SK43497A3 - Antineoplastic cocoa extracts, methods for making, using - Google Patents

Description

Antinnoplastické výťažky kakaa. spôsob ich výroby a použitia

Oblasť techniky

Vynález sa týka výťažkov kakaa, napríklad polyfenolov. výhodne polyfenolov obohatených prokyariidírimi. Vynález a takisto týka spôsobu prípravy týchto extraktov a ich použitia, napríklad ako antineoplastických činidiel a antioxidantov.

Dotera iší stav techniky

Polyfenoly predstavujú veľmi pestrú skupinu zlúčenín CFerreira. D. Steriberg, J. P.. Roux, D.D: a Braridt. E. V.. Díversity of Structrure and Function in Olygomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803. ¢1992)). ktoré sa v širokom z ktorých niektoré niektorých prípadoch ľudskú diétnu stravu.

rozsahu objavujú v rôznych rastlinách, vstupujú do potravinového reťazca. V reprezentujú dôležitú triedu zlúčenín pre

Aj keď je možné niektoré polyfenoly považovať za nevýživné, narastá záujem o tieto zlúčeniny, vzhľadom na ich možné priaznivé účinky na zdravie. Ukázalo sa, že napríklad kvercitíri Cflavonoid) vykazuje protirakovinové účinky pri experimentálnych štúdiách na zvieratách CDeschner. Έ.Ε., Ruperto. J., Wong, G. a Neumark.

Inhibitors Carciriogenesis, T., Yamamoto, of

7.

S.

H. L., CJuerticin and Rutin as

Asoxymethanol-Included Colonic Neoplasia,

1193-1196 ¢1991) a Kato, R., Nakadate, a Sugimura. T.. Inhibition of 12--0-Tetradecynoylphorbol--13-Acetate Tumor Promotion and Omithyrie Decerboxylase Activity by tíuercitiri: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition. Carcinogeriesis, 4. 1301-1305 ¢1983)). Ukázalo sa. že ¢+)--katechín a ^)-epikatechín ¢3-flavanoly) irihibujú reverznú transkriptázovú aktivitu vírusu leukémie (Chu, S.C.. Hsieh. Y.S. á Lim. J.Y.. Inhibítory Effects of Flavonoids on Naloney Murine Leukémia Virus Reverse Transcriptase Activity J. of Natural Products. 55:2. 179-83 ¢1992)). Takisto sa zistilo že novotanin ¢ρolygomérny hydrolyzovateľriý tanriin) vykazuje protinádorové účinky Hlkuda. T.. Yoshida. T.. a Hatano. T.. Molecular

Strúctures and

Polyphenols-Olygomeric - prezentované na 16. Polyphenols

Štatistické žalúdka je produkujú skupiny Groupe júla 1992).

Pharmacological Activities of

Hydrolyzable Tannins and Others medzinárodnej konferencii v Lisabone (Portugalsko) 13.-16. správy takisto ukazujú. že úmrtnosť na rakovinu podstatne nižšia v oblastiach Japonska, ktoré Ca j. Epigallokatechirigallát bol značený za farmakologicky účinný materiál obsiahnutý v zelenom čaji. ktorý inhibuje kožné nádory u myši (Okuda, T., Yoshida, T., a Hatano. T., Holecular Structures nad Pharmacoligical Acitivities of Polyphenols-Olygomeric Hydrolyzable Tannins and Others - prezentovanej na 16. medzinárodnej konferencii skupiny Groupe Polyphenols v Lisabone (Portugalsko) 13.-16. júla 1992). Takisto sa ukázalo, že kyselina ellagová vykazuje protirakovinové aktivity na rôznych modeloch nádorov u zvierat (Boukharta, 1*1.. Jalbert, G. a Gastonguay, A., Efficacy of Ellagitannins and Ellagis Acid as Cancer Chemopreventive Agents - prezentovanej na 16. medzinárodnej konferencii skupiny Groupe Polyphenols v Lisabone (Portugalsko) 13.-16. júla 1992). Nedávno si spoločnosť Kikkoman Corporation nechala patentovať aritiinutagénne použitie proarithokyanidových polygomérov. Nedávno bola na 202. národnom stretnutí Amerických chemických vied prezentovaná oblasť fenolových zlúčenín, nachádzajúcich sa v potravinách a ich schopnosť modulovať nádorový vývoj v experimentálnych modeloch zvierat (Ho a kol.. Huang a kol.. (1992)).

Avšak žiadna z týchto správ sa netýka výťažkov kakaa, spôsobu prípravy týchto výťažkov ani použitia týchto výťažkov ako antirieoplastických činidiel.

Pretože nefermentované kakaové bôby majú vysoký obsah polyfenolu, je možné sa domnievať, že extrakcia týchto zlúčenín z kakaa a mapovanie aktivít týchto extraktov odhalí účinky kakaových extraktov. Národný inštitút, zaoberajúci sa výskumom rámci programu týkajúceho sa selekcie rakoviny. zisťoval v prírodných produktov protirakovinové Theobroma a Herrania. Tieto testy účinky rôznych druhov zaznamenali len nízku protirakovinovú aktivitu niektorých extraktov z kakaových pletív, takže odborníci v oblasti výskumu antineoplastických a protikarclnogérinych účinkov nedoporučovali používanie kakaa a jeho extraktov pre liečebné terapie pri liečení rakoviny. Pretože bolo vyvinutých mnoho analytických postupov, ktorých cielom bolo určenie. akou mierou prispievajú kakaové polyfenoly k vývoju chuti (Clapperton. J.. Hammerstone, J.F. Jr.. Romanczyk, L.J. Jr., Chán. J., Yow, S., Lím, D. a Lockuood. R.. Polyphenols and Cocoa Flavor - prezentovanej na 16. medzinárodnej konferencii skupiny Groupe Polyphenols v Lisabone CPortugalsko) 13.-16. júla 1992), rozhodli sa vynálezcovia aplikovať analogické metódy na pripravené vzorky s cielom stanovenia ich protirakovinových účinkov, napriek už známym skutočnostiam. Prekvapivo sa zistilo, že kakaové polyfenolové výťažky. ktoré obsahujú prokyanidy, majú významnú použiteľnosť ako protirakovinové alebo antineoplastlcké činidlá. Okrem toho vynálezcovia demonštrujú. že kakaové extrakty. obsahujúce prokyanidy. je možné použiť ako antioxidanty.

Podstata vynálezu

Ako už bolo uvedené, cielom vynálezu je poskytnutie spôsobu výroby kakaového výťažku.

Cielom vynálezu je takisto poskytnutie kakaového výťažku.

Ďalším cielom vynálezu je poskytnutie antioxldačnej kompozície.

Cielom vynálezu je takisto demonštrácia inhibícle aktivity DNA topoizomerázového II enzýmu.

Ďalším cielom vynálezu je poskytnutie spôsobu liečenia nádoru alebo rakoviny.

Cieľom vynálezu je takisto poskytnutie protirakovinovej, protinádorovej alebo protinovotvarovej kompozície.

Cieľom vynálezu je tiež poskytnutie spôsobu výroby protirakovinovej. protinádorovej alebo protinovotvarovej kompozície.

Cieľom vynálezu je napokon poskytnutie sadu použiteľnú pri liečení nádorov alebo rakoviny.

Prekvapivo sa zistilo, že kakaový výťažok má protlnádorové. protirakovinové alebo protinovotvarové účinky. alebo že predstavuje antloxidačnú kompozície, alebo že lnhibuje účinky DNA topolzomerázového 11 enzýmu. Vynález poskytuje v podstate čistý kakaový výťažok. Tento výťažok výhodne obsahuje polyfenoly, napr. polyfenoly obohatené kakaovými prokyanidml. predovšetkým polyfenoly s aspoň jedným kakaovým prokyanldom, zvoleným zo skupiny zahrnujúcej <->-epikatechín. prokyanid B-2, prokyanldové oligoméry 2 až 12. výhodne 2 až 5 alebo 4 až 12, prokyanidin B-5, prokyanidin A-2 a prokyanidin C-l. Vynález takisto poskytuje protinádorovú. protirakovinovú alebo protinovotvarovú kompozíciu, alebo antloxidačnú kompozíciu alebo inhibičnú kompozíciu DNA topoizomerázy 11, ktorá obsahuje v podstate čistý kakaový extrakt alebo syntetické kakaové polyfenoly. napr. polyfenoly obohatené prokyanidinmi, a vhodný nosič. Tento extrakt výhodne obsahuje kakaové prokyanidíny. Kakaový výťažok je možné výhodne získať spôsobom zahrnujúcim redukovanie kakaových bôbov na prášok, zbavenie tohoto prášku tukov a extrahovanie účinných zložiek z tohoto prášku.

Okrem toho vynález poskytuje sadu na liečenie pacientov, ktorí vyžadujú liečenie pomocou protlnádorového, protirakovinového alebo protinovotvarového činidla, pomocou antloxidantu alebo pomocou DNA topolzomerázového II inhibítora, pričom táto sada obsahuje kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly alebo prokyanidin<y> a nosič vhodný na zmiešanie s týmto výťažkom alebo syntetickými polyfenolml alebo prokyanidml.

Tieto a ďalšie ciele realizácie vynálezu sa stanú zrejmejšimi po preštudovaní nasledujúcej popisnej Časti.

Stručný popíš obrázkov

Pre názornosť je popisná Časť doplnená odkazmi na sprievodné výkresy, na ktorých*

Obr. 1 znázorňuje reprezentatívny gélový permeaCný chromatogram z frakcie surových kakaových prokyanidínov;

Obr. 2A znázorňuje reprezentatívny chromatogram vysokovýkonnostnej kvapalinovej chromatografie (ďalej len HPLC) s prevrátenými fázami. ktorý ukazuje separáciu (elučný profil) kakaových prokyanidínov extrahovaných z nefermentovaného kakaa;

Obr. 2B znázorňuje reprezentatívny HPLC chromatogram s normálnymi fázami. ktorý ukazuje separáciu kakaových prokyanidínov extrahovaných z nefermentovaného kakaa;

Obr. 3 znázorňuje šesť reprezentatívnych prokyanidinových štruktúr;

Obr. 4A až 4E znázorňujú reprezentatívne HPLC chromatogramy Piatich frakcií použitých pri testovaní protirakovinových alebo protinovotvarových účinkov;

Obr. 5 a obr. 6A až 6D znázorňujú závislosť dávky a odpovede medzi kakaovými extraktmi a rakovinovými bunkami ACHN (obr. 5) a PC-3 (obr. BA až 6D) (frakčné prežitie vs. dávka, ug/ml); Γ1&Γ12 F4/92. Ι1&ΙΊΑ+Ε U12P1. Π&ΠΒ+Ε Z192P1. I*I&I*IC+E U12P2. M&MD+E U12P2;

Obr. 7A až 7H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidínovými frakciami A. B. C, D, E. A+B, A+E a A+D a PC-3 bunkovou líniou (frakčné prežitie vs. dávka, ug/ml) ; 1*11*1-1 A 0212P3. 1*11*1-1 B 0162P1. 1*11*1-1 C 0122P3, 1*11*1-1 D 0122P3, 1*11*1-1 E 0292P8. 1*11*1-1 A/B 0292P6. 1*11*1-1 A/E 0292P6. 1*11*1-1

A/D 0292/P6;

Obr. SA až 8H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A. B. C, D. E. A+B. B+E a D+E a KB Nazofaryngálnou/HeLa bunkovou líniou CfrakCné prežitie vs. dávka, ug/ml); IW-1 A 092K3. IW-1 B 0212K5. IW-1 C 0162K3, IW-1 D 0212K5. 1*11*1-1 E 0292K5. 1*11*1-1 A/B 0292K3, 1*11*1-1

B/E 0292K4. 1*11*1-1 D/E 0292K5;

Obr. 9A až 9H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A, B, C, D, E, B+D. A+E a D+E a HCT-116 bunkovou líniou CfrakCné prežitie vs. dávka, ug/ml) ; 1*11*1-1 C Q192H5, 1*11*1-1 D 0192H5. 1*11*1-1 E 0192H5, IW-1 B&D 0262H2. 1*11*1-1 A/E 0262H3. 1*11*1-1 D&E Q262H1;

Obr. 10A až 10H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A, B, C. D, E. B+D a A+E obličkovou bunkovou líniou CfrakCné prežitie vs. dávka, ug/ml) ; 1*11*1-1 A 092A5, 1*11*1-1 B 092A5. 1*111-1 C 0192A7, IW-1 D 0192A7, H&I1-1 E 0192A7. IW-1 B&D 0302A6, IW-1 C&D 0302A6, IW/1 A&E 0262A6;

Obr. 11A až 11H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A, B, C, D, E, A+B, B+E a C+E A/549 pľúcnou bunkovou líniou CfrakCné prežitie vs. dávka, ug/ml); IW-1 A 01925Θ. IW-1 B 09265. IW-1 C 019259. IW-1 D □19258. IW-1 E 019258. IW-1 A/E 026254. IW-1 B&E 030255. IW-1 C&E N6255;

Obr. 12A až 12H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A, B. C. D. E. A+C. C+D a D+E a SK-5 melanómovou bunkovou líniou CfrakCné prežitie vs. dávka, ug/ml); IW-1 A 0212S4. IW-1 B 0212S4. IW-1 C 0212S4. IW-1 D 0212S4. IW-1 E N32S1, IW-1 B&C N32S3, IW/1 D&E N32S3;

Obr. 13A až 13H znázorňujú typickú závislosť dávka-odpoveď medzi kakaovými prokyanidlnovými frakciami A. B, C, D, E, B+C.

