PL210795B1

PL210795B1 - Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247

Info

Publication number: PL210795B1
Application number: PL392749A
Authority: PL
Inventors: Selvaraj Naicker; Randall W. Yatscoff; Robert T. Foster; Mark Abel; Seetharaman Jayaraman; Hans-Jurgen Mair; Jeans-Michel Adam; Bruno Lohri
Original assignee: Isotechnika Inc
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2012-03-30
Also published as: EP1714977A3; US20130078280A1; CN1571795A; CA2461740A1; CY1105111T1; AU2002331509B2; NO20042031L; NO332459B1; US7141648B2; AU2010206069A1; JP5396571B2; DE60231570D1; KR101006206B1; DE60213115D1; HK1062568A1; BRPI0213658A8; EP1714977B1; HRP20040355B1; US7332472B2; IL186140A

Description

(22) Data zgłoszenia: 17.10.2002 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

370772 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

17.10.2002, PCT/CA02/001559 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

24.04.2003, WO03/33526 (51) Int.Cl.

C07K 7/64 (2006.01)

C07K 7/00 (2006.01)

A61K 38/13 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E),
₍₅₄₎ sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), ⁽⁵⁴⁾ sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej
syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247
	(73) Uprawniony z patentu: ISOTECHNIKA PHARMA INC., Edmonton, CA
(30) Pierwszeństwo:
19.10.2001, US, 60/346,201	(72) Twórca(y) wynalazku:
05.04.2002, US, 60/370,596	SELVARAJ NAICKER, Edmonton, CA
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	RANDALL W. YATSCOFF, Edmonton, CA ROBERT T. FOSTER, Edmonton, CA MARK ABEL, Edmonton, CA
03.01.2011 BUP 01/00	SEETHARAMAN JAYARAMAN, Edmonton, CA
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	HANS-JURGEN MAIR, Lorrach, DE JEANS-MICHEL ADAM, Reinach, CH BRUNO LOHRI, Reinach, CH
30.03.2012 WUP 03/12	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima

PL 210 795 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247 i sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247 (mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny, pokrewnych cyklosporynie A).

Uważa się, że mieszaniny ISATX247 odznaczają się zwiększoną skutecznością i/lub zmniejszoną toksycznością, w porównaniu z pojedynczymi izomerami oraz z występującymi w naturze i innymi obecnie znanymi cyklosporynami i pochodnymi cyklosporyn.

Pochodne cyklosporyny tworzą grupę cyklicznych polipeptydów składających się z jedenastu aminokwasów, wytwarzanych jako wtórne metabolity przez gatunek grzyba Tolypocladium inflatum Gams. Stwierdzono, że odwracalnie hamują one immunokompetentne limfocyty, zwłaszcza limfocyty T, w fazie G0 lub G1 cyklu komórkowego. Stwierdzono również, że pochodne cyklosporyny odwracalnie hamują wytwarzanie i uwalnianie limfokin (Granelli-Piperno i in., 1986). Chociaż znane są liczne pochodne cyklosporyny, to najszerzej stosuje się cyklosporynę A. Hamujące działania cyklosporyny A związane są z hamowaniem zdarzeń aktywacyjnych, w których pośredniczą komórki T. To hamowanie dokonywane jest przez wiązanie się cyklosporyny z wszechobecnym wewnątrzkomórkowym białkiem, cyklofiliną. Z kolei kompleks ten hamuje zależną od wapnia i kalmoduliny aktywność kalcyneuryny jako fosfatazy serynowo-treoninowej. Hamowanie kalcyneuryny zapobiega aktywacji czynników transkrypcyjnych, takich jak NFAT_p/c i NF-κΒ, koniecznych do indukcji genów cytokinowych (IL-2, IFN-γ, IL-4 i GM-CSF) podczas aktywacji komórek T. Cyklosporyna hamuje również wytwarzanie limfokiny przez komórki pomocnicze T in vitro i zatrzymuje rozwój dojrzałych komórek CD8 i CD4 w grasicy (Granelli-Piperno i in., 1986). Inne właściwości in vitro cyklosporyny obejmują hamowanie limfocytów T wytwarzających IL-2 i cytoksycznych limfocytów T, hamowanie IL-2 uwalnianych przez aktywowane komórki T, hamowanie spoczynkowych limfocytów T w odpowiedzi na aloantygeny i egzogenną limfokinę, hamowanie wytwarzania IL-1 oraz hamowanie aktywacji przez mitogen limfocytów T wytwarzających IL-2 (Granelli-Piperno i in., 1986).

Wykazano, że cyklosporyna jest silnym środkiem immunosupresyjnym tłumiącym odporność humoralną i reakcje immunologiczne za pośrednictwem komórek, takie jak odrzucanie aloprzeszczepów, opóźniona nadwrażliwość, doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zapalenie stawów wywołane adiuwantem Freunda i reakcja przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Stosuje się ją do profilaktyki w celu zapobieżenia odrzucania narządów po przeszczepach narządów; do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów; do leczenia łuszczycy; oraz do leczenia innych chorób autoimmunologicznych, w tym cukrzycy typu I, choroby Crohna, tocznia i tym podobnych chorób.

Od odkrycia cyklosporyny wyodrębniono i zidentyfikowano bardzo wiele różnych cyklosporyn występujących w naturze, a także wiele cyklosporyn wytworzono na drodze pełnej lub częściowej syntezy albo z zastosowaniem zmodyfikowanych metod hodowli. Grupa obejmująca cyklosporyny jest zatem obecnie grupą znaczącą i obejmuje np. występujące w naturze cyklosporyny A do Z [Traber i in., (1977); Traber i in., (1982); Kobel i in., (1982); oraz von Wartburg i in., (1986)], jak również różne nie występujące w naturze pochodne cyklosporyny oraz nienaturalne lub syntetyczne cyklosporyny, w tym dihydro- i izocyklosporyny; pochodne cyklosporyn (np., w których atom 3'-O grupy -MeBmt- jest acylowany lub inny podstawnik jest wprowadzony przy atomie węgla, α w grupie sarkozylowej w pozycji 3); cyklosporyny, w których grupa -MeBmt- występuje w postaci izomerycznej (czyli w której konfiguracja pomiędzy pozycjami 6' i 7' grupy -MeBmt- jest raczej cis, a nie trans); oraz cyklosporyny, w których alternatywne aminokwasy są wprowadzone w określonych pozycjach sekwencji peptydowej, z wykorzystaniem np. totalnej syntezy cyklosporyn opracowanej przez R. Wengera, patrz np. Traber i in. (1977), Traber i in. (1982) oraz Kobel i in. (1982); opisy patentowe US nr 4 108 985, 4 210 581, 4 220 641, 4 288 431, 4 554 351 i 4 396 542; europejskie opisy patentowe nr 0 034 567 i 0 056 782; publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 86/02080; Wenger (1983); Wenger (1985); oraz Wenger (1986). O analogach cyklosporyny A zawierających zmodyfikowane aminokwasy w pozycji 1 doniósł Rich i in. (1986). Immunosupresyjne, przeciwzapalne i przeciwpasożytnicze anologi cyklosporyny A opisano w opisach patentowych US nr 4 384 996, 4 771 122, 5 284 826 i 5 525 590 (uprawniony Sandoz). Dodatkowe analogi cyklosporyny ujawniono w nr WO 99/18120 (uprawniony Isotechnika Inc.).

PL 210 795 B1

Obserwuje się liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, w tym nefrotoksyczność, toksyczność w stosunku do wątroby, powodowanie zaćmy, nadmierne owłosienie, paratezję i rozrost dziąseł (Sketris i in., 1995). Z wymienionych, jednym z najpoważniejszych działań niepożądanych jest nefrotoksyczność, zależna od wielkości dawki podawanej cyklosporyny A. Leki o natychmiastowym uwalnianiu cyklosporyny A (np. Neoral^® i Sandimmune^®) mogą powodować nefrotoksyczność i inne toksyczne działania uboczne, ze względu na szybkie uwalnianie i wchłanianie, a zatem i wysokie stężenie leku we krwi. Postuluje się, że działania uboczne związane są z maksymalnymi stężeniami leku (Bennett, 1998). Dokładny mechanizm powodowania przez cyklosporynę A uszkodzeń nerek nie jest znany. Jednakże, wysunięto hipotezę, że wzrost poziomu substancji zwężających naczynia w nerkach prowadzi do zwężenia doprowadzających tętniczek kłębkowych. Rezultatem tego może być niedokrwienie nerek, zmniejszenie szybkości filtracji kłębkowej i w długim okresie zwłóknienie śródmiąższowe. Jeśli dawka jest zmniejszana lub cyklosporyna zastępowana jest innym środkiem immunosupresyjnym, to działanie nerek ulega poprawie (Valantine i Schroeder, 1995).

W zwią zku z tym, istnieje zapotrzebowanie na skuteczne ś rodki immunosupresyjne o zmniejszonej toksyczności.

Analogi cyklosporyny zawierające zmodyfikowane aminokwasy w pozycji 1 ujawniono w WO nr 99/18120 (uprawnieni Isotechnika Inc. i Hoffmann-La Roche, Ltd.). Również w WO nr 03/033527 (uprawnieni Isotechnika Inc. i Hoffmann-La Roche, Ltd.) ujawniono szczególnie korzystny analog cyklosporyny A oznaczony jako „ISATX247”. Analog ten jest strukturalnie identyczny z cyklosporyną A, z wyjątkiem modyfikacji grupy aminokwasowej w pozycji 1. Stwierdzono, że pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn. Ujawniono również pewne alkilowane, arylowane i deuterowane pochodne ISATX247.

Typowo, mieszaniny ujawnione w WO nr 03/033527 zawierają około 10-90% wag. izomeru trans i około 90-10% wag. izomeru cis. W innej postaci mieszanina zawiera około 15-85% wag. izomeru trans i około 85-15% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 25-75% wag. izomeru trans i około 75-25% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 35-65% wag. izomeru trans i około 65-35% wag. izomeru cis; w innej postaci mieszanina zawiera około 45-55% wag. izomeru trans i około 55-45% wag. izomeru cis. W jeszcze innej postaci mieszanina izomerów jest mieszaniną ISATX247, zawierającą około 45-50% wag. izomeru trans i około 50-55% wag. izomeru cis. Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa. W alternatywnej nomenklaturze izomer cis można określić jako izomer (Z), a izomer trans można nazwać izomerem (E).

W zwią zku z tym, istnieje zapotrzebowanie na sposoby wytwarzania analogów cyklosporyny, w tym izomerów ISATX247. Potrzebne są szlaki syntetyczne prowadzą ce do wytworzenia kompozycji wzbogaconych w poszczególne izomery, jak również mieszanin izomerów o pożądanym stosunku dwóch izomerów. Potrzebne są także sposoby wytwarzania pochodnych ISATX247.

Cyklosporyna i jej analogi należą do klasy cyklicznych polipeptydów o silnym działaniu immunosupresyjnym. Pomimo wielu korzyści, jakie oferują te leki ze względu na ich działanie immunosupresyjne, przeciwzapalne i przeciwpasożytnicze, występują liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, obejmują ce nefrotoksyczność i toksyczność w stosunku do wą troby. Z tego względu istnieje zapotrzebowanie na nowe środki immunosupresyjne o takim samym działaniu farmakologicznym, jakie wykazuje występująca w naturze cyklosporyna A, ale bez towarzyszących toksycznych działań ubocznych.

Zgodnie z wynalazkiem uzyskano pewne mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, które są farmaceutycznie użyteczne. Mieszaniny izomerów ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn.

Wynalazek opiera się częściowo na ustaleniu, że pewne mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny zapewniają doskonałe działanie immunosupresyjne, bez niepożądanych działań związanych z cyklosporyną A. W szczególności, nieoczekiwanie stwierdzono, że mieszaniny izomerów (czyli mieszaniny izomerów cis i trans) w stosunku od około 10:90 do około 90:10 (trans do cis) analogów cyklosporyny ze zmodyfikowaną grupą aminokwasową w pozycji 1 zapewniają doskonałą skuteczność i bezpieczeń stwo. Przykł ady takich analogów ujawniono w WO nr 99/18120 i obejmują zwią zki deuterowane i niedeuterowane. Stwierdzono w szczególności, że wyjątkowo skuteczne są mieszaniny

PL 210 795 B1 o stosunku okoł o 45:55 do około 50:50 (trans do cis) oraz zawierają ce okoł o 50-55% izomeru trans i okoł o 45-50% izomeru cis. Ponadto wykazano, ż e te mieszaniny izomerów odznaczają się jednocześnie doskonałą skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn i pochodnych cyklosporyn.

Szczególny analog (określany tu jako „ISATX247”) jest strukturalnie podobny do cyklosporyny A, z wyją tkiem zmodyfikowanej grupy funkcyjnej na obrzeż u czą steczki, w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Strukturę tej konkretnej mieszaniny izomerycznych analogów, w porównaniu do struktury cyklosporyny A, przedstawiono na fig. 1A, 1B, 2A i 2B.

Mieszaniny izomerów mogą być stosowane między innymi do immunosupresji i pomocy w różnych immunologicznych zaburzeniach, chorobach i stanach, w tym w profilaktyce, ograniczaniu, łagodzeniu i leczeniu.

Izomery ISATX247 (i ich pochodne) można syntetyzować stereoselektywnymi sposobami, mogącymi różnić się stopniem selektywności. Stereoselektywnymi sposobami otrzymuje się kompozycje wzbogacone w izomer (E) lub (Z), przy czym kompozycje te można łączyć ze sobą w taki sposób, że powstała mieszanina ma pożądany stosunek dwóch izomerów. Alternatywnie, warunki reakcji stereoselektywnej syntezy można dostosować tak, aby otrzymać pożądany stosunek bezpośrednio w wytwarzanej mieszaninie. Procentową zawartość jednego lub drugiego izomeru można sprawdzić metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub innymi znanymi metodami.

Każdy ze szlaków typowo przebiega z zastosowaniem grupy zabezpieczającej wrażliwą alkoholową grupę funkcyjną. W jednej z postaci alkohol zabezpiecza się jako octan. W innych postaciach grupami zabezpieczającymi są ugrupowania estrów benzoesanowych lub eterów sililowych. Chociaż octanowe grupy zabezpieczające są powszechnie stosowane, należy zwrócić uwagę, że w wielu przykładowych opisanych postaciach można uniknąć pewnych niepożądanych reakcji ubocznych związanych z octanową grupą zabezpieczającą, przez użycie grup zabezpieczających, takich jak ugrupowania estrów benzoesanowych lub eterów sililowych.

Zabezpieczony związek może następnie służyć jako prekursor dla różnych stereoselektywnych sposobów syntezy, w tym syntez z zastosowaniem reagentów zawierających fosfor, biorących udział w reakcji Wittiga oraz pierwiastków nieorganicznych wchodzących w skład reagentów metaloorganicznych. Ten drugi typ może przebiegać przez sześcioczłonowe pierścieniowe stany przejściowe, w których zawada przestrzenna decyduje o rezultacie konfiguracyjnym. Dostę pnych jest wiele reagentów metaloorganicznych, w tym cechujących się obecnością pierwiastków, takich jak bor, krzem, tytan, lit i siarka. Poszczególne izomery mogą być wytworzone z pojedynczego prekursora lub z wielu prekursorów.

Stosunek izomerów (E) do (Z) w dowolnej mieszaninie, niezależnie czy wytwarzanej stereoselektywnie, czy nie-stereoselektywnie, może przyjmować szeroki zakres wartości. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 10-90% wag. izomeru (E) i około 90-10% wag. izomeru (Z). W innych postaciach mieszanina może zawierać około 15-85% wag. izomeru (E) i około 85-15% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 25-75% wag. izomeru (E) i około 75-25% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 35-65% wag. izomeru (E) i około 65-35% wag. izomeru (Z). W innej postaci mieszanina zawiera około 45-55% wag. izomeru (E) i około 55-45% wag. izomeru (Z). W jeszcze innej postaci mieszanina izomerów jest mieszaniną ISATX247, zawierając ą około 45-50% wag. izomeru (E) i około 50-55% wag. izomeru (Z). Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi s ł owy, mieszanina mo ż e zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), charakteryzującego się tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (E) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z reagentem wybranym z grupy obejmującej estry Y-(trialkilosililoalliloboronianowe i związki E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkiloborowe, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu, z wytworzeniem acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E)

ISATX247.

PL 210 795 B1

Korzystnie, β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas Lewisa.

Korzystnie, w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.

Korzystnie, jako ester Y-(trialkilosililoallilo)boronianowy stosuje się ester trimetylosililoalliloboronianowy.

Korzystnie, jako E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkilobor stosuje się (E-Y-trimetylosililoallilo)-9-BBN.

Korzystnie jako reagent stouje się E-Y-(trimetylosililoallilo)dietylobor.

Korzystnie 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, acetylo-1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.

Korzystnie aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.

Korzystnie, etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.

Korzystnie, stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.

Korzystnie, stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), charakteryzującego się tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (Z) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z reagentem wybranym z grupy obejmującej estry Y-(trialkilosililoallilo)boronianowe i związki E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkiloborowe, z wytworzeniem β-trialkilosiloalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.

Korzystnie, β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorek sodu i wodorek potasu.

Korzystnie, jako reagent stosuje się E-Y-(trimetylosililoallilo)dietylobor.

PL 210 795 B1

Korzystnie, 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), charakteryzującego się tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (E) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z litowanym tlenkiem allilodifenylofosfiny, z wytworzeniem acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

b) acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E)

ISATX247.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

PL 210 795 B1

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z [3-(difenylofosfino)allilo]tytanem, z wytworzeniem związku pośredniego zawierającego tytan;

b) umożliwia się przeprowadzenie związku pośredniego zawierającego tytan w erytro-a-addukt;

c) erytro-a-addukt przeprowadza się w sól β-oksydofosfoniową przez podziałanie jodometanem;

d) sól β-oksydofosfoniową przeprowadza się w acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien; oraz

e) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, charakteryzującego się tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A poddaje się reakcji z E-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu; oraz

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu, z wytworzeniem izomeru (E) ISA_TX247.

Korzystnie, stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas

Lewisa.

Korzystnie jako kwas stosuje się BF3.

Korzystnie E-Y-(trialkilosililoallilo)bor wytwarza się w etapach, w których:

a) allilotrialkilosilan odprotonowuje się z użyciem zasady; oraz

PL 210 795 B1

b) odprotonowany allilotrialkilosilan poddaje się reakcji z dialkiloalkoksyborem i kwasem Lewisa. Korzystnie, jako dialkiloalkoksybor stosuje się dietylometoksybor, a jako kwas Lewisa stosuje się BF3.

Korzystnie, jako allilotrialkilosilan stosuje się allilotrimetylosilan.

Korzystnie, do odprotonowania allilotrialkilosilanu jako zasadę stosuje się butylolit.

Korzystnie, trimetylosililo(TMS)cyklosporynę A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A; oraz

b) (TMS)cyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A.

Korzystnie, w ozonolizie stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dichlorometan oraz mieszaninę dichlorometanu i niższego alkoholu.

Korzystnie, jako niższy alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol. Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Wynalazek dotyczy również sposobu stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247, charakteryzującego się tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A poddaje się reakcji z E-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem TMS-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) odbezpiecza się TMS-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247. Korzystnie, E-Y-(trialkilosililoallilo)bor wytwarza się w etapach, w których:

a) allilotrialkilosilan odprotonowuje się zasadą; oraz

Korzystnie, jako allilotrialkilosilan stosuje się allilotrimetylosilan.

Korzystnie, β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu i niższe alkoholany metali alkalicznych.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się t-butanolan potasu.

Korzystnie, odbezpieczanie prowadzi się z użyciem kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas chlorowodorowy, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas Lewisa i reagenty na bazie HF.

Korzystnie, stosuje się reagent na bazie HF wybrany z grupy obejmującej fluorek tributyloamoniowy i fluorek potasu.

Korzystnie trimetylosililo(TMS)cyklosporynę A wytwarza się w etapach, w których:

PL 210 795 B1

Korzystnie, jako niższy alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Wynalazek dotyczy także sposobu stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, charakteryzującego się tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z e-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

c) acetylo-(E)-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E) ISATX247.

Korzystnie, jako reagent borowy stosuje się E-Y-(trimetylosililoallilo)dietylobor.

Korzystnie, stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas Lewisa.

Korzystnie, jako kwas stosuje się kwas siarkowy.

Korzystnie, 1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.

Korzystnie, stosuje się zasadę wybraną z grupy obejmującej NH3 i dimetyloaminę.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

PL 210 795 B1

Wynalazek dotyczy też sposobu stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247, charakteryzującego się tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny poddaje się działaniu halogenku 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosfoniowym w obecności pierwszej zasady, z wytworzeniem acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy;

b) acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminę poddaje się działaniu środka utleniającego, z wytworzeniem tlenku acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy;

c) ogrzewa się tlenek acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy w procesie eliminacji Cope'a, z wytworzeniem acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

d) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu drugiej zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.

Korzystnie, jako pierwszą zasadę stosuje się heksametylodisilazydek potasu.

Korzystnie, jako reagent utleniający stosuje się kwas m-chloronadbenzoesowy.

Korzystnie, stosuje się drugą zasadę wybraną z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.

Korzystnie, jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.

Korzystnie, jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.

Korzystnie, jako alkohol stosuje się metanol.

Korzystnie, aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

Korzystnie, etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247, charakteryzującego się tym, że obejmuje szlak syntezy, w którym tak wytwarza się izomer (E) i izomer (Z) ISATX247, że izomer (E) i izomer (Z) są obecne w mieszaninie w ustalonym stosunku, przy czym szlak syntezy obejmuje etapy, w których:

a) zabezpiecza się β-alkohol aminokwasu w pozycji 1 cyklosporyny A;

b) utlenia się zabezpieczoną cyklosporynę A, z wytworzeniem aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A;

c) przeprowadza się aldehyd zabezpieczonej cyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) zabezpieczonego 1,3-dienu, poddając reakcji aldehyd zabezpieczonej cyklosporyny A z ylidem fosforowym drogą reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz

d) wytwarza się mieszaninę izomerów (E) i (Z) przez odbezpieczenie zabezpieczonego 1,3-dienu.

PL 210 795 B1

Korzystnie, grupę β-alkoholową aminokwasu w pozycji 1 cyklosporyny A zabezpiecza się drogą reakcji z reagentem, z wytworzeniem zabezpieczonej cyklosporyny A wybranej z grupy obejmującej estry octanowe, estry benzoesanowe, podstawione estry benzoesanowe, etery i etery sililowe.

Korzystnie, stosunek izomerów w mieszaninie izomerycznej mieści się w zakresie 45-55% wagowych izomeru (E) i 55-45% wagowych izomeru (Z), w przeliczeniu na całkowitą masę mieszaniny.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania mieszaniny izomerów ISATX247 o ustalonym składzie, charakteryzującego się tym, że:

a) wytwarza się pierwszy składnik wzbogacony w izomer (E) ISATX247 sposobem określonym powyżej;

b) wytwarza się drugi składnik wzbogacony w izomer (Z) ISATX247 sposobem określonym powyżej; oraz

c) miesza się pierwszy i drugi składnik w ustalonym stosunku, z wytworzeniem żądanej kompozycji izomerów.

Synteza

Cyklosporyna i jej analogi są przedstawicielami klasy związków typu cyklicznych polipeptydów o silnym działaniu immunosupresyjnym. Pomimo wielu korzyści, jakie oferują te leki pod względem ich działania immunosupresyjnego, przeciwzapalnego i przeciwpasożytniczego, występują liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, obejmujące nefrotoksyczność i toksyczność w stosunku do wątroby. W związku z tym, istnieje zapotrzebowanie na nowe środki immunosupresyjne o takim samym działaniu farmakologicznym, jakie wykazuje występująca w naturze cyklosporyna A, ale bez związanych z nią toksycznych działań ubocznych.

