PT1699915E - Utilização de eritropoietina para a regeneração de tecido hepático - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE ERITROPOIETINA PARA A REGENERAÇÃO DE TECIDO HEPÁTICO" O presente invento diz respeito à utilização de eritropoietina para induzir o crescimento estrutural de tecidos no âmbito da regeneração do fígado e tem em consideração as prioridades do pedido de patente alemã 10361813.9-41 e do pedido de patente europeia 03029961.4.

Durante a ontogénese são expressos factores de crescimento que podem desencadear processos estruturais e, no que respeita ao número de células, numéricos fundamentais para a formação de um tecido. Os organismos em crescimento e adultos perdem, aliás, em grande medida a capacidade de formar tecidos estrutural e funcionalmente intactos ou de, em caso de lesionamento de tecidos, regenerar estes. Suspeita-se ser a expressão reduzida dos factores de crescimento, que pela sua parte controlam a expressão das proteínas necessárias à formação de tecidos, a responsável por esta redução da capacidade de regeneração.

Contudo é sabido que, mesmo no organismo adulto, pelo menos alguns órgãos mantêm a capacidade de auto-rege-neração, a qual pode ser induzida por processos de lesionamento. Quase todos os outros órgãos são incapazes de, por 2 ΡΕ1699915 si mesmos, colmatar adequadamente defeitos estruturais a fim de reconstituir o tecido original.

No organismo adulto, o figado encontra-se em regra num estado de repouso, isto é, não se encontra no estado proliferante em que o órgão tem de desempenhar uma multiplicidade complexa de diferentes funções metabólicas. In vivo, o crescimento do figado é, aliás, repetidamente estimulado pela perda de massa celular — por exemplo em consequência de lesões nas células hepáticas ou de uma intervenção cirúrgica.

Em geral, contudo, o tecido hepático proliferante não substitui as estruturas funcionais e anatómicas do modo desejado, desembocando antes num aumento e numa hipertrofia do tecido hepático remanescente que só terminam quando a massa celular hepática original foi completamente substituída. A intensidade da resposta que se traduz num crescimento é função da extensão da perda de tecidos. Em contrapartida, a evolução no tempo da regeneração hepática exibe uma correlação inversamente proporcional, ou seja, perdas pequenas em termos de células hepáticas são substituídas de forma lenta, perdas grandes de células hepáticas de modo consideravelmente mais rápido.

Por conseguinte, a substituição da massa constituinte do órgão exclusivamente mediante proliferação celular não é suficiente enquanto terapia de um paciente cujos órgãos estejam consideravelmente lesionados. Por este mo- 3 ΡΕ1699915 tivo foram dadas a conhecer diferentes abordagens à indução do crescimento estrutural — isto é, de um crescimento mo-delador — de tecidos, das quais nenhuma, contudo, conduziu a um sucesso satisfatório. Este crescimento celular estrutural seria, contudo, de uma importância considerável precisamente no âmbito dos processos terapêuticos ou bio-tecnológicos.

Anteriormente já foi ensaiada a indução do crescimento de células mediante a administração de factores de crescimento tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF, onde GF é o acrónimo da expressão inglesa "Growth Factor"), o factor de crescimento vascular endotelial (VEGF) ou o factor de crescimento hepatocítico (HGF). 0 efeito destes factores sobre a multiplicação in vitro de células primárias é contudo limitado. Por outro lado, a sua utilização in vivo não é isenta de problemas em virtude dos possíveis efeitos secundários — por exemplo a activação de agentes oncogénicos.

Uma outra abordagem baseia-se na utilização de extractos de tecidos heterólogos complexos, por exemplo da hipófise ou do hipotálamo, para efeito da indução da multiplicação celular, por exemplo em hepatócitos de cultura (veja-se por exemplo o documento US 6 008 047). A utilização de extractos de tecidos animais e humanos é contudo problemática no âmbito laboratorial ou clínico, tendo em conta as doenças transmissíveis de origem virai, tais como, por exemplo, a encefalopatia espongiforme bovina ou BSE 4 ΡΕ1699915 ("Bovine Spongiform Encephalopathy" em inglês), as doenças causadas por vírus porcinos ou ovinos, o que demonstra acima de tudo quão deficiente é o conhecimento dos processos envolvidos na formação de estruturas orgânicas complexas, bem como dos factores realmente relevantes e da sua utilização e efeito. Adicionalmente, os extractos são difíceis de definir no que respeita à sua qualidade, uma vez que esta depende, entre outros factores, da origem dos mesmos e das condições de realização da sua cultura.

Aliás, até mesmo os escassos conhecimentos relativos às aplicações clássicas das culturas de tecidos primários não se deixam transpor directamente para a problemática da engenharia de tecidos. Com efeito, a engenharia de tecidos parte em regra e idealmente de sistemas celulares adultos específicos do paciente, já mais diferenciados do que as células fetais ou embriónicas. Além disso, no caso da engenharia de tecidos quer in situ quer in vitro, trata-se de situações de co-cultura que não entram em consideração nas aplicações clássicas. Em contrapartida são antes realizados esforços consideráveis para evitar, por serem indesejadas, co-culturas de células do endotélio, macrófagos e fibroblastos, tais como as presentes no fígado, quando da expansão das células hepáticas parenquima-tosas.

Em WO 02/092013 A2 foi dada a conhecer a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de hormona do crescimento ou GH ("growth hormone" em inglês) a um pa- 5 ΡΕ1699915 ciente com lesões hepáticas, de modo a estimular a capacidade de regeneração naturalmente possuída pelo fígado. Segundo o referido documento, a GH tem o efeito de acelerar a expressão do factor de crescimento Fox M1B (onde Fox é a abreviatura da expressão inglesa "forkhead box", à letra 'caixa' [domínio] da 'cabeça em garfo' [bifurcada]) em he-patócitos e deste modo reiniciar o crescimento do fígado.

