CN119751591B - 一种靶向增稳brd7抑瘤蛋白的多肽及其在制备治疗实体肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向增稳BRD7抑瘤蛋白的多肽及其在制备治疗实体肿瘤药物中的应用，属于医药治疗领域。本发明筛选并确定了TRIM28与BRD7发挥相互作用的结构基础CC2（299‑349aa），并从其中两个具有α螺旋的多肽结构中筛选鉴定了一个包含12个氨基酸且能增加BRD7蛋白稳定性的多肽TAB12，并证实该多肽在乳腺癌和鼻咽癌等多肿瘤中发挥抗肿瘤作用，可用于抗肿瘤靶向药物的研发。本发明所述的多肽药物TAB12已被证实能够竞争性阻断TRIM28与BRD7结合，抑制BRD7泛素化降解，具有良好的抗实体肿瘤的活性，有望成为新的抗肿瘤靶向药物。

Description

一种靶向增稳BRD7抑瘤蛋白的多肽及其在制备治疗实体肿瘤 药物中的应用

技术领域

本发明属于医药治疗领域，具体涉及到筛选和确定一种靶向阻断E3泛素连接酶TRIM28与抑瘤蛋白BRD7结合、增加BRD7蛋白稳定性从而在鼻咽癌、乳腺癌等多种肿瘤类型中发挥抗肿瘤作用的多肽药物及其应用。

背景技术

靶向治疗是通过药物与肿瘤细胞特定的分子靶点特异性结合从而实现精准杀伤肿瘤细胞的治疗手段。目前临床上使用的靶向药物主要是靶向瘤基因失活的小分子抑制剂、抗体类药物等，如靶向瘤基因EGFR酪氨酸激酶抑制剂、靶向HER2的单克隆抗体药物等。多肽药物是继小分子药物、抗体偶联药物之后的新一代靶向药物研发策略，能通过模拟肽结合表位来竞争性破坏蛋白质-蛋白质相互作用，影响靶蛋白的稳定性或功能，从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤或抑制。但是多肽药物目前在临床抗肿瘤治疗的研究中基本上处于实验室研究或临床前期试验阶段，因此，针对肿瘤靶向治疗的瘤基因或抑瘤基因多肽药物还有待大量深入开发。

BRD7是一个高度不稳定蛋白，其蛋白稳定性降低是导致肿瘤发生和恶性进展的重要分子机制。同时，TRIM28是BRD7的一个潜在E3泛素连接酶，能通过泛素-蛋白酶体途径诱导BRD7蛋白的降解，从而导致乳腺癌、鼻咽癌等实体肿瘤的恶性进展。因此，本发明基于阻断TRIM28/BRD7的结合从而逆转BRD7泛素化降解、增加其蛋白稳定性是肿瘤临床治疗的重要新的分子策略。本发明研发了一种能靶向阻断TRIM28与BRD7结合并增加BRD7蛋白稳定性的多肽，并证实该多肽能通过增加BRD7抑瘤蛋白稳定性在乳腺癌和鼻咽癌等多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用。该多肽药物的研发可望填补该机制下肿瘤多肽药物的空白，具有非常好的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的在于，提供一种能够靶向阻断TRIM28与BRD7蛋白结合并增稳BRD7蛋白的多肽。该多肽药物是通过筛选和精细定位TRIM28与BRD7蛋白相互作用的位点，并在功能和生物学表型上进行筛选和鉴定而设计获得，本发明证实该多肽药物在乳腺癌、鼻咽癌等多肿瘤中的抗肿瘤作用和生物安全性。

本发明第二目的在于，提供上述的多肽在治疗实体肿瘤药物中的应用。

本发明提供的一种基于TRIM28靶向增稳BRD7蛋白的多肽TAB12，其氨基酸序列为IQKHQEHILRFA，或者还包括药学上可接受的多肽修饰类型。

进一步地，

所述的多肽修饰类型包括C端修饰、N端修饰、中间残基修饰和环化修饰中的至少一种。

更进一步地，

所述修饰包括但不限于脂化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰、糖基化修饰、聚乙二醇修饰、甲基化修饰、酰胺化修饰、D-氨基酸替换中的至少一种。

