados, los que mostraban un estado saludable, mientras que en los controles, los tumores progresaron formando grandes masas sólidas y mostraban un estado general depauperado. Ratones BALB/c portadores de tumores de origen mieloide tratados con dosis única de 1 mg/kg de peso de la preparación MG2327 sobrevivieron con regresión total. Esta misma dosis incrementó la sobreviva con disminución significativa del volumen del tumor a ratones BALB/c portadores de un tumor de fibroblastos transformados con E6/E7. MG2327 protegió a ratones BALB/c de implantes de tumores mieloides.

El preparado MG2327 se obtuvo como resultado de la optimización de las condiciones de cultivo para producir moléculas anti-proliferativas, el cual constituye un agente protector contra el implante y desarrollo de tumores malignos, así como inductor de la producción de moléculas anti-proliferativas, apoptóticas y anti-angiogénicas en células normales y tumorales, que pueden ser utilizadas ventajosamente en la profilaxis y terapia del cáncer, además de otras enfermedades relacionadas con estos eventos. La cepa CMIB 4202 sobre-expresó proteínas solubles en el rango de 45-50 y 20-30 kDa (50 y 25 kDa determinados por SDS-PAGE, con un coeficiente de determinación de 0.984). La fracción de 25 KDa, denominada aquí como p25, mostró una potente actividad anti-proliferativa dosis-dependiente en los experimentos realizados con la línea celular HEp-2 cuando fue incubada con EDTA, mientras que la fracción de 50 KDa, denominada aquí como p50, no inhibió el crecimiento. Sin embargo, cuando la fracción p50 fue incubada con 5 µM Zn2SO mostró actividad anti-proliferativa, pero menos potente que la fracción p25. La IC50 de las fracciones p25 y p50 fueron 0.48 nM y 16 nM, respectivamente. En la presente invención se realizó el aislamiento de las biomoléculas proteicas con efecto anti-proliferativo (polipéptidos y prodigiosina), mediante un solo paso cromatográfico: intercambio ¡ónico con gradiente discontinuo de NaCl. Se empleó una matriz de DEAE o QAE Sepharosa Fast Flow, equilibrada con 50 mM de tampón fosfato, pH 8.00. La elusión se realizó con un gradiente discontinuo de NaCI: 50 mM de tampón fosfato-0.1 M NaCI, pH 8.00; 50 mM de tampón fosfato-0.2 M NaCI, pH 8.00; 50 mM de tampón fosfato-2 M NaCI, pH 8.00 y finalmente se eluyó la fracción pigmentada absorbida a la matriz con etanol absoluto al 70 %. Los resultados evidenciaron que el componente proteico de 25 kDa de la preparación tiene mayor capacidad para inhibir el crecimiento de las células tumorales, que el componente proteico de 50 kDa de esta misma preparación, y que ambos componentes presentan actividad biológica in vitro de manera independiente. La degradación de la proteína p50 generó fragmentos de diferente talla molecular, que incluía fragmentos de 25 kDa. Las degradaciones de p50 se incrementaron con el aumento de la temperatura y la generación de p25 fue directamente proporcional con el aumento de la temperatura, mientras que la p50 disminuyó. Los anticuerpos policlonales anti-p50 obtenidos en carnero reconocieron la p25 en Western Blot, por lo que p25 fue originada como producto de la degradación de la p50. La actividad antiproliferativa de los productos de degradación se incrementa a medida que aumentan los productos de degradación. Estos resultados demuestran que la autolisis de la p50 es capaz de originar fragmentos producto de la degradación con actividad anti-proliferativa más potente que la producida por la molécula de p50 integra. Además la proteína p25 también indujo la regresión total de tumores malignos de origen mieloide. Los fragmentos de p50 pueden ser conjugados genéticamente, o por algunas otra metodología conocida con fragmentos de anticuerpos y constituir inmunotóxinas útiles para el tratamiento de enfermedades de etiología proliferativa. Además, estos fragmentos solos o combinados con otras moléculas proteicas pueden ser empleados como portador de las mismas hacia el interior de las células o hacia receptores específicos. Los fragmentos de p50 también pueden exponerse al medio externo de sistemas de liberación controlada para direccionar los mismos hacia blancos específicos. La actividad proteolítica de P50 fue inhibida con 7 mM de EDTA, y se demostró que es una metaloproteasa, identificada por espectrometría de masas como perteneciente a la familia de las Serralisinas. La mayor similitud se encontró para las especies con identificadores PRZN_SERSP y PRZN_SERMA en la base de datos de proteínas Swissprot. La proteína p25 purificada por cromatografía no presentó actividad enzimática y se corresponde con la región carboxilo-terminal no catalítica de las Serralisinas. Los componentes proteicos y la prodigiosina se formularon en una misma composición que aumentó de manera significativa (p<0.005) el efecto inhibitorio con respecto a su formulación de forma independiente. Las composiciones fueron realizadas manteniendo la misma relación de proteínas y prodigiosina que las empleadas cuando se evaluaron los componentes de forma independiente. En dichas composiciones la prodigiosina puede encontrarse a una concentración de 0.1 - 100 nM, y los fragmentos de Serralisinas de entre 0.1 - 150 µg/mL. Como objeto de esta invención se encuentra la obtención de composiciones que contienen fragmentos polipeptídicos derivados de las Serralisinas, con mayor efecto anti-proliferativo que las moléculas de Serralisinas integras, y las combinaciones de estos fragmentos con prodigiosinas, las cuales potencian de manera selectiva la actividad biológica de estas composiciones. Adicionalmente, estos fragmentos polipéptidicos tienen efecto apoptótico sobre células cancerígenas. Este efecto apoptótico involucra a las mitocondrias, microtúbulos y fragmentación del ADN, amplificando la señal de muerte celular programada utilizando bajas dosis de estas composiciones. Estos eventos también fueron observados con composiciones combinadas de polipéptidos y prodigiosinas. El efecto anti-angiogénico de MG2327 y los fragmentos polipéptidicos anti-proliferativos fueron evaluados mediante el método de formación de estructuras tubulares en matrigel. Concentraciones no citotóxicas de MG2327 y sus fracciones p25 y p50 fueron incubadas con las células endoteliales humanas derivadas de microvasculatura (HMEC). Los resultados finales se evaluaron teniendo en cuenta la longitud de las estructuras tubulares formadas y el número de interconexiones entre ellos, utilizando el programa Image-Pro Express 4.5. Los resultados indican que el tratamiento con la composición MG2327 y sus polipéptidos antiproliferativos inhibe de manera significativa (p<0.05, ANOVA) la diferenciación o maduración de la célula endotelial, demostrando que tanto MG2327, asi como sus polipéptidos aislados tienen actividad anti-angiogénica.

