PL190628B1 - Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy i sposób liofilizacji kompozycjizawierającej trehalozę i lipidowe liposomy - Google Patents

Abstract

1. Liofilizowana kompozycja zawierajaca trehaloze i lipidowe liposomy, w których y zamknieta jest biologicznie aktywna substancja, znamienna tym, ze rozpuszczalnosc w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub nizsza niz 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest < 1,5, a cala trehaloza zostala dodana do zewnetrznej strony liposomów, uformowanych juz przed liofilizacja. 8. Sposób liofilizacji kompozycji zawierajacej trehaloze i lipidowe liposomy, do których zostala wprowadzona biologicznie aktywna substancja, znamienny tym, ze: a) od 0,2 do 1,5 czesci wagowych trehalozy dodaje sie do kazdej czesci wagowej li- pidów wodnej kompozycji liposomowej, w której srednia wielkosc liposomów miesci sie w zakresie pomiedzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawieraja biologicznie aktywna substancje, której rozpuszczalnosc w wodzie jest równa lub nizsza niz 0,01% (w/v); b) powyzsza kompozycje chlodzi sie przy pomocy plyty chlodzacej liofilizera do temperatury pomiedzy -5°C a -70°C z szybkoscia chlodzenia pomiedzy 0,5°C a 2°C/min; c) po osiagnieciu zalozonej temperatury zamrazania powyzsza kompozycje utrzymu- je sie w tej temperaturze w ciagu okresu pomiedzy 2 i 5 godzin; d) stosuje sie próznie pomiedzy 50 i 8 Pa, pozostawiajac temperature plyty chlodza- cej okreslona w punkcie b) w okresie pomiedzy 2 a 5 godzin; e) temperature plyty chlodzacej podnosi sie do -15°C i utrzymuje sie do calkowitego usuniecia wody. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy i sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy. Kompozycja ta stanowi preparat farmaceutyczny, zawierający liofilizowane liposomy otaczające biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie.

190 628

Preparat farmaceutyczny, zawierający liofilizowane liposomy otaczające biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, jest stabilny w czasie.

W opisie i zastrzeżeniach patentowych przedmiotowego wynalazku określenie „wysoce nierozpuszczalna w wodzie” stosuje się do takich substancji, które mają rozpuszczalność w wodzie < 0,01% (w/v).

Wiadomo, że stosowanie liposomów w praktyce medycznej zapobiegało trudnościom występującym przy otrzymywaniu preparatów farmaceutycznych, które są wystarczająco stabilne zarówno podczas liofilizacji, jak i w czasie. Powyższe trudności polegają przede wszystkim na wytwarzaniu liposomów; które nie rozstępują się ani nie zbijają się razem. Innymi słowy liposomy powinny pozostać całe i oddzielone od siebie.

Strukturalna integralność liposomów jest szczególnie ważna w przypadku, gdy aktywna substancja jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie. Ze względu na fakt, że rozerwanie liposomów podczas liofilizacji i/lub podczas przechowywania nie zapobiega przed przechodzeniem do roztworu rozpuszczalnych w wodzie aktywnych substancji podczas gdy wodny roztwór liposomów rekonstytuuje się przed podaniem pacjentowi przez dodanie roztworu fizjologicznego. Z drugiej strony w przypadku rozerwania liposomów zawierających aktywne substancje, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie, rekonstytuowanie się liofilizatu daje roztwór, zawierający mniej aktywnej substancji niż to jest wymagane. Im więcej jest rozerwanych liposomów, tym większa jest różnica pomiędzy teoretyczną i aktualną ilością aktywnej substancji w roztworze.

Metodę liofilizacji rozpuszczalnych w wodzie biologicznie aktywnej substancji, zawierającej liposomy ujawniono w opisie patentowym US-A-4 857 319. Dokument ten opisuje liofilizację liposomów o średniej wielkości około 50-100 nm, z dodatkiem jako środka konserwującego, disacharydu jedynie po wewnętrznej stronie (z zawartością zamkniętą przez liposomy), lub jedynie po zewnętrznej stronie, albo po obu stronach, wewnętrznej i zewnętrznej. Stosunek wagowy disacharyd/lipid mieści się w zakresie 0,1:1 i 4:1. Korzystną disacharoząjest trehaloza. Fazę zamrażania prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu (-195,8°C).

