PL187819B1 - Ekstrakt kakao, sposób jego wytwarzania i kompozycje stałe lub ciekłe do podawania doustnego - Google Patents

Abstract

1. Ekstrakt kakao, znamienny tym, ze jest wytworzony sposobem zawierajacym etapy: a) suszenie ziaren kakao przez wymrazanie i sporzadzenie miazgi z niefermentowanych lub czescio- wo fermentowanych ziaren kakao; b) odmiazdzanie liofilizowanej masy c) usuwanie lusek z ziaren kakao suszonych przez zamrazanie; d) mielenie odluszczonych ziaren kakao na proszek kakao; e) odtluszczanie proszku kakao; f) ekstrahowanie proszku kakao za pomoca rozpuszczalnika wodno-organicznego; g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierajacego co najmniej jeden oligomer 4-12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego. 19. Sposób wytwarzania ekstraktu kakao okreslonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze obejmuje: a) suszenie ziaren kakao przez wymrazanie i sporzadzenie miazgi z niefermentowanych lub czescio- wo fermentowanych ziaren kakao; b) odmiazdzanie liofilizowanej masy c) usuwanie lusek z ziaren kakao suszonych przez zamrazanie; d) mielenie odluszczonych ziaren kakao na proszek kakao; e) odtluszczanie proszku kakao; f) ekstrahowanie proszku kakao za pomoca rozpuszczalnika wodno-organicznego; g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierajacego co najmniej jeden oligomer 4 do 12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest ekstrakt kakao, charakteryzujący się tym, że jest wytworzony sposobem zawierającym etapy:

a) suszenia ziaren kakao przez wymrażanie i sporządzenie miazgi z niefermentowanych lub częściowo fermentowanych ziaren kakao;

b) odmiażdżania liofilizowanej masy

c) usuwanie łusek z ziaren kakao suszonych przez zamrażanie;

d) mielenie odłuszczonych ziaren kakao na proszek kakao;

e) odtłuszczanie proszku kakao;

f) ekstrahowanie proszku kakao za pomocą rozpuszczalnika wodno-organicznego;

g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i

h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierającego co najmniej jeden oligomer 4-12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego.

Korzystnie ekstrakt zawiera co najmniej jeden dimer, trimer, tetramer, heksamer, heptamer, oktamer, nonamer, dekamer, undekamer, dodekamer procyjanidyn kakao.

Korzystnie ekstrakt stanowi ekstrakt zawierające polifenole kakao z wyłączeniem alkaloidów ksantynowych przez usunięcie z ekstraktu alkaloidów ksantynowych z uzyskaniem frakcji wolnej od alkaloidów ksantynowych.

Korzystnie ekstrakt jest w postaci liofilizowanej

Korzystnie ekstrakt jest w postaci ciekłej.

Korzystnie alkaloidy ksantynowe stanowią kofeina i teobromina.

187 819

Korzystnie rozpuszczalnik wodno-organiczny stanowi wodny roztwór acetonu, przy czym bardziej korzystnie wodny roztwór acetonu stanowi 70% wodny roztwór acetonu.

Korzystnie rozpuszczalnik wodno-organiczny stanowi wodny roztwór acetonu z następującym dalej działaniem wodnym roztworem metanolu.

Korzystnie wodny roztwór acetonu stanowi 70% wodny roztwór acetonu i wodny roztwór metanolu stanowi 70% wodny roztwór metanolu.

Korzystnie ekstrakt jest oczyszczany za pomocą permeacyjnej chromatografii żelowej.

Korzystnie ekstrakt oczyszczany jest za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Bardziej korzystnie wysokosprawną chromatografię cieczową stanowi wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz.

Również bardziej korzystnie wysokosprawną chromatografię cieczową stanowi wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnym układzie faz.

Korzystnie ekstrakt stanowi ekstrakt otrzymywany wyżej podanym sposobem, który obejmuje dodatkowo etap liofilizacji ekstraktu wodnego w celu otrzymania sproszkowanego ekstraktu kakao.

Korzystnie wyższe oligomery procyjanidyn kakao obejmują przynajmniej pentamery.

Korzystnie wyższe oligomery procyjanidyn kakao obejmują pentamery do dekamerów.

Korzystnie wyższe oligomery procyjanidyn kakao obejmują pentamery do dodekamerów.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wyżej określonego nowego ekstraktu charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) suszenia ziaren kakao przez wymrażanie i sporządzenie miazgi z niefermentowanych lub częściowo fermentowanych ziaren kakao;

b) odmiażdżania liofilizowanej masy

c) usuwanie łusek z ziaren kakao suszonych przez zamrażanie;

d) mielenie odłuszczonych ziaren kakao na proszek kakao;

e) odtłuszczanie proszku kakao;

f) ekstrahowanie proszku kakao za pomocą rozpuszczalnika wodno-organicznego;

g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i

h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierającego co najmniej jeden oligomer 4 do 12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja w postaci stałej do podawania doustnego, charakteryzująca się tym, że zawiera ekstrakt kakao określony powyżej.

Korzystnie kompozycja ma postać tabletki, kapsułki, pigułki.

Korzystnie kompozycja stanowi stalą kompozycję do żucia.

Korzystnie kompozycja stanowi kakao- lub czekoladowo-aromatyzowaną stałą kompozycję.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja w postaci ciekłej do podawania doustnego, charakteryzująca się tym, że zawiera ekstrakt kakao określony powyżej.

Korzystnie kompozycja stanowi zawiesinę, syrop lub eliksir.

Ekstrakt korzystnie zawiera polifenol(e) takie jak polifenol(e) wzbogacony(e) w procyjanidynę(y) kakao, takie jak polifenole co najmniej jednej procyjanidyny kakao wybranej spośród (-)epikatechina, procyjanidyna B-2, oligomery 2 do 12 procyjanidyny, korzystnie 2 do 5 lub 4 do 12, procyjanidyna B-5, procyjanidyna A-2 i procyjanidyna C-l.

Te nowe ekstrakty można zastosować w kompozycji przeciwgazowej, przeciwrakowej lub przeciwnowotworowej lub przeciwutleniającej lub hamującej topoizomerazę II DNA zawierającej czysty ekstrakt kakao i ewentualnie odpowiedni nośnik. Ekstrakt korzystnie zawiera procyj ani dynę (y) kakao. Ekstrakt kakao jest otrzymywany sposobem zawierającym etapy: rozdrabniania ziaren kakao na proszek, odtłuszczania proszku i, ekstrakcji aktywnego(ych) związku(ów) z proszku.

Sposób leczenia pacjentów wymagających leczenia środkiem przeciwguzowym, przeciwrakowym lub przeciwnowotworowym lub przeciwutleniającym lub hamującym topoizomerazę II DNA, składający się z podawania pacjentowi efektywnej ilości ekstraktu kakao.

Ekstrakt kakao może być zastosowany dodatkowo w zestawie do leczenia pacjentów wymagających leczenia środkiem przeciwguzowym, przeciwrakowym lub przeciwnowotwo6

187 819 rowym lub przeciwutleniającym lub środkiem hamującym topoizomerazę II DNA zawierającym zasadniczo czysty ekstrakt kakao.

Krótki opis rysunków

Dalsza część opisu będzie bardziej zrozumiała przez odniesienie do zamieszczonych rysunków, które przedstawiają:

Figura 1 przedstawia reprezentatywny chromatogram żelowo permeacyjny rozdzielania surowych procyjanidyn kakao;

Figura 2A przedstawia reprezentatywny chromatogram z fazą odwróconą HPLC rozdzielania (profil wymywania) procyjanidyn kakao ekstrahowanych z niefermentowanego kakao;

Figura 2B przedstawia reprezentatywny chromatogram z fazą normalną HPLC rozdzielania procyjanidyn kakao ekstrahowanych z niefermentowanego kakao;

Figura 3 przedstawia kilka reprezentacyjnych struktur procyjanidyny;

Figury 4A-4E przedstawiają reprezentatywne chromatogramy HPLC pięciu frakcji stosowanych w badaniach masowych aktywności przeciwrakowej lub przeciwnowotworowej;

Figury 5 i 6A-6D przedstawiają zależność reakcji na dawkę między ekstraktami kakao a komórkami raka ACHN (fig. 5) i PC-3 (fig. 6A-6D) (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); M&M F4/92, M&M+E U12P1, M&MB+E Y192P1, M&MC+E U12P2, M&MD+E U12P2;

Figury 7A do 7H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, A+B, A+E i A+D, a linią komórkową PC-3 (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 A 0212P3, MM-1 B 0162P1, MM-1 C 0122P3, MM-1 D 0122P3, MM-1 E 0292P8, MM-1 A/B 0292P6, MM-1 A/E 0292P6, MM-1 A/D 0292P6;

Figury 8A do 8H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, A+B, B+E i D+E, a linią komórkową KB nosogardziel/HeLa (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 A 092K3, MM-1 B 0212K3, MM-1 C 0162K3, MM-1 D 0212K5, MM-1 E 0292K5, MM-1 A/B 0292K3, MM-1 B/E 0292K4, MM-1 D/E 0292K5;

Figury 9A do 9H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, B+D, A+E i D+E, a linią komórkową HCT-116 (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 C 0192H5, D 0192H5, E 0192H5, MM-1 B & D 0262H2, A/E 0262H3, MM-1 D & E 0262H1;

Figury 10A do 10H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, B+D, C+D i A+E, a nerkową linią komórkową ACHN (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 A 092A5, MM-1 B 092A5, MM-1 C 0192A7, B 092A5, MM-1 C 0192A7, MM-1 D 0192A7, M & Ml E 0192A7, MM-1 B & D 0302A6, MM-1 C & D 0302A6, MM-1 A & E 0262A6;

Figury 11A do 11H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, A+E, B+E i C+D, a linią komórkową A-549 (ułamek przeżycia -dawka, pg/ml); MM-1 A 09258, MM-1 B 09256, MM-1 C 019259, MM-1 D 019258, MM-1 E 019258, MM-1 A/E 026254, MM-1 B & E 030255, MM-1 V C & E N6255;

Figury 12A do 12H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, B+C, C+D i D+E, a linią komórkową czerniaka SK-5 (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 A 0212S4, MM-1 B 0212S4, MM-1 C 0212S4, MM-1 D0212S4, MM-1 EN32S1, MM-1 B & C N32S2, MM-1 C & D N32S3, MM-1 D&EN32S3;

Figury 13A do 13H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao frakcjami A, B, C, D, E, B+C, C+E i D+E, a linią komórkową sutka MCF-7 (ułamek przeżycia - dawka, pg/ml); MM-1 AN22M4, MM-1 B N22M4, mM-1 C N22M4, MM-1 D N22M3, MM-1 E 0302M2, MM-1 B/C 0302M4, MM-1 C & E N22M3, MM-1 D & E N22M3;

Figura 14 przedstawia typową zależności reakcji na dawkę między procyjanidami kakao (zwłaszcza frakcja D) a linią komórkową białaczki CCRF-CEM T (komórki/ml - dni wzrostu; jasne koła kontrola, zaciemnione koła 125 pg frakcja D, jasne odwrócone trójkąty 250 pg frakcja D, zaciemnione odwrócone trójkąty 500 pg frakcja D);

187 819

Figura 15A przedstawia porównanie XTT i testu cytotoksycznego fioletowego kryształu dla MCF-7 p168 komórek raka sutka traktowanych frakcją D+E (jasne kółka dla XTT i zaciemnione dla kryształu fioletu);

Figura 15B przedstawia typową krzywą reakcji na dawkę otrzymaną dla komórek linii komórkowej raka sutka MDA MB231 traktowanych różnymi poziomami surowych polifenoli otrzymanych z genotypu kakao UIT-1 (absorbancja (540 nm) - dni; kółka jasne kontrola, zaciemnione kółka nośnik, jasne odwrócone trójkąty 250 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 100 pg/ml, jasne kwadraty 10 pg/ml, absorbancja 2,0 max. dla czytnika talerza i może nie być potrzebny prezentatywny numer komórki);

Figura 15C przedstawia typową krzywą reakcji na dawkę otrzymaną dla komórek linii komórkowej raka prostaty PC-3 traktowanych różnymi poziomami surowych polifenoli otrzymanych z genotypu kakao UIT-1 (absorbancja (540 nm) - dni; kółka jasne kontrola, zaciemnione kółka nośnik, jasne odwrócone trójkąty 250 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 100 pg/ml, jasne kwadraty 10 pg/ml);

Figura 15D przedstawia typową krzywą reakcji na dawkę otrzymaną dla komórek linii komórkowej raka sutka MCF-7 p168 traktowanych różnymi poziomami surowych polifenoli otrzymanych z genotypu kakao UlT-1 (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka kontrola, zaciemnione kółka nośnik, jasne odwrócone trójkąty 250 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 100 pg/ml, otwarte kwadraty 10 pg/ml, zaciemnione kwadraty 1 pg/ml; absorbancja 2,0 max. dla czytnika talerza i może nie być potrzebny reprezentatywny numer komórki);

Figura 15E przedstawia typową krzywą reakcji na dawkę otrzymaną dla komórek linii komórkowej raka Hela szyjki macicy traktowanych różnymi poziomami surowych polifenoli otrzymanych z genotypu kakao UIT-1 (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka kontrola, zaciemnione kółka nośnik, jasne odwrócone trójkąty 250 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 100 pg/ml, jasne kwadraty 10 pg/ml, absorbancja 2,0 max. dla czytnika talerza i może nie być konieczny reprezentatywny numer komórki);

Figura 15F przedstawia cytotoksyczne efekty przeciw linii komórkowej raka szyjki macicy Hela traktowanych różnymi frakcjami polifenoli kakao (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka 100 pg/ml frakcje A-E, zaciemnione kółka 100 pg/ml frakcje A-C, jasne odwrócone trójkąty 100 pg/ml frakcje D&E; absorbancja 2,0 max. dla czytnika talerza i brak reprezentatywny numer komórki);

Figura 15G przedstawia cytotoksyczne efekty dla 100 pl/ml przeciw linii komórkowej raka sutka SKBR-3 traktowanych różnymi frakcjami polifenoli kakao (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka frakcje A-E, zaciemnione kółka frakcje A-C, jasne odwrócone trójkąty frakcje D & E);

Figura 15h przedstawia typową zależność między procyjaniną kakao frakcja D+E a komórkami Hela (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka kontrola, zaciemnione kółka 100 pg/ml, jasne odwrócone trójkąty 75 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 50 pg/ml, jasne kwadraty) polifenole kakao (z kofeiną/teopbrominą); C-4 = nieznane: odmiana = Forastero i opis z surowego ekstraktu nieznanego (Zachodnia Afryka) polifenole kakao (z kofeiną/teobrominą); 25 pg/ml, ciemne kwadraty 10 pg/ml; absorbancja 2,0 max. dla czytnika talerza i brak reprezentatywny numer komórki);

Figura 151 przedstawia typową zależność między procyjaniną kakao frakcja D+E a komórkami SKBR-3 (absorbancja (540 nm) - dni; jasne kółka kontrola, zaciemnione kółka 100 pg/ml, jasne odwrócone trójkąty 75 pg/ml, zaciemnione odwrócone trójkąty 50 pg/ml, jasne kwadraty 25 pg/ml, zaciemnione kwadraty 10 pg/ml);

Figura 15J przedstawia typowa zależność między procyjanidyną kakao frakcja D+E a komórkami Hela użytymi w teście Soft Agar Cloning (wykres kolumnowy; numer kolonii -kontrola, 1, 10, 50 i 100 pg/ml);

Figura 15K przedstawia zahamowanie wzrostu komórek Hela traktowanych surowym ekstraktem polifenolu otrzymanym z ośmiu rożnych genotypów kakao (% kontrola - stężenie, pg/ml; jasne kółka C-1, ciemne kółka C-2, jasne odwrócone trójkąty C-3, zaciemnione odwrócone trójkąty C-4, jasne kwadraty C-5, zaciemnione kwadraty C-6, jasne trójkąty C-7, zaciemnione trójkąty C-8; C-1 = UF-12: odmiana = Criollo i opis surowego ekstraktu UF-12 (Brazylia) polifenoli kakao (z kofeiną/teobromią); C-2 = NA-33 odmiana = Forastero i opis