La apoptósis, la actividad anti-angiogénica y la selectividad constituyen unas de las características más importantes de las composiciones objeto de esta invención, debido a su potencial terapéutico y protector contra el cáncer. En la presente invención se demuestra que la combinación de fragmentos de la familia de las Serralisinas, con las prodigiosinas son más potentes y selectivos que cuando son empleados de manera independiente como agentes anticancerígenos. Estos polipéptidos pueden ser empleados en la obtención de toxinas o inmunotoxinas recombinantes para la profilaxis y terapia del cáncer, u otras enfermedades relacionadas con la proliferación de células endoteliales y transformadas. Estos polipéptidos y su posible combinación con las prodigiosinas son aplicables a la industria farmacéutica para la obtención de preparados vacunales, terapéuticos o diagnósticos de uso humano o animal contra el cáncer u otras patologías de tipo proliferativo, los cuales son altamente selectivos y tienen amplio espectro de acción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1 B. La interacción de S. marcescens con las células tumorales CB Hep.1 genera cepas bacterianas con alta capacidad antiproliferativa y modificación en su expresión de proteínas. A- Sobrevida celular. Después de 72 h, la sobrevida celular fue estimada mediante el método del MTT. La cepa CMIB 4202 mostró un fuerte efecto anti-proliferativo sobre las células cancerígenas humanas HEp-2, mientras que la de SM1995 parental fue muy débil. Estos resultados fueron el promedio de tres experimentos independientes y cuatro réplicas por muestra. B-Electroforesis SDS-PAGE (tinción con plata). CMIB 4202 sobre-expresó proteínas solubles a la altura de 25 y 50 kDa. Figura 2. Actividad anti-proliferativa de las fracciones de 25 y 50 kDa sobre la línea celular HEp-2. La viabilidad celular fue determinada por el método del MTT y expresada en por cientos con respecto a las células control. Las fracciones fueron recobradas desde geles SDS (Imidazol-SDS-Zinc) y renaturalizadas. La fracción a la altura de 25 kDa mostró fuerte actividad antiproliferativa (IC50 0.35 nM/mL), mientras que p50 no inhibió el crecimiento. Al adicionar Zn4SO2 5 µM a la p50, se observó un aumento de la actividad antiproliferativa (IC50 45 nM/mL) aunque esta se mantuvo por debajo de la de la p25. Las curvas fueron generadas a partir de los valores medios obtenidos en 5 experimentos independientes y se grafican con la Desviación Standard (DS) correspondiente. Figuras 3A-3D. Cinética de expresión de proteínas y prodigiosina por la cepa CBMI 4202. La expresión de prodigiosina al medio de cultivo ocurrió durante el período de transición de la fase de crecimiento a la fase estacionaria, donde CBMI 4202 alcanzó su mayor tiempo de duplicación. A-Cinética del tiempo de duplicación celular. B- Rendimiento de expresión de la prodigiona (producto/biomasa). C- Cinética del efecto anti-proliferativo sobre células HEp-2, determinado por el método del MTT. D- Cinética del crecimiento celular determinado por densidad óptica y biosíntesis de proteínas. Figura 4. Sensibilidad de células cancerígenas y normales humanas al tratamiento con MG2327. Las células normales son poco sensibles y las de origen hematopoyético son menos sensibles que el resto de las líneas analizadas. Mientras que células activadas para su crecimiento (HUVEC bFGF) y células derivadas de lesiones tumorales malignas son más sensibles. Figura 5. Análisis de la sobrevida de ratones BALB/c tratados o no con el preparado MG2327 retados con el tumor CBHepl . A- La dosis de 1 mg/mL provocó la regresión total de los tumores en el 60 % de los animales tratados, mientras que el 100 % de los animales no tratados murieron en el término de 60 días. B- Después de 45 días de inoculadas las células tumorales, los animales no tratados presentaban un estado extremadamente depauperado, con presencia de tumores sólidos y ascitis, mientras que los tratados con 1 mg/kg no presentaron evidencias de tumor y sobrevivieron por más de 300 días. Figuras 6A-6B. Efecto antitumoral de MG2327 sobre el modelo tumoral 3T316. A-EI ploteo de las medias diarias por grupo, reveló diferencias estadísticamente significativas entre los volúmenes tumorales de animales tratados y no tratados (p<0.003). El análisis del crecimiento del tumor en el tiempo no varió de forma significativa (p= 0.109) para el grupo tratado con MG2327, mientras que el grupo control negativo presentó un incremento significativo de este parámetro (p= 0.04). B- Sobrevida de los animales tratados o no. Figuras 7A-7B Aislamiento de los principios activos proteicos desde MG2327. (A) Electroforesis SDS-PAGE (12.5 %). Resultados de la tinción con Coomassie. En el carril 1 se observa el eluato de 0.2 M NaCL, pH 8.00, donde se aprecia una banda de proteínas a la altura de 50 kDa. El carril 2 mostró una banda de proteínas de 25 KDa. La tinción fue realizada por el método del Coomasie. (B) Efecto anti-proliferativo sobre HEp-2. de la proteína p-25 y p-50 sobre las células tumorales humanas. Relación dosis-respuesta p25, p-50 y MG2327 expresado en concentración de proteínas totales. Figura 8. Efecto anti-proliferativo de los principios activos aislados desde MG2327 sobre HEp.2. Proteínas de 50 y 25 KDa contenidas en MG2327 mostraron actividad inhibitoria del crecimiento. La combinación de estas proteínas con la prodigiosina disminuyó la dosis capaz de inhibir el 50 % de las células tumorales con respecto al control (IC50). Figuras 9A-9B. SDS-PAGE y Western Blot. (A) Patrón de proteínas obtenido desde MG2327. La muestra fue analizada mediante un gel SDS-PAGE al 12 % y teñidas con plata. (B) Las bandas de proteínas de 50 y 25 kDa, aproximadamente (flechas), desde un gel SDS-PAGE similar, pero teñido con Imidazol-Zinc fueron cortadas, renaturalizadas en gel y reaplicadas a SDS-PAGE. Éste fue transferido a membrana de nitrocelulosa y el Western Blot fue realizado con anti-p50. Los anticuerpos policlonales obtenidos en carnero reconocieron la p25 y las degradaciones de la p50 y no reconocieron las bandas de proteínas no relacionadas (C. neg.). Figuras 10A-10B. Autolisis de la p50. A- Electroforesis SDS PAGE: 1- 24 °C, 2- 37 °C, 3- 45 °C, 4- 60 °C, 5- 4 °C. B- El análisis por densitometría de la p50 y p25 mostró que con el aumento de la temperatura de incubación disminuye la intensidad de p50 y aumenta p25. Figura 11. P50 purificada por cromatografía DEAE Sepharosa Fast Flow (eluída con 0.2 M NaCI), generó degradaciones con mayor actividad anti-proliferativa que la inducida por ella. Figuras 12A-12B. Actividad enzimática de p25 y p50 obtenidas desde cromatografías independientes. A- p25 no presentó actividad, mientras que p50 mostró actividad enzimática. B- La actividad enzimática de p50 fue totalmente inhibida con 7 mM de EDTA. Figura 13. MG2327 induce fragmentación del ADN dependiente del tiempo de incubación con la célula tumoral P3X63Ag8. Desde las 6 h de incubación, se observan fragmentos de oligonucleosomas que se incrementaron con el tiempo, hasta alcanzar el patrón típico de apoptósis con oligonucleosomas de 180-200 pares de bases a las 24 h. Figuras 14A-14F. Ultra-estructura de células de myeloma murino P3X63AG8 tratadas y no tratadas (células control) con 22 µg/mL de MG2327. (A) La microfotografía electrónica control negativo del myeloma murino P3X63AG8 mostró una estructura típica del citoplasma y núcleo de células normales, donde la matriz mitocondrial estaba más densa que el citoplasma circundante ( + ). (B) Cuerpos vacuolizados derivados en parte de mitocondrias alteradas (A), aumento de volumen mitocondrial y ruptura de las crestas mitocondhales que se observan en el citoplasma (A), con núcleos normales (i) 2 h después del tratamiento con MG2327. (C, D) Agrupaciones en forma de racimos de las mítocondrias ( + ), también observadas a las 2 horas de tratamiento en B. Fusión de crestas individuales (f). (E) La microfotografía electrónica presentó morfología apoptótica: condensación (»), marginación y fragmentación de la cromatina (•), y cuerpos apoptóticos (?) a las 6 h del tratamiento con MG2327. (F) Cromatina compactada (A). {Note que el aumento del volumen mitocondrial y la ruptura de las crestas, y la integridad de la membrana citoplasmática estuvieron presente en todos los tiempos analizados. Magnificaciones: x6000 (E), x 10 000 (A, B, D), 15 000 (C) y x40 000 (F). Figura 15. Efecto de MG2327, p25 y p50 (purificadas por cromatografía) y sus fracciones sobre la diferenciación de células endoteliales en matrigel. Las células HMEC se cultivaron en condiciones de activación (10 ng/mL EGF, 1 µg/mL de hidrocortisona) en presencia de concentraciones similares de MG2327 (A), p50 (B) y p25 (C), en ausencia de tratamiento (E) y sin activar (D). En el gráfico (F) se agrupan los resultados de tres experimentos independientes, donde se evidencia la actividad inhibitoria de MG2327 y sus derivados sobre la formación de redes tubulares en matrigel. Tanto MG2327 como p50 logran revertir por completo la activación inducida hasta el nivel de las células no activadas ( ANOVA MG2327, p50 y CN p>0.05). Las células tratadas con p25 muestran un índice de formación de redes inferior al observado para MG2327 y p50 (prueba t no pareada, p=0.0107 y p=0.0498, respectivamente). Figura 16. Sobrevida de ratones BALB/c inmunizados o no con MG2327 y retados con mieloma X63. Con el uso de tres y seis dosis de 1 mg/mL de MG2327 se observa el rechazo del tumor mieloide en el 100 % de los animales inmunizados.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Obtención de la cepa CMIB 4202 Para obtener cepas productoras de moléculas antitumorales, la Serratia marcescens salvaje SM1995 aislada de la superficie ventral de ratones BALB/c fue mezclada con las células tumorales CB Hep.1 (Alemán' M R • Valdés, R., Pérez, M., Ibarra, N., Reyes, B., González, ., Mendoza, O., Padilla, S., Agraz, A. and Rodríguez, M. P. 2000 Biopharm 13.4ß-52 j e ¡nocu|adas ¡ p en ratones BALB/c, preinoculados 10 días antes con petrolato líquido pesado. Ocho días después de la inoculación de la mezcla celular, se realizaron extracciones de ascitis en días alternos. La cinética del crecimiento del tumor fue analizada y el control microbiológico fue realizado a la ascitis de cada animal con regresión tumoral.

