PT1758590E - Utilização de um detergente para a remoção não cirúrgica de gordura - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE UM DETERGENTE PARA A REMOÇÃO NÃO CIRÚRGICA DE GORDURA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada com métodos cosméticos para a remoção não cirúrgica da acumulação de gordura localizada. Especificamente, o método envolve composições de detergente farmacologicamente activas que são adequadas para a injecção directamente num sitio de tratamento de um doente com necessidade de remoção de gordura sem necessidade de intervenção cirúrgica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os números que aparecem entre parênteses no final de uma frase dizem respeito a referências especificas citadas na parte final desta descrição, imediatamente antes das reivindicações.

Formulações contendo fosfatidilcolina e sais biliares (formulações de fosfatidilcolina e sais biliares, PBF) estão a ser cada vez mais utilizados para tratar a acumulação de gordura localizada (1-8). Vários estudos clinicos abertos descreveram resultados promissores utilizando injecções de PBF para o tratamento da acumulação de gordura localizada, incluindo a hérnia adiposa da pálpebra inferior e a lipodistrofia com a parte de trás do pescoço (1-3). 1 A fosfatidilcolina é um fosfolípido natural que é um componente essencial das membranas celulares e é importante para a composição e reparação das membranas celulares normais. A fosfatidilcolina é, também, a principal forma de administração do nutriente essencial colina. A colina propriamente dita é um precursor na síntese do neurotransmissor acetilcolina, do doador de metilo betaina e fosfolipidos, incluindo fosfatidilcolina e esfingomielina, entre outros. A fosfatidilcolina também está envolvida na exportação hepática de lipoproteínas de muito baixa densidade.

Os sais biliares foram utilizados para melhorar a solubilidade aquosa de fosfatidilcolina e, mais recentemente, ®

medicamentos como a anfotericina B, Taxol e diazepam (9-14). A fosfatidilcolina altamente purificada pode ser combinada com o sal biliar secundário desoxicolato de sódio, um antimicrobiano, álcool benzílico e água para formar uma preparação estável de micelas mistas que pode ser rapidamente esterilizada e utilizada para administração intravenosa (12). As preparações ~ . ® farmacêuticas desta mistura, conhecidas como Essentiale e . ®

Lipostabil , são comercializadas noutros países para o tratamento de doença hepática e hiperlipidemia, respectivamente (12, 15).

Rittes descreveu pela primeira vez que injecções de uma PBF em gordura subcutânea reduziram a hérnia adiposa infra-orbital (1). Desde então, os médicos têm utilizado as preparações farmacêuticas ou PBF preparadas semelhantes, para tratar a hérnia adiposa da pálpebra inferior, bem como depósitos de gordura nas coxas, abdómen, zona cervical, queixo e braços (2, 3, 5) . Estas PBF muitas vezes carecem de dl-alfa-tocoferol 2 (vitamina E) , vitaminas B e monofosfato de adenosina encontrada de modo variavel em Essentiale e Lipostabil (2, 16).

As formulações de fosfatidilcolina estão associadas a sensações de queimadura localizada, eritema, urticária transitória e graus variáveis de prurido, os quais geralmente desaparecem dentro de poucos dias. Também foram observadas sequelas mais graves de ulceração e dor. Uma reacção granulomatosa infecciosa foi descrita na coxa de um doente no sitio de múltiplas injecções de fosfatidilcolina (7). Dosagens aumentadas de fosfatidilcolina injectada têm efeitos secundários paralelos observados com grandes doses de formulações orais e intravenosas de Lipostabil e incluem nauseas, diarreia, dor abdominal e sincope. 0 mecanismo pelo qual a formulação contendo fosfatidilcolina causa redução de depósitos de gordura subcutânea é desconhecida, mas foram propostos vários mecanismos (4). 0 primeiro é que a fosfatidilcolina pode reduzir o tamanho de lipócitos por estimulação da actividade da lipase.

Alternativamente, as PBF foram postuladas como funcionando como um detergente que emulsiona as membranas celulares dos lipócitos. Os detergentes têm sido utilizados em medicina há décadas, especificamente como agentes esclerosantes correntemente utilizados em escleroterapia (American College of Phlebology, 2003). Os detergentes têm propriedades quimicas polares e não polares únicas que facilitam a emulsionação de substâncias insolúveis por redução da tensão superficial na sua interface (17) . De facto, detergentes de laboratório tais como ® ®

Triton X-100 e Empigen BB sao normalmente utilizados para interromper a bicamada lipidica das membranas celulares (10, 3 18-21). Dois componentes principais das PBF, fosfatidilcolina e desoxicolato de sódio, têm estas propriedades químicas únicas e portanto têm sido utilizados de forma independente como detergentes ou agentes emulsionantes (9, 18, 20-25) .

