RU2638796C1 - Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом - Google Patents
Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2638796C1 RU2638796C1 RU2016132537A RU2016132537A RU2638796C1 RU 2638796 C1 RU2638796 C1 RU 2638796C1 RU 2016132537 A RU2016132537 A RU 2016132537A RU 2016132537 A RU2016132537 A RU 2016132537A RU 2638796 C1 RU2638796 C1 RU 2638796C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- blood plasma
- preparation
- joint
- component
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000006378 damage Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 29
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 11
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 28
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 abstract 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 21
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 16
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 16
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 16
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 5
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 5
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 4
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 4
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 206010060820 Joint injury Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- -1 for this Substances 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 208000007656 osteochondritis dissecans Diseases 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000008822 Ankylosis Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 206010023198 Joint ankylosis Diseases 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003076 Osteolysis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003011 chondroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 208000029791 lytic metastatic bone lesion Diseases 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003349 osteoarthritic effect Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940033618 tisseel Drugs 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
- A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
- A61L24/10—Polypeptides; Proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов. Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов, осуществляемого путем малоинвазивного введения в суставную сумку, упомянутого препарата в виде двух компонентов - основного и инициирующего, заключающийся в том, что для получения основного компонента препарата плазму крови переносят с помощью шприца и переходного фильтра с размером пор, достаточным для обеспечения стерильности, в одно из отделений криопакета и выдерживают до полного замораживания, затем замороженную плазму крови частично размораживают, перемещают первую оттаявшую фракцию плазмы крови в пустое отделение криопакета и удаляют её из криопакета шприцом, подсоединенным к порту пакета, а оставшийся в криопакете криопреципитат плазмы крови размораживают, затем в упомянутом криопреципитате плазмы крови ресуспендируют клетки, предшественники хондроцитов, в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического эффекта, а для изготовления инициирующего компонента препарата смешивают раствором хлорида кальция и тромбина в сбалансированном солевом растворе с добавлением аминокапроновой кислоты в количестве не более максимальной рекомендованной дозы для однократного введения в суставную сумку, при определенных условиях. Двухкомпонентный препарат для лечения повреждения суставов. Вышеописанный способ позволяет обеспечить локализацию клеток в месте введения, позволяющую клеткам мигрировать из клея к месту повреждения и сохранять функциональную активность .2 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к способам получения клеточных препаратов для применения в травматологии, ортопедии и челюстно-лицевой-хирургии.
Локальные посттравматические повреждения хряща, а также дегенеративно-дистрофические повреждения хряща, такие как болезнь Кенига, остеоартроз 1-2 стадии являются распространенными заболеваниями. В некоторых странах от данной группы заболеваний страдает до 22% населения, что делает поиск подходов для восстановления дефектов хряща одним из наиболее актуальных направлений современной ортопедии и травматологии. Дегенеративные процессы в суставной хрящевой ткани приводят к возникновению болей и утрате функции различных суставов как у пожилых людей в силу возрастных изменений, так и у молодых, подвергающих суставы высоким и сверхвысоким нагрузкам во время тренировок и соревнований.
В настоящее время не существует адекватного способа регенерации суставной поверхности, который обеспечивал бы полное и долговременное восстановление структуры и функциональной активности поврежденного сустава. Описано два основных подхода к лечению повреждения суставного хряща: консервативное и оперативное. Консервативное лечение суставов проводится на основе препаратов хондропротекторного ряда или нестероидных противовоспалительных препаратов, и имеет очень ограниченный срок действия, а также целый ряд противопоказаний и осложнений при длительном приеме указанных препаратов. Оперативное лечение суставов очень инвазивно, сопровождается рядом осложнений, таких как инфекции, асептическое расшатывание компонентов эндопротеза, износ вкладыша, болевой синдром, стресс-шилдинг и остеолиз, а также зачастую требует повторного проведения операции, невозможной в силу возраста пациента и высокой инвазивности процедуры. Таким образом, в настоящее время существует потребность в усовершенствовании существующих или поиске принципиально новых способов лечения повреждений суставов.
Один из перспективных подходов к лечению повреждений суставов заключается в малоинвазивном введении аутологичных хондроцитов, прехондроцитов, либо аутологичных или аллогенных мезенхимных стромальных клеток, иммобилизованных в специальных поддерживающих системах.
