ES2216447T3 - Composiciones proteicas estabilizadas. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a composiciones estabilizadas de proteína, procedimientos para preparar dichas composiciones estabilizadas de proteína, formas de dosificación para administra dichas composiciones estabilizadas de proteínas a mamíferos y procedimientos para impedir o tratar infecciones en mamíferos por administración de dichas composiciones de proteínas a mamíferos. Más concretamente, las composiciones estabilizadas de proteína de la presente invención contienen cantidades terapéuticamente eficaces de G-CSF, combinada con un amortiguador de estabilización como HEPES, TES o TRICINA, para tratar e impedir las infecciones, incluyendo la mastitis en el ganado.

Description

Composiciones proteicas estabilizadas.

Campo de la invención

Esta invención trata de composiciones proteicas estabilizadas. Las composiciones estabilizadas de la presente invención son útiles para suministrar cantidades terapéuticamente efectivas de factores estimulantes de colonias de granulocitos, tales como factor estimulante de colonias de granulocitos bovinos (bG-CSF), a mamíferos, incluyendo el hombre, el ganado vacuno, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos, durante periodos prolongados. Más particularmente, las composiciones estabilizadas de la presente invención contienen tampones estabilizantes elegidos entre HEPES, TES y TRICINE, capaces de mantener un periodo prolongado de actividad proteica, tanto in vivo como in vitro.

Antecedentes de la invención

Las formulaciones de proteínas terapéuticamente efectivas, tales como G-CSF, siguen siendo difíciles de formular para una duración de almacenamiento prolongada in vitro y actividad in vivo. Las formulaciones de dichas proteínas deben mantener su actividad e integridad biológica durante periodos de tiempo adecuados para un tratamiento efectivo. Además, las formulaciones de dichas proteínas deben ser elaborables, así como capaces de ser administradas a un animal, de una forma farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas de proteínas se han suministrado en formas congeladas o liofilizadas, y se han mantenido in vitro en condiciones de almacenamiento que mantienen la actividad proteica durante periodos prolongados de tiempo. Las preparaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso con diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección. Las composiciones farmacéuticas de proteínas también se han suministrado en forma líquida. Tales formulaciones proteicas líquidas son difíciles de mantener almacenadas debido a la pérdida de la actividad proteica con el tiempo, especialmente a elevadas temperaturas.

Las formulaciones de proteínas terapéuticamente efectivas, tanto en forma sólida (liofilizada) como líquida, son difíciles de administrar a los animales sin un pérdida súbita de actividad tras la administración, como mediante una inyección subcutánea, al animal. La rápida pérdida de la actividad proteica en el lugar de inyección hace que la proteína no sea conveniente para tratar infecciones en mamíferos, dado que una terapia efectiva requiere dosis diarias durante los periodos de cobertura deseados. Los factores estimulantes de colonias de granulocitos (G-CSF), tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos bovino (bG-CSF), son inestables a o por encima de 40ºC debido a la pérdida de la estructura secundaria y el intercambio de disulfuros, con la consecuente pérdida de actividad. Esta pérdida de actividad se produce en el lugar de inyección, dado que la temperatura del cuerpo de un bóvido es de alrededor de 40ºC, y el sitio de inyección está en un intervalo de pH fisiológico.

Se conocen diversas formulaciones proteicas con una duración de almacenamiento prolongada. La patente de EE.UU. nº 5.104.651, concedida el 14 de abril de 1992 (Boone y col.), trata de una composición farmacéutica de G-CSF y un ácido a un pH en el intervalo de 3,0-3,7, con una conductividad de menos de 1.000 \muS/cm. La patente de EE.UU. nº 4.992.271, concedida el 12 de febrero de 1991 (Fernandes y col.), trata de una composición farmacéutica que contiene una proteína de interleucina 2 recombinante biológicamente activa disuelta en un medio vehicular con base acuosa a un pH de 6,8 a 7,8, y que contiene además un estabilizador de la proteína, tal como seroalbúmina humana. La patente de EE.UU. nº 4.623.717, concedida el 18 de noviembre de 1986 (Fernandes y col.), trata de composiciones proteicas terapéuticamente activas pasteurizadas, mediante las cuales las proteínas terapéuticamente activas sensibles al calor se pasteurizan mezclando la proteína con una cantidad estabilizante de un azúcar o un azúcar reducido y un aminoácido antes de la pasterización. La patente de EE.UU. nº 4.645.830, concedida el 24 de febrero de 1987 (Yasushi y col.), trata de una composición estable de interleucina 2 que contiene interleucina 2, seroalbúmina humana y un compuesto reductor, a un pH de 3 a 6, en disolución. La patente de EE.UU. nº 4.647.454, concedida el 3 de marzo de 1987 (Cymbalista), trata de un procedimiento de estabilización de interferón de fibroblastos humano con polivinilpirrolidona. La patente de EE.UU. nº 4.675.184, concedida el 23 de junio de 1987 (Hasegawa y col.), trata de una composición farmacéutica para el tratamiento de infecciones víricas que contiene interferón, un alcohol de azúcar polihídrico tri o superior, un tampón orgánico y un diluyente o vehículo farmacéutico, en la que la composición tiene un pH de aproximadamente 3 a 6.

Un ejemplo de una clase de proteínas terapéuticamente efectivas es el de los factores estimulantes de colonias de granulocitos (G-CSF). El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es uno de los muchos factores de crecimiento glucoproteicos conocidos como factores estimulantes de colonias. Tales factores estimulantes de colonias ayudan a la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas y estimulan la proliferación de células precursoras específicas de médula ósea y su diferenciación en granulocitos. Además, el G-CSF es capaz de estimular la formación de colonias de granulocitos neutrófilos y de inducir la diferenciación terminal de células leucémicas mielomonocíticas murinas in vitro. También se ha demostrado que el G-CSF estimula las actividades funcionales de neutrófilos, dando como resultado una actividad microbiocida incrementada. El G-CSF tiene una secuencia de aminoácidos conocida, de 174 aminoácidos.

Se han preparado formas recombinantes de los CSF y de los G-CSF. La clonación y expresión de ADN que codifica G-CSF humano es conocida (Nagata, S., y col., Nature, 319, 415-418 (1986). Los documentos WO-A-8604606 y WO-A-8604506 describen un gen que codifica un G-CSF humano. La patente de EE.UU. nº 5.606.024, concedida el 25 de febrero de 1997 (Boone y col.) y la patente de EE.UU. nº 5.472.857, concedida el 5 de diciembre de 1995, describen la secuencia de ADN que codifica el factor estimulante de colonias de granulocitos canino (cG-CSF), así como un procedimiento para tratar o prevenir las infecciones en animales cánidos o félidos mediante la administración de cantidades efectivas de G-CSF humano y canino a dichos animales. La patente de EE.UU. nº 4.810.643, concedida el 7 de marzo de 1989 (Souza), describe polipéptidos del tipo del G-CSF humano. La solicitud de patente europea nº 719.860, publicada el 3 de julio de 1996, describe la secuencia de aminoácidos del factor estimulante de colonias de granulocitos bovino natural (bG-CSF), la secuencia de ADN que codifica el bG-CSF y un procedimiento para tratar o prevenir la mastitis en un animal mediante la administración al animal de una cantidad efectiva de G-CSF. El documento WO-A-8702060 describe polipéptidos del tipo G-CSF humano, las secuencias que los codifican y procedimientos para producirlos. La patente de EE.UU. nº 4.833.127, concedida el 23 de mayo de 1989 (Ono y col.), describe un nuevo factor estimulante de colonias de granulocitos humano biológicamente activo. La solicitud de patente europea nº 612.846, publicada el 31 de agosto de 1994, describe ciertos análogos de G-CSF y composiciones que contienen dichos análogos.

Los factores estimulantes de colonias de granulocitos son útiles como agentes antiinfecciosos que aumentan la inmunocompetencia del animal, más que dirigirse a un objetivo microbiano específico necesario para el crecimiento o virulencia. Hay otros pocos agentes disponibles comercialmente usados en medicina veterinaria que dirigen respuestas inmunes no específicas conducentes a una resistencia aumentada ante una infección microbiana. Las medidas de control disponibles se limitan a antimicrobianos convencionales y a un número limitado de productos biológicos. Las pérdidas económicas relacionadas con periodos de retirada de la leche en el ganado limitan la utilidad de los antimicrobianos convencionales. Las vacunas actuales se dirigen a un número limitado de especies, y el campo de eficacia de estos agentes varía ampliamente. Las vacunas más exitosas (E. coli J5) están limitadas en su uso a nivel mundial debido a razones de seguridad relacionadas con contaminación por endotoxinas.

