PL175873B1 - Sposób rozdzielania mieszaniny dezamidowanej i niedezamidowanej ludzkiej DNazy - Google Patents

Abstract

1. Sposób rozdzielania mieszaniny dezamidowanej i niedezamidowanej ludzkiej DNazy, znamienny tym, ze poddaje sie ta mieszanine chromatografii na (i) zywicy lub na innym stalym nosniku ze zwiazanym z tym nosnikiem polimerem kationowym takim jak heparyna lub nie ulegajacy hydrolizie analog DNA, lub na (ii) czulkowej zywicy kationitowej. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Zgłoszenie niniejsze odnosi się w przedmiotowej materii do ujawnienia zawartego w International Patent Appllcdtion Publication nr WO 90/07572. Treść tego wcześniejszego zgłoszenia jest w sposdb formalny włączona do niniejszego opisu jako odnośnik.

Wynalazek niniejszy dotyczy wynikdw otrzymanych na podstawie badań przeprowadzonych z udziałem deoksyrybonukldazy (DNazy), fosfoniesterazy zdolnej do hydrolizowaniakwasu polindoksyrybonukldinowego. Dotyczy on, ogdlnie, rozdzielania rdżnych postaci wspomnianej DNazy, samych tych postaci jako takich, preparatów farmaceutycznych, dzięki ktdrym ich użyteczność można wykorzystać klinicznie oraz sposobdw użycia tych DNaz i zawierających je preparatów.

DNaza jest to fosfonidsteraza przejawiająca zdolność hydrolizowania kwasu polideoksyrybonukldinowego. DNazę oczyszcza się z rozmaitych gatuntów, w rdżnym stopniu. Pełna sekwencja aminokwasdw w przypadku DNazy ssakdw stała się po raz pierwszy dostępna w roku 1973. Patrz, na przykład, Liao i in.,J. Biol. Chem., 248, 1489 (1973).

DNaza odznacza się szeregiem znanych użytecznych właściwości i jest wykorzystywana w zastosowaniach leczniczych. Jej głdwne zastosowanie w lecznictwie polega na tym, że powoduje ona zmniejszenie lepkosprężystości wydzielin płucnych w przypadku takich chordb jak zapalenie płuc i zwłdknlenld torbielowate. W ten sposdb pomaga ona w oczyszczaniu dolnych drdg oddechowych. Patrz, na przykład, Lourenco i m., Arch. Intern. Med , 142, 2299 (1982); bhak i in., Proc. Nat. Acad. bci., 87,9188 (1990); Hubbard i in., New Engl. J. Med., 326,812 (1992).

175 873

Wyizolowano i poddano sekwencjonowaniu DNA kodujący ludzką DNazę I, oraz doprowadzono do ekspresji tego DNA w rekombinantowych komórkach-gospodarzach, umożliwiając w ten. sposób wytwarzanie ludzkiej DNazy w ilościach handlowo użytecznych. Patrz, na przykład, Shak i in., Proc. Nat. Acad. Sci., 87,9188 - 9192 (1990). Stwierdzono, że rekombinantowa ludzka DNaza (rhDNaza) jest użyteczna pod względem klinicznym, zwłaszcza w postaci oczyszczonej do takiego stopnia, w którym nie zawiera ona proteaz i innych białek, z jakimi zazwyczaj stowarzyszona jest w naturze. Patrz, na przykład, Hubbard i in., New Engl. J. Med., 326, 812 (1992).

Środki i sposoby, z wykorzystaniem których można otrzymać ludzką DNazę w postaci farmaceutycznie skutecznej, opisane są w przytoczonym powyżej zgłoszeniu patentowym. Znane sąw tej dziedzinie techniki rozmaite specyficzne sposoby oczyszczania DNazy. Patrz, na przykład, Khouw i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4065355 (wydany 27 grudnia 1977); Markey, FEBS Letters, 167, 155 (1984); Nefsky i in., Eur. J. Blochem., 179, 215 (1989).

Aczkolwiek w czasie składania wspomnianego powyżej zgłoszenia patentowego me zdawano sobie z tego sprawy, to obecnie już wiadomo, że otrzymywana z hodowli rekombinantowych komórek-gospodarzy DNaza typowo stanowi mieszaninę postaci DNazy, a mianowicie mieszaninę DNazy dezamidowanej i niedezamidowanej. Istnienie dezamidowanej postaci DNazy pozostało niedocenione, pomimo tego, że samo zjawisko dezamidacji reszt asparaginy i glutaminy w niektórych białkach jest znane. Patrz, na przykład, Eipper i in., Ann. Rev. Physiol., 50, 333 (1988); Kossiakoff, Science, 240,191 (1988); Bradbury i in. Trends in Biochem. Sci., 16,112 (1991); oraz Wright, Protein Enginee - ring, 4, 283 (1991).

Wynalazek niniejszy oparty jest na niedocenionym poprzednio fakcie, że rekombinantowa ludzka DNaza może istnieć jako mieszanina postaci dezamidowanej i postaci niedezamidowanej. Z wykorzystaniem sposobów według niniejszego wynalazku stwierdzono, że dezamidowana ludzka DNazajest w działaniu enzymatycznym mniej aktywna od niedezamidowanej ludzkiej DNazy. Toteż obecność dezamidowanej DNazy i niedezamidowanej DNazy równocześnie obok siebie w mieszaninie, a również potencjalna możliwość zajścia dalszej dezamidacji (takiej, jakiej zachodzenie stwierdzono po przechowywaniu preparatów ludzkiej DNazy in vitro), może skomplikować wysiłki zmierzające do uzyskania trwałej jednolitości otrzymanej DNazy przeznaczonej do zastosowania klinicznego. Tak więc, ponieważ samo istnienie, a także charakterystyka dezamidowanej DNazy nie były rozpoznane w dotychczasowym stanie techniki, przed niniejszym wynalazkiem, sposoby identyfikowania dezamidowanej DNazy i wydzielania jej z preparatów DNazy, w których może się ona znajdować, nie były oczywiste podczas dokonywania niniejszego wynalazku.

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest na sposoby wydzielania osobno postaci dezamidowanej i postaci niedezamidowanej ludzkiej DNazy z ich mieszaniny. W korzystnych wariantach sposobu według wynalazku, poddaje się tę mieszaninę chromatografu na żywicy, lub innym nośniku, ze związanym z nim polimerem kationowym, takim jak heparyna lub nie ulegający hydrolizie analog kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), albo chromatografii z użyciem tak zwanej “czułkowej” żywicy kationitowej. Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na zastosowanie tych metod chromatograficznych do obróbki DNaz nie pochodzących od człowieka, ale, na przykład, takich jak DNaza bydlęca.

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na dezamidowaną ludzką DNazę jako produkt oczyszczony, zasadniczo nie zawierający niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na niedezamidowaną ludzką DNazę jako produkt oczyszczony, zasadniczo nie zawierający dezamidowanej ludzkiej DNazy. Stwierdzono, że oczyszczona, niedezamidowana ludzka DNaza, w porównaniu z dezamidowaną ludzką DNazą, wykazuje pełną aktywność enzymatyczną.

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na preparaty farmaceutyczne, składające się albo z oczyszczonej dezamidowanej ludzkiej DNazy, albo z oczyszczonej niedezamidowanej ludzkiej DNazy, jako czynnika aktywnego, ewentualnie łącznie z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.

175 873

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na sposób polegający na podawaniu oczyszczonej dezamidowanej ludzkiej DNazy lub oczyszczonej niedezamidowanej ludzkiej DNazy, w ilości terapeutycznie skutecznej, w celu leczenia pacjenta, na przykład pacjenta cierpiącego na nagromadzanie się lepkiego, zawierającego DNA, materiału. Podania takich oczyszczonych DNaz, korzystnie dokonuje się przez bezpośrednią inhalację do płuc.

Wynalazek niniejszy w sposób szczególny ukierunkowany jest na sposób leczenia pacjenta cierpiącego na chorobę płucną, takąjak zapalenie oskrzeli przewlekłe, zwłóknienie torbielowate lub rozedma płuc, polegający na podawaniu oczyszczonej niedezamidowanej ludzkiej DNazy, w ilości terapeutycznie skutecznej, korzystnie bezpośrednio do dróg oddechowych.

Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest także na preparaty farmaceutyczne, zawierające niedezamidowaną ludzką DNazę znajdującą się w fiolce wykonanej z tworzywa sztucznego, ewentualnie w obecności farmaceutycznie dopuszczalnej zarobki.

Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasów (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) i sekwencję DNA (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) ludzkiej DNazy 1. Natywna sekwencja sygnałowa jest podkreślona, potencjalne kodony inicjujące zaznaczono .przez obwiedzenie, a sekwencję dojrzałą ujęto w nawiasy.