Для иммобилизации клеток в области инъекции, а также для увеличения терапевтического эффекта клетки могут быть ресуспендированы в нетоксичных, биоразлагаемых жидкостях или гелях. К таким жидкостям относятся, например, жидкости и гели на основе фибриногена (фибриновый клей, его коммерческие аналоги - Tissucol®, Tisseel®, Baxter, США).
В статье Ahmed ТА, Giulivi A, Griffith М, Hincke М. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute // Tissue Eng Part A. - 2011 - Vol. 17 - №3-4 - p. 323-335 описан фибриновый клей с мезенхимными стволовыми клетками (МСК) и способ его получения. Способ заключается в том, что из донорской крови получают криопреципитат с помощью устройства CryoSeal® FS (Asahi Kasei Medical Co., Ltd) и тромбин с помощью устройства Thrombin Processing Device™ (Thermogenesis corporation), причем концентрация фибриногена в криопреципитате составила 20,1 мг/мл, а концентрация тромбина - 38 Ед/мл. Для стимуляции хондрогенной дифференцировки МСК культивируют в среде DMEM, содержащей 10-7 М дексаметазона, 50 мг/мл 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 100 мг/мл пирувата натрия, 40 мг/мл L-пролина, 1% инсулин-трансферрин-селеновой смеси (BD Bioscience Pharmingen), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 10 нг/мл ТФР-β2 (R&D Systems). 85 мл криопреципитата смешивают с 30 мл человеческих МСК или хондроцитов с концентрацией 2×107 клеток/мл, затем добавляют 85 мл тромбина. Полученный в результате осуществления описанного способа препарат позволяет иммобилизовать клетки, предшественники хондроцитов. Однако описанный способ требует дополнительного дорогостоящего оборудования, кроме того, полученный в результате осуществления описанного способа препарат имеет высокую концентрацию фибриногена, и клей (скаффолд, каркас) получается настолько плотным, что препятствует свободной миграции клеток.
В статье Kim YS, Choi YJ, Suh DS, Heo DB, Kim YI, Ryu JS, Koh YG. Mesenchymal stem cell implantation in osteoarthritic knees: is fibrin glue effective as a scaffold? // Am J Sports Med. - 2015 - №43(1) - c. 176-85 описан способ получения фибринового клея, содержащего МСК, заключающийся в том, что используют коммерчески доступный фибриновый клей Greenplast kit (Greencross), поставляющийся в двух шприцах, в шприц, содержащий лиофилизованный препарат фибриногена из человеческой плазмы с концентрацией 71,5-126,5 мг/мл добавляют раствор апротинина с концентрацией 1100 калликреин инактивирующих единиц в мл, а в другой шприц, содержащий тромбин с концентрацией 4,9-11 мг/мл, растворенный в растворе хлорида кальция с концентрацией 13,9-15,6 мг/мл, добавляют клеточную суспензию стромальной васкулярной фракции жировой ткани, содержащей МСК в соотношении 1:1 по объему. Для получения фибринового клея клеточно-тромбиновую суспензию смешивают с раствором фибриногена в соотношении 1:1 по объему с помощью системы «Duploject» в момент введения на поверхность повреждения хряща. Авторам удалось показать восстановление хрящевой ткани коленного сустава после артроскопического введения препарата фибринового клея с МСК. Однако используемый в описанном способе фибриновый клей содержит апротинин в качестве катализатора образования фибринового сгустка. В настоящее время показано, что апротинин высокотоксичен и может вызывать повреждения почек и сердечно-сосудистой системы. FDA рекомендует замену апротинина на препараты аминокапроновой кислоты. Также, стромальная васкулярная фракция жировой ткани, используемая в качестве клеточного компонента фибринового клея, содержит относительно небольшое количество МСК. В отсутствие индукции дифференцировки не все МСК, содержащиеся в используемой фракции, смогут дифференцироваться в хондроцитарном направлении. Концентрация фибриногена в клее, полученном описанным способом, достаточно высока для того, чтобы иммобилизовать клетки, но слишком высока, чтобы обеспечить им свободное перемещение к поврежденной поверхности сустава и дифференцировку в этом месте. Кроме этого, в описанном способе используется коммерческий источник фибриногена - препарат GreenPlast, то есть материал является аллогенным для пациента, что повышает риск осложнений, увеличивает стоимость процедуры, создает зависимость от уникальных производителей. Описанный способ является наиболее близким к заявляемому изобретению и выбран в качестве прототипа.