Contudo, a hormona do crescimento tem um efeito de largo espectro, e portanto não específico, sobre o crescimento de tecidos. Em consequência, a administração de GH também tem efeitos secundários indesejados ou reacções excessivas, por exemplo sob a forma da chamada acromegalia, isto é, uma ossificação excessiva associada a estados patológicos dos ossos. Adicionalmente foi entretanto dado a conhecer que o Fox Ml é ascendentemente regulado em carcinomas das células basais. As proteínas Fox desempenham um papel importante na regulação dos genes do crescimento quando da multiplicação, diferenciação e transformação, nomeadamente também quando da activação das vias de sinalização chamadas em inglês "Sonic hedgehog homolog" ou Shh (à letra, 'homólogo de ouriço Sonic'). Estas estão, por sua vez, envolvidas na activação dos carcinomas das células basais da pele humana. Assim, M.-T. The e outros (2002) puderam mostrar em Câncer Research, vol. 62, n° 16 (Agosto), pp. 4773-80 que a regulação ascendente do Fox Ml em carcinomas de células basais constitui um dos mecanismos de iniciação essenciais mediante os quais as vias de sinalização " Sonic hedgehog" exercem efeitos mitógenos nos que- 6 ΡΕ1699915 ratinócitos, dos quais resultam os muito comuns tumores cancerígenos humanos. Em consequência, este potencial tumo-rígeno dos agonistas de Fox 1M e a especificidade deficiente e presença ubíqua em todos os tecidos constitui um obstáculo à administração de GH para efeito de estimulação da regeneração hepática.

Em WO 2004/002023 fica-se a saber, entre outras coisas, que a eritropoietina (EPO) e a trombopoietina (TPO) têm como efeito uma indução de processos estruturais in vivo ou in vitro, na medida em que estes podem ser desencadeados e terminados quando da sua administração local ou sistémica, em particular quando é iniciada in situ uma multiplicação celular localmente específica por via do efeito indutor de um implante.

Em consequência, subjazia ao presente invento a tarefa de disponibilizar um processo que induzisse e promovesse o crescimento estrutural dos tecidos hepáticos após uma ressecção do fígado na sequência da presença neste de tumores. De preferência, este crescimento deveria conduzir a uma operacionalidade essencialmente funcional e estrutural dos tecidos em causa.

De acordo com o invento, este objectivo é alcançado por via da utilização de eritropoietina, ou de um seu derivado ou análogo ou componente, para efeito da regeneração estrutural e funcional do fígado. Numa forma particularmente preferida de execução do invento procede-se à ad- 7 ΡΕ1699915 ministraçao de eritropoietina (EPO) ou de um seu derivado, componente ou análogo.

Surpreendentemente, a aplicação do factor de crescimento hematopoiético EPO revelou desencadear não só uma multiplicação celular, mas também um crescimento estrutural. Este crescimento ocorre em particular em tecidos previamente traumatizados. 0 crescimento assim induzido conduz in vivo a uma regeneração tecidular propriamente dita, ou seja, verifica-se a ocorrência não só de um crescimento proliferativo, como também de um crescimento diferenciado, orientado para a formação de estruturas complexas .

Na sua essência, a utilização de EPO para efeito da regeneração de tecidos baseia-se principalmente em dois efeitos da EPO não conhecidos até à data, nomeadamente a estimulação do crescimento estrutural, de modo coordenado e síncrono entre si, de diferentes tipos de células (tais como, por exemplo, fibroblastos, células do músculo liso com células endoteliais na zona vascular em conjugação com uma reconstituição da arquitectura de um vaso completo, tendo em consideração a matriz extracelular [colagénio, elastina, fibronectina, entactina]), por um lado, e o completar da integração parenquimatosa propriamente dita. Tal inclui, por exemplo, a formação de hepatócitos, incluindo as células de Kupffer, células de Ito, células chamadas "pit cells" em inglês (à letra 'com graínhas' ) e células endoteliais (células não parenquimatosas do fígado) asso- ΡΕ1699915 ciadas. Além da formação de uma verdadeira rede vascular e respectivas interligações é deste modo induzida uma regeneração tecidular no sentido de uma restitutio ad integrum.

No fígado, esta regeneração integral conduz a uma mistura de vasos capilares sinusoidais na zona terminal do estroma e de vasos de alimentação e evacuação além da integração parenquimatosa propriamente dita dos hepatócitos, numa estrutura tridimensional.

Tal como foi previamente referido, o efeito do factor de crescimento hematopoiético EPO é especialmente evidente em tecidos e células traumatizadas. 0 conceito de traumatismo é aqui concebido enquanto oposto do processo de histogénese (formação tecidular). Por conseguinte, o traumatismo consiste num processo que contraria a histogénese enquanto processo de formação de tecidos num organismo individual, em locais apropriados deste, ou que anula o resultado da histogénese. 0 traumatismo enquanto lesionamento de tecidos pode ser desencadeado por uma multiplicidade de acontecimentos, por exemplo feridas, inflamações ou doenças auto-imunes com autolesionamento. Estas lesões ou destruições de tecidos desencadeiam por sua vez uma multiplicidade de reacções, tais como, por exemplo, a activação dos macró-fagos, mastócitos ou células imunocompetentes que secretam os factores quimiotácticos, vasoactivos e promotores da ci-catrização das lesões, deste modo regulando mecanismos sistémicos e regiosselectivos. 9 ΡΕ1699915

As vantagens da utilização de EPO estendem-se à regeneração de todos os quatro tipos fundamentais de tecidos, nomeadamente os tecidos conjuntivo, muscular, epite-lial e nervoso. Do ponto de vista ontogenético, estes tecidos derivam ou da mesoderme (tecido conjuntivo, músculo, endotélio [enquanto forma especial do epitélio]), da endo-derme (o epitélio que reveste o tracto gastrointestinal) ou da ectoderme (tecido nervoso). No passado foi demonstrado que o receptor de EPO tem expressão em células de origem quer mesodérmica, quer endodérmica, além de em células neu-ronais.

Nestes tecidos, a utilização de EPO produz um recrutamento local da população progenitora de tecidos específicos (células estaminais), da migração das células e da diferenciação ou transdiferenciação das células em células do parênquima e estruturais. Em consequência da administração de EPO, as células multiplicam-se durante e antes desta formação tecidular.