W powyższym dokumencie charakterystyki stabilności podczas liofilizacji określano drogą pomiaru pozostałości zamkniętej aktywnej substancji w liposomach po rekonstytucji liofilizatu przez rehydrację.

Tabela 2 w wyżej wspomnianym opisie patentowym pokazuje, że pozostałość jest wysoka (99-100%) jedynie wtedy, gdy stosunek trehaloza/lipid jest wyższy niż 1,76, a trehaloza obecna jest zarówno po wewnętrznej, jak i po zewnętrznej stronie liposomów. Jeśli ten stosunek jest równy 0,11 i 0,19, pozostałość wynosi odpowiednio 22% i 49%, nawet, gdy trehaloza obecna jest zarówno po wewnętrznej jak i po zewnętrznej stronie liposomów. W przeciwieństwie do tego, jeśli trehaloza obecna jest tylko po wewnętrznej stronie, ilość zatrzymanej aktywnej substancji jest drastycznie zmniejszona, nawet przy bardzo dużych ilościach trehalozy. Nawet przy stosunku trehaloza/lipid 3,9, ilość zatrzymana wynosi tylko 26%.

Nie mniej powyższe wyniki nie są powtarzalne, jeśli biologicznie aktywna substancja jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie. Faktycznie, jeśli dodaje się trehalozę podczas wytwarzania liposomów w celu zamknięcia jej w pęcherzykach lipidu, otrzymuje się niejednorodną, nie dającą się wytłaczać zawiesinę (preparaty porównawcze 1 i 2).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że liposomy zawierające biologicznie aktywne substancje, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie, pozostają w zasadzie całe podczas liofilizacji, jeśli trehalozę dodaje się w małych ilościach do liposomów jedynie przed liofilizacją, samą liofilizację osiąga się prowadząc fazę zamrażania w temperaturze pomiędzy -5°C i -70°C.

Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy, w których zamknięta jest biologicznie aktywna substancja, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że rozpuszczalność w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest < 1,5, a cała trehaloza została dodana do zewnętrznej strony liposomów, uformowanych już przed liofilizacją.

Korzystnie, kompozycja zawiera biologicznie aktywną substancję, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, wybraną z grupy składającej się z lonidaminy, melatoniny, cyklosporyny-A i bindanitu.

190 628

Korzystnie, kompozycja zawiera lipidy wybrane z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin.

Korzystniej, kompozycja jako lipidy zawiera fosfolipidy.

Korzystnie, w kompozycji stosunek wagowy trehaloza/lipid mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1.

Korzystnie, w kompozycji średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 i 250 nm.

Bardziej korzystnie, w kompozycji średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 a 100 nm.

Sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy. do których została wprowadzona biologicznie aktywna substancja, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że:

a) od 0,2 do 1,5 części wagowych trehalozy dodaje się do każdej części wagowej lipidów wodnej kompozycji liposomowej, w której średnia wielkość liposomów mieści się w zakresie pomiędzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawierają biologicznie aktywną substancję, której rozpuszczalność w wodzie jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v);

b) powyższą kompozycję chłodzi się przy pomocy płyty chłodzącej liofilizera do temperatury pomiędzy -5°C a -70°C z szybkością chłodzenia pomiędzy 0,5°C a 2°C/min;

c) po osiągnięciu założonej temperatury zamrażania powyższą kompozycję utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu okresu pomiędzy 2 i 5 godzin.

d) stosuje się próżnię pomiędzy 50 i 8 Pa, pozostawiając temperaturę płyty chłodzącej określoną w punkcie b) w okresie pomiędzy 2 a 5 godzin.

e) temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -15°C i utrzymuje się do całkowitego usunięcia wody.

Korzystnie, w fazie b) sposobu temperatura zamrażania mieści się pomiędzy -20°C a -30°C.

Korzystnie, w fazie b) sposobu szybkość chłodzenia wynosi 0,77°C/min.

Korzystnie, w fazie c) sposobu czas wynosi 3 godziny.

Korzystnie, w fazie d) sposobu próżnia wynosi 6 Pa.

Po rekonstytucji przez hydratację kompozycja zatrzymuje w roztworze więcej niż 95% biologicznie aktywnej substancji, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie (przykłady 1,2 i 3).