Ί

C+E a D+E a HCF-7 prsnou bunkovou líniou (frakfiné prežitie us. dávka, ug/ml) ; IW-1 A N22H4. ΙΊΠ-1 B N22H4. 1*11*1-1 C N22H4. MI1-1 D Ν22Γ13. ΠΙΊ-1 E 0302112. ΜΙ-l B&C 0302H4, IW-1 CSE Ν22Γ13. tTI-l D&E N22H3;

Obr. 14 znázorňuje typický stav dávka-odpoveď prokyanidín (predovšetkým frakcia D) a a bunková línia CCRF-CEI1 T-bunkovej leukémie (bunky/ml vs. dni rastu; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú frakciu, plné kolieska znamenajú 125 ug frakcie D. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 250 ug frakcie D, plné obrátené trojuholníky znamenajú 500 ug frakcie D);

Obr. 15A znázorňuje porovnanie testov XTT a kryštalického fialového testu na HCF-7 pl68 prsných rakovinových bunkách ošetrených frakciou D+E (prázdne kolieska znamenajú XTT a plné kolieska znamenajú kryštalickú fialovú);

Obr. 15B znázorňuje typickú krivku dávka-odpoveď získanú z UDÁ HB231 prsnej bunkovej línie ošetrenej rOznymi koncentráciami surových polyfenolov získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku. plné kolieska znamenajú vehikulum. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 250 ug/ml, plné obrátené trojuholníky znamenajú 100 ug/ml, prázdne štvorčeky znamenajú 10 ug/ml; absorbancia 2,0 je maximálnou hodnotou doskového CítaCa a nemusí nevyhnutne reprezentovať bunkový poCet);

Obr. 15C znázorňuje typickú krivku dávka-odpoveď získanú z bunkovej línie PC-3 buniek rakoviny predstojnice ošetrenej rôznymi koncentráciami surových polyfenolov získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku. plné kolieska znamenajú vehikulum. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 250 ug/ml. plné obrátené trojuholníky znamenajú 100 ug/ml. prázdne štvorCeky znamenajú 10 ug/ml);

Obr. 15D znázorňuje typickú krivku dávka-odpoveď získanú z bunkovej línie I4CF-7 pl68 prsných rakovinových buniek ošetrenej rôznymi koncentráciami surových polyfenolov získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbancia C540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku. plné kolieska znamenajú vehikulum. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 250 ug/ml. plné obrátené trojuholníky znamenajú 100 ug/ml, prázdne štvorčeky znamenajú 10 ug/ml, plné štvorčeky znamenajú 1 ug/ml; absorbancia 2.0 je maximálnou hodnotou doskového čítača a nemusí nevyhnutne reprezentovať bunkový počet);

Obr. 15E znázorňuje typickú krivku dávka-odpoveď získanú z Hela cervikálnej bunkovej línie ošetrenej rôznymi koncentráciami surových polyfenolov získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbancia (540 nm) vs. dní; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku, plné kolieska znamenajú vehikulum, prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 250 ug/ml, plné obrátené trojuholníky znamenajú 100 ug/ml, prázdne štvorčeky znamenajú 10 ug/ml; absorbancia 2,0 je maximálnou hodnotou doskového čítača a nemusí nevyhnutne reprezentovať bunkový počet);

Obr. 15F znázorňuje cytotoxické účinky proti Hela cervikálnej rakovinovej bunkovej línii ošetrenej rôznymi frakciami kakaového polyfenylu (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú 100 ug/ml frakcii A-E, plné kolieska znamenajú 100 ug/ml frakcií A-C, prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 100 ug/ml frakcií D&E; absorbancia 2,0 je maximálnou hodnotou doskového čítača a nemusí nevyhnutne reprezentovať bunkový počet);

CJbr. 15G znázorňuje cytotoxické účinky pri 100 ul/ml proti SKBE-3 pľúcnej rakovinovej bunkovej línii ošetrenej rôznymi frakciami kakaového polyfenylu (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú frakciu A-E, plné kolieska znamenajú frakciu A-C, prázdne obrátené trojuholníky znamenajú frakciu D&E) ;

Obr. 15H znázorňuje typický vzťah dávka-odpoveď medzi kakaovou prokyanidínovou frakciou D+E na Hela bunkách (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku. plné kolieska znamenajú 100 ug/ml, prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 75 ug/ml. plné obrátené trojuholníky znamenajú 50 ug/ml, prázdne štvorčeky znamenajú 25 ug/ml. plné štvorčeky znamenajú 10 ug/ml; absorbancia 2,0 Je maximálnou hodnotou doskového čítača a nemusí nevyhnutne reprezentovať bunkový počet);

Obr. 151 znázorňuje typický vzťah dávka-odpoveď medzi kakaovou prokyanidínovou frakciou D+E na SKBR-3 bunkách (absorbancia (540 nm) vs. dni; prázdne kolieska znamenajú kontrolnú vzorku. plné kolieska znamenajú 100 ug/ml. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú 75 ug/ml. plné obrátené trojuholníky znamenajú 50 ug/ml, prázdne štvorčeky znamenajú 25 ug/ml, plné štvorčeky znamenajú 10 ug/ml);

Obr. 15J znázorňuje typický vzťah dávka-odpoveď medzi kakaovou prokyanidínovou frakciou D+E na Hela bunkách získaných použitím testu klonovania mäkkého agaru (stĺpcový graf; počet kolónií vs. kontrolná vzorka. 1, 10. 50 a 100 ug/ml);

Obr. 15K znázorňuje rastovú inhibíciu Hela buniek pri ich ošetrení surovými výťažkami získanými z Ôsmich rôznych kakaových genotypov (percentá kontrolnej vzorky vs. koncentrácie, ug/ml; prázdne kolieska znamenajú C-l, plné kolieska znamenajú C-2. prázdne obrátené trojuholníky znamenajú C-3, plné obrátené trojuholníky znamenajú C-4. prázdne štvorčeky znamenajú C-5, plné štvorčeky znamenajú C-6, prázdne trojuholníky znamenajú C-7, plné trojuholníky znamenajú C-8; C-1=UF-12. poľnohospodárska odroda Criollo, surové výťažky UF-12 (Brazília) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-2=NA-33. poľnohospodárska odroda Forastero, surové výťažky NA-33 (Brazília) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-3=EEG-48, poľnohospodárska odroda Forastero, surové výťažky EEG-12 (Brazília) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobromlnovaných); C-4=neznámy, poľnohospodárska odroda

Forastero, surové výťažky neznáme (západná Afrika) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-5=UF-6.13, poľnohospodárska odroda Trinitario, surové výťažky UF-613 (Brazília) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-6=ICS-100. poľnohospodárska odroda Trinitario. surové výťažky 1CS-100 (Brazília) kakaových polyfenolov dekofeinovaných/deteobrominovaných);

poľnohospodárska odroda Trinitario, (Brazília) kakaových brominovaných)s C-8=UIT-1, surové výťažky UIT-1 polyfenolov

C-7=ICS-139, surové výťažky ICS-139 dek ofelnovaných/deteopoľnohospodárska odroda Trinitario, (Malajzia) kakaových polyfenolov dekofelnovaných/deteobrominovaných);

Obr. 15L znázorňuje rastovú inhibiciu Hela buniek pri ich ošetrení surovými výťažkami získanými z fermentovaných kakaových bôbov (štádiá úplnej fermentácie a slnečného sušenia; percentá kontrolnej vzorky v závislosti od koncentrácie, ug/ml; prázdne kolieska znamenajú frakciu 0. deň, plné kolieska znamenajú frakciu 1. deň, prázdne obrátené trojuholníky znamenajú frakciu

2. deň, plné obrátené trojuholníky znamenajú frakciu 3. deň. prázdne štvorčeky znamenajú frakciu 4.deň, plné štvorčeky znamenajú frakciu 9. deň);

Obr. 15M znázorňuje účinok enzymaticky zoxidovaných kakaových prokyanidinov proti Hela bunkám (krivka-dávka-odpoveď pre surový kakaový polyfenol ošetrený polyfenoloxldázou; percentá kontrolnej vzorky vs. koncentrácia, ug/ml; plné štvorčeky znamenajú surový UIT-1 (s kofeínom a teobromínom), prázdne kolieska znamenajú UIT-1 (bez kofeínu a teobromlnu) a plné kolieska znamenajú surový UIT-1 (katalyzovaný polyfenoxidázou);

Obr. 15N znázorňuje reprezentatívnu polopreparativriu HPLC separáciu s obrátenými fázami pre kombinované frakcie kakaového prokyanldlnu D a E;

Obr. 150 znázorňuje reprezentatívnu polopreparatívnu HPLC separáciu s normálnou fázou surového kakaového polyfenolového íl výťažku;

Obr. 16 znázorňuje typické rancimátové oxidačné krivky pre kakaový prokyanidínový výťažok a frakcie v porovnaní so syntetickými antloxidantmi BHA a BHT (zvolené jednotky vs. čas; bodkovaná čiara a krížik (+) znamená BHA a BHT; * znamená D-E; x znamená surový výťažok; prázdne štvorčeky znamenajú A-C; prázdne kosoštvorce znamenajú kontrolnú vzorku);

Obr. 17 znázorňuje typickú indikáciu agarózovým gélom inhibície topoizomerázou II katalyzovaného štiepenia reťazca kinetoplastovej DNA kakaovými prokyanidlnovýml frakciami (priechod 1 obsahuje 0.5 ug značkovacích (N) klnetoplastových DNA cyklov s monomérnou dĺžkou; priechody 2 a 20 obsahujú klnetoplastickú DNA. ktorá bola lnkubovaná topoizomerázou II v X DSPIO. ale v neprítomnosti kakaových (Kontrolné -C);

DNA, ktorá sa v prítomnosti 0,5 a 5.0 ug/ml kakaovej prokyanidínovej frakcie A; priechody 5 a 6 obsahujú klnetoplastovú DNA. ktorá sa lnkubovala topoizomerázou II v prítomnosti 0.5 a 5.0 ug/ml kakaovej prokyanidínovej frakcie B; priechody 7, 8, 9.

replikami klnetoplastových DNA, ktorá topoizomerázou II v prítomnosti 0. 05. 0, 5 a 5, 0 prítomnosti 4 prokyanidínov. klnetoplastickú a 4 obsahujú topoizomerázou II priechody lnkubovala

13. 14 a 15 sú sa lnkubovala ug/ml kakaovej prokyanidínovej frakcie D; Priechody 10, 11, 12, 16, 17 a 18 sú replikami klnetoplastových DNA, ktorá sa lnkubovala topoizomerázou 11 v prítomnosti □,05, 0, 5 a 5, 0 ug/ml kakaovej prokyanidínovej frakcie E; priechod 19 je replikou kinetoplastovej DNA, ktorá sa lnkubovala topoizomerázou II v prítomnosti 5, 0 ug/ml kakaovej prokyanidínovej frakcie E);

Obr. 18 znázorňuje dve závislosti dávka-odpoveď kakaovej prokyanidínovej frakcie D proti DNA dostatočne a nedostatočne opravených bunkových línií (frakčné prežitie vs. ug/ml; ľavá strana xrs-6 DNA nedostatočne opravená bunková línia. 1*11*1—1 D D2S2X1; pravá strana BR1 dostatočne opravená DNA bunková línia. 1*11*1—1 D D2S2B1);

Obr. 19 znázorňuje krivky závislosti dávka-odpoveď pre PICF-7 bunky rezistentné voči adriamycinu a pre PICF-7 pl6B parentálnu bunkovú líniu, ktorá bola ošetrená kakaovou frakciou D+E (percentá kontrolnej vzorky vs. koncentrácie, ug/ml; prázdne kolieska znamenajú MCF-7 pl68; plné kolieska znamenajú MCF-7 ADR); a

Obr. 20 znázorňuje účinky dávky-odpovede na Hela bunky, ktoré boli ošetrené 12 frakciami pripravenými pomocou polopreparatívnej HPLC s normálnou fázou pri koncentráciách 100 ug/ml a 25 ug/ml (stĺpcový graf. percentá kontrolné v závislosti od kontrolnej vzorky a frakcii 1 až 12).

bôbov a dužiny. zbavením a rozomletím zbavených bôbov.

Ako už bolo uvedené, teraz sa prekvapivo zistilo, že kakaové výťažky vykazujú protirakovinové, protinádorové alebo protinovotvarové účinky. antloxidačné účinky a inhibujú DNA topoizomerázový II enzým. Výťažky sa zvyčajne pripravujú redukciou kakaových bôbov na prášok, odtučnením tohoto prášku a extrahovaním účinnej zlúčeniny alebo zlúčenín z takto odtučneného prášku. Prášok je možné pripraviť vymrazením kakaových bôbov a dužiny, vylupovaním kakaových vymrazených kakaových bôbov šupiek

Extrakciu účinnej zlúčeniny alebo zlúčenín je možné uskutočniť ako rozpúšťadlovú extrakciu. Takto získané výťažky je možné očistiť napr. gélovou permeačnou chromatografiou alebo preparatívnou vysokovýkonnou kvapalnou chromatografiou (HPLC) alebo kombináciou týchto techník. Bez toho, aby sme sa opierali o určitú teóriu, identifikovali sa výťažky. ktoré majú účinnosť ako kakaové polyfenoly napr. prokyanidínml. Tieto kakaové prokyanidiny majú vysokú protirakovinovú, protinádorovú alebo protinovotvarovú účinnosť, antioxidačnú účinnosť a inhibujú DNA topoizomerázový II enzým.