Quando da utilização em conformidade com o invento de EPO para efeito da regeneração hepática pode ser alcançada uma reconstituição integral do órgão previamente lesionado conducente a uma completa integração no tecido parenquimatoso, incluindo a formação de hepatócitos, incluindo as células de Kupffer, as células ditas em inglês "pit cells", as células de Ito e as células endoteliais. Com a consequente formação de uma rede vascular torna-se deste 10 ΡΕ1699915 modo possível a regeneração tecidular enquanto restitutio ad integrum.

Assim sendo, uma vantagem particular da utilização de EPO em conformidade com o invento consiste em não só ser estimulada a microcapilarização do tecido em regeneração por via do aparecimento de um endotélio, como também são promovidas a regeneração do parênquima e a formação das estruturas parietais. Só assim pode ser alcançado o resultado pretendido, o qual consiste num crescimento tridimensional coordenado para efeito da constituição de um órgão operacional.

Por conseguinte, a utilização em conformidade com o invento de EPO baseia-se num efeito que ultrapassa em larga medida o efeito já conhecido à data sobre a multiplicação das células endoteliais da EPO enquanto factor angiogenético (Buemi e outros [2002], Journal of Nephro-logy, vol. 15, n° 2, pp. 97-103) . Contudo, uma vez que as estruturas microvasculares tais como os vasos capilares e sinusoidais se compõem apenas de revestimento de células endoteliais, não exibindo uma estrutura parietal própria, até à data apenas se pôde especular sobre se a EPO também se revestia de alguma importância no que respeita à reconstituição vascular e à cicatrização de lesões (Buemi e outros [2002], Journal of Nephrology, vol. 15, n° 2, pp. 97-103). No entanto, uma substanciação destas especulações permanece omissa até à data. 11 ΡΕ1699915

Por este motivo é presentemente tão significativo que tenha podido ser comprovado pela primeira vez o efeito da EPO sobre o crescimento sincronizado e coordenado dos próprios vasos, ou seja, incluindo a formação das estruturas parietais e a regeneração do parênquima.

Uma outra vantagem da utilização da EPO consiste em o crescimento estrutural não ter de ter necessariamente como ponto de partida uma estrutura orgânica ou inorgânica tridimensional prévia, sendo pelo contrário criada de raiz uma estrutura (parcial) do órgão. Deste modo, a administração do factor de crescimento hematopoiético pode induzir uma auto-regeneração notoriamente mais célere de um tecido lesionado, o que se reveste de grande significado em aplicações clinico-terapêuticas.

Numa forma particularmente vantajosa de execução, o factor de crescimento hematopoiético é administrado para efeito da indução da regeneração de um tecido que exibe zonas traumaticamente lesionadas. Nestas porções do tecido é deste modo suscitando não só uma cicatrização da ferida mediante a formação de um tecido granuloso em que ocorre uma angiogénese, como também a reconstituição da estrutura tridimensional tecidularmente especifica a partir da matriz extracelular, por exemplo a partir de colagénio, elastina, fibronectina ou entactina.

De acordo com o invento, são utilizados como fac-tores de crescimento hematopoiéticos a EPO ou os seus com- 12 ΡΕ1699915 ponentes, derivados ou análogos. Também são adequados para o efeito os péptidos miméticos da mesma (ver adiante).

Os factores de crescimento hematopoiético consistem em proteínas em feixe helicoidal quádruplo levógiro com uma orientação ascendente — ascendente — descendente — descendente com dois laços sobrepostos que ligam entre si as duas primeiras e as duas últimas estruturas helicoidais (0. Livnah e outros (1999), Science, vol 283, n° 5404, pp. 987-90 e M.H. Ultsch e outros (1995), Blood, vol. 86, n° 2, pp. 540-47). Cada um dos domínios ligantes de receptores ou RBD ("receptor binding domains", em inglês) exibe uma homo-logia marcada no que respeita à EPO. A trombopoietina, a eritropoietina e a hormona do crescimento ligam-se ao complexo receptor Mpl ("myeloproliferative leukemia" em inglês). No artigo publicado por Youssoufianh e outros (1993) em "Structure, Function, and Activation of the Erythropoietin Receptor", Blood, vol. 62, n° 819, pp. 2223-36, é descrita uma dimerização produtiva. A eritropoietina e a trombopoietina, péptidos miméticos (EMP ["epithelial membrane protein" em inglês] e DMP ["dentin matrix protein" em inglês]) e ainda pequenas moléculas não peptídicas são igualmente funcionais, embora numa base molar inferior (ver N.C. Wrighton e outros (1996), "Small Peptides as Potent Mimetics of the Protein Hormone Erytropoietin", Science, vol. 273, n° 5274, pp. 458-64; S.E. Cwirla e outros (1997), "Peptide Agonist of the Thrombopoietin Receptor as Potent as the Natural Cytokine", Science, vol. 276, n° 5319 (Junho), pp. 1696-99; e S.A. Qureshi e outros (1999), "Mimicry 13 ΡΕ1699915 of Erythropoietin by a Nonpeptide Molecule", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS USA), vol. 96, n° 21 (Outubro), pp. 12156-61). A ligação da EMP 1 ao receptor ocorre em locais homólogos dos chamados pontos quentes ("hot spots" em inglês) para as ligações ao receptor da hormona do crescimento. As sequências estruturais da trombopoietina encontram-se descritas em pormenor em EP 1201246 A2. As sequências estruturais da eritropoietina encontram-se descritas em pormenor no pedido de patente europeia EP 84308654.7

Numa forma particularmente vantajosa de execução do presente invento é utilizada EPO que estimula in vivo a formação de eritrócitos bem como a divisão celular e a diferenciação de células precursoras de eritrócitos. A EPO pode ou ser isolada a partir de urina ou ser preparada sob uma forma recombinante. A preparação de EPO humana recom-binante é objecto de WO 86/93520. A EPO é ainda objecto dos documentos EP 0148605, EP 0205564, EP 0209539, EP 0267678, EP 0411678.