Poprzednio ujawniono analog cyklosporyny oznaczony jako „ISATX247”. Analog ten jest strukturalnie podobny do cyklosporyny A, z wyjątkiem modyfikacji grupy aminokwasowej w pozycji 1. Stwierdzono, że pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i zmniejszoną toksycznością, w porównaniu z występującymi w naturze i znanymi obecnie cyklosporynami.

Izomery ISATX247 (i ich pochodne) można syntetyzować stereoselektywnymi sposobami, mogącymi różnić się stopniem selektywności. Stereoselektywnymi sposobami wytwarza się kompozycje wzbogacone w jeden z izomerów (E) i (Z), przy czym kompozycje te można łączyć ze sobą w taki sposób, że otrzymana mieszanina ma pożądany stosunek ilościowy tych dwóch izomerów. Alternatywnie, warunki reakcji stereoselektywnego szlaku można dostosować w celu bezpośredniego wytwarzania mieszaniny o pożądanym stosunku.

Nazwa chemiczna immunosupresyjnego analogu cyklosporyny wytwarzanego sposobem według wynalazku, zwanego ISATX247, brzmi cyklo{{E,Z)-(2S,3R,4R)-3-hydroksy-4-metylo-2-(metyloamino)-6,8-nonadienoilo}-L-2-aminobutyrylo-N-metyloglicylo-N-metylo-L-leucylo-L-walilo-N-metylo-L-leucylo-L-alanylo-D-alanylo-N-metylo-L-leucylo-N-metylo-L-leucylo-N-metylo-L-walil}. Związek ten ma wzór empiryczny C63H111N11O12 i masę cząsteczkową około 1214,85. Symbol „ISATX247” jest oznaczeniem handlowym tego aktywnego farmakologicznie związku.

Strukturę ISATX247 potwierdzono głównie metodą spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Zarówno widma ¹H, jak i ¹³C przyporządkowano stosując serię jedno- i dwuwymiarowych eksperymentów NMR i przez porównanie ze znanym przyporządkowaniem widma NMR dla cyklosporyny A. Bezwzględne konfiguracje izomerów (E) i (Z) ISATX247 potwierdzono eksperymentami z jądrowym efektem Overhausera (NOE). Dodatkowe dowody potwierdzające uzyskano na podstawie spektralnej analizy masowej, która potwierdziła masę cząsteczkową, i na podstawie widma w podczerwieni, które było bardzo podobne do widma cyklosporyny A. Tego drugiego rezultatu należało oczekiwać, ze względu na podobieństwo obu tych związków.

Strukturę cyklosporyny A zilustrowano na fig. 1A. Struktura obejmuje identyfikację 11 grup aminokwasowych tworzących w cząsteczce pierścień cyklicznego peptydu. Tych 11 grup aminokwasowych oznaczono numerami rosnącymi zgodnie z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, poczynając od aminokwasu pokazanego pośrodku u góry pierścienia (i identyfikowanego jako „aminokwas 1”). Dla przejrzystości, pierwszy aminokwas obramowany jest ramką utworzoną przez linię przerywaną. Boczny łańcuch aminokwasu 1 narysowano w sposób odzwierciedlający jego strukturę chemiczną, gdyż zazwyczaj w tym miejscu zachodzą opisywane reakcje syntezy. Zwyczajowo atom węgla sąsiadujący z grupą karbonylową aminokwasu oznaczany jest jako atom węgla α, z kolejnymi literami alfabetu greckiego użytymi do oznaczania sąsiadujących atomów węgla wzdłuż łańcucha, poczynając od pierścienia peptydowego. Jak pokazano na fig. 1A, w przypadku cyklosporyny A z atomem węgla β łańcu12

PL 210 795 B1 cha bocznego związana jest grupa hydroksylowa, a zorientowane trans wiązanie podwójne znajduje się pomiędzy atomami węgla ε i ζ łańcucha bocznego.

Inną schematyczną strukturę cyklosporyny A pokazano na fig. 1B, gdzie różne części cząsteczki obramowano ramką utworzoną linią przerywaną. Rysunek ten definiuje nomenklaturę stosowaną w tym opisie, gdzie określenie „CsA” odnosi się do części cyklosporyny A ograniczonej ramką. Nomenklatura ta dostarcza skrótowych środków obrazowania rejonu, w którym zachodzą opisywane reakcje (tj. bocznego łańcucha grupy aminokwasowej w pozycji 1, narysowanego poza ramką utworzoną przez linię przerywaną na fig. 1B), bez konieczności ponownego rysowania pozostałej części cząsteczki za każdym razem opisywania reakcji. Dla fachowców jest oczywiste, że wiązanie pomiędzy atomami węgla α i β łańcucha bocznego ma normalną długość i jest ona przesadzona tylko na tym rysunku, w celu ułatwienia zdefiniowania określenia „CsA”.

Jak stwierdzono powyżej, szczególny analog cyklosporyny A jest oznaczony jako ISATX247, a jego dwa stereoizomery E (czyli trans) i Z (czyli cis), przedstawiono odpowiednio na fig. 2A i 2B. Konfiguracja cis lub trans tych stereoizomerów dotyczy konfiguracji podwójnego wiązania pomiędzy atomami węgla ε i ζ łańcucha bocznego, czyli podwójnego wiązania bliżej pierścienia peptydowego, w przeciwieństwie do podwójnego wiązania znajdującego się na końcu łańcucha.

Poniżej podano kilka dodatkowych uwag dotyczących nomenklatury stereochemicznej. W opisie określenia cis i (Z) stosowane są wymiennie, podobnie jak wymiennie stosowane są określenia trans i (E). Stosowanie określeń „erytro” i „treo” będzie ograniczone do minimum, ze względu na oczywiste zamieszanie w literaturze dotyczące znaczenia tych określeń. Patrz R. W. Hoffmann i H. -J. Zei w „Stereoselective synthesis of Alcohols. 8. Diastereoselective Synthesis of β-Methylhomoallyl Alcohols via Crotylboronates”, J. Org. Chem., tom 46, str. 1309-1314 (1981); A. Streitwieser i C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2 wydanie (Macmillan, New York, 1981), str. 845-846; oraz M. B. Smith i J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), str. 144-147. W kilku przypadkach, gdy stosuje się tutaj terminologię treo/erytro stosowana jest konwencja Streitwiesera i Heathcocka, gdzie izomer „erytro” dotyczy konfiguracji (R,S) i (S,R), a izomer „treo” dotyczy konfiguracji (R,R) i (S,S).

Ostatnie wyjaśnienie związane z nomenklaturą dotyczy końcowego wiązania podwójnego węgiel-węgiel pokazanego na fig. 2A i 2B. W alternatywnym schemacie numeracji węgle w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej w pozycji 1 mogą być numerowane poczynając od węgla końcowego (θ) w kierunku do pierścienia peptydowego. W tym układzie izomery ISATX247 mogą być traktowane jako 1,3-dieny, zgodnie z konwencjonalną nomenklaturą chemii organicznej, gdzie każde wiązanie podwójne identyfikowane jest swoim najniżej numerowanym węglem.

Poniżej omówiono schematy syntezy przedstawione na fig. 3-8. Zgodnie z postaciami wynalazku, mieszaniny izomerów można wytwarzać bezpośrednio, jeśli warunki reakcji konkretnego szlaku syntezy dostosowane są tak, aby osiągnąć pożądany stosunek izomerów w mieszaninie. Alternatywnie, można wytwarzać kompozycje wzbogacone w jeden z dwóch izomerów geometrycznych analogu cyklosporyny A i kompozycje te łączyć w ustalonym stosunku w celu otrzymania żądanej mieszaniny.

Przegląd szlaków syntezy, zgodnych z postaciami wynalazku przedstawiono na fig. 3, przy czym szczególny nacisk położono na pogrupowanie szlaków reakcji, według ich chemizmu i stereoselektywności. Na fig. 3 szlaki syntetyczne, w których wykorzystuje się reakcję Wittiga, pokazano ogólnie po prawej stronie schematu i oznaczono numerem odniesienia 31, podczas gdy szlaki 32 i 33, w których stosuje się reagenty metaloorganiczne tworzące, jak się sądzi, sześcioczłonowe pierścienie w stanie przejściowym, pokazano pośrodku i po lewej stronie schematu. Każdy ze szlaków syntezy może prowadzić do otrzymania mieszaniny izomerów lub kompozycji wzbogaconych w jeden z dwóch izomerów.

Postacie wynalazku dotyczą różnych sposobów otrzymywania żądanej mieszaniny izomerów. Elastyczność i różnorodność strategii syntezy ujawnionych w wynalazku może być częściowo odzwierciedlona w symetriach i asymetriach fig. 3. Wspólną reakcją dla wszystkich szlaków jest zabezpieczanie funkcyjnej grupy cyklosporyny A 34. W tej przykładowej postaci reakcję i stanowi przemiana cyklosporyny A 34 w acetylocyklosporynę A 35. Asymetrię na fig. 3 stanowi stosowanie aldehydu acetylocyklosporyny A 51 jako prekursora dla wszystkich szlaków z użyciem tytanowych lub litowych reagentów metaloorganicznych, ale tylko dla niektórych szlaków z zastosowaniem reakcji Wittiga z odczynnikiem zawierającym fosfor.

Ogólnie, w szlakach syntezy na fig. 3, których warunki reakcji mogą być dostosowane do wytwarzania mieszaniny o żądanym stosunku izomerów, w reakcji Wittiga wykorzystuje się reagenty

PL 210 795 B1 zawierające fosfor. W innych stereoselektywnych szlakach wykorzystuje się również nieorganiczne pierwiastki, zwykle wchodzące w skład reagentów metaloorganicznych, działających poprzez sześcioczłonowe pierścieniowe stany przejściowe, w których zawada przestrzenna decyduje o konfiguracyjnym rezultacie reakcji. W realizacji wynalazku przydatne są liczne reagenty metaloorganiczne, w tym związki pierwiastków nieorganicznych, takich jak bor, krzem, lit i siarka.

Kompozycje wzbogacone w jeden lub drugi z pary izomerów można wytwarzać z jednego prekursora. Alternatywnie, dwie kompozycje można wytwarzać z różnych prekursorów. W jednym ze stereoselektywnych szlaków fig. 3 (szlak 32) jeden prekursor prowadzi do otrzymania obu izomerów ISA_TX247, w zależności od wybranych warunków reakcji. W innym szlaku stereoselektywnym (szlak 33) potrzebne są dwa różne prekursory do wytworzenia każdej ze wzbogaconych kompozycji.

Poniżej omówiono szczegółowo reakcje z fig. 3. Reakcją wspólną dla każdego szlaku jest zabezpieczanie alkoholu w pozycji β bocznego łańcucha grupy aminokwasowej w pozycji 1. Taki schemat zabezpieczania dotyczy problemu zwykle spotykanego w syntezie organicznej, gdy pierwsza grupa funkcyjna zostaje w niezamierzony sposób modyfikowana w reakcji przeznaczonej dla (podobnej i/lub identycznej) drugiej grupy funkcyjnej, zlokalizowanej w innym miejscu cząsteczki. W celu zrealizowania tego schematu pierwszą funkcyjną grupę poddaje się reakcji z grupą zabezpieczającą, przeprowadza się pożądaną reakcję drugiej grupy funkcyjnej, a następnie usuwa się grupę zabezpieczającą z pierwszej grupy funkcyjnej.

Grupy zabezpieczające są dobrze znane w syntezie organicznej i zostały omówione przez J. R. Hansona w rozdziale 2, „The Protection of Alcohols” w publikacji Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, Anglia, 1999), str. 24-25. Hanson opisuje jak zabezpieczać grupy hydroksylowe przez przeprowadzanie ich w estry albo w etery. Estry octanowe są prawdopodobnie najczęściej używanym typem chemicznego zabezpieczania grup hydroksylowych. Zakres warunków, jakie można zastosować do wprowadzania grup octanowych, jest bardzo szeroki. Reagentami i rozpuszczalnikami są bezwodnik octowy i pirydyna; bezwodnik octowy, pirydyna i dimetyloaminopirydyna (DMAP); bezwodnik octowy, i octan sodu; bezwodnik octowy, i kwas p-toluenosulfonowy, chlorek acetylu, pirydyna, i DMAP; oraz keten. DMAP jest użytecznym katalizatorem acylowania, ze względu na tworzenie z bezwodnika bardzo reaktywnej soli N-acylopirydyniowej.

β-Alkohol cyklosporyny A 34 można zabezpieczyć jako octan, drogą reakcji związku 34 z chlorkiem acetylu, octanem etylu lub z ich mieszaniną, w wyniku czego tworzy się acetylocyklosporyna A 35. Alternatywnie, β-alkohol poddaje się nukleofilowej addycji do bezwodnika octowego, w wyniku czego tworzy się acetylocyklosporyna A 35 i kwas octowy. Reakcje te można prowadzić w obecności dimetyloaminopirydyny (DMAP), przy czym nadmiar bezwodnika octowego pełni rolę rozpuszczalnika. W tych przypadkach przedrostek „acetylo” może być używany w nazwach przez cały szlak syntezy lub do usunięcia grupy acetylowej. Przykładowo, w jednym ze szlaków ostatni związek pośredni mający grupę acetylową przy atomie węgla β nazywany jest „acetylo-(E)-1,3-dienem”.

Chociaż wytwarzanie acetylocyklosporyny A ma ustaloną pozycję w literaturze, to dla fachowców jest zrozumiałe, że do zabezpieczania β-alkoholu grupy aminokwasowej w pozycji 1 cyklosporyny A 34 można stosować grupy zabezpieczające inne niż estry octanowe. Tymi grupami zabezpieczającymi mogą być ugrupowania estrów benzoesanowych, podstawionych estrów benzoesanowych, eterów i eterów sililowych. W pewnych warunkach reakcji octanowe grupy zabezpieczające mają skłonność do niepożądanych reakcji ubocznych, takich jak eliminacja i hydroliza. Z uwagi na to, że estry benzoesanowe, etery i etery sililowe są często bardziej odporne na takie reakcje uboczne w takich samych warunkach reakcji, często korzystne jest stosowanie takich grup zabezpieczających zamiast grup octanowych. Cyklosporyna lub pochodne cyklosporyny zabezpieczone grupą acetylową lub dowolną inną grupą zabezpieczającą są określane jako „zabezpieczona cyklosporyna A”. Podobnie końcowy związek pośredni w przykładowym szlaku wspominanym powyżej byłby nazywany „zabezpieczony(E)-1,3-dien” zamiast „acetylo-(E)-1,3-dien”. Charakter wybranej grupy zabezpieczającej może mieć wpływ na pożądany przebieg dalszych etapów sekwencji reakcji.

W nawiązaniu do fig. 3, acetylocyklosporyna A 35 jest w tym przykładowym szlaku zabezpieczonym β-alkoholem służącym jako prekursor syntezy izomerów ISA_TX247 w kilku szlakach syntetycznych. Najpierw zostaną omówione szlaki obejmujące reakcję Wittiga.

Synteza mieszanin izomerów (E) i (Z) ISATX247 poprzez reakcję Wittiga

Przykładowe szlaki obejmujące reakcję Wittiga są identyfikowane na fig. 3 odnośnikiem liczbowym 31. Sposób 1 realizuje się wykorzystując bromowy związek pośredni, acetylo-n-bromocyklosporynę 41, podczas gdy w sposobie 2 stosuje się jako związek wyjściowy aldehyd acetylocyklosporyny A 51.

PL 210 795 B1

W opisanych poniżej przykładowych sposobach stosuje się reakcję Wittiga do wprowadzenia grupy alkenowej, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę produktów o różnych konfiguracjach stereochemicznych.

Reakcje Wittiga stosowane w przykładowych ujawnionych w wynalazku sposobach syntezy mieszanin izomerów (E) i (Z) ISATX247 można ewentualnie prowadzić w obecności halogenku litu. Wiadomo, że obecność halogenków litu w reakcjach Wittiga ma wpływ na stosunek wytwarzanych izomerów geometrycznych i z tego powodu dodanie takiego związku może pomóc w wytwarzaniu żądanej mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247.

Sposób 1

Mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISATX247 można wytwarzać w sposób przedstawiony na fig. 4. Użycie na fig. 4 linii falistych (zwłaszcza w przypadku związków 43 i 44) oznacza, że w przykładowej sekwencji reakcji otrzymuje się mieszaninę izomerów (E) i (Z). Udział procentowy wytwarzanych izomerów (E) i (Z) wynosi około 10-90% izomeru (E) oraz około 90-10% izomeru (Z), ale te zakresy są jedynie przykładowe i możliwe jest wiele innych zakresów. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 15-85% izomeru (E) i około 85-15% izomeru (Z). Alternatywnie, mieszanina zawiera około 25-75% izomeru (E) i około 75-25% izomeru (Z); około 35-65% izomeru (E) i około 65-35% izomeru (Z); oraz około 45-55% izomeru (E) i około 55-45% izomeru (Z). Alternatywnie, mieszanina izomerów stanowi mieszaninę ISATX247 zawierającą około 45-50% izomeru (E) i około 50-55% izomeru (Z). Te procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.

W nawiązaniu do fig. 4, końcowy atom węgla η w bocznym łańcuchu grupy aminokwasowej pozycji 1 acetylocyklosporyny A bromuje się w następnym etapie reakcji acetylocyklosporyny A 35 z N-bromosukcynoimidem i azobisizobutyronitrylem, w takim rozpuszczalniku, jak tetrachlorek węgla, w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, w wyniku czego otrzymuje się pośredni związek, acetylo-n-bromocyklosporynę 41. N-Bromosukcynoimid jest reagentem często stosowanym do zastępowania allilowych atomów wodoru bromem i sądzi się, że następuje to według mechanizmu wolnorodnikowego. Wytwarzanie związku pośredniego 41 opisali M. K. Eberle i F. Nuninger w „Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A”, J. Org. Chem., tom 57, str. 2689-2691 (1992).

Nowy związek pośredni bromek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A 42 można wytworzyć z acetylo-n-bromocyklosporyny 41, przez ogrzewanie tego związku z trifenylofosfiną, w takim rozpuszczalniku jak toluen.

Uważa się, że nowy związek pośredni 42 i inne podobne związki są kluczowymi związkami pośrednimi w syntezie wielu analogów cyklosporyny A, zawierających sprzężony układ dienowy w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Przykładowo, oprócz trifenylofosflny, takie związki jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiny i triaryloarsyny, można poddać reakcji z acetylo-n-bromocyklosporyną 41, w celu wytworzenia innych aktywowanych związków podobnych do 42.

Ponownie w nawiązaniu do fig. 4, mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-1,3-dienu 43 można wytworzyć przez zmieszanie w temperaturze pokojowej bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A 42 w toluenie z nadmiarem formaldehydu. Po dodaniu formaldehydu wkrapla się zasadę, taką jak wodorotlenek sodu i prowadzi się ekstrakcję mieszaniny izomerów dienów octanem etylu.

Reakcję Wittiga opisano w licznych podręcznikach chemii organicznej. Opis taki znajduje się w szczególności w publikacji J. McMurry, Organic Chemistry, 5 wydanie (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), str. 780-783. Reakcję Wittiga można zastosować w celu przeprowadzenia ketonu lub aldehydu w alken. W takiej reakcji ylid fosforowy zwany także fosforanem można poddać reakcji z aldehydem lub ketonem, w wyniku czego powstaje dipolarny związek pośredni zwany betainą. Zazwyczaj pośredniej betainy nie wyodrębnia się, ale raczej ulega ona samorzutnemu rozkładowi poprzez czteroczłonowy pierścień do alkenu i tlenku trifenylofosfiny. Końcowym rezultatem jest zastąpienie karbonylowego atomu tlenu grupą R2C= pierwotnie związaną z atomem fosforu.

Dla fachowców jest zrozumiałe, że bardzo dużo różnych reagentów może zastąpić podane wyżej przykładowe reagenty stosowane w reakcji Wittiga. Przykładowo, liczne związki alkilowe, arylowe, aldehydy i ketony mogą zastępować formaldehyd, w celu wytworzenia dużej liczby pochodnych cyklosporyny. Powyższe syntezy przeprowadzono z użyciem formaldehydu oraz, zamiast formaldehydu, takich związków jak aldehyd octowy, deuterowany formaldehyd, deuterowany acetaldehyd, 2-chlorobenzaldehyd, benzaldehyd i aldehyd masłowy. Takie reakcje Wittiga można przeprowadzać ze związkami innymi niż pochodne trifenylofosfoniowe, takimi jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiPL 210 795 B1 ny i triaryloarsyny. Zamiast wodorotlenku sodu można stosować różne inne zasady, takie jak węglan sodu, butylolit, heksylolit, amidek sodu, litowe zasady z zawadą przestrzenną, takie jak diizopropyloamidek litu oraz alkoholany metali alkalicznych. Oprócz zmieniania reagentów, reakcję można prowadzić w różnych rozpuszczalnikach organicznych lub mieszaninach rozpuszczalników organicznych i wody, w obecności różnych soli, zwłaszcza halogenków litu oraz w różnych temperaturach. Wszystkie wymienione powyżej czynniki mogą być dobrane przez fachowca, w celu uzyskania żądanego wpływu na stereochemię utworzonego wiązania podwójnego, czyli żądanego wpływu na stosunek izomerów cis do trans. W jednej postaci wynalazku reakcję Wittiga prowadzi się w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej tetrahydrofuran i toluen, przy czym rozpuszczalnik stosuje się w obecności związku wybranego z grupy obejmującej butylolit, niższy alkoholan sodu, niższy alkoholan potasu i węglan, w temperaturze od około -80°C do 110°C. Niższym alkoholanem potasu może być t-butanolan potasu. Ponadto rozpuszczalnik może stanowić tetrahydrofuran stosowany w obecności t-butanolanu potasu w temperaturze od około -70°C do -100°C.

W końcowym etapie syntezy grupę zabezpieczająca przy atomie węgla β usuwa się w następujący sposób. Mieszaninę acetylo-(E)-1,3-dienu i acetylo-(Z)-1,3-dienu 43 rozpuszcza się w metanolu i dodaje się wodę. Następnie, dodaje się zasadę, taką jak węglan potasu i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej. Do zasad, które można stosować zamiast węglanu potasu, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu. Do ekstrakcji końcowego produktu w postaci mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISA_TX247 44 stosuje się octan etylu.

Sposób 2

W alternatywnym szlaku syntezy mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247 z zastosowaniem reakcji Wittiga można stosować następujący czteroetapowy szlak syntezy:

1) zabezpieczanie β-alkoholu, tak jak w sposobie 1;

2) utlenianie acetylocyklosporyny A wytworzonej w pierwszym etapie, do aldehydu;

3) reakcja Wittiga; oraz

4) odacetylowanie produktu reakcji Wittiga albo równoważnie, hydroliza estru octanowego w celu odtworzenia alkoholu. Tę sekwencję reakcji zilustrowano na fig. 5.

Ten szlak syntezy zaczyna się w sposób podobny do szlaku reakcji Wittiga z fig. 4, w którym w pierwszym etapie zabezpiecza się β-alkohol octanową grupą estrową. Dwa szlaki różnią się jednak od tego miejsca tym, że w następnym etapie sposobu 2 acetylocyklosporynę A 35 przeprowadza się w aldehyd, aldehyd acetylocyklosporyny A 51. W reakcji tej stosuje się środek utleniający wystarczająco silny dla rozszczepienia wiązania C=C z wytworzeniem dwóch fragmentów. Rozszczepienie alkenów jest znane. Ozon jest prawdopodobnie najczęściej stosowanym środkiem rozszczepiającym wiązanie podwójne, ale inne reagenty utleniające, takie jak nadmanganian potasu (KMnO4) lub tetratlenek osmu, mogą również powodować rozszczepienie wiązania podwójnego.