Protirakovinové, protinádorové alebo antloxidačné a DNA topoizomerázový II kompozície, ktoré obsahujú kakaové polyfenoly protinovotvarové, enzým inhibujúce alebo prokyanidiny podľa vynálezu, je možné pripraviť použitím štandardných technik vo farmaceutickom priemysle dobre známych. Tieto kompozície môžu byť pacientovi v prípade potreby takéhoto podania podávané v dávkach spOsobmi v lekárstve dobre známymi. priCom pri voľbe dávok a spôsobov podania je potrebné vziať do úvahy také faktory, ako je vek, pohlavie. hmotnosť a celkový stav príslušného pacienta. Kompozície môžu byť podávané súšasne s ďalšími antirieoplastickýml. protirakovinovými alebo protinádorovýml Činidlami alebo antioxidantmi alebo DNA topoizomerázový Iľ enzým lnhibujúcimi Činidlami a/alebo s Činidlami, ktoré zmierňujú nežiadúce úCinky antineoplastických. protirakovinových, protinádorových, antioxidaCných alebo DNA topoizomerázový II enzým inhlbujúclch Činidiel, popr. následne po podaní týchto Činidiel, priCom je opäť nutné zobrať do úvahy také faktory, ako je je vek, pohlavie, hmotnosť a celkový stav príslušného pacienta a spôsob podania.

I*ledzi príklady kompozícií podľa vynálezu je možné zahrnúť pevné kompozície pre orálne podanie, napr. kapsulky. tablety, pilulky a pod., rovnako ako aj žuvateľné pevné kompozície, ktoré sú pre vynález veľmi vhodné, pretože pochádzajú z požlvateľných zdrojov Cnapr. pevné kompozície s kakaovou, prlp. Čokoládovou príchuťou); kvapalné preparáty, napr. pre orálne, nazálne. análne a vaginálrie podanie, napr. suspenzie, sirupy alebo elixíry s a prípravky pre parenterálne, subkutánne. intradermálne, intramuskulárne alebo intravenózne podanie Cnapr. injekovateľné podanie), predovšetkým sterilné suspenzie alebo emulzie. Avšak účinná zložka v kompozíciách môže tvoriť komplex s proteínmi, napr. vtedy, ak sa aplikuje do krvného prúdu, priCom v tomto prípade môže dôjsť k zrážaniu v dôsledku vyzrážania krvných proteínov, Co by mal odborný lekár zobrať do úvahy. V týchto kompozíciách môže byť úCinný kakaový extrakt v predzmesl s vhodným nosiCom, riedidlom alebo masťovým základom. napr. sterilnou vodou, fyziologickým roztokom alebo glukózou. ÚCinný kakaový výťažok podľa vynálezu môže byť poskytnutý v lyofilizovanej forme. napr. v izotonlckom vodnom, soľnom pufri.

Vynález takisto zahrnuje sadu poskytujúcu účinný kakaový výťažok. Táto sada môže zahrnovať samostatný zásobník obsahujúci vhodný nosič. riedidlo alebo masťový základ. Táto sada mOže takisto zahrnovať ďalšie protirakovinové, protinádorové alebo protinovotvarové činidlo alebo antloxldant alebo činidlo inhibujúce DNA topolzomerázový II enzým a/alebo činidlo, ktoré zmierňuje nežiadúce účinky antineoplastických protirakovinových, protinádorových, antioxidačných alebo DNA topolzomerázový II enzým inhibujúcich činidiel pre súbežné alebo následné podanie. Toto ďalšie činidlo. alebo činidlá. môže byť poskytované v samostatnom zásobníku, alebo zásobníkoch, alebo v zmesi s účinným kakaovým výťažkom. Okrem toho môže táto sada zahrnovať Inštrukcie na zmiešavanie alebo kombinovanie jednotlivých zložiek a/alebo podania.

Vynález sa teda týka syntetických kakaových polyfenolov alebo prokyanidínov alebo ich derivátov. ktoré zahrnujú napr. glykozidy. galláty, estery, atď.

Nasledujúce neobmedzujúce príklady majú prezentovať niektoré varianty realizácie vynálezu bez toho, aby obmedzovali rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený priloženými patentovými nárokmi.

Príklady realizácie vynálezu

Príklad 1» Zdroj kakaa a spôsob prípravy

Z troch hlavných svetových oblasti produkujúcich kakao sa získalo niekoľko genotypov Theobroma cacao, ktoré reprezentujú tri poľnohospodárske odrody kakaa CEnriquez, G.A. a Sorla, J.V.. Cocoa Cultivars Register IICA. Turrlalba, Costa Rica C1967); Engels, J.M.ľl., Genetlc Resources of Cacao> katalóg CATIE Collection, technický buletln 7, Turrlalba. Costa Rica ¢1981)). Zoznam genotypov použitých v tejto štúdii je uvedený v tabuľke 1. Zozbierané kakaové tobolky sa otvorili a bôby s dužinou sa separovali vymrazenlm. Dužina sa ručne vybrala z vymrazenej hmoty a bôby sa podrobili potom analýze. Nefermentované. vymrazerié kakaové bôby sa najprv ručne zbavili Šupiek a pomocou mlyna TEKMAR namleli na jemnú práSkovitú hmotu. Výsledná hmota sa potom cez noc odtučŕíovala použitím Soxhletovej extrakcie, pri ktorej sa ako rozpúšťadlo použil preddestllovaný hexán. Zvyšok rozpúšťadla sa z odmastenej hmoty odstránil pomocou vákua pri Izbovej teplote.

Tabuľka 1

Popis materiálového zdroja Theobroma cacao

Genotyp	Pôvod	Záhradnícka odroda
UIT-1	Malajzia	Trinitario
Neznámy	Západná Afrika	Forastero
ICS-100	Brazília	Trinitario
ICS-39	Brazília	Trinitario
UF-613	Brazília	Trinitario
EEG-48	Brazília	Forastero
UF-12	Brazília	Criollo
NA-33	Brazília	Forastero

Príklad 2« Prokyanidinové extrakčné postupy

A. Metóda 1

Prokyanidíny sa extrahovali z odtučnených nefermentovaných vymrazených kakaových bôbov z príkladu 1 pri použití modifikácie metódy popísanej Jalalom. 1*1. A. F a Colllnom. H. A. v Článku Polyphenols of Mature Plánt. Seedling and Tissue Cultures of Theobroma cacao Phytochemistry. 6. 1377-1380 C1978).

Prokyanidíny sa extrahovali z 50 g dávok odtučnenej kakaovej hmoty dvakrát 400 ml 70 X roztoku acetónu v delonlzovanej vode a potom 400 ml 70 X metanolu v delonlzovanej vode. Po zhromaždení sa rozpúšťadlá odparili pri teplote 45 °C pomocou rotaCnej odparky udržiavanej v parciálnom podtlaku. Výsledná vodná fáza sa dorledila do jedného litra deionizovanou vodou a extrahovala dvakrát 400 ml CHC1₃. Rozpúšťadlová fáza sa zlikvidovala. Vodná fáza sa potom extrahovala štyrikrát 500 ml acetátu. Výsledné emulzie sa odstreďovali na odstredivke Sorvall RC 28S. pracujúcej pri 2 000 xg za 30 minút pri 10 °C. K zlúčeným etylacetátovým extraktom sa pridalo 100 až 200 ml deionlzovanej vody. Rozpúšťadlo sa opäť odparilo pri 45 °C pomocou rotačnej odparky udržiavanej pod parciálnym podtlakom. Výsledná vodná fáza sa vymrazila v kvapalnom dusíku a potom na vymrazovacom systéme LABCONCO. Výťažky surových prokyanldlnov,, ktoré boli získané z rôznych kakaových genotypov sú zhrnuté v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Výťažky surových prokyanldlnov

Genotyp	Pôvod	Výťažky C g)
UIT-1	Malajzia	3. 81
Neznámy	Západná Afrika	2, 55
ICS-100	Brazília	3. 42
ICS-39	Brazília	3. 45
UF-613	Brazília	2. 98
EEG-48	Brazília	3.15
UF-12	Brazília	1. 21
NA-33	Brazília	2, 23

B. Metóda 2

Alternatívne je možné prokyanidlny extrahovať z odtučnených nefermentovaných vymrazených kakaových bôbov z príkladu 1 70 % vodným roztokom acetónu. 10 g odtučneného materiálu sa 5 až 10 min suspenzovalo v 100 ml rozpúšťadla. Táto suspenzia sa odstreďovala 15 min pri 4 °C pri 3 000 xg a supernatant sa nechal prejsť sklenou vatou. Získaný filtrát sa podrobil destilácii v parciálnom podtlaku a výsledná vodná fáza sa vymrazila v kvapalnom dusíku a potom vo vymrazovacom systéme LABCONCO. Výťažky surových prokyanidínov sa pohybovali v rozmedzí od 15 do 20 X. Bez toho, aby sme sa viazali na určitú teóriu, je zrejmé, že rozdiely v surových výťažkoch odrážajú variácie, ktoré sa dosiahli pri použití rfiznych genotypov, geografických pôvodov, poľnohospodárskych odrôd a spôsobov prípravy.

Príklad 5« Čiastočné čistenie kakaových prokyanidínov

A. Gélová permeačná chromatografia

Prokyanidlny získané z príkladu 2 sa čiastočne vyčistili kvapalinovou chromatografiou v kolúne SEPHADEX LH-20 (28 x 2,5 cm). Na separovanie sa použije krokový gradient do deionizovanej vody. Separácia sa začal s gradienčným zložení 15 % metanolu v deionizovanej vode, pričom ďalej krokovo každých 30 min nasledovala postupne separácia pomocou 25 X metanolu v deionizovanej vode. 35 X metanolu v deionizovanej vode. 75 X metanolu v deionizovanej vode a nakoniec 100 X metanolu. Plynulé eluované xantlnové alkaloidy (kofeín a teobromín) as zhromaždili ako jediná frakcia. Frakcie poskytujúce podfrakciu neobsahujúcu xantlnové alkaloidy bola podrobená ďalšej separácii. ktorá poskytla 5 podfrakcll. označených ΙΊΓ12Α až ľll*l2E. Rozpúšťadlo sa z jednotlivých podfrakcll odstránilo odparením pri 45 °C pomocou rotačnej odparky udržiavanej pod čiastočným podtlakom. Výsledná vodná fáza sa zmrazila v kvapalnom dusíku a cez noc vymrazovala na vymrazovacom systéme LABCONCO. Reprezentatívny chromatogram gélovej permeácle znázorňujúci túto frakciu je zobrazený na obrázku 1. Týmto spôsobom sa frakcionovalo približne 100 mg materiálu.

Obrázok 1 znázorňuje gélový permeačný chromatogram surových prokyanidínov získaný na Sephadexe LH-20.

Chromatografické podmienky· kolóna Sephadex LH-20. 28 x 2. 5 cm. mobilné fázy· krokový gradient metanolu a vody 15<85, 25<75.

35<65, 70:30 a 100>Q, krokovaný v polhodinových intervaloch, prietok» 1,5 ml/min, detektor LIVG lambdai= 254 nm a lambda_a-365 nm, rýchlosť posunu papiera zapisovača» 0,5 mm/min. hmotnosť pevnej fázy: 120 mg.

B. Polopreparativna vysokovýkonnostná kvapalná chromatografia C HPLC)

Metóda 1: Separácia s reverznými fázami

Prokyanidíny získané z príkladu 2 a/alebo 3A sa čiastočne vyčistili polopreparatívnou HPLC. HPLC systém Heulett Packard 1050, vybavený detektorom s premenlivou vlnovou dĺžkou, vstrekovacím ventilom Rheodyne 7010 s 1 ml injektážnou slučkou, sa skompletizoval s frakčným kolektorom Pharmacia FRAC-100. Separácia sa uskutočňovali na kolóne Phenomenex Ultracarb 10u ODS C 250 x 22, 5 mm) spojené s ochrannou kolónou Phenomenex Ultracarb lOu ODS ¢60 x 10 mm). Mobilná fáza tvorila A=voda; B=metanol, použité pri nasledujúcich lineárnych gradienčných podmienkach: C čas, % Al _s ¢0,85). ¢60. 50). ¢90. 0) a ¢110. 0) pri prietoku 5 ml/min. Reprezentatívny záznam polopreparatívnej HPLC je znázornený na obrázku 15n a ukazuje separáciu prokyanidínov prítomných vo frakcii D+E. Jednotlivé piky alebo selektívne chromatografické oblasti sa zhromaždili v určitých časových intervaloch. Hmotnosť pevnej fázy sa pohybovala v rozmedzí od 25 do 100 mg materiálu.

Metóda 2» Normálna fázová separácia

Prokyanidínové výťažky získané z príkladov 2 a/alebo 3A sa čiastočne vyčistili polopreparatívnou HPLC. HPLC systém Hewlett Packard 1050 a detektor Millipore-Uaters model 4B0 LC nastavený na 254 nm sa skompletizovali s frakčným kolektorom Pharmacia FRAC-100 nastaveným v pikovom kóde. Separácie sa uskutočňovali v kolóne Supelco 5u Supelcosil LC-Si ¢250 x 100 mm) spojenej ochrannou kolónou Supelco 5u Supelguard LC-Sí ¢20 x 4,6 mm). Prokyanidíny sa eluovali lineárnym gradientom pri nasledujúcich podmienkach i C čas. % A, X B) ; (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4ä, (60, 46. 50), (65, 10. 86). (70, 10, 86) a potom nasledovalo 10-miriútové ustálenie. Mobilné fázy tvorili A=dichlórmetán; B-metanol; C=zmes kyseliny octovej a vody (1:1). Použitým prietokom bol prietok 3 ml/min. Zložky sa detegovall pomocou UV žiarenia pri 254 nm a zaznamenali na záznamník Kipp & Zonan VD41. Vstrekované objemy sa pohybovali v rozmedzí od 100 do 250 ul 10 mg prokyanldinových výťažkov rozpustených v 0, 25 ml 70 X vodného roztoku acetónu. Reprezentatívny záznam polopreparatívnej HPLC znázorňuje obrázok 15o. Jednotlivé piky alebo selektívne chromatografické oblasti sa zhromaždili v časových intervaloch alebo ručne zhromaždením frakcií pre ďalšie čistenie a následné vyhodnotenie.