Podem contudo ser igualmente utilizados derivados de EPO nativa ou recombinante. Assim sendo, foi dado a conhecer (EP 0 640 619 Bl) um derivado de EPO que exibe locais de glicolização adicionais e, em consequência, uma proporção mais elevada de hidrocarbonetos com 22 radicais ácido siálico. A vantagem desta modificação reside no facto de a proporção superior de ácido siálico conduzir a um aumento da vida média da EPO no plasma, uma vez que somente 14 ΡΕ1699915 uma EPO não sializada se pode ligar ao receptor de galac-tose interveniente na decomposição da EPO. Embora, quando comparado com a EPO recombinante, este derivado de EPO, conhecido sob a designação abreviada NESP ("Novel Erythro-poiesis Stimulating Protein" em inglês), também chamada darbepoietina, exiba uma sequência de aminoácidos alterada no que respeita a cinco posições, o seu efeito sobre a estimulação da formação de eritrócitos corresponde no essencial ao da EPO nativa ou recombinante (J.W. Fisher (2003), "Erythropoietin: Physiology and Pharmacology Up-date", Experimental Biology and Medicine, vol. 228, n° 1 (Janeiro), pp. 1-14. O documento EP 0640619 BI é tido em consideração na sua totalidade no que respeita à estrutura e à preparação da NESP.

Para que a sua meia-vida seja ainda mais prolongada, a NESP pode, com vantagem, ser quimicamente conjugada com polietilenoglicol (PEG), sem que tal acarrete uma alteração da sua actividade biológica. Uma NESP deste modo modificada foi dada a conhecer em WO 01/76640, documento que é tido em consideração na sua totalidade no que respeita à estrutura e à preparação deste derivado de EPO.

Em WO 02/49673 A2 e WO 01/02017 A2 foram também dados a conhecer derivados peguilados de EPO, os quais, além de uma meia-vida no plasma prolongada, exibem também uma eficácia clinica mais elevada, em resultado, por exemplo, da introdução de 1 a 6 locais de glicosilação na sequência de aminoácidos da EPO mediante uma mutagénese 15 ΡΕ1699915 selectiva. Também este derivado pode ser utilizado em conformidade com o presente invento.

De acordo com o presente invento, a EPO pode ser utilizada sob uma forma quer humana, quer não humana.

Os factores de crescimento hematopoiéticos também podem ser vantajosamente utilizados na preparação de culturas de tecidos in vitro. Para tal, as culturas de células são realizadas em dispositivos e mediante processos especialmente adequados ao tecido, por exemplo sobre uma grelha com uma estrutura intersectante composta por malhas de 500 m, por forma a permitir que se formem constantemente agregados de hepatócitos descendentes. Combinações de EPO com GH são particularmente vantajosas in vitro.

Em particular podem ser utiliados sistemas de bombeamento não manualmente accionados e automática ou manualmente controlados, constituídos, por exemplo, por bom-bas de pistões ou produtoras de fluxos orientados magneticamente gerados ou gerados mediante compressão de ar em tubos. Na presença de células endoteliais pode ocorrer, em resultado da tensão de corte num biorreactor perfundido, uma confluência espontânea das células endoteliais nas superfícies externas dos agregados, o que pode revelar-se vantajoso em utilizações posteriores.

No que toca à encapsulação, são adequados os materiais apropriados para tal conhecidos do técnico da es- 16 ΡΕ1699915 pecialidade, nos quais podem ser integradas formas ou espaços estruturados que viabilizem um crescimento estrutural ou um aumento in situ. Alternativamente pode prescindir-se da cápsula e, por exemplo na presença de células endote-liais, proceder-se a uma endotelialização, alcançando deste modo uma hemocompatibilidade óptima. A administração de EPO, quer isoladamente, quer, no caso de defeitos estruturais de maior dimensão, em combinação com materiais de suporte ("scaffold materiais" em inglês) permite alcançar uma substituição biológica de tecidos. Estes materiais de suporte podem ser previamente colonizados in vitro ou extracorporalmente, ser biologicamente modeláveis (biodegradáveis) e, no caso ideal, micro e macro-estrutural, além de bioquimicamente serem o mais parecidos possível com a estrutura a ser substituída. A proximidade ou identidade bioquímica inclui uma reconstrução da composição in vivo por intermédio de colagénio e proteínas matriciais (elastina, fibronectina e todos os componentes matriciais do corpo sujeitos a impressão ("imprint-ing" em inglês) tecidularmente específica, tal como é conhecido) .

As células estaminais podem ser obtidas das diferentes fontes presentes no corpo do paciente: medula óssea, sangue periférico, tecido adiposo, o próprio tecido, sangue ou tecidos do cordão umbilical. Podem ser correspondentemente obtidas células estaminais alogénicas, às quais são, contudo, inerentes desvantagens imunológicas. Podem ser 17 ΡΕ1699915 utilizadas células embriónicas nao humanas, embora com as desvantagens associadas. 0 processo é particularmente adequado para células adultas, ou seja, células primariamente diferenciadas que já não possuem nenhum fenótipo embriónico ou fetal. É especialmente apropriado para células adultas humanas, por exemplo células progenitoras adultas, células tecidular-mente especificas, de preferência hepatócitos. É particularmente vantajosa que a utilização em conformidade com o presente invento seja realizada localmente, in vivo. Para tal, os factores de crescimento podem ser aplicados, por exemplo, sobre a superfície ressectada de um órgão (fígado). Podem ser aplicados topicamente ou então local ou sistemicamente com recurso a um catéter. Em caso de uma ressecção do fígado, podem ser aplicados, em alternativa ou complemento, antes, durante ou após a intervenção. Também se pode injectar os factores de crescimento (por exemplo para efeito da regeneração de cartilagem) directamente no tecido ou na articulação afectados. Deste modo, por intermédio do líquido sinovial, os factores de crescimento podem influenciar directamente a formação de uma nova estrutura cartilaginosa.

