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CN100535015C - 醛糖酸酯、制备醛糖酸酯的方法和制备在游离氨基上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法 - Google Patents

醛糖酸酯、制备醛糖酸酯的方法和制备在游离氨基上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在链的还原端被选择性地氧化形成醛糖酸的淀粉片断或淀粉片断衍生物的醛糖酸酯以及含有所述的醛糖酸酯的固形物和溶液。本发明还涉及制备所述的醛糖酸酯的方法、制备在游离氨基上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法以及由此获得的药学活性成分。

Description

醛糖酸酯、制备醛糖酸酯的方法和制备在游离氨基上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法
本发明涉及醛糖酸酯、包含这些酯的固形物和溶液及其制备方法。本发明还涉及用醛糖酸酯进行的制备在游离氨基上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法以及可通过这些方法获得的药学活性成分。
近年来，随着生物工程研究的药用蛋白质的增加，药学活性成分尤其是蛋白质与聚乙二醇衍生物的轭合(“聚乙二醇化”)或与多糖如葡聚糖或尤其是羟乙基淀粉的轭合(“羟乙基淀粉化”)越来越重要。
这类蛋白质的生物半衰期通常太短，但可以通过与上述聚合物如PEG或HES偶联而被特别地延长。然而，这种偶联也可能对蛋白质的抗原性具有有益影响。对于其它药学活性成分，通过这种偶联可大大增加其在水中的溶解度。
DE 196 28 705和DE 101 29 369分别描述了通过相应的羟乙基淀粉的醛糖内酯(aldonolactone)与血红蛋白和两性霉素B的游离氨基在无水二甲亚砜(DMSO)中进行羟乙基淀粉偶联的可行方法。
由于通常不能使用无水、非质子溶剂，尤其是对于蛋白质，或者是出于溶解度的原因或者是因为蛋白质变性，所以在水性介质中与HES偶联的方法还是行之有效的。例如，在链的还原端已被选择性地氧化成醛糖酸的羟乙基淀粉的偶联可通过水溶性碳二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)的介导进行(PCT/EP 02/02928)。然而，使用碳二亚胺通常伴有弊端，因为碳二亚胺常常会引起蛋白质分子间或分子内交联反应的副反应。
对于含有磷酸酯基团的化合物如核酸，这种偶联通常是不可能的，因为磷酸酯基团也可以与EDC反应(S.S.Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking，CRC-Press，Boca Raton，伦敦，纽约，华盛顿，1993，199页)。
鉴于上述现有技术，本发明所基于的目的是提供这样的化合物：该化合物尤其使得多糖或其衍生物与含氨基的活性成分尤其是蛋白质在纯水系统中或在含水的溶剂混合物中偶联且避免前述弊端成为可能。
另外还期望这类化合物具有这样的性质：活性成分与多糖或多糖衍生物通过共价键的连接尽可能是定量的。
另外，本发明还基于的目的是提供使多糖或其衍生物与活性成分在尽可能温和的条件下连接成为可能的化合物。因此，尤其期望反应尽可能少地改变活性成分的结构、活性和耐受性。例如，避免分子内和分子间的交联反应。此外，还期望能与含磷酸酯基团的活性成分连接。
因此本发明还有一个目的是给出可尽可能选择性地与活性成分偶联的化合物。因此，尤其期望能调节轭合物的特定化学计量学，特别期望通过使用这些化合物使得制备1∶1的轭合物成为可能。
最后，本发明还基于的目的是提供一种尽可能简单且经济的制备这类化合物和多糖或多糖衍生物与活性成分的偶联产物的方法。