Las bacterias aisladas fueron crecidas en diferentes medios y condiciones de cultivo. Los sobrenadantes de cultivos se filtraron en condiciones de esterilidad usando filtros de membrana de 0.22 µm y la toxicidad de los mismos se ensayó sobre las células CB Hep.1. La cepa de mayor citotoxicidad fue depositada con el número de acceso CMIB 4202 en la Colección de Microorganismos de Importancia Biotecnológica en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Ciudad Habana, Cuba. CMIB 4202 y su cepa parental SM 995 se cultivaron en paralelo en fermentadores de 5 L, en medio Peptona-Glicerol a 28 °C. El filtrado estéril de CMIB 4202 presentó actividad dosis-dependiente mientras que el de SM1995 tuvo muy poca actividad sobre la línea de cáncer humano HEp-2 (Fig.lA) en el ensayo antiproliferativo usando el método del MTT (Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M. R. 1990. J. Nati. Cáncer. Inst. 82:1107). La cepa CMIB 4202 sobre-expresó proteínas solubles en el rango de 45-50 y 20-30 kDa (50 y 25 kDa determinados por SDS-PAGE, con un coeficiente de determinación de 0.984), Fig. 1 B. La fracción p25 recobrada a partir de las bandas presentes en geles SDS teñidos con Imidazol-SDS-Zinc (Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernández, L., Fernández-Padrón, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical Biochemistry. 240:150) mostró fuerte actividad anti-proliferativa dosis-dependiente sobre HEp-2, mientras que la fracción de p50 no inhibió el crecimiento. Sin embargo, cuando p50 fue incubada con 5 µM Zn2SO mostró actividad anti-proliferativa, pero menor que la fracción p25 (Fig. 2). La IC50 de las fracciones p25 y p50 fueron 0.48 nM y 16 nM, respectivamente. Con el objetivo de comparar la capacidad de las dos cepas para expresar las dos proteínas, se realizo un ANOVA factorial. El valor de probabilidad de la interacción demostró que ésta no fue significativa (P= 0.93). Por otro lado, la probabilidad de ambos efectos principales mostró que ambas proteínas son expresadas en cantidades significativamente diferentes (P =0.01 ) y que la cantidad es fuertemente dependiente de la cepa (P =0.0004). Además, existieron diferencias extremadamente significativas de la expresión de estas proteínas entre ambas cepas (P<0.001 ).

EJEMPLO 2 Obtención de la preparación anti-proliferativa MG2327 Para obtener una preparación anti-proliferativa a partir de la cepa CMIB 4202 de S. marcensces, se realizó el cultivo de 1 L del microorganismo en condiciones y medios de cultivo óptimos para producir las moléculas de interés (Figs. 3A-3D). El cultivo de CMIB 4202 fue centrifugado a 12 000 g y 4 °C por 30 minutos. El sobrenadante fue colectado y posteriormente filtrado mediante tamisaje molecular hasta 0.2 µm, bajo condiciones estériles. El volumen del sobrenadante fue reducido 10 veces usando una membrana de 10 kDa de límite de exclusión, y dializado contra PBS a 4 °C durante 24 h, en condiciones fisiológicas. El material dializado fue filtrado en condiciones estériles, y 5 mL fueron dispensados en viales de cristal apirogénicos. La preparación fue almacenada a 4 °C y denominada MG2327. El escalado a fermentadores de 5 L se realizó con las condiciones establecidas en zaranda: medio peptona-glicerol a 28 °C por 14 h, areación 1 vvm, 250 rpm y 0.1 de densidad óptica inicial. El medio de cultivo fue ajustado a pH fisiológico y la fermentación se realizó a pH libre. Los restantes pasos se realizaron de igual forma que en zaranda.

EJEMPLO 3 Caracterización de ia actividad anti-proliferativa de la preparación MG2327 "in vitro" Para la caracterización de la actividad anti-proliferativa de la preparación MG2327 "in vitro" se evaluó un panel de líneas humanas (cuadro 1 ). Un total de 2000 células, excepto para PBMC (20000), fueron sembradas en placas de cultivo de 96 pocilios, y se le adicionó diferentes concentraciones de la preparación MG2327. Después de 72 horas, se estimó el número de células sobrevivientes por adición de MTT (Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S. and BOYD, M. R. 1990. J Nati Cáncer Inst. 82:1107). Los productos de formazan solubles fueron detectados a 540 nm en un lector de placas Multiscan. La preparación MG2327 mostró un amplio rango de actividad citotóxica contra las líneas celulares humanas analizadas. La IC50 estuvo en el rango de los µg/mL.