Os processos cirúrgicos e não cirúrgicos para melhorar a aparência têm aumentado a prevalência à medida que as populações envelhecem e ganham peso. A lipossucção é um dos processos de cirurgia plástica mais populares e envolve a remoção cirúrgica de depósitos de gordura utilizando sucção e, opcionalmente, assistida por soluções para ajudar na remoção da gordura. A lipossucção, também conhecida como lipoplastia ou lipectomia, é um processo cirúrgico que remove gordura através de uma incisão na pele através da qual é inserida uma cânula. A cânula é ligada a uma fonte de sucção e a gordura indesejada é aspirada através da cânula e eliminada. A lipossucção é realizada com anestesia geral ou local, dependendo da quantidade e localização da gordura a ser removida.

As formas mais vulgarmente utilizadas de lipossucção utilizam adicionalmente metodologias de injecção de fluido em que uma solução medicamentosa contendo uma mistura de sais, um anestésico e um vasoconstritor, é perfundida no sítio do tratamento antes da aspiração do tecido adiposo. A solução medicamentosa ajuda a gordura a ser removida mais facilmente, reduz a perda de sangue e proporciona anestesia durante e após a cirurgia.

Num exemplo de soluções adjuvantes para lipossucção, uma Patente dos Estados Unidos apresentada em 22 de Abril de 1997 e publicada como Patente U.S. Número 5891083 em 06 de Abril de 1999 por Capella e Capella descreve lipossucção e uma solução 4 transportadora contendo um composto para um processo cirúrgico melhorado para a remoção de gordura subcutânea. Numa forma de realização a patente de Capella descreve que o composto é uma enzima, particularmente lipase ou colipase. A enzima é adicionada a um transportador, tal como soro fisiológico para dar uma solução de lipólise. Noutra forma de realização da invenção, Capella descreve que agentes emulsionantes tais como sais biliares também podem ser vantajosos em combinação ou como o composto activo primário adicionado à solução. Em cada forma de realização da invenção de Capella, a solução de lipólise é administrada durante um período de tempo antes de lipossucção para permitir que a solução se infiltre no tecido adiposo. Em lugar algum em Capella está divulgada a utilização de uma solução de lipólise só descrita como um meio não cirúrgico para a remoção de gordura do corpo. Em todos os exemplos e formas de realização específicas divulgadas em Capella, a lipossucção é utilizada como um processo cirúrgico para remoção de gordura e lipase e sais biliares são fornecidos como um adjuvante da lipossucção.

No entanto, a lipossucção e outros métodos cirúrgicos de remoção de gordura estão associados a eventos adversos significativos incluindo hematoma, inchaço, dormência, dor e sensação de ardor temporários, risco de infecção, alterações da pigmentação; a formação de coágulos de gordura ou coágulos de sangue que pode migrar para os pulmões e causar a morte, perda excessiva de fluidos, que pode levar a choque ou à acumulação de fluidos que têm de ser drenados, queimaduras de fricção ou outras lesões da pele ou nervos ou lesão por perfuração de órgãos vitais. Além disso, a lipossucção requer um tempo de recuperação de uma a duas semanas em que o doente não pode trabalhar ou realizar determinadas actividades diárias. Além 5 disso, uma vez que os processos cirúrgicos tais como a lipossucção requerem anestesia local e ocasionalmente anestesia geral, riscos significativos relacionados com a anestesia estão associados à remoção cirúrgica de gordura.

Seria portanto desejável ter um método de remoção de acumulações de gordura localizada que não requer cirurgia ou tempo de recuperação prolongado e que tem menos efeitos secundários do que os métodos actualmente disponíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método cosmético de remoção não cirúrgica da acumulação de gordura localizada, compreendendo a administração de uma composição compreendendo desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 5%, em que a composição está isenta de fosfatidilcolina. A invenção também proporciona um método cosmético de remoção não cirúrgica da acumulação de gordura localizada, compreendendo a administração de uma composição consistindo essencialmente em desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 5% em associação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Antes da presente invenção, pensava-se que as formulações do estado da técnica (aqui a seguir designadas formulações de fosfatidilcolina e sais biliares (PBF)), contendo fosfatidilcolina (PC) e sais biliares utilizados para reduzir depósitos de gordura localizados funcionavam através da actividade da fosfatidilcolina isolada. Os detergentes tais como os sais biliares eram meramente adicionados em pequenas quantidades para dispersar a PC. Contudo, a presente invenção inesperadamente demonstra que os sais biliares, tais como o 6 desoxicolato de sódio, são os únicos agentes activos responsáveis pela redução dos depósitos de gordura localizada, e possuem efeitos detergentes no músculo e tecido conjuntivo.

Para efeitos da presente invenção, um método cosmético não cirúrgico de remoção de gordura não inclui lipossucção, lipoplastia ou lipectomia com sucção.

Numa forma de realização da presente invenção, a composição compreende adicionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente pelo menos um ingrediente activo adicional.