Typowe przykłady biologicznie aktywnych substancji, które są wysoce nierozpuszczalne w wodzie stanowią lonidamina, melatonina, cyklosporyna-A i bindaryt.

Lipidy kompozycji liposomowej, która ma być poddana procesowi liofilizacji według wynalazku korzystnie wybrane są z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin. Korzystnymi lipidami są fosfolipidy. Stosunek wagowy trehaloza/lipid z kolei korzystnie mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1.

Średnia wielkość liposomów może wynosić pomiędzy 50 i 250 nm. Korzystna wielkość mieści się pomiędzy 50 i 100 nm.

Korzystne warunki pracy w sposobie liofilizacji są następujące:

Faza 2: temperatura zamrażania -20°C do -30°C, szybkość chłodzenia: 0,77°C/min;

Faza 3: czas: 3 godziny;

Faza 4: próżnia: 6 Pa;

Faza 5:

a) jeśli temperatura zamrażania (faza 2) jest niższa niż -15°C, temperaturę płyty chłodzącej obniża się do -15°C z szybkością pomiędzy 0,5°C a 2°C, a liofilizacja trwa 20 godzin, po czym temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -10°C, a po godzinie do +5°C, a liofilizacja następuje po 16 godzinach,

b) jeśli temperatura zamrażania (faza 2) jest wyższa lub równa -15°C, liofilizację kontynuuje się w ciągu 20 godzin, po których temperaturę płyty chłodzącej utrzymuje się +5°C, a liofilizacja następuje w ciągu 16 godzin.

Szczególnie korzystna kompozycja liposomowa według wynalazku zawiera:

Składnik % (wagowych)

Fosfatydylocholina 94

Lizofosfatydykocholina 3

N-acylo-etanoloamina 1

190 628

Fosfatydyło-etanoloamina 0,1

Triglicerydy 1

Wolne kwasy tłuszczowe 0,75

DL-a-tokoferol 0,15

Zazwyczaj wodną kompozycję liposomową według wynalazku wytwarza się przez:

a) dyspergowanie biologicznie aktywnej substancji, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie w lipidach w temperaturze pomiędzy 20°C a 30°C;

b) zawieszanie tej dyspersji w fazie wodnej;

c) pozostawienie tej zawiesiny w temperaturze otoczenia na okres pomiędzy 0 a 48 godzin;

d) ogrzewanie do temperatury pomiędzy 30°C a 75°C wciągu 10-40 minut;

e) zamrażanie do temperatury pomiędzy -150°C a -200°C;

f) powtórzenie faz d) i e) co najmniej dwukrotnie i nie więcej niż 8 razy;

g) filtrowanie przez membranę filtracyjną o średnicy porów 500-1000 nm;

h) wytłaczanie przez membranę o średnicy porów 50-400 nm; i jednocześnie;

i) eliminowanie nie zamkniętej aktywnej substancji.

Czas trwania fazy c) zależy od ilości aktywnej substancji wysoce nierozpuszczalnej w wodzie, która jest przeznaczona do zamknięcia przez liposomy. Fachowiec w tej dziedzinie nie będzie miał trudności w określeniu odpowiedniego czasu drogą kilku prostych rutynowych eksperymentów z każdym z typów kompozycji aktywnych substancji i liposomów.

Korzystnie fazę wodną stanowi 0,05%-0,9% (w/v) wodny roztwór chlorku sodu. Typowo ilość użytych lipidów wynosi 0,01-0,4 części na każdą część wodnego roztworu. Z kolei ilość aktywnej substancji generalnie wynosi pomiędzy 0,01 i 0,3 części wagowych na każdą część wagową lipidów.

Generalnie wytłaczanie przeprowadza się stosując jako gaz wytłaczający sprężone powietrze lub neutralny gaz wybrany z grupy składającej się z azotu, helu i argonu. Korzystnym neutralnym gazem jest hel. Ciśnienie w fazie wtłaczania korzystnie wynosi pomiędzy 500 a 5500 kPa, a temperatura mieści się pomiędzy 20°C a 75°C, a nawet bardziej korzystnie pomiędzy 40°C a 65°C. Typowe przykłady typów odpowiednich urządzeń do wytłaczania stanowią Lipex Biomembranes Thermobarrel Extruder lub Emulsiflex CC Avestin z poliwęglanową membraną Costar™ o średnicy porów pomiędzy 50 i 600 nm.