187 819 surowego ekstraktu NA-33 (Brazylia) polifenole kakao (z kofeiną/teobrominą); C-3 = EEG-48: odmiana = Forastero i opis surowego ekstraktu EEG-48 (Brazylia C-5 = UF-613: odmiana = Trinitario i opis jest surowym ekstraktem UF-613 (Brazylia) polifenoli kakao (z kofeiną/teobrominą); C-6 = ICS-100: odmiana = Trinitario i opis jest surowym ekstraktem ICS-100 (Brazylia) polifenoli kakao (z kofeiną/teobrominą); C-7 = ICS-139: odmiana = Trinitario i opis jest surowym ekstraktem ICS-139 (Brazylia) polifenole kakao (z kofeiną/teobrominą); C-8 = UIT-1: odmiana = Trinitario i opis jest surowym ekstraktem UIT-1 (Malezja) polifenoli kakao (z kofeiną/teobrominą);

Figura 15L przedstawia zahamowanie wzrostu komórek Hela traktowanych surowym ekstraktem polifenolu otrzymanym z fermentowanych ziaren kakao i suszonych ziaren kakao (fazy fermentacji i suszenia na słońcu; % kontrola - stężenie, pg/ml; jasne kółka frakcja dnia zero, jasne odwrócone trójkąty frakcja dnia 2, zaciemnione odwrócone trójkąty frakcja dnia 3, jasne kwadraty frakcja dnia 4 i ciemne kwadraty frakcja dnia 9);

Figura 15M przedstawia efekty enzymatycznie utlenionych procyjanidyn kakao przeciw komórkom Hela (reakcja na dawkę dla oksydazy polifenolu traktowanych polifenolem surowego kakao; % kontrola - stężenie, pg/ml; zaciemnione kwadraty surowy UIT-1 (z kofeiną i teobrominą), jasne kółka surowy UTI-1 (bez kofeiny i teobrominy) i zaciemnione kółka surowy UIT-1 (katalizowana polifenolo oksydaza);

Figura 15N przedstawia reprezentatywne półpreparatywne rozdzielanie fazą odwróconą HPLC dla połączonych frakcji D i E procyjanidyn kakao;

Figura 15O przedstawia reprezentatywne półpreparatywne rozdzielanie normalną fazą ekstraktu polifenolu kakao;

Figura 16 przedstawia typowe krzywe utleniania Racimat dla ekstraktu procyjanidyn kakao i frakcji w porównaniu do syntetycznych przeciwutleniaczy BHA i BHT (dowolna jednostka - czas; linia kropkowana i plusy (+) dla BHA i BHT;

* dla D-E; x dla surowego; jasne kwadraty dla A-C; jasne romby dla kontroli);

Figura 17 przedstawia typowe wskazania żelu agarozowego zahamowania topoizomerazy II katalizowanego dekatenacja kinetoplastu DNA przez frakcje procyjanidyny (pasy 1 zawierają 0,5 pg markera (M) monomer - długość kinetoplastu DNA kółka; pasy 2 i 20 zawierają kinetoplast DNA, który był inkubowany z Topoizomerazą II w obecności 4% DMSO, ale w nieobecności procyjanidyn kakao, (kontrola -C); pasy 3 i 4 zawierają kinetoplast DNA, który był inkubowany z Topoizomerazą II w obecności 0,5 i 5,0 pg/ml procyjanidyny kakao frakcja A; pasy 5 i 6 zawierają kinetoplast DNA, który był inkubowany z Topoizomerazą II w obecności 0,5 i 5,0 pg/ml procyjanidyny kakao frakcja B; pasy 7, 8, 9, 13, 14 i 15 sąreplikacjami kinetoplastu DNA, który był inkubowany z Topoizomerazą II w obecności 0,05; 0,5 i 5,0 pg/ml procyjanidyny kakao frakcja D; pasy 10, 11, 12, 16, 17 i 18 sąreplikacjami kinetoplastu DNA, który był inkubowany z Topoizomerazą II w obecności 0,05; 0,5 i 5,0 pg/ml procyjanidyny kakao frakcja E; pas 19 jest replikacją kinetoplastu DNA, który był inkubowany z Topo- izomerazą II w obecności 0,5 pg/ml procyjanidyny kakao frakcja E);

Figura 18 przedstawia zależność reakcji na dawkę procyjanidyny kakao frakcja D przeciw naprawiającemu DNA i wadliwej linii komórkowej (ułamek przeżycia - pg/ml; lewa strona xrs-6 DNA naprawiona wadliwa linia komórkowa, MM-1 D 0282X1; prawa strona BR1 naprawiacz wadliwej linii komórkowej MM-1 D D282B1);

Figura 19 przedstawia krzywe reakcji na dawkę dla odpornych na Adriamycynę komórek MCF-7 w porównaniu z MCF-7 pl 68 linii komórek macierzystych po traktowaniu frakcją kakao D+E (% kontrola-stężenie, pg/ml; jasne kółka dla MCF-7 pl68; ciemne kółka dla MCF-7 ADR); i

Figura 20 przedstawia efekt reakcji na dawkę na komórkach Hela po traktowaniu 100 pg/ml i 25 pg/ml dwunastoma frakcjami przygotowanymi półpreparatywną normalnofazowąHPLC (wykres słupkowy, % kontrola - kontrola i frakcje 1-12).

Dokładny opis wynalazku

Jak wcześniej omówiono, nieoczekiwanie okazało się, że ekstrakt kakao ujawnia przeciwrakowe, przeciwguzowe lub przeciwnowotworowe działanie, przeciwutleniające działanie i, hamrując enzym topożzomerazY II DNA. Ekstrakt jest ogólnie \wtw2a-zany przez rozdrabnianie ziaren kakao na proszek, odtłuszczanie proszku, i ekstrakcję aktywnego związku(ów)

187 819 z odtłuszczonego proszku. Proszek może być przygotowany przez liofilizację ziaren kakao i miazgi, odmiażdżanie ziaren kakao i miazgi, odłuszczanie liofilizowanych ziaren kakao, i mielenie obłuszczonych ziaren. Ekstrakcja aktywnego(ych) składnik(ów) może być prowadzona metodą ekstrakcji rozpuszczalnikowej. Ekstrakty mogą być oczyszczane; np. metodą chromatografii żelowo permeacyjnej lub metodą cieczowej chromatografii ciśnieniowej (HPLC) lub przez połączenie tych technik. Ekstrakty mają aktywność, bez chęci wiązania się szczególnymi teoriami, zostały zidentyfikowane jako polifenol(e) kakao jak procyjanidyny. Te procyjanidyny kakao mają znaczną przeciwrakową, przeciwguzową i przeciwnowotworową aktywność; przeciwutleniającą aktywność i hamują enzym DNA topoizomerazy II.

Przeciwrakowe, przeciwguzowe lub przciwnowotworowe lub przeciwutleniające lub hamujące enzymy topoizomerazy II DNA kompozycje zawierające zgodne z wynalazkiem polifenole kakao lub procyjanidyny mogą być wytwarzane standardowymi technikami znanymi fachowcom w dziedzinie farmacji. Takie kompozycje mogą być podawane pacjentowi wymagającemu leczenia w dawkach i technikami dobrze znanymi fachowcom w dziedzinie medycyny z uwzględnieniem takich czynników jak wiek, płeć, waga i kondycja pacjenta, i sposób podawania. Kompozycje mogą być również współpodawane lub podawane kolejno z innymi środkami przeciwnowotworowymi, przeciwguzowymi lub przeciwrakowymi lub przeciwutlerrajacymi lub środkami hamującymi enzymy topoizomerazy II DNA i/lub ze środkami, które redukują lub łagodzą efekty choroby środkami przeciwnowotworowymi, przeciwguzowymi lub przciwrakowymi lub przeciwutleniaczami lub środkami inhibitującymi enzym topoizomerazy II DNA; również biorąc pod uwagę takie czynniki jak wiek, płeć, wagę i kondycje pacjenta, i sposób podawania.

Przykłady kompozycji według wynalazku obejmują stałe kompozycje do podawania doustnego jak kapsułki, tabletki, pigułki i tym podobne, jak również stałe preparaty do żucia, do których obecny wynalazek może dobrze dopasowany ponieważ pochodzi z jadalnego źródła (np. kakao lub czekoladowe, aromatyzowane stałe kompozycje); ciekłe preparaty dootworowe np. doustne, nosowe, analne, dopochwowe itp, podawanie leku jako zawiesin, syropów lub eliksirów; i preparatów do podawania dojelitowego, podskórnego, przezskómego, domięśniowego lub dożylnego (np. podawanie zastrzykami) jak też sterylnych zawiesin lub emulsji. Jakkolwiek aktywne składniki kompozycji mogą tworzyć kompleksy z proteinami jak wtedy, gdy są podawane do naczyń krwionośnych, mogą pojawić się skrzepy strąconych protein krwi; i fachowiec powinien wziąć to pod uwagę. W takich kompozycjach aktywny ekstrakt kakao może być połączony z odpowiednim nośnikiem, rozpuszczalnikiem lub zaróbką jak sterylna woda, sól fizjologiczna, glukoza i podobne. Aktywność ekstraktu kakao według wynalazku może być utrzymywana w formach liofilizowanych do odtworzenia leku, np. w izotonicznych wodnych solach buforowanych.

Dalej niniejszy wynalazek dostarcza zestawu, w którym ekstrakt kakao jest dostarczany. Zestaw może składać się z oddzielnego pojemnika zawierającego odpowiedni nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbkę. Zestaw może również zawierać dodatkowy środek przeciwrakowy, przeciwguzowy lub przeciwnowotworowy lub przeciwutleniacz lub środek hamujący enzym topoizomerazę II dNa i/lub środek, który redukuje odczuwanie bólu wywołanego podawaniem środków przeciwnowOtwo>rowych, przeciwguzowych lub przeciwrakowych lub przeciwutleniaczy lub środków hamujących enzym toppizomerazy II DNA dla współ- lub kolejnego podawania. Dodatkowy(e) środek(i) mogą występować w oddzielnym(ch) pojemniku(ach) lub w domieszce z aktywnym ekstraktem kakao. Dodatkowo zestaw może zawierać instrukcje zmieszania lub połączenia składników i/lub sposób podawania.

Co więcej, podczas gdy wynalazek opisany jest w odniesieniu do ekstraktów kakao korzystnie zawierających procyjanidyny kakao, z niniejszego ujawnienia fachowiec chemik organik będzie w stanie oszacować i przewidzieć syntetyczne drogi otrzymania aktywnych związków. Odpowiednio wynalazek zawiera syntetyczne polifenole kakao lub procyjanidyny lub ich pochodne które zawierają, ale nie ograniczająco glikozydy, galusany, estry itd itp.

Poniższe, nieograniczające wynalazku przykłady podano tylko w celach ilustracyjnych, nie należy ich uznawać za ograniczenie wynalazku, istnieje wiele oczywistych wariantów które są możliwe bez odchodzenia od ducha lub zakresu wynalazku.

187 819

Przykłady

Przykład 1: Źródła kakao i sposób przygotowania

Kilka genotypów Theobroma cacao reprezentujących trzy znane odmiany kakao (Enriquez,1967; Enbels,1981) otrzymane z trzech głównych rejonów świata produkujących kako. Spis tych genotypów używanych w niniejszych badaniach podano w tabeli 1. Najtwardsze strączki kakao otwierano i ziarno z miazgą usuwano przez liofilizację. Miazgę usuwano ręcznie z liofilizowanej masy i ziarna były poddawane niżej opisanej analizie. Niefermentowane, liofilizowane ziarna kakao były najpierw ręcznie odłuszczane, i mielono do otrzymania drobnej masy proszkowej za pomocą młyna TEKMAR. Otrzymana masa była następnie odtłuszczana przez noc metodą ekstrakcji Soxleta za pomocą redestylowanego heksanu jako rozpuszczalnika. Pozostały rozpuszczalnik usuwano pod próżnią z obłuszczonej masy w temperaturze pokojowej.

Tabela 1:

Opis materiału źródłowego Theobroma cacao

Genotyp	Miejsce pochodzenia	Odmiana
UIT-1	Malezja	Trinitario
nieznany	Zachodnia Afryka	Forastero
ICS-100	Brazylia	Trinitario
ICS-39	Brazylia	Trinitario
UF-613	Brazylia	Trinitario
EEG-48	Brazylia	Forastero
UF-12	Brazylia	Criollo
NA-33	Brazylia	Forastero

Przykład2: Procedura ekstrakcji procyjanidyny A. Sposób 1

Rocyjanidyny były ekstrahowane z odtłuszczonych, niefermentowanych, liofilizowanych ziaren kakao z przykładu 1 sposobem opisanym przez Jalala i Collina (1977). Procyjanidyny były ekstrahowane z 50 gramowych porcji odtłuszczonej masy kakao za pomocą 2 x po 400 ml 70% aceton/woda dejonizowana i następnie 400 ml 70% metanol/woda dejonizowana. Ekstrakty były gromadzone i rozpuszczalniki odparowywano w 45°C w wyparce obrotowej utrzymywanej pod częściową próżnią. Pozostała faza wodna została rozpuszczona w dejonizowanej wodzie, do 11 objętości i ekstrahowana 2 x po 400 ml CHCl·}. Faza rozpuszczalnikowa została odrzucona. Następnie fazę wodną ekstrahowano 4 x po 500 ml octanu etylu. Pozostała emulsja była następnie odwirowywana w wirówce Soryall RC 28S pracującej przy 2000 x g przez 30 min w temp. 10°C. Do połączonych ekstraktów octanu etylu dodano 100-200 ml dejonizowanej wody'. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią w 45°C za pomocą wyparki obrotowej utrzymywanej pod częściową próżnią. Pozostałą fazę wodną wymrażano z ciekłego azotu i następnie liofilizowano w LABCONCO Freeze Dry System. Wydajności surowych procyjanidyn otrzymane z różnych genotypów kakao przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2:

Wydajności surowych procyjanidyn

Genotyp	Miejsce pochodzenia	Wydajność
UIT-1	Malezja	3,81
nieznany	Zachodnia Afryka	2,55
ICS-100	Brazylia	3,42
ICS-39	Brazylia	3,45
UF-613	Brazylia	2,98
EEG-48	Brazylia	3,15
UF-12	Brazylia	1,21
NA-33	Brazylia	2,23

187 819

B Sposób 2

Alternatywnie procyjanidyny ekstrahowano z odtłuszczonych, niefermentowanych, liofilizowanych ziaren kakao z przykładu 1 za pomocą 70% wodnego acetonu. Dziesięć gramów odtłuszczonego materiału zawieszono w 100 ml rozpuszczalnika na 5-10 min. Zawiesinę odwirowywano przez 15 min w 4°C przy 3000 x g i supematant przepuszczono przez wełnę szklaną. Filtrat destylowano pod częściową próżnią i pozostałą fazę wodną wymrażano z ciekłego azotu, następnie liofilizowano w LABCONCO Freeze Dry System. Wydajności surowej procyjanidyny wynosiły w zakresie 15-20%.

Nie chcąc się wiązać żądną szczególną teorią, wydaje się, że różnice w surowych wydajnościach odzwierciedlają występujące różnice w genotypach, geograficznym pochodzeniu, odmianie i sposobie przygotowania.

Przykład 3: Częściowe oczyszczanie procyjanidyn kakao

A. Chromatografia żelów o permeacyjna

Procyjanidyny otrzymane w przykładzie 2 były częściowo oczyszczane ciekłą chromatografią Sephadexa LH-20(28 x 2,5cm). Rozdzielanie było przeprowadzone etapami od dejonizowanej wody do metanolu. Początkowa kompozycja zawierała 15% metanolu w dejonizowanej wodzie, następne etapy co 30 min. 25% metanolu w dejonizowanej wodzie, 35% metanolu w dejonizowanej wodzie, 70% metanolu w dejonizowanej wodzie, i na koniec 100% metanolu. Wyciek eluatu alkaloidów xantyny (kofeina i teobromina) był zbierany jako pojedyncza frakcja. Wydzielona frakcja wolnego alkaloidu xantyny poddana została następnie dalszemu rozfrakcjonowaniu z wydzieleniem pięciu podfrakcji nazwanych MM2A do MM2E. Rozpuszczalnik usunięto z każdej podfrakcji przez odparowanie w 45°C w wyparce obrotowej utrzymywanej pod częściową próżnią. Pozostałą fazę wodną wymrażano z ciekłego azotu i liofilizowano przez noc w LABCONCO Freeze Dry System. Reprezentatywne chromatogramy żelowo permeacyjne przedstawiające rozfrakcjonowanie przedstawiono na fig. 1. Około 100 mg materiału zostało rozfrakcjonowane tym sposobem.