Acetylocyklosporynę A można przeprowadzić w aldehyd z użyciem ozonu jako środka utleniającego, po czym działa się środkiem redukującym, w celu wytworzenia aldehydu acetylocyklosporyny A. Etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C. Rozpuszczalnikiem stosowanym podczas ozonolizy może być niższy alkohol, taki jak metanol. Jako środek redukujący można stosować trialkilofosfinę, taką jak tributylofosfina, triarylofosfinę, trialkiloaminę, taką jak trietyloamina, sulfid alkiloarylowy, tiosiarczan lub sulfid dialkilowy, taki jak sulfid dimetylowy. Przy pracy z tributylofosfiną jako środkiem redukującym, fachowcy wiedzą, że reakcja jest kontrolowana ilością środka redukującego.

β-Alkohol cyklosporyny A można zabezpieczać grupą trimetylosililową (TMS) i utleniać ozonem jako środkiem utleniającym, po czym działa się środkiem redukującym, w celu wytworzenia aldehydu TMS-cyklosporyny A. Etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80 do 0°C. Rozpuszczalnikiem stosowanym podczas ozonolizy może być mieszanina niższego alkoholu i dichlorometanu. Środek redukujący można wybrać z grupy obejmującej trialkilofosfiny, takie jak tributylofosfina, triarylofosfiny, trialkiloaminy, takie jak trietyloamina, sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany lub sulfidy dialkilowe, takie jak sulfid dimetylowy. Przy pracy z tributylofosfiną jako środkiem redukującym, fachowcy wiedzą, że reakcja jest kontrolowana ilością środka redukującego.

Dodatkowo, aldehyd cyklosporyny A można wytworzyć przez zabezpieczenie β-alkoholu cyklosporyny A przez utworzenie acetylocyklosporyny A, a następnie przeprowadzenie acetylocyklosporyny A w epoksyd acetylocyklosporyny A, za pomocą mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, takiego jak acetoksyaceton lub diacetoksyaceton. Etap ten prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym obojętnym w warunkach reakcji, takim jak acetonitryl i woda. W celu związania jonów metali ciężkich, które mogą być obecne w środowisku reakcji, dodaje się sól disodą kwa16

PL 210 795 B1 su etylenodiaminotetraoctowego. Reakcję epoksydowania prowadzi się korzystnie w pH większym od 7. Po reakcji epoksydowania prowadzi się reakcję utleniającego rozszczepienia epoksydu kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym. Utlenianie i utleniające rozszczepianie można ewentualnie połączyć w jeden etap procedury obróbki. Reakcje te opisali Dan Yang i in. w „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins”, J. Am. Chem. Soc., tom 118, str. 491-492 (1996) oraz „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions”, J. Org. Chem., tom 63, str. 9888-9894 (1998).

Zastosowanie środków utleniających opartych na rutenie opisali H. J. Carlsen i in. w „A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds”, J. Org. Chem., tom 46, nr 19, str. 3736-3738 (1981). Carlsen i in. stwierdzili, że z historycznego punktu widzenia, koszt rutenu stał się bodźcem dla opracowania katalitycznych procedur, przy czym w najczęściej stosowanych procedurach wykorzystuje się nadjodany lub podchloryny jako stechiometryczne utleniacze. Badacze ci postulują, że utrata aktywności katalitycznej stwierdzona podczas przebiegu reakcji z tradycyjnym zastosowaniem rutenu związana jest z obecnością kwasów karboksylowych. Stwierdzono, że dodanie nitryli do mieszaniny reakcyjnej, zwłaszcza acetonitrylu, znacznie zwiększa szybkość i stopień utleniającego rozszczepiania alkenów w układzie CCI4/H2O/IO4^-.

Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można otrzymać z acetylocyklosporyny A 35 przez rozpuszczenie jej w mieszaninie acetonitrylu i wody, a następnie dodanie najpierw nadjodanu sodu, a następnie hydratu chlorku rutenu. Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można wyekstrahować octanem etylu. Należy zauważyć, że synteza aldehydu 51 przez utleniające rozszczepienie odgrywa istotną rolę w wielu stereoselektywnych szlakach opisywanych poniżej i w związku z tym ta część opisu będzie odpowiednio powoływana.

Dodatkowo, aldehyd cyklosporyny A można wytworzyć przez zabezpieczenie β-alkoholu cyklosporyny A, drogą utworzenia acetylocyklosporyny A, a następnie przeprowadzenia acetylocyklosporyny A w epoksyd acetylocyklosporyny A, za pomocą mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu. Etap ten prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym obojętnym w warunkach reakcji, takim jak acetonitryl i woda. W celu związania jonów metali ciężkich, które mogą być obecne w środowisku reakcji, dodaje się sól disodową kwasu etylenodiaminotetraoctowego. Reakcję epoksydowania prowadzi się korzystnie w pH większym od 7. Po reakcji epoksydowania następuje reakcja utleniającego rozszczepienia epoksydu kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym. Utlenianie i utleniające rozszczepianie można ewentualnie połączyć w jeden etap procedury obróbki. Reakcje te opisali Dan Yang i in. w „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins”, J. Am. Chem. Soc, tom 118, str. 491-492 (1996) oraz „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions”, J. Org. Chem., tom 63, str. 9888-9894 (1998).

Trzeci etap sposobu 2 obejmuje przeprowadzanie aldehydu 51 w mieszaninę dienów (E) i (Z) w reakcji Wittiga, w podobny sposób do opisanego w sposobie 1. Tak jak w sposobie 1, ylid fosforowy dodaje się do aldehydu w celu wytworzenia betainy (nie wyodrębnianej), przy czym w efekcie następuje zastąpienie karbonylowego atomu tlenu w aldehydzie grupą R2C= pierwotnie związaną z fosforem. Tak jak wspomniano, takie reakcje Wittiga można przeprowadzać z z użyciem innych związków zawierających fosfor niż pochodne trifenylofosfoniowe, takich jak triarylofosfiny, trialkilofosfiny, aryloalkilofosfiny i triaryloarsyny, w różnych temperaturach i stosując różne roztwory zasad i rozpuszczalniki lub dodając różne sole nieorganiczne, w celu wpływania na stereochemię nowowytworzonych wiązań podwójnych.

Aldehyd acetylocyklosporyny A 51 można rozpuścić w toluenie i dodać zasadę, taką jak wodorotlenek sodu w wodzie. Następnie, dodaje się bromek allilotrifenylofosfoniowy 52 i przez pewien czas miesza się mieszaninę reakcyjną. Obróbka produktu będącego mieszaniną acetylo-(E)-1,3-dienu i acetylo-(Z)-1,3-dienu 53 obejmuje ekstrakcje heksanem i/lub octanem etylu, przy czym określenie „obróbka” oznacza proces ekstrahowania i/lub wyodrębniania produktów reakcji z mieszaniny reagentów, produktów, rozpuszczalnika, itp.

W końcowym etapie sposobu 2, podobnym do końcowego etapu sposobu 1, octanową estrową grupę zabezpieczającą alkohol w pozycji atomu β usuwa się za pomocą węglanu potasu, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISA_TX247 54. Do zasad, które można stosować zamiast węglanu potasu do usuwania grupy zabezpieczającej, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.

PL 210 795 B1

Synteza kompozycji wzbogaconych w jeden z izomerów (E) i (Z) ISATX247 z zastosowaniem związków metaloorganicznych

W stereoselektywnych szlakach syntezy można stosować reagenty nieorganiczne zawierające pierwiastki takie jak krzem, bor, tytan, siarka, fosfor i/lub lit. Szlaki te mogą przebiegać przez sześcioczłonowy pierścieniowy stan przejściowy, w którym jednym z członów pierścienia jest nieorganiczny pierwiastek pochodzący z reagenta metaloorganicznego. Zawada przestrzenna związana ze stanem przejściowym może wpływać na rezultat stereochemiczny reakcji.

W opisie będą omówione dwa przykładowe schematy stereoselektywne. Zgodnie z pierwszym schematem stereoselektywnym (sposób 3, pokazany również jako szlak 32 na fig. 3) związek zawierający krzem poddaje się reakcji eliminacji z wytworzeniem izomeru (E) albo izomeru (Z), w zależności od tego, czy reakcję eliminacji prowadzi się w warunkach kwasowych, czy w zasadowych. Jest to przykład reakcji olefinowania Petersona. Zgodnie z drugim schemtem stereoselektywnym (sposób 4, pokazany również na fig. 3 jako szlak 33) każdy z izomerów wytwarza się z innego prekursora. Izomer (Z) wytwarza się ze związków pośrednich zawierających tytan i fosfor, podczas gdy izomer (E) wytwarza się poprzez związek pośredni zawierający lit.

Sposób 3

Szlak ten jest realizowany poprzez aldehyd acetylocyklosporyny A 51.

Podobny schemat reakcji omówili ogólnie D. J. S. Tsai i D. S. Matteson w „A Stereocontrolled Synthesis of (Z) and (E) Terminal Dienes from Pinacol (E)-1-Trimethylsilyl-1-Propene-3-Boronate”, Tetrahedron Letters, tom 22, nr 29, str. 2751-2752 (1981). Sposób ten zilustrowano na fig. 6. Ogólnie, synteza obejmuje wytwarzanie estrowego reagenta, trimetylosililoalliloboronianu 62, a następnie podziałanie związkiem 62 na aldehyd acetylocyklosporyny A 51, w wyniku czego tworzy się β-trimetylosililoalkohol 64. Sądzi się, że alkohol ten tworzy się poprzez stan przejściowy zawierający bor 63. Ponieważ estry boronianowe są wolno reagującymi reagentami w reakcjach alliloborowania, dla fachowców będą docenione zalety wynikające z zastosowania szybciej działającego reagenta borowego, takiego jak E-Y-trimetylosililodietylobor lub 9-(E-Y-trimetylosililoallilo)-9-BBN. β-Trimetylosililoalkohol 64 można następnie poddać olefinowaniu Petersona, w celu wytworzenia alkenu, w tym przypadku dienu 65 albo dienu 67.

Tworzenie się alkenu następuje zgodnie z jednym z dwóch odmiennych szlaków, w zależności od tego, czy reakcję eliminacji (olefinowania) prowadzi się w kwasowych, czy w zasadowych warunkach. W warunkach kwasowych zachodzi eliminacja typu anty, z wytworzeniem izomeru (E), podczas gdy w warunkach zasadowych zachodzi eliminacja typu cis, z wytworzeniem izomeru (Z). Dla fachowców jest zrozumiałe, że stosując ten szlak syntezy każdy z izomerów można wytworzyć z tego samego prekursora. Produkt każdej reakcji eliminacji stanowi kompozycję wzbogaconą w jeden z dwóch izomerów. Określenie wzbogacona może oznaczać, że kompozycja zawiera około 75% wag. lub więcej izomeru. Alternatywnie, wzbogacona kompozycja może zawierać 80, 85 i 90% wag. jednego z izomerów. Kompozycje wzbogacone w jakiś izomer można następnie połączyć w określonym stosunku, w celu uzyskania pożądanej mieszaniny, tak jak zilustrowano to na fig. 10.

Reakcje przedstawione na fig. 6 omówiono poniżej szczegółowo, poczynając od wytwarzania reagenta zawierającego bor 62. Ogólne badania zastosowania krzemowych reagentów w syntezie z tworzeniem wiązania węgiel-węgiel omówili E. Ehlinger i P. Magnus w „Silicon in Synthesis. 10. The (Trimethylsilyl)allyl Anion: A β-Acyl Anion Equivalent for the Conversion of Aldehydes and Ketones into γ-Lactones”, J. Am. Chem. Soc, tom 102, nr 15, str. 5004-5011 (1980). W szczególności, badacze ci zajmowali się reakcją pomiędzy anionem (trimetylosililo)allilowym i aldehydem. Anion można otrzymać przez deprotonowanie allilotrimetylosilanu s-butylolitem w tetrahydrofuranie w -76°C, zawierającym 1 równoważnik tetrametyloetylenodiaminy (TMEDA).

Deprotonowanie allilotrimetylosilanu (tego etapu nie pokazano na fig. 6) omówili J. -F. Biellmann i J. -B. Ducep w „Allylic and Benzylic Carbanions Substituted by Heteroatoms”, Organic Reactions, tom 27 (Wiley, New York, 1982), str. 9. Proton alfa w stosunku do heteroatomu w podstawionych układach allilowych można usunąć bardziej zasadowym środkiem. Dostępnych jest wiele takich środków, przy czym prawdopodobnie najbardziej rozpowszechniony jest n-butylolit. n-Butylolit stosuje się w ilości stechiometrycznej ze związkiem metalowanym w roztworze tetrahydrofuranowym (THF). Temperatura jest zwykle utrzymywana poniżej 0°C (często poniżej -76°C), gdyż w takiej temperaturze n-butylolit ma niską reaktywność ze względu na swój polimerowy charakter. Dodanie środka chelatującego, takiego jak N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TMEDA), powoduje dysocjację polimeru. Jednakże, reakcję można prowadzić również w temperaturze pokojowej, nawet bez obecności TMEDA.

PL 210 795 B1

Allilosilany są łatwe do deprotonowania, gdyż wytwarzany anion jest stabilizowany nie tylko przez sprzężenie z przyległym wiązaniem podwójnym, ale także z sąsiadującą grupą sililową. Anion może reagować ze środkami elektrofilowymi albo przez swój atom węgla α, albo atom węgla γ. Regiochemiczny i stereochemiczny rezultat tych reakcji zależy od kilku czynników, z których najważniejszym jest rodzaj przeciwjonu. Allilosilany omówił S. E. Thomas w Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), str. 84-87.

Zgodnie z tym schematem reakcji deprotonowany allilosilan poddaje się następnie elektrofilowemu wychwytowi przez boran trimetylu z wytworzeniem związku pośredniego, z którego, w wyniku reakcji z pinakonem otrzymuje się trans-(trimetylosililo)alliloboronian 62. Boronian 62 może być także zwany „alliloborem” (estrem alliloboronianowym). Alternatywnie, jeśli przy wychwycie elektrofilowym stosuje się 9-metoksy-9-dialkilobor, prowadzi to do boronianowego kompleksu, który można odmetoksylować przy użyciu odczynnika trifluoroborowego (takiego jak BF3Et2O), w celu wytworzenia odpowiedniego 9-(Y-transtrimetylosililoallilo)-9-dialkiloboru.

Przyłączanie aldehydu do alliloboru omówił S. E. Thomas w powyżej cytowanej publikacji na stronach 34-35. Przyłączanie aldehydu do alliloboru niesymetrycznie podstawionego przy dystalnym końcu podwójnego wiązania węgiel-węgiel („dystalny” oznacza znajdujący się najdalej od atomu boru) powoduje powstanie homoallilowego alkoholu zawierającego dwa sąsiadujące centra chiralności. Z (E)-alliloborów otrzymuje się diastereoizomer treo, podczas gdy z (Z)-alliloborów otrzymuje się diastereoizomer erytro. Przykładową reakcję (E)-alliloboru 62 z aldehydem acetylocyklosporyny A 51 pokazano na fig. 6, gdzie związek pośredni zawierający bor 63 tworzy się po kilkudniowym mieszaniu reagentów w roztworze THF.

Liczbowy odnośnik 69 w pośrednim związku zawierającym bor 63 (fig. 6) oznacza, że możliwa jest dowolna liczba struktur przy atomie boru. Przykładowo, gdyby reagentem boronianowym 62 był trialkilosililoalliloboronian, wtedy strukturę 69 stanowiłby pięcioczłonowy pierścień zawierający dwa atomy tlenu. Podstawniki w boronianowych lub borowych reagentów stosowanych w 62 będą obecne w strukturze 63.

Postulowano, że stereoselektywność osiągana w reakcjach związków alliloborowych z aldehydami może być związana z krzesełkowym stanem przejściowym sześcioczłonowego pierścienia, którego przykład stanowi zawierający bor związek pośredni 63, przedstawiony na fig. 6. Tylko dwa karbonylowe atomy aldehydu (atomy węgla i tlenu połączone wiązaniem podwójnym) stają się członami sześcioczłonowego pierścienia jako stanu przejściowego; pozostała część aldehydu wystaje poza pierścień. Postuluje się, że część CsA aldehydu wystająca z sześcioczłonowego pierścienia jest raczej w pozycji ekwatorialnej, a nie aksjalnej względem pierścienia, ponieważ ta druga konfiguracja stwarzałaby niekorzystną zawadę przestrzenną pomiędzy podstawnikiem i atomem tlenu alliloboru 62. Dla fachowców jest zrozumiałe, że grupa SiMe3 z anionu (trimetylosililo)allilowego pokazana na fig. 6 zajmuje pozycję ekwatorialną, ponieważ w przykładzie tym wyjściowym związkiem był diastereoizomer (E) alliloboru. Alternatywnie, grupa SiMe3 mogłaby być narysowana w pozycji aksjalnej, jeśli wyjściowym alliloborem byłby diastereoizomer (Z).

Alternatywnie, możliwe jest wytwarzanie alkoholu erytrosililowego, w którym kwasowa eliminacja prowadziłaby do izomeru cis, a zasadowa eliminacja do izomeru trans, przeciwnie niż w przypadku reakcji eliminacji omówionych powyżej. Oczywiste jest dla fachowców, że na końcu syntezy byłyby otrzymane takie same produkty.

Działanie trietanoloaminą na produkt w stanie przejściowym 63 prowadzi do otrzymania β-trimetylosililoalkoholu 64. Z drugiej strony, produkt alliloborowania (trimetylosililoallilo)dialkiloboru daje sililoalkohol 64, w wyniku utleniania z użyciem NaOH/H₂O₂ lub obróbki wodą. Alkohol 64 przedstawiony na fig. 6 jest diastereoizomerem treo, ponieważ stan przejściowy alliloboru 63 był w konfiguracji (E), chociaż dla fachowca jest zrozumiałe, że inny diastereoizomer mógłby być również wytworzony, gdyby wyjściowym reagentem był (Z)-allilobor. Diastereoselektywność w nowopowstałych centrach chiralności nie jest określana na tym etapie, ze względu na usuwanie tych centrów na późniejszym etapie syntezy. Strukturę β-trimetylosililoalkoholu 64 pokazaną na fig. 6 potwierdzono stosując metody spektralne.

W metodzie syntezy alkenów znanej jako olefinowanie Petersona, eliminacja grupy trialkilosililowej i grupy hydroksylowej z β-trimetylosililoalkoholu 64 prowadzi do alkenu, w tym przypadku dienu, z uwagi na podwójne wiązanie już istniejące pomiędzy dwoma końcowymi atomami węgla w łańcuchu. Opis przeprowadzania β-hydroksysilanów w alkeny zamieszczono w publikacji S. E. Thomasa na stronach 68-69. Dalszy opis tej reakcji przedstawili P. F. Hurdlik i D. Peterson w „Stereospecific OlefinPL 210 795 B1

Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes”, J. Am. Chem. Soc., tom 97, nr 6, str. 1464-1468 (1975).

W odniesieniu do fig. 6, reakcja eliminacji, przeprowadzająca alkohol 64 w dien może przebiegać zgodnie z jednym z dwóch mechanizmów, w zależności od tego czy reakcję prowadzi się w warunkach kwasowych, czy w zasadowych. Jeden szlak prowadzi do dienu 65, podczas gdy drugi szlak prowadzi do dienu 67. W warunkach kwasowych zachodzi eliminacja typu anty, podczas gdy w warunkach zasadowych zachodzi eliminacja typu syn. Innymi słowy, reakcje eliminacji β-hydroksysilanów są stereospecyficzne i reakcje wspomagane kwasem i zasadą mają odwrotny przebieg stereochemiczny. Typowymi kwasami dla reakcji wspomaganych kwasami są kwas octowy, kwas siarkowy i różne kwasy Lewisa. Typowymi zasadami są wodorek sodu i wodorek potasu lub t-butanolan potasu. Może się zdarzać, że reakcje eliminacji z użyciem wodorku sodu w THF będą reakcjami powolnymi w temperaturze pokojowej, podczas gdy reakcje eliminacji z użyciem wodorku potasu zachodzą łatwiej.

Stereospecyficzność występuje w tym etapie ciągu przemian, ponieważ eliminacja w warunkach kwasowych wymaga, aby grupy trimetylosililowe i hydroksylowe były w konformacji antyperiplanarnej. W przeciwieństwie do tego, eliminacja w warunkach zasadowych wymaga, aby grupy trimetylosililowe i hydroksylowe były w konformacji synperiplanarnej. Te drugie warunki ułatwiają powstawanie silnego wiązania krzem-tlen i pośredniego czteroczłonowego pierścienia, rozpadającego się w sposób analogiczny do końcowego etapu reakcji Wittiga. Dla fachowca jest zrozumiałe, że silne wiązanie krzemtlen zastępuje słabsze wiązanie krzem-węgiel, co jest nadrzędne w stosunku do zastępowania silnego wiązania węgiel-tlen słabszym wiązaniem π węgiel-węgiel.

Produktami stereospecyficznej eliminacji β-hydroksyalkilosilanu są zatem acetylo-(E)-1,3-dien 67 i acetylo-(Z)-1,3-dien 65. Tak jak w poprzednich sposobach, grupa zabezpieczająca może być teraz usunięta z każdego z tych dienów, przez podziałanie K₂CO₃ w metanolu i wodzie. Usuwa się w ten sposób grupę octanową związaną z węglem β grupy aminokwasowej w pozycji 1, odtwarzając alkoholową grupę funkcyjną przy tym atomie węgla. Do zasad innych niż węglan potasu, jakie można stosować do usuwania grupy zabezpieczającej, należą wodorotlenek sodu, węglan sodu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.

Na tym etapie synteza jest zasadniczo zakończona. Kompozycje wzbogacone w jeden lub drugi izomer można zmieszać w celu otrzymania żądanego stosunku izomerów w mieszaninie. „Wzbogacenie” oznacza, że produkt zawiera co najmniej około 75% wag. tego izomeru. Innymi słowy, produkt może zawierać do 25% wag. „niepożądanego” izomeru. Mieszaninę opracowuje się tak, aby osiągnąć żądany rezultat farmakologiczny.

Sposób 4

Szlak ten realizowany jest również poprzez aldehyd acetylocyklosporyny A 51.

Alternatywny schemat wytwarzania stereoselektywnych izomerów zilustrowano na fig. 7-8. Ten szlak syntezy różni się od poprzednio omówionych tym, że:

1) szlak syntezy wytwarzania izomeru (E) ISATX247 przebiega poprzez odmienne związki pośrednie niż w przypadku izomeru (Z) oraz

2) w tych szlakach syntetycznych wykorzystuje się reagenty i/lub związki pośrednie zawierające tytan i lit.

Wiadomo, że reagenty tytanowe są szczególnie użyteczne w syntezie organicznej, ponieważ są one regio- i stereoselektywne w ich reakcjach z aldehydami i ketonami. Ogólną rolę tytanu w chemii stereoselektywnej omówili M. T. Reetz w Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), str. VII, 148-149 i 164-165. Stwierdzono tam, że charakter tytanowego ligandu może być zmieniany w taki sposób, że elektronowa i steryczna natura reagenta może być modyfikowana i wynik stereochemiczny wielu reakcji prowadzących do utworzenia wiązania C-C może być przewidziany. Zgodnie z tym chemizmem, połączenie dwóch centrów prochiralnych cząsteczek achiralnych tworzy dwa centra chiralności. Ogólna reguła rządząca rezultatami stereoselektywnymi jest taka, że enolany w konfiguracji Z lub związki krotylowe metalu tworzą preferencyjnie związki addycyjne syn, podczas gdy reagenty w konfiguracji E sprzyjają diastereoizomerom anty. Tendencje te mogą być ponownie wyjaśnione przez przyjęcie sześcioczłonowego cyklicznego stanu przejściowego o geometrii krzesełkowej.