La mastitis es una enfermedad problemática fundamental que afecta a los productores lecheros de todo el mundo. Las pérdidas económicas en los Estados Unidos relacionadas con la mastitis superan el millardo de dólares anualmente. Estas pérdidas están relacionadas con mortalidades, desecho de la leche, descensos agudos y crónicos en la producción de la leche, una selección temprana aumentada y costes de actividades veterinarias. Las vacas lecheras periparturientas mostraron respuestas inmunes alteradas (función neutrófila) que aumentan su susceptibilidad ante infecciones bacterianas de la glándula mamaria. El impacto de esta susceptibilidad aumentada se ilustra por el hecho de que aproximadamente el 40% de las nuevas infecciones clínicas intramamarias se producen dentro de las dos primeras semanas después del parto. Las mastitis está relacionada con una amplia variedad de patógenos bacterianos, incluyendo tanto organismos grampositivos como gramnegativos. Algunos de los microorganismos patógenos conocidos que provocan mastitis son Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa. Estos patógenos penetran en la ubre a través del conducto mamario y producen una inflamación del tejido productor de la leche, provocando la formación de una cicatriz tisular que puede dar como resultado una pérdida permanente de la capacidad de producir leche. Algunas formas de mastitis incluyen: infección de la ubre, mastitis crónica, mastitis clínica y mastitis subclínica.

Las actuales terapias antimicrobianas y vacunas poseen algunas deficiencias que limitan su utilidad en las vacas lecheras. La terapia antibiótica para controlar la mastitis ha resultado deficiente. Existe una necesidad de un agente bioterapéutico que sea útil para recuperar la inmunocompetencia normal, dando como resultado una disminución en la incidencia y severidad de las mastitis.

La enfermedad respiratoria bovina, también conocida como tifus epidémico, es otra enfermedad común que afecta al ganado. La enfermedad respiratoria bovina afecta al ganado tras su envío a comederos o pastizales, y es el resultado de una variedad de situaciones estresantes que afectan al ganado, incluyendo el destete, la castración, el descuerne, el ayuno, el hacinamiento, la exposición a agentes infecciosos, los cambios en la dieta y los cambios de temperatura, en combinación con infecciones por cualquiera de los diversos patógenos conocidos. Pasteurella haemolytica es uno de dichos patógenos comunes que provocan daños en el sistema respiratorio del ganado.

Se sabe que muchas otras enfermedades infecciosas, incluyendo varias enfermedades reproductoras, también afectan al hombre, al cerdo, al ganado, a perros, gatos, caballos, cabras y ovejas. Un ejemplo de dichas enfermedades, que se produce en el ganado, es la metritis.

Existe una necesidad de una composición proteica estable que permanezca terapéuticamente efectiva durante periodos prolongados de tiempo in vivo. Además, existe una necesidad de formulaciones de proteínas que proporcionen una duración de almacenamiento in vitro prolongada.

Resumen de la invención

La presente invención trata de una composición proteica estabilizada que comprende G-CSF y un tampón estabilizante elegido del grupo consistente en HEPES, TES y TRICINE.

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Las realizaciones específicas de la invención incluyen una composición estabilizada de G-CSF, composición que está a pH fisiológico.

Otras realizaciones específicas de la invención incluyen una composición estabilizada de G-CSF, composición que está a una temperatura fisiológica.

Otras realizaciones específicas más de la invención incluyen una composición estabilizada de G-CSF, en la que la composición es capaz de mantener niveles terapéuticos de G-CSF durante periodos prolongados de al menos tres días.

Algunas realizaciones más específicas de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína se elige del grupo consistente en: G-CSF humano, G-CSF bovino y G-CSF canino.

Algunas realizaciones más específicas de la invención incluyen una composición estabilizada de G-CSF en la que el G-CSF está presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml.

Otras realizaciones específicas más de la invención incluyen una composición estabilizada de G-CSF en la que el tampón estabilizante está presente en una concentración que varía desde aproximadamente 0,05 M hasta aproximadamente 2 M.

Algunas realizaciones más específicas de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino.

Otras realizaciones específicas de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino y en la que el bG-CSF está presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml.

Otras realizaciones específicas de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino y en la que el tampón estabilizante se elige del grupo consistente en: HEPES, TES y TRICINE.

Algunas realizaciones específicas más de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino y en la que el tampón estabilizante está presente en una concentración que varía desde 0,05 M hasta 2 M.

Algunas realizaciones específicas más de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino y en la que la composición está a pH fisiológico.

Algunas realizaciones específicas más de la invención incluyen una composición proteica estabilizada en la que la proteína es G-CSF bovino y en la que la composición está a temperatura fisiológica.

Preferiblemente, la composición proteica estabilizada de la invención es una composición que comprende G-CSF bovino en tampón de HEPES. Más preferiblemente, el tampón de HEPES está en una concentración que varía desde 0,05 M hasta 2 M. Tales formulaciones de G-CSF bovino están preferiblemente a pH fisiológico, tal como 7,5. Adicionalmente, tales formulaciones preferibles de G-CSF bovino son capaces de mantener, durante un periodo de tiempo prolongado, de desde al menos 3 días hasta 7 días o más, niveles terapéuticos de G-CSF bovino.

La presente invención trata además de una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de una composición proteica estabilizada para su administración parenteral a un mamífero, que comprende G-CSF y un tampón estabilizante farmacéuticamente aceptable elegido del grupo consistente en HEPES, TES y TRICINE.

Algunas realizaciones específicas de la invención incluyen una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable en la que la forma de dosificación comprende además un componente elegido del grupo consistente en modificadores de la viscosidad y tensioactivos.

La presente invención trata además de un procedimiento para preparar una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de una composición proteica estabilizada para su administración parenteral a un mamífero, que comprende la etapa de combinar el G-CSF y un tampón estabilizante elegido del grupo consistente en HEPES, TES y TRICINE.

La presente invención trata además del uso de una composición proteica estabilizada de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infecciones en mamíferos.

La presente invención trata además del uso de una composición proteica estabilizada de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de mastitis, metritis, o enfermedad respiratoria bovina en el ganado vacuno.

La presente invención trata además de un dispositivo para administrar a un mamífero una composición proteica estabilizada, que comprende un primer envase con una cantidad terapéuticamente efectiva de G-CSF, y un segundo envase con un tampón estabilizante farmacéuticamente aceptable elegido del grupo consistente en HEPES, TES y TRICINE.

Las realizaciones específicas de la invención incluyen un dispositivo en el que la proteína está presente en una cantidad suficiente como para proporcionar protección al mamífero durante al menos tres días.

Una composición preferible de la invención es una composición proteica estabilizante que comprende G-CSF bovino y un tampón de HEPES, composición que es capaz de mantener los niveles terapéuticos de G-CSF bovino en un mamífero, in vivo, durante al menos 3 días, en la que la composición está a un pH de 7,5 y en la que la composición está a una temperatura de aproximadamente la temperatura fisiológica o 40ºC. Dicha composición es particularmente útil si el mamífero es una vaca. Más particularmente, el tampón de HEPES está presente a una concentración que varía desde 0,05 M hasta 2 M. Es particularmente preferible si el tampón de HEPES está presente a una concentración de 1 M. Preferiblemente, el G-CSF bovino está presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de bG-CSF es 0,1 mg/ml.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 0,1 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de HEPES a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 2 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 0,1 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de TES a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 3 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 0,1 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de TRICINE a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 4 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 2 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de HEPES a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 5 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 2 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de TES a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 6 muestra la estabilidad (% de recuperación) de disoluciones de 2 mg/ml de bG-CSF a pH 7,5, en función del tiempo, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, en tampón de TRICINE a unas concentraciones de 0,1 M, 1 M y 2 M.

La Figura 7 muestra el recuento total de PMN en sangre periférica (expresado como porcentaje de control, valor a la hora 0) de ganado tratado con bG-CSF formulado en agua, en tampón de HEPES 1M, en tampón de TES 1M y en tampón de TRICINE 1 M.

La Figura 8 muestra la estabilidad de bG-CSF(concentración en mg/ml) en función del tiempo en tampón de Neupogen® (control, pH 4,0), en tampón de HEPES a pH 7,4, en PBS a pH 7,0, en tampón de Hanks a pH 8,5 y en tampón de bicarbonato a pH 8,2.

La Figura 9 muestra la estabilidad de bG-CSF(concentración en mg/ml) en función del tiempo en tampón de HEPES 1.000 mM, 500 mM, 100 mM, 50 mM y 20 mM, a 40ºC.

La Figura 10 muestra dos termogramas (Kcal/mol/grado) frente a la temperatura (ºC) de dos disoluciones de bG-CSF. El termograma superior, con una temperatura máxima de 47ºC, es de un bG-CSF formulado en PBS a pH 7,5, y el termograma inferior, con una temperatura máxima de 59ºC, es de un bG-CSF formulado en HEPES 1M a pH 7,5.

La Figura 11 muestra una representación gráfica del % de PMN (neutrófilos) en el ganado en función del tiempo para tres formulaciones: bG-CSF en agua (como control), bG-CSF en HEPES 1 M y bG-CSF en HEPES 1 M + polaxámero al 10%.

La Figura 12 muestra la solubilidad de bG-CSF en tampón de HEPES 1 M a pH 7,5, medida por absorbancia a 310 nm, frente a la concentración de bG-CSF (mg/ml).

La Figura 13 muestra la estabilidad (% de concentración inicial) de G-CSF bovino en tampón de HEPES 1 M y en PBS a 40ºC.