Задачей настоящего изобретения является создание способа получения препарата, предназначенного для лечения повреждения суставов, осуществляемого путем малоинвазивного введения в суставную сумку и обеспечивающего локализацию клеток в месте введения, позволяющую клеткам мигрировать из места введения к месту повреждения и сохранять функциональную активность. Такой способ должен удовлетворять требованиям стерильности и чистоты, достаточным для клинического применения препарата.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения препарата для лечения повреждения суставов готовят два раздельных компонента - основной и инициирующий, при этом для получения основного компонента препарата свежую плазму крови переносят с помощью шприца и переходного фильтра с размером пор, достаточным для обеспечения стерильности, в одно из отделений криопакета и выдерживают при температуре минус 80°С до полного замораживания, затем замороженную плазму крови частично размораживают при 4°С, перемещают первую оттаявшую фракцию плазмы крови в пустое отделение криопакета и удаляют ее из криопакета шприцом, подсоединенным к порту пакета. Оставшийся в криопакете криопреципитат плазмы крови размораживают. Клетки, предшественники хондроцитов, получают из жировой или костной ткани пациента, или из пупочного канатика стандартным методом, описанным в статье: Айзенштадт А.А., Енукашвили Н.И., Золина Т.Л., Александрова Л.В., Смолянинов А.Б. Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика // Вестник Северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова - 2015. - Т. 7. - №2. - С. 14-22. В одном из вариантов осуществления способа, клетки выдерживают в присутствии факторов, стимулирующих дифференцировку в хондрогенном направлении, например, в смеси 2×10-8 М дексаметазона, 0,5 мкМ аскорбиновой кислоты, 0,5% пролина, 0,5% пирувата и 5 нМ ТФР-β3. Перед применением клетки ресуспендируют в криопреципитате плазмы крови. Для изготовления инициирующего компонента препарата готовят 0,1-1,0% хлорида кальция, 32,5-500 Ед/мл тромбина в сбалансированном солевом растворе, например физиологическом растворе, с добавлением аминокапроновой кислоты в количестве не более максимальной рекомендованной дозы для однократного введения в суставную сумку. Перед введением основной и инициирующий компоненты препарата помещают в разные отделы системы одновременного введения препаратов, например, шприца «Duploject».
Препарат, полученный при осуществлении заявляемого способа, представлен в виде двух компонентов - основного и инициирующего, при этом основной компонент препарата представляет собой криопреципитат, полученный из плазмы крови, с концентрацией фибриногена 2-18 мг/мл, в который добавлены клетки, предшественники хондроцитов, а инициирующий компонент препарата содержит 32,5-500 Ед/мл тромбина, 0,1-1,0% хлорида кальция и аминокапроновую кислоту в количестве не более максимальной рекомендованной дозы для однократного введения в суставную сумку, в сбалансированном солевом растворе, например в физиологическом растворе. Оба компонента препарата предназначены для введения в суставную сумку одновременно и независимо, например, с помощью шприца «Duploject» с двумя раздельными выходами или комбинации «Duploject» с длинной двухпросветной иглой, при этом смешивание компонентов препарата и формирование клея происходит непосредственно в момент введения в суставную сумку.