CUADRO 1 Células y medios de cultivos empleados en los estudios "in vitro" *SFB: Suero Fetal Bovino La selectividad de la preparación MG2327 fue comparada con el fármaco comercial Doxorrubicina (DXR) empleando la línea celular HT1080 (originada de un fibrosarcoma) y fibroblastos primarios. Se empleó el ensayo anti-proliferativo descrito arriba. Se aplicaron diluciones seriadas de DXR y la preparación MG2327 partiendo de 10 µg/mL y se generó una curva con 5 puntos. La relación de mortalidad fue calculada para cada punto como la relación entre el por ciento de mortalidad para HT1080 y el por ciento de mortalidad para fibroblastos primarios. Las diferencias fueron mayores a las menores concentraciones testadas (MG2327 9:1 , DXR 1.7:1). La preparación MG2327 fue altamente selectiva para concentraciones menores que 2 µg/mL. Las células HEp-2 originadas de carcinoma laríngeo, son muy resistentes a los antitumorales empleados para uso clínico comparadas con el resto de las líneas estudiadas. Por esta razón, nosotros la empleamos como modelo para los estudios "in vitro" del efecto de la preparación MG2327. Una comparación de las curvas de citotoxicidad generadas sobre las células HEp-2 tratadas con compuestos antitumorales conocidos, mostró resultados similares (40 %) de proliferación a 3 µg/mL para la preparación MG2327, Cisplatino (CDDP), Doxorubicina (DXR), Vincristina (VC), Vinvlastina (VB) y Taxol (TX) (p> 0.05, test de ANOVA). En las mismas condiciones, otros antitumorales como Ara C, Metotrexato (MTC), Bleomicina (Bleo) y Ciclofosfamida (CPA), no mostraron efecto. CDDP es uno de los antitumorales autorizados por la FDA para el tratamiento de cáncer laríngeo, y el análisis de las curvas de sobrevida para la preparación MG2327 y CDDP mostraron valores similares para la IC10, IC50 e IC90. El estudio de sensibilidad de las diferentes líneas celulares cancerígenas o no (Fig. 4), demostró que las líneas de células normales son poco sensibles al preparado MG2327, mientras que melanoma, carcinoma laríngeo, fibrosarcoma, hepatocarcinoma, y carcinomas Cervico-uterinos (portadores del virus del papiloma humano), son muy sensibles. Los carcinomas de origen hematopoyético son menos sensibles. Las células HUVEC activadas para su crecimiento son más sensibles a la preparación MG2327 que las no activadas. Los resultados anteriores demostraron que la preparación MG2327 tiene amplio espectro de acción citotóxica sobre líneas de células malignas, con efecto selectivo sobre células tumorales/transformadas y células activadas para su crecimiento.

EJEMPLO 4 Actividad antitumoral de la preparación MG2327 Para demostrar la actividad antitumoral de la preparación MG2327 se emplearon ratones BALB/c, a los que se les implantó intraperitonealmente (i.p.) las células tumorales CB Hep.1 de origen mieloide, capaces de originar tumores ascíticos murinos (Fontirrochi, G., Dueñas, M., Fernández de Cossio, M.E., Fuentes, P., Pérez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C.1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). Después de 10 días, a los ratones se les inyectó i.p. MG2327 o PBS. El 60 % de los animales tratados con 1 mg/kg de peso sobrevivieron, mientras que solo el 25 % de los controles vivieron hasta los 45 días después de iniciado el tratamiento (Fig. 5). La regresión tumoral total fue observada en todos los animales tratados sobrevivientes, los que mostraban un estado saludable, mientras que en los controles, los tumores progresaron formando grandes masas sólidas y mostraban un estado general depauperado. Ratones BALB/c portadores de un tumor de fibroblastos transformados con E6/E7, incrementaron su sobreviva después de ser tratados con la preparación MG2327, con disminución significativa del volumen del tumor. Además, para evaluar la actividad antitumoral de MG2327 también se utilizó un modelo de cáncer asociado al virus del papiloma humano (VPH16), desarrollado por Hernández et al. (Hernández, P., Merina, N., López-Ocejo, O. and Araña, M. J. 2000. Biochem Biophys Res Commun.270:119-124). Dos grupos de ratones BALB/c fueron inoculados subcutáneamente (s.c.) con 2x106 células 3T316 en la zona ventral izquierda. A las 48 horas se administró una dosis de 0.75 mg/kg de peso de MG2327 o PBS por vía subcutánea, cercanas al sitio de inoculación primario de las células. Cuando se evidenciaron los tumores en el grupo control, se hicieron las mediciones diarias con un pie de rey. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula estándar V= 0.52 x a2 x b donde a_es el ancho y b es el largo del perímetro horizontal del tumor (Hernández, P., Merina, N., López-Ocejo, O. and Araña, M. J. 2000. Biochem Biophys Res Commun.270:119-124) y su comportamiento se muestra en la Figs. 6A-6B. Las diferencias entre el tiempo de aparición del tumor fueron estadísticamente significativas (p=0.0054) entre los animales tratados y los no tratados. El estudio de la relación tiempo-tratamiento por la prueba ANOVA, mostró que la misma magnitud de diferencia no se mantiene entre los grupos tratados y no tratados; lo que indicó la existencia de una diferencia relacionada con el tratamiento aplicado a los animales. Al aplicar una prueba de Wilcoxon para datos pareados a las mediciones entre los días 21 y 45 para cada grupo, se detectó un incremento significativo del volumen tumoral para el grupo control (p=0.043), no así para el grupo tratado (Fig. 6A). Para analizar la existencia de diferencias significativas entre los grupos en cada momento de evaluación, se aplicó una prueba U de Mann-Whitney que detectó diferencias significativas, excepto para el primer punto (p<0.01 ). Además, se detectó una importante diferencia en la velocidad de crecimiento del tumor. Las curvas de crecimiento fueron ajustadas a una línea y sus pendientes se calcularon a partir de la ecuación generada según el mejor ajuste. La comparación de las pendientes indicó que el tumor del grupo control creció a una velocidad significativamente mayor que la observada para el grupo tratado (p=0.0088). Como resultado de la implantación del tumor, los ratones del grupo control murieron entre los días 45 y 64, mientras que los animales del grupo tratado comenzaron a morir hacia el día 52, con un 20 % de sobrevida que se mantuvo en el tiempo (170 días), Fig. 6B. Ajustando los datos de sobrevida a un modelo jerárquico bayesiano (regresión de Weibull con 500 iteraciones) se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (p= 0.02447), que fue corroborada al comprobarse que los intervalos de confianza para el tiempo medio de sobrevida fueron totalmente excluyentes.

EJEMPLO 5 Fraccionamiento del preparado MG2327. Aislamiento de las biomoléculas no proteicas Para determinar la composición de la preparación MG2327 se realizó su fraccionamiento molecular y se evaluó su capacidad para inhibir el crecimiento celular in vitro de la línea celular tumoral humana HEp-2. La fracción polisacarídica (tr = 6.85 min) se separó por cromatografía en gel Aminex HPX 87-N (dimensiones: 300 x 7.8 mm, flujo: 0.5 ml/min). Se utilizaron patrones de fructosa tr = 13.15 min., glucosa tr = 12.12 min., disacárido tr = 9.40 min., trisacárido tr = 8.24 min., polisacárido tr = 7.01 min. La fracción pigmentada se separó mediante una columna TSK butilo de la MERCK equilibrada con fosfato 20 mM, pH=7, donde quedó retenida en la matriz, posteriormente se eluyó empleando etanol absoluto. El espectro de absorción (etanol 100 % a pH 5.00) del producto obtenido mostró una banda con un máximo entre 470 y 490 nm y un pico con máximo en 537 nm, que corresponden con las características descritas del monómero y dímero de la prodigiosina, respectivamente, con reportada actividad anti-proliferativa (Pérez-Tomas, R. and Montaner, B. 2003 Histol. Histopathol. 18: 379-385; Montaner, B., and Pérez Thomas, R. 2003. Curr Cáncer Drug Targets. 3:57-65). El polisacárido aislado no presentó efecto inhibitorio, mientras que la fracción correspondiente a la prodigiosina mostró actividad anti-proliferativa dosis-dependiente.