Figura 1: Chromatogram żelowo permeacyjny surowych procyjanidyn na Sephadex LH-20

Warunki chromatografii: kolumna: 28 x 2,5 cm Sephadex LH-20, faza ruchoma: metanol/woda gradient etapów, 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0 etapy w odstępach 0,5 godz., szybkość przepływu: 1,5 ml/min, detektor UV λι = 254 nm i λι - 365 nm, szybkość wykresu: 0,5 mm/min, ładunek kolumny 120 mg.

B Półpreparatywna cieczowa chromatografia ciśnieniowa (HPLC)

Sposób 1: Rozdzielanie odwrotna faza

Procyjanidyny otrzymane z przykładu 2 i/lub 3A były częściowo oczyszczane półpreparatywną metodą HPLC. Układ Hewlett Packard 1050 HPLC wyposażony w detektor różnych długości fal, strzykawka wentylowa Rheodyne 7010 z 1 ml strzykawką pętlową zmontowano ze zbiornikiem frakcji Pharmacia FRAC-W0 Fraction Collector. Rozdzielanie przeprowadzano na osłoniętej kolumnie Phenomenex Ultracarb 10 μ ODS Ultracarb (60 x 10 mm). Fazą ruchomą była kompozycja A = woda; B = metanol stosowane w następujących stopniowych warunkach: [czas, %A]; (0, 85), (60, 50), (90, 0), i (100, 0) z szybkością przepływu 5 ml/min.

Reprezentatywne ślady półpreparatywnej HPLC przedstawiono na fig. 15N dla rozdzielania procyjanidyn obecnych we frakcji D+E. Indywidualne piki lub wybrane regiony chromatograficzne zbierano w odstępach czasowych dla dalszego oczyszczania i kolejnego oceniania. Zastrzyki wprowadzały materiał w ilości 25-100 mg.

Sposób 2. Rozdzielanie normalna faza

Procyjanidyny otrzymane z przykładu 2 i/lub 3A były częściowo oczyszczane półpreparatywną HPLC. Układ Hewlett Packard 1050 HPLC, detektor Millipore Water Model 480 LC zestaw na 254 nm zestawiono ze zbiornikiem frakcji Pharmacia Frac-100 Fraction Collector. Rozdział przeprowadzano na kolumnie Supelco 5μ Supelcosil LC-Si (250 x 10 mm) połączonej z kolumną ochronną Supelco 5μ Supelcosil LC-Si (20 x 4,6 mm). Procyjanidyny były wymywane z liniowym gradientem w następujących warunkach: (czas, %A, %B) ; (0; 82; 14), (30; 67,6; 28,4), (60; 46; 50), (65; 10; 86), (70; 10; 86) z 10 min re-wyrównywaniem. Fazą ruchomą była kompozycja A = dichlorometan; B - metanol; i C = kwas octowy:wodą (1:). Stosowano szybkość przepływu 3 ml/min. Składniki były wykrywane w UV przy 254 nm,

187 819 i zapisywane na aparacie Kipp & Zonan BD41. Objętość zastrzyku w zakresie 100-250 roztworu 10 mg ekstraktu procyjanidyny rozpuszczonego w 0,25 ml 70% wodnego acetonu. Reprezentatywne ślady półpreparatywnej HPLC przedstawiono na fig. 150. Pojedyncze piki lub wybrane regiony chromatograficzne były zbierane w odstępach czasowych dla dalszego oczyszczania i kolejnego oceniania.

Warunki HLPC: półpreparatywną kolumna Supelco 5 pm Supelcosil LC-Si 250 x 10 mm, kolumna ochronna Supelco 5 pm Supelcosil LC-Si 20 x 4,6 mm, detektor: Waters LC, Spectrophotometer Model 480 254nm szybkość przepływu 3 ml/min, temperatura kolumny: pokojowa, zastrzyk: 250 pl 70% wodno acetonowego ekstraktu.

Gradient: czas (min)	CH2Cl2	Metanol	Kwas octowy/ woda (1:1)
0	82	14	4
30	67,6	28,4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

Otrzymano następujące frakcje:

Frakcja	Rodzaj
1	Dimery
2	Trimery
3	Tetrametry
4	Pentametry
5	Heksametry
6	Heptametry
7	Octamery
8	Nonamery
9	Dekarnery
10	Undekamery
11	Dodekamery
12	Wyższe oligomery

Przykład 4: Analityczna analiza HPLC ekstraktów procyjanidyny

Sposób 1: Rozdział faza odwróconą

Ekstrakty procyjanidyny otrzymane w przykładzie 3 były filtrowane przez filtr 0,45μ, i analizowane przez potrójny układ HPLC Hewlett Packard 1090 wyposażony w detektor Diodę Array'a i HP model 1046A programowalny fluorescencyjny detektor. Rozdzielanie przeprowadzano w 45°C na kolumnie Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS (200 x 2,1 mm). Flawony i procyjanidyny były eluowane z liniowym gradientem 60% B w A, następnym przemyciu kolumny B z szybkością przepływu 0,3 ml/min. Kompozycja fazy ruchomej składała się z B = 0,5% kwas octowy w metanolu i A = 0,5% kwas octowy w dejonizowanej wodzie.

187 819

Poziom kwasu octowego w ruchomej fazie A i B może wzrastać do 2%. Składniki były wykrywane fluorescencyjnie, przy λ_β = 276 nm i k_em = 316 nm. Stężenia (+)-katechiny i (-)-epikatechiny były określane względem odpowiednich roztworów standardowych. Poziomy procyjanidyny były szacowane przez użycie odpowiednich dla (-)-epikatechiny faktorów. Reprezentatywne chromatogramy HPLC przedstawiające rozdział różnych składników przedstawia fig. 2A dla jednego genotypu. Podobne profile HPLC otrzymano dla innych genotypów kakao. Warunki HLPC: kolumna: 200 x 2,1 mm Hewlett Packard Hypersil

ODS (5μ), kolumna ochronna 20 x 2,1 mm Hewlett Packard Hypersil ODS (5μ), detektor: Dioda Array'a 280nm fluorescencja przy λ_β = 7276 nm; λ_β= = 1516 nm. szybkość przepływu 0,3 ml/min, temperatura kolumny: 45°C,

Gradient	0,5% kwas octowy	0,5% kwas
czas (min)	w dejonizowanej wodzie	w metanolu
0	100	0
50	40	60
60	0	100

Sposób 2: Separacja normalna faza

Ekstrakty procyjanidyny otrzymane z przykładu 2 i/lub 3 były filtrowane przez filtr 0,45 μ i analizowane przez układ Hewlett Packard 1090 seria II HPLC wyposażony w programowalny detektor fluorescencji HP model 1046A i diodę Array'a. Rozdzielanie przeprowadzano w 37°C na 5μ kolumnie Phenomenex Lichrosphre Silica 100 (250 x 3,2 mm) połączonej z kolumną ochronną Supelguard LC-Si 5μ (20 x 4,6 mm). Procyjanidyny eluowano z liniowym gradientem w następujących warunkach: (czas; %A; %B); (0; 82; 14), (30; 67,6; 28,4), (60; 46; 50), (65; 10; 86), (70; 10, 86) i następnym 8 min re-wyrównywaniem. Kompozycja fazy ruchomej składała się z A = dichlorometan, B = etanol, i C = kwas octowy:woda w stosunku objętościowym 1:1. Stosowano szybkość przepływu 0,5 ml/min. Składniki wykrywano fluorescencyjnie przy λ_βχ= 276 nm i ż_em = 316 nm lub przez UV przy 280 nm. Reprezentatywne chromatogramy HPLC przedstawiające rozdział różnych procyjanidyn przedstawiono na fig. 2B dla jednego genotypu. Podobne profile HPLC otrzymano dla innych genotypów kakao.

Warunki HLPC: kolumna: 250 x 3,2 mm Phenomenex Lichrosphere Silica 100 (5μ), kolumna ochronna 20 x 4,6 mm Supelguard LC-Si (5μ), detektor: Fotodioda Array'a 280 nm fluorescencja przy = 276 nm; = 316 nm. szybkość przepływu 0,5 ml/min, temperatura kolumny: 37°C

Gradient: czas (min)	CH2Cl2	Metanol	Kwas octowy/ /woda (1:1)
0	82	14	4
30	67,6	28,4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

187 819

Przykład 5: Identyfikacja procyjanidyn

Procyjanidyny były oczyszczane przez ciekłą chromatografię na kolumnie Sephadex LH-20 (28 x 2,5 cm) i następnie półpreparatywnie HPLc z użyciem 1θμ kolumny pBondapak C18 (100 x 8 mm) lub półpreparatywnie z użyciem 5μ kolumny Supelcosil LC-Si (250 x 10 mm).

Częściowo oczyszczone izolaty były analizowane metodą spektometrii masowej - bombardowanie szybkimi atomami (FAB-Ms) układem VG ZAB-T wysokiej rozdzielczości MS z zastosowaniem techniki ciekłej drugiej jonowej spektroskopii masowej (LSIMS) pozytywnymi i negatywnymi jonami. Stosowano działo jonów cezu jako źródło jonizujące 30kV a „Magie Bullet Matrix” (1:1 ditriotreitol/ditioerytriol) jako donor protonów.

Analityczne badania tych frakcji metodą LSIMS ujawniły obecność wielu oligomerów flavano-3-olu jak pokazano w tabeli 3.

Tabela 3

LSIMS (pozytywne jony) dane dla frakcji procyjanidyny kakao

Oligomer	(m+l)+ m/z	(M+Na)+ m/z	Ciężar mol.
monomer (y) (katechiny)	291	313	290
dimer (y)	577/579	599/601	576/578
trimer (y)	865/867	887/889	884/866
tetramer (y)	1155	1177	1154
pentamer (y)	1443	1465	1442
heksamer (y)	1731	1753	1730
heptamer (y)	—	2041	2018
octamer (y)	...	2329	2306
nonamer (y)	...	2617	2594
dekamer (y)	...	2905	2882
undekamer (y)	—	—	3170
dodekamer (y)	...	...	3458

Główne jonowe fragmenty masowe były uważane zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami za oba pozytywne i negatywne jony analizy FAB-MS procyjanidyn (Self i inni, 1986 i Porter i inni,1991). Jony odpowiadające m/z 577(M+H)+ i ich sodowe addukty przy m/z (M+Na) + sugerują obecność podwójnie połączonych dimerów procyjanidyny w izolatach. Interesującym było stwierdzenie, że wyższe oligomery były bardziej podobne do form sodowych adduktów (M+Na)+ niż ich protonowane cząsteczkowe jony (M+H)+. Izomery procyjanidyny B-2, B-5 i C-1 były próbnie identyfikowane na podstawie prac opisanych przez Revilla i inni, (1991), Self i inni, (1986) i Porter i inni (1991). Procyjanidyny aż do oktameru i dekameru były weryfikowane przez FAB-MS w częściowo oczyszczanych frakcjach. Dodatkowo, dowód istnienia procyjanidyn aż do dodekamerów był obserwowany z analizy HPLC normalnej fazy (por. fig. 2B). Bez wiązania się szczególną teorią, wydaje się że dodekamery są granicą rozpuszczalności w stosowanych w ekstrakcji i oczyszczaniu rozpuszczalnikach. Tabela 4 przedstawia względne stężenia procyjanidyn wykrytych w wolnych od alkaloidu xantyny izolatach, na podstawie analizy odwrotną fazą HPLC. Tabela 5 przedstawia względne stężenia procyjanidyn na podstawie analizy HPLc normalną fazą.

187 819

Tabela 4:

Względne stężenia procyjanidyn w wolnych od alkaloidu xantyny izolatach

Składnik	Ciężar cząsteczkowy	Ilość %
(+) -katechina	290	1,6
(-) -epikatechina	290	38,2
B-2 dimer	578	11,0
B-5 dimer	578	5,3
C-1 trimer	866	9,3
podwójnie połączone dimery	576	3,0
tetramer (y)	1154	4,5
pentamer-oktamer	1442-2306	24,5
nieznane i wyższe oligomery	—	2,6

Tabela 5:

Względne stężenia procyjanidyny w ekstraktach wodno acetonowych

Składnik	Ciężar cząsteczkowy	Ilość %
(+) -katechina i (-)-epikatechina	290 (dla każdego)	41,9
B-2 i B-5 dimery	578	13,9
trimery	884/866	11,3
tetramery	1154	9,9
pentamery	1442	7,8
heksamery	1730	5,1
heptamery	2018	4,2
oktamery	2306	2,8
nonamery	2594	1,6
dekamery	2882	0,7
undekamery	3170	0,2
dodekamery	3458	<0,1

Figura 3 przedstawia kilka struktur procyjanidyny i fig. 4A-4E przedstawiają reprezentatywne chromatogramy HPLC pięciu frakcji zastosowanych w następujących badaniach masowych aktywności przeciwrakowej i przeciwnowotworowej. Warunki HPLC dla fig. 4A-4E były następujące:

warunki HPLC: Hewlett Packard 1090 trójskładnikowy układ HPLC wyposażony w programowalny detektor fluorescencyjny HP Model 1046A. Kolumna: Hewlett Packard 5μ H^eersl 1 ODS <200 x 2,1 mm) gradient liniowy 60% B w A z szybkością przepływu 0,3 ml/min. B = 0,5% kwas octowy w metanolu;

A = 0,5% kwas octowy w wodzie dejonizowanej.

Xex = 280nm; Ze_m = 316nm.

Figura 150 przedstawia reprezentatywne chromatogramy, półpreparatywne HPLC dodatkowych 12 frakcji zastosowanych w badaniach masowych na przeciwrakową lub przeciwnowotworową aktywność (warunki HPLC podane wyżej).

187 819

Przykład 6: Przeciwrakowa, przeciwguzowa lub przeciwnzwzrwoozwa aktywność ekstraktów kakao (procyjanidyn)

Test tetrazolowej cytotzkstcznzści MTT (bromek 3-[4,5-dimetylo-tiazol-2-ilo]-2,5-difentloteroazzlu) - płyta do mikromiareczkowania, oryginalnie rozwinięty przez Mosmann'a (1983), zastosowano do badań masowych próbek z przykładu 5. Testowane próbki, standardy (cisplatyna i chlorambucyl) i reagent MTT rozpuszczono w 100% DMSO (sulfotlenek dimetylu) w stężeniu 10 mg/ml. Przygotowano serie rozcieńczeń z podstawowego roztworu. W przypadku próbek testowych, przygotowano rozcieńczenia w zakresie od 0,01 do 100 pg/ml w 0,5% DMSO.

Wszystkie linie komórkowe ludzkiego raka otrzymano z American Type Culture Collection. Komórki narastały jako monowarstwy w alfa-MEM zawierającym 10% serum płodu bydlęcego, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny i 240 jednostek/ml nystatyny. Komórki utrzymywano w atmosferze nawilżanej, zawierającej 5% CO2 w 37°C.

Po poddaniu działaniu tiypsyny, komórki liczono o ustawiano stężenie na 50 x 10⁵ komórki/ml (różnie odpowiednio dla rakowych linii komórkowych). 200 j zawiesiny komórek umieszczono w 4 rzędach 96 otworowej płycie do mikromiareczkowania. Przez 4 godziny pozwolono komórkom przymocowywać się, do poczwórnych otworów dodano 2 p1 DMSO zawierającego roztwory badanych próbek. Początkową odpowiedź na dawkę stwierdzono eksperymentalnie, używając roztworów próbek rzędu wielkości użytego do określenia zakresu dawek do badania. Mierzono absorbancję otworów przy 540 nm za pomocą czytnika BIO RAD MP450. Średnia absorbancja z poczwórnych próbek testowych traktowanych otworów była porównywana do kontrolnej, a wynik był wyrażany w procentach kontrolnej absorbancji plus/minus standartowe odchylenie. Redukcja MMT do purpurowego formazanu współzależy w sposób liniowy od liczby żywych komórek w otworze. Zatem, przez pomiar absorbancji zredukowanego produktu można otrzymać ilość procentową komórek, które przeżyły dla danej dawki badanej próbki. Kontrolne próbki zawierają końcowe stężenie 1% DMSO.