本发明中，基于TRIM28与BRD7互作区域，制备并筛选阻断肽，以找到阻止TRIM28与BRD7蛋白结合，同时增强BRD7蛋白稳定性，进而抑制BRD7蛋白泛素化降解的多肽作为抗肿瘤的药物。

具体地，所述多肽药物能靶向抑制TRIM28与BRD7蛋白的结合，增加BRD7蛋白稳定性。

尤其是能阻止TRIM28的Coiled-Coil结构域与BRD7蛋白结合，从而抑制BRD7蛋白发生泛素化降解，作为肿瘤治疗药物。

本发明所述实体肿瘤为BRD7低表达的实体肿瘤，包括乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌、卵巢癌中的一种或多种。

所述的乳腺癌细胞包括MDA-MB-231、MCF7中的至少一种；所述的鼻咽癌细胞包括CNE2、5-8F中的至少一种。

本发明所述的应用，所述的剂型为口服给药剂型或注射给药剂型。其中，包括但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、颗粒剂、粉针剂、注射液等。所述药物的剂量为药剂学上可接受的剂量，给药方式包括但不限于瘤体注射、静脉注射、腹腔注射和口服等。

本发明所述的治疗肿瘤的药物还包括药物组合，进一步还包括药学上可接受的辅料。

优选地，具有药学上可接受的药物的剂型。

本发明有益效果

本发明提供的多肽TAB12在乳腺癌和鼻咽癌细胞中阻断TRIM28与BRD7的结合并逆转了TRIM28过表达介导的BRD7泛素化，并以剂量依赖的方式增加了BRD7蛋白稳定性。TAB12抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和体内肿瘤生长，从而在乳腺癌和鼻咽癌等肿瘤中发挥抗肿瘤作用，且在小鼠体内无明显的毒副作用。因此，TAB12可望成为一种以BRD7蛋白为靶点的潜在抗实体肿瘤药物。

附图说明

图1：TRIM28通过泛素-蛋白酶体途径负性调控BRD7蛋白稳定性的结果；

图1A：蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转TRIM28 过表达对 BRD7 蛋白的抑制作用；图1B：TRIM28过表达对MDA-MB-231和MCF7细胞中BRD7的多泛素化修饰的影响；图1C：TRIM28的沉默表达对BRD7 的泛素化水平的影响。

图2：TRIM28依赖其Coiled-Coil结构域识别并降低BRD7蛋白稳定性的结果；

图2A：TRIM28的全长和各截短体图谱；图2B：乳腺癌细胞MCF7中TRIM28 Coiled-Coil结构域与BRD7之间存在交互作用的免疫共沉淀（Co-IP）实验结果；图2C：TRIM28-CC区与BRD7之间发生相互作用的Co-IP实验结果；图2D：在两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中过表达TRIM28-CC区后，BRD7蛋白表达水平的检测结果。

图3：根据TRIM28与BRD7的最小结合区域的氨基酸序列设计基于ɑ-螺旋阻断肽的结果；

图3A：TRIM28 CC区域中ɑ-螺旋示意图；图3B：TRIM28 △CC1、△CC2载体图谱；图3C：TRIM28 299-349aa 区域是TRIM28与BRD7蛋白交互作用的结构基础的Co-IP实验结果；图3D：根据氨基酸序列的二级结构特点设计并合成的两条干扰肽。