这些目的以及其它虽然没有逐字叙述但可由本文中所述的上下文明显推导出的目的或由此自然明了的目的用权利要求1中所述的醛糖酸酯可以实现。对本发明的这些醛糖酸酯的适宜修饰以及可在制备轭合物的方法中使用的稳定的醛糖酸酯被引用了权利要求1的从属权利要求2-19所保护。
至于制备醛糖酸酯的方法，权利要求20-28能实现该基本目的。
权利要求29-34描述了制备多糖-活性成分轭合物的方法以及可通过这些方法获得的药学活性成分。
提供衍生自在链的还原端被选择性地氧化成醛糖酸的多糖或多糖衍生物的醛糖酸酯可获得实现上述目的的化合物。这类酯可被认为是活化的酸。它们在水性介质中与亲核的NH2基团反应得到(更稳定的)酰胺。
此外，通过本发明尤其取得了以下优点：
本发明的醛糖酸酯使得容易地将活性成分通过共价键与多糖或多糖衍生物连接成为可能。
本发明的醛糖酸酯可在温和的条件下与活性成分反应。在这种情况下，尤其是反应对活性成分的结构、活性和耐受性改变很小。以这种方法尤其可以避免特别是分子内和分子间的交联反应。另外，还可以偶联含磷酸酯基团的药学活性成分而且不改变这些基团。
本发明的醛糖酸可以与活性成分非常选择性地偶联。例如还可以调节所期望的轭合物的特定的化学计量学，使用这些化合物尤其使得制备1∶1的轭合物成为可能。
另外，本发明还提供了制备活化的醛糖酸酯和多糖或多糖衍生物与活性成分的偶联产物的简单且经济的方法。
本发明的醛糖酸酯由在链的还原端可被选择性地氧化的多糖或多糖衍生物衍生而来。该类多糖以及可由其获得的衍生物是本领域中所公知的，且可商购获得。多糖是其分子中含大量的(最小＞10，但通常大得多)通过糖苷键连接在一起的单糖分子(葡萄糖)的大分子碳水化合物。优选的多糖的重均分子量优选为1500-1 000 000道尔顿，特别优选为2000-300 000道尔顿，非常特别优选为2000-50 000道尔顿。分子量Mw由常规方法测定。这些方法包括例如GPC、HPLC、光散射法等。
尤其可以通过多糖残基的分子量来改变在体内的停留时间。
优选的多糖包括淀粉和可通过水解获得的淀粉片断，这种淀粉片断可被认为是淀粉降解产物。通常淀粉分为直链淀粉和支链淀粉，它们在支化度上有差异。本发明特别优选支链淀粉。
在此处支链淀粉首先是指在葡萄糖分子之间具有α-(1-4)和α-(1-6)键的非常广泛支化的淀粉或淀粉产品。链的支化通过α-(1-6)键进行。在天然存在的支链淀粉中大约每15-30葡萄糖区段不规则地存在这些支化。天然支链淀粉的分子量非常大，为107-2’108道尔顿。据估计支链淀粉还在一定限度内形成螺旋。
对于支链淀粉可以定义其支化程度。支化的量度为具有分支点(α-(1-6)键)的葡萄糖残基的分子数与支链淀粉中葡萄糖残基的总分子数之比，该比值以mol％表示。天然存在的支链淀粉的支化度为约4mol％。制备醛糖酸酯优选采用的支链淀粉具有5-10mol％的平均支化度。
还可以使用具有明显超过已知天然支链淀粉的支化度的超支化支链淀粉。在此处，支化度在各种情况下均为平均值(平均支化度)，因为支链淀粉是多分散物质。
与未改性的支链淀粉或羟乙基淀粉相比，这类超支化支链淀粉具有明显更高的支化度，所述支化度以支化的葡萄糖残基的mol％表示，因此其结构与糖原更相似。
超支化支链淀粉的平均支化度通常为＞10至25mol％。这就意味着这些支链淀粉平均约每10-4个葡萄糖单元具有一个α-(1-6)键，因而具有一个分支点。可用于医药领域的优选的支链淀粉类型的特征是支化度为11-16mol％。
进一步优选的超支化支链淀粉具有13-16mol％的支化度。
可用于本发明的支链淀粉优选具有2000-800 000道尔顿、特别是2000-300 000道尔顿、特别优选2000-50 000道尔顿的重均分子量Mw值。
上述淀粉可商购获得。此外其分离也可由文献获悉。因此，淀粉尤其可从马铃薯、木薯、树薯(manioc)、米、小麦或玉米中分离。可从这些植物中获得的淀粉通常最初要进行水解降解反应。在该过程中，分子量从约20000000道尔顿降低至数百万道尔顿，分子量进一步降低至前面提到的值同样也是已知的。尤其是采用蜡质玉米淀粉降解片断制备本发明的醛糖酸酯是可能的和特别优选的。
上述的超支化淀粉片断尤其在德国专利申请102 17 994中有描述。