Numa outra forma de execução do presente invento podem ser administrados, além dos factores de crescimento hematopoiéticos, um ou mais dos factores de crescimento seguintes: factor de crescimento transformador beta ou TGF-β 18 ΡΕ1699915 ("Transforming Growth Factor β" em inglês), prostaglandina, factor estimulante de colónias de granulócitos (macrófagos) ou G(M)-CSF ("Granulocyte (Macrophage) Colony-Stimulating Factor" em inglês), hormona libertadora da hormona do crescimento ou GHRH ("Growth Hormone Releasing Hormone" em inglês), hormona libertadora de tirotropina ou TRH ("Thyro-tropine Releasing Hormone" em inglês), hormona libertadora de gonadotropina ou GnRH ("Gonadotropin Releasing Hormone" em inglês), hormona libertadora de corticotropina ou CRH ("Corticotropine Releasing Hormone" em inglês), dopamina, hormona antidiurética ou ADH, oxitocina, prolactina, adre-nocorticotropina, tropina das células β ("beta-cell tropin" em inglês, lutropina e/ou vasopressina, além de um ou mais factores de regeneradção nervosa, de preferência factor de crescimento nervoso ou NGF ("Nerve Growth Factor" em inglês) e/ou um ou mais factores de regeneração vascular, de preferência o factor de crescimento endotelial vascular ou VEGF ("Vascular Endothelial Growth Factor" em inglês) e/ou o factor de crescimento derivado de plaquetas ou PDGF ("Platelet-Derived Growth Factor" em inglês).

Os factores de crescimento hematopoiéticos podem ser administrados por via parentérica enquanto micro-esferas injectáveis, partículas erodíveis, compostos polimé-ricos (com um polipéptido, um ácido poliglicólico), lipos-somas e pequenas partículas. Também podem ser usados dispositivos de libertação controlada de medicamentos implantáveis. As substâncias também podem ser inaladas, injec- 19 ΡΕ1699915 tadas subcutânea ou intramuscularmente ou, no caso da aplicação tópica, colocadas sob a forma de adesivo cutâneo. É do conhecimento geral que podem ser produzidas preparações proteicas destinadas a serem misturadas. São possíveis suspensões, emulsões sob a forma de geles, compostos sólidos, pós desidratados ou liofilizados. Os facto-res de crescimento também podem ser absorvidos sobre partículas ou ser encapsulados.

Pode ser particularmente vantajosa para efeito da regeneração de tecidos a utilização de células estaminais (progenotoras em sentido próprio) em conjunto com EPO, por forma a desse modo acelerar o recrutamento para o processo de regeneração de células tecidulares entre os quatro tipos fundamentais de tecidos. Tanto a EPO como os outros facto-res mencionados podem ser misturados com células estaminais, utilizando cola de fibrina como matriz de suporte. Se necessário, a matriz de suporte pode ser omitida ou substituída por uma matriz de suporte que numa etapa prévia foi mais fortemente estruturada e moldada. Os factores também podem ser sistémica ou topicamente administrados sem qualquer matriz de suporte biológica, por exemplo simplesmente em suspensão aquosa. A administração em conformidade com o invento de EPO melhora a regeneração tecidular mediante um "imprint-ing" tecidularmente específico das células estaminais e uma 20 ΡΕ1699915 diferenciação na sequência de uma proliferação e integração e coordena o crescimento no que respeita aos tipos fundamentais de tecidos. I. Domínios de aplicação Fígado

Após uma infecção virai do fígado (por exemplo hepatite A, B, C ou D) pode ocorrer uma regeneração defeituosa do fígado. A cirrose hepática constitui o estádio terminal de um defeito de regeneração do fígado em que ocorreu uma substituição das células parenquimatosas por tecido conjuntivo em virtude de, não sendo contínua, a regeneração corporal espontânea não conseguir acompanhar a velocidade a que os agentes nocivos produzem lesões.

Após traumatismos e intervenções cirúrgicas, por exemplo ressecções de tumores hepáticos, ocorre uma perda aguda de tecido viável e destruição de tecidos.

De acordo com o invento, após a administração de EPO ocorre uma regeneração acelerada dos hepatócitos e células hepáticas não parenquimais que culmina numa res-titutio ad integrum. Esta caracteriza-se por uma reconstituição da arquitectura normal dos lóbulos hepáticos, pela reconstituição do tecido conjuntivo interlobular, das veias centrais e da tríade ou triângulo de Glisson, onde são 21 ΡΕ1699915 reconhecidamente reconstituídos os duetos biliares, vasos linfáticos, artérias e a veia interlobular, além das células hepáticas. A constituição específica da rede de fibras reticulares e da sinusoide hepática. A configuração histológica pós-regeneração exibe uma estrutura em placas específica. As lacunas na vizinhança das células endoteliais indiciam uma expressão hepática típica. As células Kupffer libertadoras de interleucina 6 (IL-6), interleucina 1 (IL-1) e o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) constituem importantes células iniciadoras. A administração de EPO conduz a um número superior de processos regenerativos, mesmo em comparação com tecidos hepáticos de fígados ontogeneticamente mais jovens. In vitro, são alcançados factores de aumento compreendidos entre 10 e 30. II. Exemplos de Execução 1. Transplante celular

Hepatócitos:

As células hepáticas são isoladas mediante digestão de colagenase a partir de órgãos não transplantáveis ou ressectados hepáticos (A. Bader, I.H.B. Rinkes, E.I. Closs, C.M. Ryan, M. Toner, J.M. Cunningham, G.R. Tompkins, M.L. 22 ΡΕ1699915

Yarmush [1992], "A Stable Long-Term Hepatocyte Culture System for Studies of Physiologic Processes: Cytokine Stimu-lation of the Acute Phase Response in Rat and Human Hepatocytes", Biotechnological Progress, vol. 8, n° 3 [Maio-Junho], pp. 219-25).