Postępując w opisany wyżej sposób, otrzymuje się wodne kompozycje, zawierające około 8 mg/ml melatoniny, 3,8 mg/ml lonidaminy, 1 mg/ml cyklosporyny-A i 4 mg/ml bindarytu, przy rozpuszczalności w wodzie 3x10³ mg/ml (lonidaminy), 1xl0^_1 mg/ml (bindarytu) i praktycznie absolutnej nierozpuszczalności melatoniny (G. S. Shida i in. „J. Pineal Res.” 1994, 16, 198-201) i cyklosporyny-A [„nierozpuszczalna w wodzie”, monografia o cyklosporynie-A w „Analitical Profiles of Drug Substances”, 16, 163, (1987)].

Poniższe przykłady powinny służyć jako ilustracja przedstawionego wynalazku, bez jakiegokolwiek jego ograniczenia.

Preparat I

W sposób opisany niżej wytworzono kompozycję liposomową, zawierającą wysoce nierozpuszczalną biologicznie aktywną substancję.

100 mg melatoniny dyspergowano w 1 g fosfolipidów w temperaturze 30°C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraturrax™. Bezpośrednio po tym powyższą dyspersję zawieszono w 10 ml 0,9% (w/v) wodnego roztworu chlorku sodu przy pomocy tego samego homogenizatora, po czym ogrzano na łaźni wodnej o temperaturze 55°C w ciągu 20 minut.

Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania:

- chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty,

- ogrzewanie w temperaturze 55°C do całkowitego upłynnienia fosfolipidów.

Powyższy cykl powtórzono 6 razy. Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez filtr 0,6 pm stosując urządzenie Lipex Biomembranes.

Tak otrzymaną zawiesinę „Multilamellar Large Vesicle” (MLV) poddano 6 cyklom ciągłego wytłaczania, stosując 10 ml urządzenie do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z 0,1 jam poliwęglanowym filtrem Costar™ w temperaturze 55°C, stosując hel jako gaz wytłaczający pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kPa.

190 628

Preparat II

Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 50 mg lonidaminy zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny.

Preparat III

Postępowaliśmy jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 200 mg melatoniny zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny.

Preparat IV

Postępowaliśmy jak opisano w preparacie II, z tą różnicą, że wytłaczanie prowadzono przez 0,2 pm poliwęglanową membranę zamiast przez 0,1 pm.

Preparat V mg cyklosporyny-A dyspergowano w 2 g fosfolipidów w temperaturze 30°C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraurrax™. Bezpośrednio po tym powyższą dyspersję zawieszono w 0,9% (w/v) wodnym roztworze chlorku sodu przy pomocy tego samego homogenizatora i pozostawiono na 24 godziny w temperaturze otoczenia. Następnie otrzymaną zawiesinę ogrzewano na łaźni wodnej o temperaturze 65°C w ciągu 20 minut. Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania:

- chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty,

- ogrzewanie w temperaturze 65°C do całkowitego upłynnienia fosfolipidów.. Powyższy cykl powtórzono 6 razy.

Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez filtr 0,6 pm, stosując urządzenie Lipex Biomembranes.

Otrzymano w ten sposób zawiesinę „Multilamellar Large Vesicle” (MLV) i poddano ją 6 krotnemu cyklowi ciągłego wytłaczania w 10 ml urządzeniu do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel w temperaturze 65°C z 0,1 p m poliwęglanowym filtrem Costar™, stosując hel jako gaz wytłaczający pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kPa.

Preparat VI

Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie I, stosując 2 g fosfolipidów i 50 mg bindarytu zamiast 1 g fosfolipidów i 100 mg melatoniny.

Preparaty porównawcze 1

Preparat 1A

100 mg melatoniny i 1 g trehalozy dyspergowano w 1 g fosfolipidów w temperaturze 30°C w ciągu 10 minut przy pomocy homogenizatora typu Ultraturrax™. Bezpośrednio po tym powyższą. dyspersję zawieszono w 10 ml 0,9% (w/v) wodnego roztworu chlorku sodu, stosując ten sam homogenizator, po czym ogrzewano na łaźni wodnej o temperaturze 55°C w ciągu 20 minut.