Dwie próbki były najpierw testowane tym sposobem. Próbka MMI przedstawiała bardzo surowy izolat procyjanidyn kakao i zawierała znaczne ilości kofeiny i teobrominy. Próbka MM2 przedstawiała izolat procyjanidyn kakao częściowo oczyszczony chromatografią żelowo permeacyjną. Kofeina i teobromina nie występowały w MM2. Obie próbki badano masowo na aktywność przeciw następującym rakowym liniom komórkowym stosując procedurę opisaną uprzednio:

HCT 116 rak okrężnicy

ACHN rak gruczołowy nerkowy

SK-5 czerniak

A498 rak gruczołowy nerkowy

MCF-7 rak sutka

PC-3 rak gruczołu krokowego

CAPAN-2 rak trzustki.

Dla badanych linii komórkowych rak obserwowano małą lub żadną aktywność dla MMI. MM-2 miała aktywność przeciw rakowym liniom komórkowym HCT-116, PC-3 i ACHN. Jakkolwiek obie próbki interferowały z MTT tak, że zaciemniały obniżenie absorbancji, co mogło się odbijać zmniejszeniem liczby żywych komórek. Ta interferencja również miała wpływ na dużą ilość błędnych pomiarów, ponieważ wydaje się, że reakcja chemiczna przebiegała dużo szybciej wzdłuż obwodu płyty. Typowe próbki tego efektu przedstawiono na fig. 5. Przy wysokich stężeniach badanego materiału należało raczej oczekiwać dużego obniżenia liczby żywych komórek, niż przedstawionego wysokiego poziomu przeżycia. Mimo wszystko, badania mikroskopowe ujawniły, że ctrotoksycznt efekt istnieje, pomimo efektu interferencji MTT. Na przykład tym sposobem otrzymano wartość IC50 wynoszącą 0,5 pg/ml dla działania MM2 na linie komórkową ACHN.

Te pierwsze wyniki, w opinii wynalazców, wymagały zweryfikowania procedury testowej i uwzględnienia interferencji z mMt. Zostało to osiągnięte następująco. Po inkubacji płyty w 37°C, w nawilżanej 5% CO2 atmosferze przez 18 godzin, dokładnie odessano medium i zastąpiono je świeżym alfa-MEM. To medium było znowu odessane z otworów na trzeci dzień testu i zastąpione 100 μ1 świeżo przygotowanego medium McCoy'a. Następnie do każdego

187 819 otworu w płycie dodano 11 p1 z 5 mg/ml roztworu podstawowego MTT w PBS (solanki buforowanej fosforanem). Po inkubacji w ciągu 4 godzin w wilgotnej, 5% CO2 atmosferze w 37°C, do każdego otworu w płycie dodano 100 μΐ 0,04N HC1 w izopropanolu, następnie wymieszano aby rozpuścić wytworzony formazan w każdej zdolnej do życia komórce. Dodatkowo postanowiono rozfrakcjonować procyjanidyny aby określić specyficzne związki odpowiedzialne za aktywność. Wcześniej opisana procedura rozfrakcjonowania została zastosowana do dalszych badań masowych. Przygotowano pięć frakcji odpowiadających obszarom przedstawionym na fig. 1 i rozkładowi składnika(ów) przedstawionych na fig. 4A-4E. Próbki oznaczono MM2A do MM2E aby uzewnętrznić tę charakterystykę analityczną i wyszczególnić nieobecność kofeiny i teobrominy.

Każda z frakcji została indywidualnie przebadana przeciw rakowym liniom komórkowym HCT-116, PC-3 i ACHN. Wyniki wskazują, że aktywność nie jest przyporządkowana do określonej frakcji. Tego typu wynik nie był niczym niezwykłym ponieważ składniki w „aktywnym” naturalnym izolowanym produkcie mogą zachowywać się synergistycznie.

W przypadku izolatu procyjanidyn kakao (MM2) izolat stanowi ponad dwadzieścia wykrywalnych składników. Uważa się za możliwe, że aktywność bardziej zależy od kombinacji składników obecnych w różnych frakcjach, niż zależy od indywidualnego składnika(ów).

Na podstawie tych wyników postanowiono połączyć frakcje i powtórzyć test przeciw tym samym rakowym liniom komórkowym. Wiele kombinacji frakcji dawało efekt cytotoksyczny przeciw rakowej linii komórkowej PC-3. Szczególnie otrzymano wartości IC50 wynoszące 40 pg/ml dla każdej z kombinacji MM2A i MM2E, i 20 pg/ml dla każdej z kombinacji MM2C i MM2E. Stwierdzono również aktywność przeciw liniom komórkowym HCT-116 i ACHN, ale jak poprzednio interferencja ze wskaźnikiem MMT zakłócała dokładne obserwacje. Przeprowadzono powtórne badania dla linii komórkowych HCT-116 i ACHN aby poprawić wyniki. Jakkolwiek te wyniki były nieprzekonywujące ze względu na bakteryjne zanieczyszczenie i odsysanie materiału badanej próbki. Figury 6A-6D przedstawiają zależność reakcji na dawkę między kombinacjami ekstraktów kakao, a komórkami raka PC-3.

Z tych danych wynika jasno, że ekstrakty kakao, zwłaszcza polifenole kakao mają znaczną aktywność przeciwguzową, przeciwrakową lub przeciwnowotworową, zwłaszcza w odniesieniu do ludzkich rakowych linii komórkowych PC-3 (gruczoł krokowy), HCT-116 (okrężnica) i ACHN (nerka). Dodatkowo te wyniki sugerują, że specyficzne frakcje procyjanidyny mogą być odpowiedzialne za aktywność przeciw linii komórkowej PC-3.

Przykład 7: Przeciwrakowa, przeciwguzową lub przeciwnowotworową aktywność ekstraktów kakao (procyjanidyn)

Aby potwierdzić powyższe odkrycia przeprowadzono dalsze rozległe badania masowe kombinacji frakcji.

Wszystkie przygotowane materiały i procedury były identyczne z opisanymi powyżej, z tym, ze standardową 4-powtórzeniową dawkę na test zamieniono na 8 lub 12 powtórzeniową dawkę na test. Te badania prowadzono z indywidualnymi lub w kombinacjach pięcioma frakcjami procyjanidyn kakao przeciw następującym rakowym liniom komórkowym.

PC-3 gruczoł krokowy

KB nosogardłowyHłela

HCT-116 okrężnica

ACHN nerka

MCF-7 sutek

SK-5 czerniak

A-549 płuco

CCRF-CEM T-komórki białaczki

Indywidualne badania masowe składały się z testów różnych poziomów dawki (0,01-100 pg/ml) frakcji A, B, C, D i E (por. fig. 4A-4E i ich opis) przeciw każdej linii komórkowej. Połączone badania składały się z kombinacji równych poziomów dawek frakcji A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E i D+E przeciw każdej linii komórkowej. Wyniki z tych testów omówiono indywidualnie, i następnie podsumowano.

187 819

A. P-3 linia komórkowa gruczołu prostaty

Figury 7A-7H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę między frakcjami procyjanidyn i linią komórkową PC-3. Figury 7D i 7E pokazują, że frakcje D i E były aktywne na poziomie IC50 dla wartości 75 fig/ml. Wartości IC50 otrzymane z krzywych odpowiedzi na dawkę innych kombinacji frakcji procyjanidyn występowały w zakresie 60-80 pg/ml, gdy były obecne frakcje D lub E. Indywidualne wartości IC50 przedstawiono w tabeli 6.

B. KB linia komórkowa nosogardziel/Hela

Figury 8A-8H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę między frakcjami procyjanidyn i linią komórkową KB nosogardziel/Hela. Figury 8D-6E pokazują, że frakcje D i E były aktywne na poziomie IC50 dla wartości 75 jig/ml. Figury 8F-8H obrazują reprezentatywne wyniki otrzymane dla badań kombinacji frakcji. W tym przypadku, kombinacja frakcji procyjanidyn A+B nie dała efektów, podczas gdy kombinacje frakcji B+E i D+E były aktywne na poziomie IC50 dla wartości 60 pg/ml. Wartości IC50 które otrzymano z innych krzywych odpowiedzi na dawkę dla innych kombinacji frakcji mieściły się w zakresie 60-80 pg/ml, gdy frakcje D lub E były obecne. Indywidualne wartości IC50 przedstawiono w tabeli 6. Wyniki były zasadniczo takie same jak otrzymane przeciw linii komórkowej PC-3.

C. HCT-116 linia komórkowa okrężnicy

Figury 9A-9H przedstawiają typowe zależności reakcji na dawkę między frakcjami procyjanidyn kakao i linią komórkową HCT-116 okrężnicy. Figury 9D i 9E pokazują, że frakcja E była aktywna na poziomie IC50 wartości zbliżonych do 400 pg/ml. Te wartości otrzymano przez ekstrapolację istniejących krzywych. Należy zwrócić uwagę, że nachylenie krzywej odpowiedzi dawki dla frakcji D również wykazują aktywność. Jakkolwiek nie określono wartości IC50 z tego wykresu, ponieważ nachylenie krzywej było zbyt płytkie aby otrzymać wiarygodne wyniki. Figury 9F-9H obrazują reprezentatywne wyniki otrzymane dla badań frakcji połączonych. W tym przypadku kombinacja frakcji procyjanidyn B+D nie wykazywała znacznego działania, podczas gdy kombinacje frakcji A+E i D+E były aktywne na poziomie IC50 dla wartości odpowiednio 500 pg/ml i 85 ng/ml. Wartości IC50 otrzymane z krzywych odpowiedzi na dawkę innych kombinacji frakcji wynosiły średnio 250 (rg/ml gdy frakcja E była obecna. Ekstrapolowane wartości IC50 przedstawiono w tabeli 6.

D. ACHN linia komórkowa nerkowa

Figury 10A-10H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę frakcji procyjanidyn kakao i ACHN nerkowej linii komórkowej, figury pokazują, że żadna indywidualna frakcja nie była aktywna przeciw tej linii komórkowej. Figury 10F-10H obrazują reprezentatywne wyniki otrzymane dla badań frakcji połączonych. W tym przypadku, kombinacja frakcji procyjanidyny B+C była nieaktywna, podczas gdy kombinacja frakcji A+E dawała ekstrapolowaną wartość na poziomie IC50 w przybliżeniu 500 pg/ml. Krzywe odpowiedzi na dawkę podobne do kombinacji C+D uznano, za nieaktywne, ponieważ ich nachylenie było zbyt płytkie. Ekstrapolowane wartości IC50 dla innych kombinacji frakcji przedstawiono w tabeli 6.

E. A-549 linia komórkowa płuca

Figury 11A-11H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę między frakcjami procyjanidyn kakao i A-549 płucnej linii komórkowej. Nie zmierzono żadnej aktywności dla indywidualnych frakcji ani dla kombinacji frakcji użytych w testowanych dawkach. Tym niemniej frakcje procyjanidyny mogą być użyteczne w odniesieniu do tej linii komórkowej.

F. SK-5 linia komórkowa czerniaka

Figury 12A-12H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę między frakcjami procyjanidyny kakao i SK-5 czerniaka linią komórkową. Nie odczytano aktywności ani dla indywidualnych frakcji ani dla kombinacji frakcji w testowanych dawkach. Tym niemniej frakcje procyjanidyny mogą być użyteczne w odniesieniu do tej linii komórkowej.

G. MCF-7 linia komórkowa sutka

Figury 13A-13H przedstawiają typowe zależności odpowiedzi na dawkę między frakcjami procyjanidyny kakao i MCF-7 linią komórkową sutka. Nie odczytano aktywności ani dla indywidualnych frakcji ani dla kombinacji frakcji w testowanych dawkach. Tym niemniej frakcje procyjanidyny mogą być użyteczne w odniesieniu do tej linii komórkowej.

187 819

H. CCRF-CEM komórki-T linii białaczki

Nietypowe krzywe odpowiedzi na dawkę otrzymano przeciw CCRF-CEM komórkom-T linii białaczki. Jakkolwiek mikroskopowe zliczenie komórek w czasie dla różnych stężeń frakcji wskazało, że 500 pg frakcji A, B i D dawało 80% wzrost redukcji w okresie czterech dni. Zależność reprezentatywnych odpowiedzi na dawkę przedstawia fig. 14.

I. Podsumowanie

Wartości IC50 otrzymane z tych testów zestawiono razem w tabeli 6 dla wszystkich linii komórkowych z wyjątkiem CCRF-CEM komórek-T białaczki. Dane dla komórek-T białaczki zostały celowo ominięte w tabeli, ponieważ stosowano inną procedurę. Ogólnie podsumowując te wyniki pokazują, że największa aktywność jest związana z frakcjami D i E.

Te frakcje były najbardziej aktywne przeciw liniom komórkowym PC-3 (gruczoł prostaty) i KB (nosogardziel/Hela). Te frakcje również wykazywały aktywność przeciw liniom komórkowym HCT-116 (okreżnica) i ACHN (nerka), aczkolwiek ale tylko w bardzo wysokich dawkach. Nie stwierdzono aktywności przeciw liniom komórkowym MCF-7 (sutek), SK-5 (czerniak) i A-549 (płuco). Tym niemniej frakcje procyjanidyny mogą być użyteczne w odniesieniu do tych linii komórkowych. Wykazano aktywność przeciw linii komórkowej CCRF-CEM (komórki-T białaczki). Należy zauważyć, że frakcje D i E są najbardziej złożonymi mieszaninami. Tym niemniej, z tych danych jasno wynika, że ekstrakty kakao, zwłaszcza procyjanidyny kakao mają znaczącą przeciwguzową, przeciwrakową lub przeciwnowotworową aktywność.

Tabela 6:

Wartości IC50 dla frakcji procyjanidyny kakao przeciw różnym liniom komórkowym

(IC50 wartość w ng/ml)
Frakcja
A
B
C
D	90	80
E	75	75	400
A+B
A+C	125	100
A+D	75	75
A+E	80	75	500	500
B+C
B+D	75	80
B+E	60	65	200
C+D	80	75		1000
C+E	80	70	250
D+E	80	60	85
Wartości powyżej 100 pg/ml były ekstrapolowane z krzywych odpowiedzi na dawki ,

Przyklad8: Przeciwrakowa, przeciwguzową lub przeciwnowotworową aktywność ekstraktów kakao (procyjanidyny)

Kilka dodatkowych testów in vitro zastosowano do uzupełnienia i rozszerzenia wyników przedstawionych w przykładach 6 i 7.

Sposób A. Test barwienia fioletu krystalicznego

Wszystkie ludzkie guzowe linie komórkowe otrzymano z American Type Culture Collection. Komórki narastały w monowarstwie w IMEM zawierającym 10% płodowego bydlęcego serum bez antybiotyków Komórki były utrzymywane w nawilżanej, 5% CO2 atmosferze w 37°C.

Po poddaniu działania trypsyny, komórki policzono i ustawiono stężenie 1000-2000 komórek na 100 pl. Komórki wzrastały w 96 otworowej płycie do mikromiareczkowania

187 819 (1000-2000 komórek na otwór). Po dodaniu po 100 μ! komórek na otwór, komórki pozostawiono do przytwierdzenia się przez 24 godziny. Na koniec 24 godzinnego okresu, różne frakcje kakao dodano w różnych stężeniach aby otrzymać wyniki reakcji na dawkę. Frakcje kakao rozpuszczono w medium w 2 krotnych stężeniach i 100 p1 każdego roztworu dodano do potrójnych otworów. W kolejnych dniach płytę zabarwiono 50 p1 fioletu krystalicznego (2,5 g krystalicznego fioletu rozpuszczono w 125 ml metanolu, 375 ml wody), przez 15 minut. Zabarwienie usunięto i płytę delikatnie zanużono w zimnej wodzie aby usunąć nadmiar barwnika. Przemywanie powtórzono jeszcze dwa razy, i płytę pozostawiono do wyschnięcia. Pozostałe zabarwienie rozpuszczono przez dodanie 100 pl 0,1 M cytrynianu sodu/50% etanolu do każdego otworu. Po rozpuszczeniu, określano liczbę komórek za pomocą czytnika ELISA przy 540 nm (odpowiedni filtr przy 410 nm). Wyniki odczytu przedstawiono graficznie z absorbancjąna osi Y i dniami wzrostu na osi X.