Podmienky HPLC: polopreparatívna kolóna Supelco 5u Supelcosll LC-Si (250 x 100 mm) spojená ochrannou kolónou Supelco 5u Supelguard LC-Si (20 x 4.6 mm) a detektor Millipore-Uaters model 480 LC nastavený na 254 nm, prietok: 3 ml/min, teplota kolóny: teplota okolia, vstrekovanie: 250 ul 70 X vodného acetónového výťažku.

Gradient Čas (min)	CHaCla	Metanol	Kyselina octová/HaO (1:1)
0	82	14	4
30	67. 6	28. 4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

Týmto spôsobom sa získali tieto frakcie:

Frakcia	Typ
1	diméry
2	triméry
3	tetraméry
4	pentaméry.
5	hexaméry
6	heptaméry
7	oktaméry
8	nonaméry
9	dekaméry
10	undekaméry
11	dodekaméry
12	vyššie oligoméry

Príklad 4» Analytická HPLC analýza prokyanidinových výťažkov

Metóda 1: Separácia s reverznými fázami

Prokyanidínové extrakty získané z príkladu 3 sa prefiltrovali cez 0,45 u filter a analyzovali pomocou HPLC ternárneho systému Heulett Packard 1090 s výbavou diódového detektora a programovateľného fluorescenčného detektora HP model 1046A. Separácie sa uskutočňovali pri 45 °C na kolóne Heulett Packard 5u Hypersil ODS (200 x 2,1 mm). Flavanoly a prokyanidiny sa eluovali lineárnym gradlentom 60 % B v a potom sa kolóna premyla elučnou zložkou B, ktorej prietok bol 0,3 ml/min. Mobilná fáza bola tvorená (B) 0,5 X kyselinou octovou v metanole a (A) 0, 5 X kyselinou octovou vo vode. Koncentrácia kyseliny octovej v mobilných fázach A a B sa mohla zvýšiť až na 2 %. Zložky boli detegované fluorescenčnou metódou, pričom lambda«_M-276 nm a lambda_WTn=316 nm. Koncentrácie (+)-katechinónu a (-)-epikatechínu sa určili vzhľadom na referenčné štandardné roztoky. Koncentrácie prokyanldlnu sa určili pomocou odpoveďového faktora určeného pre C-)-epikatechín. Reprezentatívny HPLC chromatogram ukazujúci separáciu rôznych zložiek je znázornený na obrázku 2A pre jeden kakaový genotyp. Podobné HPLC profily je možné získať aj z ďalších kakaových genotypov.

HPLC podmienky, kolóna, Heulett Packard 5n Hypersil ODS ¢200 x 2.1 mm) spojené ochrannou kolónou Heulett Packard 5u Hypersil ODS C 200 x 2.1 mm) s výbavou diódového detektora nastaveného na 289 nm a programovateľného fluorescenčného detektora, kde lambda_w><=276 nm a larnbda_em=316 nm. Prietok, 3 ml/min. Teplota kolóny, 45.

Gradient« Čas Cmin)	0, 5 X kyseliny octovej v deionizovanej Ha0	0. 5 X kyseliny octovej v metanole
0	100	0
50	40	60
60	0	100

Metóda 2, Normálna fázová separácia

Prokyanidinové extrakty získané z príkladu 3 sa prefiltrovall cez 0,45 u filter a analyzovali pomocou HPLC ternárneho systému Heulett Packard 1090 s výbavou diódového detektora a programovateľného fluorescenčného detektora HP model 1046A. Separácie sa uskutočňovali pri 38 °C na kolóne 5u Phenomenex Lichorsphere Silica 100 ¢250 x 3,2 mm) spojenej s ochrannou kolónou Supelco Supelguard LC-S1 5jj < 20 x 4,6 mm). Prokyanidíny sa eluovali lineárnym gradientom pri nasledujúcich podmienkach ¢035, X A. X B) ; ¢0, 82, 14), ¢30, 67,6, 28.4). ¢60, 46. 50). ¢65, 10. 86). ¢70. 10. 86) a potom nasledovalo 8-minútové ustálenie s cieľom dosiahnutia rovnováhy. Mobilné fázy tvorili A=dichlórmetán; B=metanol; C=zmes kyseliny octovej a vody ¢objemový pomer 1,1). Použitým prietokom bol prietok 0,5 ml/min.

Zložky sa stanovili fluorescenčnou metódou, pri ktorej lambda«,_><=276 nm a lambda«._m=316 nm alebo UV metódou pri 280 nm. Reprezentatívny HPLC chromatogram, ktorý ukazuje separáciu rôznych prokyanidínov, je pre jeden genotyp znázornený na obrázku 2B. Podobné HPLC profily je možné získať aj z ďalších kakaových genotypov.

HPLC podmienky: kolóna 5u Phenomex Lichrosphere Silica 100 (250 x 3.2 mm) spojená s ochrannou kolónou Supelco Supelguard LC-Si 5u (20 x 4,6 mm), detektory: fotodlódové zoskupenie nastavené na 280 nm, fluorescenčné lambda«><=276 nm a lambda«_m=316 nm, prietok s 0,5 ml/min, teplota kolóny: 37 °C.

Gradient: Čas (min	CHa-Cla	(1:1)	Kyselina octová/Hs0
0	B2	14	4
30	67. 6	28. 4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

Príklad 5: Identifikácia prokyanidínu

Prokyanidiny sa čistili kvapalinovou chromatografiou na kolónach Sephadex LH-20 (28 x 2, 5 cm) a potom polopreparatívnou HPLC použitím kolóny lOu uBundapak C18 (100 x 8 mm) alebo polopreparatívnou HPLC použitím kolóny 5u Supercosil LC-Sí (250 x 10 mm).

Čiastočne vyčistené izoláty sa analyzovali bombardovaním urýchlenými atómami - hmotnostnou spektrometriou (FAB-MS) na VG ZAB-T PIS systéme s vysokým rozlíšením pri použití kvapalinovej sekundárnej iónovej hmotnostnej spektrometrickej (LSIMS) techniky v pozitívnom a negatívnom iónovom modele. Ako zdroj ionizácie sa použila céziová iónová pištoľ pri 30 kV a Magická strelová matrica (1«1 ditiotreitol/ditioerytritol) sa použila ako protónový donor.

Analytické testovanie týchto frakcii pomocou LSIMS odhalilo prítomnosť mnohých flavan-3-olových oligomérov, ktoré sú zhrnuté v tabuľke 3.

Tabuľka 3

LSIMS (pozitívny ión) údaje získané z frakcií kakaových prokyanidínov

Oligomér	(N+l)*	(M+Na)*	Molekulová hmotnosť
Monoméry	291	313	290
(katechíny)
Dimér(y)	577/579	599/601	576/578
Trimér(y)	865/867	887/889	884/866
Tetramér(y)	1 155	1 177	1 154
Pentamér(y)	1 143	1 465	1 442
Hexamér(y)	1 731	1 753	1 730
Heptamér(y)	-	2 041	2 018
Oktamér(y)	-	2 329	2 306
Nonamér(y)	-	2 617	2 594
Dekamér(y)	-	2 905	2 882
Undekamér(y)	-	3 170
Dodekamér(y)	—	—	3 458

Hlavné hmotnostné fargmentové ióny sa zhodovali s už predtým vypracovanými prácami týkajúcimi sa pozitívnych a negatívnych iónových FAB-MS analýz prokyanidínov (Self R., Eagles J., Galletti G.C., Mueller-Harvey I.. Hartley R.D.. Lee A.G.H.. Magnolato D., Richli U., Gujur R. a Haslam E.. Fast Atóm Bombardment Mass Spectrometry of Polyphenols (Syn Vegetable Tannins), Blomed Environ. Mass Spec. 13, 449-468 (1986) Porter

L.J., Ma Z.. Chán B.G.. Cocoa Procyanidins« Major Flavanoids and Identification of Some Minor Metabolites. Hytochemistry, 30. 1657-1663 (1991)). lún. zodpovedajúci m/z 577 (M+H)* a jeho sodný adukt pri m/z 599 (M+Ma)* predpokladá v Izolátoch prítomnosť prokyanidinových dimérov s dvojitou väzbou. Prokyanidínové izoméry B-2, B-5 a C-l sa predbežne stanovili na základe v zátvorke uvedených prác (Revilla E.. Bourzeix M. a Alonso E.. Analysis of Catechins and Procianidins in Grape Seeds by HPLC with Photodiode Array Detectíon. Chromatographia 31. 465-468 (1991) Self R., Eagles J.. Gallettl G.C.. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Lee A.G.H., Magnolato D.. Richli U.. Gujur R. a Haslam E.. Fast Atóm Bombardment Mass Spectrometry of Polyphenols (Syn Vegetable Tannins). Biomed Environ. Mass Spec. 13, 449-468 (1986) Porter L.J., Ma Z.. Chán B.G.. Cocoa Procyanidins» Major Flavanoids and Identification of Some Minor Metabolites. Hytochemistry, 30, 1657-1663 (1991)). Prokyanidíny v čiastočne vyčistených frakciách končiac oktamérom a dekamérom sa overili pomocou FAB - hmotnostnej spektroskopie. okrem toho prítomnosť prokyanidínov, končiac dodekamérom sa zistila takisto normálnou fázovou HPLC analýzou (pozri obr. 2B). Bez chceli viazať na určitú teúrlu, je možné rozpustnosť dodekaméru v rozpúšťadlách použitých pri extrakcii a čistení je trocha -obmedzená. Tabuľka 4 uvádza relatívne koncentrácie prokyanidínov nájdených v izolátoch neobsahujúcich xantínové alkaloidy na základe reverznej fázovej HPLC analýzy. Tabuľka 5 uvádza relatívne koncentrácie prokyanidínov určené pomocou normálnej fázovej HPLC analýzy.

toho, aby sme sa predpokladať. že

Tabuľka 4

Relatívne koncentrácie prokyanidínov v izolátoch neobsahujúcich xantínové alkaloidy

Zložka	Molekulová hmotnosť	Množstvo (X)
(+)-katechin	290	1.6
(-)-epikatechín	290	3B. 2
B-2 dimér	578	11. 0
B-5 dimér	578	5. 3
C-l trimér	866	9. 3
Dlméry s dvojitou	väzbou 576	3. 0
Tetramér(y)	1 154	4.5
Pentamér-oktamér	1 442-2 306	24, 5
Neznáme a vyššie	oligoméry -	2.6

	Tabuľka	5
Relatívne koncentrácie prokyanidínov výťažkoch	vo vodných	acetónových
Zložka	Molekulová hmotnosť	Množstvo (X)
(+)-katechin a C-)-epikatechín	290 (rovnaká pre	obidva)	41. 9
B-2 dimér a B-5 dimér	578		13. 9
Triméry	884/B66		11. 3
Tetraméry	1 154		9. 9
Pentaméry	1 442		7. 8
Hexaméry	1 730		5. 1
Heptaméry	2 018		4.2
Oktaméry	2 306		2.8
Nonaméry	2 594		1. 6
Dekaméry	2 882		0.7
Undekaméry	3 170		0,2
Dodekaméry	3 458		< 0. 1

Obrázok 3 znázorňuje niekolko prokyanidínových štruktúr a obrázky 4A až 4B znázorňujú reprezentatívne HPLC chromatogramy piatich frakcií použitých pri nasledujúcom určovaní protirakovinovej alebo protinádorovej účinnosti. Podmienky pre vysokovýkonnostné kvapalinové chromatografie pre obrázky 4A až 4E boli takétot

Podmienky HPLCs ternárny HPLC systém Heulett Packard 1090 vybavený programovateľným fluorescenčným detektorom HP model 1046A. Kolóna: Heulett Packard 5u Hypersil ODS (200 x 2,1 mm) lineárny gradient 60 % v A pri prietoku 0,3 ml/min. Β®=0. 5 % kyseliny octovej v metáne; A=0,5 = kyseliny octovej v deionizovanej vode. Lambda«_M=280 nm; lambda_en)=316 nm.

Obrázok 15 0 znázorňuje reprezentatívny chromatogram polopreparatívnej vysokovýkonnostnej kvapalinovej chromatografie pre ďalších 12 frakcií, použitých pri zisťovaní protirakovinovej alebo protinádorovej účinnosti (pre HPLC podmienky platia vyššie vymedzené podmienky).

Príklad 6« Protirakovinová, protinádorové alebo protinovotvarová účinnosť kakaových výťažkov (prokyanidínov)

Na testovanie vzoriek z príkladu 5 sa použilo ľlTT (3-E4, 5-dimetyltiazol-2-yl3-2. 5-difenyltetrazoliumbromid)mikrotitrové doštičkové tetrazoliové cytotoxické zoskupenie pôvodne vyvinuté Plosmannom T., a popísané v Rapid Colorimetric Assay f or Cellular Grouth and Survivals Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, J. ľmmunol. ľlethods. 65, 55 (1983). Testované vzorky. štandardy (cysplatina chlorambucil) a ľlTT reagenčné činidlá sa rozpustili v 100 X DMSO (dimetylsulfoxide) pri koncentrácii 10 mg/ml. Zo zásobných roztokov sa pripravilo množstvo neriedených vzoriek. V prípade testovaných vzoriek sa pripravili narledené vzorky obsahujúce 0. 01 až 100 ug/ml v 0, 5 X DľISO.