Ainda noutra forma de realização da presente invenção, a composição médica contém um ou mais ingredientes activos adicionais. Um ou mais ingredientes activos adicionais pode incluir agentes anti-inflamatórios tais como um agente anti-inflamatório esteróides ou um agente anti-inflamatório não esteróide; analgésicos e agentes de dispersão tais como hialuronidase ou colagenase.

Noutra forma de realização da presente invenção, a composição médica contém excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Numa forma de realização da presente invenção, o doente é um humano.

Noutra forma de realização da presente invenção, o método não cirúrgico não inclui lipossucção.

Em formas de realização da presente invenção, a composição 7 é administrada por injecção subcutânea directamente em tecido adiposo.

Numa forma de realização da presente invenção, a acumulação de gordura localizada é hérnia adiposa da pálpebra inferior, lipomas, lipodistrofia, lipodistrofia com a parte de trás do pescoço, ou depósitos de gordura associados a celulite.

Noutra forma de realização da presente invenção, um método cosmético de remoção não cirúrgica de acumulação de gordura localizada num doente com hérnia adiposa da pálpebra inferior compreende a administração de uma composição compreendendo desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 5% em que a composição está isenta de fosfatidilcolina.

Numa forma de realização da presente invenção é proporcionado um método de não lipossucção para a remoção não cirúrgica de depósitos de gordura localizados num doente que compreende a administração não cirúrgica de uma composição que consiste essencialmente em desoxicolato de sódio numa concentração entre 0,001% e 5%, opcionalmente pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente pelo menos um ingrediente activo adicional, e a composição médica não inclui fosfatidilcolina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 representa a estrutura molecular de (a) fosfatidilcolina (b) desoxicolato de sódio e (c) álcool benzilico. 8 A FIG. 2 representa os efeitos da formulação de fosfatidilcolina e ácidos biliares (Fórmula PC, PBF) e apenas desoxicolato de sódio na viabilidade de células cultivadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção: (a) ensaio de MTS que mede a viabilidade de queratinócitos expostos à Fórmula PC e apenas desoxicolato de sódio; (b) Ensaio de lactato desidrogenase (LDH) que mede a libertação de LDH por células expostas à Fórmula PC e apenas desoxicolato de sódio. A FIG. 3 representa os efeitos da PBF e apenas desoxicolato de sódio em tecido adiposo porcino primário de acordo com os ensinamentos da presente invenção: (a) ensaio de MTS que produz pigmento roxo, indicando células vivas, em amostras de gordura tratadas com o tampão PBS como controlo negativo (Cont-), apenas „ , ® desoxicolato de sodio (DC), a PBF (PC) e detergente Tnton como controlo positivo (Cont+); (b) Uma comparação da viabilidade das células gordas entre os diferentes tratamentos. A FIG. 4 ilustra a fluorescência de calceina em amostras de

gordura tratadas com apenas desoxicolato de sódio (DC), PBF ® (PC) , detergente Tnton como controlo positivo (Cont + ) e tampao PBS como controlo negativo (Cont-) de acordo com os ensinamentos do presente invenção. A FIG. 5 representa a microscopia de luz de biópsias de pele de porco após tratamento com composições preparadas de acordo com os ensinamentos da presente invenção revelando (a) lipócitos de controlo e (b) lipócitos após injecção de PBF (H&E, ampliação original, x20); (c) lipócitos de controlo e (d) lipócitos após injecção de apenas desoxicolato de sódio (H&E, ampliação original, xlO); (e) músculo de controlo e (f) músculo 9 após injecção de apenas fosfatidilcolina (H&E, ampliaçao original, xlO); (g) gordura apos injecção com detergente Empigen (H&E, ampliação original, x20). A FIG. 6 representa um lipoma removido de um doente dois dias depois de injecção com desoxicolato de acordo com os ensinamentos da presente invenção: (a) patologia macroscópica e (b) histologia (Η & E, ampliação original, x20).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida ao problema de acumulação de gordura localizada em doentes proporcionando um método não cirúrgico para remoção de depósitos de gordura por administração de concentrações solubilizadoras de gordura de detergentes em formulações farmaceuticamente aceitáveis.

As injecções que utilizam fórmulas da técnica anterior (formulação de fosfatidilcolina e ácidos biliares, PBF) que combinam fosfatidilcolina (PC) purificada e desoxicolato de sódio, um sal biliar utilizado para solubilização de fosfolipidos, têm sido utilizadas para tratar a hérnia adiposa infraorbital e outras áreas de acumulação de gordura localizada (1-8). Com base no papel da f osf atidilcolina como um emulsionante da bilis e na sua utilização no tratamento da hiperlipidemia, a fosfatidilcolina foi postulada como o ingrediente activo em PBF (1, 2, 21, 25-27). Os detergentes tais como os sais biliares nestas composições da técnica anterior foram adicionados apenas para dispersar ou solubilizar o presumido ingrediente activo, PC. No entanto, até à data, não há 10 relatórios publicados em apoio desta teoria. As presentes requerentes demonstraram inesperadamente que o sal biliar era realmente o agente activo para a emulsionação da gordura localizada.