EJEMPLO 6 Fraccionamiento de la preparación MG2327. Aislamiento de las biomoléculas proteicas con efecto anti-proliferativo, mediante un solo paso cromatográfico: intercambio iónico con gradiente discontinuo de NaCl. Composiciones La preparación MG2327 fue aplicada a una matriz de DEAE Sepharosa Fast Flow, equilibrada con 50 mM de tampón fosfato, pH 8.00. La elusión se realizó con un gradiente discontinuo de NaCI: 50 mM de tampón fosfato-0.1 M NaCI, pH 8.00; 50 mM de tampón fosfato-0.2 M NaCI, pH 8.00; 50 mM de tampón fosfato-2 M NaCI, pH 8.00 y finalmente se eluyó la fracción pigmentada absorbida a la matriz con etanol absoluto al 70 %. La fracción correspondiente a 0.2 M NaCI, pH 8.00 y el primer eluato colectado de la fracción que no se pegó (pass), presentaron actividad inhibitoria dosis-dependiente en el ensayo ya descrito. Por electroforesis SDS-PAGE se observó una banda de proteína a la altura de 50 kDa y una banda mayoritaria (pureza > 90 %) a la altura de 25 kDa, respectivamente (Fig. 7A). Los pesos moleculares fueron calculados mediante la función que relaciona el peso molecular del patrón comercial con la distancia de migración de las bandas; r*=0.984. La Figura 7B. muestra el efecto anti-proliferativo de p50 y p25 comparadas con la preparación MG2327. La p50 y la p25 presentaron efecto anti-proliferativo sobre HEp.2. El cuadro 2 muestra los resultados comparativos entre p50, p25 y el preparado MG2327, empleando el análisis estadístico de varianzas (ANOVA). Se realizó una comparación de la respuesta para cada dosis empleada. Se puede observar que existen diferencias significativas entre las actividades de las tres muestras analizadas. Estas diferencias dependen de la dosis empleada. Para altas concentraciones de los componentes de la preparación (9 y 18 µg/mL) existieron diferencias significativas entre la fracción de 25 y 50 kDa, donde la fracción de 25 kDa fue más activa, no siendo así para bajas concentraciones (2.25 y 4.5 µg/mL).

CUADRO 2 Resultados comparativos entre los componentes proteicos y el preparado MG2327, empleando el análisis estadístico de varianzas (ANOVA).

Entre el componente proteico de 50 kDa y el preparado MG2327 existieron diferencias significativas para la dosis de 18 µg/mL donde el preparado fue más activo, logrando la inhibición del crecimiento del 100 % de las células tumorales, mientras que el componente proteico de 50 kDa logró inhibir aproximadamente el 80 % del crecimiento. Para la dosis de 2.25, 4.5, y 9 µg/mL no existieron diferencias significativas entre la respuesta ocasionada por la fracción de 50 kDa y el preparado MG2327. Sin embargo, la actividad del componente proteico de 25 kDa fue significativamente diferente a la del preparado MG2327 para la dosis de 2.5, 4.5 y 9 µg/mL, donde el componente proteico de 25 kDa presentó mayor actividad biológica y para la dosis de 18 µg/mL no existieron diferencias significativas, ya que ambas muestras lograron inhibir el 100 % de las células tumorales. Estos resultados evidenciaron que el componente proteico de 25 kDa tiene mayor capacidad para inhibir el crecimiento de las células tumorales, que el componente proteico de 50 kDa y que ambos componentes presentan actividad biológica in vitro de manera independiente. Este esquema de purificación se repitió varias veces, lográndose resultados similares.

EJEMPLO 7 Composición de polipéptidos de Serralisina con prodigiosina Se formularon los componentes proteicos y la prodigiosina en una misma composición que aumentó significativamente (p<0.005) el efecto inhibitorio con respecto a su efecto de forma independiente. En la Fig. 8 se gráfica la IC50 de las biomoléculas anti-proliferativas que aislamos de la preparación MG2327 y sus composiciones. La preparación MG2327 está referida a proteínas totales. Las composiciones fueron realizadas manteniendo la misma relación de proteínas y prodigiosina que las empleadas cuando se evaluaron los componentes de forma independiente. En dichas composiciones la prodigiosina puede encontrarse a una concentración de 0.1 - 100 nM, y los fragmentos de Serralisinas de 0.1 - 150 µg/mL.

EJEMPLO 8 p50 genera p25 Anti-p50 obtenidos en carnero fueron utilizados para conocer la relación entre p25 y p50. MG2327 fue aplicada a un gel SDS-PAGE al 12 % y teñido con Imidazol-Zinc (Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernández, L., Fernández-Padrón, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical biochemistry. 240:150-152). Las bandas de proteínas de 50 y 25 kDa, aproximadamente (Figs. 9A-9B) fueron cortadas, renaturalizadas en gel y reaplicadas a SDS-PAGE. Éste fue transferido a membrana de nitrocelulosa y el Western Blot fue realizado. Los anticuerpos policlonales anti-p50 reconocieron la p25 y las degradaciones de la p50. Las tallas moleculares fueron estimadas con marcadores de peso molecular preteñidos (Bio-Rad). El Western blot presentado aquí es representativo de tres experimentos similares.

EJEMPLO 9 Los productos de la degradación de p50 originados por temperatura son más activos gue la propia p50 La p50 obtenida en el ejemplo 6 fue incubada a diferentes temperaturas y su actividad anti-proliferativa fue testada sobre HEp.2, usando el método del MTT ya descrito anteriormente. El patrón de degradaciones generado para cada condición (4, 37, 45 y 60 °C) fue cuantificado por densitometría. La generación de fragmentos producto de la degradación fue directamente proporcional con el aumento de la temperatura, por lo que a medida que la cantidad de p50 disminuye se incrementa la p25 como producto de la degradación de p50 (Figs. 10A-10B). Los productos de la degradación de p50 mostraron mayor actividad anti-proliferativa que la p50 íntegra (Fig. 11 ).

EJEMPL0 10 p25 induce regresión de tumores malignos La proteína p25 obtenida por la cromatografía descrita en el Ejemplo 6, fue aplicada a cromatografía de fase reversa (RP-HPLC), para comprobar su homogeneidad y pureza. Se empleó un gradiente de acetonitrilo de 0-100 en 100 min. Se observó un pico de proteínas con pureza mayor del 90 %, demostrando la homogeneidad del eluato purificado. La p25 fue entonces inyectada i.p. a ratones BALB/c después de 8 días de implantado el tumor mieloide P3X63Ag8 y perfectamente desarrollado. La dosis de 22 µg/kg de peso de p25 indujo regresión total en el 80 % de los animales tratados. Los controles negativos murieron en el término de 30 días, donde habían ya desarrollado tumores sólidos.

EJEMPLO 11 p50 es una metaloproteasa, mientras gue p25 no tiene actividad proteolítica El método de Anson y Mirsky modificado (Anson, M.L., Mirsky, A.E. 1932. J. Gen. Physiol. 16: 59) usando caseína como sustrato, fue ajustado en nuestro laboratorio con Tripsina (y=1.9314x-0.682; R2=0.999). Las fracciones proteicas obtenidas en la cromatografía descrita en el Ejemplo 6 fueron ensayadas con este método. P50 presentó actividad proteolítica que fue inhibida con 7 mM de EDTA, por lo que resultó ser una metaloproteasa. P25 no presentó actividad enzimática, Figs. 12A-12B. El método del cimógeno usando gelatina como sustrato (Vacca, A., lurlaro, M., Ribatti, D., Minischetti, M., Nico, B., Ria, R., Pellegrino, A. and Dammacco, F. 1999. Blood. 94:4143-4155) fue empleado para verificar la actividad proteolítica de p50 y p25. Además se analizó la capacidad enzimática de las degradaciones de la p50. En este ensayo la proteína p50 obtenida por la cromatografía descrita en el EJEMPLO 6 presentó actividad enzimática. La fracción proteica de la banda de gel a la altura de 25 kDa (desde MG2327) mostró actividad proteolítica, mientras que la p25 obtenida por cromatografía no mostró esta actividad.

