PT1689437E - Formulação de eritropoietina em solução - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO DE ERITROPOIETINA EM SOLUÇÃO" A eritropoietina (daqui em diante designada como EPO) é uma hormona do tipo glicoproteina que promove a diferenciação e a proliferação de células progenitoras dos eritrócitos. Os eritrócitos estão presentes no sangue durante um certo período de tempo. Após um tempo médio de vida de cerca de 120 dias, nos humanos, as células vermelhas do sangue são destruídas e retiradas do corpo. Por outro lado, as células vermelhas do sangue são constantemente fornecidas, a partir da medula óssea, de modo a que o número total de eritrócitos seja mantido num nivel normal. Em particular, os doentes que sofrem de doenças renais não possuem eritrócitos suficientes no sangue. A eritropoietina desempenha um papel primordial na formação de eritrócitos e é, portanto, frequentemente utilizada no tratamento de doentes que estejam anémicos. Em particular, doentes sujeitos a hemodiálise recebem permanentemente EPO. A concepção de um fármaco para abastecimento do mercado com preparações estáveis de EPO requer que as alterações químicas, como hidrólise, reacções de permuta de di-sulfureto ou alterações físicas como desnaturação, agregação ou adsorção que frequentemente ocorrem nas formulações de EPO sejam suprimidas o mais possível. Uma vez que a EPO é um polipéptido glicosilado tem sido frequentemente liofilizado para estabilização. No entanto, a liofilização aumenta os custos de produção e o fármaco liofilizado tem de ser dissolvido de modo a preparar uma 1 solução aquosa imediatamente antes da administração ao doente. Este é um trabalho adicional para os médicos e pode causar problemas quando os sólidos não são fácil e convenientemente dissolvidos na solução aquosa.

Foram feitas várias propostas para evitar os problemas de estabilidade. Produtos que estavam no mercado continham albumina do soro humano ou gelatina purificada, que são geralmente utilizadas como estabilizantes. Mas, uma vez que é praticamente impossível excluir todo e qualquer risco de uma possível contaminação relacionada com viroses ou TSE (encefalopatia espongiformes transmissíveis) , estes estabilizantes foram substituídos. 0 documento EP-A909564 de Chugai propõe uma preparação de uma solução de eritropoietina contendo um aminoácido como um agente de estabilização. 0 documento WO 00/61169 divulga composições farmacêuticas de eritropoietina que estão livres de produtos do soro sanguíneo e que são estabilizadas com um aminoácido e um derivado de mono-9-octadecenoato poli(oxi-1,2-etano-di-il) de sorbitano.