Entre os detergentes, os sais biliares são solubilizantes particularmente potentes de membranas de bicamada lipídica (9, 20, 21, 23, 28). Todas as membranas celulares biológicas são compostas pela mesma estrutura bilipídica, e estão portanto sujeitas a solubilização por detergentes (10, 19, 34). A solubilização de membranas celulares por um detergente envolve a distribuição do detergente entre as bicamadas lipídicas, desestabilização da bicamada, desintegração e subsequente formação de micelas mistas (compostas por detergente e lípidos das membranas celulares) (10, 19, 21). Os sais biliares, e outros detergentes, diminuem a tensão superficial na fronteira de materiais imisciveis e permitem a desagregação de grandes agregados em partículas cada vez mais pequenas. Nos tecidos, estes agentes dissolvem as membranas celulares e causam a lise celular. É gerada uma resposta inflamatória, fazendo com que o organismo remova o material solubilizado pelo detergente.

Por esta razão, as presentes requerentes compararam o desoxicolato de sódio com a PBF completa utilizando um ensaio quantitativo simples para medir a viabilidade celular (FIG. 2a). Não é possível isolar e testar fosfatidilcolina pura porque é insolúvel em soluções aquosas a menos que seja combinado com substâncias como sais biliares (12). A fosfatidilcolina é altamente solúvel em etanol, metanol, clorofórmio e outros solventes orgânicos, contudo estes agentes podem danificar bicamadas lipídicas (29-31). Em experiências preliminares, não houve diferença na lise celular e histologia entre PC isolada 11 pura e o etanol utilizado para a dissolver. Embora se tenha demonstrado que o álcool benzilico, um dos componentes da fórmula PC, afecta a fluidez das membranas celulares, é um não um detergente e, portanto, a sua quantidade limitada na fórmula tem efeitos líticos negligenciáveis nas membranas celulares (32, 33) .

Dado que a penetração em tecidos intactos tem probabilidade de ser um factor limitante, foram utilizadas culturas de células para determinar as diluições dos reagentes (PBF e desoxicolato) necessárias para afectar as células. 0 desoxicolato diminuiu profundamente a viabilidade de células cultivadas aproximadamente igual à PBF completa (FIG. 2a). Esta constatação foi reproduzida em tecido expondo gordura porcina a PBF e desoxicolato (FIG. 3). Estes resultados suportam a observação inesperada de que o desoxicolato de sódio desempenha um papel activo principal na PBF. A hipótese não vinculativa das presentes requerentes foi que o desoxicolato e a PBF afectam a viabilidade celular por perturbação das membranas celulares através da acção detergente. A lise das membranas em células cultivadas foi medida utilizando um ensaio de lactato desidrogenase (LDH) e no seio do tecido utilizando calceina, um marcador fluorescente retido em células com membranas celulares intactas. 0 ensaio de LDH mede a actividade de LDH, que é uma enzima citossólica libertado quando as células são lisadas. As culturas de células tratadas com a PBF e desoxicolato demonstraram ambas um aumento da lise celular dependente da concentração (FIG. 2b) . Além disso, os efeitos liticos directos observados em células cultivadas tratadas com estes agentes sugerem actividade independente da lipase endógena. A calceina foi perdida nas amostras de gordura 12 expostas a PBF, desoxicolato e Triton X-100, um detergente de laboratório conhecido (FIG. 4) . Esta constatação confirmou que a ruptura das membranas celulares ocorre em tecidos frescos expostos a ambos PBF e desoxicolato.

Comparando os efeitos da PBF com desoxicolato em cultura de células conduziu ao resultado surpreendente de que o desoxicolato causou perda semelhante da viabilidade celular, mas menos de lise celular. Estas diferenças podem ser dependentes da concentração ou pode haver efeitos sinérgicos entre fosfatidilcolina e desoxicolato no seio da fórmula. No entanto, os dados demonstraram que, em concentrações semelhantes às utilizadas clinicamente, o desoxicolato e a PBF tiveram efeitos semelhantes na histologia dos tecidos e na viabilidade celular. Tomados conjuntamente, estes dados inesperadamente demonstram que o desoxicolato actua como o componente activo nas PBF da técnica anterior.