Figura 2 przedstawia korelację między aktywnością enzymatyczną a stopniem dezamidacji próbek ludzkiej DNazy. Aktywność właściwą oznaczono przez normalizację aktywności DNazy według oznaczenia metodąz zielenią metylową(MG) (wjednostkach stężenia względem krzywej wzorcowej) do stężenia DNazy zmierzonego z zastosowaniem enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA). Procent dezamidacji określono metodą mapowania trypsynowego. Próbki ludzkiej DNazy oznaczone “Dzień zebrania” oczyszczono z hodowli rekombinantowych komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) wyrażających DNA kodujący ludzką DNazę I. Próbki takie pobierano w dniu 3,5,7,9,11,13 i 20 od rozpoczęcia hodowli. Próbki oznaczone “Wysokie pH” były to próbki oczyszczonej DNazy z dnia 13, które inkubowano in vitro w ciągu 2 dni, przy pH 8, w temperaturze 37°C. Próbki oznaczone “Stabilność” były to próbki oczyszczonej DNazy z dnia 13, które przechowywano in vitro w temperaturze 5°C, 25°C lub 37°C w ciągu okresów o różnej długości.

Figura 3 jest to przykład mapy trypsynowej DNazy użytej do oznaczenia stopnia dezamidacji. Pokazana tu próbka stanowi DNazę zdezamidowaną w 65%. “mAU” oznacza milijednostki absorbancji przy 214 nm.

Figura 4 w sposób schematyczny przedstawia dezamidację reszty asparaginy w pozycji 74 sekwencji aminokwasów (Asn-74) w natywnej ludzkiej DNazie. Deamidacja prowadzi do przekształcenia Asn-74 albo w resztę kwasu asparaginowego (Asp), albo w resztę izoasparagimanu (izo-Asp). Każda z trzech postaci DNazy dostarcza, w rezultacie trawienia trypsyną, parę peptydów, co wskazuje na identyczność poszczególnych postaci DNazy.

Figura 5 jest to chromatogram próbki ludzkiej DNazy poddanej frakcjonowaniu na czułkowej kolumnie kationitowej (TCX). Pokazana tu próbka stanowi DNazę dezamidowaną w 67%.

Figura 6 przedstawia mapę trypsynową dwu szczytowych frakcji pochodzących z rozdziału metodąTCX, pokazanego na fig. 5. Nieobecność peptydu trypsynowego T6-7 z mapy produktu trawienia frakcji piku 2 wskazuje na nieobecność dezamidowanej DNazy.

Figura 7 przedstawia chromatogramy kilku próbek ludzkiej DNazy frakcjonowanych na kolumnie TCX. Próbka oznaczona “MI-28 STD” jest to preparat ludzkiej DNazy uzyskany z hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) transformowanych DNA kodującym natywną ludzką DNazę I. Próbka oznaczona “Mutant ASP DNazy” jest to DNaza zawierająca raczej resztę kwasu asparaginowego niż resztę asparaginy w pozycji 74 sekwencji aminokwasów i która ma wobec tego taką samą sekwencję aminokwasów jak postać Asp dezamidowanej DNazy, pokazana na figurze 4. Mutant ASP DNazy otrzymano z hodowli komórek transformowanych DNA kodującym tę zmutowaną postać ludzkiej DNazy. DNA kodujący Mutant ASP DNazy wytworzono na drodze ukierunkowanej pod względem miejsca mutagenezy DNA kodującego natywną ludzką DNazę Porównanie chromatogramów wykazuje, że jedna z postaci ludzkiej DNazy wM1-28 STD eluuje się z kolumny TCX w tym samym miejscu co Mutant ASP DNazy.

175 873

Figura 8 pokazuje chromatogramy kilku próbek ludzkiej DNazy frakcjonowanych na kolumnie TSK-Heparin (Toso Haas, Montgomeryville, Pennsylvania). Próbka oznaczona “12K nr 8 stanowi preparat ludzkiej DNazy otrzymany z hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) transformowanych DNA kodującym natywną ludzką DNazę I. Próbka oznaczona ”Wzorzec dezamidowany jest to oczyszczona dezamidowana ludzka DNaza. Próbka oznaczona “Wzorzec niedezamidowany” jest to oczyszczona niedezamidowana ludzka DNaza Oczyszczoną dezamidowaną ludzką DNazę oraz oczyszczoną medezamidowaną ludzką DNazę otrzymano z wykorzystaniem chromatografii TCX.

Figura 9 przedstawia chromatogramy kilku próbek ludzkiej DNazy frakcjonowanych na kolumnie z unieruchomionym analogiem DNA. Próbka oznaczona “Ml -28 stanowi preparat ludzkiej DNazy otrzymany z hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) transformowanych DNA kodującym natywną ludzką DNazę I. Próbka oznaczona ''Wzorzec dezamidowany jest to oczyszczona dezamidowana ludzka DNaza. Próbka oznaczona “Wzorzec niedezamidowany” stanowi oczyszczoną niedezamidowaną ludzką DNazę. Tak oczyszczoną dezamidowaną ludzką DNazę jak i oczyszczoną niedezamidowaną ludzką DNazę otrzymano z wykorzystaniem chromatografii TCX. Próbka oznaczona “Mutant ASP DNazy” jest to DNaza zawierająca raczej resztę kwasu asparaginowego niż resztę asparagmy w pozycji 74 sekwencji aminokwasów.

A. Definicje

Przez termin “ludzka DNaza” rozumie się w niniejszym opisie polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów ludzkiej dojrzałej DNazy I przedstawioną na figurze 1, jak również warianty sekwencji aminokwasów (włączając w to odmiany alleliczne), wykazujące aktywność enzymatyczną w sensie hydrolizowania DNA. Tak więc, termin “ludzka DNaza” jest to rozumiane w szerokim zakresie określenie tych substancji, ujawnionych i wytworzonych w zgłoszeniach patentowych powyżej opisanych.

Termin “ludzka DNaza” niezbędnie obejmuje natywną dojrzałą ludzką DNazę zawierającą resztę asparaginy (Asn) w pozycji 74 sekwencji aminokwasów polipeptydu. Stwierdzono, że asparagina jest podatna na dezamidację, w wyniku której może dojść do utworzenia mieszaniny postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej, ludzkiej DNazy. Zamiast reszty Asn w pozycji 74 sekwencji aminokwasów, dezamidowana DNaza zawiera resztę kwasu asparaginowego (Asp) lub resztę izoasparaginianu (izo-Asp) (patrz figura 4).

Termin “dezamidowana ludzka DNaza” stosowany w niniejszym opisie oznacza ludzką DNazę dezamidowaną na reszcie asparaginy występującej w pozycji 74 sekwencji aminokwasów natywnej dojrzałej ludzkiej DNazy. Stwierdzono, że dezamidowana ludzka DNaza może powstawać w trakcie wytwarzania ludzkiej DNazy metodą rekombinantową i można ją znaleźć w preparatach ludzkiej DNazy otrzymywanych z rekombinantowych komórek-gospodarzy. Oprócz tego, dezamidowana ludzka DNaza może tworzyć się w trakcie przechowywania in vitro niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

Aczkolwiek dezamidacji poddać można także resztę asparaginy w pozycji 7 sekwencji aminokwasów natywnej dojrzałej ludzkiej DNazy (oprócz reszty asparaginy w pozycji 74 sekwencji aminokwasów), to jednak stwierdzono, że taka podwójnie dezamidowana DNaza nie przejawia aktywności enzymatycznej.

Termin “mieszanina” stosowany w niniejszym opisie w odniesieniu do preparatów ludzkiej DNazy, oznacza występowanie razem zarówno dezamidowanej postaci ludzkiej DNazy jak i niedezamidowanej postaci ludzkiej DNazy. I tak, na przykład, stwierdzono, że w preparatach ludzkiej DNazy otrzymanych na drodze ekspresji rekombinantowej, około 50% do 80%, lub więcej, ludzkiej DNazy występuje jako DNaza dezamidowana.

Termin “oczyszczona dezamidowana ludzka DNaza” stosowany w niniejszym opisie oznacza dezamidowaną ludzką DNazę zasadniczo me zawierającą niedezamidowanej ludzkiej DNazy. Innymi słowy, niedezamidowana ludzka DNaza stanowić będzie mniej niż około 10%, korzystnie mniej niż około 5%, a najkorzystniej mniej niż około 1% wagowych całej ilości DNazy w preparacie oczyszczonej dezamidowanej ludzkiej DNazy.

175 873

Termin “oczyszczona niedezamidowana ludzka DNaza” stosowany w niniejszym opisie oznacza niedezamidowaną ludzką DNazę zasadniczo nie zawierającą dezamidowanej ludzkiej DNazy. Innymi słowy, dezamidowana ludzka DNaza stanowić będzie mniej niż około 25%, korzystnie mniej niż około 5%, a najkorzystniej mniej niż około 1% wagowych całkowitej ilości DNazy w preparacie oczyszczonej, niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

Termin “zaróbka” stosowany w niniejszym opisie oznacza farmaceutycznie dopuszczalną substancję stosowaną łącznie z DNaząw celu stosownego i korzystnego podania DNazy pacjentowi. Odpowiednie zarobki są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i opisane są, na przykład, w: Physicians Desk Reference, Merck Index i w Remington's Pharmaceutical Sciences.