另外还可以使用多糖衍生物制备本发明的醛糖酸酯。这些衍生物尤其包括羟烷基淀粉，例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，其可以由上述淀粉、尤其是由支链淀粉通过羟烷基化获得。其中，优选羟乙基淀粉(HES)。
本发明优选使用的HES是支链淀粉的羟乙基化衍生物，其中所述的支链淀粉为占蜡质玉米淀粉95％以上的葡萄糖聚合物。支链淀粉由以α-1，4-糖苷键存在且具有α-1，6-糖苷分支的葡萄糖单元构成。可用于本发明的羟乙基淀粉的平均分子量Mw优选为2-300 000道尔顿。
HES具有有利的流变学性质，目前在临床上作为血容量替代物(volumereplacement agent)使用并用于血液稀释疗法(Sommermeyer等，Krankenhauspharmazie，第8卷(8，1987)271-278页和Weidler等，Arzneimittelforschung/Drug Res.，41，(1991)494-498页)。
HES主要由重均分子量Mw、数均分子量Mn、分子量分布和取代程度来表征。在这种情况下醚键中的羟乙基取代可能在葡萄糖残基的2、3和6位碳原子上。在此处取代程度以DS(“取代度”)或MS(“摩尔取代度”)描述，其中DS以取代的葡萄糖分子在所有葡萄糖单元中的比例为基准，MS是指每个葡萄糖单元中羟乙基的平均数。
取代程度MS(摩尔取代度)被定义为每个葡萄糖残基的羟乙基平均数。它根据样品中的羟乙基总数进行测量，例如通过Morgan法、通过醚断裂并随后定量测定由此形成的碘乙烷和乙烯来测量。
不同的是，取代程度DS(取代度)被定义为取代的葡萄糖残基在所有葡萄糖残基中的比例。它可由样品水解后所测得的未取代的葡萄糖量进行测定。根据这些定义很显然MS＞DS。在其中只存在单取代即每个取代的葡萄糖残基只有一个羟乙基的情况下，MS＝DS。
羟乙基淀粉残基优选具有MS为0.1-0.8的取代程度。特别优选羟乙基淀粉残基具有MS为0.4-0.7的取代程度。
对于羟乙基化作用，未取代的葡萄糖残基中各羟基的反应活性不同，这取决于反应条件。因此有可能在一定限度内影响取代模式，即随机分布于各聚合物分子中的各个不同取代的葡萄糖残基。有利的是C2位和C6位大部分被羟乙基化，C6因为其容易接近而更常被取代。
对于本发明的目的而言，优选使用主要在C2位上被取代和尽可能均匀取代的羟乙基淀粉(HES)。在EP 0 402 724 B2中描述了这类HES的制备。它们在生理上适当的时间内完全降解，而另一方面又显示出可控的消除特性。主要在C2位取代使得α-淀粉酶降解羟乙基淀粉较困难。有利的是如果可能在聚合物分子内不存在连续取代的葡萄糖残基，以便确保完全降解。此外，尽管取代度低，但这类羟乙基淀粉在水性介质中具有足够高的溶解度，以致其溶液在长时期内也是稳定的且不形成团块或凝胶。
基于葡萄糖残基的羟乙基，优选羟乙基淀粉残基的C2∶C6取代比为2-15。C2∶C6取代比特别优选为3-11。
上述的多糖或多糖衍生物的醛基选择性地氧化成醛糖酸本身是已知的。该氧化可通过温和的氧化剂例如DE 196 28 705 A1中所述的碘/氢氧化钾或通过酶来完成。
可以使用游离的醛糖酸进行反应。另外，也可以使用盐。这些盐尤其包括碱金属盐，如例如醛糖酸的钠盐和/或钾盐。
使用醇制备本发明的醛糖酸酯。术语醇包括含HO基团的化合物。这些HO基团尤其可与氮原子或苯基键合。
优选使用本领域已知的酸性醇。这些醇尤其包括N-羟基二酰亚胺例如N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺、取代的酚和羟基吡咯，例如羟基苯并三唑，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。
用于制备本发明的醛糖酸酯的其它合适的酸性醇在文献中有详细描述。(V.H.L.Lee编辑，Peptide and Protein Drug Delivery，Marcel Dekker，1991，65页)。
在本发明的一个特定方面，使用其HO基团的pka为6-12、优选为7-11的醇。该值是指在25℃下测定的酸解离常数，该值在文献中被多次引用。