De modo a ilustrar o efeito de detergentes na histologia de tecidos, pele de porco fresca foi injectada com PBF, desoxicolato, e detergentes de laboratório bem caracterizados (FIG. 5) . Todos os reagentes causaram uma perturbação significativa da organização dos lipócitos em comparação com injecção de PBS (controlo). Estes resultados foram igualmente observados no interior dos músculos e do tecido conjuntivo. A dissolução das fronteiras das células pelas substâncias de teste e a semelhança dos seus efeitos com os de detergentes bem caracterizados comprovam a função da PBF e do desoxicolato como detergentes. A limitação com este modelo experimental é que ele não revela as verdadeiras sequelas que ocorrem após a injecção em tecido vivo. É evidente a partir de relatórios clínicos que 13 uma resposta inflamatória rápida, evidente como eritema e edema, ocorre após a injecção (1-3). A inflamação repetida pode potencialmente levar a fibrose, especialmente após múltiplas injecções. A fibrose está descrita em vários doentes que desenvolveram nódulos firmes em sitios de injecção após a administração de PBF que eventualmente são resolvidos ao longo de vários meses (35).

As constatações histológicas mostram que a PBF injectável e o desoxicolato por si só causou ruptura da arquitectura em gordura e músculo, mas não teve nenhum efeito aparente na epiderme, derme ou partes acessórias (FIG. 5) No entanto, o

Empigen BB, um detergente de laboratório potente, teve efeitos histológicos profundos em colagénio dérmico (tecido conjuntivo). Alternativamente, a gordura e o músculo podem ser mais sensíveis ao tratamento com detergente do que estas outras estruturas nas concentrações testadas (semelhantes às utilizadas na prática clínica).

Através de uma série de experiências laboratoriais utilizando amostras de tecido frescas e culturas de células, as presentes requerentes demonstraram que a PBF da técnica anterior popularmente utilizada em injecções subcutâneas para dissolução de gordura funciona principalmente ao causar lise não específica das membranas celulares. As membranas celulares são constituintes de todos os tipos de tecidos; especificamente, a presentes requerentes demonstraram que estes detergentes causam solubilização de gordura, músculo e tecido conjuntivo. Portanto, as presentes requerentes concluíram que o desoxicolato de sódio, o componente sal biliar da fórmula utilizada para dissolver a fosfatidilcolina, era o principal ingrediente activo dessas 14 formulações da técnica anterior. Esta conclusão é apoiada pelo facto de os sais biliares serem solubilizantes potentes das membranas celulares. Além disso, o mecanismo da PBF e do desoxicolato de sódio na dissolução de gordura é provavelmente acção detergente.

Numa forma de realização da presente invenção, a composição inclui desoxicolato de sódio e excipientes farmaceuticamente aceitáveis num veiculo aquoso.

As composições produzidas de acordo com a presente invenção podem incluir outros ingredientes activos, incluindo, e em qualquer combinação compatível, agentes de dispersão, intensificadores de penetração e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Os veículos aquosos farmacologicamente aceitáveis para as composições da presente invenção podem incluir, por exemplo, qualquer solução líquida que seja capaz de dissolver um detergente e que não é tóxica para o indivíduo específico que recebe a formulação. Exemplos de veículos aquosos farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, soro fisiológico, água e ácido acético. Tipicamente, os veículos aquosos farmaceuticamente aceitáveis são estéreis.

As composições de detergentes farmacologicamente activas úteis em formas de realização da presente invenção são formuladas para a remoção não cirúrgica de depósitos de gordura localizados. Como aqui utilizado, "não cirúrgico" refere-se a processos médicos que não requerem uma incisão. As injecções são exemplos de processos não cirúrgicos. A lipossucção é um processo cirúrgico. 15

Numa forma de realização da presente invenção, a composição de detergente farmacologicamente activa é administrada por injecção, por exemplo, por injecção bolus. Para ser eficaz, a composição detergente tem de ter contacto directo com o tecido adiposo independentemente de como é perfundido. As formulações de detergente podem ser injectadas subcutaneamente ou perfundidas directamente na gordura. As formulações para a injecção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Um "excipiente farmaceuticamente aceitável" significa um composto que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é genericamente segura, não tóxica e nem biologicamente nem de outra forma indesejável, e inclui excipientes que são aceitáveis para utilização veterinária ou utilização farmacêutica humana. Um excipiente farmaceuticamente aceitável como utilizado na descrição e reivindicações inclui um ou mais de um desses excipientes. Alguns exemplos de excipientes apropriados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanta, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, fosfatidilcolina, celulose, água estéril, xarope e metil celulose. As formulações podem adicionalmente incluir: agentes lubrificantes, tais como talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes molhantes; agentes emulsionantes e de suspensão; e agentes conservantes tais como hidroxibenzoatos de metilo e propilo e álcool 16 benzílico. As composições da presente invenção podem ser formuladas de modo a proporcionar libertação rápida, controlada ou retardada do ingrediente activo após a administração ao doente por utilização dos processos conhecidos na técnica.

Excipientes adicionais adequados para formulação com as composições de detergente da presente invenção incluem intensificadores de penetração e agentes de dispersão. Exemplos não limitativos de agentes de dispersão que permitem a dispersão de fármacos nos tecidos incluem hialuronidase e colagenase. A hialuronidase funciona aumentando a permeabilidade dos tecidos e a propagação ou dispersão de outros fármacos. A colagenase foi utilizada para isolar adipócitos da gordura subcutânea e não tem efeitos liticos em adipócitos propriamente ditos. Além disso a hialuronidase e a colagenase podem facilitar a cura por aceleração da remoção de tecido necrótico após o tratamento com as formulações de detergente da presente invenção.