Všetky ľudské nádorové bunkové línie sa získali z americkej zbierky typových kultúr. Bunky sa nechali rásť vo forme monovrstiev v alfa-MEM obsahujúcom 10 Z plodového bovinného séra 100 jednotlek/ml penicilínu. 10 ug/ml streptomycínu a 240 jednotiek/ml nystatínu. Bunky sa udržiavali v navlhčenej 5 % C0₂ atmosfére pri teplote 37 °C.

Po trypsinlzácll sa bunky sčítali a nastavili na koncentráciu 50 x 10⁵ buniek/ml (líšiacich sa v závislosti od príslušnej rakovinovej bunkovej línie). 200 ul bunkovej suspenzie sa umiestilo do jamiek Stvorradovéj. 96-jamkovéj mikrotitračnej platne. Potom. ako sa bunky nechali počas 4 hodín prichytiť, sa vždy do kvadruplexových jamiek pridali 2 ul DMSO obsahujúceho roztoky testovanej vzorky. Začiatočné experimenty, zisťujúce závislosť od dávky, využívajúce množstvo neriedených testovacích vzoriek, sa použili na stanovenie rozmedzia dávok, ktoré majú byť testované. Absorbancie jamiek pri 540 nm sa potom zamerali na BI0 RAD MP4-50 platňovom čltači. Priemerná absorbancla testovanej vzorky získanej spriemernením výsledkov pre štyri vzorky sa porovnala s kontrolnými výsledkami pre Štandardy a výsledky sa vyjadrili ako percento kontrolnej absorbancie +/- štandardná odchýlka. Redukcia ΓΙΤΤ na nachový formazánový produkt lineárne koreluje s počtom živých buniek v jamke. Takže meraním absorbancie redukčného produktu je možné získať kvantovanie percent bunkového prežitia v danej dávke testovanej vzorky. Kontrolné jamky obsahujú finálnu koncentráciu 1 % DMSO.

Týmto postupom sa najprv testovali 2 vzorky. Vzorka MM1 predstavovala úplne surový lzolát kakaových prokyanldlnov a obsahovala nezanedbateľné množstvo kofeínu a teobromlnu. Vzorka MM2 reprezentovala kakaový prokyanidínový izolát čiastočne vyčistený gélovou permeačnou chromatografiou. Kofeín a teobromín neboli vo vzorke MM2 prítomné. U obidvoch vzoriek sa pomocou už popísaných procedúr určovala účinnosť proti nasledujúcim rakovinovým bunkovým líniám:

HCT-116 rakovina hrubého čreva

ACHN obličkový adenokarcinóm

SK-5 melanóm

Α49Θ obličkový adenokarcinóm ľlCF-7 rakovina prsníka

PC-3 rakovina predstojnice CAPA-2 rakovina podžalúdkovej žľazy

Pokiaľ ide o 1*11*11. zistilo sa, že jeho účinnosť na vyššie len malá alebo vôbec určitá účinnosť proti líniám. Avšak ukázalo vymenované rakovinové bunkové línie je žiadna. Pokiaľ ide o 1*11*12, zistila sa HCT-116, PC-3 a ACHN rakovinovým bunkovým sa, že ako 1*11*11. tak aj 1*11*12 interferuje s ΠΤΤ reakčným Činidlom, takže prispievajú k zníženiu absorbancie. ktoré by mohlo odrážať zníženie počtu buniek schopných existencie. Táto interferencia takisto prispieva k veľkým stĺpcom chýb, pretože sa zdá. že chemická reakcia, ktorá prebieha v jamkách v obvode piata, prebieha oveľa rýchlejšie. Typický príklad týchto javov je znázornený na obrázku 5. Pri vysokých koncentráciách testovaného materiálu sa dá očakávať, že dôjde k veľkému poklesu prežívajúcich buniek. Avšak mikroskopické pozorovania ukázali, že k cytotoxickým účinkom dochádza aj napriek l*ITT interferenčným vplyvom. Týmto spôsobom sa získala napr. pre účinnosť 1*11*12 na ACHN bunkovej línii hodnota IC_So 0,5 ug/ml. Tieto bežné výsledky si z pohľadu vynálezcu vyžiadali testovacie postupy tak, aby sa vylúčila interferencia s l*ITT. To sa dosiahlo pomocou nasledujúceho spôsobu. Po inkubovani platní pri 37 °C v navlhčenej 5 % CO₂ atmosfére. ktoré trvalo 18 hodín, sa médium opatrne odsalo a nahradilo čistým alfa-l*IEI*l médiom. Toto médium sa tretí deň realizácie testu z jamiek opäť odsalo a nahradilo 100 ul čerstvo pripraveného PlcCoyovho média. Do jamiek všetkých plat sa potom pridalo llul 5 mg/ml zásobného roztoku MTT v PBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok). Po 4 hodinovej inkubácii v navlhčenej 5 X C0₂ atmosfére pri 37 °C sa do všetkých jamiek platne pridalo 100 ul 0. 04N HCI v Izopropanole a potom sa zmesi intenzívne miešali s cieľom rozpustenia formazánu produkovaného všetkými životaschopnými bunkami. Navyše bolo rozhodnuté stanoviť špecifické zložky podfrakcií prokyanidínu zodpovedné za tieto účinky.

Separačné postupy, ktoré už boli popísané pre prípravu subfrakcll. sa použili pre prípravu vzoriek pre ďalšie testovanie. Pripravilo sa päť frakcii reprezentujúcich oblasti znázorňujúce na obrázku 1 a distribúciu zložky a zložiek znázornenú na obrázku 4A až 4E. Vzorkám sa priradili kódy ΙΊΙΊ2Α až I*II*I2E, ktoré odrážajú ich analytické vlastnosti a označujú neprítomnosť kofeínu a teobromlnu.

Pre každú frakciu sa jednotlivo zisťovala účinnosť proti HCT-116. PC-3 a ACHN rakovinovým bunkovým líniám. Výsledky neukázali účinnosť žiadnej zo špecifických frakcií. Tento výsledok je možné považovať za neobvyklý. pretože zložky v aktívnych prírodných produkčných izolátoch sa môžu chovať synergicky. V prípade kakaového prokyanidlnového izolátu C 1*11*12) Izolát obsahoval viac ako 20 detegovateľných zložiek. Predpokladalo sa. že je možné. aby sa účinnosť týkala skôr než jednotlivej zložky alebo zložiek kombinácie zložiek prítomných v rôznych frakciách. Na základe týchto výsledkov sa rozhodlo skombinovať frakcie a testy zamerané na účinnosť proti rovnakým rakovinovým bunkovým líniám sa zopakovali. Niekolko kombinácii produkovalo cytotoxické účinky proti PC-3 rakovinovým bunkovým líniám, presnejšie pre kombináciu l*IM2A a ΠΙΊ2Ε predstavovali IC_So hodnoty 40 ug/ml a pre kombinácie I*II*I2C a ΙΊΡ12Ε sa získala TC_So hodnota 20 ug/ml. Takisto bola zaznamenaná účinnosť proti HCT-116 a ACHN bunkovým líniám. ale ako v predchádzajúcom prípade, interferencie s l*ITT Indikátorom znemožnili presné pozorovanie. Zhodné experimenty sa opakovane uskutočnili HCT-116 a ACHn bunkových líniách s cieľom zlepšiť výsledné dáta. Avšak tieto výsledky nemali dôkazovú hodnotu vzhľadom na bakteriálnu kontamináciu a vyčerpanie materiálu testovanej vzorky. Obrázky 4A až 6D ukazujú závislosť odpovede od dávky medzi kombináciami kakaových výťažkov a PC-3 rakovinovými bunkami. Avšak z týchto údajov je zrejmé. že kakaové výťažky. predovšetkým kakaové polyfenoly alebo prokyanldlny majú značnú protinádorovú, protirakovinovú alebo protiriovotvarovú účinnosť. predovšetkým pokiaľ ide o ľudské rakovinové bunkové línie PC-3 (predstojnica). HCT-116 Chrubé črevo) a ACHN (obličky). Okrem toho tieto výsledky naznačujú, že za účinnosť proti PC-3 bunkovej línii môžu byť zodpovedné Špecifické prokyanidiriové frakcie.

Príklad 7« Protirakovinová, protinádorová alebo protinovotvarová účinnosť kakaových výťažkov (prokyanidínov)

S cieľom potvrdenia vyššie uvedených zistení a s cieľom štúdia ďalších kombinácií frakcií sa uskutočnili ďalšie porovnávacie testy. Všetky pripravené materiály a postupy boli zhodné s vyššie popísanými materiálmi a postupmi, s tou výnimkou, že sa štandardné 4 opakovania testovanej dávky zvýšili na 8 alebo 12 opakovaní testovanej dávky. Pri týchto štúdiách sa posudzovala účinnosť jednotlivých piatich kakaových prokyanidínových frakcií a ich kombinácií proti nasledujúcim rakovinovým bunkovým líniám·

HCT-116 rakovina hrubého čreva

ACHN obličkový adenokarcinóm

SK-5 melaném

KB Nazofaryngeálna/HeLa

MCF-7 rakovina prsníka

PC-3 rakovina predstojnice

A-459 pľúc

CCRF-CEM T-bunková leukémia.

Jednotlivé testy zisťovali účinnosť rôznych koncentrácii dávok (0,01 až 100 ug/ml) frakcii A, B. C. D a E (pozri obr. 4A súvisiaci popis) proti jednotlivým bunkovým testy zisťovali účinnosť rovnakých dávkových koncentrácií frakcií A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E a D+E proti jednotlivým bunkovým líniám. Výsledky týchto testov sú diskutované jednotlivo a potom v celkovom súhrne.

až 4E a s nimi líniám. Kombinačné

A. PC-3 bunková línia predstojnice

Obrázky 7A až 7H znázorňujúce typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovými frakciami a PC-3 bunkovou líniou. Obr. 7D až 7E ukazujú, že frakcie D a E boli účinné pri hodnote IC_SO 75 ug/ml. Hodnoty IC_So získané z kriviek závislosti dávka - odpoveď ďalších kombinácií prokyanidinových frakcií sa v prípade, že tieto kombinácie obsahovali frakciu D alebo E. pohybovali v rozmedzí od 60 do 80 ug/ml. Jednotlivé TC₅o hodnoty sú zhrnuté v tabulke 6.

B. KB nazofaryngeálna/HeLa bunková línia

Obrázky BA až BH znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovými frakciami a KB nazofaryngeálnou/HeLA bunkovou líniou. Obr. 8D a 8E ukazujú, že frakcie D a E boli účinné pri hodnote IC_5O 75 ug/ml. Obrázky 8f až BH znázorňujú reprezentatívne výsledky získané zo štúdie kombinácií frakcií. V tomto prípade nemá kombinácia prokyanidinových frakcií A+B žiadny účinok, pričom kombinácie frakcií B+E a D+E boli účinné pri IC₅o hodnote 60 ug/ml. TC_So hodnoty získané z kriviek závislosti dávka-odpoveď ďalších kombinácií prokyanidinových frakcii sa v prípade, že tieto kombinácie obsahovali frakciu D alebo E, pohybovali v rozmedzí od 60 do 80 ug/ml. Jednotlivé IC_So hodnoty sú zhrnuté v tabulke 6. Tieto výsledky sú v podstate zhodné s výsledkami získanými pri určovaní účinnosti proti PC-3 bunkovej línii.

C. HCT-116 bunková línia hrubého čreva

Obrázky 9A až 9H znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovými frakciami a HCT-116 bunkovou líniou hrubého čreva. Obr. 9D a 9E ukazujú, že frakcie 0 a E boli účinné pri hodnote lC_So približne 400 mg/ml. Táto hodnota sa získala extrapoláciou z existujúcej krivky. Je nutné uviesť, že sklon krivky dávka-odpoveď pre frakciu D takisto naznačuje účinnosť. Avšak pre túto frakciu sa hodnota IC_So nestanovila, pretože sklon tejto krivky bol príliš plochý na to, aby sa získali vierohodné hodnoty. Obrázky 9F až 9H znázorňujú reprezentatívne výsledky získané zo štúdie kombinácií frakcií. V tomto prípade nevykazuje kombinácia prokyanidinových frakcií B+D podstatnejší účinok, pričom kombinácie frakcií A+E a D+E boli účinné pri lC₅o hodnote 500 ug/ml, resp. 85 ug/ml. 1C_SO hodnoty získané z kriviek závislosti dávka-odpoveď ďalších kombinácií prokyanldinových frakcií v prípade. že tieto kombinácie obsahovali frakciu E, dosahovali približne 250 ug/ml. Extrapolované IC_5O hodnoty sú zhrnuté v tabuľke 6.

D. ACHN obličková bunková línia

Obrázky 10A až 10H znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovýml frakciami a ACHN obličkovou bunkovou líniou. Obr. 10A a 10E ukazujú, že žiadna jednotlivá frakcia nebola proti tejto línii úCinná. Obrázky 10F až 10H znázorňujú reprezentatívne výsledky získané zo štúdie kombinácií frakcií V tomto prípade nemá kombinácia prokyanldinových frakcií B+C žiadny účinok, pričom kombinácia frakcií A+E bola účinná pri IC_So hodnote 500 ug/ml, pričom táto hodnota sa zistila extrapoláciou z existujúcej krivky. Krivky závislosti dávka-odpoveď podobné krivke kombinácie C+D boli považované za neúčinné, pretože ich sklon bol príliš plochý. Extrapolované IC_So hodnoty pre ďalšie frakčné kombinácie sú zhrnuté v tabuľke 6.