EJEMPLO 12 Identificación de los polipéptidos anti-proliferativos de 25 kDa desde MG2327 Para la identificación de las proteínas con actividad antiproliferativa presentes en la banda de 25 kDa, se cortó el gel SDS-PAGE (descrito en el Ejemplo 8) con MG2327 aplicado. La banda fue incubada durante 5 min en 1 mL de tampón Tris/HCI (100 mM pH 8.5) hasta que estuvo completamente transparente. La banda fue cortada en pequeños cubos de aproximadamente 1 mm3, embebidos con acetonitrilo, rehidratados en un volumen mínimo de bicarbonato de amonio (25 mM) conteniendo tripsina o LEP a una concentración de 12.5 ng/µL. La digestión en gel fue incubada a 37 °C por 18 h en un mezclador termostatado. Los péptidos resultantes de la digestión LEP fueron analizados por MALDI-MS. Los iones monoisotópicos de las señales más intensas fueron introducidos en el programa ProFound para la identificación de la proteína de interés en la base de datos de secuencias. Aunque nosotros no realizamos ninguna restricción taxonómica durante la búsqueda en la base de datos, la proteasa de 50 kDa de Serratia marcescens EC 3.4.24.40 fue alineada como la de mayor similitud. Cuatro péptidos (51-57, 58-66, 67-80 and 81-90) pertenecieron a la región N-terminal y uno (402-409) perteneció a la región C-terminal de la proteína. La talla molecular EC 3.4.24.40 difiere de las presentes en la banda analizada (aproximadamente 25 kDa, estimada por SDS-PAGE). Este hallazgo sugiere que la banda de 25 kDa contiene dos fragmentos co-migrantes de 25 kDa con similitud a la proteína de 50 kDa EC 3.4.24.40 perteneciente a la familia de las Serralisinas. Para corroborar esta hipótesis, una digestión tríptica de las proteínas de la banda de 25 kDa fue desarrollada. El espectro ESI-MS de los péptidos extraídos fue deconvolucionado y las señales más intensas fueron introducidas en el programa Profound. La salida mostró la misma proteína identificada previamente (EC 3.4.24.40). La cobertura de secuencia de la digestión tríptica (21 %) fue mayor que la digestión previa (10 %). El mapa de cobertura de secuencia mostró siete péptidos que coincidieron muy bien con algunos de los fragmentos trípticos de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. Cinco de ellos (28-41 , 58-66, 67-80, 81-90 and 163-171 ) correspondieron a la región N-terminal, mientras que los dos péptidos restantes (351-373 and 374-393) pertenecieron a la región C-terminal. Estos resultados no solo confirmaron la identificación previa de la proteína, sino que también la cobertura del mapa sugiere la presencia de dos fragmentos co-migrantes de 25 kDa de las proteínas identificadas como PRZN_SERMA/PRZN_SERSP, en la banda analizada. El espectro ESI-MS/MS correspondiente a péptidos de las regiones del N- y C-terminal de las proteínas previamente mencionadas fueron interpretados manualmente y las secuencias parciales fueron extraídas para su identificación, cuadro 3.

CUADRO 3 Interpretación manual del espectro ESI-MS/MS de 5 péptidos presentes en la banda de 25 kDa. Los péptidos del 1-4 pertenecieron a la región N-terminal de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP, mientras que el péptido 5 correspondió a la región C-terminal de estas mismas proteínas.

Con los métodos empleados y los resultados obtenidos podemos concluir que en la banda de 25 kDa analizada existe una mezcla de proteínas que contiene fragmentos con similitud al N- y C-terminal de las proteínas PRZN SERMA/PRZN SERSP.

EJEMPLO 13 Identificación de la p50 Para identificar la proteína p50 con actividad anti-proliferativa, la fracción proteica correspondiente a la proteína de 50 kDa obtenida del protocolo de purificación descrito en el Ejemplo 6 fue digerida con endoproteinasa Lys-C. La identificación de los péptidos se realizó mediante secuenciación por Degradación Edman automatizada y un espectrómetro de masas de doble sector JMS HX-110, con cañón FAB. Con los resultados obtenidos y los alineamientos realizados mediante el software Swissprot y PIR se concluyó que dicha proteína pertenece a la familia de las Serralisinas con un peso molecular de 50 kDa. La mayor similitud se encontró para las especies con identificadores PRZN_SERSP y PRZN_SERMA en el banco Swissprot. La masa molecular de todos los péptidos analizados por espectrometría de masas coincidió con los valores teóricos esperados para péptidos de estas proteínas digeridas con endoproteinasa Lys-C.

EJEMPLO 14 Identificación de la p25 purificada por cromatografía Para identificar la proteína de 25 kDa con actividad antiproliferativa, apoptótica y anti-angiogénica, la p25 purificada por la cromatografía DEAE descrita en el Ejemplo 6 fue aplicada a SDS-PAGE. La banda de proteína fue lavada durante cinco minutos con 500 µL de agua y después fue desteñida con una solución de ácido cítrico 100 mM, posteriormente fue lavada nuevamente con agua MilliQ, cortada en pequeños cubos de aproximadamente 1 mm3. Después, se le añadió acetonitrilo hasta su deshidratación y su exceso fue eliminado. Los cubos de gel fueron deshidratados completamente en una centrifuga evaporadora y posteriormente rehidratados en una solución de bicarbonato de amonio (50 mM) que contenía tripsina a una concentración de 12.5 ng/µL. Luego fueron incubados durante 30 minutos a 37 °C en un mezclador termostatado durante toda la noche. Los péptidos se eluyeron pasivamente al adicionar 20 µL en una solución de bicarbonato de amonio y una incubación adicional a 37 °C durante 45 minutos. Los péptidos fueron extraídos mediante el empleo de unos ZipTipcid ™ y posteriormente se aciduló la mezcla de reacción al adicionar 5 µL de ácido fórmico puro y se extrajeron nuevamente los péptidos mediante el empleo de los ZipTipcis ™- Los péptidos adheridos a los ZipTipC?s ™ fueron lavados repetidamente con una solución de ácido fórmico al 5 % y posteriormente eluídos en un volumen de 2-3 µL de una solución de acetonitrilo al 60 % que contenía ácido fórmico al 1 %. Los péptidos originados durante la digestión fueron cargados en unas agujas de capilares de borosilicato cubiertos en oro e introducidos en la fuente de ionización del espectrómetro de masas híbrido de geometría ortogonal equipado con una fuente de nanospray (QTOF-2™).

Los espectros de masas ESI-MS fueron adquiridos en un rango 350-2000 Da durante 1 segundo. Las señales más intensas fueron seleccionadas para su posterior secuenciación por ESI-MSMS. El gas de colisión empleado fue el argón y se utilizó una energía de colisión apropiada para producir una fragmentación extensiva de los péptidos seleccionados, que permitiese su identificación en las bases de datos de manera inequívoca. Los espectros ESI-MS fueron deconvolucionados y exportados en un formato DTA e importado en el programa MASCOT para la identificación de la proteína en las bases de datos SWISSPROT y NCBInr mediante la estrategia del PEPTIDO Mass Fingerprint (PMF). Para una identificación correcta de la proteína se utilizó una calibración interna al emplear un péptido autoproteolítico de la tripsina y se fijó un error de 0.05 Da para realizar la búsqueda de los péptidos observados en el espectro y se seleccionaron aquellas señales que tenían una intensidad superior al 10 % de la intensidad del pico base. Cuatro péptidos presentes en la banda analizada fueron secuenciados por ESI-MSMS (cuadro 4). Estos péptidos pertenecieron a la región C-terminal de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP (indicados en rojo en las secuencias del cuadro 6), previamente identificadas en los Ejemplos anteriores.

CUADRO 4 Péptidos pertenecientes a la p25 de S. marcescens gue fueron secuenciados por ESI-MSMS.

También se encontraron otras señales que aunque no se secuenciaron, sus valores de masas concuerdan muy bien con los valores de masas esperados para los péptidos trípticos de la región C-terminal de las proteínas identificadas como PRZN_SERMA/PRZN_SERSP, cuadro 5 (señalados en azul en el cuadro 6). Entre estos péptidos aparece una señal doble cargada que pudiera corresponder con el péptido C-terminal de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. No se encontraron péptidos que pudieran ser asignados a cortes específicos de la región N-terminal de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP.