La Figura 14 muestra la estabilidad (% de concentración inicial) de G-CSF humano en tampón de HEPES 1 M y en PBS a 40ºC.

La Figura 15 compara la estabilidad (% de concentración inicial) de G-CSF humano y G-CSF bovino en tampón de HEPES 1 M a pH 7,5.

La Figura 16 muestra el porcentaje de concentración inicial de bG-CSF en tampón de HEPES 1 M a pH 4,0 frente al tiempo (días) a 40ºC.

La Figura 17 muestra el porcentaje de concentración inicial de bG-CSF en tampón de HEPES 1 M a pH 7,5 frente al tiempo (días) a 40ºC.

La Figura 18 muestra el porcentaje de concentración inicial de bG-CSF en tampón de TES 1 M a pH 4,0 frente al tiempo (días) a 40ºC.

La Figura 19 muestra el porcentaje de concentración inicial de bG-CSF en tampón de TES 1 M a pH 7,5 frente al tiempo (días) a 40ºC.

La Figura 20 muestra los resultados en RP HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 5ºC, frente al tiempo (semanas).

La Figura 21 muestra los resultados en SE HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 5ºC, frente al tiempo (semanas).

La Figura 22 muestra los resultados en RP HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 30ºC, frente al tiempo (semanas).

La Figura 23 muestra los resultados en SE HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 30ºC, frente al tiempo (semanas).

La Figura 24 muestra los resultados en RP HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 40ºC.

La Figura 25 muestra los resultados en SE HPLC de % de concentración inicial de bG-CSF de muestras almacenadas a 40ºC, frente al tiempo (semanas).

La Figura 26 es el espectro de DC (dicroísmo circular) de bG-CSF.

La Figura 27 es una representación gráfica de la elipticidad molar a una longitud de onda de 222 nm en función de la temperatura.

La Figura 28 muestra el porcentaje de concentración inicial de bG-CSF en varias concentraciones de tampón de HEPES a pH 7,5 y a 40ºC, frente al tiempo (días).

La Figura 29 es una representación gráfica de los GB frente al tiempo tras la inyección (en horas) de bG-CSF formulado en HEPES 1 M frente a una formulación de control.

Descripción detallada de la invención

La presente invención trata de composiciones de G-CSF estabilizadas basadas en el sorprendente descubrimiento de que las proteínas, y en particular, las proteínas útiles para el tratamiento de infecciones en mamíferos, tales como el hombre, perros, gatos, ovejas, cabras, caballos y cerdos, pueden ser estabilizadas mediante la adición de un tampón estabilizante elegido entre HEPES, TES y TRICINE a la proteína, de forma que la composición proteica estabilizada es capaz de mantener un periodo prolongado de actividad proteica tanto in vivo como in vitro. Con respecto a la actividad in vivo, las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención pueden mantener niveles terapéuticamente efectivos de dichas proteínas en un mamífero durante un periodo prolongado.

En particular, la presente invención es una formulación de liberación prolongada (actividad prolongada) de bG-CSF en un tampón estabilizante, tal como HEPES o TES, que proporciona una actividad medicamentosa terapéutica prolongada. Se sabe que el bG-CSF se desnaturaliza a temperaturas alrededor de 40ºC, y es inestable a pH neutro. Esto es una preocupación, dado que el pH fisiológico es próximo al neutro y la temperatura corporal de una vaca es de aproximadamente 40ºC.

Las proteínas de las composiciones estabilizadas de la presente invención pueden ser proteínas naturales, proteínas aisladas o purificadas, o proteínas producidas recombinantemente. También se incluyen dentro de la invención todas las proteínas que han sido modificadas químicamente, siendo una modificación química de las proteínas tal como oxidación de metionina, S-alquilación de cisteína y adición de disulfuro con beta-mercaptoetanol, alquilación de grupos amino de lisina, etc.. Una proteína preferible para su uso en las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención es bG-CSF.

Por "bG-CSF" se entiende el factor estimulante de colonias de granulocitos, incluyendo el factor estimulante de colonias de granulocitos en su forma natural así como todas las variantes y mutantes de la misma, incluyendo, por ejemplo, las variantes recombinantes con una o más deleciones, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos. Tales variantes y mutantes mantienen toda o la suficiente actividad biológica como para proporcionar un beneficio terapéutico en un mamífero. El G-CSF en su forma natural es una glucoproteína que comprende una proteína de 174 aminoácidos y una forma con tres aminoácidos adicionales. Ambas formas tienen cinco residuos de cisteína, cuatro formando dos puentes de disulfuro y uno en forma libre.

Las proteínas preferibles son aquellas que son útiles en el tratamiento o prevención de infecciones en mamíferos como el hombre, perros, ganado, cerdos, cabras, ovejas, caballos y gatos. Tales infecciones pueden ser infecciones bacterianas o infecciones protozoarias, o pueden estar causadas por virus.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, salvo que se indique lo contrario, el término "infección(es)" incluye infecciones por bacterias, protozoos, hogos y virus que se producen en mamíferos, así como los desórdenes relacionados con dichas infecciones que pueden ser tratados o prevenidos mediante la administración de las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención.

Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse usando las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas del ganado, tales como, por ejemplo, mastitis bovina, asociada, pero no limitada a, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactia, Streptococcus agalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium spp.; enfermedad respiratoria bovina, asociada pero no limitada al virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), virus de la parainfluenza (PI3), virus de la diarrea viral bovina (BVD), Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida y Haemophilus somnus; enfermedades reproductoras tales como metritis; y diarrea bovina asociada, pero no limitada a, E. coli y Eimeria spp..

Otros ejemplos de enfermedades infecciosas que pueden ser tratadas usando las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas de los perros, tales como piodermia y la enfermedad respiratoria de los perros, también denominada tos de las perreras.

La composición proteica estabilizada de la presente invención puede usarse para proporcionar beneficios terapéuticos distintos a tratar o prevenir infecciones. Un ejemplo de un beneficio terapéutico o efecto distinto al tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas es la administración de G-CSF humano recombinante a perros y gatos para mejorar la mielosupresión inducida por quimioterapia y permitir protocolos de tratamiento del cáncer más agresivos.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, la palabra "estabilizante", salvo que se indique lo contrario, se refiere a niveles terapéuticos sostenidos de la proteína durante un periodo de tiempo prolongado. Tales niveles terapéuticos sostenidos de la proteína pueden producirse bien tras la administración a un mamífero, o bien in vitro, antes del uso o durante el almacenamiento de la composición proteica estabilizada de la invención. La estabilidad de las composiciones proteicas de la invención puede determinarse, por ejemplo, mediante el % de concentración inicial frente al tiempo, usando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.

Tras la administración a un mamífero, las composiciones estabilizadas de la presente invención proporcionan niveles terapéuticos sostenidos de la proteína, de forma que dicha proteína es capaz de proporcionar su efecto terapéutico o beneficioso durante un periodo prolongado. Según se usa en la presente memoria descriptiva, y salvo que se indique lo contrario, el término "periodo prolongado" se refiere al periodo de tiempo en el que se mantienen los niveles terapéuticos de la proteína, bien tras la administración a un mamífero o, alternativamente, in vitro, antes de su uso, o durante el almacenamiento de la composición proteica estabilizada de la invención.

Un periodo prolongado de niveles terapéuticos de proteína proporciona un efecto beneficioso o terapéutico en el mamífero durante un periodo de tiempo más largo que el que es posible mediante la administración de la misma proteína al mamífero sin la presencia del tampón estabilizante, comparado, por ejemplo, con una disolución de control de la proteína en agua o en PBS. Alternativamente, en condiciones de almacenamiento in vitro, el periodo prolongado de niveles terapéuticos de proteína proporciona una estabilidad aumentada de la proteína durante un periodo de tiempo más largo que el que es posible con el almacenamiento de la misma proteína en unas condiciones sin la presencia del tampón estabilizante, como cuando se compara, por ejemplo, con una disolución de control de la proteína en agua o en PBS. Preferiblemente, el periodo prolongado es de al menos tres días. Más preferiblemente, el periodo prolongado es de alrededor de siete días o más.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, y salvo que se indique lo contrario, el término "niveles terapéuticos" se refiere a aquella cantidad de una proteína que proporciona un efecto terapéutico en varios regímenes de administración. Dichas cantidades son fácilmente determinables por el experto en la materia. La cantidad de proteína dependerá del tipo y gravedad de la infección, de la vía de administración, etc.

Por "tampón estabilizante" se entiende cualquiera de los numerosos tampones que, cuando se combinan con la proteína de la composición estabilizada de la presente invención, proporcionan una composición proteica estabilizada, composición que es capaz de mantener niveles terapéuticos de dicha proteína durante un periodo prolongado. El mantenimiento de los niveles terapéuticos puede determinarse, por ejemplo, mediante la medida de la actividad de la proteína, según determinan los procedimientos conocidos en la materia. Preferiblemente, el tampón estabilizante opera a pH fisiológico. Los tampones estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, tampones orgánicos, tales como los tampones de iones dipolares, generalmente denominados "tampones buenos", que operan dentro del intervalo de 6 a 8,5. Algunos ejemplos de dichos tampones estabilizantes incluyen: HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N-2-etanosulfónico), TES (ácido N-Tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico) y TRICINE (N-Tris(hidroximetil)metil glicina). Algunos ejemplos de tampones que pueden usarse en las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención se muestran en la Tabla 2.