醇的分子量优选为80-500g/mol，尤其是100-200g/mol。
可以将醇以游离形式加入反应混合物中。也可以使用在加入水后(适当时用酸催化)可释放醇的化合物进行反应。
在本发明的一个特定方面，使用碳酸二酯与醛糖酸或醛糖酸盐进行反应。这些化合物使反应能够特别迅速和温和，仅形成碳酸或碳酸盐、醇和所期望的醛糖酸酯。
优选的碳酸二酯尤其是N′N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和磺基-N′N-琥珀酰亚胺基碳酸酯。
这些碳酸二酯可以以较小量被使用。因此，以醛糖酸和/或醛糖酸盐为基准，可以使用1至3摩尔过量、优选1至1.5摩尔过量的碳酸二酯。使用碳酸二酯时反应时间较短。因此，在很多情况下反应可以在2小时后、优选在1小时后完全。
产生醛糖酸酯的反应优选在无水非质子溶剂中进行。水含量应优选不超过0.5％重量，特别优选不超过0.1％重量。合适的溶剂尤其是二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺(DMA)和/或二甲基甲酰胺(DMF)。
酯化反应是本身已知的，可以用任何一种方法进行。产生醛糖酸酯的反应尤其可使用活化化合物进行。当使用游离醇时这种方法是适宜的。活化化合物尤其包括碳二亚胺，如例如二环己基碳二亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
当使用游离的醇时，后者可以以摩尔过量使用。在本发明的一个特定方面，以醛糖酸和/或醛糖酸衍生物为基准，优选使用5-50倍摩尔过量、特别优选8-20倍摩尔过量的醇成分。
产生醛糖酸酯的反应在温和的条件下进行。因此，上述反应可优选在0℃-40℃、特别优选10℃-30℃的温度下进行。
在本发明的一个特定方面，反应用低碱活性(base activity)进行。低碱活性可通过将反应混合物加入10倍过量的水中来测定。在这种情况下，加入之前水在25℃下的pH为7.0，水基本上不含缓冲剂。通过测量加入反应混合物之后在25℃下的pH得到反应混合物的碱活性。加入之后该混合物的pH优选不高于9.0，特别优选不高于8.0，且特别优选不高于7.5。
HES-醛糖酸类例如与N-羟基琥珀酰亚胺的反应在不含水、含EDC的干燥DMA中于室温下平稳进行，得到HES-酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。在这一点上，特别令人惊奇的是不存在通过大量过量存在的葡萄糖残基的OH基团与EDC反应而发生的HES分子的副反应，且由EDC和醛糖酸最初形成的O-酰基异脲重排成相应的N-酰基脲的反应被抑制。
由上述反应得到的溶液可不经分离醛糖酸酯而直接用于偶联反应。由于与溶解在缓冲容积中的靶蛋白相比，在非质子溶剂中的预活化的醛糖酸的体积通常较小，因此在大多数情况下非质子溶剂的量没有干扰作用。优选的溶液包含至少10％重量的醛糖酸酯，优选至少30％重量的醛糖酸酯，特别优选至少50％重量的醛糖酸酯。
醛糖酸酯可被已知的沉淀剂如例如干燥的乙醇、异丙醇或丙酮从非质子溶剂例如DMA的溶液中沉淀出来，并通过重复该过程一次以上而被纯化。优选的固形物包含至少10％重量的醛糖酸酯，优选至少30％重量的醛糖酸酯，特别优选50％重量的醛糖酸酯。
然后可将所述的醛糖酸酯分离出来作为用于偶联例如用于羟乙基淀粉化的物质。在此过程中，未发生与EDC活化的酸的上述副反应。
对于偶联，也可以将活化的醛糖酸的溶液加入药学活性成分的水溶液中，该水溶液优选是被缓冲的，具有适宜的pH。药学活性成分包含至少一个可反应产生醛糖酰胺(aldonamide)的氨基。优选的活性成分包括蛋白质和肽。
反应的pH取决于活性成分的性质。如果可能，pH优选为7-9，特别优选为7.5-8.5。
偶联通常在0℃-40℃、优选10℃-30℃的温度下进行，该温度条件并非旨在进行限制。反应时间可通过适当的方法容易地确定。反应时间通常为1小时至100小时，优选20小时至48小时。