Konkretny przykład tego typu syntezy stereoselektywnej omówili Y. Ikeda i in. w „Stereoselective Synthesis of (Z)- and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents”, Tetrahedron, tom 43, nr 4, str. 723-730 (1987). W tej publikacji podano, że allilodifenylofosfi20

PL 210 795 B1 nę można stosować do wytwarzania [3-(difenylofosfino)allilo]tytanu, który z kolei można skondensować z aldehydem, a następnie wytworzyć sól fosfoniową, w celu otrzymania (Z)-1,3-alkadienu, w wysoce regio- i stereoselektywny sposób. W przeciwieństwie do tego, litowany tlenek allilodifenylofosfiny można skondensować z aldehydem, prowadząc do otrzymania (E)-1,3-alkadienu, ponownie o pożądanej stereoselektywności.

W nawiązaniu do fig. 7, synteza izomeru (Z) ISATX247 przebiega (tak jak w poprzednich schematach) poprzez wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A 51 z cyklosporyny A 34. [3-(Difenylofosfino)allilo]tytan 72 wytwarza się przez deprotonowanie allilodifenylofosfiny 71 mocną zasadą, taką jak t-BuLi, a następnie reakcję produktu z tetraizopropanolanem tytanu. Teoretycznie proponowany stan przejściowy 73 prowadzi do erytro-a-adduktu 74, który może być następnie przeprowadzony w sól β-oksydofosfoniową 75, przez podziałanie na związek 74 jodometanem (Mel). Postuluje się, że obecność stanu przejściowego 73 jest co najmniej częściowo odpowiedzialna za stereoselektywność tego szlaku syntezy.

Zgodnie z przykładowymi sposobami przedstawionymi ogólnie w opisie, metal reagenta metaloorganicznego może być tym ośrodkiem, który reguluje regioselektywność (Ikeda, str. 725). Oznacza to, że aldehyd 51 na fig. 7 reaguje ze związkiem difenylofosfinowym 72 w pozycji α, prowadząc do otrzymania α-adduktu 74, gdyż atom węgla γ grupy difenylofosfinowej jest skoordynowany z metalem, którym w tym przypadku jest tytan. Obserwowaną selektywność Z produktu dienowego można wyjaśnić zakładając występowanie sześcioczłonowego stanu przejściowego 73. Ponieważ postuluje się, że zarówno zajmujący wiele miejsca boczny łańcuch aldehydu cyklosporyny A 35, jak i grupa difenylofosfinowa zajmują pozycje ekwatorialne w stanie przejściowym, to selektywnie tworzy się erytro α-addukt 74, co prowadzi do powstania (Z)-1,3-dienu 76.

W przeciwieństwie do sekwencji reakcji przedstawionych na fig. 7, w którym wytwarza się izomer (Z) ISATX247 poprzez stan przejściowy tytanu, tym sposobem nie wytwarza się tak łatwo izomeru (E). W rzeczywistości doniesiono, że próby syntezy izomeru (E) tym sposobem kończą się niskimi wydajnościami. Natomiast, jak przedstawiono na fig. 8, pochodną litową 82 można poddać reakcji z aldehydem 51 z wytworzeniem stanu przejściowego zawierającego lit 83, z którego tworzy się 1,3-dien o stosunku E/Z większym od około 75:25. Tak jak na fig. 7, wysoka stereoselektywność produktu reakcji jest prawdopodobnie związana ze stanem pośrednim 83, w którym, jak się postuluje, grupa winylowa reagenta zawierającego lit 82 i boczny łańcuch aldehydu cyklosporyny A 51 zajmują pozycję ekwatorialną tak, że otrzymuje się (E)-1,3-dien 84 w sposób stereoselektywny. Jak omówiono poprzednio, pewnych niepożądanych reakcji ubocznych z udziałem octanowych grup zabezpieczających można uniknąć we wszystkich syntezach stereoselektywnych przez użycie grup zabezpieczających, takich jak estry benzoesanowe lub etery sililowe.

Wytwarzanie mieszanin

Jak stwierdzono powyżej, pewne mieszaniny izomerów cis i trans ISATX247 odznaczają się jednocześnie zwiększoną skutecznością działania i/lub zmniejszoną toksycznością, w porównaniu do występujących w naturze i znanych obecnie cyklosporyn.

Zgodnie z postaciami wynalazku izomery ISATX247 (i ich pochodne) syntetyzowane są w stereoselektywnych szlakach, różniących się stopniem stereoselektywności. W stereoselektywnych szlakach można wytwarzać pierwszy składnik lub kompozycję wzbogaconą w izomer (E) oraz drugi składnik lub kompozycję wzbogaconą w izomer (Z) i składniki te można następnie połączyć ze sobą w taki sposób, że wytworzona mieszanina ma pożądany stosunek dwóch izomerów. Alternatywnie, dopuszcza się, że pierwszy składnik można wytworzyć przez wydzielenie produktu reakcji, w celu wyodrębnienia i wzbogacenia zawartości izomeru (E) oraz drugi składnik można wytworzyć przez wydzielenie produktu reakcji, w celu wyodrębnienia i wzbogacenią zawartości izomeru (Z). W jeszcze innej postaci, warunki reakcji mogą być dostosowane do wytwarzania pożądanego stosunku izomerów bezpośrednio w wytwarzanej mieszaninie.

Zasady te zilustrowano na fig. 9A-C i 10. Na fig. 9A-C pokazano trzy hipotetyczne reakcje syntezy prowadzące do wytworzenia izomerów (E) do (Z) w stosunku odpowiednio około 65 do 35% wag., 50 do 50% wag. oraz 35 do 65% wag. Oczywiście te stosunki są przykładowe i podane tylko do celów ilustracyjnych, w związku z czym mógłby być dobrany dowolny hipotetyczny zestaw liczbowy. Dla fachowca jest oczywiste, że warunki reakcji stosowane do osiągnięcia stosunku podanego na fig. 9A mogą być różne od warunków dla stosunków na fig. 9B i 9C, w celu osiągnięcia innego stosunku izomerów w mieszaninie produktów. Warunki dla każdej reakcji dostosowywano do wytwarzania konkretnego stosunku dwóch izomerów.

PL 210 795 B1

W przeciwieństwie do niektórych szlaków syntezy, w których wytwarza się mieszaninę izomerów, izomery można najpierw wytwarzać oddzielnie, a następnie mieszać w ustalonych proporcjach, w celu osiągnięcia żądanego stosunku. Tę koncepcję zilustrowano na fig. 10, gdzie produkt jednego szlaku stereoselektywnego jest wzbogacony w jeden z izomerów tak, że produkt zawiera więcej niż około 75% wag. izomeru (E), a produkt innego szlaku stereoselektywnego jest wzbogacony w inny izomer tak, że ten produkt zawiera więcej niż około 75% wag. izomeru (Z). Te liczby są również przykładowe i czystość żądanego izomeru, powstającego w stereoselektywnym szlaku w jednej z postaci może być większa niż lub równa około 75% wag. Czystość żądanego izomeru może być odpowiednio większa niż lub równa około 80, 85, 90 i 95% wag.

Po oddzielnej syntezie izomerów można je zmieszać w celu osiągnięcia żądanego stosunku, tak jak zilustrowano to na fig. 10. Dla celów ilustracyjnych, takie same hipotetyczne stosunki wybrano na fig. 10, jak i na fig. 9A-C. W nawiązaniu do fig. 10, zmieszano izomery (E) i (Z), otrzymując trzy różne mieszaniny, w których stosunki izomerów (E) do (Z) wynoszą odpowiednio około 65 do 35% wag., 50 do 50% wag. oraz 35 do 65% wag.

Mieszaninę izomerów (E) i (Z) ISATX247 można rozdzielić w ten sposób, że uzyskuje się wzbogacenie mieszaniny w jeden z izomerów, w odniesieniu do drugiego. Przykładowo, może być zastosowana reakcja Dielsa-Aldera do przeprowadzania izomeru cis w zamknięty pierścień, w reakcji z alkenem. Jeśli alken związany jest z substratem możliwym do wyodrębnienia (np. odsączalnym), to izomer cis można zasadniczo usunąć z mieszaniny, pozostawiając kompozycję wzbogaconą w izomer trans. Izomer cis można odzyskać ze związku o zamkniętym pierścieniu przez doprowadzenie ciepła, wytwarzając kompozycję wzbogaconą w izomer cis. W ten sposób izomery cis i trans można rozdzielić.

W praktyce, stosunek izomerów (E) i (Z) w dowolnej mieszaninie, niezależnie od stopnia stereoselektywności sposobu, jaki posłużył do ich otrzymania, może przyjmować szeroki zakres wartości. Przykładowo, mieszanina może zawierać około 10-90% izomeru (E) i około 90-10% izomeru (Z). Przykładowo, mieszanina może zawierać około 15-85% wag. izomeru (E) i około 85-15% wag. izomeru (Z) albo około 25-75% wag. izomeru (E) i około 75-25% wag. izomeru (Z), albo około 35-65% wag. izomeru (E) i około 65-35% wag. izomeru (Z), albo około 45-55% wag. izomeru (E) i około 55-45% wag. izomeru (Z). Mieszaninę izomerów może stanowić mieszanina ISATX247, zawierająca około 45-50% wag. izomeru (E) i około 50-55% wag. izomeru (Z). Procentowe udziały wagowe podane są w przeliczeniu na całkowitą masę kompozycji i należy rozumieć, że suma procentów wagowych izomeru (E) i izomeru (Z) wynosi 100% wag. Innymi słowy, mieszanina może zawierać 65% wag. izomeru (E) i 35% wag. izomeru (Z) lub vice versa.

Procentowe udziały jednego lub drugiego izomeru w mieszaninie mogą być zweryfikowane metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub innymi znanymi metodami.

Kompozycje farmaceutyczne

Możliwy jest sposób leczenia pacjentów potrzebujących immunosupresji, polegający na podawaniu kompozycji farmaceutycznych zawierających jako składniki czynne mieszaninę wytwarzaną sposobem według wynalazku. Kompozycje te wskazane są w szczególności w stanach autoimmunologicznych i zapalnych oraz stanach związanych z odrzuceniem przeszczepu lub powodujących odrzucenie przeszczepu, np. w leczeniu (w tym łagodzeniu, zmniejszeniu, eliminowaniu lub leczeniu etiologii lub objawów) albo zapobieganiu (w tym znaczącemu lub całkowitemu ograniczeniu, profilaktyce lub unikaniu) następujących przypadków:

a) ostre odrzucenie przeszczepu narządów lub tkanek, np. leczenie biorców, np. przeszczepów serca, płuc, łącznie serca i płuc, wątroby, nerek, trzustki, skóry, jelita lub rogówki, szczególnie zapobieganie i/lub leczenie odrzutu pośredniczonego przez komórki T, jak również reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, takiej jaka następuje po przeszczepie szpiku kostnego;

b) przewlekłe odrzucanie przeszczepionego narządu, w szczególności zapobieganie chorobie naczyń przeszczepu, np. charakteryzującej się zwężeniem tętnic przeszczepu na skutek zgrubienia błony wewnętrznej naczyń, ze względu na proliferację komórek mięśni gładkich i związanych z tym efektów;

c) odrzucanie heteroprzeszczepów, w tym ostre, nadostre i przewlekłe odrzucanie narządu, występujące w przypadku, gdy dawca narządu nie pochodzi z tego samego gatunku co biorca, zwłaszcza odrzuty pośredniczone przez komórki B lub odrzuty pośredniczone przez przeciwciała;

d) choroby autoimmunologiczne i stany zapalne, w szczególności stany zapalne z etiologią obejmującą składnik immunologiczny lub autoimmunologiczny, takie jak zapalenie stawów (np. reuma22

PL 210 795 B1 toidalne zapalenie stawów, przewlekłe postępujące zapalenie stawów i zniekształcające zapalenie stawów) i inne choroby reumatyczne.

Konkretnymi chorobami autoimmunologicznymi, które mogą być leczone synergicznymi mieszaninami wytwarzanymi sposobem według wynalazku, są autoimmunologiczne zaburzenia hematologiczne (w tym np. anemia hemolityczna, anemia aplastyczna, wybiórcza aplazja czerwonokrwinkowa i małopłytkowość samoistna), toczeń rumieniowaty układowy, zapalenie wielochrząstkowe, twardzina, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, miastenia, łuszczyca, zespół Stevena-Johnsona, sprue samoistne, (autoimmunologiczna) zapalna choroba jelit (w tym np. wrzodziejące zapalenie okrężnicy i choroba Crohna), oftalmopatia endokrynna, choroba Gravesa, sarkoidoza, stwardnienie rozsiane, pierwotna żółciowa marskość wątroby, cukrzyca młodzieńcza (cukrzyca typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniego i tylnego odcinka), wysychające zapalenie rogówki i spojówek oraz wiosenne zapalenie rogówki i spojówek, śródmiąższowe zwłóknienie płuc, artropatia łuszczycowa, zapalenie kłębuszków nerkowych (z lub bez zespołu nerczycowego, np. włącznie z samoistnym zespołem nerczycowym lub nefropatią z minimalnymi zmianami) i młodzieńcze zapalenie skórno-mięśniowe. Autoimmunologiczne i zapalne stany skórne, które także uważa się za możliwe do leczenia i profilaktyki za pomocą synergicznych mieszanin wytwarzanych sposobem według wynalazku, obejmują np. łuszczycę, zapalenie skóry kontaktowe, zapalenie skóry atopowe, wyłysienie plackowate, rumień wielopostaciowy, zapalenie skóry opryszczkowe, twardzinę skóry, bielactwo nabyte, zapalenie naczyń z nadwrażliwości, pokrzywkę, pęcherzowy pemfigoid, liszaj rumieniowaty, pęcherzycę, nabyte pęcherzowe oddzielanie się naskórka oraz inne zapalne lub alergiczne stany skóry, jak również zapalne stany płuc i dróg oddechowych, włączając w to astmę, alergie i pylicę płuc.

Mieszaniny izomerów analogów wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być podawane same lub z farmaceutycznym nośnikiem ciepłokrwistym istotom żywym potrzebującym takiego leczenia. Nośnik farmaceutyczny może być substancją stałą lub cieczą. Mieszaninę można podawać doustnie, miejscowo, pozajelitowo, przez inhalację sprayem lub doodbytniczo, w preparatach w postaci dawkowanej, zawierających zwykłe nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, środki wspomagające i zaróbki. Stosowane w opisie określenie „pozajelitowe” obejmuje wstrzykiwania podskórne, dożylne, domięśniowe, wstrzykiwania domostkowe lub metody infuzyjne.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku mogą korzystnie mieć postać odpowiednią do podawania doustnego, np. tabletek, kołaczyków, pastylek do ssania, zawiesin wodnych lub olejowych, proszków lub granulek do dyspergowania, emulsji, kapsułek twardych lub miękkich, syropów lub eliksirów. Kompozycje przeznaczone do podawania doustnego można wytwarzać znanymi sposobami wytwarzania kompozycji farmaceutycznych, przy czym takie kompozycje mogą zawierać jeden lub większą liczbę środków wybranych z grupy obejmującej środki słodzące, środki smakowo-zapachowe, środki barwiące i środki konserwujące, w celu uzyskania farmaceutycznie eleganckiego i apetycznego preparatu. Tabletki zawierające składnik czynny zmieszany z nietoksycznymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami można również wytwarzać znanymi sposobami. Stosowanymi zaróbkami mogą być np. (1) obojętne rozcieńczalniki, takie jak węglan wapnia, laktoza, fosforan wapnia lub fosforan sodu; (2) środki granulujące i rozsadzające, takie jak skrobia kukurydziana lub kwas alginowy; (3) środki wiążące, takie jak skrobia, żelatyna lub guma arabska oraz (4) środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk. Tabletki mogą być niepowlekane lub mogą być powlekane znanymi sposobami dla opóźnienia ich rozpadu i wchłaniania w układzie żołądkowo-jelitowym i zapewnienia przez to opóźnionego działania przez dłuższy okres. Przykładowo, można stosować substancję opóźniającą uwalnianie, taką jak monostearynian glicerylu lub distearynian glicerylu. Mogą być one również powlekane metodami opisanymi w opisach patentowych US nr 4 256 108, 4 160 452 i 4 265 874, w celu wytworzenia osmotycznych tabletek terapeutycznych o kontrolowanym uwalnianiu.

W pewnych przypadkach preparaty do podawania doustnego mogą mieć postać twardych żelatynowych kapsułek, w których składnik czynny wymieszany jest z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem, np. z węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem. Mogą one mieć także postać miękkich kapsułek żelatynowych, w których składnik czynny zmieszany jest z wodą lub fazą olejową, na przykład z olejem arachidowym, ciekłą parafiną lub z olejem oliwkowym.

Zawiesiny wodne zazwyczaj zawierają składniki czynne zmieszane z zaróbkami odpowiednimi do wytwarzania zawiesin wodnych. Takimi zaróbkami są: (1) środki suspendujące, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, alginian sodu, poliwinyPL 210 795 B1 lopirolidon, żywica tragakantowa i guma arabska; albo (2) środki dyspergujące lub zwilżające, którymi mogą być występujące w naturze fosfatydy, takie jak lecytyna, produkt kondensacji tlenku alkilenu z kwasem tłuszczowym, np. stearynian polioksyetylenu, produkt kondensacji tlenku etylenu z alkoholem alifatycznym o długim łańcuchu, np. heptadekaetylenoksycetanol, produkt kondensacji tlenku etylenu z częściowym estrem kwasu tłuszczowego i heksytolu, taki jak monooleinian oksyetylenowanego sorbitu, albo produkt kondensacji tlenku etylenu z częściowym estrem kwasu tłuszczowego i bezwodnika heksytolu, np. monooleinian oksyetylenowanego sorbitanu.

Zawiesiny wodne mogą także zawierać jeden lub większą liczbę środków konserwujących, np. p-hydroksybenzoesan etylu lub n-propylu; jeden lub większą liczbę środków barwiących; jeden lub większą liczbę środków słodzących, takich jak sacharoza, aspartam lub sacharyna.

Zawiesiny olejowe można otrzymać przez wytwarzanie zawiesiny składnika czynnego w oleju roślinnym, np. w oleju arachidowym, oleju oliwkowym, oleju sezamowym lub oleju kokosowym, w tranie rybnym zawierającym kwas tłuszczowy omega 3 albo w oleju mineralnym, takim jak ciekła parafina. Zawiesiny olejowe mogą zawierać środek zagęszczający, np. wosk pszczeli, parafinę twardą lub alkohol cetylowy. Dla uzyskania apetycznego preparatu doustnego można dodać środek słodzący i środek smakowo-zapachowy. Kompozycje te mogą być konserwowane przez dodanie przeciwutleniacza, takiego jak kwas askorbinowy.

Proszki lub granulki do dyspergowania są odpowiednie do przygotowywania zawiesin wodnych. Zawierają one składnik czynny w mieszaninie ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym, środkiem suspendującym i jednym lub większą liczbą środków konserwujących. Przykładowymi środkami dyspergującymi lub zwilżającymi oraz środkami suspendującymi są środki wymienione powyżej. Mogą być również obecne dodatkowe zaróbki, np. opisane powyżej środki słodzące, smakowo-zapachowe i barwiące.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku mogą również być w postaci emulsji typu olej w wodzie. Fazę olejową może stanowić olej roślinny, taki jak olej oliwkowy lub olej arachidowy albo olej mineralny, taki jak ciekła parafina, albo mieszanina tych olejów. Odpowiednimi środkami emulgującymi mogą być: (1) występujące w naturze żywice, takie jak guma arabska i żywica tragakantowa, (2) występujące w naturze fosfatydy, takie jak soja i lecytyna, (3) estry lub częściowe estry 30, pochodzące od kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytoli, np. monooleinian sorbitanu, (4) produkty kondensacji tych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, np. monooleinian oksyetylenowanego sorbitanu. Emulsje mogą także zawierać środki słodzące i środki smakowo-zapachowe.

Syropy i eliksiry można formułować ze środkami słodzącymi, np. z gliceryną, glikolem propylenowym, sorbitem, aspartamem lub sacharozą. Preparaty takie mogą również zawierać środek łagodzący, środek konserwujący, środek smakowo-zapachowy i środki barwiące.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci jałowych zawiesin wodnych lub olejowych do wstrzykiwań. Zawiesiny te można formułować znanymi sposobami, stosując odpowiednie, wymienione wyżej środki dyspergujące lub zwilżające oraz suspendujące. Jałowy preparat do wstrzykiwań może mieć także postać jałowych roztworów lub zawiesin do wstrzykiwań w nietoksycznym pozajelitowo dopuszczalnym rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, np. w 1,3-butanodiolu. Do dopuszczalnych zaróbek i rozpuszczalników, jakie można stosować, należy woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo, jako rozpuszczalniki lub ośrodki suspendujące zwykle stosuje się jałowe nielotne oleje roślinne. Można w tym celu stosować dowolny obojętny ciekły olej, w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Dodatkowo, w preparatach do wstrzykiwań znajdują zastosowanie kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy.

Mieszaniny wytwarzane sposobem według wynalazku można również podawać w postaci czopków do doodbytniczego podawania leku. Kompozycje te można wytwarzać przez zmieszanie leku z odpowiednią, niedrażniącą zaróbką, stałą w zwykłych temperaturach, ale ciekłą w temperaturze odbytu i z tego względu topiącą się w odbytnicy z uwolnieniem leku. Takimi składnikami są masło kakaowe i glikole polietylenowe.

Do stosowania miejscowego wykorzystuje się kremy, maści, żele, roztwory lub zawiesiny, itp., zawierające ujawnione cyklosporyny.

Korzystnie, stosuje się ciekły roztwór zawierający jako składniki nieaktywne środek powierzchniowo czynny, etanol, rozpuszczalnik lipofilowy i/lub amfifilowy. Konkretnie, stosuje się doustną wieloskładnikową emulsję zawierającą mieszaninę izomerów analogów wytwarzanych sposobem według wynalazku oraz następujące składniki nielecznicze: bursztynian d-a-tokoferyloglikolu polietylenowego

PL 210 795 B1

1000 (witamina E TPGS), olej triglicerydowy o średnim łańcuchu (MCT), Tween 40 i etanol. Korzystnie, można również stosować miękką kapsułkę żelatynową (zawierającą żelatynę, glicerynę, wodę i sorbit), zawierającą mieszaninę izomerów analogów wytwarzanych sposobem według wynalazku oraz takie same nielecznicze składniki jakie zawiera roztwór doustny.

W leczeniu wyżej wymienionych stanów dzienny poziom dawkowania wynosi około 0,05-50 mg/kg masy ciała. Poziom dawki i harmonogram podawania mogą zmieniać się w zależności od rodzaju stosowanej mieszaniny izomerów, stanu osoby leczonej i dodatkowych czynników, takich jak wiek i stan pacjenta. Korzystne dawki wynoszą około 0,5-10 mg/kg/dzień oraz około 0,1-10 mg/kg/dzień. W korzystnej postaci dawkę około 2-6 mg/kg/dzień podaje się doustnie dwa razy dziennie. W szczególnie korzystnej postaci dawkę około 0,5-3 mg/kg/dzień podaje się doustnie dwa razy dziennie.

Ilość składnika czynnego, jaka może być połączona ze składnikami nośnika przy wytwarzaniu pojedynczej postaci dawkowanej zmienia się zależnie od leczonego osobnika i sposobu podawania. Przykładowo, preparat przeznaczony do podawania doustnego ludziom może zawierać od 2,5 mg do

2,5 g środka czynnego połączonego z właściwą i dogodną ilością materiału nośnikowego, który stanowi 5-95% całości kompozycji. Jednostkowe postacie dawkowane na ogół zawierają około 5-500 mg składnika czynnego. W korzystnej postaci do doustnego podawania stosuje pojedyncze kapsułki zawierające około 50 mg mieszaniny izomerów. W innej korzystnej postaci do doustnego podawania stosuje się roztwory zawierające około 50 mg/ml mieszaniny izomerów.