Korzystnym preparatem ludzkiej DNazy jest jej zbuforowany lub nie zbuforowany roztwór wodny, a korzystnie izotoniczny roztwór soli, taki jak 150 mM chlorek sodowy zawierający 1,0 mM chlorku wapniowego, o pH 7. Tego rodzaju roztwory w sposób szczególny nadają się do użycia w rozpylaczach dostępnych w handlu, a w tym w rozpylaczach strumieniowych i rozpylaczach ultradźwiękowych, przydatnych do podawania leku, na przykład bezpośrednio do dróg oddechowych lub płuc pacjenta dotkniętego schorzeniem. Jeśli chodzi o dalsze szczegóły dotyczące sposobów formułowania i stosowania ludzkiej DNazy, odnieść się należy do powyżej wspomnianych zgłoszeń patentowych.

Termin “ilość terapeutycznie skuteczna” stosowany w niniejszym opisie oznacza dawkowanie w zakresie od około 1 pg do około 100 mg ludzkiej DNazy/kg masy ciała pacjenta, przy podawaniu w postaci preparatów farmaceutycznych, jak to opisano w niniejszym opisie. Terapeutycznie skuteczna ilość ludzkiej DNazy zależeć będzie, na przykład, od celu terapii, drogi podawania oraz stanu pacjenta. Zgodnie z tym, dla lekarza leczącego będzie rzeczą konieczną wyznaczanie dawki i modyfikowanie drogi podawania odpowiednio do potrzeb dla uzyskania optymalnego efektu terapeutycznego. Z punktu widzenia różnic aktwyności enzymatycznej między opisywanymi tu DNazami, dezamidowaną i niedezamidowaną, może okazać się, że ilość oczyszczonej niedezamidowanej DNazy potrzebna do osiągnięcia zamierzonego efektu terapeutycznego będzie mniejsza od ilości oczyszczonej dezamidowanej ludzkiej DNazy, lub mieszaniny obu tych postaci enzymu, niezbędnej do osiągnięcia tego samego skutku w tych samych warunkach.

Oczyszczone DNazy według niniejszego wynalazku, a zwłaszcza postać niedezamidowaną, stosuje się do enzymatycznie uwarunkowanej zmiany lepkosprężystości śluzu. Tego rodzaju oczyszczone ludzkie DNazy są szczególnie użyteczne w leczeniu pacjentów cierpiących na choroby płucne, połączone z nienormalnie lepkimi, ropnymi wydzielinami, w stanach takich jak ostra lub przewlekła odoskrzelowa choroba płucna, włączając w to zapalenie płuc zakaźne, zapalenie oskrzeli lub zapalenie tchawicy i oskrzeli, rozstrzenie oskrzelowe, zwłóknienie torbielowate, gruźlica płuc i zakażenia grzybicze. W przypadku leczenia tego rodzaju, roztwór lub subtelnie rozdrobniony suchy preparat oczyszczonej dezamidowanej ludzkiej DNazy lub oczyszczonej niedezamidowanej ludzkiej DNazy, wkrapla się w typowy sposób do oskrzeli, na przykład przez wytworzenie aerozolu.

B. Korzystne warianty sposobu realizacji wynalazku

Po pomyślnie przeprowadzonym klonowaniu i ekspresji ludzkiej DNazy w rekombinantowych komórkach-gospodarzach, odkryto po dokonaniu podstawowego rozpoznania, że DNaza otrzymana w wyniku takiej ekspresji rekombinantowej typowo występowała w postaci mieszaniny dotychczas nie zidentyfikowanych składników. W szczególności, analiza ludzkiej DNazy oczyszczonej z hodowli rekombinantowych komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), przeprowadzona metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF), potwierdziła złożoność mieszaniny odmian DNazy. Rozmaite rodzaje DNazy wynikają, jak stwierdzono, z szeregu różnych wydarzeń potranslacyjnych polegających na modyfikacji DNazy, a w tym na jej dezamidacji.

Do ustalenia samej obecności i poziomu dezamidowanej DNazy w tego rodzaju preparatach użyto dwóch metod. Pierwszy z tych sposobów polegał na trawieniu trypsyną wyjściowego preparatu DNazy i analizie utworzonych peptydów metodą HPLC z odwróconymi fazami.

175 873

W metodzie tej, ilość dezamidowanej DNazy w preparacie wyjściowym oznaczano przez pomiar ilości sześciu peptydów trypsynowych, wskazujących na dezamidację.

Sposób drugi obejmuje chromatografię wyjściowego preparatu DNazy na czułkowej kolumnie kationitowej (TCX). Odkryto, że kolumna TCX nadaje się do rozdzielania dezamidowanej ludzkiej DNazy od niedezamidowanej ludzkiej Dnazy tak, że każda postać DNazy może być w sposób skuteczny oddzielona od innej, i że może być otrzymana jako produkt oczyszczony. W metodzie tej, ilość dezamidowanej i niedezamidowanej DNazy w preparacie wyjściowym oznaczano przez pomiar, na chromatogramach, powierzchni pików odpowiadających rozdzielonym postaciom DNazy.

Aczkolwiek te dwie metody są, mniej więcej, skuteczne w równym stopniu, jeśli chodzi o oznaczanie i ujęcie ilościowe dezamidowanej DNazy, to jednak metoda TCX jest szczególnie skuteczna, ponieważ wymaga znacznie mniejszego nakładu czasu i pracy niż ta druga metoda. Ponadto, chromatografia TCX zapewnia sposób rozdzielenia obu postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej DNazy, podczas gdy typowe żywice kationitowe i różne inne żywice stosowane w chromatografii (które przebadano) nie były zdolne do zapewnienia takiego rozdziału.

Ogólne zasady chromatografii TCX opisali, na przykład, Miller [J. Chromatography, 510, 133 (1990)]; Janzen i in. [J. Chromatography, 522,77 (1990)]; oraz Hearn i in. [J. Chromatography, 548,117 (1991)]. Bez ograniczania wynalazku do jakiegokolwiek mechanizmu lub teorii tej operacji, przyjmuje się, że reszta Asn-74 w ludzkiej DNazie, która podatna jest na dezamidację, znajduje się wewnątrz wiążącej DNA bruzdy enzymu, w analogii do znanej krystalicznej struktury DNazy bydlęcej. Bruzda wiążąca DNA zawiera reszty zasadowego aminokwasu (w celu wiązania DNA) i w oczywisty sposób dostępnajest dla ligandów czułkowej żywicy kationitowej, ale nie dla o wiele krótszych ligandów typowych żywic kationitowych. Przypuszczalnie, ligandy czułkowej żywicy kationitowej imitują naturalne kwasy nukleinowe jako substraty enzymu. Dlatego też, oczekuje się, że chromatografia kationitowa oparta na czynności “czułków”, okaże się użyteczna przy oczyszczaniu innych nukleaz, takich jak rybonukleaza (RNaza) lub endonukleazy restrykcyjne, jak również białek wiążących DNA.

Alternatywnie, rozdziału obu postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej DNazy dokonać można z wykorzystaniem metody chromatograficznej, w której stosuje się żywicę, czy inny nośnik, z kowalencyjnie związanymi polimerami kationowymi, takimi jak heparyna lub syntetyczny, nie ulegający hydrolizie analog DNA. Kolumny chromatograficzne z unieruchomioną heparyną są dostępne w handlu (na przykład z firmy Toso Haas Co., Montgomeryville, Pennsylvania). Nie ulegające hydrolizie analogi DNA opisali, na przykład Spitzer i in. w Nuc. Acid. Res. 16, 11691 (1988). Kolumnę unieruchomionego, nie ulegającego hydrolizie analogu DNA dogodnie sporządza się za pomocą zsyntetyzowania takiego analogu DNA z grupą aminokwasowąna końcu 3'jednej, lub obu jego nici komplementarnych. Grupa aminowa staje się wtedy dostępna do sprzęgania z kolumną epoksy-aktywowaną, jak to opisano, na przykład, w literaturze publikowanej przez Rainin Biochemical LC Products (Wobum, Massachusetts).

Następnie, po udanym rozdzieleniu obu postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej, ludzkiej DNazy z wykorzystaniem sposobów według niniejszego wynalazku, stwierdzono, że dezamidowana ludzka DNaza wykazuje aktywność enzymatyczną zmniejszoną w porównaniu z aktywnością niedezamidowanej ludzkiej DNazy, co ustalono metodą z zielenią metylową (MG). [Kumick, Arch. Biochem., 29, 41 (1950)]. Stwierdzam, że dezamidowana ludzka DNaza przejawia aktywność enzymatyczną stanowiącą zaledwie ponad połowę aktywności niedezamidowanej ludzkiej DNazy. Tak więc, dzięki łączeniu ze sobą oczyszczonej dezamidowanej DNazy i oczyszczonej niedezamidowanej DNazy według niniejszego wynalazku, w różnych stosunkach ilościowych, jest rzeczą możliwą wytworzenie preparatów farmaceutycznych ludzkiej DNazy o pożądanej aktywności właściwej na dowolnym poziomie mieszczącym się w zakresie aktywności właściwej pojedynczych składników tak, aby uzyskać wartość optymalną z punktu widzenia skutków leczenia konkretnego schorzenia. ,

Następujące przykłady podano jedynie w celu objaśnienia, bez zamiaru ograniczania zakresu wynalazku w jakikolwiek sposób.