Sposób B. Test klonowania w miękkim agarze

Komórki klonowano w miękkim agarze zgodnie ze sposobem opisanym przez Nawata i inni (1981). Zawiesinę pojedynczych komórek przygotowano w medium zawierającym 0,8% agaru z różnymi stężeniami frakcji kakao, zawiesiny były podzielone do 35 mm naczyń pokrytych medium zawierającym 1,9% agaru. Po 10 dniach inkubacji, kolonie większe niż 60 pm średnicy były określane w układzie Ominicron 3600 Image Analysis system. Wyniki przedstawiono graficznie w układzie numer kolonii na osi Y i stężenia frakcji kakao na osi X.

Sposób C. Test tetrazolowy XTT mikrokultury

Procedurę testu XTT opisanego przez Scudiero i innych (1988) zastosowano do badań różnych frakcji kakao. Test XTT był zasadniczo taki sam jak opisany z zastosowaniem procedury MTT (przykład 6) z tym wyjątkiem następujących modyfikacji. XTT (wodorotlenek (2,3bis(2-λetoksy-4-6itro-5-sulfofe6ylo)-5-[(ίenyloamino)karbonylo|-2H-etra/.olu)p^I^zΛ'gcιtowano w 1 mg/ml medium bez serum, ogrzanym wstępnie do 37°C. PMS przygotowano w 5 mM PBS. XTT i PMS wymieszano razem; do każdego otworu dodano 10 (j1 PMS na ml XTT i 50 [ii PMSXTT. Po inkubacji w 37°C przez 4 godziny, płytę mieszano przez 30 minut w mechanicznym shakerze i mierzono absorbancje przy 450-600 nm. Wyniki przedstawiono graficznie w układzie absorbancja na osi Y i dni wzrostu lub stężenie na osi X.

Dla sposobów A i C wyniki również przedstawiono graficznie jako procent kontroli na osi Y i dni wzrostu lub stężenie na osi X.

Porównanie testów XTT i fioletu krystalicznego przeprowadzono dla frakcji kakao D&E (przykład 3B) przeciw linii komórkowej raka sutka MCF-7pl68, aby określić, który test był bardziej czuły. Jak przedstawiono na fig. 15A oba testy mają takie same odpowiedzi na dawkę dla stężenia > 75 pg/ml. Dla stężeń poniżej tej wartości wyższe standartowe odchylenia wartości wykazywał test fioletu krystalicznego niż test XTT. Ponieważ test filetowego kryształu jest łatwiejszy do zastosowania, wszystkie poniższe testy, jeżeli nie określono inaczej były przeprowadzone tą procedurą.

Wyniki testu fioletu krystalicznego przedstawiono (fig. 15B-15E) aby zademonstrować efekt surowego ekstraktu polifenolu (przykład 2) na odpowiednio linii komórkowej raka sutka MDA MB231, linii komórkowej raka gruczołu krokowego PC-3, linii komórkowej raka sutka MCF-7 pl63, i linii komórkowej Hela rak szyji. We wszystkich przypadkach dawka 250 pg/ml całkowicie hamowała wzrost komórek wszystkich raków w czasie 5-7 dni. Linia komórkowa Hela okazała się być bardziej czuła na ekstrakt, ponieważ dawka 100 pg/ml również hamowała wzrost. Frakcje kakao z przykładu 3B były również testowane przeciw Hela i innej linii komórkowej raka sutka SKBR-3. Wyniki (fig. 15F i 15G) pokazują, że frakcje D&E mają najwyższą aktywność. Jak pokazano na fig. 15h i 151, otrzymano wartość IC50 dla około 40 pg/ml D&E dla linii komórkowych obu raków.

Frakcje kakao D&E były również badane w teście klonowania w miękkim agarze, który wykazał zdolność badanych związków do hamowania zakotwiczonego niezależnego wzrostu. Jak pokazano na fig. 15J, stężenie 100 pg/ml całkowicie hamuje tworzenie koloni komórek Hela.

187 819

Surowy ekstrakt polifenolu otrzymany z ośmiu różnych genotypów reprezentujących trzy gatunki kakao był również testowany przeciw komórkom linii komórkowej Hela. Jak pokazano na fig. 15K wszystkie gatunki miały zbliżone efekt odpowiedzi na dawkę. Odmiany UIT-1 okazały się najbardziej aktywne przeciw linii komórkowej Hela. Te wyniki demonstrują, że wszystkie genotypy kakao mają frakcje polifenolowe, które są aktywne przeciwko co najmniej jednej linii komórkowej ludzkiego raka niezależnie od geograficznego pochodzenia, odmiany i genotypu.

Inne serie testów przeprowadzono dla surowych ekstraktów fenolowych przygotowanych w jednotonowej skali z typowej 5-dniowej fermentacji ziaren kakao brazylijskiego, suszonych następnie przez 4 dni na słońcu. Wyniki przedstawia fig. 15L pokazująca nieoczywiste efekty tych wczesnych etapów procesu, sugerujących małe szanse kompozycji polifenoli. Wiadomo, (Lehrian i Patterson, 1983), że oksydaza polfenolu (PPO) utlenia polifenole w etapie fermentacji. Aby określić jaki miałby wpływ efekt enzymatycznego utleniania na aktywność przeprowadzono inny eksperyment. Przygotowano surowe PPO przez ekstrakcję drobno zmielonych, niefermentowanych, liofilizowanych, odtłuszczonych brazylijskich ziaren kakao w stosunku 1 gm proszku w 10 ml acetonu. Zawiesinę odwirowano z szybkością 3000 obrotów na minutę przez 15 minut. Powtarzano to trzy razy, za każdym razem wyładowywano supernatant czterema ekstrakcjami przez filtrujący lejek Buchnera. Proszek acetonowy wysuszono na powietrzu, następnie testowano zgodnie z procedurą opisaną przez McLorda i Kilara (1983). Do roztworu surowych polifenoli (100 mg/ml buforu cytrynianowo-fosforanowego, 0,02M, pH 5,5) dodano 100 mg proszku acetonowego (4000 f/mg protein) i mieszano przez 30 minut z bąbelkującą parą wodną przez zawiesinę. Próbkę odwirowano 5000 x g przez 15 minut i surenatant ekstrahowano 3 x za pomocą 20 ml octanu etylu. Połączono ekstrakty octanu etylu, wysuszono przez destylacje pod częściową próżnią, dodano 5 1 wody, następnie liofilizowano. Materiał następnie badano przeciw komórkom Hela i odpowiedź na dawkę porównywano do surowych ekstraktów polifenoli, które nie były enzymatycznie traktowane. Wyniki (fig. 15M) przedstawiają znaczące przesunięcie krzywej odpowidzi na dawkę dla ekstraktów enzymatycznie utlenianych, pokazują, że produkty utleniane bardziej hamowały wzrost komórek niż ich naturalne postacie.

Przykład 9: Przeciwutleniająca aktywność ekstraktów kakao zawierających procyjanidyny

Fakty z literatury sugerują zależność między konsumpcją naturalnie występujących przeciwutleniaczy (witamina C, E i B-karoten) a niższą zachorowalnością na choroby, również na raka (Designing Foods, 1993; Caragay, 1992). Ogólnie uważa się, że te przeciwutleniacze oddziałowywują na pewne utleniacze i wolne rodniki mające związek z wywoływaniem pewnego rodzaju nowotworów. Dodatkowo, pewne związki będące polifenolami roślinnymi przeciwrakowymi mają również zasadniczą przeciwutleniającą aktywność (Ho i inni, 1992; Huang i inni, 1992).

Aby określić czy ekstrakty kakao zawierające procyjanidyny mają własności przeciwutleniające zastosowano standardową metodę Rancimat. Do wytworzenia ekstraktów kakao zastosowano sposób opisany w przykładach 1, 2 i 3, za pomocą żelowo permeacyjnej wytworzono z nich dwie frakcje. Te frakcje, określone jako frakcje połączone A-C i D-E (por. fig. 1) porównano z syntetycznymi przeciwutleniaczami BHA i BHT.

Po usunięciu skórki, z nieprażonych orzeszków ziemnych wytłoczono olej. Każdy testowany związek był kontaktowany z olejem na dwu poziomach - 100 ppm i - 20 ppm, które uwzględniono w tabeli 7. Rozpuszczony w 50 μ! metanolu przeciwutleniacz dodano do każdej próbki i wytworzono dyspersje przeciwutleniacza. Próbkę kontrolną przygotowano z 50 fil metanolu bez przeciwutleniacza.

Badano po dwie próbki w teście stabilności Rancimat w 100°C i 20 cc/min powietrza. Parametry eksperymentu dobrano do parametrów stosowanych w metodzie aktywnego tlenu (Active Oxygen Method AOM) lub w szybkim teście stabilności (Swift Stability Test, Van Oosten i inni, 1981). Typowe ślady testu Rancimat'a przedstawia fig. 16. Wyniki zebrano w tabeli 8 przedstawiającej ilość godzin potrzebnych do osiągnięcia poziomu utlenienia 100 meq.

187 819

Tabela 7: Stężenia przeciwutleniaczy

Próbka	Poziom 1 ppm	Poziom 2 ppm
Butylowany hydroksytoluen (BHT)	24	120
Butylowany hydroksyanizol (BHA)	24	120
Surowa frakcja kakao w octanie etylu	22	110
Frakcja A-C	20	100
Frakcja D-E	20	100

Tabela 8:

Stabilność utleniania oleju z orzeszków ziemnych dla różnych przeciwutleniaczy.

Próbka	20 ppm średnia	100 ppm średnia
Kontrolna	10,5 ±0,7
BHT	16,5 ±2,1	12,5 ±2,1
BHA	13,5 ± 2,1	14,0 ± 1,4
Surowa frakcja kakao	18,0 ±0,0	19,0 ± 1,4
Frakcja A-C	16,0 ±6,4	17,5 ±0,0
Frakcja D-E	14,0 ± 1,4	12,5 ±0,7

Te wyniki przedstawiają wzrost odporności na utlenianie oleju z orzeszków ziemnych dla wszystkich testowanych substancji dodawanych. Największy wzrost odporności na utlenianie stwierdzono dla próbki kontaktowanej z surową frakcją kakao w octanie etylu. Te wyniki pokazują, że ekstrakty kakao zawierające procyjanidyny mają własności utleniające równe lub większe niż takie same ilości syntetycznych BHT i BHA. Wynalazek zatem może być stosowany w miejsce BHT i BHA w znanych zastosowaniach BHT i BHA, jak na przykład przeciwutleniacze i/lub dodatki spożywcze. Na podstawie tych wyników znawca może łatwo określić odpowiednie ilości substancji według wynalazku do zastosowań jako „BHT i BHA” np. ilość dodawaną do środków spożywczych, bez dodatkowych badań.

Przykład 10: Badania zahamowania topoizomerazy II

Według badań topologicznych DNA (Wang, 1985) topoizomeraza I i II DNA są enzymami katalizującymi pękanie i łączenie łańcuchów DNA. W uzupełnieniu badań nad wewnątrzkomórkową funkcją topoizomerazy, jednym z najbardziej znaczących odkryć było stwierdzenie, że topoizomeraza II jest pierwszym komórkowym celem dla wielu klinicznie ważnych przeciwguzowych związków (Yamashita i inni, 1990), które zawierają wstawione środki (m-AMSA, Adriamycynę® i eliptycynę) jak również niewstawione epodopylotoksyny. Wiele linii ewidentnie pokazuje, że niektóre przeciwguzowe leki mają właściwości stabilizowania kompleksu DNA-topoizomerazą II („rozszczepialny kompleks”), które po ekspozycji na środki denaturujące powodują rozszczepianie DNA (Muller i inni, 1989). Sugerowano, że tworzenie rozszczepialnych kompleksów przez przeciwguzowe leki tworzy addukt DNA co może prowadzić do śmierci komórki. Zgodnie z tym atrakcyjnym modelem, specyficzne nowe czynniki wywołujące rozpuszczalne kompleksy DNA-topoizoraeraza II są użyteczne jako środki przeciwrakowe, przeciwguzowe lub przeciwnowotworowe. Aby zidentyfikować cytotoksyczne związki o aktywności celowej DNA, badano procyjanidyny kakao na wzmaganie cytotosycznej aktywności przeciw wielu DNA- niszczenia czułych linii komórkowych i testów enzymatycznych z ludzką topoizomerazą II otrzymaną z limfy.

Sposób A. Dekatenacja kinetoplastu DNA przez topoizomeraze II

Hamowanie in vitro dekatenacji topoizomerazą II kinetoplastu DNA, jak opisał Muller i inni (1989) przeprowadzono jak niżej opisano. Przygotowano nucleame ekstrakty zawierające aktywną topoizomerazę II z ludzkiej limfy przez modyfikacje metody Millera i innych (1981) i Danksa i innych (1988). Jedna jednostka oczyszczonego enzymu wystarczała do

187 819 dekatenacji 0,25 pg kinetoplastu DNA w ciągu 30 mnut w 34°C. Kinetoplast DNA otrzymano z trypanosomu Crithidia fasciculata. Każdą frakcję przeprowadzano w 0,5 ml centryfudze zawierającej 19,5 pl H2O, 2,5 pl i buforu 10X (bufor 1X zawiera 50 mM tris-HCL, pH 8,0, 120 mM KCl, 10 mM MgCh, 0,5 mM ATP, 0,5 mM diroiotoeitzlu i 30 pg BSA/ml), 1 pl i k ikenoplpstu DNA (0,2 pg), i i pl DMSO z awierającego badane ρΓθογ^ηϊά.γηγ yakao w różnych stężeniach. Te kombinację mieszano dokładnie i utrzymywano w lodzie. Jedną jednostkę topoizomeoązt dodano bezpośrednio przed inkubacją w łaźni wodnej w 34°C przez 30 minut.

Po inkubacji, próbę dekatenacji zatrzymano przez dodanie 5 pi stopującego buforu (5% sarkozyl, 0,0025% bromofenolu błękitnego, 25% glicerolu) i umieszczono w lodzie. Elektroforezowano DNA w żelu 1% agarozy w buforze TAE zawierającym bromek etidium (0,5 pg/ml) wizualizowano DNA przez naświetlanie ultrafioletem 310 nm. Żele fotografowano aparatem Polariod Land.

Figura 11 przedstawia wyniki tego eksperymentu. Zupełnie skatenowane kinetoplasty DNA nie migrują w 1% żelu agarozy. Nekąrenącja kinetoplastu DNA przez topoizomerazę II generuje pasma monomejtcznego DNA (monomer kółka, postać I i II), które migrują w żelu. Zahamowanie enzymu przez dodanie proctjąnidtn kakao jest widoczne przez postępujące znikanie pasm monomerów w funkcji zwiększania stężenia. Na podstawie tych wyników, frakcje procyjanidyn kakao A, B, D i E wykazują zahamowanie ropoizomeoazt przy stężeniu w zakresie 0,5 do 5,0 pg/ml. Te stężenia hamujące były bardzo zbliżone do otrzymywanych dla mitoksantronu i m-AMSA [4'-(9-akjydyntloamino)-metanosulfonz-m-anizydyna],

B. Linie komórkowe czułe na leki

Procyjanidyny kakao badano na cttorokttczność przeciw liniom komórkowym czułym na zniszczenie DNA. Jedną z tych linii komórkowych była xrs-6 DNA podwójnej nitki poprawionego mutanta rozwinięta przez p.Jeggo (Kemp i inni, 1984). Poprawione wady linii xrs-A czynią ją specjalnie czułą na promieniowanie X, na związki, które wywołują bezpośrednie rozrywanie podwójnego łańcucha DNA, jak bleomtcyna i na związki, które hamują topoizomerazę II i mogą bezpośrednio wywoływać pękanie podwójnego łańcucha jak sugeruje Warters i inni (1991). Cttotokstczność w kierunku naprawiania linii została porównana z cytotoksycznością przeciw Unii CHO naprawiającej BR1. Zwiększenie cyrorokstcznoścl w kierunku korzystnego naprawiania linii wadliwej (xrs-6) interpretowane jest jako rworzenio rozpuszczalnego kompleksu.