Należy jednak rozumieć, że konkretny poziom dawki dla poszczególnego pacjenta zależy od różnorodnych czynników, włączając w to aktywność stosowanego związku, wiek, dietę, masę ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, czas podawania, drogę podawania, szybkość wydalania, połączenie leków oraz charakter i ciężkość konkretnej leczonej choroby lub stanu.

Metodologia

Stosowanie pochodnych cyklosporyny, klasy cyklicznych polipeptydów wytwarzanych przez grzyb Tolypocladium inflatum Gams, zwiększa się w immunosupresyjnej terapii, ze względu na korzystny wpływ na reakcje, w których pośredniczą komórki T. Zaobserwowano, że pochodne cyklosporyny odwracalnie hamują immunokompetentne limfocyty, zwłaszcza limfocyty T, jak również hamują wytwarzanie i uwalnianie limfokiny. Działanie to wywoływane jest głównie przez pobudzane cyklosporyną A hamowanie kalcyneuryny, fosfatazowego enzymu znalezionego w cytoplazmie komórek (Schreiber i Crabtree, 1992). Wskaźnikiem skuteczności cyklosporyny A lub pochodnej cyklosporyny A jest ich zdolność do hamowania fosfatazowej aktywności kalcyneuryny. W teście hamowania kalcyneuryny mierzy się aktywność leku w miejscu jego działania, w związku z czym jest to najdokładniejsza i bezpośrednia ocena in vitro skuteczności analogów cyklosporyny A (Fruman i in., 1992).

ISATX247 jest anologiem cyklosporyny A podobnym do cyklosporyny A, z wyjątkiem nowej modyfikacji funkcyjnej grupy w grupie aminokwasowej w pozycji 1. Obecnie stwierdzono, że ISATX247 wykazuje do 3 razy większą skuteczność niż cyklosporyna A w teście hamowania kalcyneuryny in vitro.

Badania farmakodynamiczne (in vivo i in vitro) wykazały, że ISATX247 ma większą skuteczność niż inne istniejące związki cyklosporynowe. Skuteczność mieszaniny izomerów analogów cyklosporyny o składzie od około 10:90 do około 90:10 (trans- do cis-), w szczególności ISATX247 zawierającego 50-55% izomeru Z i 45-50% izomeru E, jako środka immunosupresyjnego (w porównaniu do cyklosporyny A) zademonstrowano w teście aktywności kalcyneuryny in vitro, modelu przeszczepu serca szczura, modelu aloprzeszczepu komórek wysp trzustkowych u myszy, modelu zapalenia stawów u myszy wywołanego kolagenem i/lub modelu zapalenia stawów u królika wywołanego antygenem. Dane te pokazują, że mieszaniny izomerów są równoważne lub bardziej skuteczne niż cyklosporyna A i z tego powodu są użyteczne w leczeniu zaburzeń immunoregulacyjnych.

Obserwuje się liczne działania niepożądane związane z terapią cyklosporyną A, w tym nefrotoksyczność, toksyczność w stosunku do wątroby, powodowanie zaćmy, nadmierne owłosienie, paratezję i rozrost dziąseł (Sketris i in., 1995). Z wymienionych, jednym z najpoważniejszych działań niepożądanych jest nefrotoksyczność, zależna od wielkości dawki podawanej cyklosporyny A. Dokładny mechanizm powodowania przez cyklosporynę A uszkodzeń nerek nie jest znany. Jednakże wysunięto hipotezę, że wzrost poziomu substancji zwężających naczynia w nerkach prowadzi do miejscowego zwężenia doprowadzających tętniczek kłębkowych. Rezultatem tego może być niedokrwienie nerek, zmniejszenie szybkości filtracji kłębkowej i w długim okresie zwłóknienie śródmiąższowe.

Niekliniczne bezpieczeństwo ISATX247 oszacowano na pewnej liczbie gatunków zwierząt. Badania toksyczności przy powtarzalnych dawkach doustnych u szczurów, psów i naczelnych wykazały,

PL 210 795 B1 że ISATX247 jest dobrze tolerowany i doprowadzał do efektów odpowiadających immunosupresyjności. Jedynym zauważonym we wszystkich gatunkach efektem toksykologicznym była biegunka/wolne stolce.

ISATX247 nie wykazuje działania mutagennego, co wykazano w testach in vitro bakteryjnej mutacji wstecznej i aberracji chromosomowej oraz testu in vivo mikrojądra u szczurów. Nie zakończono badań nad rakotwórczością. Badania toksyczności ciążowej ISATX247 przeprowadzono na szczurach i królikach. Nie stwierdzono żadnych związanych z leczeniem wad rozwojowych lub zmian. Przy dawkach, które powodowały toksyczność u matki, obserwowano także wpływ toksyczny na zarodek.

Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.

Figura 1A przedstawia strukturę cyklosporyny A, ilustrując 11 grup aminokwasowych tworzących pierścień cyklopeptydowy, jak również budowę bocznego łańcucha aminokwasowego w pozycji 1.

Figura 1B stanowi inną ilustrację cyklosporyny A, ze szczególnym uwypukleniem znaczenia używanego w opisie określenia „CsA”.

Figura 2A przedstawia strukturę izomeru (E) (lub izomeru trans) analogu cyklosporyny A o nazwie ISATX247.

Figura 2B przedstawia strukturę izomeru (Z) (lub izomeru cis) analogu cyklosporyny A ISATX247.

Figura 3 przedstawia przegląd przykładowych szlaków syntezy, które można zastosować do wytwarzania analogów cyklosporyny zgodnie z wynalazkiem, przy czym stereoselektywne szlaki są pogrupowane według warunków reakcji.

Figura 4 przedstawia szlak syntezy prowadzącej do wytworzenia izomerów (E) i (Z) ISATX247 z prekursora bromowego.

Figura 5 przedstawia inny szlak syntezy prowadzącej do wytworzenia izomerów (E) i (Z) ISATX247 z prekursora aldehydowego.

Figura 6 przedstawia przykładowy schemat stereoselektywnej reakcji, który można zastosować do wytwarzania kompozycji wzbogaconych w izomer (E) lub w izomer (Z) ISATX247, przy czym każdy z izomerów może być wytworzony z tego samego alkoholu prekursorowego.

Figura 7 przedstawia alternatywny schemat steroselektywnej syntezy kompozycji wzbogaconej w izomer (Z) ISATX247.

Figura 8 przedstawia alternatywny schemat steroselektywnej syntezy kompozycji wzbogaconej w izomer (E) ISATX247.

Figury 9A-C przedstawiają przykładowe szlaki syntezy mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, przy czym warunki każdej reakcji są dostosowane do wytwarzania przykładowego konkretnego stosunku dwóch izomerów.

Figura 10 przedstawia przykładowe steroselektywne szlaki wytwarzania mieszaniny izomerów (E) i (Z) ISATX247, w których najpierw wytwarza się kompozycje wzbogacone w jeden z dwóch izomerów, a następnie miesza się je ze sobą zgodnie z ustalonymi proporcjami, w celu osiągnięcia pożądanego stosunku.

Figura 11 przedstawia wyniki testu wykazującego, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez ISATX247 (45-50% izomeru (E) i 50-55% izomeru (Z)) było do 3 razy skuteczniejsze (oznaczone przez IC50) w porównaniu do cyklosporyny A.

Figura 12 przedstawia strukturę i skład izomeryczny pewnych mieszanin izomerycznych deuterowanych i niedeuterowanych analogów.

Figura 13 przedstawia wyniki testu wykazującego, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez różne mieszaniny izomeryczne deuterowanych i niedeuterowanych analogów było co najmniej równie skuteczne (na podstawie IC50), jak w przypadku cyklosporyny A.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1. Acetylowanie cyklosporyny A

Do cyklosporyny A (50,0 gramów, 41,6 milimola) w atmosferze N2 dodano bezwodnik octowy (140 mililitrów) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia się cyklosporyny A. Dodano dimetyloaminopirydynę (7,62 g, 62,4 mmola) i w atmosferze N2 mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny do zakończenia reakcji. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 5°C, a następnie przesączono. Otrzymaną substancję stałą przemyto heksanem w celu usunięcia dodatkowej ilości bezwodnika octowego. Otrzymaną pastowatą substancję stałą przeniesiono powoli w trakcie intensywnego mieszania do 5% wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (1,5 litra). Otrzymaną zawiesinę mieszano do otrzymania drobnoziarnistej zawiesiny i ustania wydzielania się CO2. Substancję stałą odsączono i przemyto wodą do uzyskania przesączu o obojęt26

PL 210 795 B1 nym pH. Stały produkt wysuszono przez noc w suszarce próżniowej (55°C) i otrzymano 44,0 g (85%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.

P r z y k ł a d 2. Utlenianie produktu z przykładu 1

Do acetylocyklosporyny A (42,97 g, 34,54 mmola) dodano acetonitryl (320 ml) i wodę (80 ml), po czym mieszaninę mieszano do rozpuszczenia całego materiału. Dodano nadjodan sodu (14,77 g, 69,08 mmola). Następnie, dodano hydrat chlorku rutenu (0,358 g, 1,73 mmola) i w atmosferze N2 mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Dodano wodę (300 ml) i mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza. Mieszaninę wyekstrahowano dwukrotnie octanem etylu (300 ml, a następnie 250 ml). Ciemnoczarne ekstrakty octanu etylu połączono ze sobą i przemyto 250 ml wody, a następnie 250 ml solanki. Roztwór organiczny wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano, w wyniku czego otrzymano zielonkawoczarną substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt (29,1 g, 68%) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie acetylo-ISATX247

i) Wytwarzanie ylidu in situ

Do 340 ml toluenu dodano aldehyd acetylocyklosporyny A (31,84 g, 25,84 mmola) i mieszaninę mieszano do rozpuszczenia całego substratu. Do otrzymanego roztworu dodano 340 ml 1N wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Otrzymaną mieszaninę mieszano intensywnie i dodano bromek allilotrifenylofosfoniowy (58,22 g, 151,90 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie dodano dodatkową ilość bromku allilotrifenylofosfoniowego (16,64 g, 43,42 mmola) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 24 godziny. Mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza i oddzielono fazę toluenową. Fazę wodną wyekstrahowano dodatkowo 200 ml toluenu. Połączono dwa ekstrakty toluenowe i przemyto kolejno 200 ml dejonizowanej wody i 200 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu. Roztwór wysuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano toluen, w wyniku czego uzyskano bardzo lepki żel. Na produkt ten podziałano 142 ml octanu etylu i mieszano do uzyskania drobnoziarnistej zawiesiny. W trakcie szybkiego mieszania dodano powoli heksan (570 ml). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, otrzymaną zawiesinę przesączono i zebraną substancję stałą przemyto 160 ml mieszaniny 5:1 heksan/octan etylu. Połączone przesącze zatężono w wyparce obrotowej do lepkiej substancji półstałej. Na tę substancję podziałano 75 ml octanu etylu i mieszano do otrzymania drobnoziarnistej zawiesiny. W trakcie szybkiego mieszania dodano powoli heksan (225 ml). Mieszanie kontynuowano przez 30 minut, otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną substancję stałą przemyto 100 ml mieszaniny 5:1 heksan/octan etylu. Przesącz zatężono w wyparce obrotowej i otrzymano jasnożółtą substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt (14,09 g) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

ii) Wytwarzanie ylidu i reakcja w obecności LiBr

Do zawiesiny bromku allilotrifenylofosfoniowego (7,67 g, 20 mmoli) w THF (20 ml) ochłodzonej do 0°C w trakcie mieszania dodano roztwór KO-t-Bu w tetrahydrofuranie (20 ml, 20 mmoli, 1M roztwór). Następnie w tej temperaturze kontynuowano mieszanie przez 30 minut i dodano roztwór LiBr w THF (10 ml, 10 mmoli, 1M roztwór). Mieszaninę mieszano przez 30 minut i przez kaniulę dodano roztwór aldehydu acetylo-CsA (4,93 g, 4 mmole) w THF (10 ml). Po mieszaniu przez 15 minut w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zadano nasyconym roztworem NH4CI (25 ml). Obróbkę i chromatografię prowadzono w sposób opisany powyżej, w wyniku czego otrzymano acetylowany ISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej (3,5 g).

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie ISATX247

Acetylo-ISATX247 (14,6 g, 11,62 mmola) rozpuszczono w 340 ml metanolu i następnie dodano 135 ml dejonizowanej wody. Dodano węglan potasu (13,36 g, 96,66 mmola) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 24-48 godzin do zakończenia reakcji. Odparowano większość metanolu i w trakcie mieszania dodano 250 ml octanu etylu. Powoli dodano 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego (120 ml), a następnie oddzielono fazę octanu etylu. Fazę wodną wyekstrahowano dodatkową 200 ml porcją octanu etylu. Połączone ekstrakty octanu etylu przemyto kolejno 150 ml dejonizowanej wody, 100 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego i 150 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu, a następnie wysuszono nad MgSO4. Odparowano octan etylu i uzyskano jasnożółtą substancję stałą. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano ISATX247 (10,51 g, 75%), w postaci bezbarwnej substancji stałej. ISATX247 zawierał 45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z.

PL 210 795 B1

Produkty z przykładów 1-4 scharakteryzowano metodą spektrometrii masowej i/lub spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego.

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie acetylo-n-bromocyklosporyny A

Acetylocyklosporynę A (41,48 g, 33,3 mmola) wytworzoną jak w przykładzie 1, N-bromosukcynoimid (10,39 g, 58,4 mmola) i azobisizobutyronitryl (1,09 g, 6,67 mmola) rozpuszczono w 250 ml tetrachlorku węgla i otrzymaną mieszaninę ogrzewano 2,5 godziny w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin. Mieszaninę ochłodzono i rozpuszczalnik odparowano. Na pozostałość podziałano 350 ml eteru dietylowego i przesączono w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnej. Przesącz przemyto kolejno 150 ml wody i 150 ml solanki, wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 28,57 g (65%) acetylo-Y-bromocyklosporyny A, w postaci żółtej substancji stałej.

P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A

Acetylo-Y-bromocyklosporynę A (28,55 g, 21,6 mmola) i trifenylofosfinę (7,55 g, 28,8 mmola) rozpuszczono w 210 ml toluenu i otrzymany roztwór ogrzewano do 100°C przez 21 godzin. Roztwór ochłodzono i odparowano toluen. Na otrzymaną oleistą substancję półstałą podziałano 250 ml mieszaniny heksan/eter (1:4), starannie wymieszano i zdekantowano rozpuszczalnik. Proces ten powtórzono jeszcze 3 razy z 150 ml eteru. Pozostałość następnie rozpuszczono w 50 ml octanu etylu i wytrącono 220 ml heksanu. Powstałą substancję stałą odsączono i otrzymano 22,5 g (66%) bromku trifenylofosfoniowego acetylocyklosporyny A, w postaci jasnobrązowej substancji stałej.

P r z y k ł a d 7. Reakcja Wittiga

Bromek trifenylofosfoniowy acetylocyklosporyny A (100 mg, 0,06 mmola), nadmiar 37% formaldehydu (0,25 ml) i toluen (2 ml) mieszano szybko w temperaturze pokojowej. Wkroplono 1N wodny roztwór wodorotlenku sodu (2 ml) i mieszanie kontynuowano przez 3,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu (20 ml) i wodą (10 ml). Fazę octanu etylu oddzielono, przemyto kolejno wodą (10 ml) i solanką (10 ml), wysuszono nad siarczanem magnezu i rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 70 mg (88%) mieszaniny izomerów (E) i (Z) acetyloISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej.

P r z y k ł a d 8. Odacetylowanie produktu reakcji Wittiga

Mieszaninę izomerów z przykładu 7 (70 mg, 0,056 mmola) rozpuszczono w metanolu (5 ml), a następnie dodano wodę (1 ml). Dodano węglan potasu (75 mg) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 19 godzin. Odparowano większość metanolu i do pozostałości dodano 15 ml octanu etylu, a następnie 10 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego. Oddzielono fazę octanu etylu, a fazę wodną wyekstrahowano dodatkowymi 10 ml octanu etylu. Przed wysuszeniem nad siarczanem magnezu i odparowaniem rozpuszczalnika, połączone ekstrakty octanu etylu przemyto kolejno 10 ml wody, 10 ml 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego i 10 ml solanki. Surowy produkt poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny (2:3) aceton/heksan, w wyniku czego otrzymano 37 mg (54%) ISATX247, w postaci bezbarwnej substancji stałej zawierającej około 85% izomeru E i około 15% izomeru Z.

Produkty z przykładów 5-8 scharakteryzowano metodą spektrometrii masowej i/lub spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego.

P r z y k ł a d 9. Wytwarzanie izomerów geometrycznych ISATX247

Izomery cis i trans ISATX247 można niezależnie otrzymać w następujący sposób. Sekwencja obejmuje znane metalowanie allilotrimetylosilanu, elektrofilowy wychwyt przez boran trimetylu, z następującą potem hydrolizą, a potem transestryfikację z wytworzeniem pośredniego estru, trans(trimetylosililo)alliloboronianu. Alliloborowanie aldehydu cyklosporyny prowadzi do wytworzenia pośredniego związku boru, który przez kompleksowanie przeprowadza się w żądany β-trimetylosililoalkohol. Na tym etapie nie jest określana diastereoselektywność przy tworzeniu się nowych centrów chiralności, gdyż centra te są usuwane w późniejszym etapie. Należy zauważyć, że zgodnie z oczekiwaniami względna stereochemia dwóch centrów w β-trimetylosililoalkoholu jest anty i wynika z wiązania podwójnego trans w prekursorze, trans-(trimetylosililo)alliloboronianie.

Eliminacja z udziałem zasady (Hudrlick i in., 1975) β-trimetylosililoalkoholu prowadzi do kompozycji wzbogaconej w acetylo-(Z)-1,3-dien, podczas gdy eliminacja z udziałem kwasu prowadzi do kompozycji wzbogaconej w acetylo-(E)-1,3-dien. Odbezpieczanie prowadzi do odpowiednich alkoholi dienowych, odpowiednio izomerów (Z) i (E) ISATX247.

PL 210 795 B1

W alternatywnym podejściu do dienów stosuje się związki allilofosforowe. Metalowanie allilodifenylofosfiny, a następnie transmetalowanie z użyciem Ti(O-i-Pr)4 prowadzi do wytworzenia pośredniego związku tytanu. W wyniku allilotytanowania, z następującą potem stereospecyficzną eliminacją, otrzymuje się kompozycję wzbogaconą w dien (Z).

Z drugiej strony, jeśli tlenek allilodifenylofosfiny zastosuje się w podobnej sekwencji reakcji (fig. 8), to otrzyma się głównie (75%) izomer (E).

i) Alliloborowanie acetylo-CsA-CHO (E)-1-Trimetylosililo-1-propeno-3-boronian wytworzono sposobami uprzednio opisanymi (Ikeda i in., 1987). W atmosferze azotu do roztworu (E)-1-trimetylosililo-1-propeno-3-boronianu (0,2 g, 0,832 mmola) w THF (3 ml) w trakcie mieszania dodano aldehyd acetylocyklosporyny A (1,026 g, 0,832 mmola). Mieszaninę reakcyjną monitorowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (kolumna C-8, odwrócony układ faz) i mieszano ją przez 7 dni. Następnie, dodano trietanoloaminę (0,196 g, 1,3 mmola) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 4 dni. β-Trimetylosililoalkohol otrzymano przez oczyszczanie w kolumnie z żelem krzemionkowym.

MS(ES) m/z 1368,9 (M + Na⁺).

Do zawiesiny KH (3,5 mg, 26,4 μmola, 30% dyspersja oleju mineralnego przemyta bezwodnymi heksanami) w bezwodnym THF (1 ml) dodano β-trimetylosililoalkohol (10 mg, 7,4 mikromoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono eterem dietylowym (10 ml), a następnie przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 (2 x 5 ml). Po wysuszeniu (Na2SO4) i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano wzbogacony (Z)-acetylo-1,3-dien.

MS (ES)m/z 1294,8 (M + K⁺).

ii) Allilotytanowanie acetylo-CsA-CHO

Do ochłodzonego (-78°C) roztworu allilodifenylofosfiny (0,54 g, 2,4 mmola) w bezwodnym THF (8 ml) w trakcie mieszania dodano t-BuLi (1,42 ml, 2,4 mmola, 1,7M roztwór w pentanie). W tej temperaturze ceglastoczerwony roztwór mieszano przez 15 minut, a następnie w 0°C przez 30 minut. Mieszaninę ponownie ochłodzono do -78°C i dodano Ti(O-i-Pr)4 (0,71 ml, 2,4 mmola). W tej temperaturze brązowy roztwór mieszano przez 15 minut, po czym przez kaniulę dodano roztwór acetylo-CsA-CHO (2,5 g, 2 mmole) w THF (10 ml). Jasnożółty roztwór mieszano przez kolejne 30 minut, a następnie przez noc ogrzano do temperatury pokojowej. W temperaturze 0°C do mieszaniny reakcyjnej dodano Mel (0,15 ml, 2,4 mmola). W tej temperaturze kontynuowano mieszanie przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną wlano do lodowatego 1% HCl (100 ml). Warstwę wodną wyekstrahowano EtOAc (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (2 x 25 ml) i solanką (25 ml). Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano żółtą substancję stałą, którą poddano chromatografii w kolumnie z żelem krzemionkowym. W wyniku elucji mieszaniną 1:3 aceton/heksany otrzymano acetylo-ISATX247 wzbogacony w izomer (Z). Jak w przykładzie 4, odbezpieczanie doprowadziło do ISATX247 wzbogaconego w izomer (Z) (stosunek Z/E, 75:25).

P r z y k ł a d 10. Wytwarzanie mieszaniny izomerów ISATX247 wzbogaconej w izomer (E)

Do roztworu tlenku allilodifenylofosfiny (1 mmol) i heksametylofosforoamidu (2 mmole) w tetrahydrofuranie (5 ml) dodano w -78°C n-butylolit (1 mmol, w heksanach). Mieszaninę mieszano w -78°C przez 30 minut. Dodano roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (0,8 mmola) w tetrahydrofuranie (7 ml) i pozostawiono mieszaninę reakcyjną do stopniowego ogrzania się do temperatury pokojowej, a następnie mieszano ją przez 18 godzin. Mieszaninę wlano do lodowato zimnego 1N kwasu chlorowodorowego (50 ml), a następnie przeprowadzono ekstrakcję octanem etylu. Ekstrakt organiczny przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem magnezu i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 25% aceton/75% heksany, w wyniku czego otrzymano mieszaninę izomerów (E) i (Z) acetylo-ISATX247. Po usunięciu octanowej grupy zabezpieczającej, jak opisano w przykładzie 4, otrzymano mieszaninę izomerów ISATX247 wzbogaconą w izomer (E). Protonowa spektroskopia NMR wykazała, że mieszanina zawierała 75% izomeru (E) i 25% izomeru (Z) ISATX247. Reakcję tę przeprowadzono również zgodnie z modyfikacją Schlossera (R. Liu, M. Schlosser, Synlett, 1996, 1195). Do ochłodzonego (-78°C) roztworu tlenku allilodifenylofosfiny (1,21 g, 5 mmoli) w THF (20 ml) w trakcie mieszania dodano n-BuLi (2 ml, 5 mmoil, 2,5M roztwór w heksanach). Czerwony roztwór mieszano przez 40 minut w -78°C. Następnie, przez kaniulę dodano w ciągu 15 minut roztwór acetylo-CsA-CHO (1,25 g, 1,02 mmola) w THF (12 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po obróbce tej mieszaniny i chromatografii w sposób opisany powyżej otrzymano acetylo-ISATX247 (stosunek Z:E wynosił ₁

40:60, oznaczony na podstawie analizy ¹H NMR).