175 873

C. Przykłady

1. Mapowanie trypsynowe

Sposób postępowania przyjęty przy mapowaniu trypsynowym ludzkiej DNazy zreasumowano jak następuje.

Etap 1. Doprowadza się stężenie 1 mg próbki DNazy do poziomu 4 mg/ml za pomocązatężenia w aparacie Amicon Centricon-10 lub za pomocą rozcieńczenia przy użyciu zarobki. Objętość końcowa : 250 μ].

Etap 2. Dodaje się do próbki 250 fl buforu do obróbki wstępnej (40 mM BisTris, 10 mM EGTA, pH 6,0). Prowadzi się inkubację w ciągu godziny, w temperaturze 37°C.

Etap 3. Zmienia się bufor przez przeniesienie próbki do buforu do trawienia z zastopowaniem kolumny Pharmacia NAP-5. Objętość końcowa : 1 ml.

Etap 4. Dodaje się do próbki 10 μΐ roztworu trypsyny (1 mg/ml trypsyny, 1 mM HCl). Prowadzi się inkubację w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C.

Etap 5. Dodaje się do próbki drugą część podwielokrotną, a mianowicie 10 gl, roztworu trypsyny i prowadzi się inkubację jeszcze w ciągu 2 godzin, w temperaturze 37°C.

Etap 6. Zatrzymuje się trawienie przez dodanie 6 gl kwasu tnfluorooctowego (TFA). Próbki przechowuje się w temperaturze 5°C, lub niższej, aż do momentu, gdy zostaną poddane chromatografii.

Etap 7. Rozdziela się mieszaninę peptydów metodąHPLC z przyjęciem warunków następujących :

Kolumna : Nucleosil C18, 5-im, 100 A, 2,0 x 150 mm (Alltech, Co., Deerfield, Illinois).

Temperatura kolumny : 40°C.

Eluent A : 0,12% TfA w wodzie.

Eluent B : 0,10% TFA w acetonitrylu.

Profil gradientu :

Czas (min)	% A	% B
0	100	0
5	100	0
65	40	60
69	5	95
70	5	95

Szybkość przepływu : 0,25 ml/min. Objętość wstrzykiwanej próbki : 250 gl.

Czas ponownego zrównoważenia kolumny po przebiegu, przy 100% A : 20 min.

Temperatura przedziału automatycznego aplikatora próbek : 5°C.

Detekcja : absorbancja przy 214 nm i 280 nm.

Etap 8. Identyfikuje się peptydy trypsynowe : T7, (D)T7, T7-8, (D)T7-8, T6-7-8 i T6-7 na podstawie ich czasu retencji przez porównanie ze wzorcem.

Etap 9. Całkuje się chromatogram otrzymany przy 280 nm. Sprawdza się jakość całkowania przez zbadanie linii podstawowej i rozdzielenie pików eluujących się blisko siebie. Szczególną uwagę należy zwrócić na wcześnie eluujące się peptydy T7 oraz (D)T7, które mogąnie być dobrze rozdzielone.

Etap 10. Normalizuje się powierzchnie pików sześciu wspomnianych peptydów do zawartości tyrozyny. Każdy z peptydów T7, (D)T7, T7-81 (D)T7-8 zawiera pojedynczą resztę Tyr, podczas gdy T6-7-8 i T6-7 zawierają trzy reszty Tyr. Oblicza się udział postaci dezamidowanej w oparciu o znormalizowane powierzchnie pików (D)T7, (D)T7-8, T6-7-8 i T6-7 w stosunku do całkowitej znormalizowanej powierzchni pików wszystkich sześciu peptydów.

Dla dokładnego przeprowadzenia mapowania trypsynowego zmierzającego do oznaczenia dezamidowanej DNazy zgodnie ze sposobem postępowania powyżej przedstawionym, potrzeba użyć 1 mg DNazy w objętości 250 gl. Stąd też, przygotowanie próbki wyjściowej dla tej metody wymaga albo zatężenia albo rozcieńczenia próbki dla uzyskania odpowiedniego rezulta175 873 tu. DNaza w obecności wapnia przejawia w wysokim stopniu oporność na działanie proteaz włącznie z trypsyną. Dlatego, następny etap omawianej metody obejmuje częściowe usunięcie donów wapnia za pomocą podziałania kwasem [etyldnobis(oksyetyldnonitrylo)]tetraoctowym (EGTA). Zbyt intensywna obrdbka z udziałem EGTA może doprowadzić do denaturacji i zagregowania DNazy tak, że etap ten należy przeprowadzać w sposdb ostrożny. Następnie próbkę potraktowaną EGTA, o objętości 0,5 ml, przenosi się, ze zmianą buforu, do 1 ml buforu do trawienia, po czym dodaje się trypsynę i próbkę inkubie w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin. Następnie dodaje się drugą podwidlokrotną część trypsyny i próbkę inkubie jeszcze w ciągu 2 godzin. Trawienie zatrzymuje się za pomocą zakwaszenia i próbkę albo przechowuje w celu pdźninjszego jej zanalizowania, albo bezpośrednio wprowadza na kolumnę HPLC.

250 pl (250 pg) mieszaniny pzptyddw otrzymanej w wyniku trawienia trypsynąpodndje się rozdziałowi na kolumnie HPLC z odwróconymi fazami z zachowaniem warunkdw powyżej przedstawionych. Typową mapę trypsynową ludzkiej DNazy pokazano na figurze 3. HPLc przeprowadzono przy użyciu aparatu Hewlett - Packard model 1090M HPLC. Wyciek z kolumny kontrolowano równocześnie przy 214 nm i 280 nm przy użyciu detektora diodowego typu “diodn array detector”, który jest elementem urządzenia stanowiącym jego cechę charakterystyczną. Ponieważ wcześniejsza część mapy jest decydująca dla ilościowego ujęcia dezaminowdnej DNazy, jak to poniżej opisano, inne aparaty, o większym opdźnizniu gradientowym i o innych objętoś^ach pozakolumnowych, mogą okazać się nieodpowiednie dlatego oznaczenia. Każda analiza wykonana tą metodą wymaga 70 minut dla oddzielenia gradientowego i 20 minut dla ponownego zrównoważenia kolumny, przy całkowitym czasie cyklu analitycznego HPLC wynoszącym 90 ml. Racjonalne uzasadnienie i podejście do całkowania pikdw w celu oznaczenia dezamidowdndj DNazy w próbce opisano poniżej.

Dezaminαcja ludzkiej DNazy zachodzi co najmniej na reszcie asparaginy, zndjnująced się w pozycji 74 sekwencji dminokwasdw (Asn-74) w natywnej, dojrzałej ludzkiej DNaziz. Asn-74 występuje od C-końcowzj strony miejsca rozszczepienia trypsyną przy reszcie argininy w pozycji 73 sekwencji aminokwasdw (Arg-73), jak widać to z wykazu przewidywanych peptyddw trypsynowych ludzkiej DNazy, przedstawionego w tabeli I.

Tabela 1

Ρζ^υΙυ, których utworzenie jest przewidywane w wyniku trawienia trypsyną nmywnej, dojrzałej ludzkiej DNazy

Oznaczenie identyfikujące	Reszty	Sekwencja dmmokwasdw pzptyd u
1	2	3
Tl	1-2	LK
T2	3 - 15	1AAFN1QTFGETK (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3)
T3	16-31	MbNATLVbY1VQ1LbR (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4)
T4	32-41	YD1ALVQEVR (bekwencja o numerze lnnnlyfikdcyjnym 5)
T5	42-50	DbHLTAVGK (bnkwencjd o numerze identyfikacyjnym 6)
T6	51 - 73	LLDNLNQDAPDTYHYVVbELGR (bekwencja o numerze lnnnlyfikdcyjnym 7)
T7	74-77	NbYK (bnkwencjd o numerze identyfikacyjnym 8)
T8	78 - 79	ER
T9	80 - 111	YLFVYRPDQVbAVDbYYYDDGCEPCGNDTFNR (Sekwencjd o numerze identyfikacyjnym 9)
T10	112- 117	EPA1VR (Sekwencjd o numerze identyfikacyjnym 10)
T11	118- 121	FFbR (bekwencja o numerze identyfikacyjnym 11)
T12	122- 126	FTEYR (bnkwencja o numerze identyfikacyjnym 12)

175 873 cd Tabeli nr 1

1	2	3
T13	127- 157	EFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEK (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13)
T14	158- 185	WGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSS1R (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14)
T15	186-213	LWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDR (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15)
T16	214-222	IVVAGMLLR (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16)
T17	223 - 260	GAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 17)

