PL210453B1 - Ester kwasu aldonowego, substancja stała zawierająca ten ester, roztwór zawierający ten ester, sposób jego wytwarzania, sposób wytwarzania substancji farmaceutycznie czynnych sprzężonych za pomocą wolnych grup aminowych z polisacharydami lub pochodnymi polisacharydów oraz farmaceutyczna substancja czynna - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy estrów kwasu aldonowego, substancji stałych i roztworów zawierających te estry oraz sposobu ich wytwarzania. Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania farmaceutycznych substancji czynnych sprzężonych za pomocą wolnych grup aminowych z polisacharydami lub pochodnymi polisacharydów, który przebiega z zastosowaniem estru kwasu aldonowego oraz farmaceutycznych substancji czynnych, które dają się otrzymać tym sposobem.

Sprzęganie farmaceutycznych substancji czynnych, zwłaszcza protein, z pochodnymi poli(glikolu etylenowego) (PEGilowanie/PEGylierung) lub polisacharydami, takimi jak dekstran lub w szczególnoś ci hydroksyetyloskrobia (HESylowanie/HESylierung) zyskało w ostatnich latach na znaczeniu ze względu na wzrost ilości protein farmaceutycznych z badań biotechnologicznych.

Takie proteiny mają często zbyt krótki czas połowicznego rozkładu biologicznego, który można celowo wydłużyć przez sprzęganie z wyżej wymienionymi związkami polimerowymi, takimi jak PEG lub HES. Dzięki sprzęganiu można też dodatnio wpływać na własności antygenowe protein. W przypadku innych farmaceutycznych substancji czynnych dzięki sprzęganiu można znacznie zwiększyć rozpuszczalność w wodzie.

W niemieckich opisach patentowych DE 196 28 705 i DE 101 29 369 opisano sposoby, w których wskazano na możliwość przeprowadzania sprzęgania z hydroksyetyloskrobią w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) poprzez reakcję odpowiednich laktonów kwasów aldonowych hydroksyetyloskrobi z wolnymi grupami aminowymi hemoglobiny względnie amfoterycyny B.

Ponieważ w przypadku protein często nie można przeprowadzać reakcji w bezwodnych aprotycznych rozpuszczalnikach ze względu na rozpuszczalność lub też ze względu na denaturację proteiny, dlatego dysponuje się także sposobami sprzęgania z HES w ośrodku zawierającym wodę. Udało się np., sprzęganie hydroksyetyloskrobi selektywnie utlenionej do kwasu aldonowego na redukującym zakończeniu łańcucha za pośrednictwem karbodiimidu rozpuszczalnego w wodzie EDG (1-etylo-3-(3-diaminopropylo)karbodiimidu) (patrz publikacja PCT/EP02/02928). Często jednak zastosowanie karbodiimidów obarczone jest niedogodnościami, ponieważ karbodiimidy bardzo często powodują wewnątrzcząsteczkowe lub międzycząsteczkowe reakcje sieciowania protein, które stanowią reakcje uboczne procesu sprzęgania.

W przypadku związków zawierających grupy fosforanowe, takich jak kwasy nukleinowe, sprzęganie prawie się nie udaje, ponieważ grupy fosforanowe mogą także reagować z EDG (patrz S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, wyd.: CRC-Press, Boca Raton, Londyn, Nowy Jork, Waszyngton D.C., 1993, strona 199.

Na podstawie omawianego stanu techniki podstawą opracowania wynalazku było oddanie do dyspozycji związków, które umożliwiają sprzęganie polisacharydów lub ich pochodnych z substancjami czynnymi zawierającymi grupy aminowe, zwłaszcza proteinami, w czystych układach wodnych lub też mieszaninie rozpuszczalników z wodą, z uniknięciem opisanych wyżej niedogodności.

Ponadto takie związki powinny być tak przygotowane, żeby zachodziło możliwie ilościowe wiązanie substancji czynnej z polisacharydem lub pochodną polisacharydu za pomocą wiązania kowalencyjnego.

Ponadto podstawą opracowania wynalazku było oddanie do dyspozycji związków, które umożliwiają możliwie oszczędzające sprzęganie polisacharydu lub jego pochodnej z substancją czynną. W szczególności, powinny więc powstawać struktury, które wskutek reakcji zmieniają aktywność i tolerancję substancji czynnej w możliwie niewielkim stopniu. Przykładowo powinno się unikać wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych reakcji sieciowania. Ponadto powinna istnieć możliwość sprzęgania także z substancjami czynnymi zawierającymi grupy fosforanowe.

Ponadto zadaniem niniejszego wynalazku powinno być oddanie do dyspozycji związków, które pozwalają na możliwie selektywne sprzęganie substancji czynnych. Tak więc, w szczególności powinno być możliwe celowe nastawianie stechiometrii produktu sprzęgania, przy czym przez zastosowanie tych związków powinno być możliwe wytwarzanie produktu sprzęgania zwłaszcza w stosunku 1:1.

Podstawą opracowania wynalazku było również oddanie do dyspozycji możliwie prostego i ekonomicznego sposobu wytwarzania takich związków i produktów sprzęgania polisacharydów lub pochodnych polisacharydów z substancjami czynnymi.

Zadania te, jak też i dalsze zadania, które wprawdzie nie zostały dosłownie wymienione, lecz wiążą się z dyskutowanymi w niniejszym opisie jak też w oczywisty sposób z niego wynikają, lub też w sposób wymuszony z nich powstają, rozwiązano za pomocą estru kwasu aldonowego według wynalazku.