В отличие от прототипа, заявляемый способ отличается применением обычного оборудования типа морозильной камеры и холодильника для приготовления криопреципитата плазмы крови, а использование криопакета, вакуумной пробирки и переходного фильтра с диаметром пор, достаточным для обеспечения стерильности, например 0,22 мкн, позволяет провести весь цикл приготовления криопреципитата плазмы крови в закрытой системе, обеспечивая стерильность, необходимую для препарата, предназначенного для введения пациенту. Заявляемый способ получения криопреципитата плазмы крови позволяет приготовить препарат с содержанием фибриногена, достаточным для локализации клеток в месте введения, и позволяющим клеткам мигрировать к поверхности поврежденного сустава. Полученный в результате осуществления заявляемого способа препарат содержит меньшую концентрацию фибриногена, 2-18 мг/мл вместо 71,5-126,5 мг/мл. Это позволяет создать необходимую плотность фибринового клея, достаточную для локализации клеток в месте введения, и при этом позволяющую клеткам мигрировать к поверхности поврежденного сустава. Количество клеток, вводимых в основной компонент препарата, не ограничивается заявляемым способом, и зависит от способа лечения и материала, используемого для получения клеток. При лечении различных повреждений суставов требуется различное количество клеток, предшественников хондроцитов, поэтому в препарат вводится такое количество этих клеток, которое может произвести терапевтический эффект. Использование МСК, индуцированных в хондрогенном направлении путем выдерживания в растворе индукторов дифференцировки, например, в смеси 2×10-8 М дексаметазона, 0,5 мкМ аскорбиновой кислоты, 0,5% пролина, 0,5% пирувата и 5 нМ ТФР-β3, позволяет увеличить количество активных клеток и их функциональную активность в отношении дифференцировки в хондроциты и дальнейшей репарации повреждения хряща, а также ускоряет процессы регенерации. Кроме того, в отличие от прототипа, клетки входят в состав основного компонента препарата, содержащего фибриноген, поскольку хлорид кальция в инициирующем компоненте препарата значительно снижает функциональную активность клеток. Хлорид кальция в инициирующем компоненте препарата обеспечивает полимеризацию фибриногена в концентрации не ниже 0,1%, однако в концентрации выше 1,0% вызывает выраженный апоптоз хондроцитов [Amin А.K., Huntley J.S., Bush P.G., Simpson A.H.R.W., Hall A.C. Chondrocyte death in mechanically injured articular cartilage - the influence of extracellular calcium. Journal of Orthopaedic Research. 2009. - Vol. 27. - P. 778-784]. Заявляемый способ не ограничивает количество аминокапроновой кислоты, вводимой в инициирующий компонент препарата. Аминокапроновая кислота угнетает фибринолиз и, таким образом, улучшает характеристики фибринового клея. Количество вводимой аминокапроновой кислоты может быть ограничено только медицинскими показаниями, которые позволят определить максимальную дозу для введения в суставную сумку без выраженных побочных эффектов на организм пациента.
В одном из вариантов осуществления способа, для получения основного компонента препарата используют аутологичную плазму крови, для этого у пациента забирают кровь в вакуумную пробирку с антикоагулянтом, например гепарином, ЭДТА или любым другим, разделяют плазму крови и форменные элементы крови путем центрифугирования. Применение аутологичной плазмы крови позволяет избежать рисков, связанных с применением аллогенных материалов, и получить полностью неиммуногенный препарат.
В другом варианте осуществления способа, для получения основного компонента препарата используют плазму пуповинной крови, для этого пуповинную кровь забирают в вакуумную пробирку с антикоагулянтом, например гепарином, ЭДТА или любым другим, разделяют плазму крови и форменные элементы крови путем центрифугирования. Применение плазмы пуповинной крови позволяет снизить риск инфицирования донора, т.к. используется длительно хранимый, заранее протестированный материал. Кроме этого плазма пуповинной крови значительно более богата биологически активными веществами, улучшающими выживаемость клеток и графтообразование по сравнению с кровью взрослого донора.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
На Фиг. 1 представлено содержание фибриногена в лишенной тромбоцитов плазме (РРР), криопреципитате и остаточной плазме (А) и зависимость его концентрации в криопреципитате от количества циклов замораживания-оттаивания (В). Данные представлены в виде среднего, ошибки среднего, также приведены значения всех элементов выборки. * - достоверные отличия, p<0,05.
На Фиг. 2 представлено время полимеризации фибринового клея в зависимости от концентрации тромбина.
На Фиг. 3 представлены микрофотографии МСК в фибриновом клее на 4-й день культивирования при концентрации фибриногена в криопреципитате плазмы крови 18 г/л (А) и на 2-й (Б) и 4-й (В) день культивирования при концентрации фибриногена в криопреципитате плазмы крови 2,4 г/л, и контрольной культуры МСК на 4-й день культивирования (Г). Масштаб - 100 мкм.
На Фиг. 4 представлены результаты определения иммунофенотипа МСК, мигрировавших из фибринового клея, до начала дифференцировки (МСК) и на 7-е сутки (Прехондроциты). (А) Таблица с результатами определения процентного содержания клеток, позитивных по наличию поверхностных маркеров МСК. (Б) Гистограмма интенсивности окрашивания клеток антителами к поверхностному маркеру CD44. Показано увеличение экспрессии CD44, характерное для начала дифференцировки в хондроцитарном направлении.