As composições de detergente farmacologicamente activas da presente invenção são úteis para o tratamento de acumulações de gordura localizadas, incluindo mas não limitadas a hérnia adiposa da pálpebra inferior, acumulações na cintura, ancas e outras áreas cosméticas, xantelasma, lipomas e lipodistrofia, incluindo lipodistrofia com "corcova de búfalo" (3). Noutra forma de realização, as composições de detergente da presente invenção são úteis para o tratamento de depósitos de gordura associados a celulite.

Os exemplos seguintes são proporcionados para definir com mais precisão e permitir as composições e os métodos da presente invenção. 17

EXEMPLOS

Exemplo 1

Formulações de Desoxicolato de Sódio e Fosfatidilcolina A formulação de fosfatidilcolina e sais biliares (PBF) (5,0% de PC derivada de soja altamente purificada, 4,75% de desoxicolato de sódio e 0,9% de álcool benzílico, em água estéril, Tabela 1) foi obtida de Hopewell Pharmacy, Hopewell, . ® ® NJ. Desoxicolato de sodio e detergente Triton X-100 (Triton , poliéter álcool alquilarílico) foram obtidos de Sigma-Aldrich ® ®

Corp. (St. Louis, MO). Detergente Empigen BB (Empigen , laurildimetilbetaina, Calbiochem, Biosciences, Inc., La Jolla, CA). Reagentes mãe (diluições de 5%) foram preparados em tampão PBS . A estrutura molecular de (a) fosfatidilcolina, (b) desoxicolato de sódio e (c) álcool benzílico estão apresentadas na FIG. 1.

Tabela 1. PBF injectável 5,00% (p/v)

4, 75% 0,90% 100 mL

Fosfatidilcolina

Desoxicolato de sódio Álcool benzílico Água 18

Exemplo 2

Efeitos das soluções de desoxicolato de sódio e fosfatidilcolina em células cultivadas

Para medir a viabilidade das células após o tratamento com detergente, queratinócitos HaCaT humanos foram cultivadas em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, penicilina e estreptomicina. As células HaCaT foram cultivadas em placas com 6 poços e incubadas com 0%, 0,005%, 0,050% ou 0,500% de PBF (Fórmula PC) ou desoxicolato de sódio durante 30 min a 37 °C antes da determinação da viabilidade celular utilizando o ensaio de MTS, que utiliza um composto de tetrazólio que produz uma mudança de cor quando biorreduzido por células metabolicamente activas (CellTiter 96 AQueous Non-radioactive Cell Proliferation Assay,

Promega Corp., Madison, WI). A viabilidade celular foi determinada por um espectrofotómetro de absorvência (a 490 nm) após um período de 4 horas de incubação com o ensaio a 37 °C.

Para determinar a viabilidade das células em tecido fresco, amostras de gordura foram incubadas durante 4 horas em placas com 24 poços com reagentes mãe e o ensaio de MTS. Amostras de tecido foram depois visualizadas quanto à mudança de cor e a quantidade de MTS nos seus sobrenadantes foi medida por absorvência (a 490 nm) . Todos os estudos foram realizados em triplicado. A absorvência a 490 nm (OD 490) é proporcional ao número de células vivas na cultura. Havia uma OD a 490 comparável no controlo e diluições de 0,005% de ambos os compostos (FIG. 2-A) , indicando pouco efeito destas substâncias na viabilidade das células para esta concentração. A viabilidade celular diminuiu progressivamente nas concentrações de 0,05% e 19 0,5% de ambas as soluçoes. A lise celular em resposta ao tratamento com detergente foi determinada em células HaCaT incubadas com os reagentes nas diluições de células indicadas durante 30 min a 37°C. A libertação de lactato desidrogenase foi medida por absorvência (a 490 nm) após uma incubação de 1 hora com o ensaio de LDH como recomendado pelo fabricante (CytoTox 96 Non-Radioactive

Cytotoxicity Assay, Promega). Todos os estudos foram realizados em triplicado. A libertação de LDH é directamente proporcional à absorvência a 490 nm (OD 490). Houve libertação de LDH mínima a partir de células de controlo e das incubados com diluições de 0,005% de ambos os compostos (FIG. 2b) . Houve progressivamente mais LDH libertado a 0,05% e 0,5% de PBF e desoxicolato.