PL 210 453 B1

Przedmiotem wynalazku jest ester kwasu aldonowego wywodzący się z polisacharydów będących frakcjami skrobi lub pochodnymi frakcji skrobi lub z pochodnych polisacharydów stanowiących hydroksyalkiloskrobie, selektywnie utlenionych na redukującym zakończeniu łańcucha do kwasów aldonowych.

Korzystnie frakcje skrobi są frakcjami z rozkładu amylopektyny.

Korzystnie frakcje z rozkładu amylopektyny uzyskane są z woskowej skrobi kukurydzianej przez rozkład kwasem i/lub rozkład za pomocą α-amylazy.

Korzystnie frakcje skrobi mają średni ciężar cząsteczkowy Mw od 2000 do 50000u i przeciętny stopień rozgałęzienia 5-10% molowych w postaci wiązań a-1,6-glikozydowych.

Korzystnie frakcje skrobi mają średni ciężar cząsteczkowy Mw od 2000 do 50000u i przeciętny stopień rozgałęzienia w zakresie od >10% molowych do 25% molowych w postaci wiązań α-1,6-glikozydowych.

Korzystnie pochodne frakcje skrobi są hydroksyetylowymi pochodnymi frakcji z rozkładu woskowej skrobi kukurydzianej.

Średni ciężar cząsteczkowy Mw frakcji hydroksyetyloskrobi leży w zakresie od 2-300000u i stopień podstawienia MS leży w zakresie między 0,1 a 0,8 a stosunek podstawników C2/C6 na atomach węgla C2 i C6 w anhydroglukozie leży między 2 a 15.

Korzystnie alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 80 do 500 g/mol.

Korzystnie alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego wykazuje wartość pks w zakresie od 6 do 12.

Korzystnie alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego zawiera grupę HO-N lub grupę fenolową.

Korzystnie alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego, wybrany jest spośród N-hydroksysukcynimidu, sulfo-N-hydroksysukcynimidu, podstawionych fenoli i hydroksybenzotriazolu, zwłaszcza stanowi N-hydroksysukcynimid i sulfo-N-hydroksysukcynimid.

Przedmiotem wynalazku jest również substancja stała zawierająca co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony powyżej oraz roztwór zawierający co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony powyżej.

Roztwór zawiera korzystnie co najmniej jeden rozpuszczalnik organiczny i co najwyżej 0,5% wagowego wody.

Korzystnie roztwór zawiera co najmniej jeden aprotyczny rozpuszczalnik, z grupy obejmującej korzystnie dimetylosulfotlenek (DMSO), N-metylopirolidon, dimetyloacetamid (DMA) i/lub dimetyloformamid (DMF).

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania estru kwasu aldonowego określonego powyżej charakteryzujący się tym, że poddaje się reakcji korzystnie w temperaturze w zakresie od 0 do 40°C, co najmniej jeden kwas aldonowy lub sól kwasu aldonowego z co najmniej jednym stosowanym korzystnie w nadmiarze składnikiem alkoholowym w aprotycznym rozpuszczalniku, przy czym jako składnik alkoholowy stosuje się związki zawierające grupy OH, które mogą być związane między innymi z atomem azotu lub z resztą fenylową względnie związki, które przy dodaniu wody uwalniają alkohol.

Korzystnie składnik alkoholowy wprowadza się z 5- do 50-krotnym nadmiarem molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy lub pochodną kwasu aldonowego.

Korzystnie reakcję przeprowadza się z zastosowaniem co najmniej jednego aktywującego reagenta, a aktywujący reagent zawiera co najmniej jeden karbodiimid.

Aktywujący reagent wprowadza się z 1 do 3-krotnym nadmiarem molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy lub pochodną kwasu aldonowego.

W sposobie według wynalazku stosuje się korzystnie diester kwasu węglowego.

Reakcję przeprowadza się w słabo zasadowym środowisku.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania farmaceutycznych substancji czynnych sprzężonych za pomocą wolnej aminowej grupy funkcyjnej z polisacharydami lub pochodnymi polisacharydów, charakteryzujący się tym, że poddaje się reakcji co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony powyżej z farmaceutyczną substancją czynną, która zawiera co najmniej jedną grupę aminową.

Reakcję tę prowadzi się w środowisku wodnym, przy czym wartość pH ośrodka wodnego leży w zakresie 7 do 9, a reakcję przeprowadza się w temperaturze w zakresie od 0 do 40°C.

PL 210 453 B1

Jako farmaceutyczną substancją czynną stosuje się polipeptyd lub proteinę.

Przedmiotem wynalazku jest również farmaceutyczna substancja czynna sprzężona z polisacharydem lub pochodną polisacharydu dająca się otrzymać sposobem określonym powyżej charakteryzująca się tym, że farmaceutyczną substancją czynną jest substancja czynna ulegająca denaturacji w ś rodowisku bezwodnym i niepożądanym reakcjom ubocznym z karbodiimidami, takim jak sieciowanie wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe lub reakcja z grupami fosforanowymi farmaceutycznej substancji czynnej.

Przez oddanie do dyspozycji estrów kwasów aldonowych, które wywodzą się od polisacharydów lub pochodnych polisacharydów selektywnie utlenianych na redukującym zakończeniu łańcucha do kwasów aldonowych, udało się oddać do dyspozycji związki, które rozwiązują wymienione wcześniej zadania. Takie estry mogą być uważane za aktywne kwasy.

W ś rodowisku wodnym ulegają one reakcji z nukleofilowymi grupami NH2 do (trwał ych) amidów.