Zamiast reszty Asn (oznaczenie w kodzie jednoliterowym “N”) w pozycji 74 w natywnej, niedezamidowanej ludzkiej DNazie, dezamidowana ludzka DNaza zawiera albo resztę Asp, albo resztę izo-Asp, jak to uwidoczniono na figurze 4. Izo-Aspjest to izomeryczna, β-ammokwasowa postać kwasu asparaginowego. Wiązanie peptydowe między Arg-73 i izo-Asp jest odporne na rozszczepiające działanie trypsyny, w wyniku czego dezamidowana ludzka DNaza dostarcza charakterystycznego peptydu trypsynowego zawierającego reszty 51-77, zwanego T6-7, ponieważ stanowi on połączone ze sobą peptydy T 6 i T7. W warunkach przyjętych przy mapowaniu trypsynowym, wiązanie peptydowe Arg-73-Asn-74 w niedezamidowanej ludzkiej DNazie oraz wiązanie peptydowe Arg-73-Asp-74 w postaci Asp dezamidowanej ludzkiej DNazy, ulegają rozszczepieniu działaniem trypsyny. Stąd, niedezamidowana DNaza jest wskazana na mapie trypsynowej przez obecność peptydu T7, uwidocznionego w tabeli 1, podczas gdy postać Asp-74 dezamidowanej ludzkiej DNazy wskazana jest na mapie trypsynowej przez obecność dezamidowanego peptydu T7, nazwanego (D)T7. Te trzy wspomniane peptydy występująna figurze 3. Niestety, trypsyna jedynie częściowo rozszczepia wiązanie peptydowe w C-końcowej stronie T7, pomiędzy resztami 77 a 78, tak, że każdy ze wspomnianych peptydów T7, (D)T7 i T6-7 ma koniugat T-8, odpowiednio T7-8, (D)T7-8 i T6-7-8. Sześć tych peptydów należy brać w rachubę przy ilościowym ujęciu dezamidowanej ludzkiej DNazy metodąmapowania trypsynowego.

W zasadzie, peptydy (D)T7, (D)T7-8, T6-7 i T6-7-8 reprezentują sobą dezamidowaną ludzką DNazę, natomiast peptydy T7 i T7-8 reprezenttująniedezamidowaną ludzką DNazę i znajomość względnych wartości stosunków ilościowych tych peptydów umożliwia obliczenie w sposób prosty stopnia dezamidacji w preparacie DNazy. W celu obliczenia wielkości ułamka próbki stanowiącego dezamidowaną DNazę, potrzebna jest znajomość stosunków molowych postaci dezamidowanej i niedezamidowanej.

W metodzie mapowania trypsynowego występują dwa dodatkowe problemy, które należy rozwiązać. Jeden z tych problemów dotyczy zagadnień chromatograficznych, a drugi związanych z detekcją. Problem chromatograficzny polega na tym, że peptyd T2 eluuje się wspólnie z peptydem T6-7, a przez to utrudnia całkowanie dokładnej powierzchni piku tego wskazującego dezamidację peptydu. Problem ten rozwiązać można za pomocą scałkowania chromatogramu otrzymanego przy 280 nm, ponieważ wszystkie spośród sześciu peptydów, o których mowa, zawierają co najmniej jedną resztę tyrozyny (Tyr), dzięki czemu wykazują silną absorpcję przy 280 nm, podczas gdy T2 nie zawiera reszt Tyr lub tryptofanu (Trp), wobec czego absorbuje w stopniu nieistotnym przy tej długości fali. Problem związany z detekcją polega na tym, że peptydy T6-7 i T6-7-8 zawierają, każdy, po trzy reszty tyrozyny, natomiast pozostałe cztery peptydy zawierają tylko po jednej takiej reszcie. Tak więc, peptydy zawierające T 6 odznaczają się wyższą absorpcyjnością molową od absorpcyjności molowej peptydów zawierających tylko T7, a proste porównanie powierzchni pików skłaniać będzie do przecenienia zawartości odmiany dezamidowanej w próbce. Problem ten rozwiązuje się za pomocą znormalizowania powierzchni pików tych sześciu peptydów do liczby reszt Tyr w peptydzie. Dokonana w ten sposób normalizacja powierzchni pików implikuje, że wszystkie reszty tyrozyny, w każdym z peptydów, znajdują się w

175 873 równoważnym otoczeniu chemicznym, co prawdopodobnie jest słusznym założeniem, jeśli chodzi o względnie niewielkie peptydy, takie jak peptydy tu omawiane. Po przeprowadzeniu normalizacji, skorygowane powierzchnie pików tak dla peptydów dezamidowanych jak i niedezamidowanych porównać można ze sobą, i w ten sposób możliwe staje się wyciągnięcie wniosków odnośnie do oceny zawartości dezamidowanej DNazy w próbce.

2. Czułkowa chromatografia kationitowa

Czułkowe żywice kationitowe (TCX), inaczej niż w przypadku typowych żywic kationitowych, zawierają ligandy polijonowe, związane z powierzchnią krzemionki. Stosowane w tym przykładzie ligandy kolumny LiChrospher ® 1000 SOg (EM Separations, Gibbstown, New Jersey) reklamowane sąjako ligandy zawierające od 25 do 50 gryp sulfopropylowych rozmieszczonych wzdłuż szkieletu polietylenowego, złączonego jednym końcem z powierzchnią krzemionki.

Chromatogram TCX próbki rekombinantowej ludzkiej DNazy rozwinięty na kolumnie LiChrospher ® 1000 SO3· pokazano na figurze 5. Rekombinantową ludzką DNazę oczyszczono z hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) transformowanych DNA kodującym ludzką DNazę. [Shaki in., Proc. Nat. Acad. Sci., 87,9188 - 9192 (1990); Shaki in., International Patent Application Publication nr WO 90/07572 (opublikowano 12 lipca 1990)].

Otrzymane dwa piki zebrano i poddano rozmaitym oznaczeniom, w wyniku czego zidentyfikowano je jako postacie DNazy różniące się jedynie resztą w pozycji 74 sekwencji aminokwasów. Figura 6 przedstawia mapy trypsynowe dwóch pików odebranych z kolumny TCX. potwierdzające, że stanowią one, odpowiednio, dezamidowaną i niedezamidowanąpostać ludzkiej DNazy. Mapa trypsynowa udowadnia również, że obie odmiany dezamidowanej DNazy (posiadające Asp i izo-Asp w pozycji 74 sekwencji aminokwasów) obecne są w pierwszym piku pochodzącym z rozdziału metodą TCX. Tabela II przedstawia wartości aktywności właściwej zmierzone dla dwóch pików, potwierdzające zależność występującą między dezamidacjąa aktywnością właściwą, wnioskowaną na podstawie korelacji pokazanej na figurze 2, a następnie potwierdzając wyniki identyfikacji frakcji TCX. Aktywność frakcji DNazy oznaczono metodą z zielenią metylową (MG).

Tabela II

Aktywność frakcji odebranych z kolumny TCX (Wartości stężeń w metodzie MG i ELISA są to wartości średnie z oznaczeń przeprowadzonych na dwu próbkach)

Próbka	MG (pg/ml)	ELISA (pg/ml)	Aktywność właściwa
Preparat wyjściowy rekombinantowej ludzkiej DNazy (wsad)	8315	7828	1,06
TCX, pik 1 (dezamidowana)	85,3	119,7	0,71
TCX, pik 2 (niedezamidowana)	149,2	99,4	1,50

Postać mutantową ludzkiej DNazy, z resztą Asp w pozycji 74 sekwencji aminokwasów, wytworzono na drodze ukierunkowanej pod względem miejsca mutagenezy DNA kodującego natywną, dojrzałą ludzką DNazę. Mutant ten eluuje się wspólnie z pierwszym pikiem otrzymanym w powyżej opisanej operacji chromatograficznej, jak pokazano na figurze 7.

Następujący tekst jest to sposób postępowania stosowany przy wypełnianiu kolumny czulkową żywicąkatiomtową LiChrospher® 1000 SO₃'. Inną czułkową żywicą kationitową, podobnie użytecznąjeśli chodzi o rozdział obu postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej, ludzkiej DNazy, jest Fractogel® - czułkowa żywica kationitowa (z firmy EM Separations, Gibbstown, New Jersey). LiChrospher i Fractogel są to zarejestrowane znaki towarowe EM Industries, Inc., Hawthome, N. Y., lub E. Merck, Darmstadt, RFN. “Mocne” formy czułkowych żywic kationitowych (czy to LiChrospher czy Fractogel), zawierają grupę funkcyjną SO3 i, jak się obecnie wydaje, dzięki temu pozwalają uzyskiwać najlepsze wyniki.

175 873

3. Sposób postępowania przy wypełnianiu kolumny HPLC żywicą LiChrospher® 1000 SO₃

a. Materiały i aparatura

1. Ładunek Superformance glass, złoże 1,0 cm x 5,0 cm.

2. Bufor do wypełniania: 10 mM octan sodowy, 1 mM CaCl₂, pH do 4,5 przy użyciu kwasu octowego. Przesącza się przy użyciu filtra 0,2 pl

3. Zbiornik do wypełniania kolumny o pojemności 20 ml. (Alltech. część nr 9501 lub równoważny).

4. Pusta kolumna zestali nierdzewnej, 4,6 mm x 50 mm, wyposażona w 0,5 μ spieki zaporowe.

5. Pompa HPLC zdolna do utrzymywania ciśnienia wstecznego 2000 funtów na cal kwadratowy (Waters. Model 510 lub równoważna).

b. Metoda wypełniania.