No entanto, foi verificado que as formulações conhecidas ainda têm tendência para formar agregados. Embora não seja desejável estar limitado por uma teoria, a formação de agregados pode ser explicada com a estrutura da EPO. A sequência bem conhecida da EPO contém quatro resíduos de cisteína. Existem duas pontes de dissulfureto entre cys7-cys161 e cys29-cys33. Assume-se que, devido a processos de oxidação-redução, em particular após um armazenamento prolongado em solução aquosa, podem existir rearranjos entre as pontes de dissulfureto que originam agregados que não podem ser dissolvidos. Isto pode 2 resultar em reacções imunológicas secundárias indesejadas. Recentemente foram relatados esses efeitos secundários em alguns doentes com anemia renal crónica tratados com eritropoietina (Eprex®, alfa epoetina) . Durante o tratamento estes doentes desenvolveram PRCA (aplasia Eritróide pura), um grave efeito secundário imunológico que conduz a anemia dependente de transfusão (Casadevall 2002 "Antibodies against rHuEPO: native and recombinant." Nephrol Dial Transplant 17 Suppl 5: 42-7; Casadevall, Nataf et al. 2002 "Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin." N Engl J Med 346(7): 469-75). É muito provável que este efeito secundário seja causado pela formulação farmacêutica de Eprex® (Schellekens 2003 "Relationship between biopharmaceutical immunogenicity of epoetin alfa and pure red cell aplasia." Curr Med Res Opin 19(5): 433-4). É, portanto, um objectivo da presente invenção proporcionar uma formulação de solução de eritropoietina que seja estável e em que a formação de agregados, mesmo a temperaturas superiores, seja substancialmente reduzida ou mesmo completamente evitada. A presente invenção proporciona, portanto, formulações farmacêuticas de eritropoietina estáveis como caracterizadas nas reivindicações. A solução estável de eritropoietina compreende uma quantidade farmacêutica de eritropoietina. A quantidade de eritropoietina varia desde cerca de 1000 IU/mL até 40000 iU/mL. Dependendo das necessidades dos médicos, as concentrações preferidas são 2000 IU/mL, 5000 IU/mL e 10000 IU/mL tanto para injecções intravenosas (iv) como subcutâneas (sc). O termo 3 "eritropoietina" como utilizado na presente invenção inclui aquelas proteínas que possuem a actividade biolóqica da eritropoietina humana assim como análogos de eritropoietina, isoformas de eritropoietina, miméticos da eritropoietina, fragmentos de eritropoietina, proteínas de eritropoietina híbrida ou proteínas de fusão. 0 padrão de glicosilação da eritropoietina possui um forte efeito e pode, portanto, influenciar o número de unidades que uma certa quantidade de eritropoietina possui. 0 agente tamponamento a ser utilizado na presente solução é um tampão de fosfato de sódio. 0 tampão é utilizado de modo a manter o valor de pH entre cerca de 5,9 a cerca de 6,8, de um modo preferido, entre 6,2 e 6,6 e, de um modo muito preferido entre 6,4 e 6,5. 0 valor de pH pode ser ajustado com uma base correspondente. No sistema tampão de fosfato da presente invenção quer o NaOH como o ácido fosfórico são utilizados para esse fim. Também é possível adicionar KOH em vez de NaOH. A quantidade de agente tamponamento que está presente na formulação farmacêutica varia entre cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, de um modo preferido, entre cerca de 10 mM a cerca de 30 mM.

Surpreendentemente, foi descoberto que a solução de eritropoietina pode ser estabilizada pela adição quer de NaCl quer de tris-(hidroximetil)-aminometano (tris) ou, de um modo preferido, ambos. O termo "tris" cobre todas as formas deste composto, tal como tris-base ou tris HC1. As soluções que são injectadas no corpo de um doente possuem, de um modo preferido, uma osmolaridade adequada. Isto pode ser conseguido pela adição de cloreto de sódio. No decurso da presente invenção foi verificado que a adição de NaCl ao tampão fosfato reduz substancialmente a formação de agregados. O NaCl é adicionado 4 numa quantidade que varia entre cerca de 20 a cerca de 150 mM, sendo preferido entre 30 a 120 mM e muito preferido, entre 50 e 100 mM. 0 efeito estabilizante também pode ser obtido adicionando tris-(hidroximetil)-aminometano numa quantidade na gama entre cerca de 10 a cerca de 150 mM, em que é preferido uma gama, entre cerca de 40 a cerca de 100 mM. Tris-(hidroximetil)-aminometano é reconhecido na técnica anterior como um sistema tampão para formulações farmacêuticas de proteínas (e. g. documento WO 03/072060) . Normalmente, é utilizado na gama de pH entre 7 e 9. A valores de pH entre pH 5,9 e pH 6,8, o tris-(hidroximetil)-aminometano não apresenta ou apresenta propriedades de tamponamento muito diminutas. O efeito estabilizante surpreendente do tris-(hidroximetil)-aminometano não está, portanto, relacionado com as suas propriedades de tamponamento. 0 efeito estabilizante pode ser alcançado pela adição quer de cloreto de sódio quer de tris-(hidroximetil)-aminometano. No entanto, o efeito estabilizante é substancialmente aumentado pela adição de ambos os agentes estabilizantes, nomeadamente NaCl e tris juntos na solução.

Para além disso, a solução de eritropoietina compreende também, de um modo preferido, um tensioactivo não-iónico, de um modo preferido, polissorbato. Os polissorbatos são os produtos de policondensação dos ésteres de sorbitanoo e polietilenoglicol. Os resíduos de ácidos gordos dos ésteres de sorbitano a serem utilizados de acordo com a presente invenção são derivados exclusivamente de plantas, não de animais. Isto é importante de modo a aumentar a segurança da solução de 5 eritropoietina. Para além disso, é importante que o conteúdo em peróxido determinado de acordo com a Farmacopeia Europeia (Ph Eur), secção 2.5.5. seja inferior a 1,00 μΜοΙ/g, de um modo preferido, inferior a 0,5 μΜοΙ/g. Isto corresponde a um conteúdo em peróxido entre 0,01 - 1 μΜ, de um modo preferido, inferior a 0,5 μΜ como concentração da composição farmacêutica final. Os polissorbatos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, sobre a marca registada Tween®20 ou Tween®80, respectivamente.