As células isoladas ou de culturas previamente preparadas são armazenadas em azoto liquido. Após a descongelação das células em conformidade com protocolos conhecidos (N. Karim, C. Allmeling, J.-G. Hengstler, A. Have-rich, A. Bader [2000], "Diazepam Metabolism and Albumin Secretion of Porcine Hepatocytes in Collagen-Sandwich After Cryopreservation", Biotechnological Letters, vol. 22, n° 20 [Outubro], pp. 1647-52), as suspensões/culturas de hepa-tócitos são misturadas com 100-150 unidades internacionais ou IU de epoetina alfa por quilograma de peso corporal do receptor. Para tal, a epoetina alfa é adicionada enquanto solução estéril com um volume de 1 a 1,5 ml a 10 ml de uma suspensão de hepatócitos com uma concentração de 2 a 10 milhões de células por mililitro.

Esta suspensão é intraportalmente injectada de modo lento (1 ml/minuto). A suspensão pode ser adicionalmente misturada com 1000 UI de heparina a fim de evitar a ocorrência de tromboses.

Alternativamente também se pode injectar a mistura de células e EPO sob a cápsula hepática ou directamente 23 ΡΕ1699915 no parênquima hepático, em diferentes locais deste. Neste caso sugere-se que a concentração de hepatócitos seja aumentada de um factor compreendido entre 2 e 5 e que o volume injectado sofra uma redução correspondente.

Os canais de puncionamento são fechados com uma cola de fibrina disponível no comércio (TISSUCOL da Baxter) . Em alternativa pode recorrer-se a um tamponamento com velo de colagénio. 0 tamponamento também pode ser misturado com a solução de epoetina alfa. Deve ter-se cuidado de garantir que o tamponamento se mantêm seco no local de adesão . A cola de fibrina consiste numa mistura de dois componentes. Um dos componentes é usualmente fibrinogénio, sendo o outro uma solução de activação com iões Ca++ e ini-bidores da proteinase (por exemplo aprotina). A epoetina alfa pode ser adicionada à solução de activação mediante misturação por forma a que seja obtida uma concentração final de 100 a 150 IU por kg de peso corporal.

Podem ser utilizadas de modo análogo células estaminais provenientes da medula óssea, do tecido adiposo, de um parênquima específico ou do sangue (purificação da camada leucocitária ["buffy coat" em inglês], células positivas no que respeita a CD34 [CD34 + ] ) do cordão umbilical e de células mesenquimais do tecido do cordão umbilical. 24 ΡΕ1699915

Paralelamente ao transplante celular em zonas is-quémica, tóxica, infecciosa ou mecanicamente (traumatica-mente) lesionadas, as células podem ser introduzidas numa cola de fibrina ou plasma autólogo e ser polimerizadas mediante a adição de epoetina alfa (100 a 150 IU por kg de peso corporal).

Paralelamente pode dar-se inicio a uma administração subcutânea de 10 000 IU de EPO de modo a que, no total, sejam aplicadas 40 000 IU no decurso de uma semana. O resultado é uma regeneração tecidular duplicada ou triplicada conducente a uma reparação estrutural. 2. Administração pós-operatória A epoetina alfa é neste caso administrada numa concentração correspondente a 100 a 150 IU por kg de peso corporal. A administração de EPO permite alcançar um aumento endógena da hormona do crescimento para o dobro, em consequência da qual a regeneração tecidular é acelerada. A restitutio ad integrum ocorre cerca de 1 a 2 semanas mais cedo em comparação com o que sucede em pacientes cujo tratamento não involveu a administração de EPO. A EPO também pode ser administrada após um trans- 25 ΡΕ1699915 plante hepático por bipartição ou um transplante hepático total por forma a induzir a regeneração do fígado.

Após um transplante do fígado pode suceder que o tecido transplantado ou, no caso de dadores vivos, o tecido remanescente não esteja disponível enquanto tecido activo com a prontidão necessária e em quantidade suficiente. Neste caso podem ser administrados 100 a 150 IU de epoetina alfa por kg de peso corporal 24 h antes da operação, no momento da operação e de 24 em 24 h, após a operação. Consegue-se deste modo uma regeneração hepática nitidamente mais rápida, podendo com recurso a ultrassons ser diagnosticado um aumento de volume no 4o ou 5o dia pós-operatório. 3. Administração após ressecção cirúrgica do fígado em caso de tumores benignos e malignos

Em caso de uma ressecção extensiva do fígado impõe-se alcançar uma regeneração acelerada, uma vez que a disponibilidade de uma massa celular suficiente é importante para a sobrevivência do paciente. Após ressecção cirúrgica, a epoetina alfa pode ser administrada sistemicamente na proporção delOO a 150 IU de por kg de peso corporal ou ser aplicada topicamente (em cola de fibrina, plasma) numa quantidade correspondente.

Caso se suspeite da presença persistente de tumores ou da presença de metástases não ressectáveis podem ser administradas quer sistémica, quer topicamente, consoante o 26 ΡΕ1699915 tipo de tumor e o prognóstico, os fármacos citostáticos usuais em combinação com a EPO.

Após ressecção e administração da EPO ocorre um crescimento dimensional 30% mais rápido no grupo tratado quando comparado com o grupo não tratado. São sobretudo os hepatócitos nas superfícies ressectadas a intervir mais ac-tivamente no processo de crescimento estrutural. É alcançada uma formação integral da rede vascular e dos tecidos circundantes. Além disso, do modo típico correspondente a um órgão normal, os hepatócitos encontram-se dispostos em lóbulos vascularizados, placas de células não parenquimais (células de Kupffer, "pit cells", células de Ito e células endoteliais) .

Ocorre um crescimento dimensional sistémico. 0 crescimento dimensional termina quando é alcançado o tamanho inicial. O grupo ao qual a EPO foi administrada periope-ratoriamente exibe logo ao Io ou 2 o dia pós-operatório um teor de hemoglobina superior em cerca de 0,5 g/dl. Tal deve ser considerado como sinal do efeito conhecido da EPO. Paralelamente ocorre contudo a regeneração hepática. Neste caso multiplicam-se não só os hepatócitos como todos os tipos de células e sobretudo também as estruturas do tecido conjuntivo, as quais constituem o suporte arquitectónico do fígado. 27 ΡΕ1699915

Realização dos ensaios: 28 fêmeas de porco (pesando entre 40,0 e 62,0 kg) foram aleatoriamente distribuídas por três grupos. A remoção parcial do lado esquerdo do fígado foi realizada segundo a téncica da endoscopia gástrica.