На Фиг. 5. представлены микрофотографии МСК, окрашенных антителами к коллагену II типа (I) до дифференцировки (А) и на 7-е сутки после начала дифференцировки в хондроцитарном направлении (Б). Ядра окрашены DAPI (II). Совмещенное изображение представлено на Фиг. 5 (III).
Способ осуществляли следующим образом.
Пример осуществления изобретения.
Приготовление тромбинового раствора.
Смешивали 40 мкл 5% аминокапроновой кислоты, 20 мкл 10% хлорида кальция, и 940 мкл фосфатно-солевого буфера или физиологического раствора (0,9% хлорид натрия). Тромбин (Baxter или Технология-Стандарт, Новосибирск) растворяли до концентрации 500 U/мл или 32.5 U/мл в полученной смеси. Время полимеризации фибринового клея при введении препарата зависит от концентрации тромбина (Фиг. 2).
Приготовление криопреципитата плазмы крови.
Венозную кровь собирали в стандартную вакуумную пробирку для сбора крови объемом 9 мл, содержащую антикоагулянт, например литий-гепарин, затем транспортировали упомянутую пробирку в лабораторию. Центрифугировали кровь, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия), 15 мин при 2200 g. Не открывая пробирку, отбирали надосадочную жидкость, или плазму, с помощью гиподермической иглы, подсоединенной к шприцу. Удаляли гиподермическую иглу, к шприцу с плазмой подсоединяли фильтр с диаметром пор 0,22 мкм соответствующей стороной, luer female. Ко второму выходу фильтра, luer male, подсоединяли иглу с калибром не больше 21-23G. Вводили эту иглу порт криопакета, например, Macopharma, после чего выдавливали плазму из шприца в одно из отделений криопакета. Замораживали собранную плазму при -80°С, например в морозильной камере Sanyo MDF-U74V Ultra-low Temperature Laboratory Freezer. Помещали криопакет с замороженной плазмой в контейнер с температурой +2-4°С, например в холодильнике фармацевтическом ХФ-250-3 "POZIS". Как только содержимое пакета достигало консистенции «снежной кашицы» с небольшим количеством жидкости, сдавливали охлажденным пинцетом «кашицу», выдавливая жидкую фракцию в пустое отделение криопакета, затем быстро удаляли ее через порт криопакета. После этого размораживали оставшееся в криопакете содержимое. Уровень фибриногена определяли с использованием коагулометрического метода по Клаусу.
Получение и культивирование МСК
МСК выделяли из жировой ткани или пупочного канатика, как было описано в: Айзенштадт А.А., Енукашвили Н.И., Золина Т.Л., Александрова Л.В., Смолянинов А.Б. Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика // Вестник Северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова - 2015. - Т. 7. - №2. - С. 14-22. Образцы подкожной жировой ткани измельчали, затем выдерживали при 37°С в 0,2% растворе коллагеназы в фосфатно-солевом буфере, после чего центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия), 10 мин при 400 g. Удаляли супернатант, осадок помещали в культуральный флакон площадью 75 см2, в который предварительно было добавлено 10-15 мл полной культуральной среды, например среды МЕМ-α / Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для МСК или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия). Помещали флаконы в СО2-инкубатор, например BBD 6220 (Thermo, Германия).
Сосуды пупочного канатика промывали сбалансированным солевым раствором, например раствором Версена, с помощью шприца, заполняли 0,2% раствором коллагеназы в том же буфере, промывали и повторно заполняли раствором коллагеназы в PBS. Затем клеммировали пупочный канатик с двух сторон, помещали в чашку Петри и выдерживали в шейкере-инкубаторе, например, ES-20 (Biosan, Латвия), в течение 1 ч при температуре 37°С и слабом помешивании. После этого упомянутый раствор коллагеназы собирали и тщательно промывали пупочную вену физиологическим солевым раствором, например раствором PBS. Раствор коллагеназы и солевой раствор после промывок собирали и центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия), 10 минут при 400 g. Удаляли супернатант, осадок помещали в культуральный флакон площадью 75 см2, в который предварительно было добавлено 10-15 мл полной культуральной среды, например, среды МЕМ-α или Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для МСК или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия). Помещали флаконы в CO2-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия).