Exemplo 3

Efeitos das Soluçoes de Desoxicolato de Sódio e Fosfatidilcolina em Tecido de porco

Tecido de porco foi obtido imediatamente após o sacrifício, rapado e colocada em gelo durante um máximo de quatro horas antes da utilização. Amostras de gordura foram obtidas por remoção da epiderme e derme de uma biópsia de punção com um bisturi e aparadas. Nas amostras de gordura foi aplicado corante de calceína por incubação durante 1 hora a 37 °C com Calcein-AM (Sigma). Os reagentes mãe foram adicionados às amostras de gordura e estas foram incubadas durante 30 min a 37 °C com agitação suave. A retenção de calceína foi determinada por 20 fluorescência de tecidos utilizando luz roxa (411 nm) e observando visualmente a luz verde emitida (500 nm) utilizando filtros de emissão. A histologia foi realizada por injecção de soluções mãe de reagentes (0,5 mL) na pele de porco na sua espessura total em vários niveis (epiderme, derme e tecido subcutâneo) com seringas de 1,0 mL e agulhas de calibre 30, 0,5 polegadas. A profundidade da agulha foi visualizada ao longo da margem do tecido de porco com a intenção de saturar o tecido alvo. Uma hora após a incubação com PBS a 37 °C, foram obtidos dos sítios injectados múltiplos espécimes da biópsia com 5,0 milímetros, sendo cada condição realizada em triplicado. O tecido foi fixado em formaldeído, encastrado em parafina, e corado com hematoxilina-eosina. As amostras foram avaliadas por um dermatopatologista certificado que desconhecia o protocolo de tratamento. A Pele de porco fresca foi utilizada para determinar se os efeitos dessas substâncias detergentes em células cultivadas eram semelhantes em tecidos. A FIG. 3 demonstra a produção de pigmento roxo escuro (indicando células viáveis) em tecido adiposo tratado com o tampão PBS (controlo negativo) utilizando o ensaio de MTS. A PBF e soluções a 5% de desoxicolato e positivo), demonstraram uma perda (indicando morte celular) nas A diferença de viabilidade das soluções foi quantificada pela dos sobrenadantes recolhidos das (FIG. 3b). Todos os reagentes na viabilidade de células de detergente Triton (controlo comparável de corante roxo amostras de gordura tratadas, células de gordura entre as medição da absorvência (a 490) amostras de gordura tratadas tiveram efeitos significativos gordura de tecido fresco. 21 A lise celular foi confirmada utilizando um ensaio de libertação de corante calceina. A calceina torna-se fluorescente após hidrólise e fica retida em células que têm membranas celulares intactas. Uma vez que não marca as células mortas e é perdida em condições que causam lise celular, a perda de fluorescência verde em amostras de tecido adiposo tratado com o corante calceina indica lise celular (FIG. 4) . Amostras tratadas com desoxicolato, PBF e detergente Triton (controlo positivo) apresentaram perda de fluorescência semelhante.

As alterações histológicas resultantes da injecção de PBF, ® desoxicolato e Empigen são apresentadas na FIG. 5. A formulação de fosfatidilcolina e sais biliares (FIG. 5b) e desoxicolato (FIG. 5d) produziu efeitos histológicos semelhantes aos causados por Empigen (FIG. 5g) e Triton (não ilustrado), dois detergentes de laboratório bem caracterizados. Estas alterações foram evidentes em gordura e músculo. Enevoamento acentuado e dissolução das membranas celulares dos adipócitos com ruptura da sua arquitectura lobular normal foram observados após a injecção de ambos PBF (FIG. 5b) e desoxicolato (FIG. 5d) . A FIG. 5f demonstra desorganização das fibras musculares e atrofia após a injecção da PBF. Alterações semelhantes em tecido muscular eram visíveis nas amostras tratadas com desoxicolato e os detergentes ® ®

Triton e Empigen . Nao houve alterações na epiderme, derme ou estruturas acessórias após a injecção dos reagentes com excepção ® de Empigen , que causou perda de coloraçao nuclear dos fibroblastos e hialinização do colagénio dérmico. 22

Exemplo 4

Experiência Clínica com Composiçoes de Desoxicolato de Sódio

Aos doentes com lipomas benignos, foram injectadas conjuntos isolados de tecido adiposo, com soluções de desoxicolato de sódio (DC) sem fosfatidilcolina directamente no lipoma. Os resultados deste estudo demonstram que os efeitos detergentes de desoxicolato observados em gordura nos tecidos animais são reprodutíveis clinicamente em humanos. Todos os lipomas injectados foram reduzidos em tamanho depois de pelo menos um tratamento com concentrações variadas de desoxicolato (Tabela 2) . Um lipoma de um doente, injectado com DC a 1%, foi retirado após o tratamento e foram realizadas análises patológica e histológica. Dentro do lipoma excisado, é observável macroscopicamente a necrose (FIG. 6a) com uma área bem demarcada de hemorragia e necrose na borda lateral que se prolonga até ao meio da gordura do lipoma que contrasta com a gordura do lipoma normal que é de cor mais clara. A análise histológica (FIG. 6b) revela uma área bem definida de hemorragia e gordura necrótica, bem como uma reacção inflamatória significativa que contrasta com as células de gordura normais adjacentes transparentes e redondas. 23