El pH de la composición proteica estabilizada de la presente invención puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 4,0 hasta aproximadamente 8.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "pH fisiológico", salvo que se indique lo contrario, se refiere al intervalo de pH encontrado en mamíferos, incluyendo el hombre, el ganado, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. El pH fisiológico de los mamíferos está generalmente dentro del intervalo de desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,0.

La temperatura de la composición proteica estabilizada de la presente invención puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 50ºC.

Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "temperatura fisiológica", salvo que se indique lo contrario, se refiere el intervalo de temperaturas corporales encontrado en mamíferos, incluyendo el hombre, el ganado, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. La temperatura fisiológica de los mamíferos está generalmente dentro del intervalo de desde aproximadamente 37ºC hasta aproximadamente 41ºC. Las temperaturas fisiológicas de algunos ejemplos de mamíferos son las siguientes: hombre, 37ºC; ganado, 39ºC; gatos, 38ºC; perros, 39ºC; cabras, 39ºC; caballos, 37ºC; y cerdos, 37ºC.

Preferiblemente, las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención contienen como proteína el G-CSF bovino, en un tampón estabilizante, tampón que se elige entre tampón de HEPES, tampón de TES y tampón de TRICINE. La composición proteica estabilizada resultante es capaz de mantener la actividad del bG-CSF a niveles terapéuticamente efectivos durante un periodo prolongado de al menos tres días, al pH fisiológico del ganado y a la temperatura fisiológica del ganado de aproximadamente 40ºC.

Puede preparase una composición estabilizada de G-CSF combinando la proteína y el tampón estabilizante, usando técnicas de combinación conocidas y generalmente disponibles. Un procedimiento en particular para preparar una composición proteica estabilizada incluye el uso de la proteína en una forma purificada, preparada según las técnicas de purificación de proteínas conocidas por el experto en la materia.

Para una proteína en particular de valor terapéutico, se puede disolver la proteína en particular (hasta su solubilidad máxima) en cada uno de los diversos tampones, tales como HEPES, TES, TRICINE u otros tampones, a concentraciones de tampón variables, tales como desde 0,05 hasta 2 M. Además, el pH de la disolución puede variarse, típicamente desde aproximadamente un pH de 4,0 hasta aproximadamente 8,0. La solubilidad máxima de la proteína en un tampón en particular puede determinarse mediante medios convencionales conocidos en la materia. La disolución puede entonces almacenarse a la temperatura fisiológica de un mamífero al que se pretende administrar la disolución de la proteína, y la cantidad de proteína presente en la disolución puede determinarse en función del tiempo. El nivel terapéutico de la proteína en la disolución puede determinarse monitorizando el % de recuperación de la proteína en función del tiempo. La cantidad de proteína remanente, o el % de recuperación de proteína, puede compararse con un nivel umbral conocido de la proteína requerido para el beneficio terapéutico. Entonces el periodo de tiempo prolongado puede determinarse como el número de días durante los cuales la cantidad de proteína remanente en la disolución es igual o mayor al nivel umbral conocido de proteína requerido para su beneficio terapéutico. Un tampón que es efectivo como tampón estabilizante es aquel que, cuando se combina con la proteína en particular, proporciona niveles terapéuticos sostenidos de la proteína durante un periodo prolongado, es decir, un periodo de tiempo más largo que el que es posible mediante la administración de la misma proteína al mamífero sin la presencia del tampón estabilizante.

La estabilidad de una proteína puede determinarse midiendo la actividad de la proteína en función del tiempo. Puede usarse la temperatura de desenrollamiento (T_{m}) de la proteína como marcador de la estabilidad de la disolución y de la estabilidad de las proteína in vivo. La temperatura de desenrollamiento de una proteína en particular es la temperatura a la cual la proteína pierde su estructura secundaria y, típicamente, su actividad, y puede determinarse usando procedimientos conocidos por el experto en la materia, tales como calorimetría diferencial de barrido.

Las cantidades de proteína presentes en las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención pueden variar desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml. Para el G-CSF, el intervalo preferible es desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml.

Un ejemplo de una composición proteica estabilizada según la presente invención es una composición que contiene bG-CSF y tampón de HEPES, en la que el bG-CSF está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg/ml, y en la que el tampón de HEPES está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 2 M. Más preferiblemente, la concentración de bG-CSF está dentro del intervalo de desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml.

Otro ejemplo de una composición proteica estabilizada según la presente invención es una composición que contiene bG-CSF y tampón de TES, en la que el bG-CSF está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg/ml, y en la que el tampón de HEPES está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 2 M. Más preferiblemente, la concentración de bG-CSF está dentro del intervalo de desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml.

Otro ejemplo más de una composición proteica estabilizada según la presente invención es una composición que contiene bG-CSF y tampón de TRICINE, en la que el bG-CSF está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg/ml, y en la que el tampón de HEPES está presente en un intervalo de concentración de desde aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 2 M. Más preferiblemente, la concentración de bG-CSF está dentro del intervalo de desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml.

La composición proteica estabilizada de la presente invención puede prepararse en una forma congelada o liofilizada usando medios convencionales conocidos por el experto en la materia. Las formas liofilizadas de la proteína pueden ser reconstituidas con el tampón estabilizante. La disolución puede, alternativamente, almacenarse en forma líquida para su uso inmediato. Preferiblemente, la composición proteica estabilizada de la presente invención está en una forma líquida que mantiene su actividad durante el almacenamiento a largo plazo.

Las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral (subcutánea, intravascular, intraperitoneal e intramuscular), nasal, tal como mediante inhalación, intraocular o intradérmica, o mediante procedimientos de infusión usando formas conocidas por el experto en la materia. Es preferible la administración por vía parenteral.

Independientemente de la vía de administración, las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención pueden formularse en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos o evidentes para el experto en la materia.

Las formas de dosificación farmacéuticamente aceptables de las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención son preferiblemente adecuadas para su administración por vía subcutánea. Una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable para la administración por vía subcutánea es, típicamente, de un volumen no mayor a aproximadamente 20 ml (como para su administración a caballos y al ganado), estéril (adecuada para su uso en mamíferos), y además, es bien tolerada por el mamífero, es decir, no provoca inflamación, dolor o necrosis apreciables en el lugar de inyección.

En general, las formas de dosificación farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden contener otros componentes farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, tensioactivos o detergentes, agentes modificadores de la viscosidad, azúcares o proteínas, componentes adicionales que están presentes en cantidades adecuadas para una administración farmacéutica eficaz y segura. Por ejemplo, la forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de las composiciones proteicas estabilizadas de la presente invención puede formularse siguiendo el convenio aceptado, usando vehículos, estabilizantes, diluyentes y/o conservantes. Los diluyentes pueden incluir agua, suero salino, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes pueden incluir albúmina, entre otros. Otros vehículos y aditivos adecuados son conocidos, o serán evidentes, para el experto en la materia.

La composición proteica estabilizada de la presente invención puede suministrarse en un dispositivo que comprende un primer envase con una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína y un segundo envase con un tampón estabilizante farmacéuticamente aceptable. La proteína puede estar en forma sólida, como en una forma congelada o liofilizada, o en una forma líquida. Entonces el tampón estabilizante puede combinarse con la proteína y administrarse a un mamífero, de forma que la cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína del primer envase, cuando se combina con el tampón estabilizante farmacéuticamente aceptable del segundo envase, es capaz de mantener niveles terapéuticos de dicha proteína en el mamífero durante un periodo prolongado.

Las realizaciones específicas de la invención incluyen un dispositivo en el que la proteína está presente en una cantidad suficiente para proporcionar protección al mamífero durante al menos tres días.

La forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de la presente invención puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta aproximadamente 50 \mug/kg, preferiblemente desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 25 \mug/kg, y más preferiblemente desde aproximadamente 3 \mug/kg hasta aproximadamente 25 \mug/kg. Las forma de dosificación más preferible es de aproximadamente 24 \mug/kg para su uso con bG-CSF. La dosis es efectiva durante al menos aproximadamente tres días.

Ejemplo 1 Estabilidad prolongada del bG-CSF en tampones de HEPES, TES y TRICINE

Se prepararon concentraciones de tampón de 0,1 M, 1 M y 2 M para cada uno de los tres tampones, HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N-2-etanosulfónico), TES (ácido N-Tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico) y TRICINE (N-Tris(hidroximetil)metil glicina). Los tampones se obtuvieron de Fluka Biochemica, EE.UU.. El pH de cada tampón se ajustó a 7,5 usando hidróxido sódico (J. T. Baker, EE.UU.). Los tampones se filtraron estérilmente usando un filtro GV de 0,2 micrómetros (Millipore, EE.UU.). Las concentraciones de los tampones que se prepararon fueron: tampón de HEPES: 0,1 M, 1 M y 2 M; tampón de TES: 0,1 M, 1 M y 2 M; tampón de TRICINE: 0,1 M, 1 M y 2 M.