Deve ser realçado que a formulação da solução de eritropoietina, de acordo com a presente invenção, não contém produtos derivados de sangue humano, em particular albumina do soro humano. Para além disso, a formulação não contém aminoácidos como estabilizantes. De um modo preferido, a solução também não contém ureia. A formulação da presente invenção também não contém aminoácidos que sejam adicionados a outras formulações como estabilizantes.

As soluções de eritropoietina são utilizadas para injecção. As formulações são, portanto, de um modo preferido, soluções injectáveis que são preparadas para injecção intravenosa ou subcutânea. Dependendo da utilização especifica, a formulação também pode conter os aditivos usuais neste tipo de soluções inj ectáveis. A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes: 6

Exemplo 1

Preparação de soluções de eritropoietina

As soluções-mãe do fármaco EPO foram diluídas até 100 yg/mL com várias soluções para obter as formulações apresentadas nas Tabelas 1 e 2, seguintes. A Tabela 1 representa uma formulação produzida de acordo a técnica anterior. Esta formulação contém glicina como estabilizante e o pH desta formulação da técnica anterior varia entre pH 6,6 a pH 7,2.

Tabela 1 Formulação EPO (yg/mL) PB (mM) NaCl (% p/v) Glicina (mM) Tween 80 (% P/v) pH Técnica anterior 100 20 0,438 67 0, 03 7,0 PB significa tampão fosfato.

Foram ainda preparadas formulações de acordo com a presente invenção. As formulações diferem no que diz respeito ao conteúdo de NaCl e Tris. As formulações são apresentadas na Tabela 2 seguinte. 7

Tabela 2 Formulação EPO (yg/mL) PB (mM) NaCl (mM) Tris (mM) Tween 20 (% p/v) PH A 100 20 128 0 0,03 6,5 B 100 20 113 20 0,03 6,5 C 100 20 67 70 0,03 6,5 D 100 20 0 140 0,03 6,5

Após a preparação, as soluções foram filtradas (PALL Gelman, Acrodisc, 0,2 ym, membrana Supor, apirogénica, estéril) e colocadas (volume 1 mL) em frascos de vidro de 2 mL, do tipo I. Não se observou absorção de EPO no filtro. Os frascos rolhados (utilizando rolhas de borracha butil siliconizada flurotec de 13 mm, Daiichi) e tapados foram armazenados sobre condições ICH (ICH = Conferência Internacional sobre a Harmonização dos Requisitos Técnicos dos Fármacos para Utilização Humana) a 40 ± 3 °C / humidade ambiente de 80%, até 8 semanas.

De modo a se obter formulações comparáveis, utilizaram-se Tween 20 e Tween 80, respectivamente, nas formulações. As preparações de Tween, tal como utilizadas, possuiam um conteúdo inicial baixo em peróxido.

Exemplo 2 - Determinação de agregados O grau de agregação foi medido por cromatografia de exclusão de alta pressão (HP-SEC). Ao utilizar a tecnologia de HP-SEC é possível determinar a quantidade exacta do monómero de EPO. Os dímeros e os multímeros são eluídos em picos diferentes. Para a medição utilizou-se uma TSK G3000 SWXL, 5 ym, 300 x 7,8 mm. A fase móvel foi um tampão compreendendo NaCl a 150 mM, NaH2P04 x 2H20 a 10 mN pH 7,2. A área sobre os picos foi calculada e a quantidade de monómero foi medida durante um período de tempo até 8 semanas. As amostras foram armazenadas a 40 °C. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 3. SD significa desvio médio.