Ao grupo de controlo (n=16) não foi administrada EPO. Ao grupo 2 (n=6) foi localmente sobre a superfície ressectada administrada uma combinação de 10 000 unidades de EPO com um agente espessante de fibrina (QUIXIL). O grupo 3 foi tratado de modo análogo embora as porcas recebessem, além do tratamento local com EPO, 10 000 unidades de EPO admistradas sistemicamente nos dias 0, 3, 7 e 11 do ensaio.

Foram retiradas amostras de fígado: no dia 0, 24 h após a ressecção, de uma zona da fracção de fígado cirurgicamente removida situada 1 cm abaixo da superfície de ressecção e, 14 dias após a ressecção, de sob a superfície de ressecção além de do lóbulo lateral direito.

Para efeito da detecção do antigénio Ki-67, do antigénio nuclear de proliferação celular ou PCNA ("Proli-ferating Cell Nuclear Antigen" em inglês) de apoptose foi realizado o ensaio de acordo com a técnica da imunopero-xidase com complexo estreptavidina-biotina em tecidos hepáticos fixados em formalina e incorporados em parafina. 28 ΡΕ1699915

Resultados

Grupo 1 (controlo, n=16) Grupo 2 (factor de crescimento: local) Grupo 3 (factor de crescimento: local e sistémico) volume do fígado (ml) 892,071 ± 130,56 894,02 ± 104,705 1073,10 ± 190,13 * peso do fígado (g) 1001,55 ± 155,76 1027,18 ± 166,95 1249,42 ± 222,51 * hemoglobina (mmol/1) (14° dia) 6,0077 ± 0,65 6,550 ± 0,89 6,58 ± 0,5541 peso da porca (kg) 48,37 ± 5,25 52,67 ± 6,76 50,54 ±9.801 Grupo 1 grupo de controlo Grupo 2 factor de crescimento: local Grupo 3 factor de crescimento: local e sistémico Ki-67 (%) (14° dia) 1,85 ± 2,01 14,0 ± 12,11 * 15,08 ± 15,71 * PCNA (%) 25,33 ± 9,83 29,87 ± 7,18 37,16 ± 14,32 apoptose (%) 0,56 ± 0,429 0,267 ± 0,103 0,56 ± 0,30 média aritmética e desvio padrao * p < 0,05 4. Endoprótese ou implante optimizado (exemplo de comparação)

Os implantes podem consistir em materiais biodegradáveis ou permanentes. São exemplos destes últimos as endopróteses metálicas, por exemplo na zona da anca. Após a produção da forma metálica em bruto é produzida uma micro-estruturação mediante abrasão, gravura com ácido ou tratamento com laser. Podem deste modo ser obtidos poros abertos e asperezas com dimensões da ordem de 1 a 50-60 μιη.

Estas estruturas são subsequentemente preenchidas 29 ΡΕ1699915 numa solução de β-fosfato tricálcico ou β-TCP ("β TriCal-ciumPhosphate" em inglês) de modo a que seja obtido um revestimento homogéneo da superfície superior. As estruturas são em seguida idealmente submetidas a um processo de sin-terização suplementar a fim de fixar as estruturas β-TCP.

Nas estruturas minerais podem ser incorporados sais solúveis ou açúcar ou ser induzidas libertações de gases a fim de obter novos poros interligados. Após este processo de acabamento, as estruturas são impregnadas ou revestidas com o factor de crescimento de acordo com o presente invento ou um seu derivado, componente ou análogo. Podem ser colocados depósitos nas superfícies na medida em que as cavidades se enchem de EPO ou são utilizadas substâncias de libertação gradual. Em alternativa, o implante retirado da embalagem sob uma forma estéril pode ser revestido com EPO ou um seu análogo.

Alcança-se deste modo uma melhoria do processo de ligação dos tecidos ao implante. 0 osso fica macrovascular-mente ligado e o implante fica mais rápida e duradouramente integrado no osso.

De modo análogo se podem colocar implantes na zonas bucal, maxilar e facial (implantes dentários). É possível a combinação com uma colonização com células estaminais realizada em biorreactores. 30 ΡΕ1699915

Os implantes biológicos (vasos, válvulas cardíacas, pele) e membranas também podem ser revestidos com EPO e/ou GH e/ou TPO. 5. Tratamento da osteoporose (exemplo de comparação)

Uma solução em plasma autóloga de grânulos de fosfato tricálcico revestidos com EPO é introduzida em vértebras deficitárias/porosas por intermédio de punção com recurso a uma agulha. Nas vértebras, os grânulos são rapidamente convertidos em osso endógeno, sendo o processo de degeneração transformado num efeito anabólico. 0 efeito pode ser útil em relação a vértebras em risco agudo de fractura. É possível a combinação com um processo de colonização, de preferência por células estami-nais provenientes da medula óssea autóloga ou do periósteo e sangue e/ou tecido adiposo. 6. Indicação: regeneração da cartilagem (exemplo de comparação )

As células cartilaginosas constituem tecidos fortemente braditróficos. Um traumatismo regional ou abrasões podem originar processos inflamatórios que podem evoluir para uma artite. A administração de EPO na cavidade articular ou sistemicamente e/ou em combinação com transplantes celulares de condrócitos ou cilindros osteocondrais promove a regeneração tecidular e a reconstituição estrutural inte- 31 ΡΕ1699915 gral É possível a administraçao sistémica ou subcutânea de 10 000 UI por dia. 7. Indicação: doenças de pele (exemplo de comparação)

Feridas que saram com dificuldade são revestidas com EPO ou TPO (ou respectivos derivados, componentes ou análogos) após prévia preparação do leito da ferida. Para tal procede-se de preferência a um desbridamento mecânico. No coágulo de sangue são introduzidas 10 000 IU de EPO.