Zdolny do naprawiania linii CHO, BR1, został rozwinięty przez Barrows i innych (1987) i ujawnia O⁶-aikiioguanina-DNA-alkilotransferazę po dodaniu do normalnego enzymu naprawiania CHO DNA. Naprawiający rozerwane wiązanie podwójne CHO wadliwej linii (xrs-6) był darem od dr P. Jeggo i współpracowników (Jeggo i inni, 1989). Obie te linie wzrastały w postaci monowarstwy w alfa-MEM zawierającym serum i antybiotyki jak opisano w przykładzie 6. Komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w nawilżanej atmosferze 5% CO2. Przed traktowanie procyjanidami kakao, wzrastające jako monowarstwa komórki były traktowane trypsyną. Testy przeprowadzono stosując procedurę testową opisaną w przykładzie 6.

Wyniki (fig. 18) nie przedstawiają wzrostu zahamowania ctrztokstczności w kierunku komórek xrs-6 sugerując, że procyjanidyny kakao hamują topoizomerazę II w inny sposób niż tworzenie rozpuszczalnych pękających podwójnych łańcuchów. Oznacza to, że procyjanidyny kakao reagują z topoizomerazą II zanim zacznie ona reagować z DNA wytwarzając nierozpuszczalne kompleksy.

Tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów jest nowym odkryciem. Antracykliny, alkaloidy podofilint, antracenediont, akrydyny i οΙΙψΨ^^ są dopuszczalne do klinicznych zastosowań przeclwrαkowtca, pozeciwguzowyca lub przeclwnoworwzoowych, i tworzą rozpuszczalne kompleksy (Liu,1989). Ostatnio zidentyfikowano kilka nowych klas związków hamujących topoizomerazę II, które nie wykazują tworzenia rozpuszczalnych kompleksów. Są to amonafida (Hsiang i inni, 1989), disramtctna (Fesen i inni, 1989), flawonoidy (Yamashita i inni, 1990), saintopina (Yamashita i inni, 1991), membranon (Drake i inni, 1989), terpenoidy (Kawada i inni, 1991), antrapirazole (Fry i inni, 1985), diokopiperazyny (Tanaba i inni, 1991) i morska akrydyna - dercytyna (burres i inni, 1989).

187 819

Ponieważ procyjanidyny kakao inaktywują topoizomerazę II zanim utworzone zostaną rozpuszczalne kompleksy, mają one chemioterapeutyczną wartość zarówno same jak i w kombinacji z innymi znanymi i mechanicznie opisanymi inhibitorami topoizomerazy II. Procyjanidyny również okazały się być nową klasą inhibitorów topoizomerazy II (Kashiwada i inni, 1993) i mogą być mniej toksyczne dla komórek niż inne znane inhibitory, co zwiększa ich użyteczność w chemioterapii.

Do badań efektów frakcji kakao D & E zastosowano linie komórkowe MCF-7 ludzkiego raka sutka (ADR), który tworzy membranowe połączenia glikoprotein (gpl70) nadając im wielolekową odporność (Leonessa i inni, 1994) i jego rodzicielską linię komórkową MCF-7 p 168. Jak przedstawiono na fig. 19, linia rodzicielska hamowała wzrost poziomu dawki frakcji D & E, podczas gdy Adriamycyną (ADR) uodpamiane linie były mniej efektywne dla wyższych dawek. Te wyniki pokazują, że frakcje kakao D & E oddziaływująna linie komórkowe 0 wielolekowej odporności.

Przykład 11: Syntezy procyjanidyn

Syntezę procyjanidyn prowadzono zgodnie z procedurą rozwiniętą przez Delcour'a i innych (1983), z modyfikacjami. W uzupełnieniu kondensacji (+)-katechiny z dihydroquercetyną w warunkach redukujących, (-)-epikatechina była również używana do odzwierciedlania wysokich stężeń (-)-epikatechiny występujących naturalnie w niefermentowanych ziarnach kakao. Produkty syntezy były izolowane, oczyszczane, analizowane i identyfikowane według procedury opisanej w przykładach 3, 4 i 5. Tym sposobem wytworzono biflawonidy, triflawonidy i tetraflawonidy używane następnie jako standardy w sposób opisany wyżej dla ekstraktów kakao.

Pr z y k ł a d 12: Test normalnej fazy półpreparatywnych frakcji

Jakkolwiek ekstrakt polifenoli jest kompleksem związków, niezbędnym było określenie, które związki są aktywne przeciw liniom komórkowym raka, w celu ich dalszego oczyszczania, w testach reakcji na dawkę i dla ich kompleksowej strukturalnej identyfikacji. Stosowano zwykłą fazę półpreparatywnego rozdzielania (przykład 3B) do rozdzielania procyjanidyn kakao na podstawie ich oligomerycznego rozmiaru. Dodatkowo, poza oryginalnym ekstraktem, przygotowano dwanaście frakcji (fig. 2B i 150) i testowano dawki 100 pg/ml i 25 pg/ml przeciw Hela, aby określić które oligomery mają największą aktywność. Jak przedstawiono na fig. 20, frakcje 4-11 (pentamery-dodekamery) mają wartość IC50 około 25 pg/ml. Te wyniki wskazują, że te oligomery mają największą aktywność przeciw komórkom Hela. Dodatkowa analiza normalnofazowa HPLC frakcji kakao D i E pokazała, że te frakcje są wzbogacone w te oligomery.

W świetle powyższego jest jasnym, że ekstrakt i polifenole kakao, jak również kompozycje, sposoby i zestaw według wynalazku nadają się do zastosowania. Pod tym względem, wykazano, że wynalazek edible source???=strawny? i, że aktywność in vitro może wykazywać co najmniej jakąś aktywność in vivo, zwłaszcza w odniesieniu do dawek omawianych powyżej.

Dodatkowo, powyższy wynalazek pokazuje, że ekstrakt i polifenole kakao, jak również kompozycje, sposoby i zestaw wykazują aktywność przeciwutleniającą jak BHT 1 BHA, jak również odporność na utlenianie. Zatem wynalazek może być stosowany w miejsce znanych zastosowań BHT i BHA, jak przeciwutleniacze , na przykład przeciwutleniacze środków spożywczych. Wynalazek może być również stosowany w miejsce inhibitorów topoizomerazy w obecnie znanych ich zastosowaniach. Istnieje wiele kompozycji i sposobów, w których wynalazek ma zastosowanie; na przykład, kompozycje przeciwutleniające i konserwujące, kompozycje hamujące topoizomerazę, sposoby konserwowania środków spożywczych, lub ich elementy jak ochrona przed utlenianiem, sposoby hamowania topoizomerazy, które obejmują zarówno ekstrakt i/lub polifenol(e) kakao jak lub, które obejmują środki spożywcze, elementy lub izomerazę w odniesieniu do kompozycji lub ekstraktu i/lub polifenolu(i) kakao.

Po dokładnym opisaniu korzystnych postaci niniejszego wynalazku, należy rozumieć, że wynalazek przedstawiony w załączonych zastrzeżeniach nie jest ograniczony do szczególnych przypadków przedstawionych w opisie, możliwych jest wiele wariantów rozwiązań oddających ducha i zakres wynalazku.

187 819

LITERATURA

1. Barrows, L.R., Borchers, A.H., i Paxton, M.B., Transfectant CHO Cells Expressing O⁶ - alkylguanine - DNA-alkyltransferase Display Increased Resistance to DNA Damage Other than C)6-guanine Alkylation, Carcinogenesis, 8:1853 (1987).

2. Boukharta, M., Jalbert, G. i Castonguay, A., Efficacy of Ellagitannins and Ellagic Acid as Cancer Chemopreventive Agents - Presented at the XVI^th International Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992.

3. Burres, N.S., Sazesh, J., Gunawardana, G.P., i element, J.J., Antitumor Activity and Nucicie Acid Binding Properties of Dercitin, a New Acridine Alkaloid Isolated from a Marine Dercitus species Sponge, Cancer Research, 49, 5267-5274 (1989).

4. Caragay, A.B., Cancer Preventive Foods i Ingredients, Food Technology, 46:4, 65-79 (1992).

5. Chu, S.-C., Hsieh, Y.-S. i Lim, J.-Y., Inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity, J. of Natural Products, 55:2, 179-183 (1992).

6. Clapperton, J., Hammerstone, J.F. Jr., Romanczyk, L.J. Jr., Chan, J., Yow, S., Lim, D. i Lockwood , R., Polyphenols and Cocoa Flavor - Presented at the Χνΐ^Λ Internationa! Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992.

7. Danks, M.K., Schmidt, C.A., Cirtain, M.C., Suttle, D.P., i Beck, W.T., Altered Catalytic Activity of and DNA Cleavage by DNA Topoisomerase II from Huaan Leukemic Cells Selected for Resistance to VM-26, Biochem., 27:8861 (1988).

8. Delcour, J.A., Ferreira, D. i Roux, D.G., Synthesis of Condensed Tannins, Part 9, The Condensation Sequence of Leucocyanidin with (+)- Catechin and with the Resultant Procyanidins, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1711-1717 (1983).

9. Deschner, E.E., Ruperto, J., Wong, G. i Newmark, H.L., Quercetin and Rutin as Inhibitors of Azoxymethanol - Induced Colonic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (1991).

10. Designing Foods, Manipulating Foods to Promote Health, Inform, 4:4, 344-369 (1993).

11. Drake, F.H., Hofmann, G.A., Mong., S.-M., Bartus, J.O., Hertzberg, R.P., Johnson, R.K., Mattem, M.R., i Mirabelli, C.K., In vitro and Intercellular Inhibition of Topoisomerase II by the Antitumor Agent Membranone, Cancer Research, 49, 2578-2583 (1989).

12. Engels J.M.M., Genetic Resources of Cacao: A Catalogue of the CATIE Collection, Tech. Bull. 7, Turrialba, Costa Rica (1981).

13. Enriquez G.A. i Soria J.V., Cocoa Cultivars Register IICA, Turrialba, Cost Rica (1967).

14. Ferreira, D., Steynberg, J.P., Roux, D.G i Brandt, E.V., Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803 (1992).

15. Fesen, M. i Pommier, Y., Mammalian Topoisomerase II Activity is Modulated by the DNA Minor Groove Binder - Distainycin in Simian Virus 40 DNA, J. Biol. Chem., 264, 11354-11359(1989).

16. Fry, D.W., Boritzki, T.J., Besserer, J.A., i Jackson, R.C., In vitro Strand Scission and Inhibition of Nucleic Acid Synthesis on L1210 Leukemia Cells by a New Class of DNA Complexes, the anthra [1, 9-CD]pyrazol-6(2H)-ones (anthrapyrazoles), Biochera. Pharmacol., 34, 3499-3508 (1985).

17. Hsiang, Y.-H., Jiang, J.B., i Liu, L.F., Topoisomerase II Mediated DNA Cleavage by Amonafide and Its Structural Analogs, Mol. Pharmacol., 36, 371-376 (1989).

18. Jalal, M.A.F. and Collin, H.A., Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacoa, Phytochemistry, 6, 1377-1380 (1978).

19. Jeggo, P.A., Caldecott, K., Pidsley, S., i Banks, G.R., Sensitivity of Chinese Hamster Ovary Mutants Defective in DNA Double Strand Break Repair to Topoisomerase II Inhibitors, Cancer Res., 49:7057 (1989).

187 819

20. Kashiwada, Y., Nonaka, G.-I., Nishioka-, I., Lee, K.J.-H., Bori, I., Fukushima, Y., Bastow, K.F., i Lee, K.-H., Tannin as Potent Inhibitors of DNA Topoisomerase II in vitro. J. Pharm. Sci., 82:5, 487-492 (1993).

21. Kato, R., Nakadate, T., Yamamoto, S. i Sugimura, T., Inhibition of 12-0tetradecanoylphorbol-13-acetate Induced Tumor Promotion and Ornithine Decarboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983).

22. Kawada, S.-Z., Yamashita, Y., Fujii, N. i Nakano, H., Induction of Heat Stable Topoisomerase II-DNA Cleavable Complex by Nonintercalative Terpenoids, Terpentecin and Clerocidin, Cancer Research, 51, 2922-2929 (1991).

23. Kemp, L.M., Sedgwick, S.G i Jeggo, P.A., X-ray Sensitive Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells Defective in Double Strand Break Rejoining, Mutat. Res., 132:189 (1984).

24. Kikkoman Corporation, Antimutagenic Agent Containing Proanthocyanidin Oligomer Preferably Having Flavang3-olgDiol Structure, JP 04190774-A, July 7, 1992.

25. Lehrian, D.W.; Patterson, G.R. In Biotechnology; Reed, G., Ed.; Verlag Chemie: Weinheim, 1983, Vol.5, Chapter 12.

26. Leonessa, F., Jacobson, M., Boyle, B., Lippman, J., McGarvey, M., i Clarke, R. Effect of Tamoxifen on the Multidrug-Resistant Phenotype in Human Breast Cancer Cells: Isobolograms, Drug Accumulation, and M_r 170,000 Glycoprotein (gp 170) Binding Studies, Cancer Research, 54, 441-447 (1994).

27. Liu, L.F., DNA Toposimerase Poisons as Antitumor Drugs, Ann. Rev. Biochem., 58, 351-375 (1989).

28. McCord, J.D. and Kilara A. Control of Enzymatic Browning in Processed Mushrooms (Agaricus bisporus). J. Food Sci., 48:1479 (1983).

29. Miller, K.G., Liu, L.F. i Englund, P.A., Homogeneous Type II DNA Topoisomerase from Hela Cell Nuclei, J. Biol. Chem., 256:9334 (1981).

30. Mosmann, T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytoxicity Assays, J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983).

31. Muller, M.T., Helal, K., Soisson, S. i Spitzer, J.R., A Rapid and Quantitative Microtiter Assay for Eukaryotic Topoisomerase II, Nuc. Acid Res., 17:9499 (1989).

32. Nawata, H., Chong, M.T., Bronzert, D. i Lippman, M.E. Estradiol-Independent growth of a Subline of MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Culture, J. Biol. Chem., 256:13, 6895-6902 (1981).

33. Okucia, T., Yoshida, T., i Hatano, T., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols - Oligomeric Hydrolyzable Tannins and Others - Presented at the XVI* International Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13^1 (^, 1992.

34. Phenolic Compounds in Foods and Their Effects on Health II. Antioxidants & Cancer Prevention, Huang, M.-T., Ho, C.-T., i Lee, C.Y. editors, ACS Symposium Series 507, American Chemical Society, Washington, D.C. (1992).

35. Phenolic Compounds in Foods and Their Effects on Health I, Analysis, Occurrence & Chemistry, Ho, C.- T., Lee, C.Y., i Huang, M.-T editors, ACS Symposium Series 506, American Chemical Society, Washington, D.C. (1992).

36. Porter, L.J., Ma, Z. i Chan, B.G., Cocoa Procyanidins: Major Flavanoids and Identification of Some Minor Metabolites, Phytochemistry, 30, 1657- 1663 (1991).

37. Revilla, E., Bourzeix, M. i Alonso, E., Analysis of Catechins and Procyanidins in Grape Seeds by HPLC with Photodiode Array Detection, Chromatographia, 31,465-468 (1991).

38. Scudiero, D.A., Shoemaker, R.H., Pauli, K.D., Monks, A., Tierney, S., Nofziger, T.H., Currens, M.J., Seniff, D., i Boyd, M.R. Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines, Canur Research, 48, 4827-4833 (1988).

39. Self, R., Eagles, J., Galletti, G.C., Mueller-Harvey, I., Hartley, R.D., Lee, A.GH., Magnolato, D., Richli, U., Gujur, R. i Haslam, E., Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry of Polyphenols (syn. Vegetable Tannins), Biomed Environ. Mass Spec. 13, 449-468 (1986).