CUADRO 5 Péptidos trípticos pertenecientes a la proteína PRZN SERMA detectados en el espectro ESI-MS Con los métodos y resultados presentados en este ejemplo podemos afirmar que en la banda de 25 kDa obtenida de la p25 purificada por cromatografía DEAE y altamente anti-proliferativa, está presente un fragmento C-terminal de 25 kDa de las proteínas PRZN_SERMA/PRZN_SERSP.

CUADRO 6 Identificación de la p50 y p25 obtenidas por cromatografía DEAE En la secuencia están tachados los aminoácidos que no están presentes en la proteína madura. Sin estos aminoácidos los pesos moleculares de estas proteínas son 50595.4 Da y 50293.4 Da para PRZN_SERSP y PRZN_SERMA, respectivamente. La identificación de los péptidos trípticos que difieren entre ambas moléculas indica que ambas especies pueden estar presentes e incluso coexistir (verde (itálica): identificado por espectrometría de masas y marrón (subrayado): identificado por degradación Edman dentro del rectángulo continuo). Los péptidos señalados ( y '"-' ) fueron identificados en la p25 obtenida por la cromatografía descrita en el Ejemplo 6. Los péptidos señalados ( ' " " ) y subrayado fueron identificados en la p50 obtenida por la cromatografía descrita en el Ejemplo 6 y el péptido en (itálica) fue identificado desde un fragmento de gel.

EJEMPLO 15 Proteínas del N- y C- terminal con 25 kDa Para determinar la talla molecular de las proteínas que pudieran co-existir a la altura de 25 kDa en SDS-PAGE, originadas a partir de degradaciones de PRZN_SERMA/PRZN_SERSP, sus secuencias fueron introducidas en el programa GenRun. Los fragmentos correspondientes al N-y C-terminal de 25 kDa (± 2 kDa) son mostrados en el cuadro 7.

CUADRO 7 Proteínas con talla de 25 ± 2 kDa, originadas a partir de degradaciones de PRZN_SERMA/PRZN_SERSP. El peso molecular fue determinado mediante el programa GenRun, a partir de los extremos N- y C-terminal.

EJEMPLO 16 MG2327 induce apoptósis MG2327 induce apoptósis sobre mieloma X63 con fragmentación del ADN, involucrando mitocondrias y microtúbulos Para determinar el tipo de muerte que experimentan las células tumorales, el mieloma murino P3X63Ag8 (2*107), fueron tratadas in vitro con 22 µg/mL de MG2327. A diferentes tiempos de tratamiento, las células tratadas o no fueron preparadas para su estudio ultraestructural por microscopía electrónica de transmisión y su ADN genómico fue extraído para desarrollar la técnica del ADN ladder.

La fragmentación del ADN fue detectada con electroforesis en gel de agarosa La apoptósis está frecuentemente acompañada de un rápido corte del ADN celular en múltiplos de 180-200 pb, correspondiendo al espacio inter.-nucleosomal. La detección de la fragmentación del ADN se realizó en geles de agarosa al 2% (Soldatenkov, V. A., Prasad, S., Voloshin, Y., and Dritschilo, A. 1998. Cell Death Differ. 5:307-12), Fig. 13, donde se observó un significante incremento en la formación de oligonucleosomas que correlacionaron con los cambios morfológicos observados en cultivo y por microscopía electrónica. Los cortes ¡nternucleosomales precedieron la apariencia de señales morfológicas de apoptósis, cuando las células fueron observadas por microscopía óptica. Además, las microfotografías mostraron organelos citoplasmáticos alterados (mitocondria, 2 h) que precedieron la condensación de la cromatina (4 h) y los cortes intemucleosomales (6 h).

MG2327 afecta microtúbulos y la organización ultraestructural de las mitocondrias originando un incremento en la apoptósis de P3X63Ag8 Las células no tratadas mostraron una ultraestructura típica de mitocondrias: crestas mitocondriales claramente visibles, y alta densidad de la matriz mitocondrial, distribuidas por todo el citoplasma (Fig. 14A). En las células tratadas con la preparación MG2327, el tamaño de las mitocondrias se incrementó, la densidad de la matriz mitocondrial fue mucho menor, y la morfología de las crestas se encontraba severamente afectadas (Fig. 14B-14E). Estas alteraciones ultraestructurales generalmente son un indicativo de la disfuncionalidad de estos organelos. Además, nosotros observamos extensivas vacuolizaciones citoplasmáticas, que involucraron organelos tales como retículo endoplasmático y mitocondrias, a partir de las dos horas posteriores al tratamiento, (Fig. 14B), y la integridad morfológica del núcleo. A las 6 h de tratamiento se observaron en el núcleo distintos cambios morfológicos (condensación, marginación y fragmentación de la cromatina). En la microfotografía de la fase tardía de la apoptósis (8 h) en P3X63Ag8 tratadas con MG2327 se observó la cromatina compactada (Fig. 14F). En todos los tiempos analizados la integridad de la membrana fue preservada. Interesantemente, las células P3X63Ag8 tratadas durante 2 h con MG2327 presentaron mitocondrias en forma de racimos, que se agruparon hacia un lado de las células (Fig. 14B-14E), interpretado como el resultado de la ruptura de los microtúbulos, y el fracaso del transporte mitocondrial a lo largo de este organelo (Schatten' H- and Lewis' L 2001. Acta Astronaut- En la Fig. 14C, 14D, también se observaron mitocondrias incrementadas de tamaño y estructuras condensadas dentro de las mismas, unidas a la membrana interna mitocondrial. Estas estructuras pudieron ser originadas por crestas individuales que parecieron estar fusionadas. MG2327 pudiera inducir apoptósis mediante la liberación del citocromo c al citosol (producto del aumento de tamaño de las mitocondrias), mediada por la apertura de canales en la membrana externa, que trae consigo la activación de caspasas que originan apoptósis (Green, D.R. and Reed, J.C. 1998.

Science. 28:1309-1312. Review). En última instancia, en ausencia del aumento de tamaño de las mitocondrias, el citocromo c almacenado en las crestas intramitocondriales dañadas, pudieran ser total y rápidamente liberadas al interior del citosol, por las uniones creadas entre las crestas y el espacio intermembrana abierto por el proceso de fusión (Scorrano, L.., Ashiya, M., Buttle, K., Weiler, S., Oakes, S.A., Mannella, C.A. and Korsmeyer, S.J. 2002. Dev Cell. 2:55-67).

El proceso descrito contribuyó significativamente a la amplificación de las señales de apoptósis generadas por MG2327.

EJEMPLO 17 P25 y p50 inducen apoptósis Para saber si p25 y p50 pudieran estar involucradas en los eventos apoptóticos descritos para MG2327, estas proteínas fueron incubadas de forma individual con las células P3X63Ag8 en diferentes concentraciones y analizadas por microscopía electrónica. La condensación de la cromatina, los daños en las crestas mitocondriales y las estructuras en forma de racimos de las mitocondrias también fueron observadas. Estos resultados indican que la inducción de apoptósis por MG2327 está comprometida con el efecto de estas proteínas.

EJEMPLO 18 Efecto anti-angiogénico de MG2327 y los polipéptidos anti-proliferativos Formación de estructuras tubulares en matrigel Se analizó la formación de cordones endoteliales por las células endoteliales humanas derivadas de microvasculatura (HMEC) sobre matrigel (Crum R, Szabo S, Folkman J. 1985. Science. 230:1375- 8; Vacca, A., Ribatti, D., Presta, M., Minischettti, M., lurlaro, M, Ria, R, Albini, A, Bussolino, F. and Dammaacco, F. 1999. Blood 93:3064), en presencia de concentraciones no citotóxicas de MG2327 y sus fracciones p25 y p50. Los ensayos se condujeron como ha sido repollado por Sanz y colaboradores (Sanz, L., Pascual, M., Muñoz, A., González, M.A., Salvador CH, Álvarez-Vallina L. 2002. Microvascular Research 63:335-339). Los resultados finales se evaluaron teniendo en cuenta la longitud de las estructuras tubulares formadas y el número de interconexiones entre ellos utilizando el programa Image-Pro Express 4.5. Los resultados indican que el tratamiento con la preparación MG2327 y sus fracciones inhibe de manera significativa (p<0.05, ANOVA) la diferenciación o maduración de la célula endotelial (Fig.15).