Se prepararon disoluciones que contenían 0,1 mg/ml de bG-CSF en cada uno de los tampones, TES, TRICINE y HEPES, a cada una de las concentraciones de tampón descritas anteriormente, añadiendo una cantidad de 4,69 mg de bG-CSF a granel (basada en una potencia del 53,3%) a un matraz volumétrico de 25 ml, que después se llevó a volumen con la concentración de tampón adecuada.

Se prepararon disoluciones que contenían 2 mg/ml de bG-CSF en cada uno de los tampones, TES, TRICINE y HEPES, a cada una de las concentraciones de tampón descritas en la Tabla 1, añadiendo una cantidad de 93,8 mg de bG-CSF a granel (basada en una potencia del 53,3%) a un matraz volumétrico de 25 ml, que después se llevó a volumen con la concentración de tampón adecuada.

Entonces las formulaciones de bG-CSF se filtraron a través de un filtro de unión de proteínas inferiores de 0,22 micrómetros (Millipore G. V.). Se colocó un volumen de 1 ml de cada formulación en un vial de 1 ml, y después se colocaron en un horno a 40ºC durante 9 días. Las disoluciones de bG-CSF estabilizadas con tampón que se prepararon fueron: 0,1 mg/ml de bG-CSF en (1) tampón de HEPES: 0,1 M, 1 M y 2 M; (2) tampón de TES: 0,1 M, 1 M y 2 M; y (3) tampón de TRICINE: 0,1 M, 1 M y 2 M. Las muestras se extrajeron de cada uno de los viales cada tres días y se analizaron mediante HPLC de exclusión (SEC-HPLC). Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6 y en las Tablas 3 y 4.

TABLA 3

1

La Tabla 3 muestra el % de recuperación (remanente) de disoluciones de bG-CSF de 0,1 mg/ml, preparadas según se ha descrito anteriormente, en función del tiempo. Las disoluciones se almacenaron a 40ºC.

TABLA 4

2

La Tabla 4 muestra el % de recuperación (remanente) de disoluciones de bG-CSF de 2 mg/ml, preparadas según se ha descrito anteriormente, en función del tiempo. Las disoluciones se almacenaron a 40ºC.

Las Figuras 1 a 3 muestran la estabilidad de las disoluciones de bG-CSF de 0,1 mg/ml a pH 7,5, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, a concentraciones variables de 0,1 M, 1 M y 2 M de tampones de HEPES, TES y TRICINE, respectivamente. La estabilidad o mantenimiento de la actividad del bG-CSF mejoraba según aumentaba la concentración del tampón hacia 1 M o superior, según se muestra en las Figuras 1 a 3. A 0,1 mg/ml de bG-CSF había un 90% de recuperación de bG-CSF en HEPES 1 M (Figura 1).

Las Figuras 4 a 6 muestran la estabilidad de disoluciones de bG-CSF de 2,0 mg/ml a pH 7,5, en unas condiciones de almacenamiento de 40ºC, a concentraciones variables de 0,1 M, 1 M y 2 M de tampones de HEPES, TES y TRICINE, respectivamente. De nuevo, la estabilidad o mantenimiento de la actividad del bG-CSF mejoraba según aumentaba la concentración del tampón hacia 1 M o superior, según se muestra en las Figuras 4 a 6.

Los datos presentados en las Tablas 3 y 4 y en las Figuras 1 a 6 muestran que la presencia de tampones HEPES, TES y TRICINE mantiene significativamente la actividad del bG-CSF durante periodos prolongados, desde 3 hasta 9 días.

Ejemplo 2 Comportamiento in vivo del bG-CSF formulado en agua y en tampones de HEPES 1 M, TES 1 M y TRICINE 1 M

El ensayo in vivo del bG-CSF formulado en agua y en tampones de HEPES 1 M, TES 1 M y TRICINE 1 M se realizó en terneros. Se administró a los terneros una dosis de 24 \mug/kg y se monitorizaron los valores de PMN (neutrófilos).

La Figura 7 muestra el recuento total de PMN en sangre periférica (expresado como porcentaje de control, valor a la hora 0) de ganado tratado con bG-CSF formulado en agua, tampón de HEPES 1M, tampón de TES 1M y tampón de TRICINE 1 M. Los tres tampones dieron aproximadamente 100 horas de cobertura tras una única inyección. Esto demuestra que los tres tampones proporcionan un periodo prolongado de actividad proteica in vivo en el lugar de inyección.

Ejemplo 3 Efecto del tampón de HEPES sobre la estabilidad in vitro del bG-CSF

Se formularon varias cantidades de bG-CSF en diversos sistemas tamponantes, según se describe a continuación, a una concentración de 0,1 mg/ml en un intervalo de pH de aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 8,5. Todas las muestras se filtraron con un filtro de 0,2 micrómetros (GV, Millipore, EE.UU.) antes del llenado. Las muestras se llevaron a estabilidad a 40ºC y se monitorizaron durante 7 a 10 días mediante HPLC en fase inversa (RP HPLC), SEC HPLC y bioensayo, según se describe a continuación. La temperatura de desenrollamiento del bG-CSF se midió mediante un sistema de microcalorimetría VP-DSC (EE.UU.).

La Figura 8 proporciona una comparación de la estabilidad del bG-CSF en diversos sistemas tamponantes, incluyendo Neupogen® (disponible comercialmente, EE.UU., G-CSF humano), usado como control, HEPES a pH 7,4, PBS a pH 7,0, tampón de Hanks (disponible comercialmente, EE.UU.) y tampón de bicarbonato. Los resultados indican que el bG-CSF formulado en tampón de HEPES 1 M fue el más estable de todas las formulaciones ensayadas, y mostró una estabilidad similar a la del tampón de Neupogen® a pH 4,0. La estabilidad del bG-CSF en tampón de HEPES, según se demuestra en la Figura 8 fue sorprendente e inesperada, ya que el bG-CSF era previamente conocido por ser inestable en condiciones de pH neutro o fisiológico y a temperaturas de alrededor de 40ºC o mayores. El bG-CSF formulado en PBS a pH 7,0, en tampón de Hanks y en tampón de bicarbonato no era estable. Esto se confirmó según se describe en la Tabla 5.

TABLA 5

3

Durante 7 días de almacenamiento a 40ºC, el bG-CSF en tampón de Neupogen® y de HEPES no perdió nada de actividad. Como también se muestra, el bG-CSF en PBS era 10 veces menos activo, y el bG-CSF en tampón de Hanks y de bicarbonato fue de 100 a 1.000 veces menos activo que los iniciales, respectivamente.

La Figura 9 muestra el efecto de la concentración del tampón de HEPES sobre la estabilidad del bG-CSF en tampón de HEPES 1.000 mM, 500 mM, 100 mM, 50 mM y 20 mM a 40ºC. Según se muestra en la Figura 9 según disminuía la concentración de HEPES se producía una significativa pérdida de estabilidad del bG-CSF.

La Figura 10 es un termograma de dos disoluciones diferentes de bG-CSF. El termograma superior con una temperatura máxima de 47ºC, corresponde a bG-CSF formulado en PBS a pH 7,5 y el termograma inferior, con una temperatura máxima de 59ºC, corresponde a bG-CSF formulado en HEPES 1 M a pH 7,5. En ausencia de tampón de HEPES, la temperatura de desenrollamiento del bG-CSF a pH 7,5 es aproximadamente 40ºC (temperatura de establecimiento), mientras que el bG-CSF en HEPES 1 M da como resultado un aumento en 10ºC de la temperatura de desenrollamiento. Un aumento en la temperatura de desenrollamiento es indicativo de estabilización.

Ejemplo 4 Comportamiento in vivo del bG-CSF formulado en HEPES 1 M

El ensayo in vivo del bG-CSF formulado en HEPES 1 M se realizó en terneros. Se administró una dosis de 12 \mug/Kg a los terneros, y se monitorizaron los valores de leucocitos (GB) y PMN (neutrófilos). Los resultados se muestran en la Figura 11.

La Figura 11, que es una representación gráfica del % de PMN (neutrófilos) frente al tiempo, es una comparación de tres formulaciones: bG-CSF en agua (como control), bG-CSF en HEPES 1 M y bG-CSF en HEPES 1 M + polaxámero al 10%. Según se muestra en la Figura 11, los valores de PMN permanecen por encima del umbral (nivel relacionado con la protección) durante 3 días o 72 horas. Se ensayaron seis reses por formulación.

En un segundo estudio, en el que se administró una dosis de 24 \mug/Kg a los terneros usando bG-CSF en tampón de HEPES 1 M + polaxámero al 10%, una única inyección proporcionó aproximadamente 200 horas de protección, o aproximadamente 8 días de cobertura. Este resultado demuestra que el tampón de HEPES mejora la estabilidad in vivo del bG-CSF, que a su vez proporciona un periodo prolongado de actividad, y por tanto, de administración de esta proteína.