1. Przygotowanie żywicy

a) Rozpakowuje się ładunek Superformance glass 1,0 cm x 5,0 cm (objętość złoża = 3,93 ml żywicy). Żywicę zawiesza się, do objętości 20 ml, w przezroczystym naczyniu szklanym zamkniętym przykrywką, przy użyciu buforu do wypełniania kolumny. Mieszaninę bełta się w celu otrzymania jednolitej zawiesiny, po czym dzieli na dwie 10 ml części podwielokrotne. Do każdej części podwielokrotnej dodaje się 10 ml buforu do wypełniania kolumny, w wyniku czego otrzymuje się zawiesiny zawierające w przybliżeniu 1,95 ml żywicy w 20 ml buforu do wypełniania.

b) . Bełta się żywicę w celu otrzymania jednolitej zawiesiny. Zawiesinę pozostawia się w celu osadzenia się, aż do utworzenia przez cząstki stałego złoża na dnie naczynia (2 do 4 godzin). Ostrożnie zlewa się supernatant zawierający drobne cząstki.

c) Do żywicy wprowadza się 20 ml buforu do w-ypełmania i powtarza tię etapb). Postępowanie to należy powtórzyć co najmniej cztery razy, aby zapewnić usunięcie wszystkich drobnych cząstek żywicy.

2. Wypełnienie kolumny

a) Łączy się pustą kolumnę HPLC 4,6 mm x 50 mm ze zbiornikiem do wypełniania. Bełta się żywicę w 20 ml buforu do wypełniania.

b) Wprowadza się rozbełtaną żywicę do zbiornika i szybko zamyka przykrywką. Tłoczy się pompą bufor do wypełniania pod ciśnieniem nie przekraczającym 2000 funtów na cal kwadratowy. Szybkość przepływu reguluje się tak, aby ciśnienie przy wypełnianiu pozostawało na stałym poziomie około 2000 funtów na cal kwadratowy i po ustabilizowaniu się ciśnienia utrzymuje przepływ w ciągu 15 minut. Następnie kolumnę odłącza się i zamzrowuJe górną końcówkę. Kolumny można użyć bezpośrednio po tym, albo można ją przechowywać w 0,02% azydku sodowym.

Dla większości próbek, włącznie z DNazą sformułowaną w 150 mM NaCl, nie jest wymagane żadne przygotowanie próbki przed jej wstrzyknięciem do kolumny. Kolumnę równoważy się przy użyciu buforu octanowego o pH 4,5, zawierającego jony wapnia, po czym dokonuje się wstrzyknięcia próbki, a następnie eluuje się kolumnę gradientem soli. Dla rozdziałów postaci, dezpmiPzmαneJ i niePezamidowanej, ludzkiej DNazy, prowadzonych w małej skali, przydatny jest następujący sposób postępowania. Stosunki powierzchni pików na otrzymanym chromatogramie równe są stosunkom dezαmldomaneJ i niedezamodowanej DNazy w próbce.

Etap 1. Wprowadza się próbkę, zawierającą do 150 mM NaCl, o pH do 9, do fiolki automatycznego aplikatora próbek. Pobrane próbki płynu hodowli komórek wymagają doprowadzenia pH do wartości 4,5 i odwirowania, w celu usunięcia białek, które nie są rozpuszczalne w buforach stosowanych w niniejszym sposobie postępowania.

Etap 2. Rozdziela się dwie postacie DNazy z zastosowaniem metody HPLC w warunkach następujących :

Kolumna : TCX LiChrospher® 1000 SO₃', upakowana w kolumnie stalowej. Kolumny o wymiarach 4,6 x 50 mm, oraz 4,6 x 150 mm, po upakowaniu, gotowe są do użycia.

Temperatura kolumny : temperatura otoczenia.

Eluent A : 10 mM octan sodowy, 1 mM CaCl₂, pH 4,5.

Eluent B : 1 M NaCl w buforze A.

175 873

Profil gradientu :

Czas (min)	% A	% B
0	100	0
4	100	0
30	30	70
30,1	5	95
37	5	95

Szybkość przepływu: 0,8 ml/min (kolumna 50 mm) oraz 0,5 ml/min (kolumna 150 mm).

Objętość wstrzykiwanej próbki: do 250 μΐ.

Czas równoważenia kolumny po przebiegu, przy 100% A : 20 minut.

Temperatura przedziału automatycznego aplikatora próbek · 5°C.

Detekcja : absorbancja przy 280 nm.

Etap 3. Całkuje się chromatogram. Oblicza się udział postaci dezamidowanej w oparciu o stosunek wielkości powierzchni piku wcześniej eluującej się dezamidowanej DNazy do wielkości całkowitej powierzchni pików obu postaci.

Czułkowa chromatografia kationitowa jest także środkiem do rozdzielania w dużej skali obu, dezamidowanej i niedezamidowanej, postaci ludzkiej DNazy. Rozdziały w dużej skali dogodniej przeprowadza się z przyjęciem operacyjnych warunków elucji uproszczonych w porównaniu z warunkami opisanymi powyżej odnośnie do analitycznych, w małej skali prowadzonych rozdziałów dwu postaci DNazy. Stąd też, rozdziały w dużej skali prowadzi się na czułkowym kationicie osadzonym na Fractogel, zgodnie z następującym sposobem postępowania obejmującym elucję w gradiencie pH.

Etap 1. Wypełnia się 31,6 kolumnę (1,6 cm średnica wewnętrzna x 15,7 cm wysokość) Fractogel EMD SO3-650M - czułkowa żywica kationitowa (EM Separations, Gibbstown, New Jersey).

Etap 2. DNazę diafiltrowaną wprowadza się przy użyciu buforu do równoważenia (30 mM octan sodowy (NaAc), 1 mM chlorek wapniowy (CaCl₂), 50 mM chlorek sodowy (NaCl), pH 5). Dokonuje się zatężenia za pomocą ultrafiltracji do objętości 355 ml i stężenia 2,5 mg/ml.

Etap 3. Przemywa się kolumnę 2% wodorotlenkiem sodowym (NaOH) użytym w ilości równej 2,5 objętości kolumny (CV).

Etap 4. Przemywa się kolumnę 2,5 CV buforu do wstępnego równoważenia (300 mM NaAc, 1 M NaCl, pH 5).

Etap 5. Przemywa się kolumnę 2,5 CV buforu do równoważenia.

Etap 6. Wprowadza się do kolumny 1-1,3 g diafiltrowanej/ultrafiltrowanej DNazy (z etapu 2). Rozpoczyna się odbieranie frakcji wycieku z kolumny po rozpoczęciu wprowadzania DNazy..

Etap 7. Przemywa się kolumnę 5 CV buforu do równoważenia.

Etap 8. Przemywa się kolumnę 5 CV buforu do przemywania o pH 5,3 (25 mM bursztynian, 1 mM CaCl₂, pH 5,3).

Etap 9. Przemywa się kolumnę 10 CV buforu do przemywania o pH 5,4 (25 mM bursztynian, 1 mM CaCty pH 5,4).

Etap 10. Przemywa się kolumnę 10 CV buforu do przemywania o pH 6 (25 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 6,0).

Etap 11. Łączy się frakcje odebrane w etapach 6 - 8 z utworzeniem puli złożonej głównie z dezamidowanej DNazy. Łączy się frakcje odebrane w etapie 10 z utworzeniem puli niedezamidowanej DNazy. Frakcje odebrane w etapie 9 zawierają mieszaninę obu tych postaci DNazy i można je zawrócić do obiegu.

Opisany powyżej protokół jest jednym z przykładów zastosowania czułkowej żywicy kationitowej do oczyszczania w skali preparatywnej obu postaci rekombinantowej ludzkiej DNazy w sposób nadający się do powiększania skali i otrzymywania w dużej skali oczyszczonej dezamidowanej i oczyszczonej niedezamidowanej DNazy.

175 873

4. Chromatografia z udziałem heparyny i unieruchomionego analogu DNA

Na figurze 8 zestawiono chromatogramy otrzymane w wyniku przeprowadzenia na kolumnie TSK-Heparin (Toso Haas, Montgomeryville, Pennsylvania) analiz próbek zawierających albo mieszaninę postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej, ludzkiej DNazy, albo oczyszczoną dezamidowaną ludzką DNazę, albo oczyszczoną, niedezamidowaną ludzką DNazę. Kolumnę TSK-Heparin rozwijano z zachowaniem tych samych warunków, jakie opisano powyżej odnośnie do rozwijania analitycznej kolumny TCX. Zestawione chromatogramy pokazują, że na kolumnie z unieruchomioną heparyną dochodzi do rozdzielenia obu, dezamidowanej i niedezamidowanej, postaci DNazy.