E. A-459 pľúcna bunková línia

Obrázky 11A až 11H znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovýml frakciami a A-459 pľúcnou bunkovou líniou. V tomto teste nebol pri použitých dávkach jednotlivých frakcií ani kombinácií frakcii dosiahnutý žiadny účinok. Avšak prokyanidínové frakcie môžu mať v súvislosti s touto bunkovou líniou určitý účinok.

F. SK-5 melanúmová bunková línia

Obrázky 12A až 12H znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanidínovýml frakciami a SK-5 melanómovou bunkovou líniou. V tomto teste nebol pri použitých dávkach jednotlivých frakcii ani kombinácií frakcií dosiahnutý žiadny účinok. Avšak prokyanidínové frakcie m6žu mať v súvislosti s touto bunkovou líniou určitý účinok.

G. MCF-7 prsná bunková línia

Obrázky 13A až 13H znázorňujú typickú závislosť odpovede od dávky medzi kakaovými prokyanldlnovýml frakciami a MCF-7 prsnou bunkovou líniou. V tomto teste nebol pri použitých dávkach pri použitých dávkach jednotlivých frakcii ani kombinácii frakcii dosiahnutý žiadny účinok. Avšak prokyanidínové frakcie môžu mať v súvislosti s touto bunkovou líniou určitý účinok.

H. CCRF-CEM T-bunková línia leukémie

Pri stanovovaní účinnosti proti CCRF-CEM T-bunkovej línii leukémie sa získali krivky závislosti odpovede od dávky. Avšak mikroskopické súčty počtu buniek v závislosti od času pri rôznych koncentráciách frakcie ukázali, že 500 ug frakcie A. B a D spôsobili BO X redukciu rastu počas 4-dennej časového zdržania. Reprezentatívna závislosť odpovede od dávky je znázornená na obrázku 14.

I. Zhrnutie

ICso hodnoty získané v týchto testoch sú súhrnne uvedené v tabuľke 6. Pre všetky bunkové línie s výnimkou CCRF-CEM t-bunkovej línie leukémie. Údaje, týkajúce sa CCRF-CEM t-bunkovej línie leukémie sa z tejto tabuľky zámerne vynechali, pretože pri ich stanovovaní bol použitý iný testovací postup. Všeobecné zhrnutie týchto výsledkov ukazuje, že najviac účinností je spojenej s frakciami D a E. Tieto frakcie boli najúčinnejšie proti bunkovým líniám PC-3 (predstojnica) a KB (nazofaryngeálna/HeLa). Tieto frakcie takisto vykazujú účinnosť proti bunkovým líniám HCT-116 Chrubé črevo) a ACHN (obličky), ale len pri podstatne vyšších dávkach. Proti bunkovým líniám MCF-7 (prsník). SK-5 (melanóm) a A-549 (pľúca) nebola zistená žiadna účinnosť. Avšak prokyanidínové frakcie môžu byť v súvislosti s týmito bunkovými líniami použité. Takisto sa dokázala účinnosť proti bunkovej linii CCRF-CEPI <T-bunková leukémia). Je nutné uviesť, že frakcie D a E sú kompozične najkomplexnejšie, avšak z týchto výsledkov je zrejmé, že kakaové výťažky, predovšetkým kakaové prokyanidíny majú značnú protirakovinovú, protinádorovú alebo protinovotvarovú účinnosť.

Tabuľka 6

ICso hodnoty pre frakcie kakaových prokyanidínov proti rôznym bunkovým líniám (TC₅o hodnoty v ug/ml)

Frakcia	PC-3	KB	HCT-	-116	ACHN MCF-7 SK-5	A-549
A
B
C
D	90	80
E	75	75	400
A+B
A+C	125	100
A+D	75	75
A+E	90	75	500		500
B+C			•
B+D	75	80
B+E	60	65	200
C+D	80	75			1 000
C+E	80	70	250
D+E	8	60	85
Hodnoty	vyššie	ako	100	ug/ml	sa extrapolovali z	kriviek

závislosti odpovede od dávky.

Príklad 8» Protirakovinová, protinádorová alebo protinovotvarová účinnosť kakaových výťažkov (prokyanidínov)

S cieľom skompletizovania a rozšírenia výsledkov získaných v príkladoch G a 7 sa použilo niekoľko ďalších ln vitro skúšobných testovacích postupov.

Metóda A. Test kryštalického fialového zafarbenia

Všetky ľudské nádorové bunkové línie sa získali z americkej zbierky typových kultúr. Bunky sa nechali rásť vo forme monovrstiev v IMEM obsahujúcom 10 X plodového bovinného séra bez antibiotík. Bunky sa udržiavali v navlhčenej 5 X CO_a atmosfére pri teplote 37 °C.

Po trypsinizácii sa bunky sčítali a nastavili na koncentráciu 1 000 až 2 000 buniek/100 ul. Bunkové bujnenie sa určilo očkovaním buniek (1 000 až 2 000 buniek/jamka) na 96-jamkovú mikrotitračnú platňu. Po pridaní 100 ul buniek sa bunky nechali 24 hodín prichytiť. Na konci periódy sa do jamiek pridali rôzne kakaové koncentráciách s cieľom získania závislosti Kakaové frakcie sa rozpustili v médiu tejto 24-hodinovej frakcie v rôznych odpovede od dávky, pri dvojnásobnej koncentrácii a vždy do troch jamiek sa pridalo 100 ul príslušného roztoku obsahujúceho zhodnú frakciu v zhodnej koncentrácii. Počas nasledujúcich dní sa platne zafarbovali 15 minút 50 ul kryštalickej fialovej (2,5 g kryštalickej fialovej rozpustenej v 152 ml metanolu a 375 ml vody). Zafarbenie sa odstránilo a platňa sa opatrne ponorila do studenej vody z dôvodu odstránenia zafarbenia. Premývanie sa zopakovalo ešte dvakrát a platne sa nechali vyschnúť. Zvyšné zafarbenie sa rozpustilo pridaním 100 ul 0. IM cltrátu sodného a 50 X etanolu do každej jamky. Po rozpustení sa počet buniek vypočítal na platňovom čítači ELISA pri 540 nm (referenčný filter pri 410 nm). Výsledky z čítača ELISA sa vyniesli do grafu tak. že na os Y sa vyniesla absorbancia a na os X dni rastu.

Metóda B: Test klonovania mäkkého agaru

Bunky sa klonovali v mäkkom agare pri použití metódy, ktorú popísal Nauata H.. Chong M.T.. Bronzert D. a Lippman M.E. v článku Estadiol-Independent Grouth of a Subline of MCF-7 Human

Cancer Celie in Culture“, J. Diol. Chem., 256:13, 3 895-6 902 (1981). Jednotlivé bunkové suspenzie sa pripravili pridaním rôznych koncentrácii kakaových suspenzii do média obsahujúceho 0,8 X agaru. Suspenzie sa rozdelili rovnako do 35 mm nádobiek potiahnutých médiom obsahujúcim 1,0 % agaru. Po desaťdennej inkubácii sa stanovil na zobrazovacom analytickom systéme Omnicron 3 600 počet kolónii. ktorých priemer bol väčší ako 60 um. Výsledky boli vynesené do grafu, pričom na osi Y bol vynesený počet kolónii a na osi X koncentrácia kakaových frakcii.

ľletóda C: XTT mikrokultúrny tetrazoliový test

Na testovanie rôznych kakaových frakcii sa použil XTT testovací postup, ktorý popisuje Scudiero D.A.. Shoemaker R.H., Paull K.D., Nonks A.. Tierney S.. Nofziger T.H.. Currens N.J., Seniff D. a Boyd PI. R. v článku Evalutlon of a Soluble

Tetrazolium/Formazan Assay for Celí Grouth and Drug Senzitivity in Culture Using Human and Other Tumor Celí Lines. Canur Research, 48. 4 822-4 833 (1988). XTT test s v podstate zhodoval s testom využívajúcim NTT postup (príklad 6), s výnimkou nasledujúcich modifikácií. XTT ((2. 3-bis(2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-C(fenylamino)karbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid) sa pripravil v koncentrácii 1 mg/ml média bez séra a predhrial sa na 37 “C. PI*IS sa pripravilo ako 5 mN PBS. XTT a PNS sa zmiešali dokopy a do každej Jamky sa pridalo 10 ul PNS na ml XTT a 50 Ul PNC-XTT. Po štvorhodinovej inkubácii pri 37 °C sa platne premiešavali 30 minút na mechanickej trepačke a potom sa zmerala absorbancia pri 450 až 600 nm. Výsledky sa vyniesli do grafu, pričom absorbancia sa naniesla na os Y a dni rastu alebo koncentrácia na os X.

Výsledky získané použitím metódy A a C sa takisto vyniesli do grafu ako X kontrolnej vzorky (na osi Y) v závislosti do dní rastu alebo koncentrácie (os X).

Na porovnanie XTT testovacieho postupu a kryštalického fialového postupu. kde sa malo určiť. ktorý test je citlivejší.

sa použila kakaová frakcia D&E (príklad 3B) proti prsnej rakovinovej bunkovej línii ľlCF-7 plGB. Ako ukazuje obrázok 15A. obidva testy vykazujú pri koncentráciách vyšších ako 75 ug/ml rovnaké závislosti odpovede od dávky. Pri koncentráciách nižších ako táto hodnota vykazuje kryštalický fialový test vyššie štandardné odchýlky ako výsledky testu XTT. Avšak pretože je kryštalický fialový test ľahší na použitie, uskutočňovali sa všetky nasledujúce testy. pokiaľ nie je uvedené nieCo iné. pomocou tejto metódy. Výsledky kryštalického fialového testu Cobr. 15B až 15E) majú demonštrovať účinky surového polyfenolového výťažku (príklad 2) na prsnú rakovinovú bunkovú líniu MDA MB231, PC-3 rakovinovú bunkovú líniu predstajnice. MCF-7 pl63 prsnú rakovinovú bunkovú líniu a cervikálnu rakovinovú bunkovú liniu Hela. Vo všetkých prípadoch dávka 250 ug/ml úplne inhibovala všetok rakovinový bunkový rast počas 5 až 7 dní. Zdalo sa, že Hela bunková línia je na výťažok citlivejšie, pretože bunkový rast už inhibovala dávka 100 ug/ml. Kakaové frakcie z príkladu 3B sa testovali proti Hela bunkovej línii a proti ďalšej SKBR-3 prsnej rakovinovej bunkovej línii. Tieto výsledky (obr. 15F a 15G) ukazujú, že frakcia D&E má najvyššiu účinnosť. Ako ukazuje obrázok 15H a 151. hodnoty IC_So pre frakciu D a A dosahovali pre obdive rakovinové bunkové línie približne 40 ug/ml.

Kakaová frakcia D&E sa takisto testovala použitím testu klonovania v mäkkom agare, ktorý určil schopnosť testovanej zlúčeniny alebo zlúčenín inhibovať ukotvený nezávislý rast. Ako ukazuje obrázok 15J, koncentrácia 100 ug/ml tejto frakcie úplne inhibuje tvorbu kolónie buniek Hela.

Proti línii Hela celí sa takisto testovali surové polyfenolové výťažky získané z ôsmich rôznych kakaových genotypov reprezentujúcich tri záhradnícke odrody kakaa. Ako ukazuje obrázok 15K, všetky rôzne varianty kakaa vykazovali podobnou odpoveďou účinnosť v závislosti od dávky. UIT-1 variant vykazoval najväčšiu účinnosť proti linii buniek Hela. Tieto výsledky ukazujú. že všetky kakaové genotypy zahrnujú polyferiolovú reakciu, ktorá vykazuje účinnosť aspoň proti jednej línii ľudskej rakovinovej bunky, ktorá je nezávislé od geografického pôvodu, poľnohospodárskej odrody genotypu.

Ďalšie série testov sa uskutočnili na surových polyfenolových extraktoch pripravených z jednej tony tradičných brazílskych kakaových bôbov, päť dní fermentovaných a potom 4 dni sušených na slnku. Výsledky na obrázku 15L ukazujú, že extrakty v týchto skoro spracovaných štádiách nevykazujú Žiadne účinky, čo svedčí o malej zmene v zložení polyfenolov. Avšak je známe, že CLehrian, D.U., Patterson G.R., In Biotechnology; Reed G., ed.s Verlag Chemle: Uelnheim, 1983, zväz. 5, kap. 12.) polyfenoloxidáza CPPG) oxiduje počas fermentácie polyfenolmi. S cieľom zistenia vplyvov. ktoré by mohli mať vplyv na účinnosť enzymatlcky zoxidovaných polyfenolov, sa uskutočnili ďalšie testy. Surová PPG sa pripravila extrahovaním jemne namletých, nefermentovaných, vymrazených, odtučnených brazílskych kakaových bôbov s acetónom v pomere 1 mg prášku na 10 ml acetónu. Získaná suspenzia sa odstreďovala pri 3 000 ot/min. počas 15 minút. To sa opakovalo trikrát. pričom sa každý raz odstránil supernatant a štvrtá extrakcia sa preliala cez Buchnerov filtračný lievik. Získaný acetónový prášok sa nechal vysušiť vzduchom a potom sa podrobil testu popísanému McLordom J.D. a Kilarom A., v článku Control of Enzymatic Brouning in Processed ľlushrooms (. Agarlcus B is poruš)'¹ J. Food Sci.. 48:1 479 C1983) . Do roztoku surových polyfenolov C100 mg/ml Citráto-f osf átového pufra, O. 021*1. pH 5, 5) 100 mg acetónového prášku <4 000 u/mg proteínu) sa pridalo a nechalo 30 minút miešať prúdom vzduchu prebublávajúcim cez suspenziu. Vzorka sa odstreďovala pri 5 000 xg 15 minút a supernatant extrahoval 3x 20 ml etylacetátu. Etylacetátové výťažky sa zlúčili, vysušili destiláciou pri čiastočnom vákuu a po pridaní 5 ml vody sa lyofilizovali. Pripravený materiál sa testoval proti bunkám Hela a závislosť odpovede od dávky sa porovnala s tou istou závislosťou surových polyfenolových výťažkov, ktoré neboli! enzymatlcky ošetrené. Výsledky C obr. 151*1) ukazujú značný posun na krivke odpoveď-dávka pre enzymatlcky zoxidovaný výťažok. čo ukazuje. že zoxidované produkty sú účinnejšími irihibítormi než ich prirodzené Formy.