PL 210 795 B1

P r z y k ł a d 11. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej grupą benzoilową

Cyklosporynę A (6,01 g, 5 mmoli) i 4-dimetyloaminopirydynę (305 mg, 2,5 mmola) rozpuszczono w pirydynie (5 ml). Dodano bezwodnik benzoesowy (3,4 g, 15 mmoli) i mieszaninę mieszano przez 19 godzin w 50°C. Dodano więcej bezwodnika benzoesowego (1,7 g, 7,5 mmola) i DMAP (305 mg,

2,5 mmola) i w 50°C kontynuowano mieszanie przez dalsze 24 godziny. Dodano bezwodnik benzoesowy (0,85 g, 3,8 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 23 godziny. Następnie, mieszaninę reakcyjną wlano powoli do wody, w trakcie mieszania roztworu. Wytrącony benzoesan cyklosporyny A odsączono i przemyto wodą. Zebrany placek filtracyjny rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu, dodano 10% roztworu kwasu cytrynowego i mieszaninę mieszano przez 1 godzinę. Wytrącony produkt odsączono i przemyto wodą do uzyskania pH przesączu, takiego samego jak woda. Stały benzoesan cyklosporyny A wysuszono w 50°C pod próżnią i otrzymano bezbarwną substancję stałą.

P r z y k ł a d 12. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej eterową grupą trietylosililową

Cyklosporynę A (3,606 g, 3 mmole) rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (8 ml) i dodano DMAP (122 mg, 1 mmol). Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 0°C, a następnie wkroplono trifluorometanosulfonian trietylosililu (3,6 mmola). Mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano ją przez noc. Następnie mieszaninę reakcyjną wlano powoli do wody, w trakcie mieszania. Wytrącony eter trietylosililowy odsączono i przemyto wodą. Zebrany placek filtracyjny rozpuszczono w minimalnej ilości metanolu, dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego i mieszaninę mieszano przez 30 minut. Wytrącony produkt odsączono i przemyto wodą do uzyskania pH przesączu, takiego samego jak woda. Stały eter trietylosililowy wysuszono w 50°C pod próżnią i otrzymano bezbarwną substancję stałą. Grupy zabezpieczające triizopropylosililową i t-butylodimetylosililową również wprowadzano stosując analogiczny sposób postępowania.

P r z y k ł a d 13. Test aktywności immunosupresyjnej z zastosowaniem hamowania kalcyneuryny

Wskaźnikiem skuteczności cyklosporyny A lub pochodnej cyklosporyny A jest ich zdolność do hamowania fosfatazowej aktywności kalcyneuryny. W teście hamowania kalcyneuryny mierzy się aktywność leku w miejscu jego działania, w związku z czym jest to bezpośrednia ocena in vitro skuteczności analogów cyklosporyny A (Fruman i in., 1992).

Immunosupresyjną aktywność ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) w porównaniu z cyklosporyną A oszacowano w teście hamowania kalcyneuryny (CN). Rezultaty tego testu pokazują, że hamowanie fosfatazowej aktywności kalcyneuryny przez ISATX247 (45-50% izomeru Z i 50-55% izomeru E) było do 3 razy silniejsze (na podstawie IC50) w porównaniu z cyklosporyną A (fig. 11).

Immunosupresyjną aktywność różnych mieszanin izomerów deuterowanych i niedeuterowanych analogów, w porównaniu z cyklosporyną A, oszacowano stosując test hamowania kalcyneuryny (CN). Strukturę i skład izomeryczny kompozycji tych analogów przedstawiono na fig. 12. Na fig. 12 oznaczenie „I4” odpowiada strukturze ISATX247. I4-M2 oznacza ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 5-8 (oznaczonych na tym rysunku jako sposób 2). I4-D4 oznacza deuterowany ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 1-4. I4-D2 oznacza deuterowany ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 5-8. Inne mieszaniny izomerów opisane są na rysunku.

Wyniki tego testu pokazują, że hamowanie aktywności fosfatazy kalcyneurynowej przez te mieszaniny izomerów analogów było co najmniej tak skuteczne (na podstawie IC50) jak hamowanie przez cyklosporynę A (fig. 13). CsA oznacza cyklosporynę A; Izocyklo4 oznacza ISATX247 wytworzony sposobem opisanym w przykładach 1-4. Izocyklo5 odpowiada I5-M1 z fig. 12. Izocyklo4-d4 odpowiada I4-D4 z fig. 12. Izocyklo5-d5 odpowiada I5-D5 z fig. 12. Izocyklo4-d2 odpowiada I4-D2 z fig. 12. Izocyklo4-M2 odpowiada I4-M2 z fig. 12. Izocyklo5-M2 odpowiada I5-M5 z fig. 12.

P r z y k ł a d 14. Aktywność immunosupresyjna z zastosowaniem modelu przeszczepu serca u szczurów

Oszacowano skuteczność ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) zapobiegania odrzucaniu przeszczepianych serc pomiędzy różnymi szczepami szczurów i porównano ją ze skutecznością cyklosporyny A. Model przeszczepów serca u szczurów jest najczęściej stosowanym modelem szacowania in vivo skuteczności nowych leków immunosupresyjnych, ponieważ przedłużenie przeżywania przeszczepu jest w tym modelu trudne do osiągnięcia, ze względu na odrzuty immunologiczne.

Procedura obejmuje heterotopowy przeszczep (do aorty brzusznej i dolnej żyły głównej) serca szczurów rasy Wistar Furth szczurom Lewis. Dootrzewnowe wstrzykiwania cyklosporyny A albo mieszaniny izomerów analogów dokonywano biorcom przeszczepów zaczynając 3 dni przed transplanta30

PL 210 795 B1 cją i kontynuowano je przez 30 dni po transplantacji. Jeśli zauważono zaburzenie czynności przeszczepu podczas 30-dniowego okresu potransplantacyjnego, to zwierzęta uśmiercano. Jeśli zwierzę przeżywało dłużej niż 30 dni po transplantacji, przerywano test i odłączano czujniki kontrolne i zwierzętom zezwolono na dalszą egzystencję, aż do zaburzeń czynności przeszczepu lub do 100 dni po transplantacji.

Średnie współczynniki przeżycia dla każdej grupy biorców zestawiono w tabeli 1. Rezultaty te pokazują, że ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) w optymalnej dawce 1,75 mg/kg/dzień przedłużało czas przeżycia około 3-krotnie, w porównaniu do cyklosporyny A. Pewna liczba zwierząt otrzymujących ISATX247 miała ciągle funkcjonujące przeszczepy 100 dni po transplantacji (70 dni po przerwaniu dawkowania). Dane te wykazują aktywność immunosupresyjną mieszanin izomerów analogów przy zapobieganiu odrzutom przeszczepów.

T a b e l a 1

Wpływ ISATX247 i cyklosporyny A podawanych dootrzewnowo na średnie czasy przeżycia szczurów z przeszczepionymi sercami [ś rednia z dwóch oddzielnych badań , n 13]

Dawka (mg/kilogram/dzień)	Średni czas przeżycia (liczba dni po operacji) Średnia ± SEM (skaningowy mikroskop elektronowy)
Zaróbka kontrolna	Cyklosporyna A	ISAtx247
0	9 ± 1
0,5		13^a ± 4	11^a ± 2
1,75		18^b ± 7	57^b ± 32
3		50^c ± 8	55^c ± 12

^{a, c} nieznacznie różne ^b znaczą co róż ne (p < 0,01)

Oszacowano również skuteczność różnych deuterowanych i niedeuterowanych mieszanin izomerów analogów (strukturę podano na fig. 12) w zapobieganiu odrzucaniu przeszczepianych serc pomiędzy różnymi szczepami szczurów i porównano ją ze skutecznością cyklosporyny A. Dawki wynosiły 1,75 mg/kg/dzień przez 30 dni. Wyniki zebrano w tabeli 2. Wyniki te pokazują, że mieszaniny izomerów w dawce 1,75 mg/kg/dzień przedłużały czas przeżycia co najmniej w takim samym stopniu jak cyklosporyna A oraz wykazują aktywność immunosupresyjną tych mieszanin izomerów analogów w zapobieganiu odrzutom przeszczepów.

T a b e l a 2

Wpływ różnych mieszanin izomerów analogów i cyklosporyny A podawanych dootrzewnowo w dawce 1,75 mg/kg/dzień na średnie czasy przeżycia szczurów z przeszczepionymi sercami

Testowany związek	Średni czas przeżycia (liczba dni po operacji)
Zaróbka kontrolna	9
Cyklosporyna A	20
I5-M1	20
I4-M2	20+
I4-D2	30

P r z y k ł a d 15. Aktywność immunosupresyjna w przypadku aloprzeszczepów komórek wysp trzustkowych

Zdolność ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) w porównaniu do cyklosporyny A do przedłużenia przeżycia w modelu przeszczepionych komórek wysp trzustkowych u myszy sprawdzono w badaniach obejmujących przeszczep 500 wysp trzustkowych z myszy CBA/J do torebki nerkowej cukrzycowych biorców, jakimi były myszy Balb/c.

Po transplantacji, ISATX247 lub cyklosporynę A podawano przez wstrzykiwania dootrzewnowe (i. p.) w dawkach 0 (zaróbka), 1,75, 10, 20 lub 25 mg/kg/dzień przez 30 dni. Poziom glukozy we krwi

PL 210 795 B1 monitorowano codziennie, aż do momentu niewydolności przeszczepu, zdefiniowanego poziomem glukozy większym od 17 mmola/litr, w dwóch kolejnych dniach.

Wyniki wskazują na to, że ISATX247 w dawkach 20 mg/kg/dzień przedłużał czas przeżywania przeszczepu o 40% (tabela 3). Zauważono również, że przy zwiększaniu dawki ISATX247 był mniej toksyczny niż cyklosporyna A. Było to szczególnie widoczne przy dawce 25 mg/kg/dzień.

T a b e l a 3

Przeżywanie aloprzeszczepów wysp trzustkowych u cukrzycowych myszy otrzymujących ISATX247 albo cyklosporynę A podawane przez wstrzykiwania dootrzewnowe w dawkach 1,75, 10, 20 lub 25 mg/kg/dzień

Dawka (mg/kg/dzień)	Leczenie	N	Mediana czasu przeżycia (dni)	Średni czas przeżycia (dni)
0	Zaróbka	7	17	16,8
1,75	CsA	9	17	17,4
1,75	ISA	9	18	18,7
10	CsA	6	21	25,3
10	ISA	5	18	19,2
0	Zaróbka	12	16	15,9
20	CsA	9	19	20,2
20	ISA	9	> 28	> 28
0	Zaróbka	5	21	21,1
25	CsA	10	ND*	ND*
25	ISA	8	50	46,4

* 7 z 10 zwierząt z tej grupy nie przeżyło ze względu na toksyczność CsA. Z tego powodu tylko 3 zwierzęta zakończyły ten test w tej grupie i nie przeprowadzono analizy statystycznej

P r z y k ł a d 16. Aktywność immunosupresyjna w przypadku zapalenia stawów

W ostatnich trzech dekadach prowadzono rozległe badania na trzech zwierzęcych modelach reumatoidalnego zapalenia stawów u ludzi oraz szeroko stosowano przedkliniczne badania przesiewowe i opracowywania nowych środków przeciwreumatycznych. Obejmowały one modele zapalenia stawów wywołanego adiuwantem, wywołanego kolagenem i wywołanego antygenem. Poniższe badania miały na celu ocenę przeciwzapalnej skuteczności ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) w modelu zapalenia stawów u myszy wywołanego kolagenem i modelu zapalenia stawów u królika wywołanego antygenem. Histopatologia i immunopatologia obserwowana w tych dwóch modelach przypomina wyniki uzyskiwane w tej chorobie u ludzi. W obu modelach badano skuteczność ISATX247 zapobiegania początkowi zapalenia stawów (protokół zapobiegania) i leczenia zapalenia stawów (protokół leczenia). Badania te potwierdzają immunosupresyjne działanie opisanych mieszanin izomerów analogów cyklosporyny.

A. Zapalenie stawów wywołane kolagenem

Samce myszy DBA/1 Lac J, trzymane w warunkach wolnych od przeciwciał wirusa, w wieku 8-10 tygodni immunizowano podskórnie 100 mikrogramami kolagenu z kurczaków typu II, zemulgowanego w kompletnym adjuwancie Freunda. ISATX247, cyklosporynę A lub zaróbkę (Chremophor EL/etanol 72:28, obj.) podawano codziennie przez wstrzykiwanie dootrzewnowe (i. p.) 1-50-krotnie rozcieńczonego solą fizjologiczną podstawowego roztworu leku (0,25, 0,5 lub 1 mg/ml), co doprowadziło do uzyskania stężeń 0 (zaróbka), 125, 250 lub 500 μg/mysz ISA_TX247 oraz 250 lub 500 μg/mysz cyklosporyny A. W przypadku zwierząt przeznaczonych do protokołu zapobiegania (12/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia immunizacji kolagenem (dzień 0) do uśmiercenia w dniu 40. W przypadku zwierząt przeznaczonych do protokołu leczenia (12/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia rozpoczęcia choroby (~ dzień 28) do uśmiercenia zwierząt w dniu 38.

Ocenianymi parametrami były śmiertelność, kreatynina surowicza, histologia i oszacowanie rezultatu, takie jak kliniczna ocena (wizualna), puchnięcie tylnych łap, ocena histologiczna, ocena nadżerek i immunohistochemia.

PL 210 795 B1

Oceny nadżerek dokonano na ślepo badając strzałkowe sekcje bliższego stawu międzypaliczkowego (PIP) palca środkowego na obecność lub brak nadżerek (zdefiniowanych jako oddzielone ubytki w chrząstkach lub kościach wypełnione tkanką zapalną). Takie podejście umożliwiło porównywanie tego samego stawu. Uprzednie badania wykazały obecność nadżerek w > 90% tych stawów u zwierząt z nieleczonym zapaleniem stawów.

Wyniki wskazują, że ujemne oceny nadżerek w przypadku grupy leczonej wysokimi dawkami ISA_TX247 (500 μg/mysz) były znacząco wyższe niż ujemne oceny nadżerek w przypadku grupy leczonej zaróbką (p < 0,05). Zarówno grupy leczone średnimi dawkami ISA_TX247 (250 μg/mysz), jak i wysokimi dawkami cyklosporyny A (500 μg/mysz) miały wyższe ujemne oceny nadżerek, w porównaniu do grupy leczonej zaróbką (p < 0,1). Ponadto, grupy kontrolne leczone niskimi dawkami ISATX247 (125 μg/mysz) i średnimi dawkami cyklosporyny A (250 μg/mysz), miały wyższe, chociaż statystycznie nieznaczące, ujemne oceny nadżerek, w porównaniu do grupy kontrolnej leczonej zaróbką.

Jedynym rodzajem leczenia znacząco zapobiegającym rozwojowi nadżerek w stawach było ISA_TX247 w dawce 500 μg/mysz. To znaczące zmniejszenie udziału stawów PIP wykazujących nadżerkowe zmiany u myszy potraktowanych ISATX247, w porównaniu do kontrolnej grupy myszy potraktowanych zaróbką, demonstruje, że ISATX247 ma właściwości modyfikujące chorobę.

B. Zapalenie stawów wywołane antygenem

Króliki New Zealand White, utrzymywane w warunkach wolnych od konkretnych czynników chorobotwórczych, immunizowano 10 mg albuminy jaja kurzego w soli fizjologicznej, zemulgowanej w kompletnym adjuwancie Freunda, podawano domięśniowo i podskórnie w kilku miejscach karku. Czternaście dni później wszystkie zwierzęta zaczęły otrzymywać 2 razy dziennie dostawowe zastrzyki 5 mg albuminy jaja kurzego i 65 ng ludzkiego rekombinowanego transformującego czynnika wzrostu 2 w soli fizjologicznej.

ISATX247, cyklosporynę A lub zaróbkę (Chremophor EL/etanol 72:28, obj.) podawano codziennie przez wstrzykiwanie podskórne 1-4-krotnie rozcieńczonego solą fizjologiczną podstawowego roztworu leku (w zaróbce), co doprowadziło do uzyskania stężeń 0 (zaróbka), 2,5, 5,0 lub 10 mg/kg/dzień dla ISATX247 oraz 5,0, 10 lub 15 mg/kg/dzień dla cyklosporyny A. Zwierzętom przeznaczonym do protokołu zapobiegania (8/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia immunizacji albuminą jaja kurzego (dzień 0) do uśmiercenia w dniu 42. Zwierzętom przeznaczonym do protokołu leczenia (8/grupę) rozpoczęto dawkowanie od dnia rozpoczęcia choroby (~ dzień 28) do uśmiercenia zwierząt w dniu 42.

Ocenianymi parametrami były śmiertelność, masa ciała, kreatynina surowicza, histologia i oszacowanie rezultatu, takie jak puchnięcie stawu kolanowego, liczba komórek w mazi stawowej, ogólna ocena pośmiertna i histologia.

Zaobserwowano znaczne zmniejszenie histopatologicznej oceny mazi u zwierząt po 28-dniowej terapii (protokół zapobiegania) ISATX247 (P 0,05) i cyklosporyną A (P 0,05), w porównaniu do zwierząt kontrolnych traktowanych zaróbką. Towarzyszyło temu znaczne zmniejszenie liczby komórek w mazi stawowej (ISATX247, P 0,05; cyklosporyna A, P 0,05). Znaczne polepszenie histopatologicznej oceny mazi u zwierząt z rozwiniętym zapaleniem stawów było również widoczne po 14-dniowym leczeniu ISATX247 (P 0,05) i cyklosporyną A (P 0,05), w porównaniu do zwierząt kontrolnych traktowanych zaróbką (protokół leczenia). Znaczące zmniejszenie makroskopowej oceny zapalenia stawów było widoczne u zwierząt leczonych ISATX247 (P = 0,01), ale nie u zwierząt leczonych cyklosporyną A. Leczenie było dobrze tolerowane, bez znaczącej toksyczności ocenianej analizą kreatyniny w surowicy lub histolologią pośmiertną.

Dane te pokazują, że ISATX247 jest równoważny lub potencjalnie bardziej skuteczny niż cyklosporyna A w leczeniu i zapobieganiu reumatoidalnemu zapaleniu stawów w modelu wywoływanego antygenem zapalenia stawów u królików.

P r z y k ł a d 17. Właściwości farmakokinetyczne i toksykokinetyczne

Farmakokinetyczne i toksykokinetyczne parametry ISATX247 (45-50% izomeru E i 50-55% izomeru Z) i cyklosporyny A testowano na modelu królika. Królik był także stosowany jako model w badaniach nefrotoksyczności cyklosporyny A, ale dużo rzadziej niż szczur. Badania wykazały, że cyklosporyna A podawana królikom powoduje zmiany strukturalne i funkcjonalne w dawkach nie tylko niższych od uprzednio podawanych w innych modelach zwierzęcych, ale także w mieszczących się na co najmniej górnym poziomie zakresu terapeutycznego u ludzi (Thliveris i in., 1991, 1994). Wykrycie zwłóknienia śródmiąższowego i arteriopatii, oprócz cytologicznych zmian w kanalikach, również sugeruje, że królik jest właściwszym modelem do badania nefrotoksyczności, gdyż te strukturalne jednostki są cechami charakterystycznymi nefrotoksyczności obserwowanej u ludzi. ISATX247 podawano dożylPL 210 795 B1 nie (i. v.) przez pierwsze 7 dni i podskórnie (s. c.) przez dodatkowe 23 dni, zgodnie z następującym harmonogramem.

T a b e l a 4

Harmonogram podawania dawek w badaniach właściwości farmakokinetycznych i toksykokinetycznych ISATX247 w modelu królika

Grupa badanych	Dni 1-7: dawka	Dni 8-30: dawka	Liczba
zwierząt	i. v. (mg/kg)	s. c. (mg/kg)	zwierząt
			Samce	Samice
1. Kontrolna z podawaniem zaróbki	0	0	4	4
2. Kontrolna z podawaniem cyklosporyny A	10	10	6	6
3. Niska dawka	5	5	0	2
4. Średnia dawka	10	10	4	4
5. Wysoka dawka	15	15	4	4

Dla uzyskania pewności, że jakiekolwiek obserwowane zmiany nerkowe spowodowane są działaniem ISATX247, a nie czynników chorobotwórczych, w badaniach użyto królików pozbawionych czynników chorobotwórczych (SPF).

W dniach 1 i 7 pobrano próbki krwi przed podaniem leku i 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 18 i 24 godziny po podaniu dawki, dla utworzenia profilu farmakokinetycznego. Innymi ocenianymi parametrami były obserwacje kliniczne, masa ciała, spożywanie pokarmu, hematologia, chemia kliniczna, ogólna patologia oraz histopatologiczne badania wybranych tkanek/narządów.

Próbki krwi analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią masową (LCMS).

W poniższej tabeli 5 zestawiono wartości średnich parametrów farmakokinetycznych u królików, którym podano 10 mg/kg cyklosporyny A lub ISATX247.

T a b e l a 5

Farmakokinetyczne parametry u samców królików, którym podawano dożylnie cyklosporynę A i ISATX247, w ilości 10 mg/kg/dzień. Wyniki wyrażono jako wartości średnie ± SD

Mierzony parametr	Cyklosporyna A	ISAtx247
Dzień 1	Dzień 7	Dzień 1	Dzień 7
tmax (godziny)	0,5	0,5	0,5	0,5
Cmax ^^g/l)	1954 ±320	2171 ± 612	1915±149	1959±470
t^1/2 (godziny)	7,4 ± 2,8	9,0 ± 4,0	7,4 ± 1,7	9,2 ± 1,1
Powierzchnia pod krzywą ^g = h/litr)	6697±1717	6685±1247	5659±1309	5697 ±1373

Nie zaobserwowano statystycznie znaczących różnic pomiędzy farmakokinetycznymi parametrami cyklosporyny A i ISATX247 u samców królików otrzymujących dawkę 10 mg/kg/dzień.

Farmakokinetyczne parametry ISATX247 u samic królików otrzymujących taką samą dawkę nie różniły się znacząco od parametrów obserwowanych u samców królików, z wyjątkiem maksymalnego stężenia w 7 dniu.

Nie zanotowano znaczących zmian w hematologicznych parametrach królików otrzymujących kontrolną zaróbkę, cyklosporynę A i ISATX247.

Podczas badań zauważono różnicę w poziomie kreatyniny w różnych grupach, tak jak pokazano to w poniższej tabeli 6.

Różnice te wskazują, że cyklosporyna A miała znacznie większy ujemny wpływ na nerki niż kontrolna zaróbka lub ISATX247.

Należy zauważyć, że nawet przy dawce ISATX247 o 50% wyższej, tj. 15 mg/kg/dzień, w porównaniu z 10 mg/kg/dzień cyklosporyny A, nie ma znaczącego wzrostu poziomu kreatyniny w surowicy.

PL 210 795 B1

T a b e l a 6

Procentowa zmiana poziomu kreatyniny w surowicy ponad linią podstawową u samców królików otrzymujących zaróbkę, cyklosporynę A lub ISATX247 przez 30 dni

Rodzaj badanej grupy	Dzień 15	Dzień 30
Króliki, którym podawano zaróbkę	+6%	-3%
Króliki, którym podawano cyklosporynę A (10 mg/kg)	+22%	+33%
Króliki, którym podawano ISAtx247 (10 mg/kg)	+ 1%	+ 10%
Króliki, którym podawano ISAtx247 (15 mg/kg)	-19%	-11%

Badania narządów we wszystkich królikach otrzymujących kontrolną zaróbkę, 10 mg/kg cyklosporyny A, 5 mg/kg ISATX247, 10 mg/kg ISATX247 nie ujawniły znaczących odchyleń od normy. Dotyczyło to w szczególności nerek, w których nie stwierdzono objawów zwłóknienia śródmiąższowego, widocznych zwykle u zwierząt leczonych cyklosporyną A (Thliveris i in., 1991, 1994). U samców królików otrzymujących 15 mg/kg ISATX247 zauważono zmniejszenie spermatogenezy.