187 819

40. Tanabe, K., Ikegami, Y., Ishda, R. i Andoh, T., Inhibition of Topoisomerase II by Antitumor Agents bis(2,6-dioxopiperazine) Derivatives, Cancer Research, 51,4903-4908 (1991).

41. Van Oosten, C.W., Poot, C. i A.C. Hensen, The Precision of the Swift Stability Test, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 83:4, 133-135 (1981).

42. Wang, J.C., DNA Topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 54, 665-697 (1985).

43. Warters, R.L., Lyons, B.W., Li, T.M. i Chen, D.J., Topoisomerase II Activity in a DNA Double-Strand Break Repair Deficient Chinese Hamster Ovary Cell Line, Mutat. Res., 254:167 (1991).

44. Yamashita, Y., Kawada, S.-Z. i Nakano, H., Induction of Mammalian Topoismerase II Dependent DNA Cleavage by Nonintercalative Flavanoids, Genistein and Orbol., Biochem Pharm, 39:4, 737-744 (1990).

45. Yamashita, Y., Kawada, S.-Z., Fujii, N. i Nakano, H., Induction of Mammalian DNA Topoisomerase I and II Mediated DNA Cleavage by Saintopin, a New Antitumor Agent from Fungus, Biochem., 30, 5838-5845 (1991).

187 819

Figurę 2 A: Ehition Profile of Coco· Procyanldins Extracted from UIT-1

Column: 5/i Hypersil ODS (200 x 2.1 mm);

Llnear Gradient of 60% B into A at a Flow Rale of 0.3 ml/min.

B»0.5% Acetic Acid in Metanol; A «=>0.5% Acebc Acid in Deionized Waler, λ,, =280 nm; λ„.=3Ι6 nm

187 819

Figure 2B. Analytical Normal Phase HPLC Separation of Cocoa Procyanidins Rozdzielanie normalnofazowe HPLC procyjanidyn

HPLC Condidons:

250 x 3.2ram Lichrosphere 5 Silica column (5μ) 20 x 4.6mm Supelguard LC-Si (5g) guard column Detecton Photodiode Anay & 280nm

Gradient: Time (min.)	CH,C1.	Mcthanol
0	82	14
30	67.6	28.4
60	46	50
65	10	86
70	10	86

Flow ratę: 0.5 raL/min Column Temperaturę: 37*C

187 819

Figurę 3: Representative Structures of Cocoa Procyanidins Struktury procyjanidyn kakao

187 819

HPLC Condilions: Hewlett Packard 1090 tenory HPLC System erjoipped with HP Model KHfiA Projramable Fluorcrence Ddecłor.

Cofania: Sp Hypenil ODS (200 * 2.1 mm)

Linear yradient of 60% B into A al a (Iow nte of 0.3 ml/ntin. B«O.5%acelicacidinmelhanol;A-0.5%aeetie acid In deioniied water. X_H~280nm; λ_*»316nm

Figure 4A Representative HPLC Traces of Procyanidin Fractions

HPLC frakcji procyjanidyn

...i '0

ί.Ο·

SO ίοi?

aJA

Scphadea L1120 Frartkm A

MM2A

JO 10

ΓI ma (min.* to

187 819 nru. connutow. Hewien neon iwu tenaiy HPLC SySetn apipped with HP Modd 1W6A PrognmaMe _ Floortsctnce Dcłector. ,.

Column: 5, HypenO ODS (200 x 2.1 mm)

Unear gradient of 60% B into A at a (Iow nie of 0.3 ml/min. B=0. J% acetic acid inmelhaftol;A«03%acetk 1.3 acid in deionized water. X„280nm; X_e«>316(ira

Figuro 4S Representative HPLC Traces of Procyanidin Fractions _ns

HPLC frakcji procyjanidyn

)O to

Time (min.>

I

187 819

HPLC Conditioos: Hewtefl Packird 1090 tenory HPLC System equipped with HP Model 1046A Programable Fluorescence Detector.

Column: 5μ Hypenil ODS (200 a 2.1 mm)

Linear gradient of 60* B into Λ at a flow ratę ot 0.3 ml/min. B«*0.5* tcelic idd In methanoi; A~0.5* acetic acid ht deionizcd water. h.,“280nm; “3I6nm

Figurę 4C Representative HPLC Traces of Procyanidin Fractions

HPLC frakcji procyjanidyn

Γ1woreaeenc·

187 819

HPLC Coodiliora: Hewlett Pacbrd 1090 tenuiy HPLC System eęttippod with HP Model ΚΜ6Λ Pragnmable Fluorcscence Ddector.

Cotumn: Sp Hypersil ODS (200 * 2.1 mm)

Linear gradient of ¢0% B bito A al a (Iow nie of 0.3 ml/mia. B0JX acctic acid In melhanoł; A“0J% acelie arid in deioniztd water. k_a*280nm; N. ii ćma

Figure 4D Representative HPLC Traces of Procyanidin Fractions

HPLC frakcji procyjanidyn

187 819

HPLC Conditions: Hewlett Paciani 1090 tematy HPLC System «{uipped with HP Model 1046Λ Profianoble Fluorescence Dctedor.

Coluntn: 5p Hypenil ODS (200 x 2.1 mm)

Linear gradient of ¢0% B into Λ at a (Iow nie of 0.3 ml/min. B =0.5% acetic acid fal raethanol; Λ-O.Sft acetic acid in deionizcd water. λ«*·280ππη »3I6nm

Figure 4E Representative HPLC Traces of Procyanidin Fractions

HPLC frakcji procyjanidyn

187 819

Figurę 5: Dose - Response Relationship Between Amount MM2 and ACHN Survival

Reakcja na dawkę dla MM2 i ACHN

Froclionol Survival

/xg/mLMM2

187 819

Figure 6A Dose-Response Relationships Between Combinations of Procyanidin Fractions and PC-3 Cancer Celi Linę

Reakcja na dawkę procyjanidyny PC-3

Dose M&MA+E UI2P1

187 819

Figurę 6B Dose-Response Reiationships Between Combinations of Procyanidin Fractions and PC-3 Cancer Cell Linę

Reakcja na dawkę procyjanidyny PC-3

Dose MAMB+E YI92PI

187 819

Figure 6C Dose-Response Relationships Between Combinations of Procyanidin Fractions and PC-3 Cancer Celi Linę

Reakcja na dawkę procyjanidyny PC-3

Γ··'5- WAM''. UIJPI

187 819

Figure 6D Dose-Response Relationships Between Combinations of Procyanidin Fractions and PC-3 Canccr Cell Linę

Reakcja na dawkę procyjanidyny PC-3

Dose MAMD + E UI2P2

187 819

Figurę 7A Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the PC-3 Prostatę Celi Line Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3

Froctionol Survivol

J00 1000

187 819

Figure 7B Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3 froctionot Survivol

Oou UU-1 S O162P1

187 819

Fi/ure 7C Dose-Response Reiationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3

Froclionol Survivol

Dos· UW-1 C OI22P3

187 819

Figure 7D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Celi Linę

IndividuaJ Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3

Dos· Mtf-t 0 0122PJ

187 819

Figure 7E

Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the PC-3 Prostatę Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3

1.2 ł-_T

Fractionol Survivol

1.0

o.a

o.s

o.4 μ

0.2

o.o

‘0.2

0.001 0.01 0.1

100* 1000

Dose MM-1 E O292P8

187 819

Figure 7F Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3

Dom UU-1 A/B 0292P6

187 819

Figure 7G Duse-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3 froclionol Sury i

Ooae MM—ł A/ί 0292P6

187 819

Figure 7H Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

PC-3 Prostatę Cell Line

Representative Procyanidin Fraction Combinations Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny PC-3 froctionol Survival

100 1000

187 819

Fi/ure 8A Dose-Response Reiationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

IDUOipDjj

Dose WM-1AO92K3

Figure 8B Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

187 819

187 819

Figure 8C Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasopharyngeal/HeLa Celi Linę

Indhddual Procyanidin Fractions

Froctionoi Survivo|

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

100 1000

187 819

Figure 8D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

Dose mm-I 0 0212*5

187 819

Figure 8E Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

Fractional Survival

187 819

Figure 8F Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny KB

187 819

Figurę 8G Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Line

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

100 1000

187 819

Figurę 8H Dose-Response Reiationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

KB Nasophaiyngeal/HeLa Celi Linę

Representauve Protyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny KB

Froclionol Survivo)

187 819

Figure 9A Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the HCT-116 Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

Froctionol Survtvol

100 1000

187 819

Figure 9B Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

187 819

Figure 9C Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

187 819

Figurę 9D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Cell Line

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

Dosc D 0192H5

187 819

Figure 9E Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Fcocllonol

Oose E O192K5

187 819

Figure 9F Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Celi Une

Representaiive Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

Dose UM-l B&t> 02S2K2

187 819

Figure 9G Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the HCT-116 Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

100 1000

187 819

Figure 9H Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

HCT-116 Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja HCT-116

Froclionoł Survivol

Dose MM—1 C2C2H1

187 819

Figurę 10A Dose-Response Reiationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

Do»e MM-ϊ A O92A5

187 819

Figure 10B Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

187 819

Figure 10C Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

FrocUonol Surviv₀|

Dose MW-l C 0192A7

187 819

Figure 10D Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Cell Line

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

Dose MU-i 0 0192A7

187 819

Froełional Survivo|

Figure 10E Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Celi Linę Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

187 819

Figure 10F Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

Dose MU-ł B&D 0332*5

187 819

Figure 10G Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN

Dose MM-1 C«ŁD 0302A5

187 819

Figurę 10H Dose-Response Reiationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the ACHN Renal Cell Linę

Represenutive Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny ACHN rrocliorwł Survivt)|

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

Dose MM—1 A&C 0262A6

Figure 11A Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

A-549 Lung Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549

187 819

Dom MM—1 A 019258

187 819

Figure 11B Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the A-549 Lung Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549

Dose Utf-1 B 02256

187 819

Figure 11C Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

A-549 Lung Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549

187 819

Figure 11D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

A-549 Lung Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549

Dose MM-1 0 019258

187 819

Figure 11E Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the A-549 Lung Cell Line

Individual Procyanidin Fractions Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549

Dosc MM— 1 E 019258

187 819

Figure 11F Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

A-549 Lung Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę-frakcja procyjanidyny A-549

187 819

Figure 11G Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the A-549 Lung Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny A-549

100 iooo

187 819

Figure 11H Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the A-549 Lung Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny A-549 hoctionof Suryiyol

100 >000

187 819

Fi/ure 12A Dose-Response Reiationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny SK-5 f roctioooj

Dose UW-1 A 0212S4

Figure 12B Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny SK-5

187 819

Dose MW-1 B 0212S4

187 819

Figure 12C Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Line

Individual Procyanidin Fractions

Oos· MU»? C 021254

187 819

Figure 12D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny SK-5

187 819

Figure 12E Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Linę

Indivjdual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny SK-5

FrocUonol

187 819

Figure 12F Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny SK-5

187 819

Figure 12G Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

SK-5 Melanoma Cell Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny SK-5

Dos· MU-1 C&D K32S3

187 819

Figure 12H Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the SK-5 Melanoma Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny SK-5

FrocUonol Sorwol

Dos· UU—1 N32S3

187 819

Figure 13A Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

MCF-7 Breast Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

187 819

Figure 13B Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

MCF-7 Breast Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

Dose MW-1 B K22M<

187 819

Figure 13C Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

MCF-7-Breast Celi Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

Dose UW-1 C W22W4

187 819

Figure 13D Dose-Response Relationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

MCF-7 Breast Cell Line

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

Desę UU-1 D N22U3

187 819

Fi/ure 13E Dose-Response Reiationships Between

Cocoa Procyanidin Fractions and the

MCF-7 Breast Cell Linę

Individual Procyanidin Fractions

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny MCF-7

Dose «M-ι Γ0302Μ2

187 819

Figure 13F Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the MCF-7 Breast Cell Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

Dose MM-1 B/C 0302M4

187 819

Figure 13G Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the MCF-7 Breast Celi Linę

Representative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę — frakcja procyjanidyny MCF-7

187 819

Figure 13H Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fractions and the MCF-7 Breast Celi Linę

R«presentative Procyanidin Fraction Combinations

Reakcja na dawkę - frakcja procyjanidyny MCF-7

Fractionol Survivol

Oose D«k£ N22M3

187 819

FIGURE 14

Dose-Response Relationships Between Cocoa Procyanidin Fraction D and the CCRF-CEM T-Cell Leukemia Celi Linę

Reakcja na dawkę frakcji D i CCRF-CEM

Cdls/tsL

190.9500 1809000 1708500 1608000 1507500 1407000 1306500 1206000 1105500 1005000 904500 804000 703500 603000 502500 402000 301500 201000 —T 0 1 2 3 4 5 Deyi of Grcrerth

O Contro!

• 12S Jtactfoa D ▼ 250 pg Racdoo D 9 £0Q pg FnaiaaD

187 819

Figure 15 A: Comparison of ΧΊΤ and Crystal Violet Cytotoxicity Assays on MCF - 7 pl68 ceUs Treated with Fraction D + E

Porównanie ΧΤΤ i kryształu fioletu

CONCENTRATION (ug/ml)

187 819

Figure 1S B: Dose Response for UIT-1 Crude Polyphenol Ertract on MDA MB 231 Cells

Reakcja na dawkę UIT-1 na MDA MB 231

• NOTĘ: ABSORBANCE OF 2.0 IND1CATES THE HAMMUU ABSORBANCE 0F THE PLATĘ REAOER. ΓΓ IS NOT REPRESENTITVE OF CELL NUUBER.

187 819

Figurę 15 C: Dose Response for UIT-1 Crude Polyphenol Extract on PC-3 Cells

Reakcja na dawkę UIT-1 na PC-3

DAYS

187 819

Figure 15 D: Dose Response for UIT-1 Crude Polyphenol Extract on MCF-7 pl68 CeUs

Reakcja na dawkę UIT-1 na MCF-7 pl68

ABSORBANCE (540nm)

OAYS » NOTĘ: ABSORBANCE OF 2.0 INOICATES THE ΜΑΧΙΜΟΜ ABSORBANCE OF THE PLATĘ REAOER. IT IS NOT REPRESENTATIVE OF CELU NUMBER.

Figure 15 £: Dose Response for UIT-1 Crude Polyphenol Extract on Hela Cells

187 819

Reakcja na dawkę UIT-1 na komórki Hela

• ΝΟΤΕ: ABSORBANCE OF 2.0 INDICATES THE UAHUUM ABSORBANCE OF THE PLATĘ READER. TT IS NOT REPRESENTTTVE OF CELL NUUBER.

187 819

Cytoksyczność komórek Hela

Figure 15 F: Cytotrnddty of Cocoa Fractions at lOfyL/mL on Hela Cells

DAYS • ΝΟΤΕ: ABSORBANCE OF 2.0 INDICATES THE MAMUUW ABSORBANCE OF THE PLATĘ READER. ΓΓ IS NOT REPRESENTATIYE OF CELL NUMBER.

187 819

Figurę 15 G: Cytoidclty Of Cocoa Fractions at lOO^L/mL on SKBR > 3 Cells Cytotoksyczność SKBR-3

DAYS

187 819

Figure 15 H: Dose Responśe for Cocoa Fraction D + E on Hela Cells

Reakcja na dawkę frakcji D + E na komórki Hela

ABSORBANCE (540nm

DAYS • ΝΟΤΕ: ABSORBANCE OF 2.0 INDICATES THE MAXIMUM ABSORBANCE OF THE PLATĘ READER. IT IS NOT REPRESENTATIVE OF CEU. NUMBER.