Príklad 9» Antloxidačné účinnosť kakaových výťažkov obsahujúcich prokyanidiny

Literatúra uvádza vzťah medzi spotrebou prirodzene sa vyskytujúcich antioxidantov (vitamínov C. E a B-karoténu) a nižším výskytom chorôb zahrnujúcich rakovinu (Deslgning Foods, Planipulating Foods to Promote Health, Inform, 4«4, 344—369 (1993)). Všeobecne sa uvažuje, že tieto antioxldanty ovplyvňujú určité oxidačné a voľnoradikálové procesy, vrátane niektorých typov nádorového pôsobenia. Okrem toho, niektoré rastlinné polyfenolové zlúčeniny, ktoré sú známe ako antikarcinogénne, takisto vykazujú silné antloxidačné účinky (Ho a kol.. 1992, Huang a kol. 1992).

S cieľom stanovenia. či kakaové výťažky obsahujúce prokyanidiny vykazujú antloxidačné vlastnosti, sa použila štandardná Ranclmatová metóda. Postupy popísané v príkladoch 1. 2 a 3 sa použili na prípravu kakaových výťažkov, ktoré boli ďalej spracúvané tak, že poskytli dve frakcie gélovej permeačnej chromatografie. Tieto dve frakcie sú aktuálne skombinované frakcie A až C a D a E (pozri obr. 1), ktorých antloxidačné vlastnosti sa porovnávali s antioxidačnýml vlastnosťami syntetických antioxidantov BHA a BHT.

Z nepražených arašidových orechov sa vylisoval po odstránení šupiek arašídový olej. Každá testovaná zlúčenina sa naočkovalo do oleja v dvoch koncentráciách, tj. približne 100 ppm a 20 ppm. pričom aktuálne koncentrácie sú uvedené v tabuľke 7. Do každej vzorky sa pridalo 50 ul metanolom solublllzovaného antioxidantu s cieľom pomôcť dispergácii uvedeného antioxidantu. Kontrolná vzorka sa pripravila z 50 ul metanolu neobsahujúceho antioxldant.

Pre každú vzorku sa testovala použitím Rancimatového stabilizačného testu oxidačná stabilita pri 100 °C a 20 cm³/min vzduchu. Testovacie parametre sa zvolili tak. aby zodpovedali parametrom použitým pri ľletóde aktívneho kyslíka (AÍ'JM) alebo Sulftovmu testu stability (Van Oosten C.U., Poot C. a Hensen A.C., The Precision of teh Suift Stability Test, Fette, Seífen, Anstrichmittel, 83.4, 133-135 (1981)).

Typická Rancimátová stopa je znázornená na obrázku 18. Výsledky testov je uvedené v tabuľke 8 ako hodiny potrebné na to. aby bola dosiahnutá peroxidová úroveň 100 meq.

Tabuľka 7

Koncentrácia antioxidantov

Vzorka	Koncentrácia	1 Koncentrácia ppm
Butyrovaný hydroxytoluén	(BHT)	24	120
Butyrovaný hydroxyanizol	(BHA)	24	120
Surová etylacetátová frakcia kakaa	22	110
Frakcia A-C		20	100
Frakcia D-E		20	100

-Tabuľka 8

Oxidačná stabilita oleja z podzemnice olejnej s rôznymi antioxidantml

Vzorka 20 ppm 100 ppm

Priemer

Kontrolná

Butyrovaný hydroxytoluén (BHT) Butyrovaný hydroxyanizol (BHA) Surová kakaová frakcia Frakcia A-C

Frakcia D-E

1. 5U ±0.7
16. 5	+	2. 1	12. 5	+	2. 1
13. 5	+	2.1	14. 0	+	1.4
18. 0	+	0, 0	19. 0	+	1. 4
16, 0	±	6. 4	17,5	+	0. 0
14. 0	+	1.4	12. 5	+	0.7

výsledky demonštrujú oleja so všetkými zvýšeniu oxidačnej

Tieto arašídového najvyššiemu naočkovanej demonštrujú.

zvýšenú oxidačnú stabilitu testovanými aditivami. K stability došlo u vzorky surovým etylovým výťažkom kakaa. Tieto výsledky že kakaové výťažky obsahujúce prokyanidíny majú antloxldačný potenciál rovný zhodným množstvám syntetického BHA a BHT alebo vyšší. V súlade s vynálezom je možné kakaové výťažky použiť namiesto BHA a BHT, napríklad ako antloxidant a/alebo potravinárske adítívum. A v tomto ohľade je nutné uviesť, že vynález je z jedlého zdroja. Na základe týchto výsledkov môže odborník v danom obore takisto ľahko určiť vhodné množstvo extraktov pre takéto aplikácie, napr. množstvo pridávané do potravín bez zbytočných experimentov.

Príklad 10» Štúdia inhibície Topoizomerázy II

DNA topoizomerázy I a II sú enzýmy. ktoré katalyzujú Štiepenie a opakované spájanie DNA reťazcov a tým kontrolujú topologlcké stavy DNA (Uang J.C.. DNA Topoisomerases, Ann. Rev. Biochem.. 54, 665-697 C1965)).

Okrem štúdie intracelulárnej funkcie topoizomerázy bolo jedným z najpodstatnejších nálezov označenie topoizomerázy II za primárny bunkový cieľ pre mnohé klinicky dôležité protinádorové zlúčeniny (Yamashita Y., Kauada S.Z. a Nakano H., Induction of Mammalian Topolsomerase II Dependent DNA Cleavage by Monintercalative Flavanoids, Genostein and Orbol., Biochem Pharm, 39»4, 737-744 (1990)) zahrnujúcich vnútorne katalytické činidlá (m-AMSA. Adriamycín a ellipiticín). rovnako ako aj vnútorne nekatalytické epipodofyllotoxíny. Niekoľko línií ukazuje, že spoločnou vlastnosťou niektorých protinádorových liečiv je stabilizácia komplexu DNA-topolzomerázy II Cčistiaceho komplexu), ktorý o vystavení denatúrujúcim činidlám vedie k indukovaniu DNA štiepenia (Muller 1*1.T.. Helal K., Soisson S a Spltzer, J.R.. A Rapld and Ouantltative Microtiter Assa for Eukaryotíc Topolsomerase II, Nuc. Acid. Res., 17»9 499 (1989)). Zistilo sa, že tvorba čistiaceho komplexu spočívajúca v tom. že protinádorové liečivá produkujú objemné DNA aduktov, vedie k zahubeniu buniek.

V súlade s týmto príťažlivým modelom sa použil nový špecifický induktor čistiaceho komplexu DNA-topaizomerázy II ako protinádorové, protirakovinové a protinovotvarové činidlo. Pri pokusoch identifikovať aktivity cytotoxickej zlúčeniny, ktorých cieľom je DNA, sa testovali zvýšené cytotoxlcké účinky kakaových prokyanldov proti niekoľkým bunkovým líniám citlivým na poškodenie DNA a uskutočnil sa enzymatlcký test pri použití ľudskej topoizomerázy II získanej z lymfómu.

A. Dekantácia klnetoplastickej DNA topoizomerázou

Inhibícia topoizomerázovej II dekantácie kinetoplastovej DNA in vitro sa určila podľa Mullera 1*1.T., Helala K., Soissona S a Spitzera, J.R.. A Rapid and Quantltative Microtiter Assa for Eukaryotic Topoisomerase II, Nuc. Acid. Res., 17s9 499 C1989)) nasledujúcim spôsobom. Z ľudského lymfómu sa modifikáciou metód Millera K.G., Lia L.F a Englunga P.A., Homogenous Type II DNA Topoisomerase from Hela Celí Nuclei. J. Biol. Chem., 256:9 334 C1981) a Danksa 1*1.K., Schmidta C.A., Cirtaina 1*1.C., Sutlea D.P. a Becka U.T., Altered Catalytic Activity of and DNA Cleavage by DNA Topoisomerase II from Human Leukemlc Cells Selected for Resistance to Vľl-26, Biochem., 27:8 861 (1988) pripravili jadrové extrakty majúce topoizomerázovú I účinnosť. Jedna jednotka čisteného enzýmu bola dostatočná pre dekantáciu 0,25 ug kinetoplastovej DNA počas 30 minút pri 34 °C. Kinetoplastová DNA sa získala z trypanozómu Críthidia fascículata. Každá reakcia sa uskutočňovala v 0,5 ml mikrocentrlfugovej skúmavke obsahujúcej 19.5 ul H_s0. 2.5 ul desaťnásobku pufra (jeden násobok pufra obsahuje 50 ml*l tris-HCl, pH 8,0, 120 ml*l KC1. 10 mM MgCl_a, 0.5 mM ATP, 0,5 mM ditiotreitolu a 30 ug BSA/ml), 1 ul kinetoplastovej DNA (0.2 ug) a 1 ul DMSO - s obsahom rôznych koncentrácií kakaových prokyanldínových frakcií. Táto kombinácia sa dokonale premiešala a udržiavala v ľade. Jedna jednotka topoizomerázy sa pridala bezprostredne pred Inkubáciou do vodného kúpeľa s teplotou 34 °C. kde sa nechala 30 minút.

Po inkubácii sa dekatenačný test zastavil pridaním 5 ul koncového pufra (5% sarkozylu. 0.0025X0 brómfenolovej modrej. 25X glycerolu) a vzorka sa umiestila na ľad. DNA sa podrobila na IX agarúzovom géle elektroforéze v TAE pufri obsahujúcom etidiumbromid (0,5 ug/ml). Osvetlenie UV pri 310 nm vlnovej dĺžke umožnilo vizualizáciu DNA. Gély sa vyfotografovali použitím fotoaparátu Polaroid Land.

Obr. 17 ukazuje výsledky týchto experimentov. Úplne katenovaná kinetoplastická DNA nemigrovala do IX agarúzového gélu. Dekantácia kinetoplastovej DNA topoizomerázou II generuje pásy monomérnej DNA (monomérny kruh. formy I a II), ktoré migrujú do gélu. Inhibícia enzýmu pridaním kakaových prokyanidinov sa prejavuje na postupnom vymiznutí monomérnych pásov. ako vzrastajúca koncentrácia. Z týchto výsledkov vyplýva. že prokyanidínové frakcie A. B, D a E inhibujú topoizomerázu II pri koncentráciách pohybujúcich sa v rozmedzí od 0. 5 do 5, 0 ug/ml. Tieto inhibičné koncentrácie boli veľmi podobné koncentráciám získaným pre mitoxantron a m-AI*ISA C 4’ -O-akridlnylamino)metánsulfón-m-anizidid].

B. Bunkové línie citlivé na liečivo

Zisťovala sa cytotoxicita kakaových bôbov proti niekoľkým bunkovým líniám DNA citlivých na poškodenie. Jednou z týchto bunkových línii bol mutant opravujúci rozštiepenie dvojitého reťazca xrs-6 DNA vyvinutý P. Jeggoom P.A., Caldecottom K., Pidsleyoín S. a Banskom G.R., v článku Sensitivity of Chinese Hamster Ovary Mutants Defective in DNA Double Strand Break Repair to Topoisomerase II Inhibitors, Cancer Res.. 49:7 057 (19B9) (Kemp L.ľl., Seduick S.G. a Jeggo P.A., X-ray Sensltive Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells Defective in Double Strand Break Rejoing. Mutant. Res., 132:189 (1984)). DNA opravná deficiencia xrs-G bunkovej línie udeľuje zlúčeninám, ktoré produkujú štiepenie DNA dovjltého reťazca, napríklad bleomyclnu. a zlúčeninám, ktoré inhibujú topoizomerázu a môžu tak vyvolávať štiepenie dvojitého reťazca nepriamo, citlivosť predovšetkým voči räntgenovému žiareniu (Uarters R.L.. Lyons B.U... Li T.H. a Chen D.J.. Topoisomerase II Activity a DNA Double-Strand Break Repair Deficient Chinese Hamster Ovary Celí Line. Mutant. Res.. 254:167 (1991)). Cytotoxicita proti deficientnej línii sa porovnala s cytotoxicitou proti COH línii schopnej opraviť DNA, BR1. Zvýšená cytotoxicita proti pre opravu deficientnej (xrs-6) línii sa interpretovala ako evidencia vzniku štiepenia DNA štiepiteľného dvojitého reťazca.

Na opravu DNA kompetentnej CHO línie BR1 bola vyvinutá Barrousom, L.R., Borchersom, A.H. a Palxtonom, 1*1.B., Transfectant CHO Celia Expressing D^A-alkylguanine-DNA-alkyltransferase Dlsplay Increased Reslstance to DNA Damage Other than O^A-guanine Alkylatlon, Carcinogenesls. 8«1 853 (1987).