图4：来源于TRIM28 Coiled-Coil 区域的多肽药物TAB12竞争性抑制TRIM28与BRD7的结合并增加BRD7蛋白稳定性的结果；

图4A：在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，TAB12和TAB14对BRD7蛋白表达的影响；图4B：在乳腺癌细胞系MCF7中，TAB12和TAB14对BRD7蛋白表达的影响；图4C：在乳腺癌MCF7中TAB14和TAB12处理对TRIM28与BRD7蛋白的结合能力影响的Co-IP实验结果；图4D：TAB14和TAB12处理对TRIM28介导的BRD7泛素化水平影响结果。

图5：多肽药物TAB12的TAT修饰肽TAT-TAB12在乳腺癌、鼻咽癌等多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用的结果；

图5A：TAT-TAB12处理对乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF7）和鼻咽癌细胞（CNE2、5-8F）增殖影响的CCK8实验结果；图5B：TAT-TAB12对乳腺癌细胞克隆形成能力影响的结果。

图6：TAT-TAB12通过稳定BRD7蛋白在小鼠体内发挥抗肿瘤作用的结果；

图6A：荷瘤鼠经多肽药物处理后的外观形态图；图6B：三组处理小鼠肿瘤大小对比；图6C：TAT-TAB12对肿瘤生长的影响；图6D：TAT-TAB12对瘤体重量的影响；图6E：TAT-TAB12对小鼠体重的影响。

图7：多肽药物TAT-TAB12对小鼠重要器官无明显毒副作用的结果。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明所使用的MDA-MB-231、MCF7、5-8F、CNE2细胞系均购自于中南大学高等研究中心生物医学中心。细胞培养条件均为：DMEM液体培养基加10%胎牛血清（FBS）和1%双抗（青霉素、链霉素），置于37℃、5% CO₂浓度的恒温培养箱内培养。

实施例1 TRIM28通过泛素-蛋白酶体途径负性调控BRD7蛋白稳定性

1.1实验方案：

（1）将对照质粒和TRIM28过表达质粒分别转染至两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中。转染48 h后更换完全培养基，加入蛋白酶体抑制剂MG132（20µM）处理4 h。随后，收集细胞并抽提蛋白质，通过Western Blot实验检测TRIM28与BRD7蛋白的表达情况。

（2）在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7中分别共转染Vector或TRIM28以及Ub表达质粒来探讨TRIM28过表达对BRD7的泛素化水平的影响。转染 48 h 后，更换培养基并加入MG132（20µM）继续处理 4 h。收集细胞样本并提取蛋白质。使用BRD7抗体进行Co-IP，随后利用Ub抗体进行Western Blot 实验检测BRD7的泛素化情况。同样，在乳腺癌细胞 MDA-MB-231和MCF7中分别共转染对照siNC 或 siTRIM28#1 或 siTRIM28#2 以及 Ub 表达质粒，待转染 48h 后，加入含MG132（20µM）的培养基，将其置于培养箱中继续培养4 h，收集细胞并进行蛋白质抽提。用BRD7 抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）实验，富集与BRD7存在结合的蛋白。随后进行Western Blot实验，使用Ub抗体检测BRD7 蛋白的泛素化水平。

1.2实验结果：

在未加MG132组的两株乳腺癌细胞中，过表达TRIM28显著抑制了BRD7 的蛋白表达水平，而在MG132处理组中，TRIM28过表达对BRD7蛋白表达水平的抑制作用被逆转（图1A）。泛素化实验结果显示，TRIM28过表达增加了MDA-MB-231和MCF7细胞中BRD7的多泛素化（图1B）。此外，与对照siNC相比，TRIM28的沉默表达明显下调了 BRD7 的泛素化水平（图 1C）。这些研究结果表明 TRIM28通过增加BRD7蛋白的泛素化修饰促进其蛋白降解。