187 819

Figure 15 I: Dose Response for Cocoa Fraction D + E on SKBR - 3 CeUs Reakcja na dawkę frakcji D + E na SKBR-3

DAYS

187 819

Figure 15 J: Dose Response for Cocoa Fraction D 4* E on Hela Cells by Soft Agar Cloning Assay

Reakcja na dawkę frakcji D + E na komórki Hela

187 819

Figure 1ί X: Growth Inblbitloa ef Hela Celb by Crude Cocoa Eiitracts Preparcd from Differeot Cocoa Cenotypes

Zahamowanie wzrostu komórek Hela - ekstrakt kakao o

κ ►“ z

o α

K

120

100

* —i « 1 i i-1-ΙΟ 25 50 75 100 125 150 175 200 CONCENTRATION (ug/ml)

tf	GENOTYPE	HOHTl. RACE
C-1	Uf-12	CWOLLO
C 2	NA-33	FORASTERO
C3	EEG-48	FORASTERO
C-4	UNKNOWN	FORASTERO
C6	Uf 6U	TftłMTAftO
ce	tcs too	1MMTAM0
c Ϊ	CS 139	TNM1AAO

pEscwmow

CRUOE EKTRACTS OF UF-U (BRĄZUJ COCOA FOtYPHENOLS PCCAFFEMATBMlCTHREOBROMMATEDt CRUDC EKTRACTS OF NA-33 CBRAZ&J COCOA FOtYTHENOtS (OECAFFBKATEDOETHREOBROMtfiATWI CRUOE EKTRACTS OF EEG-48 (BRĄZUJ COCOA POLYPHENOLS (DeCAffflNATEWOETHREOBROfcONATEDJ CfUX)C EATftACTS OF UNKNOWN (W. AFMCAN) COCOA POtYPWENOLS (OCCAFFQNATEDJOCTHR£OBROMtNATW| CRUOE EKTRAC1S OF UF<13 IBAA2HJ COCOA POLYPHCNOIS (OCCAff EMATED/OCTHREOBftOMMATED)

CRUOE CJCTRACTS OF CS100 (BRĄZUJ COCOA POtYPHCNOtS (DECAFFEMATEDOETHREOBROMNATED)

CRUOE EKTRACTS OF tSC-139 (BRĄZU) COCOA KKYFHEWOtS (OCCAFFEMATEDACnWCOOROMMATEDł

187 819

Zahamowanie wzrostu komórek Hela

7. CONTROL

Figure 15 L: Growth Inhibition of &ela Cells by Cocoa Polyphenol Extracts Taken at Dlffercnt Time Stages Throughout a Fermentatlon and Sun Drying Stage

CONCENTRATION (ug/ml)

187 819

Figure 15 M: Dose Response for Polyphenol Oxidase Treated Crude Cocoa Polyphenol Estrad

Reakcja na dawkę oksydazy polifenoli % CONTROL

120

100

L

200

1_I_I-L

100 150

CONCENTRATION (ug/ml)

187 819

Figure 15 N: Rewie Pha« ScmLPrcparatlre HPLC Separatlon of Frndloo D + E

Pólpreparatywna odwrotna faza HPLC frakcji D + E

HPLC Conditioni: CO 110 aua lOu Ptienonraez Ulmeub 003 (20) juin) colomn; 250 x 2X5 ma lOa PCenoacMa Ułtncwb ODS (20) pnpanioy eoluma

Ondieat (Time, »A): ¢).15), (CO, JO), (90.0). (110,0) whcrt A-H/3, ud B-MEOH

Ddector. HPIOSO Idathmtfcagb doretar β 254am Recarier Bpp A Zeaaa BD41 OoOeckir: Honaada Fmc 100 Flow mc 5 el/mb

187 819

Figure 15 O: Normal Fhase Scmi-Preparative HPLC Separation of a Crude Cocoa Polyphenol Estrad

Pólprcparatywna normalna faza HPLC

HPLC Conditioaa: 250 x lOeua Sopaiooaa LC-SI (5pa) Satnipraperuiva Column 20 x 4.6aua Supatcoeil LC-Si (3m») Ouard

Gadłaat: TIwm fnrint rWJ-L Mdńanoł Ar—tg AeMAŁO Π; n

0	82	14
30	67.6	28.4
60	46	50
65	10	66
70	10	66

Detector: Watara LC SpectropbatooMcr Model 480 β 254om Flow ntK 3«nL/min, anbtcm tam parana*

25QpL of 70« aqueous aoeooe ottract litfectad

187 819

Figure 16. Rancimat Oxidation Curves for Cocoa Procyanidins and Synthetic Antioxidants

Krzywe utleniania Rancimat procyjanidyn kakao i syntetycznych antyutleniaczy ppm Sample Set

BHA BHT

D-E -θ- A-C

Crude

Control

187 819

Figure 17. Inhibition of Topoisomerase II Catalyzed Decatenation of Kinetoplast DNA by Cocoa Procyanidin Fractions

Zahamowanie Topoizomerazy II

Lanes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 .12 13

15 16 17 18 19 20

Lane 1 contains 0.5gg of marker (M) monomer-length kinetoplast DNA circles

Lanes 2 and 20 contain kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase II in the presence of 4% DMSO, but in the absence of any cocoa procyanidins. (Contro! -o Lanes 3 and 4 contain kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase 11 in che presence of 03 and 5.0 gg/mL cocoa procyanidin fraction A.

Lanes 5 and 6 contain kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase II in the presence of 0.5 and 5.0 gg/mL cocoa procyanidin fraction B.

Lanes 7,8,9,13,14,and 15 are replicates of kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase Π in the presence of 0.05,0.5 and 5.0 gg/mL cocoa procyanidin fraction D. Lanes 10,11,12,16,17, and 18 are replicates of kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase II in the presence of 0.05,0.5 and 5.0 gg/mL cocoa procyanidin fraction E. Lane 19 is a replicate of kinetoplast DNA that was incubated with Topoisomerase II in the presence of 5.0 gg/mL cocoa procyanidin fraction E.

187 819

Figure 18. Dose Response Reiationships Between Cocoa Procyanidin Fraction D and DNA Repair Competent and Deficient Cell Lines Reakcja na dawkę frakcja D i DNA

Itvi DNA Deficienl Repair C«U Un· BRI Competent DNA Rejaif Cdi Lim

Froctionol

ug/ml MM-t D D282X1 ug/ml MM-t D D28201

187 819

Figure 19: Dose Response Curve for Adriamycin Resistant MCF-7 CeUs in Comparison to MCF-7 pl68 Farental Celi Linę with Cocoa Fraction D + E

Reakcja na dawkę Adriamycyna MCF-7

7. CONTROL

-I-1_I_I_I_I_ΙΟ 25 50 75 100 125 150

CONCENTRATION (ug/ml)

187 819

Figure 20: Dose Respoase EiTect on Hela by Normal Phase Fractions

Reakcja na dawkę - Hela % CONTROL

z o

o

187 819

Figure 1: Cel PenmfatioB Chnusirognro of Crude Procyuidini on LH-20

Chromatogram ielowo permeocyjny na Sephadex LH-20

OuomitognpUc Conditfnor Column; 21 x Ł5 cm Sepfaadez LH-20, Mobile Phase: Methuol/Wuee Step Gndieot. 13:85, 23:75, 33:63, 70:30, 100:0 Stepped ai 1/2 Hour Ioterńb, Flow Sile; 1J ml/nria, Detector, UV O X_t«>234 na ud Xj-3S5 sra, Chan Speed: OJ mzo/mia, Coluan Load; 120 ag.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (25)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Ekstrakt kakao, znamienny tym, że jest wytworzony sposobem zawierającym etapy:

   a) suszenie ziaren kakao przez wymrażanie i sporządzenie miazgi z niefermentowanych lub częściowo fermentowanych ziaren kakao;

   b) odmiażdżanie liofilizowanej masy

   c) usuwanie łusek z ziaren kakao suszonych przez zamrażanie;

   d) mielenie odłuszczonych ziaren kakao na proszek kakao;

   e) odtłuszczanie proszku kakao;

   f) ekstrahowanie proszku kakao za pomocą rozpuszczalnika wodno-organicznego;

   g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i

   h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierającego co najmniej jeden oligomer 4-12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego.
2. 2. Ekstrakt kakao według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden dimer, trimer, tetramer, heksamer, heptamer, oktamer, nonamer, dekamer, undekamer, dodekamer procyjanidyn kakao.
3. 3. Ekstrakt kakao według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi ekstrakt z wyłączeniem alkaloidów ksantynowych przez usunięcie z ekstraktu alkaloidów ksantynowych z uzyskaniem frakcji wolnej od alkaloidów ksantynowych.
4. 4. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jest w postaci liofilizowanej.
5. 5. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jest w postaci ciekłej.
6. 6. Ekstrakt według zastrz. 3, znamienny tym, że alkaloidy ksantynowe stanowią kofeina i teobromina.
7. 7. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 6, znamienny tym, że rozpuszczalnik wodno-organiczny stanowi wodny roztwór acetonu.
8. 8. Ekstrakt według zastrz. 7, znamienny tym, że wodny roztwór acetonu stanowi 70% wodny roztwór acetonu.
9. 9. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 6, znamienny tym, że rozpuszczalnik wodno-organiczny stanowi wodny roztwór acetonu z następującym dalej działaniem wodnym roztworem metanolu.
10. 10. Ekstrakt według zastrz. 9, znamienny tym, że wodny roztwór acetonu stanowi 70% wodny roztwór acetonu i wodny roztwór metanolu stanowi 70% wodny roztwór metanolu.
11. 11. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo3, albo 6, znamienny tym, że ekstrakt jest oczyszczany za pomocąpermeacyjnej chromatografii żelowej.
12. 12. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 6, znamienny tym, że ekstrakt oczyszczany jest za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
13. 13. Ekstrakt według zastrz. 12, znamienny tym, że wysokosprawną chromatografię cieczową stanowi wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz.
14. 14. Ekstrakt według zastrz. 12, znamienny tym, że wysokosprawną chromatografię cieczową stanowi wysokosprawna chroma tografia cieczowa w normalnym układzie faz.
15. 15. Ekstrakt według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 6, znamienny tym, że sposób obejmuje dodatkowo etap liofilizacji ekstraktu wodnego w celu otrzymania sproszkowanego ekstraktu kakao.
16. 16. Ekstrakt według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera przynajmniej pentamery procyjanidyn.
17. 17. Ekstrakt według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera pentamery do dekametrów procyjanidyn.

    187 819
18. 18. Ekstrakt według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera pentamery do dodekamerów procyjanidyn.
19. 19. Sposób wytwarzania ekstraktu kakao określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje:

    a) suszenie ziaren kakao przez wymrażanie i sporządzenie miazgi z niefermentowanych lub częściowo fermentowanych ziaren kakao;

    b) odmiażdżanie liofilizowanej masy

    c) usuwanie łusek z ziaren kakao suszonych przez zamrażanie;

    d) mielenie odłuszczonych ziaren kakao na proszek kakao;

    e) odtłuszczanie proszku kakao;

    f) ekstrahowanie proszku kakao za pomocą rozpuszczalnika wodno-organicznego;

    g) oddestylowywanie rozpuszczalnika i

    h) odzyskiwanie ekstraktu kakao zawierającego co najmniej jeden oligomer 4 do 12 procyjanidyn kakao w postaci roztworu wodnego.
20. 20. Kompozycja w postaci stałej do podawania doustnego, znamienna tym, że zawiera ekstrakt kakao określony w zastrz. 1.
21. 21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że ma postać tabletki, kapsułki, pigułki.
22. 22. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że stanowi stałą kompozycję do żucia.
23. 23. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że stanowi kakao- lub czekoladowo-aromatyzowaną stałą kompozycję.
24. 24. Kompozycja w postaci ciekłej do podawania doustnego, znamienna tym, że zawiera ekstrakt kakao określony w zastrz. 1.
25. 25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że stanowi zawiesinę, syrop lub eliksir.

    Wynalazek dotyczy nowych ekstraktów kakao polifenolowych, korzystnie polifenolowe wzbogacone procyjanidyną. Ponadto wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania takich ekstraktów, jak również nowych kompozycji ciekłych lub stałych do podawania doustnego, które zawierają nowe ekstrakty kakao, czyli zastosowania nowych ekstraktów w kompozycjach ciekłych lub stałych do podawania doustnego.

    Wymienione w niniejszym ujawnieniu dokumenty wraz z pełnymi odnośnikami literaturowymi dla każdej z publikacji zamieszczono na końcu opisu, w części poprzedzającej zastrzeżenia. Te dokumenty należą do zakresu wynalazku, i każdy dokument tam wymieniony jest włączony w opis jako odnośnik.

    Polifenole są niewiarygodnie urozmaiconą grupą związków (Ferreira i inni, 1992), które szeroko występują w różnych roślinach, niektóre z nich wchodzą w łańcuch pokarmowy.

    W niektórych przypadkach reprezentują one ważną klasę związków dla ludzkiej diety. Jakkolwiek niektóre z polifenoli uważane są za niestrawne, zainteresowanie tymi związkami wzrasta z powodu ich korzystnego oddziaływania na zdrowie. Na przykład w eksperymentalnych badaniach na zwierzętach okazało się, że ąuercetyna (flawonoid) ma właściwości przeciwrakowe (Deshner i inni, 1991 i Kato i inni, 1983). (+)-katechina i (-)-epikatechina (flawan-3-ole) mają właściwości hamowania wirusa białaczki odwracając aktywność transkryptazy (Chu i inni, 1992). Nobotanina (oligomeryczna zdolna do hydrolizy tannina) również posiada przeciwnowotworową aktywność (Okuda i inni, 1992). Statystyczne raporty ujawniły, że umieralność na raka żołądka jest znacząco niższa w produkujących herbatę rejonach Japonii. Galusan epigalokatechiny występujący w zielonej herbacie opisany został jako farmakologicznie aktywny materiał hamujący nowotwory skóry myszy (Okuda i inni, 1992). Kwas elagowy, również ujawnił aktywność przeciwrakową w wielu modelowych nowotworach zwierząt (Bukfarta i inni, 1992). Ostatnio, oligomery proantocyjanidyny zostały opatentowane przez Kikkoman Corporation do zastosowań jako antymutageny. Ostatnio, na 202-gim Narodowym

    187 819

    Spotkaniu Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (National Meeting of The American Chemical Society) przedstawiono związki fenolowe w dziedzinie środków spożywczych i w obszarze ich działań na nowotwory wywoływane na eksperymentalnych modelowych zwierzętach (Ho i inni, 1992; Huang i inni, 1992).

    Jednakże, żaden z tych raportów nie ujawnia ani nie sugeruje ekstraktów kakao, żadnych metod wytwarzania takich ekstraktów, ani żadnych ich zastosowań jako środków przeciwnowotworowych.

    Ponieważ niefermentowane ziarna kakao zawierają znaczny poziom polifenoli, autorzy wynalazku rozważali podobną aktywność i zastosowanie dla ekstraktów kakao, np. związki z wnętrza kakao mogą być ujawnione przez ekstrakcję takich związków z kakao i badania masowe aktywności takich ekstraktów. Narodowy Instytut Raka przeprowadził masowe badania różnych gatunków Theobroma i Herrania na ich aktywność przeciwrakową jako część swoich badań w programie doboru naturalnych produktów. Niski poziom aktywności opisano dla niektórych ekstraktów z tkanek kakao, i prac nie kontynuowano. W dziedzinie przeciwnowotworowych lub przeciwrakowych środków, kakao ani jego ekstrakty nie były uważane za użyteczne; np. wiadomości z dziedzin przeciwnowotworowej lub przeciwrakowej odwodziły fachowców od zastosowania kakao i jego ekstraktów w terapii raka. Rozwinięto wiele analitycznych procedur badających rozkład polifenoli w dziedzinie aromatyzowania (Clapperton i inni, 1992), twórcy niniejszego wynalazku postanowili zastosować analogiczne metody do przygotowywania próbek do badań masowych przeciwrakowych, w przeciwieństwie do wiedzy w dziedzinie przeciwnowotworowej lub przeciwrakowej. Nieoczekiwanie w przeciwieństwie do znanej wiedzy np. badania przeprowadzone przez Narodowy Instytut Raka, twórcy niniejszego wynalazku odkryli, że ekstrakty polifenolowe kakao, które zawierają procyjanidyny, mają użyteczne zastosowania jako środki przeciwrakowe lub przeciwnowotworowe. Dodatkowo, wynalazcy ujawnili, że ekstrakty kakao zawierające procyjanidyny mają użyteczne zastosowanie jako przeciwutleniacze.

    Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego ekstraktu kakao i sposobu wytwarzania tego ekstraktu kakao.

    Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji do podawnia doustnego w formie ciekłej lub stałej.

    Nieoczekiwanie okazało się, że ekstrakt kakao ma przeciwguzową, przeciwrakową lub przeciwnowotworową aktywność; ma aktywność przeciwutleniającą, hamuje aktywność enzymu topoizomerazy Ii DNA.