Jak to powyżej opisano, inny sposób oddzielania od siebie dezamidowanej i niedezamidowanej postaci DNazy polega na zastosowaniu kolumny zawierającej unieruchomiony analog DNA, oporny na hydrolizujące działanie DNazy. Jednym z przykładów tego podejścia, polegającego na użyciu kolumny z unieruchomionym analogiem DNA, jest synteza fosforotianowego oligonukleotydu 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-NH j-3'. Tę samokomplementarną sekwencję można połączyć w postać dwuniciową i sprzęgnąć z kolumną Rainin Hydropore-EP (Rainin Co., Wobum, Massachusetts). Figura 9 pokazuje zestawione chromatogramy pochodzące z badania na tej kolumnie próbek zawierających albo mieszaninę postaci, dezamidowanej i niedezamidowanej, ludzkiej DNazy, albo oczyszczoną dezamidowaną ludzką DNazę, albo oczyszczoną niedezamidowaną ludzką DNazę, albo oczyszczoną metantową ludzką DNazę, zawierającą raczej resztę kwasu asparaginowego niż resztę asparaginy, w pozycji 74 sekwencji aminokwasów. Kolumnę rozwijano, w celu przeprowadzenia tych oznaczeń, w buforze zawierającym 1 mM chlorek wapnia i 5 mM MES o pH 6. Elucję prowadzono w liniowym gradiencie stężenia soli, do 1 M chlorku sodowego, w ciągu 20 minut, przy szybkości przepływu 1 ml/min. Jak to przedstawiono na figurze 9, w warunkach tych nastąpiło częściowe rozdzielenie dezamidowanej postaci DNazy i niedezamidowanej postaci DNazy. Oprócz tego, na kolumnie tej nastąpiło także rozdzielenie dwu postaci izomerycznych dezamidowanej DNazy, różniących się od siebie tym, że w pozycji 74 sekwencji aminokwasów zawierają albo kwas asparaginowy albo kwas izoasparaginowy. Tak więc, dodatkową korzyścią odnoszoną z tej metody chromatograficznej jest to, że umożliwia ona wyodrębnianie obu izomerów powstających w wyniku dezamidacji ludzkiej Dnazy. ·5. Aktywność enzymatyczna dezamidowanej ludzkiej DNazy i niedezamidowanej ludzkiej DNazy

Do zbadania wpływu dezamidacji na aktywność enzymatyczną ludzkiej DNazy wykorzystano szereg różnych metod analitycznych. Przeznaczoną do tych badań oczyszczoną dezamidowaną ludzką DNazę i oczyszczoną niedezamidowaną ludzką DNazę otrzymano z zastosowaniem chromatografii TCX, opisanej w powyższej części niniejszego opisu.

Zgodnie zjednąz metod oznaczania aktywności enzymatycznej DNazy, syntetyczny, dwuniciowy DNA, o długości 25 par zasad, oznakowano dimtrofenolem (DNP) na jednym końcu i biotyną na drugim. Detekcję hydrolizy substratu działaniem DNazy prowadzono za pomocą wychwytywania produktów reakcji w studzienkach płytki do mikromiareczkowama powleczonych przeciwciałem przeciw DNP i wyrażano ilościowo wyniki z użyciem nienaruszonej sondy z kompleksem straptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Aktywność właściwą ustabilizowanych próbek skorelowano (r² = 0,613; n = 5) z poziomem dezamidacji DNazy (w zakresie 27% - 93%). Na podstawie ekstrapolacji wyników otrzymanych metodą najmniejszych kwadratów oszacowano, że aktywność właściwa dezamidowanej ludzkiej DNazy była w przybliżeniu o 77% niższa od aktywności właściwej niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

Inny sposób oznaczania aktywności enzymatycznej DNazy obejmował hydrolizę chromogennego substratu, fenylofosfonianu p-nitrofenylu (PNPP),jakto opisali Liao i in., Blochem. J., 255, 781 - 787 (1988). Kinetyki hydrolizy PNPP z udziałem ludzkiej DNazy sąesowate i zostały dopasowane do równania Hilla metodą regresji nieliniowej. W ten sposób określono, że V_max całkowicie zdezamidowanej ludzkiej DNazy jest o 77% niższa od V_max niedezamidowanej ludz175 873 kiej DNazy. Stężenie substratu dla aktywności równej połowie aktywności maksymalnej (S_{o 5}) me różniło się w sposób znaczący dla próbek dezamidowanej i niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

Jeszcze innym sposobem oznaczania aktywności enzymatycznej DNazy jest badanie opisane przez Kunitz'a w J. Gen. Physiol., 33,349 (1950), korzystnie zmodyfikowane w tym sensie, że reakcję enzymatyczną przeprowadza się przy pH około 7,0 - 7,5. Metodą tą ustalono, że także w tym przypadku aktywność enzymatyczna dezamidowanej ludzkiej DNazy jest niższa od aktywności enzymatycznej niedezamidowanej ludzkiej DNazy.

6. Przechowywanie ludzkiej DNazy in vitro

Ludzką DNazę, oczyszczonąz rekombinantowych komórek CHO, rozpuszczono, w stężeniu 4 mg/ml, w nie buforowanym roztworze wodnym 150 mM NaCl i 1 mM CaCl₂. Następnie próbki utworzonego roztworu DNazy umieszczono w fiolkach wykonanych ze szkła i w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego. Użyto fiolek wykonanych z tworzywa sztucznego dwóch różnych rodzajów, a mianowicie fiolek wykonanych z żywicy syntetycznej Dupont 20 (produkcji firmy E. I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware, USA) oraz fiolek wykonanych z żywicy syntetycznej Escorene (produkcji firmy Exxon Corp.). Oba te tworzywa sztuczne stanowią polietylen o małej gęstości. Jednakże stosować tu można także pojemniki wytworzone z innych tworzyw sztucznych, takich jak polipropylen, polistyren lub inne poholefiny. Fiolki zawierające roztwór DNazy przechowywano albo w temperaturze -70°C, albo w temperaturze 2 8°C, albo w temperaturze 25°C. Początkowo, w roztworach było około 60% - 65% DNazy dezamidowanej.

Znajdujące się w fiolkach roztwory DNazy poddano badaniu po przechowywaniu w różnych okresach w celu określenia poziomu dezamidacji DNazy. Wyniki tych oznaczeń analitycznych przedstawiono w tabeli III.

Tabela III % dezamidacji rekombinantowej ludzkiej DNazy przechowywanej w fiolkach wykonanych ze szkła i w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego

Próbka	Dzień	-70°C	2 - 8°C	25°C
Szkło	83	66	66	78
	174	63	66	81
Dupont 20	83	65	66	71
	174	63	63	70
Escorene	83	65	66	71
	174	64	62	70

Po upływie 83 - 174 dni przechowywania w temperaturze -70°C lub w temperaturze 2 - 8°C, nie stwierdzono żadnej różnicy między ilością dezamidowanej DNazy znajdującej się w fiolkach z tworzywa sztucznego a ilością dezamidowanej DNazy znajdującej się w fiolkach wykonanych ze szkła. W każdym takim przypadku, około 64% (± 2%) DNazy w fiolkach była to, jak stwierdzono, DNaza dezamidowana.

Jednakże, nieoczekiwanie stwierdzono, że po upływie 83 lub 174 dni przechowywania w temperaturze 25°C, wystąpiła różnica między ilością dezamidowanej DNazy zawartej w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego, a ilością dezamidowanej DNazy znajdującej się w fiolkach szklanych. Znacząco mniej dezamidowanej DNazy było w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego. W szczególności, po upływie 83 dni przechowywania w temperaturze 25°C, 78% DNazy w fiolkach wykonanych ze szkła była to DNaza dezamidowana, podczas gdy jedynie około 70% DNazy zawartej w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego stanowiło DNazę dezamidowaną. Po upływie 174 dni przechowywania w temperaturze 25°C, 81% DNazy w fiolkach wykonanych ze szkła stanowiło DNazę dezamidowaną, podczas gdy jedynie około 71% DNazy znajdującej sie w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego była to dezamidowana DNaza.

175 873

Bez zamiaru ograniczania zakresu wynalazku do jakiejś konkretnej teorii czy mechanizmu działania, sądzi się, że różnica poziomów dezamidacji DNazy stwierdzona w próbkach znajdujących się w fiolkach wykonanych ze szkła bądź z tworzywa sztucznego, wynikać może z różnicy wartości pH roztworów zawartych w tych fiolkach. Początkowo, wartość pH roztworu DNazy znajdującego się w fiolkach wykonanych ze szkła była nieco wyższa od wartości pH roztworu DNazy zawartego w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego (odpowiednio, około

6,7 i około 6,5). Wartość pH roztworu DNazy znajdującego się w fiolkach wykonanych ze szkła z upływem czasu ciągle lekko wzrastała, (aby osiągnąć, po 83 dniach przechowywania w temperaturze 25°C poziom w przybliżeniu 6,9 i po upływie 174 dni przechowywania w temperaturze 25°C poziom w przybliżeniu 7,0), być może w wyniku oddziaływania krzemianów lub jonów pochodzących z powierzchni szkła, przechodzących do roztworu. Przy wyższych wartościach pH wzrasta szybkość dezamidacji ludzkiej DNazy. Ponieważ dotychczas nie zdawano sobie sprawy z tego, że dezamidacja ludzkiej DNazy zachodzi przy podwyższonym pH, omawiany wariant sposobu realizacji niniejszego wynalazku obejmuje sposób formułowania i/lub przechowywania ludzkiej DNazyjako roztworów o kwasowych wartościach pH, zazwyczaj o pH 4,5 - 6,8, a najkorzystniej o pH 5,0 - 6,8.