相对于药学活性成分，可以使用过量的醛糖酸酯。以药学活性成分为基准，优选使用1-5倍摩尔过量、特别优选1.5-2倍摩尔过量的醛糖酸酯。
在上述反应中基本上唯一的副产物是醇，例如N-羟基琥珀酰亚胺，其可以容易地与偶联产物分离，例如通过超滤法分离。可能发生的副反应是被水水解成游离的酸和游离的醇。因此特别令人惊奇的是本发明的醛糖酸酯大部分参与了与药学活性成分的偶联反应。这从实施例、尤其是通过附图中所描绘的色谱图可明显看出。
图1未反应的牛白蛋白(BSA)的MALLS-GPC色谱图。单体白蛋白和二聚体白蛋白被明显分开。
图2未反应的HES-10/0.4-琥珀酰亚胺基酯的MALLS-GPC色谱图。
图3HES-10/0.4-琥珀酰亚胺基酯和BSA的反应产物的MALLS-GPC色谱图。所给出的信号是折射率(RI)、UV检测器和90°的光散射信号的3重检测信号。
图4HES-10/0.4-琥珀酰亚胺基酯和BSA的反应产物的MALLS-GPC色谱图，表示分子量对时间。
以下通过实施例和比较实施例更详细地解释了本发明，而并非旨在将本发明限制于这些实施例。
实施例和制备方法
实施例1
用N-羟基琥珀酰亚胺制备HES 10/0.4-酸酯
在40℃下，将平均分子量Mw＝10000道尔顿且取代程度MS＝0.4、链的末端还原端已经按照DE 19628705被选择性地氧化的5g干燥羟乙基淀粉溶解在30ml干燥二甲基乙酰胺中，将溶液冷却后，加入10倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，同时排除潮气。然后分份加入与HES酸等摩尔量的EDC，加入后24小时使反应混合物反应至完全。随后用干燥丙酮沉淀出反应产物并通过重复再沉淀将其纯化。
实施例2
Hes 10/0.4-酸偶联的肌红蛋白的制备
将15mg肌红蛋白溶解在20ml蒸馏水中，并用氢氧化钠溶液将pH调节至7.5。在1小时期间将1.5g实施例1中制备的HES 10/0.4-酸N-羟基琥珀酰亚胺分份加入该溶液中，并通过加入氢氧化钠溶液使pH保持在7.5不变。
将混合物搅拌过夜。
通过凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉化的肌红蛋白的形成，以所用的肌红蛋白为基准，产率为70％。
实施例3
用N′N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯制备HES 10/0.4-酸酯
将0.02mmol(相当于0.14g)干燥的HES 10/0.4-酸溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，同时排除潮气。将0.02mmol N′N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入该溶液中，在室温下搅拌1小时使反应进行至完全。
实施例4
HES 10/0.4-酸与牛血清白蛋白的偶联产物的制备
将50mg牛血清白蛋白(相当于0.7mmol BSA)溶解在6ml pH 8.4的0.3摩尔的碳酸氢盐溶液中。将由实施例3得到的混合物加入该溶液中，通过在室温下搅拌2小时使反应进行至完全。
通过低压HPGPC用多检测(UV 280nm、MALLS光散射检测器(MALLS＝多角激光散射)、RI检测器)证明反应已经成功。
为了比较，图1-4给出了未反应的HES 10/0.4-琥珀酰亚胺基酯、起始原料BSA和反应混合物的色谱图。
由BSA峰的明显降低和280nm处检测到的更高分子量峰的出现可明显看出反应成功。
实施例5
用N′N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯制备HES 50/0.7-酸酯
将0.02mmol(0.5g)干燥的HES 50/0.7-酸溶解在2ml干燥的二甲基甲酰胺中，同时排除潮气。将0.02mmol N′N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯加入该溶液中，在室温下搅拌1小时使反应进行至完全。
实施例6