EJEMPLO 19 MG2327 tiene efecto indirecto sobre células proliferantes MG2327 protege a ratones BALB/c de implantes de tumores mieloides Para analizar la actividad protectora de MG2327 contra implantes de tumores, ratones BALB/c fueron inoculados (i.p.) con 1 mg/mL de este preparado antitumoral con diferentes esquemas de inmunización. Se empleó una dosis por semana durante tres semanas y dos dosis por semana durante tres semanas con intervalos de al menos tres días entre dosis. Un grupo control negativo fue inoculado con PBS. Dos millones de células del mieloma P3X63Ag8 fueron inoculadas i.p. a los grupos experimentales y al grupo control, después de 150 días de la primera dosis (5 meses después). Los ratones controles negativos murieron en el término de 25 días, mientras el 100 % de los animales tratados de ambos grupos experimentales sobrevivieron sin presencia de tumor (Fig. 16).

EJEMPLO 20 El dominio C-terminal de otras serralisinas también tiene efecto citotóxico, sin actividad proteolítica La cepa ATCC14756 fue cultivada en iguales condiciones que la cepa CMIB4202 según el Ejemplo 2 y sus sobrenadantes de cultivo se procesaron como se describió en el Ejemplo 6. En ambas preparaciones se observaron proteínas a la altura de 50 kDa que eluyeron con 50 mM de fosfato-0.2 M NaCI, pH 8.00. Estas proteínas presentaron actividad enzimática que fue inhibida con 10 mM de EDTA y recobrada con 5 µM de Zn2SO4. Ambas proteínas fueron digeridas químicamente con CNBr y su patrón de corte fue similar, generando fragmentos similares de aproximadamente 25 kDa, correspondientes al C-terminal de la p50, a partir de la metionina interna de la secuencia hasta el final de la molécula. Los fragmentos obtenidos en la digestión se renaturalizaron mediante cambio de tampón por diálisis durante 48 h. La actividad biológica de estos fragmentos fue testada en el ensayo de citotoxicidad aquí descrito, utilizando células HEp.2, las cuales se incubaron durante 72 horas en presencia de los mismos. Los fragmentos sin actividad proteolítíca, en presencia de 5 mM de EDTA, producto de la digestión, presentaron actividad citotóxica dosis-dependiente superior, aproximadamente 2.5 veces más que la de la molécula de p50 completa. Estos fragmentos una vez conocida su secuencias, también son posibles obtenerlos mediante síntesis química o por vía recombinante.

EJEMPLO 21 Combinación de fragmentos de Serralisinas con anticuerpos o fragmentos de estos Los fragmentos polipeptídicos obtenidos en los Ejemplos 6 y 20 se conjugaron químicamente con el anticuerpo monoclonal AcM CB/ior-CEA.1 (Tormo B et al. APMIS 97:1073-1080,1989), con sus regiones variables y con el fragmento de anticuerpo obtenido por vía recombinante a partir de la secuencia de este AcM (Diabody) (patente WO 03/093315). Las biomoléculas conjugadas fueron ensayadas sobre las líneas celulares de tumores humanos LoVo (ATCC CCL-229), AsPC-1 (ATCC CRL-1682) y LS 174T (ATCC CL-188), todas que expresan CEA en cultivo, realizado un ensayo antiproliferativo similar al descrito en el Ejemplo 3. Los fragmentos conjugados se utilizaron a concentraciones citotóxicas equivalentes a la de los fragmentos no conjugados, observándose una respuesta dosis-dependiente, mientras que a concentraciones no citotóxicas, no se observo respuesta anti-proliferativa, pero se evidencio que a pesar de la ausencia de respuesta, los fragmentos conjugados se unían a las células cuando se empleo el procedimiento de reconocimiento del CEA humano asociado a células mediante ELISA de células e inmunofluorescencia indirecta, (patente WO 03/093315). Estos resultados demuestran que los conjugados aquí descritos pueden ser utilizados en la terapia y el diagnostico del cáncer.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica caracterizada porque contiene uno o varios fragmentos polipeptídicos pertenecientes al carboxilo terminal, a partir de la metionina interna de la secuencia hasta el final de la molécula, de una o varias Serralisinas, o variantes de estos fragmentos, la cual es capaz de producir efectos anti-tumorales, terapéuticos o preventivos, en el organismo receptor.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los fragmentos de Serralisinas, son obtenidos a partir del sobrenadante de cultivos celulares, por manipulación génica o por síntesis química.

3.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada además porque los fragmentos de Serralisinas pueden encontrarse en la composición solos, conjugados o mezclados.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las variantes o modificaciones de los fragmentos de Serralisinas son obtenidos por síntesis química, por manipulación génica o del sobrenadante de cultivos celulares.

5.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3 y 4, caracterizada además porque los fragmentos de Serralisinas o variantes de estos pueden formar parte de moléculas quiméricas o híbridas obtenidas por manipulación génica o por síntesis química.

6.- Los fragmentos de Serralisinas de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3 4 y 5, denominados ARA1 , ARA2, ARA3 y ARA4, caracterizados además porque contiene las secuencias Seq. No. 1 , Seq. No. 2, Seq. No. 3 y Seq. No. 4, respectivamente identificados en el listado de secuencias, y formar parte de la composición de las reivindicaciones anteriores, solos, conjugados o mezclados.

7.- Los fragmentos de Serralisinas ARA1 , ARA2, ARA3 y ARA4 de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados además porque fragmentos derivados, variantes génicas o sintéticas de estos, inducen efectos anti-tumorales terapéuticos o preventivos en el organismo receptor.

8.- Los fragmentos de Serralisinas ARA1 , ARA2, ARA3 y ARA4, o fragmentos derivados de éstos, de comformidad con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizados además porque pueden formar parte de una composición que contenga anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, cadenas de ácidos nucleicos, o moléculas de naturaleza proteica o sacaridica, solos, conjugados, mezclados, o insertados, e inducen efectos anti-tumorales terapéuticos o preventivos en el organismo receptor.

9.- Los fragmentos de Serralisinas ARA1 , ARA2, ARA3 y ARA4, y/o fragmentos de éstos, de conformidad con las reivindicaciones 6, 7 y 8, caracterizados además porque pueden formar parte de la composición como agregados moleculares solos, entre ellos o con otras moléculas de naturaleza proteica o sacaridica.

10.- Los fragmentos ARA1 , ARA2, ARA3 y ARA4 de Serralisinas, y/o fragmentos de éstos, de conformidad con las reivindicaciones 6, 7, 8 y 9, caracterizados además porque pueden formar parte de un preparado para el diagnóstico o pesquisaje de patologías relacionadas con la sobreexpresión de receptores de factores de crecimiento y enfermedades inflamatorias.

11.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 -5, caracterizada además porque contiene una o varias prodigiosinas que potencian la actividad anti-tumoral de la composición.

12.- El uso de la composición de conformidad con las reivindicaciones 1-5, para preparar un medicamento útil en la estimulación del sistema inmune, como anti-angiogénico, apoptótico, anti-proliferativo, antimicrobiano, y como inductor de factores anti-proliferativos, apoptóticos, anti-angiogénicos, inmunomoduladores o reguladores de la diferenciación.