Ponadto poprzez niniejszy wynalazek uzyskuje się między innymi następujące korzyści:

Estry kwasu aldonowego według wynalazku umożliwiają łatwe wiązanie substancji czynnej poprzez wiązanie kowalencyjne z polisacharydem lub pochodną polisacharydu.

Estry kwasu aldonowego według niniejszego wynalazku mogą być poddawane reakcji z substancją czynną w oszczędnych warunkach. W tym wypadku, w szczególności, struktura, aktywność i tolerancja substancji czynnej zmienia się wskutek reakcji tylko w niewielkim stopniu. Moż na dzię ki temu uniknąć, między innymi, w szczególności, wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych reakcji sieciowania. Ponadto można sprzęgać farmaceutyczne substancje czynne, które zawierają grupy fosforanowe bez zmiany tych grup.

Estry kwasów aldonowych według wynalazku umożliwiają bardzo selektywne sprzęganie substancji czynnej. Ponadto można przykładowo celowo nastawić stechiometrię żądanego produktu sprzęgania, przy czym przez zastosowanie tych związków umożliwia się wytwarzanie produktu sprzęgania zwłaszcza w stosunku 1:1.

Ponadto niniejszy wynalazek oddaje do dyspozycji prosty i ekonomiczny sposób wytwarzania aktywowanych estrów kwasów aldonowych i produktów sprzęgania polisacharydów lub pochodnych polisacharydów z substancjami czynnymi.

Estry kwasów aldonowych według niniejszego wynalazku wywodzą się z polisacharydów lub pochodnych polisacharydów, które mogą być selektywnie utleniane na redukującym zakończeniu łańcucha. Tego typu polisacharydy oraz pochodne dające się z nich otrzymać, są szeroko znane fachowcom i mogą być dostępne na rynku. Polisacharydy są wielkocząsteczkowymi węglowodanami, których cząsteczka zawiera dużą ilość (przynajmniej >10, lecz zwykle znacznie więcej) molekuł monosacharydów (glukozy) powiązanych ze sobą wiązaniami glikozydowymi. Przeciętny wagowy ciężar cząsteczkowy korzystnego polisacharydu leży korzystnie w zakresie od 1500 do 1000000u, korzystnie 2000 do 300000u, a szczególnie korzystnie w zakresie od 2000 do 50000u. Ciężar cząsteczkowy MW oznacza się zwykłymi sposobami. Należą do nich przykładowo wodna CPC (permeacyjna chromatografia cieczowa), HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa), rozpraszanie światła i podobne.

Przez ciężar cząsteczkowy polisacharydu można między innymi zmieniać czas przebywania w ciele.

Do korzystnych polisacharydów należy skrobia oraz frakcje skrobi dające się otrzymać przez hydrolizę, które mogą być określone, jako produkty rozkładu skrobi. Skrobię rozdziela się zwykle na amylozę i amylopektynę, które różnią się stopniem rozgałęzienia. Według wynalazku szczególnie korzystna jest amylopektyna.

Pod pojęciem amylopektyna rozumie się przy tym przede wszystkim całkiem ogólnie rozgałęzione skrobie lub produkty skrobiowe, zawierające wiązania α- (1-4)- i α-(1-6)- między cząsteczkami glukozy. Rozgałęzienia łańcucha występują przy tym na wiązaniach α-(1-6)-. W przypadku amylopektyn pochodzenia naturalnego występują one nieregularnie co każde 15-30 segmentów glukozy. Ciężar cząsteczkowy naturalnej amylopektyny jest bardzo wysoki i znajduje się w zakresie 10⁷ do 2x10⁸ u.

Można stąd wywnioskować, że amylopektyna tworzy także helisy w określonych granicach.

Dla amylopektyny można określić stopień rozgałęzienia. Miarą rozgałęzienia jest stosunek ilości jednostek anhydroglukozy, które zawierają punkty rozgałęzień (wiązania α-(16)-) do łącznej ilości cząsteczek anhydroglukozy w amylopektynie, przy czym ten stosunek podaje się w % molowych. W amylopektynie pochodzenia naturalnego stopień rozgałęzienia wynosi około 4% molowych. Korzystnie do wytwarzania estrów kwasów aldonowych stosowane są amylopektyny o średnim stopniu rozgałęzienia w zakresie od 5 do 10% molowych.

PL 210 453 B1

Można ponadto stosować hiperrozgałęzione amylopektyny, o stopniu rozgałęzienia znacznie przekraczającym znany stopień rozgałęzienia amylopektyny pochodzenia naturalnego. W przypadku stopnia rozgałęzienia chodzi przy tym w każdym przypadku o wielkość średnią (średni stopień rozgałęzienia), ponieważ amylopektyny są substancjami polidyspersyjnymi.

Takie hiperrozgałęzione amylopektyny mają znacznie wyższe stopnie rozgałęzienia wyrażone w % molowych rozgałęzionych anhydroglukoz w porównaniu z niezmienioną amylopektyną wzglę dnie hydroksyetyloskrobią i dlatego swą budową bardziej podobne są do glikogenu.

Średni stopień rozgałęzienia hiperrozgałęzionych amylopektyn leży zwykle w zakresie między >10 a 25% molowych. Oznacza to, że taka amylopektyna przeciętnie co każde 10 do 4 jednostek glukozy zawiera wiązanie α-(1-6)-, czyli punkt rozgałęzienia. Amylopektyny do stosowania w dziedzinie medycyny odznaczają się korzystnie stopniem rozgałęzienia między 11 a 16% molowych.