Żadnych zmian nie zanotowano u trzech samic królika, na których zakończono całość badań przy dawce 15 mg/kg ISATX247.

P r z y k ł a d 18. Immunosupresyjne działanie ISATX247

Pełną krew z makaków jawajskich (n = 4) inkubowano z ISATX247 lub cyklosporyną i pobudzano różnymi mitogenami w podłożu hodowli. Proliferację limfocytów oceniano przez wprowadzenie znaczonej trytem tymidyny oraz przez badanie ekspresji antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA) na komórkach fazy SG2M metodą przepływowej analizy cytometrycznej. Cytometrię przepływową stosowano także do oceny wytwarzania wewnątrzkomórkowch cytokin przez komórki T i ekspresji antygenów aktywujących limfocyty T. Następnie, obliczano EC50 (stężenie leku koniecznego do osiągnięcia 50% efektu maksymalnego) stosując program komputerowy WinNonlin™. Wyniki pokazują, że proliferacja limfocytów, wytwarzanie cytokin i ekspresja powierzchniowych antygenów komórek T były skuteczniej hamowane przez ISATX247 niż przez cyklosporynę, jak wskazują na to wartości EC50 (wyrażone w ng/ml) zamieszczone w poniższej tabeli 7.

T a b e l a 7

Parametr	ISAtx247	Cyklosporyna
Wychwyt ³H-tymidyny	160,54	565,52
Ekspresja PCNA	197,72	453,88
Wytwarzanie IL-2	103,35	504,80
Wytwarzanie IFN	102,67	465,65
Wytwarzanie TNF	90,58	508,29
Ekspresja CD 71	149,84	486,82
Ekspresja CD 25	121,00	431,53
Ekspresja CD 11a	204,40	598,90
Ekspresja CD 95	129,98	392,97
Ekspresja CD 154	160,87	975,10

Tak więc, stosując test ex vivo stwierdzono, że ISATX247 hamuje różne funkcje immunologiczne 2,3-6 razy skuteczniej niż cyklosporyna.

P r z y k ł a d 19. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributyloallilofosfoniowego W 20 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono t-butanolan potasu (0,31 g, 2,8 mmola). W temperaturze około -40°C powoli dodano bromek tributyloallilofosfoniowy (0,99 g, 3,1 mmola) rozpuszczony w 3 ml tetrahydrofuranu. Otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez około 10 minut w około -40°C, po czym dodano powoli roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) w 6 ml tetrahydrofuranu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny przez 1,5 godziny reakcja była zakończona.

PL 210 795 B1

W celu zadania mieszaniny reakcyjnej mieszaninę wprowadzono do wodnego roztworu kwasu fosforowego (1,2 g, 1,0 mmol). Otrzymany roztwór wodny wyekstrahowano 100 ml toluenu, a następnie 50 ml toluenu. Połączone warstwy organiczne przemyto wodą i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 90%, w postaci żółtawej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 87% izomeru E i około 13% izomeru Z (jak oznaczono to metodą spektroskopii ¹H-NMR).

P r z y k ł a d 20. Reakcja Wittiga z zastosowaniem bromku tributyloallilofosfoniowego i zasady litowej

W mieszaninie 20 ml toluenu i 3 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono bromek tributyloallilofosfoniowy (1,38 g, 4,3 mmola). W temperaturze około -78°C powoli dodano butylolit (1,6M w heksanie, 2,43 ml, 3,9 mmola). Otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez około 10 minut w około -78°C, po czym dodano powoli roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) w 6 ml toluenu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny reakcyjnej przez 3,5 godziny reakcję przerwano przez wprowadzenie mieszaniny reakcyjnej do mieszaniny 50 ml toluenu i wodnego roztworu kwasu fosforowego (0,25 g, 2,2 mmola). Przed rozdzieleniem dwóch warstw dopuszczono do ogrzania się powstałej dwufazowej mieszaniny do temperatury pokojowej. Warstwę toluenową przemyto 20 ml wody i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 80%, w postaci żółtawej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 70% izomeru E i około 30% izomeru Z (jak oznaczono to metodą spektroskopii ¹H-NMR).

P r z y k ł a d 21. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributyloallilofosfoniowego i zasady litowej

Reakcję SAP018 prowadzono w sposób opisany powyżej, ale w temperaturze około -40°C. Powtórzono warunki doświadczalne przykładu 20, stosując w tym przypadku temperaturę prowadzenia reakcji około -40°C. W tych warunkach stosunek izomerów w wyodrębnionym produkcie, acetylowanym ISATX247, odpowiadał zawartości około 74% wag. izomeru E i około 26% wag. izomeru Z, jak oznaczono to metodą spektroskopii ¹H-NMR.

P r z y k ł a d 22. Reakcja Wittiga z użyciem bromku tributyloallilofosfoniowego

Roztwór aldehydu acetylocyklosporyny A (1,5 g, 1,2 mmola) i bromku tributyloallilofosfoniowego (0,99 g, 3,1 mmola) w 15 ml tetrahydrofuranu ochłodzono do temperatury około -80°C. Powoli dodano t-butanolan potasu (0,19 g, 1,7 mmola) rozpuszczony w 9 ml tetrahydrofuranu. W celu zakończenia reakcji otrzymaną żółtą mieszaninę mieszano przez jedną godzinę w około -80°C, po czym dodano powoli roztwór 6 ml tetrahydrofuranu. Po mieszaniu żółtopomarańczowej mieszaniny reakcyjnej przez

1,5 godziny reakcja była zakończona. W celu przerwania reakcji do mieszaniny dodano wodny roztwór kwasu fosforowego (0,15 g, 1,3 mmola). Otrzymaną mieszaninę zatężono i pozostałość rozpuszczono w 5 ml metanolu. Następnie mieszaninę powoli dodano do 5 ml wody. Otrzymany osad odsączono, przemyto 4 ml mieszaniny metanol/woda (1:1) i wysuszono pod próżnią. Produkt, acetylowany ISATX247, otrzymano z wydajnością około 90%, w postaci bezbarwnej substancji stałej. Stosunek izomerów odpowiadał zawartości około 91% wag. izomeru E i około 9% izomeru Z (oznaczony metodą spektroskopii ¹H-NMR).

P r z y k ł a d 23. Ozonoliza acetylo-CsA

Roztwór acetylocyklosporyny A (15 g, 12,1 mmola) w 200 ml metanolu ozonowano w temperaturze -78°C, stosując generator ozonu Sandera pod ciśnieniem około 0,11 MPa, przy przepływie 300 litrów O2/godzinę do zakończenia reakcji (około 5 minut). Przez roztwór przepuszczono argon i dodano sulfid dimetylowy rozpuszczony w metanolu. Dla zakończenia redukcji mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokójowej. Po zatężeniu do około 50 ml roztwór powoli dodano do 500 ml wody. Powstały osad odsączono, przemyto 60 ml wody i wysuszono pod próżnią. Produkt, aldehyd acetylowanego CsA otrzymano w postaci bezbarwnej substancji stałej, z wydajnością około 95% i czystością około 98% (oznaczoną metodą HPLC).

P r z y k ł a d 24. Wytwarzanie cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową

W 30°C rozpuszczono cyklosporynę A (40 g, 1 równoważnik) w dichlorometanie (100 ml) i dodano N,N-bis-(trimetylosililo)mocznik (1,1 równoważnika). Po mieszaniu przez 5 minut w 30°C dodano kwas p-toluenosulfonowy (0,02 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin do zakończenia reakcji, monitorowanej metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), wysokociśnieniowej lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub spektrometrii masowej (MS), a następnie mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano w połowie nasycony wodny roztwór wodorowęglanu sodu (100 ml). Fazę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano dichlorometanem. Połączone fazy organiczne wysuszono nad bezwodnym

PL 210 795 B1

Na2SO4 i przesączono. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano surową cyklosporynę A zabezpieczoną grupą trimetylosililową.

P r z y k ł a d 25. Wytwarzanie aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową

Cyklosporynę A zabezpieczoną grupą trimetylosililową (5 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w dichlorometanie (50 ml) i roztwór ochłodzono do temperatury około -78°C, po czym przez roztwór przepuszczano pęcherzykami ozon, aż do pojawienia się niebieskiego zabarwienia. Następnie, w celu usunięcia ozonu przez roztwór, przepuszczano argon, aż do uzyskania bezbarwnego roztworu, przy czym etap ten prowadzi się w celu usunięcia nadmiaru ozonu. Dodano trietyloaminę (5 równoważników) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 17 godzin. Po obróbce wodą otrzymano aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

P r z y k ł a d 26. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 3:1 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga

Do mieszaniny t-butanolanu potasu (3 równoważniki) i bromku allilotrifenylofosfoniowego (2 równoważniki) w toluenie (10 ml), uprzednio mieszanej przez 60 minut, dodano aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g, 1 równoważnik). Po prowadzeniu reakcji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę 3:1 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

P r z y k ł a d 27. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:1 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga

Aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (2,5 g) rozpuszczono w 25 ml toluenu i podziałano nań 1N wodnym roztworem wodorotlenku sodu (10 równoważników). Mieszaninę reakcyjną intensywnie mieszano i dodano bromek allilotrifenylofosfoniowy (7,5 równoważnika, porcjami). Po prowadzeniu reakcji przez kilka godzin w temperaturze pokojowej i obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę około 1:1 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

P r z y k ł a d 28. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:2 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga

Aldehyd cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g) rozpuszczono w 5 ml toluenu razem z węglanem potasu (1,5 równoważnika) i bromkiem allilotrifenylofosfoniowym (1,5 równoważnika). Po prowadzeniu reakcji przez 4 godziny w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w trakcie intensywnego mieszania, a następnie po obróbce mieszaniny reakcyjnej otrzymano mieszaninę około 1:2 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

P r z y k ł a d 29. Wytwarzanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową w postaci mieszaniny o stosunku 1:3 izomerów Z:E podwójnego wiązania, w reakcji Wittiga

Bromek allilotributylofosfoniowy (3 równoważniki, wytworzony z bromku allilu i tributylofosflny) rozpuszczono w THF (3,5 ml). Dodano toluen (7,5 ml), a następnie t-butanolan potasu (4 równoważniki). Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, mieszaninę ochłodzono do około -30°C. Wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (1 g, 1 równoważnik) w toluenie (5 ml). Po 45 minutach w około -30°C, mieszaninę poddano obróbce, w wyniku czego otrzymano mieszaninę około 1:3 (NMR) izomerów Z i E podwójnego wiązania dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

Poniższe dwa przykłady 30 i 31 dotyczą allilometalowania.

P r z y k ł a d 30. Wytwarzanie β-trimetylosililoalkoholu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową

Do roztworu allilotrimetylosilanu (10,1 równoważnika) w THF (15 ml) w temperaturze pokojowej dodano butylolit (1,6M w heksanach, 10 równoważników). Po prowadzeniu reakcji przez 30 minut roztwór ochłodzono do -75°C i potraktowano dietylo-B-metoksyborem (10,1 równoważnika). Po 1 godzinie dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (10,1 równoważnika), w celu wytworzenia B-(Y-trimetylosililoallilo)dietyloboru. Po 1 godzinie wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (5 g, 1 równoważnik) w THF (15 ml). Po 20 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do -10°C i dodano nasycony wodny roztwór NH4CI. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej dodano wodę (45 ml) i mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano 3 razy 25 ml octanu etylu. Fazy organiczne przemyto kolejno wodą (25 ml) i nasyconym wodnym roztworem NH4CI (25 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt poddano chromatografii (żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol lub

PL 210 795 B1 octan etylu/heptan), w wyniku czego otrzymano β-trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową.

P r z y k ł a d 31. Wytwarzanie β-trimetylosililoalkoholu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową

Do roztworu allilotrimetylosilanu (10,1 równoważnika) w THF (15 ml) w temperaturze pokojowej dodano butylolit (1,6M w heksanach, 10 równoważników). Po 30 minutach reakcji roztwór ochłodzono do -65°C i potraktowano dietylo-B-metoksyborem (10,1 równoważnika). Po 1 godzinie dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (10,1 równoważnika), z wytworzeniem B-(Y-trimetylosililoallilo)dietyloboru. Po 1 godzinie wkroplono roztwór aldehydu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (5 g, 1 równoważnik) w THF (15 ml). Po 15 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do 10°C i dodano nasycony wodny roztwór NH4CI. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej dodano wodę (12,5 ml) i nasycony NaHCO3 (25 ml). Mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano dwukrotnie 25 ml eteru t-butylowo-metylowego. Fazy organiczne przemyto dwukrotnie wodą (2 x 25 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (25 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt poddano chromatografii (żel krzemionkowy, heptan/octan etylu), w wyniku czego otrzymano β-trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową.

Poniższe trzy przykłady 32, 33 i 34 dotyczą reakcji eliminacji Petersona.

P r z y k ł a d 32. Wytwarzanie E-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (100 mg, 1 równoważnik) rozpuszczono w THF (1 ml). Dodano stężony H2SO4 (1,24 ml, 3 równoważniki) i w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc. Dodano wodę (150 ml) i mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (200 ml). Fazę wodną ponownie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (150 ml). Fazy organiczne przemyto wodą (150 ml). Połączone fazy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego uzyskano dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (ISATX247 zabezpieczony grupą acetylową). Surowy produkt poddano krystalizacji z mieszaniny eter t-butylowo-metylowy/THF oraz rekrystalizacji z mieszaniny eter t-butylowo-metylowy/DCM, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową (ISATX247 zabezpieczony grupą acetylową), w postaci mieszaniny 99-97%:1-3% izomerów E i Z wiązania podwójnego (400 MHz, NMR, 2% błąd pomiaru).

Hydrolizę E-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą acetylową przeprowadzono następująco: dien acetylocyklosporyny A (4 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w metanolu (80 ml) i wodzie (32 ml). Dodano węglan potasu (3,65 g, 8,3 równoważnika). Po mieszaniu przez 15 godzin w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną ogrzewano w 40°C przez 4 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (70 ml). Powoli dodano 15% wodny roztwór kwasu cytrynowego (30 ml), a następnie wodę (10 ml). Warstwę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano octanem etylu (56 ml). Fazy organiczne przemyto wodą (30 ml), 15% roztworem kwasu cytrynowego (40 ml) i nasyconym roztworem NaCl (30 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247) w postaci mieszaniny 98:2 izomerów E/Z wiązania podwójnego (400 MHz NMR, około 2-3% błędu). Patrz R. W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, tom 555 (1982); W. R. Roush, „Allylorganometallics”, Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, tom 2, str. 1-53; oraz Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, str. 2307 (1993).

P r z y k ł a d 33. Wytwarzanie Z-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową i jego przeprowadzanie w Z-dien cyklosporyny A (ISATX247) β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (2 g, 1 równoważnik) rozpuszczono w THF (20 ml). Roztwór ochłodzono do 0-2°C i dodano t-butanolan potasu (4 równoważniki). Po prowadzeniu reakcji przez 1,5 godziny dodano octan etylu (20 ml) i wodę (40 ml). Oddzielono warstwę wodną i wyekstrahowano ją ponownie octanem etylu (20 ml). Fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl (20 ml). Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano mieszaninę Z-dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (ISATX247 zabezpieczony grupą trimetylosililową) i Z-dienu cyklosporyny A (izomeru Z ISATX247). Odsililowanie zakończono przez rozpuszczenie surowej mieszaniny w metanolu (roztwór 10% wag.) i dodanie 1M wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego (1 równoważnik). Po 15 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę i octan etylu. Warstwę wodną oddzielono i ponownie wyekstrahowano octanem etylu. Fazy or38

PL 210 795 B1 ganiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247), w postaci mieszaniny 94:6 izomerów Z i E wiązania podwójnego (NMR).

P r z y k ł a d 34. Wytwarzanie E-dienu cyklosporyny A (ISATX247) β-Trimetylosililoalkohol cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową (500 mg, 1 równoważnik) rozpuszczono w dichlorometanie. Roztwór ten ochłodzono do temperatury około 0-2°C i dodano kompleks eteru dietylowego i trifluorku boru (5 równoważników). Po 1 godzinie dodano wodę (20 ml) i dichlorometan (20 ml). Oddzielono warstwę organiczną i przemyto ją wodą (20 ml), wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego bezpośrednio otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247), w postaci mieszaniny 91:9 wag. izomerów E i Z wiązania podwójnego (NMR).

P r z y k ł a d 35. Odbezpieczanie dienu cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową

Dien cyklosporyny A zabezpieczonej grupą trimetylosililową rozpuszczono w metanolu (roztwór 10% wag.). Na roztwór ten podziałano 1M wodnym roztworem kwasu chlorowodorowego (1 równoważnik). Po 15 minutach w temperaturze pokojowej dodano wodę i octan etylu. Wodną warstwę oddzielono i ponownie wyekstrahowano ją octanem etylu. Fazy organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano dien cyklosporyny A (ISATX247).

P r z y k ł a d 36. Epoksydowanie acetylocyklosporyny A

Acetylocyklosporynę A (2,0 g, 1,61 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (30 ml). Dodano 1,3-diacetoksyaceton (0,14 g, 0,8 mmola), a następnie 0,0004M wodny roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (20 ml) i wodorowęglanu sodu (0,405 g, 4,82 mmola). W ciągu 2 godzin do mieszaniny w trakcie mieszania dodano porcjami okson (43,8% KHSO5) (2,23 g, 6,43 mmola). Utrzymywano pH 8,2 przez ciągłe dodawanie 1N NaOH (całkowita ilość 6,4 ml) za pomocą pH-statu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 22-25°C przez sporadyczne chłodzenie w łaźni z zimną wodą. Po

2,5 godziny reakcję przerwano przez dodanie kilku kropli roztworu wodorosiarczynu sodu. Dodano wodę (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (100 ml, a następnie 75 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je ze sobą, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono, w wyniku czego otrzymano surowy epoksyd acetylocyklosporyny A (1,92 g, 95%; HPLC: 99,4% powierzchni), w postaci białej, stałej piany.

P r z y k ł a d 37. Wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A

Surowy epoksyd acetylocyklosporyny A (1,92 g, 1,52 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (25 ml). Dodano wodę (20 ml), a następnie nadjodan sodu (489 mg, 2,28 mmola) i 0,5M kwas siarkowy (3,05 ml, 1,52 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 40°C przez 18 godzin, a następnie usunięto nadmiar nadjodanu sodu przez dodanie wodnego roztworu wodorosiarczynu sodu. Dodano rozcieńczony roztwór chlorku sodu (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (za każdym razem po 100 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono i uzyskano surowy aldehyd acetylocyklosporyny A (1,74 g, 92%; HPLC: 95,7% powierzchni), w postaci białej piany. Surowy produkt poddano chromatografii ma żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt w postaci białej, stałej piany (1,41 g, 71% w przeliczeniu na acetylocyklosporynę A; HPLC: 100% powierzchni).

P r z y k ł a d 38. Wytwarzanie aldehydu acetylocyklosporyny A realizowane w jednym reaktorze

Acetylocyklosporynę A (2,0 g, 1,61 mmola) rozpuszczono w acetonitrylu (30 ml). Dodano 1,3-diacetoksyaceton (0,084 g, 0,48 mmola), a następnie 0,0004M wodny roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (20 ml) i wodorowęglan sodu (0,405 g, 4,82 mmola). W ciągu 2 godzin do mieszaniny w trakcie mieszania dodano porcjami okson (43,8% KHSO5) (1,67 g, 4,82 mmola). Utrzymywano pH 8,2 przez ciągłe dodawanie 1N NaOH (całkowita ilość 3,4 ml) za pomocą pH-statu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 20-25°C. Po 3,5 godzinie do mieszaniny reakcyjnej dodano 0,5M kwas siarkowy (5 ml, 2,5 mmola), a następnie kilka kropli stężonego kwasu siarkowego do osiągnięcia pH 1,3. Następnie, dodano nadjodan sodu (516 mg, 2,41 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i w 40°C przez 22 godziny. Dodano wodę (100 ml) i mieszaninę dwukrotnie wyekstrahowano eterem t-butylowo-metylowym (100 ml, a następnie 75 ml). Organiczne ekstrakty przemyto rozcieńczonym wodnym roztworem chlorku sodu (100 ml), połączono je ze sobą, wysuszono nad Na2SO4 i zatężono, w wyniku czego otrzymano surowy aldehyd acetylocyklosporyny A (1,9 g, 96%; HPLC: 83,4% powierzchni), w postaci białej piany. Surowy produkt poddano

PL 210 795 B1 chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem jako eluenta mieszaniny 40% aceton/60% heksan i otrzymano produkt w postaci białej, stałej piany (1,35 g, 68% w przeliczeniu na acetylocyklosporynę A; HPLC: 100% powierzchni).

P r z y k ł a d 39. (ISO) Reakcja Wittiga aldehydu acetylocyklosporyny A z 3-dimetyloaminopropylotrifenylofosforylidenem

Stereoselektywne wytwarzanie 1,3-dienów opisali E. J. Corey i M. C. Desai w Tetrahedron Letters, tom 26, nr 47, str. 5747-8, (1985). W publikacji tej ujawniono, że ylid otrzymany przez podziałanie na 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosforan heksametylodisilazydkiem potasu może ulegać reakcji Wittiga z aldehydem, w wyniku czego selektywnie tworzy się Z-alkenylodimetyloamina. W wyniku utleniania aminy kwasem m-chloronadbenzoesowym otrzymano odpowiedni N-tlenek, który można następnie ogrzewać w reakcji znanej jako eliminacja Cope'a, z wytworzeniem żądanego 1,3-dienu, w którym konfiguracja olefiny utworzonej w rekcji Wittiga jest wyłącznie Z, czyli cis.

Analogicznie, izomer z ISATX247 można wytworzyć w reakcji aldehydu acetylocyklosporyny A z ylidem otrzymanym przez podziałanie na bromek 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosfoniowy heksametylodisilazydkiem potasu. Otrzymany związek pośredni utlenia się, a następnie poddaje eliminacji Cope'a, z wytworzeniem acetylo-(Z)-ISATX247. W wyniku odbezpieczania z użyciem zasady otrzymuje się (Z)-ISATX247. Odczynnikiem utleniającym może być kwas m-chloronadbenzoesowy.

Do zawiesiny bromku 3-dimetyloaminopropylotrifenylofosfoniowego (2,5 g, 5,83 mmola) w bezwodnym toluenie (20 ml) w trakcie mieszania dodano za pomocą strzykawki heksametylodisilazydek potasu (11,6 ml, 5,8 mmola, 0,5M roztwór w toluenie). Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, czerwony roztwór odwirowano i przez kaniulę przeniesiono supernatant do kolby reakcyjnej. Na substancję stałą podziałano bezwodnym toluenem (10 ml), roztwór mieszano i odwirowano. Supernatant przeniesiono do kolby reakcyjnej i do połączonego czerwonego roztworu ylidu dodano OAc-CsA-CHO (1,44 g, 1,17 mmola). Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 2 godziny, przy czym barwa zmieniła się na jasnożółtą. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (50 ml) i przemyto kolejno nasyconym roztworem NaHCO3 (50 ml) i solanką (50 ml). Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano bladożółtą substancję stałą. W wyniku chromatografii w kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym z elucją mieszaniną aceton/heksany (gradient: 10 do 75% acetonu i 90 do 25% heksanów) usunięto wszystkie zanieczyszczenia związane z fosforem. W wyniku dalszej elucji acetonem otrzymano żądany produkt w postaci bezbarwnej substancji stałej (1,28 g, wydajność 84%).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): 2,23 (s, 6H), 2,03 (s, 3H).