Tak otrzymaną zawiesinę poddano następującemu cyklowi chłodzenia i ogrzewania:

- chłodzenie w ciekłym azocie w ciągu 1 minuty,

- ogrzewanie w temperaturze 55°C do czasu całkowitego upłynnienia fosfolipidów. Powyższy cykl powtórzono 6 razy.

Zawiesinę przepuszczono dwukrotnie przez 0,6 pm filtr, stosując urządzenie Lipex Biomembranes.

W ten sposób otrzymano bardzo gęstą masę. Próba wytłaczania przy pomocy 10 ml urządzenia do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z 0,1 pm filtrami poliwęglanowymi Costar™ w temperaturze 55°C z użyciem helu jako gazu wytłaczającego pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kPa, była niezadowalająca.

Preparat 1B

Postępowaliśmy jak opisano w postępowaniu z preparatem 1A, z tą różnicą że wyłączono melatoninę. Otrzymano zawiesinę „Multilamellar Large Vesicle” (MLV), która dała się doskonale wytłaczać przy pomocy 10 ml urządzenia do wytłaczania typu Lipex Biomembranes Thermobarrel z poliwęglanowymi 0,1 pm filtrami Costar™ w temperaturze 55°C z użyciem helu jako gazu wytłaczającego pod ciśnieniem pomiędzy 1000 i 4800 kPa.

Preparaty porównawcze 2

Preparat 2A

Postępowaliśmy tak jak opisano w preparacie porównawczym 1A z tą różnicą że użyto 2 g fosfolipidów zamiast 1 g. W tym przypadku otrzymano również, niedającą się wytłaczać, bardzo gęstą masę.

190 628

Preparat 2B

Postępowaliśmy tak jak w przypadku preparatu porównawczego 1B z tą różnicą, że użyto 2 g fosfolipidów zamiast 1. W tym przypadku otrzymano również dającą się doskonale wytłaczać zawiesinę MLV.

Przykład 1

Preparat II podzielono na 1 ml próbki i do każdej dodano trehalozę w stosunku wagowym trehaloza/lipid, podanym w tabeli 1/1.

Liofilizację przeprowadzono na płycie liofilizera następująco:

1) chłodzenie do -25°C z szybkością 0,77°C/min;

2) utrzymanie w tej temperaturze (-25°C) w ciągu 3 godzin;

3) zastosowanie próżni (6 x 10'² milibara) i utrzymanie w tej temperaturze (-25°C) w ciągu 2 godzin;

4) ogrzewanie do -15°C w ciągu 20 godzin pod próżnią 6 x 10'² milibara;

5) ogrzewanie do -10°C w ciągu 2 godzin pod ciśnieniem 6 x 10’² milibara;

6) ogrzewanie do +5°C w ciągu 20 godzin pod próżnią 6 x 10'2 milibara;

7) zwolnienie próżni;

8) wprowadzenie powietrza.

Liofilizat (1 ml) nawodniono ponownie 1 ml destylowanej wody i pozostawiono w temperaturze otoczenia na 30 minut dla umożliwienia rekonstrukcji liposomów.

0,5 ml powyższego roztworu rozcieńczono następnie 10 ml roztworu fizjologicznego w celu pomiaru średniej wielkości liposomów w urządzeniu NICOMP 370. Tabela 1/1 przedstawia otrzymane wyniki.

Tabela 1/1

Średnia wielkość liposomów przed i po liofilizacji

Szarża	Trehaloza/lipidy (w/w)	Przed	Po
LM/302	0	102	911,7
	1 :2	102	115,9
	1 : 1	102	109,7
	2 : 1	102	167,9
LM/303	0	99,2	911,7
	1 :2	99,2	98,7
	1 : 1	99,2	109,8
	2 : 1	99,2	291,3
LM/304	0	98,6	911,8
	1 : 2	98,6	94,9
	1 : 1	98,6	105,8
	2 : 1	98,6	794

Z tabeli 1/1 widać, że nieobecność trehalozy pociąga za sobą w pewnym stopniu łączenie się liposomów, wyrażające się wzrostem ich średniej wielkości. Nieoczekiwanie wzrost trehalozy (trehaloza/lipidy 2:1) powoduje również pewien stopień łączenia się, a w konsekwencji wzrost średniej wielkości.

Podobne wyniki otrzymano z preparatem IV.