Dalsze korzystne hiperrozgałęzione amylopektyny posiadają stopień rozgałęzienia w zakresie między 13 a 16% molowych.

Amylopektyny do stosowania w niniejszym wynalazku posiadają korzystnie średni wagowo ciężar cząsteczkowy Mw w zakresie od 2000 do 800000u, zwłaszcza 2000 do 300000, a szczególnie korzystnie 2000 do 50000u.

Opisane powyżej skrobie są produktami handlowymi. Ponadto ich uzyskiwanie znane jest z literatury. Tak więc, skrobie można uzyskiwać w szczególności z ziemniakami, tapioki, manioku, ryżu, pszenicy lub kukurydzy. Skrobie otrzymane z tych roślin często wielokrotnie poddawane są reakcjom rozkładu. Ciężar cząsteczkowy redukuje się przy tym z około 20000000u do kilku milionów u, przy czym znane jest także dalsze zmniejszanie ciężaru cząsteczkowego do wcześniej wymienionych wielkości. Szczególnie korzystnie można stosować do wytwarzania estrów kwasu aldonowego, między innymi, reakcje rozkładu woskowej skrobi kukurydzianej.

Przedstawione wcześniej hiperrozgałęzione frakcje skrobi opisane zostały między innymi w niemieckim zgł oszeniu patentowym 102 17 994.

Ponadto, do wytwarzania estrów kwasu aldonowego według wynalazku można stosować także pochodne polisacharydów. Należą do nich w szczególności hydroksyalkiloskrobie, przykładowo hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia, które można uzyskiwać ze skrobi opisanych wcześniej, w szczególnoś ci z amylopektyny, przez hydroksyalkilowanie. Wś ród nich szczególnie korzystna jest hydroksyetyloskrobia (HES).

Według wynalazku stosuje się korzystnie HES, która jest hydroksyetylowaną pochodną polimeru glukozy - amylopektyny występująca w ponad 95% w woskowej skrobi kukurydzianej. Amylopektyna składa się z jednostek glukozy, występujących w postaci wiązań a-1,4-glikozyd owych i wykazujących rozgałęzienia a-1,6-glikozydowe.

HES wykazuje korzystne własności reologiczne i obecnie stosowana jest klinicznie jako objętościowy wypełniacz i do terapii rozcieńczania krwi (Sommermeyer i inni, Kranenhauspharmazie, tom 8 (8, 1987) strony 271-278 i Weidler i inni, Arzneimittelforschung/Drug Res., 41 (1991) strony 494-498).

HES charakteryzuje się głównie za pomocą średniego wagowo ciężaru cząsteczkowego Mw, średniego liczbowo ciężaru cząsteczkowego Mn, rozrzutu ciężaru cząsteczkowego i stopnia podstawienia. Podstawianie grupami hydroksyetylowymi z wiązaniem eterowym możliwe jest przy tym na atomach węgla 2, 3 i 6 jednostek anhydroglukozy. Stopień podstawienia można opisać przy tym jako DS („degree of substitution), który podaje udział podstawionych cząsteczek glukozy w stosunku do wszystkich jednostek glukozowych lub jako MS („molar substitution), w którym określa się średnią ilość grup hydroksyetylowych na jednostkę glukozy.

Stopień podstawienia MS (podstawienie molowe) jest zdefiniowany jako przeciętna ilość grup hydroksyetylowych na jednostkę anhydroglukozy. Oznacza się go na podstawie łącznej ilości grup hydroksyetylowych w próbce, przykładowo metodą Morgana, przez rozczepienie wiązań eterowych, a następnie ilościowe określenie jodku etylu i etylenu, jakie się przy tym wytworzą.

Natomiast stopień podstawienia DS (stopień podstawienia) jest określony jako udział podstawionych jednostek anhydroglukozy w stosunku do wszystkich jednostek anhydroglukozy. Można go oznaczyć ze zmierzonej ilości niepodstawionej glukozy po hydrolizie próbki. Z tych definicji wynika, że MS>DS. W przypadku, gdy występuje tylko monopodstawienie, a więc każda podstawiona jednostka anhydroglukozy zawiera tylko jedną grupę hydroksyetylową, to MS=DS.

Reszta hydroksyetyloskrobi ma korzystnie stopień podstawienia MS od 0,1 do 0,8. Szczególnie korzystnie reszta hydroksyetyloskrobi ma stopień podstawienia MS od 0,4 do 0,7.

PL 210 453 B1

Reaktywność poszczególnych grup hydroksyetylowych w niepodstawionej jednostce anhydroglukozy na hydroksyetylowanie jest różna w zależności od warunków reakcji. W określonych granicach można wpływać na wzór podstawienia, a więc na poszczególne, różnie podstawione jednostki anhydroglukozy, które statystycznie rozdzielone są w poszczególnych cząsteczkach polimeru. Korzystnie hydroksyetylowaniu ulegają przeważnie pozycje C2- i C6-, przy czym częściej podstawieniu ulega pozycja C6- ze względu na lepszą dostępność.

W ramach niniejszego wynalazku stosuje się korzystnie hydroksyetyloskrobie (HES) podstawione przeważnie w pozycji C2-, możliwie jednorodnie podstawione. Wytwarzanie takich HES zostało opisane w opisie patentowym EP 0 402 724 B2. Rozkładają się one w fizjologicznie rozsądnym czasie bez reszty i z drugiej strony wykazują mimo to dającą się sterować zdolność wydalania. Przeważające podstawienie typu C2 sprawia, że hydroksyetyloskrobia jest stosunkowo trudna do rozkładu dla α-amylazy. Dla zabezpieczenia zdolności rozkładu bez reszty korzystne jest, że wewnątrz cząsteczki polimeru nie występują możliwie żadne kolejno podstawione jednostki anhydroglukozy. Ponadto, takie hydroksyetyloskrobie, pomimo niskiego podstawienia, posiadają wystarczająco dużą rozpuszczalność w ośrodkach wodnych tak, że roztwory pozostają trwałe przez dłuższy czas i nie tworzą się żadne aglomeraty czy żele.