Este processo pode ser repetido até o fundo da ferida estar limpo. O crescimento estrutural tem início após 2 a 3 dias, sendo conducente à formação acelerada de um tecido granular. 8. Indicação: doenças do tracto intestinal (exemplo de comparação )

No que respeita ao caso de fenómenos inflamatórios do tracto intestinal associados a perda de peso e anemia, chegou-se à conclusão de que a anemia não consistia num fenómeno secundário devido a uma absorção deficiente dos alimentos, podendo antes ser uma manifestação concomitante da deficiência de EPO originária. A administração de 10 000 IU de EPO por dia conduz a uma melhoria da recons-tituição/regeneração do intestino. 32 ΡΕ1699915 9. Indicaçao neuroregeneraçao (exemplo de comparação) A administração de EPO após secção transversal da medula espinal conduz a um crescimento estrutural dos neu-rónios e à emergência de novos axónios. A administração de vitamina C funciona como coadjuvante deste processo. A EPO pode ser fornecida regionalmente em conjugação com cola de fibrina, plasma autólogo e/ou células estaminais endógenas (medula óssea, células CD34+ do sangue, de células adiposas, periósteo ou cordão umbilical). 9. Indicação: Parkinson / exemplo de uma doença crónica em que a reacção desencadeadora já desapareceu (exemplo de comparação)

Macrófagos autólogos estimulados com recurso a partículas degradáveis são estereotaxicamente integrados em áreas degeneradas. Paralelamente, injecta-se na área EPO (10 000 IU) em conjugação com células estaminais autólogas (0,3). Ainda em paralelo administra-se EPO sistemicamente, ao longo de 2 semanas. Este princípio de estimulação que consiste na indução de uma inflamação por intermédio de macrófagos também pode ser utilizado em relação a outras doenças crónicas em que não seja preponderante um traumatismo agudo ou uma reacção inflamatória aguda. 33 ΡΕ1699915 11. Cicatrizaçao após queimadura (exemplo de comparaçao)

Em 8 pacientes queimados, o local dador do transplante cutâneo sarou com uma velocidade 50% superior quando da administração de EPO. Queimaduras faciais profundas do segundo grau (grau 2B) sararam sem formar cicatrizes quando é administrada ao paciente EPO. Caso não seja administrada EPO formam-se cicatrizes quando este tipo de feridas sara.

Lisboa, 24 de Agosto de 2010

Claims (5)

1. ΡΕ1699915 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de eritropoietina (EPO) na preparação de um medicamento para a promoção da regeneração estrutural acelerada após ressecção cirúrgica do fígado na sequência da presença neste de tumores benignos e malignos, em que a regeneração inclui a formação de uma rede vascular em torno da área ressectada, a reconstituição de uma arquitectura lobular normal do fígado, do tecido conjuntivo interlobular, das veias centrais e da tríade de Glisson, bem como o alcançar do tamanho inicial do fígado.
2. 2. Utilização de EPO de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento se destina a ser utilizado tópica ou sistemicamente.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o medicamento se destinar a ser utilizado em combinação com um agente citostático.
4. 4. Eritropoietina (EPO) para utilização num processo para a regeneração estrutural acelerada de tecidos hepáticos após ressecção cirúrgica do fígado na sequência da presença neste de tumores benignos e malignos, em que a regeneração inclui a formação de uma rede vascular em torno da área ressectada, a reconstituição de uma arquitectura lobular normal do fígado, do tecido conjuntivo interlobu- ΡΕ1699915 2 lar, das veias centrais e da tríade de Glisson, bem alcançar do tamanho inicial do fígado.
5. 5. EPO de acordo com a reivindicação utilização tópica ou sistémica. como o 4 para Lisboa, 24 de Agosto de 2010 1 ΡΕ1699915 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição uk rca-ssas-sm EP Q30298S1A USS0S8S47A WO 02092013 AZ WO 2034001023 A EP 1201248 M EP S4388SS4 A «Íf! «ΚΓχ'νΏΛ A EPS20SS64A EP0S8S539A EP 0267678 A EP‘341 -WS EP0S4G618B1 WO 3176S40 A W© 0248873 Â2 WD 0102017 A2 « EPQM88G5A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Sa No«te« T«t» «t aL IS- Aagte 2002. te. 62 (':«}. 4773-80 « Jmmsí--ctfNephrdogy. 2002. IS, 874¾ * Lteah O. et aí. Sosnce. 987-?0 * Uitscts M,M.. «$ aí, 1S3S.: yoi.: SS^ » Wttg&km NC· aí sí. Sms& peides ss.:j«te=tics «f the prcten feoraao* esy&sasteSia·. Bamce- 1 9§§, te 27? í:-S?4),íSS-S4 .«· Cwtts S. E. st a!, Pepttóe sf Use- ίϋ»^·· poe&ro mcsptoí ss potsní ss te cyte.te. Sd- mc», tã§? Qíimsfw SA- st aí. mmwy ot Esterc^i«$;nte r®B Sekmees fmSUSA, *, 1215S-SÍ Físte> JW. my8w®&eÊet· Pí?ys|ste®í -«& Pim~·· 1-14 Bate, A.: Rfcte&, Í.H.B.etess, LE.; Rjran, CJ», iJètàKy k :: C«ten8Í»ssnv J 5 ©13-'-YsnmwshvM L A síabísitel-Ses-ra cates s>tea5: fer steíes of physsicgse processes Oyfeáifere«f te acu® pfcsse response <*t ratssd tetestetessytes BfatesehoBÍ.Piio{f.. -1882; te δ. 21S-22S Kairim, ft:C.; Hw^ster, J,-S,: Ba»·. vertei), Ai-: Bate, A-Disiepam irseíaboterc and sí-fcuroin seçratkssv o? pterae te^teytss ln :tes-gesvsantech âtesryGpfiBseívatKws, BístetecsIL&t-#srs, 2000, te. 22, 1847-1852