При достижении клетками 50% конфлюэнтности добавляли в флакон с культурой клеток факторы, стимулирующие дифференцировку в хондрогенном направлении, например, смесь 2×10-8 М дексаметазона, 0,5 мкМ аскорбиновой кислоты, 0,5% пролина, 0,5% пирувата и 5 нМ ТФР-β3. Минимальное время инкубации составляло 1 час, максимальное - 5-7 дней.
Приготовление фибринового клея с локализованными в нем клетками.
Стерильно отбирали 1 мл криопреципитата плазмы крови, например, с помощью шприца, присоединенного к порту криопакета. Из флаконов с культурой клеток, предшественников хондроцитов, предназначенных для трансплантации, удаляли культуральную жидкость, затем добавляли в упомянутые флаконы 0,25% раствор трипсина, предварительно нагретого до 37°С и сразу же жидкость с клетками из флакона собирали в пробирку, центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия), 7 минут при 300-500 g. Супернантант удаляли, добавляли в пробирку 2,5% стерильный раствор альбумина в физиологическом растворе и ресуспендировали осадок. Затем жидкость из флакона собирали в пробирку, центрифугировали, например, на центрифуге СМ-6М (Elmi, Латвия), 7 минут при 300-500 g. Супернантант удаляли, добавляли в пробирку 1 мл криопреципитата плазмы крови и ресуспендировали осадок.
Отбирали 1 мл криопреципитата плазмы крови с клетками в шприц. В другой шприц отбирали 1 мл инициирующего раствора.
Смешивали 0,5 мл криопреципитата плазмы крови с клетками и 0,5 мл инициирующего раствора с помощью аппликационного набора Duploject (Baxter), системы из двух шприцов с общей иглой, или с помощью двух стандартных медицинских шприцов объемом 2 мл, непосредственно внося компоненты в лунки 6-луночного планшета.
После завершения полимеризации фибринового клея с клетками, предшественниками хондроцитов, в лунки планшета добавляли 2 мл полной культуральной среды, закрывали планшеты и выдерживали при 37°С в течение 7 дней. Смену среды осуществляли каждые 2 дня. Исследовали клетки как растущие в геле, так и покинувшие его. Методами световой микроскопии оценивали внешний вид клеток, число клеток, растущих вне геля, число одиночных клеток и колоний в геле. Через 7 дней фибриновый сгусток удаляли, а покинувшие его клетки (примерно 20% от общего числа клеток в лунке) использовали для изучения способности клеток из фибринового клея дифференцироваться в хондроцитарном направлении.
Клетки, покинувшие гель, культивировали до достижения ими 60-70% конфлюэнтности и далее переносили в хондрогенную культуральную среду, содержащую 10% хондрогенного заменителя сыворотки (hMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrocyte Differentiation Medium, Lonza) и культивировали согласно протоколу производителя. Методами световой микроскопии морфологию клеток оценивали на 2 и 4 день от переноса в хондрогенную среду (Фиг. 3). При низкой концентрации фибриногена (Б) часть клеток покидает фибриновый сгусток в течение 48 часов после начала культивирования. Далее такие клетки распластываются на субстрате и пролиферируют. На 4 сутки культура клеток, покинувших фибриновый клей (В), морфологически неотличима от контрольной (МСК, выделенные и культивируемые по стандартному протоколу) (Г). Методами проточной цитометрии оценивали иммунофенотип клеток до и после начала дифференцировки (Фиг. 4). В процессе дифференцировки наблюдается увеличение экспрессии маркера CD44 - рецептора к гиалуроновой кислоте, что характерно для хондроцитов.
Успешность дифференцировки также оценивали по появлению клеток, окрашиваемых антителами к коллагену II (Фиг. 5). Начало экспрессии в клетках коллагена II типа является ранним признаком дифференцировки в хондрогенном направлении.
Полученный препарат может быть введен в суставную сумку методом артроскопии или артротомии для лечения врожденных или приобретенных дегенеративных повреждений хряща. Перечень заболеваний, к которым может быть применен данный метод, включает в себя (но не ограничивается ими) следующие заболевания: острый или хронический остеоартрит, формирование хрящевой ткани при эндопротезировании, артроз, болезнь Кенига, анкилоз.
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.