W przeliczeniu na grupy hydroksyetylowe w jednostkach anhydroglukozy, reszta hydroksyetyloskrobi wykazuje korzystnie stosunek podstawienia C2:C6 w zakresie od 2 do 15. Szczególnie korzystnie stosunek podstawienia C2:C6 wynosi 3 do 11.

Selektywne utlenianie grup aldehydowych przedstawionego wcześniej polisacharydu względnie pochodnej polisacharydu do kwasu aldonowego jest jako takie znane. Można je przeprowadzić za pomocą łagodnego środka utleniającego, przykładowo jodu/wodorotlenku potasu według opisu DE 196 28 705 A1, lub za pomocą enzymu.

Do reakcji można stosować wolny kwas aldonowy. Ponadto można też stosować sole. Należą tu w szczególności sole alkaliczne, takie przykładowo, jak sól sodowa i/lub potasowa kwasu aldonowego.

Do wytwarzania estrów kwasu aldonowego według wynalazku stosuje się alkohole. Pojęcie alkohol obejmuje związki zawierające grupy OH. Te grupy OH mogą być związane między innymi z atomem azotu lub z resztą fenylową.

Korzystnie stosuje się azydoalkohole/hydroksyloaminy, znane fachowcom. Należą do nich między innymi N-hydroksyimidy, przykładowo N-hydroksysukcynimid i sulfo-N-hydroksysukcynimid, podstawione fenole i hydroksyazole, przykładowo hydroksybenzotriazol, przy czym szczególnie korzystne są N-hydroksysukcynimidy i sulfo-N-hydroksysukcynimid.

Dalsze azydoalkohole odpowiednie do wytwarzania estrów kwasów aldonowych według wynalazku są wymienione w literaturze (V.H.L. Lee Wyd. Peptide and Protein Drug delivery, Marcel Dekker, 1991, str. 65).

Według pewnej szczególnej postaci wykonania niniejszego wynalazku stosuje się alkohole, których grupa OH wykazuje wartość pkkwasu (pks) w zakresie od 6 do 12, korzystnie w zakresie od 7 do 11. Ta wartość dotyczy współczynnika dysocjacji kwasu oznaczanego w 25°C, przy czym wartość ta często podawana jest w literaturze.

Ciężar cząsteczkowy alkoholu leży korzystnie w zakresie od 80 do 500 g/mol, zwłaszcza 100 do

200 g/mol.

Alkohol można dodawać do mieszaniny reakcyjnej w postaci wolnej. Ponadto można także stosować w reakcji związki, które przy dodaniu wody ewentualnie przy katalizie kwasowej uwalniają alkohol.

Według pewnej szczególnej postaci wykonania niniejszego wynalazku, do reakcji z kwasem aldonowym lub solą kwasu aldonowego stosuje się diester kwasu węglowego. Związki te umożliwiają wyjątkowo szybką i oszczędzającą reakcję, przy czym tworzą się jedynie kwas węglowy względnie węglany, alkohole i żądane estry kwasu aldonowego.

Korzystnymi diestrami kwasu węglowego są między innymi węglan N,N'-sukcynimidylowy i węglan sulfo-N,N'-sukcynimidylowy.

Te diestry kwasu węglowego można stosować w stosunkowo niewielkich ilościach. Tak więc można stosować diester kwasu węglowego z 1- do 3-molowym nadmiarem, korzystnie z nadmiarem 1 do 1,5-molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy i/lub sól kwasu aldonowego. Czas trwania reakcji przy zastosowaniu diestrów kwasu węglowego jest stosunkowo krótki. Reakcję można więc często zakończyć po 2 godzinach, korzystnie po 1 godzinie.

Reakcja przemiany do estru kwasu aldonowego zachodzi korzystnie w bezwodnym rozpuszczalniku aprotycznym. Zawartość wody powinna wynosić korzystnie co najwyżej 0,5% wagowych,

PL 210 453 B1 korzystnie co najwyżej 0,1% wagowych. Odpowiednimi rozpuszczalnikami są, między innymi, dimetylosulfotlenek (DMSO), N-metylopirolidon, dimetyloacetamid (DMA) i/lub dimetyloformamid (DMF).

Reakcja przeestryfikowania jest znana jako taka, przy czym można stosować każdy sposób. Reakcję do estru kwasu aldonowego można realizować między innymi z zastosowaniem związków aktywujących. Przy zastosowaniu wolnego alkoholu zalecany jest sposób postępowania tego rodzaju. Do związków aktywujących należą w szczególności karbodiimid, taki przykładowo jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) i 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid (EDC).

Przy stosowaniu wolnego alkoholu można go stosować w nadmiarze molowym. W szczególnej postaci wykonania niniejszego wynalazku składnik alkoholowy stosuje się korzystnie z 5- do 50-krotnym nadmiarem molowym, szczególnie korzystnie z 8- do 20-krotnym nadmiarem molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy i/lub pochodną kwasu aldonowego.