Średnią wielkość liposomów i ilości lonidaminy określono z pewnej liczby próbek, świeżo wytworzonych jak opisano wyżej. Następnie próbki umieszczono w lodówce w temperaturze 5°C i dzielono na próbki w określonych przedziałach czasu, nawodniano ponownie

190 628 w celu określenia ilości aktywnej substancji i średniej wielkości liposomów. Tak otrzymane wyniki podano w tabeli 1/2.

Tabela 1/2

Stosunek trehaloza/lipid (wagowo) 1:2

Szarza	Czas (miesiące)	Ilość HPLC (mg/ml)	Średnia wielkość (nm)
LM/328	to	3,3	107
	1	3,2	110
	3	3,2	114
	6	3,1	127,2
LM/329	to	3,2	103,3
	1	3,2	101
	3	3,2	110,5
	6	3,1	115
LM/330	to	3,3	99,2
	1	3,4	99,5
	3	3,2	100,5
	6	3,1	113,6

Przykład 2

Preparat III liofilizowano jak opisano wyżej w przykładzie 1 i określono średnią wielkość liposomów przed i po liofilizacji (tabela 2/1), jak również średnią wielkość liposomów i ilość melatoniny w świeżych preparatach przetrzymywanych w temperaturze 5°C, jak opisano w poprzednim przykładzie (tabela 2/2).

Tabela 2/1

Średnia wielkość liposomów przed i po liofilizacji

Szarża	Trehaloza/Lipidy (w/w)	Przed	Po
LM/336	0	92	16953
	1 :2	92	6875
	1 : 1	92	96,5
	2 : 1	92	109,7
LM/337	1 : 2	92	146,3
	1 : 1	92	98,8
	2 : 1	92	8319,8
LM/338	1 : 2	92	179,7
	1 : 1	92	225,7
	2 : 1	92	2984

190 628

Podobne wyniki otrzymano również z preparatem I

Tabela 2/2

Stosunek trehaloza/lipid (wagowo) 1:1

Szarża	Czas (miesiące)	Ilość HPLC (mg/ml)	Średnia wielkość (nm)
LM/359	t0	6	104
	1	6	103,2
	3 J	5,8	109,5
LM/360	t0	6,5	107,2
	1	6,5	106,3
	3	6,7	13,6
LM/361	t0	6,2	98,4
	1	6,3	99
	3	6	100,5

Przykład 3

Preparat IV liofilizowano jak opisano wyżej w przykładzie 1 i określono średnią wielkość liposomów przed i po liofilizacji (tabela 3/1), jak również średnią wielkość liposomów i ilość bindarytu w świeżych preparatach przetrzymywanych w temperaturze 5°C, jak opisano w poprzednim przykładzie (tabela 3/2).

Tabela 3/1

Średnia wielkość liposomów przed i po liofilizacji

Szarża	Trehaloza/lipidy (w/w)	Przed	Po
LM/342	0	102,7	7524,1
	1 : 2	102,7	928
	1 : 1	102,7	109
	2 : 1	102,7	140
LM/343	1 :2	102,7	546,6
	1 : 1	102,7	112,3
	2 : 1	102,7	1559,2
LM/344	1 : 2	102,7	194,9
	1 : 1	102,7	112,2
	2 : 1	102,7	4722

190 628

Tabela 3/2

Stosunek trehaloza/lipid (wagowo) 1:1

Szarża	Czas (miesiące)	Ilość HPLC (mg/ml)	Średnia wielkość (nm)
LM/356	t0	3,2	135,4
	1	3,1	128
	3	3,2	131,3
LM/357	t0	3,1	122
	1	3,1	121
	3	3,2	126,2
LM/358	to	3,1	126
	1	3,1	122,8
	3	2,9	121,8

P r z y k ł a dp o r ó w n a w c z y 1

Preparat II podzielono na 1 ml próbki i dodano do każdej trehalozę w stosunku trehaloza/lipid podanym w tabeli porównawczej 1.

Preparat następnie zamrożono w temperaturze ciekłego azotu (-195,8°C) i liofilizowano w ciągu 20 godzin bez zewnętrznej kontroli temperatury.

Liofilizat (1 ml) nawodniono ponownie 1 ml wody destylowanej i utrzymywano w temperaturze otoczenia w ciągu 2 godzin.