HES 50/0.7与BSA偶联产物的制备
将50mg牛血清白蛋白BSA(0.7mmol)溶解在6ml pH 8.4的0.3摩尔的碳酸氢盐溶液中。将由实施例5得到的活化的HES 50/0.7-酸的溶液加入该溶液中，通过在室温下搅拌2小时使反应进行至完全。
如实施例4所述通过低压HPGPC用三重检测对反应混合物进行分析监测。
由280nm处未反应的BSA信号降低以及相应的移动至更高分子量的偶联产物的信号的出现可明显看出反应成功。该移动比实施例4中更大，与HES酸的更高的分子量相符合。

Claims (19)

1.在链的还原端被选择性地氧化成醛糖酸的多糖或多糖衍生物的醛糖酸酯，其特征在于所述的多糖或多糖衍生物为淀粉片断衍生物并且所述的淀粉片断衍生物为蜡质玉米淀粉降解片断的羟乙基衍生物，并且由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇为酸性醇。
2.权利要求1中所述的醛糖酸酯，其特征在于所述的羟乙基淀粉片断的平均分子量Mw为2000-300000道尔顿，取代程度MS为0.1-0.8，且葡萄糖残基的C2和C6碳原子上的C2/C6取代比为2-15。
3.权利要求1-2中任意一项所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇分子量为80-500g/mol。
4.权利要求1-2中任意一项所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇pka为6-12。
5.权利要求1-2中任意一项所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇包含HO-N基团或酚基团。
6.权利要求1-2中任意一项所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇选自N-羟基琥珀酰亚胺、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺、取代的酚和羟基苯并三唑。
7.权利要求6中所述的醛糖酸酯，其特征在于由其衍生得到醛糖酸酯中醇部分的醇为N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。
8.包含权利要求1-7中任意一项所述的至少一种醛糖酸酯的固形物。
9.包含权利要求1-7中任意一项所述的至少一种醛糖酸酯的溶液。
10.权利要求9中所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含至少一种有机溶剂。
11.权利要求10中所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含不超过0.5％重量的水。
12.权利要求10-11中任意一项所述的溶液，其特征在于所述的溶液包含至少一种非质子溶剂。
13.权利要求12中所述的溶液，其特征在于所述的溶剂包括二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和/或二甲基甲酰胺。
14.制备在游离氨基官能团上与多糖或多糖衍生物偶联的药学活性成分的方法，其特征在于使权利要求1-7中任一项所述的至少一种醛糖酸酯与含有至少一个氨基的药学活性成分反应。
15.权利要求14中所述的方法，其特征在于反应在水性介质中进行。
16.权利要求15中所述的方法，其特征在于水性介质的pH为7-9。
17.权利要求14所述的方法，其特征在于反应在0℃-40℃的温度下进行。
18.权利要求14-17中任意一项所述的方法，其特征在于所述的药学活性成分为多肽或蛋白质。
19.与多糖或多糖衍生物偶联的且可通过权利要求14-18中任意一项所述的方法获得的药学活性成分，其特征在于所述的药学活性成分在无水介质中变性并且发生由碳二亚胺引起的分子间和分子内交联反应或发生碳二亚胺与药学活性成分的磷酸酯基团的反应。
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