O^Ä-alkylguanín-DNA-alkyltransferázu, okrem opravujúcich enzýmov. Obidve tieto monovrstvy v alfa-l*ll*l obsahujúcom popisuje príklad 6. Bunky boli udržiavané v navlhčenej 5% C0_a atmosfére pri 37 °C. Pred ošetrením kakaovými prokyanidmi sa bunky rastúce ako monovrstvy spojili použitím trypsinového ošetrenia. Testy sa uskutočňovali použitím ΓΤΤΤ testovacieho postupu popísaného v príklade 6.

ktorá exprimuje normálnych DNA línie sa nechali rásť ako sérum a antibiotiká, ako

Výsledky (obr. 18) nenaznačujú žiadne zvýšenie cytotoxicity proti xrs-6 bunkám, čo ponúka možnosť, že kakaové prokyanidy pre Inhibíciu topoizomerázy II využili iný spôsob než štiepenie štieplteľného dvojitého reťazca. To znamená, že kakaové prokyanidy vzájomne vnútorne reagovali s topoizomerázou II pred tým, ako reagoval s DNA za vzniku nerozštiepiteľného komplexu.

Zlúčeniny tvoriace nerozštiepiteľný komplex sú relatívne novým objavom. Členovia antracyklínov. podofylinných alkaloidov, antracéndiénov. akridínov elllpticinov sú využívaní pre klinické protinádorové, protirakovinové alebo antineoplastlcké aplikácie a produkujú štieplteľné komplexy (Liu L.F.. DNA Topoisomerase

Poiscíns as Antitumor Drugs, Ann. Rev. Biochem., 58? 351-375 (1989)5. Nedávno bolo identifikovaných niekoľko inhibítorov topoizomerázy II, ktoré, ako sa zdá, neprodukujú Stiepiteľné komplexy. Tieto inhibítory zahrnujú amonafld (Hsiang I.H., Jiang

J.B. a Liu L.F., Topoisomerase II Mediated DNA Cleavage by Amonaside and Its Structural Analogs, ľlol. Pharmacol., 36, 371-376 (1989)). dístarnycin (Fesen M. a Pommier Y., Mammarial topoisomerase II Activity is Modulated by the DNA Plinor Groove Binder - Distainycin in Slmian Virus 40 DNA, J. Blol. Chem., 264111 354-11 359 (1989)). flavanoldy (Yamashita Y., Kauada S.Z. a Nakano H., Induction of Mammalian Topoisomerase II Dependent DNA Cleavage by Plonintercalatlve Flavanolds, Genostein and Grbol., Biochem Pharm, 39s4, 737-744 (1990)), saintopin (Yamashita Y.. Kauada S.Z., Fujll N. a Nokano H., Induction of Plammalian DNA Topoisomerase I and II Plediated DNA Cleavage by Saintopin, a Neu Antitumor Agent from Fungus, Biochem., 30, 5 838-5 845 (1991)), membraanon (Drake F.H., Hofmann G.A., Plong S.PI., Bartus J.O., Hertzberg R.P., Johnson R.K., Platten PI.R. a Plirabelli C. K., In vitro and Intercellular Inhibition of topoisomerase II by the Antitumor Agent Plembranone Cancer Research, 49, 2 578-2 583 (1989)), terpenoidy (Kauada S.Z., Yamashita Y.. Fujii N. a Nakano H., Induction of Head Stable Topoisomerase II-DNA · Cleavable Complex by Nonintercalative Terpenoids. Terpetecin and Clerocidin, Cancer Research , 51, 2 922-2 929 (1991)), antrapyrazoly (Fry D.W.. Boritzki T.J.. Besserer J.A. a Jackson R.C., In vitro Strand Scisslon and Inhibition of Nucleic Acid Synthesis on L1210 Leukémia Cells by a Neu Class of DNA Complexes, the Anthra Cl, 9-CD)Pyrazol-6(2H)-ones (Anthrapyrazoles), Biochem., Pharmacol., 34, 3 499-3 508 (1985)), dioxoplperaziny (Tanabe K., Ikegami Y., Ishda R. a Andoh T.. Inhibition of Topoisomerase II by Antitumor Agents bis (2.6-dioxopiperazine) Derivates, Cancer Research, 51, 4 903-4 908 (1991)) a námorný akridin-dekricín (Burres N.S., Sazesh J., Gumauardana G.P. a Clement J.J., Antitumor Activity and Nucleic Binding Properties of Dercitin, a Neu Acridine Alkaloid Isolated form a Marine Der-citus Specles Sponke, Cancer Research, 49, 5 267-5 274 (1989)).

Pretože kakaové prokyanidiny inaktivujú pred vznikom štiepiteľných komplexov topoizomerázu II. majú buď samotné, alebo v kombinácii s ďalšími známymi a mechanisticky definovanými inhibítormi topoizomerázy II určitú chemoterapeutickú hodnotu. Okrem toho sa takisto zdá, že kakaové prokyanidy sú novou triedou inhibitorov topoizomerázy II C Kashiuada Y.. Nonaka G.I.. Nishioka I.. Lee K.J.H.. Borí I., Fukushima Y.. Baštou K.F a Lee

K.H.. Tannin as Potent Inhibitors of DNA Topolsomerase II in vitro. J. Pharm. Sci., 82»5. 487-492 (1993)) a mohli by byť teda menej toxické voči bunkám, než ďalšie známe inhlbltory. čim by sa zvyšovala ich použiteľnosť pri chemoterapii.

Parenterálne línie PICF-7 pl68 Bunkovej línie PICF-7 (ADR) ľudskej prsnej rakoviny. ktorá exprimuje glykoproteín (gp 170) viazaný na membránu, ktorý vykazuje rezistenciu voči viacerým liečivám (Leonessa F.. Jacobson M., Boile L.. Lippman J.. PIcGarvey 1*1. a Čiarke R., Effect of Tamoxifer on the Plultidrug-Resistant Phenotype in Human BreastCancer Cells s Isobolograms, Drug Accumulation. and 1*1170. 000 Glycoprotein (gp 170) Binding Studies, Cancer Research, 54, 441-447 (1994)) sa použili na testovanie účinkov kakaovej frakcie D&E. Ako ukazuje obrázok 19, parenterálne línia bola inhibované pri zvyšujúcich sa dávkových koncentráciách frakcie D&E, zatiaľ čo Adriamycínová (ADR) rezistentná línia bola pri vyšších dávkach menej účinná. Tieto výsledky ukazujú. že kakaová frakcia D&E má vplyv na bunkové línie odolné voči väčšiemu počtu liečiv.

Príklad 11« Syntéza prokyanídínov

Syntéza sa uskutočňovala postupom, ktorý vyvinul Delcour

J.A.. Ferreira D. a Rouks D.G. a je popísaný v Synthesis of Condensed Tannins. Part 9, The Condensatlon Sequenee of Leucocyanldin uith (+)-Catechin and ulth the resultant Procyanidins. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., 1 711-1 717 (1983) a ktorý sa uskutočňoval bez ďalších modifikácií. Okrem kondenzovania (+)-katechínu s dihydrokvercetínom pri redukujúcich podmienkach, sa takisto použil (-)-epikatechín s cieľom reflektovať vyššie koncentrácie (-)-epikatechínu než ako sú prirodzene obsiahnuté v produkty syntézy sa identifikovali postupmi nefermentovaných kakaových bôboch. Tieto izolovali. Čistili, analyzovali a popísanými v príkladoch 3. 4 a 5. Týmto spôsobom sa pripravili biflavanoidy. triflavanoidy a tetraflavanoldy a tie sa použili ako štandardy spôsobom popísaným vyššie v súvislosti s kakaovými výťažkami.

Príklad 12» Test normálnych fázových polopreparatívnych frakcií

Vzhľadom na to, že sú polyfenolové výťažky kompozičnými komplexmi, je nevyhnutné urCiť. ktoré zložky boli pri Čistení, testoch dávka-odpoveď a obsiahlej štruktúrnej Identifikácii aktívne proti líniám rakovinových buniek. Na separovanie kakaových prokyanldlnov s bázou s ollgomérnou veľkosťou sa použila polopreparatlvna HPLC separácia (príklad 3B) s normálnymi fázami. Okrem pôvodného výťažku sa pripravilo 12 frakcii (obr. 2B a 150) a tie sa testovali v dávkach 100 ul/ml a 25 ul/ml proti Hela bunkovej línii s cieľom urCiť, ktorý ollgomér vykazuje najvyššiu aktivitu. Ako ukazuje obr. 20, frakcie 4 až 11 (pentamér až dodekamér)' vykazujú IC₅o hodnoty približne 25 ul/ml. Tieto výsledky ukazujú. že tieto špecifické ollgoméry majú najvyššiu úClnnosť proti Hela bunkám. Okrem toho,

HPLC analýza kakaovej frakcie D&E ukázala, že obohatená uvedenými špecifickými oligomérmi.

normálna fázová táto frakcia je

Z predchádzajúceho je zrejmé, že tento kakaový výťažok a kakaové polyfenoly, rovnako ako spôsob ich výroby a sada podľa vynálezu, sú využiteľné. V tomto ohľade je potrebné uviesť, že vynález pochádza z jedlého zdroja a účinnosť in vitro môže demonštrovať aspoň dajakú účinnosť in vivo, predovšetkým ak sa zoberú do úvahy vyššie diskutované dávky.

Okrem toho, vyššie uvedený popis ukazuje, že kakaový výťažok a kakaové polyfenoly, rovnako ako aj ich kompozície, spôsob ich výroby a sadá podľa vynálezu, majú antioxidačnú účinnosť zhodnú s účinnosťou BHT a BHA a rovnako tak aj oxidaCnú stabilitu. Takže vynález je možné takisto použiť namiesto BHT alebo BHA v známych aplikáciách BHA resp. BHT. ako antloxldant. napríklad antloxldaCné potravinové adltlvum. Vynález je možné takisto použiť namiesto Inhlbltorov topoizomerázy pri v súCasnostl známych aplikáciách. V súlade s tým vynález ponúka mnohé kompozície a spôsoby. napríklad antloxldaCné alebo konzervačné kompozície. kompozície Inhibujúce topolzomerázu. spôsoby konzervácie potravín alebo ľubovoľných požadovaných výrobkov, napríklad pred oxidáciou a spôsoby inhibovania topoizomerázy. ktoré zahrnujú buď výťažok kakaa a/alebo kakaový polyfenol alebo polyfenoly, alebo ktoré zahrnujú uvedenie potravín, výrobkov alebo topoizomerázy do kontaktu s príslušnou kompozíciou alebo s kakaovým výťažkom a/alebo kakaovým polyfenolom alebo polyfenolml.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. V podstate čistý kakaový výťažok alebo syntetický polyfenol alebo polyfenoly, vyznačujúci sa tým, že obsahuje oligoméry 3 až 12 polyfenolu alebo polyfenolov.
2. 2. V podstate čistý kakaový výťažok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým. že je vyrobený spôsobom zahrnujúcimi redukovane kakaových bôbov na prášok, odtučnenie prášku a extrahovanie a čistenie kakaového polyfenolu alebo polyfenolov z prášku.
3. 3. V podstate čistý kakaový výťažok podľa nároku 2. vyznačujúci sa tým. že spôsob redukovania kakaových bôbov na prášok zahrnuje:

   vymrazovanie bôbov a dužiny, zbavenie vymrazenej hmoty dužiny, zbavenie vymrazených kakaových bôbov šupky a namletie šupiek zbavených bôbov.
4. 4. V podstate čistý kakaový výťažok podľa niektorého z nárokov 2 alebo 3. vyznačujúci sa tým, že spôsob výroby ďalej zahrnuje čistenie výťažku gélovou permeačnou chromatografiou a/alebo preparatívnou vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).
5. 5. V podstate čistý kakaový výťažok podľa nároku 1. vyznačujúci sa tým. že v podstate obsahuje oligoméry 5 až 12 polyfenolu alebo polyfenolov.
6. 6. Antioxidačná kompozícia. vyznačujúca sa tým, že obsahuje v podstate čistý kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly podľa nároku 5 a vhodný nosič.
7. 7. Antioxidačná kompozícia podľa nároku 6. vyznačujúca sa t ý m. že obsahuje kakaové prokyanidiny vyrobené spôsobom zahrnujúcim!

   redukovane kakaových bôbov na prášok, odtučnenie prášku a extrahovanie a čistenie kakaového polyfenolu alebo polyfenolov z prášku.
8. 8. Antioxidačná kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa t ý m. že spôsob redukovania kakaových bôbov na prášok zahrnuje s vymrazovanie bôbov a dužiny, zbavenie vymrazenej hmoty dužiny, zbavenie vymrazených kakaových bôbov šupky a namletle šupiek zbavených bôbov.
9. 9. Antioxidačná kompozícia podľa nároku 7 alebo 8, vyznačujúca sa tým, že spôsob výroby ďalej zahrnuje čistenie výťažku gélovou permeačnou chromatografiou a/alebo preparativnou vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).
10. 10. Sada na ošetrenie pacienta, v prípade potreby ošetrenie antineoplastickým činidlom, vyznačujúca sa tým. že v podstate obsahuje čistý kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly podľa nároku 5 a vhodný nosič.
11. 11. Sada podľa nároku 10. vyznačujúca sa tým, že obsahuje inštrukcie na zmiešavanie jednotlivých zložiek alebo informácie týkajúce sa spôsobu podacia pacientovi.
12. 12. Lyoflllzovaná antineoplastlcká kompozícia, vyznačujúca sa tým. že obsahuje v podstate čistý kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly podľa nároku 5 a vhodný nosič.
13. 13. Antioxidačná alebo konzervačná kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje v podstate čistý kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly podľa nároku 1.
14. 14. Kompozícia lnhibujúca topoizomerázu. vyznačujúca sa t ý m. že obsahuje v podstate čistý kakaový výťažok alebo syntetický kakaový polyfenol alebo polyfenoly podľa nároku 1.