实施例2 TRIM28依赖其Coiled-Coil结构域识别BRD7并降低BRD7蛋白稳定性

2.1实验方案：

（1）根据TRIM28的蛋白结构域，构建一系列Flag-TRIM28结构域缺失载体，包括TRIM28-△RING（缺失RING结构域）、TRIM28-△BB（缺失B-BOX结构域）、TRIM28-△CC（缺失Coiled-Coil结构域）、TRIM28-△PHD（缺失PHD结构域）及TRIM28-△BROMO（缺失BROMO结构域）。在乳腺癌细胞系MCF7中共转染Flag-TRIM28系列截短体和HA-BRD7全长质粒，使用anti-HA进行Co-IP实验，探讨TRIM28与BRD7发生交互作用的结构域。

（2）构建包含TRIM28的Coiled-Coil结构域的表达载体Flag-TRIM28-CC，在乳腺癌细胞系MCF7中共转染Flag-TRIM28-CC及HA-BRD7质粒，同时使用Flag及HA抗体进行正向及反向Co-IP实验，接下来通过Western Blot实验,使用anti-Flag及anti-HA检测TRIM28-CC与BRD7是否存在互作。

（3）在两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中转染TRIM28-CC质粒，48h后收细胞进行蛋白抽提，通过Western Blot检测BRD7蛋白表达水平。

2.2实验结果：

Co-IP及Western Blot实验结果显示，在乳腺癌细胞MCF中，TRIM28 Coiled-Coil结构域与BRD7之间存在交互作用（图2A、B）。随后，构建包含TRIM28-CC截短体并通过Co-IP进一步证实了二者之间的相互作用（图2C）。在两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中过表达TRIM28-CC截短体后，BRD7蛋白表达水平显著升高（图2D），表明TRIM28的Coiled-Coil结构域极有可能成为基于多肽的 BRD7蛋白活化的靶点。

实施例3 根据TRIM28与BRD7的最小结合区域的氨基酸序列设计基于ɑ-螺旋的阻断肽

3.1实验方案：

α-螺旋是蛋白质-蛋白质相互作用的基本识别元件，因此，基于蛋白质-蛋白质相互作用而设计的α-螺旋肽是生物大分子相互作用的理想阻断剂。根据PDB数据库中的TRIM28 RBCC的晶体结构（PDB： 6QU1），发现在TRIM28 CC结构域中有三段α-螺旋结构。根据TRIM28 CC结构域特点，分别构建两段TRIM28 CC结构域缺失载体，即TRIM28-△CC1（缺失246-295aa）和TRIM28-△CC2（缺失299-349aa）；通过Co-IP和Western Blot实验，进一步缩短TRIM28与BRD7结合的区域。在乳腺癌MDA-MB -231细胞系中分别共转染HA-BRD7全长表达质粒与Flag-TRIM28全长（即图3C中的FL）、Flag-TRIM28-△CC1或△CC2表达质粒，使用anti-Flag进行Co-IP，通过Western Blot检测与Flag结合的BRD7的水平，找到TRIM28-CC区域中与BRD7结合的部分。随后根据TRIM28与BRD7结合的最小区域的氨基酸序列设计并合成α-螺旋阻断肽。

3.2实验结果：

Co-IP实验结果显示，TRIM28△CC1截短体仍然能够结合并拉下BRD7蛋白，而TRIM28△CC2截短体则丧失了与BRD7蛋白的结合能力，支持TRIM28的CC2区（299-349aa）是TRIM28与BRD7蛋白交互作用的结构基础（图3A-C）。根据TRIM28 RBCC的晶体结构特点，发现TRIM28 的CC2区包含两个α-螺旋结构，于是我们根据其氨基酸序列设计并合成了两条干扰肽（图3D），分别为14肽和12肽，将其命名为TAB14（序列：LNKRGRVLVNDAQK）和TAB12（序列：IQKHQEHILRFA），后续需进一步从中筛选出能够阻断TRIM28与BRD7结合并增稳BRD7蛋白的多肽。