Tabela 3

A PB, NaCl pH 6,5

Formação de semanas 40 °C SD Agregados 0 0 0,15 4 1, 05 0,42 6 2,38 0,42 8 2,27 0,53 B Formação de semanas 40 PB, 20 mM Tris, NaCl pH 6,5 °C 0,03% Tween 20 SD Agregados 0 0 LO T-1 1 0 4 0,53 0,47 6 LO co 1-1 0,41 8 co CT% 1-1 0,43 9 c PB, 70 mM Tris NaCl pH 6,5

Formação de semanas 40 °C 0,03% Tween 20 SD Agregados 0 0 0,15 4 0,31 0,43 6 0, 77 0,43 8 2,14 0, 61

D PB, 140 mM Tris, NaCl pH 6,5 semanas 40 °C 0,03% Tween 20 SD 0 0 0,33 4 0,49 0,6 6 1, 06 0,59 8 0,13 0, 68

Formação de Agregados Técnica anterior formulação de EPO (técnica anterior) PB, Glicina, pH 7,0

Formação de semanas 40 °C 0,03% Tween 80 Agregados 0 0 4 6,11 0, 96 6 10,29 0,26 10 A partir da Tabela 3 pode verificar-se que a substituição do aminoácido glicina por NaCl e/ou Tris provoca uma significante redução da formação de agregados. Os resultados da experiência 3 são apresentados nas Figuras 1-4. Todas as experiências foram realizadas em tampão fosfato (PB).

Na Figura 1 é apresentada a formação de agregados ao longo do tempo (até seis semanas) . A maior parte dos agregados foi encontrada numa formulação em que se utilizou glicina como factor estabilizante (técnica anterior). Este resultado foi comparado com as formulações de acordo com a presente invenção em que estava presente quer NaCl quer Tris 70 mM e NaCl. A Figura 2 apresenta, numa escala alargada, o efeito da adição de Tris 70 mM e Tween 0,03% em adição ao NaCl. A Figura 3 apresenta o efeito da quantidade de Tris em formulações que também contêm NaCl e Tween 20. Pode ser observado que podem ser obtidos bons resultados dentro de um intervalo entre Tris 20 mM e Tris 140 mM, em que os melhores resultados foram obtidos com cerca de Tris 70 mM. A Figura 4 apresenta uma comparação entre a formulação conhecida da técnica anterior e formulações de acordo com a invenção. A formação de agregados mais baixa foi observada com cerca de Tris 70 mM, NaCl e Tris 0,03% com um valor de pH de 6,5.

Lisboa, 05 de Março de 2007 11

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Formulação farmacêutica estável de eritropoietina contendo tris-(hidroximetil)-aminometano como estabilizante, na qual a formulação não contém aminoácidos ou albumina do soro humano.
2. 2. Formulação farmacêutica estável da reivindicação 1 compreendendo: a) tampão de fosfato de sódio como agente de tamponamento de pH, b) tris-(hidroximetil)-aminometano numa quantidade de 10 a 200 mM como estabilizante, c) uma quantidade farmacêutica de eritropoietina.
3. 3. Formulação da reivindicação 2 que compreende NaCl numa quantidade de 20-150 mM.
4. 4. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que a quantidade de NaCl varia entre 50 a 100 mM.
5. 5. Formulação da reivindicação 1 a 4 que é uma formulação aquosa.
6. 6. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o agente de tamponamento de pH possui a fórmula NaxHyP04, em que xélou2eyélou2ea soma de x e y é 3 e na qual o agente de tamponamento de pH está 1 presente na formulação farmacêutica numa quantidade entre 5 mM e 50 mM.
7. 7. Formulação de qualquer das reivindicações anteriores em que o pH varia entre 5,9 e 6,8, de um modo preferido, entre 6,2 e 6,6.
8. 8. Formulação de qualquer das reivindicações anteriores em que o tris-(hidroximetil)-aminometano está presente numa quantidade entre 20 e 100 mM.
9. 9. Formulação de qualquer das reivindicações anteriores que também contém um detergente não-iónico numa quantidade que varia entre 0,005 e 0,1% p/v.
10. 10. Formulação de reivindicação 9, em que o detergente não- iónico é um polissorbato, de um modo preferido, Tween 20 ou Tween 80.
11. 11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, em que o polissorbato não é produzido a partir de materiais derivados de animais e em que o conteúdo em peróxido é inferior a 1,00 ymol/g.
12. 12. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores que contém ainda ácido etilenoaminotetraacético numa quantidade entre 0,1 e 0,5 mM. Lisboa, 05 de Março de 2007 2