Ejemplo 5 Solubilidad del bG-CSF en HEPES 1 M

Se determinó la solubilidad del bG-CSF en HEPES 1 M a pH 7,5. Se disolvieron aproximadamente 80 mg de bG-CSF en 30 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,5). La disolución proteica se filtró a través de un filtro GV Millipore de 0,2 micrométros y después se transfirió a una celda de ultrafiltración de 50 ml. La celda estaba equipada con una membrana de unión de proteínas inferiores, con un corte de peso molecular (PM) de 10.000. La disolución proteica se concentró usando la celda de ultrafiltración. A distintos tiempos se extrajeron muestras de la celda para su análisis mediante UV-Vis a 310 nm (medida de la dispersión de la luz) y para medir su concentración mediante RP HPLC. Se representó gráficamente la absorbancia a 310 nm frente a la concentración. La absorbancia a 310 nm debería aumentar linealmente con la concentración; a saturación hay una ruptura súbita de la curva a 310 nm y la absorbancia a 310 nm aumenta drásticamente. La concentración a la que esto ocurre es la solubilidad máxima. Este procedimiento es conocido por el experto en la materia y se usa típicamente para determinar la solubilidad de la proteína. Como se muestra en la Figura 12, la solubilidad máxima del bG-CSF en HEPES 1 M a pH 7,5 es aproximadamente 5 mg/ml. La solubilidad máxima de la proteína se muestra a la concentración que representa una ruptura en la curva. A una concentración de aproximadamente 5 mg/ml se produce un súbito aumento en la absorbancia a 310 nm, correspondiente a la solubilidad máxima de la proteína.

Ejemplo 6 Efecto de los tampones de HEPES, TES y TRICINE sobre la temperatura de desenrollamiento del bG-CSF

Se prepararon disoluciones que contenían 0,5 mg/ml de bG-CSF en HEPES 1 M, HEPES 2 M, TES 1 M, TES 2M y TRICINE 1M; y 2 mg/ml de bG-CSF en HEPES 1 M, HEPES 2 M, TES 1 M, TES 2M y TRICINE 1M. Estas disoluciones de prepararon del mismo modo al descrito en el Ejemplo 1. Se preparó una disolución de control usando PBS (salino tamponado con fosfato de Dulbecco, pH 7,4). El pH de las disoluciones de bG-CSF era pH 7,5. La temperatura de desenrollamiento del bG-CSF se determinó mediante calorimetría diferencial de barrido (Microcal Inc., EE.UU.) usando una tasa de barrido de 60 grados por hora a un intervalo de temperatura de desde 20ºC hasta 90ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

4

La temperatura de desenrollamiento se usó como un marcador de la estabilidad de la disolución y de la estabilidad in vivo de las proteínas. Los resultados de la Tabla 6 indican que la temperatura de desenrollamiento (T_{m}) del bG-CSF formulado en tampones de HEPES, TES o TRICINE a concentraciones 1 M y mayores era significativamente mayor comparada con un control de PBS. Los tres tampones aumentaron la T_{m} en aproximadamente 2 a 11ºC. La concentración de tampón afectó sustancialmente al grado de incremento en la T_{m}. La T_{m} del bG-CSF aumentaba según aumentaba la concentración del tampón. Hubo un aumento de aproximadamente 3ºC cuando la concentración de HEPES aumentó desde 1 M hasta 2 M, y hubo un aumento de aproximadamente 5ºC cuando la concentración de TES aumentó desde 1 M hasta 2 M. Según aumentaba la concentración del bG-CSF, la T_{m} del bG-CSF disminuía. Hubo un descenso de aproximadamente 2ºC cuando la concentración de bG-CSF aumentó desde 0,5 mg/ml hasta 2 mg/ml, tanto en tampón de HEPES como de TES. La disolución con tampón de TES aumentó la T_{m} del bG-CSF en más de 11ºC a una concentración de tampón de 2 M y a una concentración de bG-CSF de 0,5 mg/ml.

Los resultados de la Tabla 6 muestran que los tres tampones (HEPES, TES y TRICINE) aumentan significativamente la T_{m} del bG-CSF comparados con PBS. El bG-CSF formulado en TES 2 M muestra la mayor estabilidad en disolución con relación a otros tampones.

Ejemplo 7 Comparación de la estabilidad del G-CSF humano y bovino de formulaciones en PBS y en HEPES

Se prepararon formulaciones de 0,15 mg/ml de hG-CSF y bG-CSF en salino tamponado con fosfato (PBS de Dulbecco, pH 7,4) y en tampón de HEPES 1 M (HEPES 1 M, pH 7,5). Las formulaciones se colocaron en viales de 1 ml (volumen de llenado de 400 ml) y se almacenaron a 40ºC durante 10 días. Las muestras se ensayaron cada tres días mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y se inspeccionaron visualmente.

La Figura 13 muestra que se observó una mejora significativa en la estabilidad del G-CSF humano cuando se formulaba en tampón de HEPES 1 M comparado con PBS. El G-CSF humano mostró una degradación durante 10 días a 40ºC cuando se formuló en PBS a pH 7,4, mientras que se observó un 65% de recuperación cuando se formuló en tampón de HEPES 1 M.

Las Figuras 13 y 14 muestran que el G-CSF bovino muestra una estabilidad un poco mejor tanto en formulaciones de HEPES como de PBS que el G-CSF humano. Se observó aproximadamente un 80% de recuperación de G-CSF bovino en la formulación con HEPES 1 M después de 10 días a 40ºC, mientras que se observó aproximadamente un 65% de recuperación de G-CSF humano. Ambas proteínas, G-CSF bovino y humano, son considerablemente más estables en tampón de HEPES 1 M que en PBS.

Ejemplo 8 Estabilidad de G-CSF humano y bovino en formulaciones con tampón de HEPES 1 M

Se prepararon formulaciones de 0,1 mg/ml de hG-CSF y bG-CSF en tampón de HEPES 1 M (HEPES 1 M, pH 7,5). Las formulaciones se colocaron en viales de 1 ml (volumen de llenado de 400 ml) y se almacenaron a 40ºC durante 10 días. Las muestras se ensayaron cada tres días mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y se inspeccionaron visualmente.

La Figura 15 muestra la estabilidad del G-CSF bovino y del G-CSF humano en formulaciones de HEPES 1 M. Hubo aproximadamente un 90% de recuperación de G-CSF bovino, y aproximadamente un 70% de recuperación de G-CSF humano, después de 10 días a 40ºC.

Ejemplo 9 Efecto del pH de la formulación sobre la estabilidad del bG-CSF

Se formularon formulaciones de disoluciones de bG-CSF de 0,1 mg/ml en tampones de HEPES 1 M y TES 1 M a pH 4,0 & 7,5. Las formulaciones se colocaron en viales de 1 ml (volumen de llenado de 400 ml) y se almacenaron a 40ºC durante 10 días. Las muestras se ensayaron cada tres días mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC).

Como se muestra en las Figuras 16 y 18, la recuperación del bG-CSF después de 10 días 40ºC fue de aproximadamente el 100% a pH 4,0, comparado con las Figuras 17 y 19, que muestran aproximadamente un 80-85% de recuperación observada cuando el bG-CSF se formuló a pH 7,5.

Ejemplo 10 Muestreo de seis meses del estudio de estabilidad térmica a largo plazo del bG-CSF en formulaciones con HEPES y TES 1,0 M

A continuación se dan las formulaciones incluidas en este estudio. Una formulación comercial de HEPES 1,0 M se obtuvo de GibcoBRL (lote nº 1016436), mientras que el TES 1,0 M se preparó a partir de un polvo obtenido de Fluka Scientific (lote nº RA12602). Los valores de pH de los tampones se ajustaron a 7,5. El bG-CSF fue proporcionado por Bioprocess (lote nº BP185-11) con una pureza del 53,3%.

Se prepararon formulaciones de bG-CSF de 0,1 mg/ml y 2,0 mg/ml en tampón de HEPES 1,0 M y de TES 1,0 M.

Para el almacenamiento de las muestras se emplearon viales de Flint de 3,5 ml de tipo 1 (lote nº R04105-7322) con tapones de 13 mm Gray T/F 1888 (lote nº R05619-7487) usando un volumen de llenado de 1,0 ml. En la Tabla 7 se da un resumen del almacenamiento de muestras y los puntos de extracción. Se almacenaron 5 viales de cada formulación para cada tiempo de ensayo.

TABLA 7 Resumen del almacenamiento de muestras y tiempos del análisis de potencia

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Las formulaciones de bG-CSF de 2,0 mg/ml se diluyeron diez veces antes de su análisis por HPLC.

Se tomaron tres muestras de cada formulación de cada cámara de almacenamiento (5, 30, 40ºC) y se analizaron mediante RP y SE HPLC para comprobar la potencia del bG-CSF. Cada muestra se ensayó tres veces. Las concentraciones se calcularon usando una curva estándar que se determinó previamente. Se determinaron los porcentajes (%) de las concentraciones iniciales de bG-CSF para cada análisis y se calculó una media para cada formulación a cada tiempo. El % medio inicial de las concentraciones de bG-CSF se representó gráficamente frente al tiempo para cada temperatura de almacenamiento para mostrar gráficamente el descenso en la potencia del bG-CSF. Las Figuras 20 y 21 son los resultados obtenidos mediante RP y SE HPLC, respectivamente, para las muestras almacenadas a 5ºC. Los resultados obtenidos para las muestras almacenadas a 30ºC se dan en las Figuras 22 y 23, mientras que aquellos obtenidos para las muestras almacenadas a 40ºC pueden encontrarse en las Figuras 24 y 25.