实施例4 来源于TRIM28 Coiled-Coil 区域的多肽TAB12竞争性抑制TRIM28与BRD7的结合并增加BRD7蛋白稳定性

4.1实验方案：

（1）待细胞密度达到80-90%时，用不同浓度的TAB14和TAB12（0µM、5µM、10µM、20µM、40µM）分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7，24h后收集细胞并抽提蛋白，通过WesternBlot 实验探讨TAB14和TAB12处理对BRD7的蛋白表达水平的影响。

（2）在乳腺癌细胞MCF7中转染TRIM28及BRD7质粒，转染24h后，加入20µM 的TAB14或TAB12继续培养24h，使用anti-Flag进行Co-IP，通过Western Blot实验检测TAB14、TAB12处理对TRIM28与BRD7结合的影响。

（3）在乳腺癌细胞MCF7中共转染TRIM28、BRD7及Ub质粒，24h后更换含有20µM 的TAB14或TAB12的培养基继续培养24h，随后加入MG132处理4h。使用anti-BRD7进行Co-IP,anti-Ub 抗体检测BRD7的泛素化水平。

4.2实验结果：

在两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7中，TAB12以剂量依赖的方式增加了BRD7蛋白表达水平，而TAB14对BRD7蛋白表达没有显著影响（图4A、B）。在乳腺癌MCF7中，Co-IP实验结果显示，相比于TAB14处理组，TAB12处理导致TRIM28与BRD7蛋白的结合能力显著减弱（图4C），同样TAB12处理能够显著逆转TRIM28介导的BRD7泛素化水平的升高（图4D）。以上结果表明TAB12能够抑制TRIM28与BRD7的相互作用及TRIM28介导的BRD7的泛素化降解，从而增加BRD7蛋白稳定性。

实施例5 多肽药物TAB12的TAT修饰肽TAT-TAB12在乳腺癌、鼻咽癌等多种肿瘤中发挥抗肿瘤的作用

5.1实验方案：

我们已经筛选到TAB12能够增加乳腺癌细胞中BRD7蛋白稳定性，于是我们将TAB12与经典的细胞穿透肽TAT（GRKKRRQRRRPP）融合形成TAT-TAB12，序列为：GRKKRRQRRRPP-IQKHQEHILRFA，以增强其细胞穿透力。随后我们通过CCK8实验及克隆形成实验探讨多肽药物TAT-TAB12的抗肿瘤作用。

（1）CCK8实验：收集乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF7及鼻咽癌细胞5-8F和CNE2，通过血细胞计数板进行细胞密度测定。将细胞稀释后以3000个细胞/孔接种至96孔板中，设置0d、1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d六个时间点，每个时间点设置五个复孔。将96孔板置于细胞培养箱中继续培养，待细胞贴壁后，使用80µM的TAT-TAB12处理MDA-MB-231、MCF7、CNE2和5-8F细胞，对照组为TAT处理组。弃0 d孔内原有培养基，加入含有10% CCK8 试剂的培养基 100 μL，将其放入37℃培养箱中孵育2-3 h后，利用酶标仪检测 450 nm的吸光度值，此时间点即为 0 d，后续每隔1天测定细胞的吸光度值（CCK8孵育时间保持一致）。分析6个时间点的吸光度值并用GraphPad绘制细胞增殖曲线。

（2）克隆形成实验：取生长状态良好的乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF7）以1500个/孔的密度接种于6孔板中，分别设置TAT对照组及TAT-TAB12处理组，每组3个复孔。待长出较小克隆后，将80µM 的TAT和TAT-TAB12与细胞共培养3d，随后更换正常培养基继续培养至肉眼观察到较为明显的克隆时终止培养。使用 1×PBS 润洗 1-2 次后加入4%多聚甲醛固定细胞30-60 min。固定完成后，再用 1×PBS 清洗 2-3 次，使用结晶紫溶液进行染色，染色10-15 min后洗去结晶紫，晾干后拍照。最后分析并统计各组形成克隆数目。