Reakcję do estru kwasu aldonowego udaje się przeprowadzać w oszczędzających warunkach. Opisane wcześniej reakcje można przeprowadzać w temperaturach korzystnie w zakresie od 0°C do 40''C, korzystnie 10°C do 30°C.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania niniejszego wynalazku reakcję prowadzi się przy słabym odczynie zasadowym. Słaby odczyn zasadowy można zmierzyć przez dodanie mieszaniny reakcyjnej do 10-krotnego nadmiaru wody. Woda przed dodaniem wykazuje wartość pH 7,0 w 25°C, przy czym nie zawiera rzeczywiście żadnego buforu. Przy pomiarze wielkości pH w 25°C po dodaniu mieszaniny reakcyjnej uzyskuje się alkaliczny odczyn mieszaniny reakcyjnej. Korzystnie mieszanina ta po dodaniu wykazuje korzystnie wartość pH co najwyżej 9,0, szczególnie korzystnie co najwyżej 8,0 a szczególnie korzystnie co najwyż ej 7,5.

Reakcję z kwasami HES-aldonowymi, np. N-hydroksysukcynimidem przeprowadza się w suchym DMA z wyłączeniem wody z EDC w wyrównanej reakcji w temperaturze pokojowej do estru N-hydroksysukcynimidu z kwasem HES. Niespodziewane jest przy tym w szczególności, że nie zachodzą żadne reakcje uboczne cząsteczki HES podczas reakcji z ekstremalnym nadmiarem istniejących grup OH jednostek anhydroglukozy z EDC oraz ograniczona zostaje reakcja przegrupowania utworzonego najpierw O-acyloizomocznika z EDC i kwasu aldonowego do odpowiedniego N-acylomocznika.

Roztwory otrzymane poprzez opisaną wcześniej reakcję można stosować w reakcjach sprzęgania bez wyodrębniania estru kwasu aldonowego. Ponieważ z reguły objętość wstępnie zaktywowanego kwasu aldonowego w aprotycznym rozpuszczalniku jest mała w porównaniu z objętością docelowej proteiny rozpuszczonej w buforze, ilości aprotycznego rozpuszczalnika najczęściej nie działają szkodliwie. Korzystne roztwory zawierają przynajmniej 10% wagowych estru kwasu aldonowego, korzystnie przynajmniej 30% wagowych estru kwasu aldonowego a szczególnie korzystnie przynajmniej 50% wagowych estru kwasu aldonowego.

Estry kwasu aldonowego można strącić z roztworu w aprotycznym rozpuszczalniku, przykładowo DMA, za pomocą znanych środków strącających, takich przykładowo, jak suchy etanol, izopropanol lub aceton i oczyścić przez wielokrotne powtarzanie tej operacji. Korzystne substancje stałe zawierają przynajmniej 10% wagowych estru kwasu aldonowego, korzystnie przynajmniej 30% wagowych estru kwasu aldonowego, a szczególnie korzystnie przynajmniej 50% wagowych estru kwasu aldonowego.

Takie estry kwasu aldonowego można w istocie następnie wyizolować do sprzęgania i stosować przykładowo do HESylowania. Nie występują w tym wypadku żadne reakcje uboczne, jak w przypadku opisanego wyżej kwasu aktywowanego EDC.

Ponadto do sprzęgania można dodawać roztwór zaktywowanego kwasu aldonowego do wodnego roztworu farmaceutycznej substancji czynnej, korzystnie buforowanej, przy odpowiednim pH. Farmaceutyczne substancje czynne zawierają przynajmniej jedną grupę aminową, którą można przekształcić do amidu kwasu aldonowego. Do korzystnych substancji czynnych należą proteiny i peptydy.

Wartość pH podczas reakcji jest zależna od własności substancji czynnej. Korzystnie, jeśli to możliwe, wartość pH leży w zakresie od 7 do 9, korzystnie 7,5 do 8,5.

Sprzęganie zachodzi ogólnie w temperaturach w zakresie od 0°C do 40°C, korzystnie od 10°C do 30°C, które to granice nie powinny stanowić ograniczenia. Czas trwania reakcji można łatwo określić odpowiednimi sposobami. Ogólnie, czas reakcji leży w granicach od 1 godziny do 100 godzin, korzystnie 20 godzin do 48 godzin.

Ester kwasu aldonowego można stosować w ilości z nadmiarem w przeliczeniu na substancję czynną. Korzystnie ester kwasu aldonowego stosuje się z 1 do 5-krotnym nadmiarem molowym, szczególnie korzystnie z 1,5- do 2-krotnym nadmiarem w przeliczeniu na farmaceutyczną substancję czynną.

PL 210 453 B1

Jako produkt uboczny podczas wyżej opisanego przekształcenia wypada jedynie tylko alkohol, przykładowo N-hydroksycukcynimid, który można łatwo oddzielić od produktu sprzęgania, np., przez ultrafiltrację. Jako reakcja uboczna może występować zmydlanie wodą do wolnego kwasu i wolnego alkoholu. Dlatego jest szczególnie niespodziewane, że ester kwasu aldonowego według wynalazku wchodzi w przeważającej ilości w reakcję sprzęgania z substancją farmaceutycznie czynną. Wynika to także z przykładów, szczególnie z chromatogramów przedstawionych na figurach.

Rysunek 1: Chromatogram MALLS-GPC nieprzereagowanej albuminy zwierzęcej (BSA). Monomery i dimery albuminy są wyraźnie oddzielone.

Rysunek 2: Chromatogram MALLS-GPC nieprzereagowanego estru HES-10/0,4-sukcynimidylowego.