Claims (8)
1. Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов, осуществляемого путем малоинвазивного введения в суставную сумку, упомянутого препарата в виде двух компонентов - основного и инициирующего, заключающийся в том, что для получения основного компонента препарата плазму крови переносят с помощью шприца и переходного фильтра с размером пор, достаточным для обеспечения стерильности, в одно из отделений криопакета и выдерживают при температуре минус 80°С до полного замораживания, затем замороженную плазму крови частично размораживают при 4°С, перемещают первую оттаявшую фракцию плазмы крови в пустое отделение криопакета и удаляют ее из криопакета шприцом, подсоединенным к порту пакета, а оставшийся в криопакете криопреципитат плазмы крови размораживают, затем в упомянутом криопреципитате плазмы крови ресуспендируют клетки, предшественники хондроцитов, в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического эффекта, а для изготовления инициирующего компонента препарата смешивают раствор 0,1-1,0% хлорида кальция, 32,5-500 Ед/мл тромбина в сбалансированном солевом растворе с добавлением аминокапроновой кислоты в количестве не более максимальной рекомендованной дозы для однократного введения в суставную сумку.
2. Способ по п. 1, при котором в качестве плазмы крови используют аутологичную плазму крови пациента.
3. Способ по п. 1, при котором в качестве плазмы крови используют плазму пуповинной крови.
4. Способ по п. 1, при котором в качестве клеток, предшественников хондроцитов, используют мезенхимные стволовые клетки, полученные из жировой или костной ткани пациента.
5. Способ по п. 4, при котором клетки, предшественники хондроцитов, перед использованием выдерживают в присутствии факторов, стимулирующих дифференцировку в хондрогенном направлении.
6. Способ по п. 1, при котором в качестве клеток, предшественников хондроцитов, используют мезенхимные стволовые клетки, полученные из пупочного канатика.
7. Способ по п. 6, при котором клетки, предшественники хондроцитов, перед использованием выдерживают в присутствии факторов, стимулирующих дифференцировку в хондрогенном направлении.
8. Двухкомпонентный препарат для лечения повреждения суставов, осуществляемого путем малоинвазивного введения в суставную сумку, полученный способом по любому из пп. 1-7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132537A RU2638796C1 (ru) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016132537A RU2638796C1 (ru) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2638796C1 true RU2638796C1 (ru) | 2017-12-15 |
Family
ID=60718638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016132537A RU2638796C1 (ru) | 2016-08-05 | 2016-08-05 | Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2638796C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2704256C1 (ru) * | 2019-02-18 | 2019-10-25 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Способ приготовления аутологичного двухкомпонентного фибринового клея |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013139955A1 (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Trb Chemedica International S.A. | Method for repair of ligament or tendon |
| RU2542391C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2015-02-20 | Аугустинус БАДЕР | Способ регенерации ткани |
-
2016
- 2016-08-05 RU RU2016132537A patent/RU2638796C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2542391C2 (ru) * | 2003-12-30 | 2015-02-20 | Аугустинус БАДЕР | Способ регенерации ткани |
| WO2013139955A1 (en) * | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Trb Chemedica International S.A. | Method for repair of ligament or tendon |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| KIM YS, CHOI YJ, KOH YG. Mesenchymal stem cell implantation in knee osteoarthritis: an assessment of the factors influencing clinical outcomes.// Am J Sports Med. 25 Jun 2015 Sep;43(9):2293-301. * |
| MOHSEN SHEYKHHASAN et al. Fibrin Scaffolds Designing in order to Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells Differentiation to Chondrocytes in the Presence of TGF-β3// International Journal of Stem Cells Vol. 8, N 2, 2015. * |
| TAMER A.E. AHMED et al. Fibrin Glues in Combination with Mesenchymal Stem Cells to Develop a Tissue-Engineered Cartilage Substitute// Tissue Engineering Part A. October 2010, 17(3-4): 323-335. * |