¹³C NMR (300 MHz, CDCI3): 129,33, 126,95.

MS m/z: 1301 (M⁺), 1324 (M + Na⁺).

Przemiana w N-tlenek

Do ochłodzonego (0°C) roztworu związku dimetyloaminowego otrzymanego w reakcji Wittiga (0,44 g, 0,34 mmola) w CHCI3 (3 ml) w trakcie mieszania dodano roztwór m-CPBA (0,07 g, 0,405 mmola) w CHCI3 (2 ml). Po mieszaniu przez 30 minut dodano sulfid dimetylowy (0,5 ml), a następnie CH2CI2 (50 ml). Po przemywaniu roztworem NaHCO3 (25 ml) i wodą (25 ml), wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano substancję stałą (0,43 g).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3): 3,19 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,03 (s, 3H).

¹³C NMR (300 MHz, CDCI3): 131,89, 124,13.

MS m/z: 1340 (M + Na⁺).

Eliminacja Cope'a N-tlenku. Wytwarzanie izomeru (Z)-acetylo-ISATX247

Sam N-tlenek (350 mg) mieszano i ogrzewano w 100°C pod próżnią przez 2 godziny. Następnie przepuszczono go przez kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym. W wyniku elucji mieszaniną aceton/heksany (gradient: 5 do 25% acetonu i 95 do 75% heksanów) otrzymano bezbarwną substancję stałą (314 mg).

¹H NMR (500 MHz, CDCI3): 6,49 (dt, J = 16,99, 10,5 Hz, 1H).

¹³C NMR (400 MHz, CDCI3): 132,20, 131,09, 129,70, 116,85.

MS m/z: 1279 (M + Na⁺).

Izomer (Z) ISATX247

Do roztworu (Z)-acetylo-ISATX247 (50 mg) w MeOH (4 ml) dodano wodę (1,5 ml) i K2CO3 (60 mg) i w temperaturze pokojowej mieszano przez 48 godzin. z mieszaniny reakcyjnej usunięto rozpuszczal40

PL 210 795 B1 niki i wyekstrahowano ją EtOAc (20 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą (10 ml) i solanką (10 ml). Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika otrzymano bezbarwną substancję stałą.

¹H NMR (500 MHz, CDCI3): 6,58 (dt, J = 16,99, 10,5 Hz, 1H).

MS m/z: 1236,8 (M + Na⁺).

Otrzymany związek był izomerem (Z) ISATX247. Metodą NMR nie wykryto obecności izomeru (E).

Literatura

W stosownych częściach opisu odniesienia do poniższych pozycji literaturowych lub powoływania się na nie zaznaczono numerami opisów lub zgłoszeń patentowych albo przez podanie w nawiasach autora i roku publikacji.

Bennett, W. M., „The nephrotoxicity of new and old immunosuppressive drugs” Renal Failure, tom 20, str. 687-90 (1998).

J. -F. Biellmann, J. -B. Ducep w „Allylic and benzylic carbanions substituted by heteroatoms” Organic Reactions, torn 27 (Wiley, New York, 1982), str. 9.

H. J. Carlsen i in. w „A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds” J”. Org. Chem., tom 46, nr 19, str. 3736-3738 (1981).

T. Chang, L. Z. Benet, M. F. Hebert, „The effect of water-soluble vitamin E on cyclosporine pharmacokinetics in healthy volunteers” Clin. Pharmacol. Ther., tom 59, str. 297-303 (1996).

E. J. Corey, M. C. Desai w Tetrahedron Letters, tom 26, nr 47, str. 5747-8, (1985).

M. K. Eberle, F. Nuninger, „Synthesis of the main metabolite (OL-17) of cyclosporin A” J. Org. Chem., tom 57, str. 2689-2691 (1992).

E. Ehlinger, P. Magnus w „Silicon in synthesis. 10. The (trimethylsilyl)allyl anion: A β-acyl anion equivalent for the conversion of aldehydes and ketones into Y-lactones” J. Am. Chem. Soc., tom 102, nr 15, str. 5004-5011 (1980).

D. S. Fruman, C. B. Klee, B. E. Bierer, S. J. Burakoff, „Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK506 and cyclosporin A” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom 89, str. 3686-90 (1992).

A. Granelli-Piperno, L. Andrus, R. M. Steinman, „Lymphokine and nonlymphokine mRNA levels in stimulated human cells: kinetics, mitogen requirements, and effects of cyclosporin A” J. Exp. Med., tom 163, str. 922 (1986).

J. R. Hanson, „The Protection of Alcohols” Protecting Groups in Organic Synthesis, rozdz. 2, str. 24-25 (Sheffield Academic Press, Sheffield, England, 1999).

M. F. Hebert, J. P. Roberts, T. Prueksaritanont, L. Z. Benet, „Bioavailability of cyclosporin with concomitant rifampin administration is markedly less than predicted by hepatic enzyme induction” Clin. Pharmacol Ther., tom 52, str. 453-7 (1992).

R. W. Hoffmann, Angewandte Chemie International Edition, tom 555 (1982).

R. W. Hoffmann, H. -J Zei, „Stereoselective synthesis of alcohols. 8. Diastereoselective synthesis of β-methylhomoallyl alcohols via crotylboronates” J. Org. Chem., tom 46, str. 1309-1314 (1981).

P. F. Hurdlik i D. Peterson w „Stereospecific Olefin-Forming Elimination Reactions of β-Hydroxysilanes” J. Am. Chem. Soc, tom 97, nr 6, str. 1464-1468 (1975).

Y. Ikeda, J. Ukai, N. Ikeda, H. Yamamoto, „Stereoselective synthesis of (Z)- and (E)-1,3-alkadienes from aldehydes using organotitanium and lithium reagents” Tetrahedron, tom 43, nr 4, str. 723-730 (1987).

Kobel i in., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology, tom 14, str. 237-240 (1982).

J. McMurry, Organic Chemistry, 5. wydanie (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), str. 780-783.

M. T. Reetz w Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), str. VII, 148-149 i 164-165.

Rich i in., J. Med. Chem., tom 29, str. 978 (1986).

W. R. Roush, „Allylorganometallics” Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon Press, tom 2, str. 1-53.

S. L. Schreiber, G. R. Crabtree, „The mechanism of action of cyclosporin A and FK506” Immunol. Today, tom 13, str. 136-42 (1992).

I. Sketris, R. Yatscoff, P. Keown, D. M. Canafax, M. R. First, D. W. Holt, T. J. Schroeder, M. Wright, „Optimizing the use of cyclosporine in renal transplantation” Clin. Biochem., tom 28, Str. 195-211 (1995).

M. B. Smith i J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), str. 144-147.

PL 210 795 B1

A. Streitwieser, C. H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2. wydanie (Macmillan, New York, 1981), str, 845-846.

J. A. Thliveris, R. W. Yatscoff, M. P. Lukowski, K. R. Copeland, J. R. Jeffery, G. F. Murphy, „Chronic Ciclosporin nephrotoxicity: A rabbit model” Nephron. tom 57, str. 470-6 (1991).

J. A. Thliveris, R. W. Yatscoff, M. J. Mihatsch, „Chronic cyclosporine-induced nephrotoxicity: A rabbit model” Transplantation, tom 57, str. 774-6 (1994).

S. E. Thomas w Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), str. 84-87.

Traber i in., Helv. Chim. Acta, tom 60, str. 1247-1255 (1977).

Traber i in., Helv. Chim. Acta, tom 65, str. 1655-1667 (1982).

D. S. Tsai, D. S. Matteson, „A stereocontrolled synthesis of (Z) and (E) terminal dienes from pinacol (E)-1-trimethylsilyl-1-propene-3-boronate” Tetrahedron Letters, tom 22, nr 29, str. 2751-2752 (1981).

H. A. Valantine, J. S. Schroeder, „Recent advances in cardiac transplantation” [od wydawcy; komentarz], N. Engl. J. Med., tom 333, nr 10, str. 660-1 (1995).

von Wartburg i in., Progress in Allergy, tom 38, str. 28-45 (1986).

Wenger, Transpl. Proc, tom 15, Supl. 1, str. 2230 (1983).

Wenger, Angew. Chem. Int. Ed., tom 24, str. 77 (1985).

Wenger, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, tom 50, str. 123 (1986).

Y. Yamamoto, N. Asao, Chemical Reviews, str. 2307 (1993).

Dan Yang i in., „A C2 Symmetric Chiral Ketone for Catalytic Asymmetric Epoxidation of Unfunctionalized Olefins” J. Am. Chem. Soc, tom 118, str. 491-492 (1996).

Dan Yang i in., „Novel Cyclic Ketones for Catalytic Oxidation Reactions” J. Org. Chem., tom 63, str. 9888-9894 (1998).

Opis patentowy US nr 4 108 985.

Opis patentowy US nr 4 160 452.

Opis patentowy US nr 4 210 581.

Opis patentowy US nr 4 220 641.

Opis patentowy US nr 4 256 108.

Opis patentowy US nr 4 265 874.

Opis patentowy US nr 4 288 431.

Opis patentowy US nr 4 384 996.

Opis patentowy US nr 4 396 542.

Opis patentowy US nr 4 554 351.

Opis patentowy US nr 4 771 122.

Opis patentowy US nr 5 284 826.

Opis patentowy US nr 5 525 590.

Publikacja europejskiego opisu patentowego nr 0 034 567.

Publikacja europejskiego opisu patentowego nr 0 056 782.

Publikacja zgłoszenia międzynarodowego nr WO 86/02080.

Publikacja zgłoszenia międzynarodowego nr WO 99/18120.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), znamienny tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (E) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z reagentem wybranym z grupy obejmującej estry Y-(trialkilosililoalliloboronianowe i związki E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkiloborowe, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu, z wytworzeniem acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E) ISATX247.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas Lewisa.

PL 210 795 B1
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ester Y-(trialkilosililoallilo)boronianowy stosuje się ester trimetylosililoalliloboronianowy.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkilobor stosuje się (E-Y-trimetylosililoallilo)-9-BBN.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako reagent stosuje się E-Y-(triemetylosililoallilo)dietylobor.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że acetylo-1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosflny i trialkiloaminy.
13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
18. Sposób według zastrz. 10-17, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
22. Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), znamienny tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (Z) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z reagentem wybranym z grupy obejmującej estry Y-(trialkilosililoallilo)boronianowe i związki E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkiloborowe, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

PL 210 795 B1

c) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorek sodu i wodorek potasu.
24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.
25. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako ester Y-(trialkilosililoallilo)boronianowy stosuje się ester trimetylosililoalliloboronianowy.
26. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako E-Y-(trialkilosililoallilo)dialkilobor stosuje się (E-Y-trimetylosililoallilo)-9-BBN.
27. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako reagent stosuje się E-Y-(trimetylosililoallilo)dietylobor.
28. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.
30. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że acetylo-1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
31. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
33. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.
34. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
35. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
36. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
38. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
39. Sposób według zastrz. 31-38, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
41. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
43. Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (E), znamienny tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (E) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z litowanym tlenkiem allilodifenylofosflny, z wytworzeniem acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

PL 210 795 B1

b) acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E) ISATX247.
44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.
46. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że acetylo-1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
47. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
48. Sposób według zastrz. 47, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
49. Sposób według zastrz. 47, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosflny i trialkiloaminy.
50. Sposób według zastrz. 47, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
51. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfInę.
52. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
53. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
54. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
55. Sposób według zastrz. 47-54, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
57. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
58. Sposób według zastrz. 57, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
59. Sposób wytwarzania mieszaniny ISATX247 wzbogaconej w izomer (Z), znamienny tym, że stereoselektywna synteza materiału wzbogaconego w izomer (Z) obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z [3-(difenylofosfino)allilo]tytanem, z wytworzeniem związku pośredniego zawierającego tytan;

b) umożliwia się przeprowadzenie związku pośredniego zawierającego tytan w erytro-a-addukt;

c) erytro-a-addukt przeprowadza się w sól β-oksydofosfoniową przez podziałanie jodometanem;

d) sól β-oksydofosfoniową przeprowadza się w acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien; oraz

e) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.
60. Sposób według zastrz. 59, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.

PL 210 795 B1
62. Sposób według zastrz. 59, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
63. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
64. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.
65. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
66. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
67. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
68. Sposób według zastrz. 67, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
69. Sposób według zastrz. 65, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
70. Sposób według zastrz. 62-69, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
71. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
72. Sposób według zastrz. 59, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
73. Sposób według zastrz. 72, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
74. Sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A poddaje się reakcji z E-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu; oraz

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu, z wytworzeniem izomeru (E) ISA_TX247.
75. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas Lewisa.
76. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że jako kwas stosuje się BF3.
77. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że E-Y-(trialkilosililoallilo)bor wytwarza się w etapach, w których:

a) allilotrialkilosilan odprotonowuje się z użyciem zasady; oraz

b) odprotonowany allilotrialkilosilan poddaje się reakcji z dialkiloalkoksyborem i kwasem Lewisa.
78. Sposób według zastrz. 77, znamienny tym, że jako dialkiloalkoksybor stosuje się dietylometoksybor, a jako kwas Lewisa stosuje się BF3.
79. Sposób według zastrz. 77, znamienny tym, że jako allilotrialkilosilan stosuje się allilotrimetylosilan.
80. Sposób według zastrz. 77, znamienny tym, że do odprotonowania allilotrialkilosilanu jako zasadę stosuje się butylolit.
81. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.
82. Sposób według zastrz. 74, znamienny tym, że trimetylosililo(TMS)cyklosporynę A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A; oraz

PL 210 795 B1

b) (TMS)cyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A.
83. Sposób według zastrz. 82, znamienny tym, że w ozonolizie stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dichlorometan oraz mieszaninę dichlorometanu i niższego alkoholu.
84. Sposób według zastrz. 83, znamienny tym, że jako niższy alkohol stosuje się metanol.
85. Sposób według zastrz. 82, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
86. Sposób według zastrz. 82, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.
87. Sposób według zastrz. 82, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
88. Sposób według zastrz. 86, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
89. Sposób według zastrz. 86, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
90. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
91. Sposób według zastrz. 87, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
92. Sposób według zastrz. 82 albo 85-91, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
93. Sposób według zastrz. 92, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
94. Sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A poddaje się reakcji z E-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem TMS-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) odbezpiecza się TMS-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.
95. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że E-Y-(trialkilosililoallilo)bor wytwarza się w etapach, w których:

a) allilotrialkilosilan odprotonowuje się z użyciem zasady; oraz

b) odprotonowany allilotrialkilosilan poddaje się reakcji z dialkiloalkoksyborem i kwasem Lewisa.
96. Sposób według zastrz. 95, znamienny tym, że jako dialkiloalkoksybor stosuje się dietylometoksybor, a jako kwas Lewisa stosuje się BF3.
97. Sposób według zastrz. 95, znamienny tym, że jako allilotrialkilosilan stosuje się allilotrimetylosilan.
98. Sposób według zastrz. 95, znamienny tym, że do odprotonowania allilotrialkilosilanu jako zasadę stosuje się butylolit.
99. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.
100. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu i niższe alkoholany metali alkalicznych.
101. Sposób według zastrz. 100, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się t-butanolan potasu.
102. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że odbezpieczanie prowadzi się z użyciem kwasu wybranego z grupy obejmującej kwas chlorowodorowy, kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas Lewisa i reagenty na bazie HF.
103. Sposób według zastrz. 102, znamienny tym, że stosuje się reagent na bazie HF wybrany z grupy obejmującej fluorek tributyloamoniowy i fluorek potasu.
104. Sposób według zastrz. 94, znamienny tym, że trimetylosililo (TMS) cyklosporynę A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A; oraz

b) (TMS)cyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu trimetylosililo(TMS)cyklosporyny A.

PL 210 795 B1
105. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że w ozonolizie stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej dichlorometan oraz mieszaninę dichlorometanu i niższego alkoholu.
106. Sposób według zastrz. 105, znamienny tym, że jako niższy alkohol stosuje się metanol.
107. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
108. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosflny i trialkiloaminy.
109. Sposób według zastrz. 104, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
110. Sposób według zastrz. 108, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
111. Sposób według zastrz. 108, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
112. Sposób według zastrz. 111, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
113. Sposób według zastrz. 109, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
114. Sposób według zastrz. 104 albo 107-113, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
115. Sposób według zastrz. 114, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
116. Sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (E) ISATX247, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny A poddaje się reakcji z E-Y-(trialkilosililoallilo)borem, z wytworzeniem β-trialkilosililoalkoholu;

b) β-trialkilosililoalkohol poddaje się działaniu kwasu, z wytworzeniem acetylo-(E)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

c) acetylo-(E)-1,3-dien poddaje się działaniu zasady, z wytworzeniem izomeru (E) ISATX247.
117. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że w etapie działania kwasem na β-trialkilosililoalkohol prowadzi się reakcję olefinowania Petersona.
118. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że jako reagent borowy stosuje się E-Y-(trimetylosililoallilo)dietylobor.
119. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas siarkowy i kwas Lewisa.
120. Sposób według zastrz. 119, znamienny tym, że jako kwas stosuje się kwas siarkowy.
121. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że 1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
122. Sposób według zastrz. 121, znamienny tym, że stosuje się zasadę wybraną z grupy obejmującej NH3 i dimetyloaminę.
123. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
124. Sposób według zastrz. 123, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.
125. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
126. Sposób według zastrz. 125, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
127. Sposób według zastrz. 125, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.
128. Sposób według zastrz. 125, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.

PL 210 795 B1
129. Sposób według zastrz. 127, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
130. Sposób według zastrz. 127, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
131. Sposób według zastrz. 130, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
132. Sposób według zastrz. 128, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
133. Sposób według zastrz. 125-132, znamienny tym, że w ozonolizie acetylocyklosporyny A jako rozpuszczalnik stosuje się niższy alkohol.
134. Sposób według zastrz. 133, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
135. Sposób według zastrz. 116, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
136. Sposób według zastrz. 135, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
137. Sposób stereoselektywnej syntezy izomeru (Z) ISATX247, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

a) aldehyd acetylocyklosporyny poddaje się działaniu halogenku 3-(dimetyloamino)propylotrifenylofosfoniowym w obecności pierwszej zasady, z wytworzeniem acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy;

b) acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminę poddaje się działaniu środka utleniającego, z wytworzeniem tlenku acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy;

c) ogrzewa się tlenek acetylo-(Z)-oktenylodimetyloaminy w procesie eliminacji Cope'a, z wytworzeniem acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dienu; oraz

d) acetylo-(Z)-cyklosporyno-1,3-dien poddaje się działaniu drugiej zasady, z wytworzeniem izomeru (Z) ISATX247.
138. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że jako pierwszą zasadę stosuje się heksametylodisilazydek potasu.
139. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że jako reagent utleniający stosuje się kwas m-chloronadbenzoesowy.
140. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że stosuje się drugą zasadę wybraną z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
141. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że 1,3-dien acetylocyklosporyny poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu, alkoholan potasu oraz zasady aminowe wybrane z grupy obejmującej NH3, hydroksyloaminę, hydrazynę i niższe dialkiloaminy.
142. Sposób według zastrz. 141, znamienny tym, że jako zasadę stosuje się dimetyloaminę.
143. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że acetylo-1,3-dien poddaje się działaniu zasady wybranej z grupy obejmującej wodorotlenek sodu, węglan sodu, węglan potasu, alkoholan sodu i alkoholan potasu.
144. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że aldehyd cyklosporyny A wytwarza się w etapach, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A; oraz

b) acetylocyklosporynę A utlenia się ozonem jako środkiem utleniającym, a następnie prowadzi się obróbkę środkiem redukującym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
145. Sposób według zastrz. 144, znamienny tym, że etap ozonolizy prowadzi się w temperaturze od około -80°C do 0°C.
146. Sposób według zastrz. 144, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej trialkilofosfiny, triarylofosfiny i trialkiloaminy.

PL 210 795 B1
147. Sposób według zastrz. 144, znamienny tym, że stosuje się środek redukujący wybrany z grupy obejmującej sulfidy alkiloarylowe, tiosiarczany i sulfidy dialkilowe.
148. Sposób według zastrz. 146, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się tributylofosfinę.
149. Sposób według zastrz. 146, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trialkiloaminę.
150. Sposób według zastrz. 149, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się trietyloaminę.
151. Sposób według zastrz. 147, znamienny tym, że jako środek redukujący stosuje się sulfid dimetylowy.
152. Sposób według zastrz. 144-151, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem stosowanym w ozonolizie acetylocyklosporyny A jest niższy alkohol.
153. Sposób według zastrz. 152, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się metanol.
154. Sposób według zastrz. 137, znamienny tym, że wytwarzanie aldehydu cyklosporyny A obejmuje etapy, w których:

a) β-alkohol cyklosporyny A zabezpiecza się przez wytworzenie acetylocyklosporyny A;

b) acetylocyklosporynę A przeprowadza się w epoksyd acetylocyklosporyny A, z użyciem mononadsiarczanu, korzystnie oksonu, w obecności ketonu, korzystnie aktywowanego ketonu, korzystnie acetoksyacetonu lub diacetoksyacetonu, przy pH wyższym niż 7; oraz

c) rozszczepia się epoksyd kwasem nadjodowym lub nadjodanem w środowisku kwaśnym, z wytworzeniem aldehydu acetylocyklosporyny A.
155. Sposób według zastrz. 154, znamienny tym, że etapy b i c łączy się ze sobą w jeden etap obróbki.
156. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATx247, znamienny tym, że obejmuje szlak syntezy, w którym tak wytwarza się izomer (E) i izomer (Z) ISATx247, że izomer (E) i izomer (Z) są obecne w mieszaninie w ustalonym stosunku, przy czym szlak syntezy obejmuje etapy, w których:

a) zabezpiecza się grupę β-alkoholową aminokwasu w pozycji 1 cyklosporyny A;

b) utlenia się zabezpieczoną cyklosporynę A, z wytworzeniem aldehydu zabezpieczonej cyklosporyny A;

c) przeprowadza się aldehyd zabezpieczonej cyklosporyny A w mieszaninę izomerów (E) i (Z) zabezpieczonego 1,3-dienu, poddając reakcji aldehyd zabezpieczonej cyklosporyny A z ylidem fosforowym drogą reakcji Wittiga, ewentualnie w obecności halogenku litu; oraz

d) wytwarza się mieszaninę izomerów (E) i (Z) przez odbezpieczenie zabezpieczonego 1,3-dienu.
157. Sposób według zastrz. 156, znamienny tym, że grupę β-alkoholową aminokwasu w pozycji 1 cyklosporyny A zabezpiecza się drogą reakcji z reagentem, w wytworzeniem zabezpieczonej cyklosporyny A wybranej z grupy obejmującej estry octanowe, estry benzoesanowe, podstawione estry benzoesanowe, etery i etery sililowe.
158. Sposób według zastrz. 156 albo 157, znamienny tym, że stosunek izomerów w mieszaninie izomerycznej mieści się w zakresie 45-55% wagowych izomeru (E) i 55-45% wagowych izomeru (Z), w przeliczeniu na całkowitą masę mieszaniny.
159. Sposób wytwarzania mieszaniny izomerów ISATx247 o ustalonym składzie, znamienny tym, że:

a) wytwarza się pierwszy składnik wzbogacony w izomer (E) ISATx247 sposobem określonym w zastrz. 1 albo 43;

b) wytwarza się drugi składnik wzbogacony w izomer (Z) ISATx247 sposobem określonym w zastrz. 22 albo 59; oraz

c) miesza się pierwszy i drugi składnik w ustalonym stosunku, z wytworzeniem żądanej kompozycji izomerów.