0,5 ml powyższego roztworu rozcieńczono następnie 10 ml roztworu fizjologicznego w celu pomiaru średniej wielkości liposomów w urządzeniu NICOMP 370. Otrzymane wyniki przedstawiono niżej w tabeli porównawczej 1.

Tabela porównawcza)

Średnia wielkość liposomów przed i po liofilizacji

Szarża	Trehaloza/lipidy (w/w)	Przed	Po
LM/302	0	102	911,8
	1 : 2	102	254,8
	1 : 1	102	219,3
	2 : 1	102	773,7
LM/303	0	99,2	911,8
	1 :2	99,2	349,9
	1 : 1	99,2	180,4
	2 : 1	99,2	717,2
LM/304	0	98,6	911,8
	1 : 2	98,6	722,5
	1 : 1	98,6	161,1
	2 : 1	98,6	150

190 628

Z tabeli porównawczej 1 widać, że jeśli liofilizację prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu, zarówno pod nieobecność trehalozy jak i w obecności trehalozy, w stosunkach podanych w powyższej tabeli, ma miejsce pewien stopień łączenia się liposomów, wyrażający się wzrostem ich średniej wielkości. Poza tym powyższe dane pokazują, że jeśli liofilizację prowadzi się w temperaturze ciekłego azotu, sam przebieg liofilizacji (przy wytwarzaniu takiej samej kompozycji) nie zawsze reprodukuje takie same wyniki.

190 628

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Liofilizowana kompozycja zawierająca trehalozę i lipidowe liposomy, w których zamknięta jest biologicznie aktywna substancja, znamienna tym, że rozpuszczalność w wodzie biologicznie czynnej substancji jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v), stosunek wagowy trehaloza/lipid jest < 1,5, a cała trehaloza została dodana do zewnętrznej strony liposomów, uformowanych już przed liofilizacją.
2. 2. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że biologicznie aktywna substancja, która jest wysoce nierozpuszczalna w wodzie, jest wybrana z grupy składającej się z lonidaminy, melatoniny, cyklosporyny-A i bindanitu.
3. 3. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że lipidy są wybrane z grupy składającej się z fosfoglicerydów, glicerydów, diglicerydów, triglicerydów, fosfolipidów, lipidów galaktozylowych i glikozylowych, cholesterolu i jego pochodnych, sfingolipidów i ich mieszanin.
4. 4. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że lipidami są fosfolipidy.
5. 5. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek wagowy trehaloza/lipid mieści się pomiędzy 1:2 i 1:1.
6. 6. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 i 250 nm.
7. 7. Liofilizowana kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że średnia wielkość liposomów mieści się pomiędzy 50 a 100 nm.
8. 8. Sposób liofilizacji kompozycji zawierającej trehalozę i lipidowe liposomy, do których została wprowadzona biologicznie aktywna substancja, znamienny tym, że:

   a) od 0,2 do 1,5 części wagowych trehalozy dodaje się do każdej części wagowej lipidów wodnej kompozycji liposomowej, w której średnia wielkość liposomów mieści się w zakresie pomiędzy 50 i 250 nm, które to liposomy zawierają biologicznie aktywną substancję, której rozpuszczalność w wodzie jest równa lub niższa niż 0,01% (w/v);

   b) powyższą kompozycję chłodzi się przy pomocy płyty chłodzącej liofilizera do temperatury pomiędzy -5°C a -70°C z szybkością chłodzenia pomiędzy 0,5°C a 2°C/min;

   c) po osiągnięciu założonej temperatury zamrażania powyższą kompozycję utrzymuje się w tej temperaturze w ciągu okresu pomiędzy 2 i 5 godzin;

   d) stosuje się próżnię pomiędzy 50 i 8 Pa, pozostawiając temperaturę płyty chłodzącej określoną w punkcie b) w okresie pomiędzy 2 a 5 godzin;

   e) temperaturę płyty chłodzącej podnosi się do -15°C i utrzymuje się do całkowitego usunięcia wody.
9. 9. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie b) temperatura zamrażania mieści się pomiędzy -20°C a -30°C.
10. 10. Sposób liofilizacji według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że w fazie b) szybkość chłodzenia wynosi 0,77°C/min.
11. 11. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie c) czas wynosi 3 godziny.
12. 12. Sposób liofilizacji według zastrz. 8, znamienny tym, że w fazie d) próżnia wynosi 6 Pa.