| АЙЗЕНШТАДТ А.А. Внутриклеточные иммуноглобулины в линиях namalva и u266 при сокультивировании с мезенхимными стромальными клетками.// Цитология. 2014, 56(2), стр. 117-122. * |
| ЕНУКАШВИЛИ Н.И. и др. Разработка скаффолдов на основе фибринового клея для применения аутологичных МСК в травматологии/при дегенеративных повреждениях суставов.// Сборник научных трудов. Клеточные технологии - практическому здравоохранению, 2015. / Под общей редакцией проф. Леонтьева С.Л. - ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург: Изд-во Вестник уральской медицинской академической науки. - 2015. - С. 119-121. * |
| ЕНУКАШВИЛИ Н.И. и др. Разработка скаффолдов на основе фибринового клея для применения аутологичных МСК в травматологии/при дегенеративных повреждениях суставов.// Сборник научных трудов. Клеточные технологии - практическому здравоохранению, 2015. / Под общей редакцией проф. Леонтьева С.Л. - ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург: Изд-во Вестник уральской медицинской академической науки. - 2015. - С. 119-121. KIM YS, CHOI YJ, KOH YG. Mesenchymal stem cell implantation in knee osteoarthritis: an assessment of the factors influencing clinical outcomes.// Am J Sports Med. 25 Jun 2015 Sep;43(9):2293-301. АЙЗЕНШТАДТ А.А. Внутриклеточные иммуноглобулины в линиях namalva и u266 при сокультивировании с мезенхимными стромальными клетками.// Цитология. 2014, 56(2), стр. 117-122. СМОЛЯНИНОВ А.Б. и др. Направленная дифференцировка МСК в хондроциты. Подготовка биоимпланта для трансплантации. //Мультидисциплинарные аспекты молекулярной медицины: сборник материалов 3-го Россий * |
| СМОЛЯНИНОВ А.Б. и др. Направленная дифференцировка МСК в хондроциты. Подготовка биоимпланта для трансплантации. //Мультидисциплинарные аспекты молекулярной медицины: сборник материалов 3-го Российского конгресса с международным участием "Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное". 26-29 марта 2015 года. / Под науч. ред. И.А. Максимцева, В.И. Ларионовой. - СПб.: Изд-во СПбГЭУ, 2015. - 205 с. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2704256C1 (ru) * | 2019-02-18 | 2019-10-25 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Способ приготовления аутологичного двухкомпонентного фибринового клея |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6892485B2 (ja) | トロンビン血清の調製、その利用およびその調製機器 | |
| Schmitt et al. | Application of stem cells in orthopedics | |
| ES2710921T3 (es) | Composiciones para tratar y prevenir lesión y enfermedad tisular | |
| JP2018164757A5 (ru) | ||
| ES2546734T3 (es) | Preparación rápida y uso de tejidos y estructuras obtenidas por ingeniería tisular como implantes individuales | |
| Valbonesi | Fibrin glues of human origin | |
| CN113507921A (zh) | 包含间充质干细胞-水凝胶的注射型组合物及其制备、冷冻及解冻方法 | |
| US10456500B2 (en) | Implantable preparations for regeneration of tissues and treatment of wounds, their method of preparation, and method of treatment of patients with said implantable preparations | |
| CN110974847A (zh) | 干细胞治疗下肢缺血性疾病的方法 | |
| KR20210091760A (ko) | 혈소판 방출물의 제조방법 | |
| US20110177170A1 (en) | implantable neuroendoprosthetic system, a method of production thereof and a method of reconstructive neurosurgical operation | |
| CN115666647A (zh) | 用恢复期血浆/血清进行病毒感染治疗 | |
| Bohlouli et al. | Tissue buccal fat pad–stromal vascular fraction as a safe source in maxillofacial bone regeneration: A clinical pilot study | |
| RU2638796C1 (ru) | Способ получения двухкомпонентного препарата для лечения повреждения суставов путем малоинвазивного введения в суставную сумку и препарат, полученный этим способом | |
| WO2025077377A1 (zh) | iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用 | |
| TW202440906A (zh) | 低侵入性導入關節囊以治療關節損傷之雙組份製劑以及其之製備方法 | |
| RU2800991C9 (ru) | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта | |
| RU2800991C2 (ru) | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта | |
| KR20090061745A (ko) | 엘라스틴을 안정화제로서 함유하는 반유동성 이식용 조성물 | |
| Matta et al. | Bioengineering and Regenerative Medicine in Surgery | |
| US20200289579A1 (en) | Chondrocyte proliferation | |
| HK40063015A (en) | Injection formulation composition containing mesenchymal stem cell-hydrogel and method for preparing, freezing and defrosting same | |
| CN111548988A (zh) | 一种医用漂洗液及其制备方法和应用 | |
| CN111012801A (zh) | 治疗下肢缺血性疾病的干细胞治疗剂及其用途 | |
| HK40063015B (zh) | 包含间充质干细胞-水凝胶的注射型组合物及其制备、冷冻及解冻方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190320 Effective date: 20190320 |