Tabela 2. Redução do tamanho dos lipomas após o tratamento

com DC

Lipoma Tamanho (cm) Pré-tratamento Tamanho (cm) Pós-tratamento Tratamentos totais (% de DC injectado) 1 2,00 x 1,00 1,25 x 0,50 2 (2,5%) 2 2,00 1,50 x 0,50 3 (5% e 2,5%) 3 2,00 x 2,50 2,00 x 1,00 3 (5% e 2,5%) 4 4,00 x 3,50 2,50 x 2,00 2 (1%) 5 2,00 x 1,75 1,25 2 (1%) 6 2,80 0,50 1 (5%) 7 1,00 Imperceptível 1 (1%)

Salvo indicação em contrário, todos os números que exprimem quantidades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condições reaccionais, e assim por diante utilizados na descrição e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todas os casos pelo termo "cerca de". Assim, salvo indicação em contrário, os parâmetros numéricos apresentados no seguinte descrição e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procura obter pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina dos equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado à luz do número de dígitos significativos descritos e por aplicação das técnicas de arredondamento correntes. Não obstante o facto de os intervalos e parâmetros numéricos que estabelecem o âmbito lato da invenção serem aproximações, os valores numéricos indicados nos exemplos específicos são descritos com a maior precisão possível. Qualquer valor numérico, no entanto, inerentemente contém certos erros que resultam necessariamente do desvio padrão encontrado nas respectivas medições de ensaio.

Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referências semelhantes utilizadas no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações anexas) deverão ser interpretados de forma a abranger tanto o singular como o plural, salvo indicação em contrário aqui ou em clara contradição com o contexto. A descrição aqui feita de gamas de valores é apenas destinada a servir como um método simplificado de fazer referência individual a cada valor separado que está dentro do intervalo. Salvo indicação aqui feita em contrário, cada valor individual está incorporado na descrição como se fosse individualmente aqui descrito. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados por qualquer ordem adequada salvo qualquer indicação aqui em contrário ou de resto se estiver em contradição clara dado o contexto. A utilização aqui de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplificativa (e. g. "tal como"), destina-se apenas para a esclarecer melhor a invenção e não põe uma limitação no âmbito da invenção de outro modo reivindicada. Nenhuma linguagem da descrição deve ser interpretada como indicando qualquer elemento essencial não reivindicado essencial para a prática da invenção.

Os agrupamentos de elementos ou formas de realização alternativas da invenção aqui divulgadas não devem ser interpretados como limitações. Pode fazer-se referência ou reivindicar cada elemento do grupo individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros 25 elementos aqui encontrados. Prevê-se que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos, ou excluídos, de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer dessas inclusões ou exclusões, a descrição é aqui considerada como contendo o grupo como modificado cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush utilizado nas reivindicações anexas.

As formas de realização preferidas da presente invenção são aqui descritas, incluindo a melhor forma conhecida pelas requerentes para a realização da invenção. É claro, variações dessas formas de realização preferidas serão evidentes para as pessoas com conhecimentos correntes da matéria por leitura da descrição anterior. As requerentes esperam que técnicos qualificados utilizem essas variações consoante apropriado, e as requerentes têm a intenção de que a invenção seja posta em prática de outra forma do que a aqui especificamente descrita.

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Lisboa, 28 de Outubro de 2011 30

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método cosmético de remoção não cirúrgica de uma acumulação de gordura localizada, compreendendo a administração de uma composição compreendendo desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 5%, em que a composição está isenta de fosfatidilcolina.
2. 2. Método cosmético de remoção não cirúrgica de uma acumulação de gordura localizada, compreendendo a administração de uma composição que consiste essencialmente em desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 5% em associação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a composição compreende desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 2,5%, por exemplo 2,5%.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende desoxicolato de sódio numa concentração de entre 0,001% e 1%, por exemplo 1%.
5. 5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que a composição compreende ainda um ou mais ingredientes adicionais seleccionados de agentes de dispersão, intensificadores de penetração, agentes conservantes, e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que o um ou mais ingredientes adicionais não alteram materialmente a eficácia do detergente farmacologicamente activo na 1 remoção da acumulaçao de gordura localizada.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que um dos um ou mais ingredientes adicionais é álcool benzílico e/ou água.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que um dos um ou mais ingredientes adicionais é seleccionado de um intensificador de penetração e um agente de dispersão.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o agente de dispersão é seleccionado de hialuronidase e colagenase.
9. 9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-8, em que a acumulação de gordura localizada é num humano.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a acumulação de gordura localizada é: uma hérnia adiposa da pálpebra inferior, depósitos de gordura na coxa, abdómen, zona cervical, queixo ou braço; ou uma acumulação de gordura na cintura ou na anca.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a composição é uma composição injectável.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a composição é administrada subcutaneamente. Lisboa, 28 de Outubro de 2011 2