5.2实验结果：

CCK8实验结果表明，与对照TAT组相比，TAT-TAB12处理能够显著抑制乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF7）和鼻咽癌细胞（CNE2、5-8F）的增殖（图5A）。克隆形成实验表明，与TAT组相比，TAT-TAB12能够抑制乳腺癌细胞克隆形成能力（图5B）。表明TAT-TAB12在体外能够显著抑制肿瘤细胞生长，表现出良好的抗肿瘤作用。

实施例6 TAT-TAB12通过稳定BRD7在体内发挥抗肿瘤作用

6.1实验方案：

构建移植瘤模型所使用的BALB/c雌性裸鼠从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买，共21只，年龄为4-5周，重量为16 ± 2 g，动物质检合格。动物饲养和相关操作均在无特定病原体（SPF）条件下在湖南省肿瘤医院动物实验中心完成。以下为裸鼠移植瘤构建的具体步骤：

（1）使用生长状态良好的乳腺癌细胞MCF7，D-Hanks清洗2-3遍，消化，离心。加入生理盐水清洗细胞2-3次，加入2mL生理盐水重悬细胞。

（2）对细胞进行计数，将细胞密度稀释至每100 μL 含有 3×10 ⁶个MCF7细胞，并以2：1的比例向细胞悬液中加入基质胶，吹打混匀备用。

（3）每只裸鼠右侧肩胛处皮下接种150 μL MCF7 细胞悬液（3×10 ⁶细胞），定期观察小鼠肿瘤生长情况。

（4）从第四天长出肉眼可见肿块时开始，每隔 2 天测量一次瘤体的长度（L）和宽度（W）及小鼠体重，根据肿瘤体积计算公式（体积＝L×W²/2）计算肿瘤体积。

（5）待肿瘤体积生长至40-100mm³大小时，将裸鼠随机分为三组，每组7只，分别为生理盐水处理组、TAT处理组以及TAT-TAB12处理组。荷瘤小鼠每隔两天注射100µL TAT、TAT-TAB12（30mg/kg）或生理盐水，以瘤内注射的方式，共注射6次。

（6）在第18天安乐死裸鼠，统计分析瘤体体积变化情况并绘制瘤体生长曲线。对荷瘤鼠进行拍照记录，随后剥离瘤体，进行拍照并称量重量。

6.2实验结果：

裸鼠皮下移植瘤模型结果显示，与生理盐水处理组（saline）和TAT处理组相比，TAT-TAB12的治疗显著抑制了小鼠肿瘤的生长速率，同时显著减轻瘤体体积和重量（图6C-D）。在整个治疗过程中，所有组的体重均未受影响（图6E）。以上结果表明，TAT-TAB12能够抑制体内肿瘤的生长，在乳腺癌中发挥抗肿瘤的作用。

实施例7 多肽药物TAT-TAB12对小鼠重要器官无明显毒副作用

7.1实验方案：

在实施例6的移植瘤模型中，每组随机选取3只小鼠，将其重要器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏剥离并进行固定、石蜡包埋、切片之后进行HE染色，观察各个器官组织状态，分析其有无明显的异常或病变，探讨多肽药物的体内毒性。

7.2实验结果：

小鼠器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）的组织病理学检查结果显示，saline处理组、TAT处理组以及TAT-TAB12处理组的重要器官均未发现明显的异常或病变（图7），表明多肽药物TAT-TAB12对荷瘤小鼠均无明显毒性。

Claims (5)

1.一种靶向增稳BRD7抑瘤蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：IQKHQEHILRFA。

2.权利要求1所述的多肽在制备治疗实体肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的实体肿瘤为：乳腺癌或鼻咽癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的多肽能靶向抑制TRIM28与BRD7蛋白的结合，增加BRD7蛋白稳定性。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，乳腺癌细胞包括MDA─MB─231、MCF7中的至少一种；鼻咽癌细胞包括CNE2、5─8F中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。