Rysunek 3: Chromatogram MALLS-GPC produktu reakcji estru HES-10/0,4-sukcynimidylowego i BSA. Pokazane zostały sygnały 3-krotnej detekcji współczynnika refrakcji (RI), detektor UV oraz sygnał światła rozproszonego w 90°C.

Rysunek 4: Chromatogram MALLS-GPC produktu reakcji estru HES-10/0,4-sukcynimidylowego i BSA przedstawiający zależność masy cząsteczkowej w funkcji czasu.

Następnie wynalazek zostanie objaśniony bliżej za pomocą przykładów i przykładów porównawczych, które nie powinny ograniczać wynalazku tylko do tych przykładów.

Przykłady i sposoby wytwarzania

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie estru kwasu HES 10/0,4 z N-hydroksysukcynimidem g wysuszonej hydroksyetyloskrobi selektywnie utlenionej na terminalnym zakończeniu łańcucha dającym się redukować według opisu patentowego DE 196 28 705 o średnim ciężarze cząsteczkowym Mw = 10000u i stopniu podstawienia MS=0,4 rozpuszcza się w 30 ml suchego dimetyloacetamidu w 40°C i po schłodzeniu roztworu zadaje 10-krotną molową ilością N-hydroksysukcynimidu bez dostępu wilgoci. Następnie do kwasu HES dodaje porcjami się równomolowe ilości EDC i pozostawia do przereagowania na 24 godziny po dodaniu wsadu reagentów. Następnie produkt reakcji strąca się suchym acetonem i wielokrotnie strąca w celu oczyszczenia.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie mioglobiny sprzężonej z kwasem HES-10/0,4 mg mioglobiny rozpuszcza się w 20 ml wody destylowanej i nastawia pH na 7,5 za pomocą ługu sodowego. Do roztworu dodaje się porcjami w ciągu 1 godziny 1,5 g kwasu HES 10/0,4-N-hydroksysukcynimidu wytworzonego jak w przykładzie 1 i utrzymuje się stałą wartość pH 7,5 przez dodatek ługu sodowego. Wsad pozostawia się do mieszania przez noc. Tworzenie hesylowanej mioglobiny oznacza się za pomocą permeacyjnej chromatografii żelowej z wydajnością 70% w przeliczeniu na wprowadzaną mioglobinę.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie estru kwasu HES 10/0,4 z węglanem N,N'-disukcynimidylowym

0,02 mmola (odpowiadającego 0,14 g) suszonego kwasu HES 10/0,4 rozpuszcza się w 2 ml suchego dimetyloformamidu bez dostępu wilgoci. Do roztworu dodaje się 0,02 mmola węglanu N,N'-disukcynimidylowego i pozostawia do przereagowania przez 1 godzinę mieszając w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie produktu sprzęgania kwasu HES 10/0,4 z albuminą osocza bydlęcego mg albuminy osocza bydlęcego (BSA, odpowiadającej 0,7 μmola) rozpuszcza się w 6 ml 0,3 molowego roztworu wodorowęglanu przy pH 8,4. Do roztworu dodaje się wsad według przykładu 3 i pozostawia do przereagowania, mieszając przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

Wykrywanie reakcji prowadzi się za pomocą niskociśnieniowej wysokosprawnej permeacyjnej chromatografii cieczowej z wielokrotną detekcją (UV 280 nm, detektor rozpraszania światła MALL (MALL=multi angle laser light scattering/wielokątowe rozpraszanie światła leserowego), detektor RI).

Rysunki 1 do 4 pokazują porównawcze chromatografy nieprzereagowanego estru sukcynimidylowego HES 10/0,4, wyjściowego produktu BSA oraz wsadu reakcyjnego.

Przebieg reakcji śledzi się na podstawie znacznego zmniejszenia wielkości piku BSA i wystąpienia wyżej cząsteczkowego piku wykrywalnego przy 280 nm.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie estru kwasu HES 50/0,7 z węglanem N,N'-disukcynimidylowym

PL 210 453 B1

0,02 mmola (0,5 g) wysuszonego kwasu HES 50/0,7 rozpuszcza się w 2 ml suchego dimetyloformamidu bez dostępu wilgoci. Do roztworu dodaje się 0,02 mmola węglanu N,N'-disukcynimidylowego i pozostawia do przereagowania przez 1 godzinę mieszając w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie produktu sprzęgania HES 50/0,7 z BSA mg albuminy osocza bydlęcego BSA (0,7 μmola) rozpuszcza się w 6 ml 0,3 molowego roztworu wodorowęglanu przy pH 8,4. Do roztworu dodaje się roztwór aktywowanego kwasu HES 50/0,7 z przykładu 5 i pozostawia do przereagowania przez 2 godziny mieszając w temperaturze pokojowej.

Analityczną kontrolę wsadu reakcyjnego prowadzi się za pomocą niskociśnieniowej wysokosprawnej permeacyjnej chromatografii cieczowej z trzykrotną detekcją, jak to opisano w przykładzie 4.

Przebieg reakcji śledzi się na podstawie znacznego zmniejszenia wielkości sygnału nieprzereagowanego BSA i odpowiedniego wystąpienia sygnału przesuniętego do wyżej cząsteczkowego zakresu ciężaru cząsteczkowego dla produktu sprzęgania wykrywalnego przy 280 nm. Przesunięcie zwiększa się odpowiednio do wyższego ciężaru cząsteczkowego kwasu HES w porównaniu z przykładem 4.

Claims (31)

1. Ester kwasu aldonowego wywodzący się z polisacharydów będących frakcjami skrobi lub pochodnymi frakcji skrobi lub z pochodnych polisacharydów stanowiących hydroksyalkiloskrobie, selektywnie utlenionych na redukującym zakończeniu łańcucha do kwasów aldonowych.

2. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcje skrobi są frakcjami z rozkładu amylopektyny.

3. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 2, znamienny tym, że frakcje z rozkładu amylopektyny uzyskane są z woskowej skrobi kukurydzianej przez rozkład kwasem i/lub rozkład za pomocą α-amylazy.

4. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 3, znamienny tym, że frakcje skrobi mają średni ciężar cząsteczkowy Mw od 2000 do 50000u i przeciętny stopień rozgałęzienia 5-10% molowych w postaci wiązań a-1,6-glikozydowych.

5. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 3, znamienny tym, że frakcje skrobi mają średni ciężar cząsteczkowy Mw od 2000 do 50000u i przeciętny stopień rozgałęzienia w zakresie od >10% molowych do 25% molowych w postaci wiązań a-1,6-glikozydowych.

6. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 1, znamienny tym, że pochodne frakcje skrobi są hydroksyetylowymi pochodnymi frakcji z rozkładu woskowej skrobi kukurydzianej.

7. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 6, znamienny tym, że średni ciężar cząsteczkowy Mw frakcji hydroksyetyloskrobi leży w zakresie od 2-300000u i stopień podstawienia MS leży w zakresie między 0,1 a 0,8 a stosunek podstawników C2/C6 na atomach węgla C2 i C6 w anhydroglukozie leży między 2 a 15.

8. Ester kwasu aldonowego według co najmniej jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 80 do 500 g/mol.

9. Ester kwasu aldonowego według co najmniej jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego wykazuje wartość pks w zakresie od 6 do 12.

10. Ester kwasu aldonowego według co najmniej jednego z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego zawiera grupę HO-N lub grupę fenolową.

11. Ester kwasu aldonowego według co najmniej jednego z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego, wybrany jest spośród N-hydroksysukcynimidu, sulfo-N-hydroksysukcynimidu, podstawionych fenoli i hydroksybenzotriazolu.

12. Ester kwasu aldonowego według zastrz. 11, znamienny tym, że alkohol wywodzący się ze składnika alkoholowego estru kwasu aldonowego jest N-hydroksysukcynimidem i sulfo-N-hydroksysukcynimidem.

13. Substancja stała, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony w co najmniej jednym z zastrz. 1 do 12.

PL 210 453 B1

14. Roztwór, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony w co najmniej jednym z zastrz. 1 do 12.

15. Roztwór według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden rozpuszczalnik organiczny.

16. Roztwór według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera co najwyżej 0,5% wagowego wody.

17. Roztwór według jednego z zastrz. 14 do 16, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden aprotyczny rozpuszczalnik.

18. Roztwór według zastrz. 17, znamienny tym, że rozpuszczalnik obejmuje dimetylosulfotlenek (DMSO), N-metylopirolidon, dimetyloacetamid (DMA) i/lub dimetyloformamid (DMF).

19. Sposób wytwarzania estru kwasu aldonowego określonego w co najmniej jednym z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że poddaje się reakcji korzystnie w temperaturze w zakresie od 0 do 40°C, co najmniej jeden kwas aldonowy lub sól kwasu aldonowego z co najmniej jednym stosowanym korzystnie w nadmiarze składnikiem alkoholowym w aprotycznym rozpuszczalniku, przy czym jako składnik alkoholowy stosuje się związki zawierające grupy OH, które mogą być związane między innymi z atomem azotu lub z resztą fenylową, względnie związki, które przy dodaniu wody uwalniają alkohol.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że składnik alkoholowy wprowadza się z 5- do 50-krotnym nadmiarem molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy lub pochodną kwasu aldonowego.

21. Sposób według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się z zastosowaniem co najmniej jednego aktywującego reagenta.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że aktywujący reagent zawiera co najmniej jeden karbodiimid.

23. Sposób według co najmniej jednego z zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że aktywujący reagent wprowadza się z 1 do 3-krotnym nadmiarem molowym w przeliczeniu na kwas aldonowy lub pochodną kwasu aldonowego.

24. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się diester kwasu węglowego.

25. Sposób według co najmniej jednego z zastrz. 19 do 24, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się w słabo zasadowym środowisku.

26. Sposób wytwarzania farmaceutycznych substancji czynnych sprzężonych za pomocą wolnej aminowej grupy funkcyjnej z polisacharydami lub pochodnymi polisacharydów, znamienny tym, że poddaje się reakcji co najmniej jeden ester kwasu aldonowego określony w jednym z zastrz. 1 do 12 z farmaceutyczną substancją czynną, która zawiera co najmniej jedną grupę aminową.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w środowisku wodnym.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wartość pH ośrodka wodnego leży w zakresie 7 do 9.

29. Sposób według co najmniej jednego z zastrz. 26 do 28, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się w temperaturze w zakresie od 0 do 40°C.

30. Sposób według co najmniej jednego z zastrz. 26 do 29, znamienny tym, że farmaceutyczną substancją czynną jest polipeptyd lub proteina.

31. Farmaceutyczna substancja czynna sprzężona z polisacharydem lub pochodna polisacharydu dająca się otrzymać sposobem określonym w co najmniej jednym z zastrz. 26 do 30, znamienna tym, że farmaceutyczną substancją czynną jest substancja czynna ulegająca denaturacji w środowisku bezwodnym i niepożądanym reakcjom ubocznym z karbodiimidami, takim jak sieciowanie wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe lub reakcja z grupami fosforanowymi farmaceutycznej substancji czynnej.