Hubo una pequeña degradación del bG-CSF de las muestras almacenadas a 5 y 30ºC, excluyendo la formulación proteica de 0,1 mg/ml en TES 1,0 M.

Ejemplo 11 Capacidad estabilizante del tampón HEPES sobre proteínas bioterapéuticas

Los valores de T_{m} de las proteínas de interés, discutidos a continuación, se determinaron tanto en tampón de fosfato como en tampón de HEPES usando un microcalorímetro Microcal, modelo VP-DSC. Se preparó un disolución de tampón de fosfato 25 mM usando Na_{2}HPO_{4} (lote nº 08019PQ) de Aldrich, y el pH se ajustó a 7,5. El tampón de HEPES 1,0 M (pH = 7,5, lote nº 1016436) se obtuvo de GibcoBRL. Los intercambios de tampón se consiguieron mediante una celda de ultrafiltración con agitación, modelo 8010 (Amicon, Inc.), en combinación bien con una membrana de ultrafiltración YM10 o YM30 Diaflo® (Amicon, Inc.), dependiendo del tamaño de la proteína.

Se reconstituyeron 2,0 mg de pST liofilizado (lote nº 41509-217-2) obtenido de Bioprocess en 2,0 ml de agua Milli-Q. Después de cinco intercambios, se transfirieron 1,0 ml de la proteína reconstituida a un tampón de fosfato 25 mM usando una membrana YM10. Los 1,0 ml remanentes se intercambiaron entonces en tampón de HEPES 1,0 M. Las muestras se prepararon a una concentración de proteína de 1,0 mg/ml, y después se analizaron por microcalorimetría. El análisis microcalorimétrico del pST se realizó dos veces tanto en tampón de fosfato como en tampón de HEPES.

Se obtuvieron aproximadamente 2,0 ml de NIF (lote nº 440631-22-7) de Bioprocess a una concentración de 2,97. La muestra recibida de Bioprocess se dividió en dos alícuotas. 1,0 ml de la proteína se intercambiaron en tampón de fosfato 25 mM, y el NIF remanente se intercambió en tampón de HEPES 1,0 M. En cada caso se emplearon cinco intercambios usando una membrana YM30. Las disoluciones se prepararon a una concentración de 1,0 mg/ml en el tampón adecuado, y los valores de T_{m} se determinaron mediante microcalorimetría.

Las proteínas bioterapéuticas estudiadas se indican en la Tabla 8 con sus respectivos valores de T_{m} que fueron determinados para tampones de fosfato y de HEPES.

TABLA 8 Resultados de T_{m} obtenidos en el estudio microcalorimétrico de cuatro proteínas bioterapéuticas en tampones de fosfato y de HEPES

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La Tabla 8 muestra que el tampón de HEPES proporciona una estabilidad aumentada tanto para NIF como para pST.

Ejemplo 12 Actividad prolongada in vivo del factor estimulante de colonias de granulocitos bovino recombinante (rbG-CSF) usando tampón de HEPES

El factor estimulante de colonias de granulocitos bovino (bG-CSF) se obtuvo de Bioprocess Research and Development - Pfizer (Groton, CT), el manitol de E.M. Industries (Hawthorne, NY), el salino tamponado con fosfato de Dulbecco 1X (PBS) de GibcoBRL (Grand Island, NY), el citrato sódico y el acetato sódico de Aldrich (Milwaukee, WI), el Tween-80, el cloruro sódico y el ácido clorhídrico de J. T. Baker (Phillipsburg, EE.UU.).

Cromatografía de exclusión por tamaños RP-HPLC (SEC)

Se monitorizó la estabilidad de la disolución mediante RP-HPLC y SEC. La RP-HPLC se realizó usando una columna Vidac, Protein C4, usando una fase móvil de TFA H20 al 0,1% (disolvente A) y TFA CAN al 0,1% (disolvente B). Tasa de flujo: 1 ml/min; detección UV: 220 nm; temperatura: 25ºC. La cromatografía de exclusión por tamaños se realizó usando una columna TosoHaas, TSK-GLE SW_{xl}, 7,8 mm ID X 30 cm. Fase móvil: NaCl 0,3 M en tampón de citrato 0,05 M, pH 5,75; tasa de flujo: 1 ml/min; detección UV: 280 nm; temperatura: 25ºC.

Microcalorimetría

Se midió la temperatura de desnaturalización (TD) usando un sistema VP DSC (MicroCal, Inc.). Se cargó aproximadamente 1 ml de la disolución en la celda, se analizó frente a una formulación placebo de referencia a una tasa de aproximadamente 10ºC/min.

Dicroísmo circular

La estructura secundaria del bG-CSF se monitorizó usando un espectroscopio de dicroísmo circular equipado con un accesorio de medición de la temperatura de barrido (CD*ORD, modelo J-710/720 - Japan Spectroscopic Co., LTD).

Bioensayo

Se determinó la actividad in vitro de las formulaciones de bG-CSF usando un ensayo de proliferación de células de médula ósea murinas (ensayo BMC). Las células de médula ósea se recogieron asépticamente a partir de fémures de ratones hembra CF1 (Charles River) extrayendo el fémur enjuagando cuidadosamente la médula del hueso usando una jeringa 3cc/23G y una disolución salina equilibrada de Hanks (Gibco BRL). La suspensión celular se filtró a través de un tamiz de nailon para eliminar los restos y después se centrífugo a 1100 rpm durante diez minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 15 ml de medio RPM1 (Gibco BRL) complementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco BRL), penicilinestreptomicina al 1% (10.000 unidades/ml), L-glutamina al 1% (Gibco BRQ). Las células de médula ósea se cuantificaron usando un Coulter Channelyzer 256, y la concentración celular se ajustó a un rendimiento de 6,67 x 10^{5} céls/ml. Se añadieron aproximadamente 10^{5} células a cada pocillo de un placa de 96 pocillos. Entonces se añadieron las formulaciones de factor estimulante de colonias de granulocitos a cada pocillo (por triplicado) a diversas concentraciones. Después de una incubación de 3 días a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 3 días, se añadió ^{3}H-timidina (New England Nuclear, Boston, Mass) a cada pocillo a una concentración final de 2\muCi/ml. Se dejó proceder el marcaje radiométrico durante al menos 18 horas a 37ºC (5% de CO_{2}). Las placas se congelaron a -20ºC, se descongelaron y las células se sembraron sobre rejillas de fibra de vidrio de 96 pocillos usando un cosechador celular Brandel (Biomedical Research and Development Laboratories, Gaithersburg, Maryland). La actividad se determinó usando un contador de líquido de centelleo Wallac 1205 Betaplate (Wallac, Gaithersburg, Maryland). La actividad de las formulaciones de bG-CSF se determinó dividiendo los recuentos de la muestra por minuto por lo recuentos medios de control por minuto (número de veces sobre el fondo). Una actividad de 3 o más veces sobre el fondo se consideró positiva.

Actividad in vivo del bG-CSF

La actividad in vivo de las formulaciones de bG-CSF se ensayó en terneros jóvenes mestizos con un peso corporal que varía aproximadamente desde 100 hasta 150 kg. Los terneros se adquirieron y se enviaron al Animal Health Research Centre en Terre Haute, Indiana, y se aclimataron a las instalaciones durante un periodo mínimo de dos días antes de ser asignados a un estudio. La mayoría de los terneros se usó para un estudio, se dejó reposar al menos una semana, y después se reasignó a un segundo estudio. Los terneros no se usaron para más de dos estudios. Antes de la asignación a un estudio, los terneros se prerrevisaron 1-3 días antes del inicio del estudio evaluando su temperatura rectal, peso corporal, salud general y recuentos y diferenciales de leucocitos totales (GB). En general, los terneros con temperaturas rectales \geq 104ºC y recuentos de GB totales de 4.000/mm^{3} ó 12.000/mm^{3} fueron excluidos de los estudios. En el día 0, se le sacó sangre a los terneros, y se pesaron antes del tratamiento. Se calculó una dosis de 24 \mug/kg de formulación de bG-CSF en el momento del tratamiento para cada ternero, basada en el peso corporal y administrada por vía subcutánea mediante una inyección en la región preescapular del cuello. Las muestras sanguíneas se recogieron en anticoagulante con EDTA para el cálculo de los GB/diferencial mediante venopunción en el cuello en unos tiempos determinados tras el tratamiento. Los recuentos totales de GB se realizaron con un contador celular hematológico Nova Celltrack I, usando una dilución 1:250 de sangre completa en un diluyente isotónico. Los recuentos diferenciales de GB se realizaron usando extensiones de sangre seca teñidas con un conjunto de tinción Diff-Quik (Dade). Se contaron y diferenciaron un total de 100 GB en un microscopio óptico Zeiss, con una lente 100x de inmersión en aceite y piezas oculares del objetivo de 12,5x (aumentos totales = 1.250x).

Efecto del pH y de la temperatura sobre la estabilidad de la disolución de bG-CSF

La Tabla 9 muestra el efecto de la temperatura sobre la estabilidad del bG-CSF. El impacto de la temperatura sobre la estabilidad de la disolución de bG-CSF se siguió mediante RP-HPLC, SEC-HPLC, bioensayo e inspección visual (formulación: 0,1 mg/ml de bG-CSF, manitol al 5%, tampón de acetato 10 mM, Tween-80 al 0,004%, pH 4,0). Según se aprecia en la Tabla 9, hay una discontinuidad en la estabilidad del bG-CSF a temperaturas de o por encima de 40ºC. Tanto por RPHPLC como por SEC-HPLC hay una pérdida del pico de la proteína parental a 40ºC y por encima. La desaparición del pico parentela a temperaturas superiores está seguido por un aumento en los particulados de la disolución. Esto se observó tanto visualmente como mediante monitorización por dispersión de la luz a 310 nm. Las disoluciones de G-CSF bovino que se almacenaron a 40ºC durante 3 semanas son 10-100 veces menos activas que a 5ºC y 30ºC. A 50ºC durante 3 semanas, el bG-CSF es 100-1.000 veces menos activo que las disoluciones almacenadas a 5 y 30ºC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 La estabilidad del bG-CSF en función de la temperatura (estabilidad de 3 semanas)

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Se usó dicroísmo circular (DC) para seguir el impacto de la temperatura sobre el bG-CSF. El espectro de DC del bG-CSF se ilustra en la Figura 26. El espectro sugiere que la estructura secundaria del bG-CSF en mayoritariamente una hélice alfa, similar a la del G-CSF humano, que es estructuralmente muy similar al bG-CSF. Los espectros de DC se examinaron a varias temperaturas con objeto de determinar la temperatura de desnaturalización (TD). La Figura 27 es una representación gráfica de la elipticidad molar a una longitud de onda de 222 nm (longitud de onda característica de una hélice alfa) en función de la temperatura. Entre 40ºC y 50ºC la elipticidad molar aumenta, indicando la pérdida de la estructura secundaria y la desnaturalización del bG-CSF.

También se evaluó el efecto del pH sobre la estabilidad de la disolución de bG-CSF. Con objeto de trazar únicamente el efecto del pH sobre la estabilidad, y no el impacto de desnaturalización debido a la temperatura, las disoluciones se almacenaron a 30ºC (TD del bG-CSF entre 40-50ºC). La Tabla 10 resume la estabilidad del bG-CSF en función del pH durante un periodo de 2 semanas a 30ºC. La tasa de pérdida de la actividad proteica aumenta según aumenta el pH. Los datos sugieren que a pH bajo se protona la cisteína del bG-CSF, y por tanto la formulación es más estable. A pH alto esta cisteína libre está implicada en reacciones de intercambio de disulfuro y son la causa más probable de inestabilidad.

TABLA 10 La estabilidad del bG-CSF en función del pH (estabilidad de 2 semanas a 30ºC).

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Efecto del tampón de HEPES sobre la estabilidad de la disolución de bG-CSF

Hemos observado que el bG-CSF formulado en tampón de HEPES 1 M a pH 7,5 mostraba una estabilidad de disolución mayor, incluso cuando se almacenaba a 40ºC durante varios días. Esto era inesperado, dado que previamente se sabía que el bG-CSF es inestable a pH neutro y se desnaturaliza a temperaturas de o por encima de 40ºC. La Figura 28 ilustra el efecto de la concentración del tampón de HEPES sobre la estabilidad de la disolución de bG-CSF a pH 7,5 y una temperatura de almacenamiento de 40ºC. La estabilidad del bG-CSF disminuyó significativamente según disminuía la concentración del tampón de HEPES. El efecto del HEPES 1M sobre la temperatura de desnaturalización (TD) del bG-CSF se determinó mediante microcalorimetría. La Figura 10, un termograma, compara la TD de las dos formulaciones (con y sin HEPES 1 M) del bG-CSF. En ausencia de tampón de HEPES, el establecimiento de la transición endotérmica es aproximadamente 40ºC, mientras que el bG-CSF formulado en HEPES 1 M tiene un establecimiento de la TD de alrededor de 50ºC. Un aumento de la temperatura de desnaturalización generalmente es indicativo de estabilización.

Actividad in vivo del bG-CSF

Evaluamos la actividad in vivo de esta formulación en vacas. La Figura 29, que es una representación gráfica del recuento de GB frente al tiempo, es una comparación del bG-CSF formulado en HEPES 1 M comparado con la formulación de "control". "Control" se refiere a la formulación que contiene manitol al 5%, tampón de acetato 10 mM, Tween 80, pH 4,0.

Como puede verse en la Figura 29, el recuento de GB permanece por encima del valor umbral del 200% del nivel de la línea base (nivel relacionado con la protección frente a infecciones) sólo durante aproximadamente 24-30 horas. Sin embargo, cuando el bG-CSF se formulaba en HEPES 1 M, los valores de PMN permanecen por encima del umbral durante un mínimo de 3 días o 72 horas (en algunos casos, los GB permanecían por encima del umbral durante casi una semana). Este estudio fue reproducible (en cada estudio se usaron 6 vacas por formulación). Los resultados de este estudio sugieren que el tampón de HEPES no sirve sólo como un estabilizante in vitro, sino que de alguna forma mejora el comportamiento in vivo del bG-CSF.

Los inesperados resultados observados con el tampón de HEPES sobre el comportamiento del bG-CSF impulsaron la investigación de tampones similares tales como MOPS, HEPPS, TES y TRICINE. Estos tampones también mostraron una estabilidad in vitro mejorada del bG-CSF, similar a la del tampón de HEPES. Se realizó un estudio in vivo donde se formuló bG-CSF en tampón de TES y en tampón de TRICINE, y ambas formulaciones dieron como resultado una actividad in vivo prolongada del bG-CSF en vacas, similar a la formulación de HEPES.

La formulación del bG-CSF en tampón de HEPES 1 M da como resultado una actividad prolongada del bG-CSF in vivo. Esta actividad prolongada puede ser un resultado de la estabilidad mejorada del bG-CSF en el lugar de inyección. La estabilidad de la disolución de bG-CSF a pH neutro y a una temperatura de 40ºC mejoró significativamente cuando el bG-CSF se formuló en HEPES 1 M. Otros tampones orgánicos, tales como MOPS, HEPPS, TES y TRICINE, también dieron como resultado una mejora en la estabilidad del bG-CSF.

Claims (22)

1. Una composición proteica estabilizada que comprende G-CSF y un tampón estabilizante elegido del grupo consistente es HEPES, TES y TRICINE.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la proteína se elige del grupo consistente en: G-CSF humano, G-CSF bovino y G-CSF canino.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que la proteína es G-CSF bovino.

4. La composición de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición está a un pH fisiológico.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición está a un pH de desde 4,0 hasta 7,5.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición está a una temperatura fisiológica.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición es capaz de mantener niveles terapéuticos de G-CSF durante un periodo prolongado de al menos tres días.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el periodo prolongado es de la menos tres días in vivo.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el G-CSF está presente a una concentración en el intervalo de 0,01 hasta 5 mg/ml.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tampón estabilizante está presente en una concentración que varía desde 0,05 M hasta 2 M.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tampón estabilizante es HEPES y está presente en una concentración de 1 M.

12. Una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de una composición proteica estabilizada para su administración parenteral a un mamífero, que comprende una composición según la reivindicación 1.

13. La forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 12, en la que la forma de dosificación comprende además un componente elegido del grupo consistente en modificadores de la viscosidad y tensioactivos.

14. La forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de las reivindicaciones 12 ó 13, en la que la proteína es G-CSF bovino, presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, y la composición está a un pH de aproximadamente 7,5.

15. La forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 14, en la que el tampón es HEPES, en la que el HEPES está presente a una concentración que varía desde 0,05 M hasta 2 M.

16. Un procedimiento para preparar una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de una composición proteica estabilizada para su administración parenteral a un mamífero, que comprende la etapa de combinar el G-CSF y un tampón estabilizante elegido del grupo consistente en, HEPES, TES y TRICINE.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la proteína es G-CSF bovino presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, y la composición está a un pH de 7,5.

18. El uso de una composición proteica estabilizada según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infecciones en mamíferos.

19. El uso de una composición proteica estabilizada según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la mastitis, la metritis o la enfermedad respiratoria bovina en el ganado.

20. El uso de una composición proteica estabilizada de la reivindicación 18 ó 19, en el que el G-CSF es G-CSF bovino presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, y la composición está a un pH de 7,5.

21. Un kit para administrar a un mamífero que comprende la composición proteica estabilizada que comprende un primer envase que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de G-CSF y un segundo envase que contiene un tampón estabilizante farmacéuticamente aceptable elegido del grupo consistente en HEPES, TES y TRICINE.

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22. El kit de la reivindicación 21, en el que la proteína es G-CSF bovino presente a una concentración en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml y la composición está a un pH de 7,5.