Tak więc, znaczne polepszenie stabilności ludzkiej DNazy w roztworze uzyskuje się przez umieszczenie roztworu takiej DNazy w fiolkach wykonanych raczej z tworzywa sztucznego niż ze szkła, przy czym w sposób oczywisty do dezamidacji DNazy z upływem czasu dochodzi w wyraźnie mniejszym stopniu w przypadku roztworów znajdujących się w fiolkach wykonanych z tworzywa sztucznego niż w fiolkach wykonanych ze szkła. Odkrycie to może być w szczególny sposób związane z dokonywaniem wyboru opakowania ludzkiej DNazy przeznaczonej do użytku w zastosowaniach terapeutycznych, kiedy to specjalnie zależy na tym, aby ludzka DNaza nadawała się do przechowywania w ciągu dłuższego czasu bez znaczącej straty aktywności enzymatycznej. Oczywiście użyteczne tu będą, w równym stopniu, fiolki wykonane ze szkła posiadające powłokę nieszklaną, na przykład fiolki szklane wyłożone tworzywem sztucznym. Jest rzeczą ważną unikanie przechowywania DNazy w kontakcie ze szkłem, zwłaszcza w przypadku przechowywania jej w okresie dłuższym od około 15-30 dni.

Powyższy opis wyszczególnia konkretne sposoby, których można użyć w praktycznym zastosowaniu niniejszego wynalazku. Dysponując szczegółowymi, konkretnymi metodami stosowanymi do identyfikacji, charakteryzowania, wyodrębniania i użycia czystej dezamidowanej ludzkiej DNazy i czystej niedezamidowanej ludzkiej DNazy według niniejszego wynalazku, oraz dalszymi ujawnieniami dotyczącymi specyficznych układów modelowych odnoszących się do tego, fachowcy w tej dziedzinie techniki będą w wystarczającym stopniu wiedzieć jak wymyślić alternatywne, niezawodne sposoby dojścia do tych samych efektów przy spożytkowaniu korzyści odnoszonych z niniejszego wynalazku. Tak więc, aczkolwiek w tekście opisu może pojawić się szczegółowy opis powyższego, to nie należy interpretować tego jako ograniczenia ogólnego zakresu wynalazku, ale raczej zakres niniejszego wynalazku należy określać jedynie przez prawną konstrukcję załączonych zastrzeżeń.

(2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 1.

(i) Charakterystyka sekwencjj:

(A) Długość : 346 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia · liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 1:

Ser Cys Thr Gly Ser Ala Leu Lys Cys Phe Phe Arg Asp Leu Ser 5 10 15

Ser Xaa Thr Thr Phe Phe Ser Leu Ser Ser Lys Arg Arg Lys Leu 20 25 30

175 873

Ser Ser Lys Asp Ile Pro	Asp	Ser Xaa Gln His Ser 40	Arg His Leu 44
	35
Xaa Gly His	His His His 50	Leu	Arg Met Arg Sly Met 55	Lys Leu Leu 60
Gly Ala Leu	Leu Ala Leu 65	Ala	Ala Leu Leu Gln Gly 77	Ala Val Ser 75
Leu Lys Ile	Ala Ala Phe 80	Asn	Ile Gln Thr Phe Gly 85	Glu Thr Lys 90
Met Ser Asn	Ala Thr Leu 95	Val	Ser Tyr Ile Val Gln 110	Ile Leu Ser 115
Arg Tyr Asp	Ile Ala Leu 110	Val	Gln Glu Val Arg Asp 111	Ser His Leu 110
Tiar· Ala Val	Gly Lys Leu 125	Leu	Asp Asn Leu Asn Gln 110	Asp Ala Pro 110
Asp Thr Tyr	His Tyr Val 140	Val	Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser 114 110
Tyr Lys Glu	Arg Tyr Leu 155	Phe	Val Tyr Arg Pro Asp 110	Gln Val Ser 110
Ala Val Asp	Ser Tyr Tyr 170	Tyr Asp Asp Gly Cys Glu 177	Pro Cys; Gly 185)
Asn Asp Thr	Phe Asn Arg 185	Glu	Pro Ala Ile Val Arg 110	Phe Phe Ser 115!
Arg Ehe Thr	Glu Val Arg 200	Glu	Phe Ala Ile Val Pro 2005	Leu His Ala 200
Ala Pro Gly	Asp Ala Val 215	Ala	Glu Ile Asp Ala Leu 220	Tyr Asp Val 225
Tyr Leu Asp	Val Gln Glu 230	Lys	Trp Gly Leu Glu Asp 235	Val Met Leu 243
Met Gly Asp	Phe Asn Ala 245	Gly	Cys Ser Tyr Val Arg 250	Pro Ser Gln 25505
Trp Ser Ser	Ile Arg Leu 260	Trp	Thr Ser Pro Thr Phe 265	Gln Trp Leu 270
Ile Pro Asp	Ser Ala Asp 275	Thr	Thr Ala Thr Pro Thr 2130	His Cys Ala 2155

175 873

Tyr

Asp Arg

Ile

Val 290

Val

Ala

Gly

Met

Leu 225

Leu

Arg

Gly

Ala

Val no

Val

Pro

Asp

Ser

Ala 305

Leu

Pro

Phe

Asn

Phe 310

Gln

Ala

Ala

Tyr

Gly 3-I5

Leu

Ser

Asp

Gln

Leu 320

Ala

Gln

Ala

Ile

Ser 335

Asp

Hls

Tyr

Pro

Val 330

Glu

Val

Met

Leu

Lys 335

Xaa

Ala

Ala

Pro

Pro 340

Hls

Thr

Ser

Xaa

Thr 345

Ala

346 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 2. (i) Charakterystyka sekwencjj:

(A) Długość : 1039 zasad (B) Typ kwas ukkleinowy (C) Struktura niciowa : jednoniciowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencp: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 2:

TCCTGCACAG	GCAGTGCCTT	GAAGTGCTTC	TTCAGAGACC	iTTCTTCATA	50
GACTACTTTT	TTTTCTTTAA	GCAGCAAAAG	TATGAAATTA	TCGTGGGAGA	000
ATATTCCAGA	TTCTTGACAG	CATTCTCGTC	GTGTCTGGGA	ACATCACCAT	150
CATCTCAGGA	TGAGGGGCAT	GAAGCTCOTG	TTTGTGCTGG	TGGGGCTGGG	200
GGCCCTACTG	CAGGGGGCCG	TGTCCCTGAA	GATGGCAGCC	TTGGGCATGC	250
AGACATTTGG	GGAGACCAAG	ATG^CM^	GCAGGGTCGT	CAGCTACATT	300
GTGCAGATCC	TGAGCCGCTA	TGGGATCGGG	GTGGTGCGGG	GTGTCAGGGA	350
CAGCCACCTG	ACTGCCGTGG	TGGGACTGCT	GTAGGGCGTG	GATGATAGTA	400
CACCAGACAC	CTATCACTAC	ATGGTGGGTT	GTCGGGTAGA	GGTTGGGAGG	050
TATAAGGAGC	GCTACCTGTT	CGTGTAGGAG	GCTTACGGTA	TATCTGGAAT	500
GGACAGCTAC	TAGTACGATG	ATGTCTAGTA	CCCTTGGAAG	GGTGGGGGCG	500

175 873

TCAACCGAGA	GCCAGCCATT	GTCAGGTTCT	TCTCCCGGTT	CACAGAGGTC	600
AGGGAGTTTG	CCATTGTTCC	CCTGCATGCG	GGCCCGGGGG	ACGCAGTAGC	650
CGAGATCGAC	GCTCTCTATG	ACGTCTACCT	GGATGTCCAA	GAGAAATGGG	700
GCTTGGAGGA	CGTCATGTTG	ATGGGCGACT	TCAATGCGGG	CTGCAGCTAT	750
GTGAGACCCT	CCCAGTGGTC	ATCCATCCGC	CTGTGGACAA	GCCCCACCTT	800
CCAGTGGCTG	ATCCCCGACA	GCGCTGACAC	CACAGCTACA	CCCACGCACT	850
GTGCCTATGA	CAGGATCGTG	GTTGCAGGGA	TGCTGCTCCG	AGGCGCCGTT	900
GTTCCCGACT	CGGCTCTTCC	CTTTAACTTC	CAGGCTGCCT	ATGGCCTGAG	950
TGACCAACTG	GCCCAAGCCA	TCAGTGACCA	CTATCCAGTG	GAGGTGATGC	1000
TGAAGTGAGC	AGCCCCTCCC	CACACCAGTT	GAACTGCAG	1039

(2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 3.

(i) Charakterystyka sekwenc^:

(A) Długość : 13 aminokwasów (B) Typ : aminokmaszma (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 3:

Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys 1 5 10 13 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 4.

(i) Charakterystyka sekwenc^ :

(A) Długość : 16 aminokwasów (B) Typ : aminzkwasoma (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji · Sekwencja o numerze iPentyfikacyjnom : 4:

Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser 15 10 15

Arg (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 5.

(i) Charakterystyka sekwencjj :

(A) Długość : 10 aminokwasów (B) Typ : αminokwasoma (D) Topologia : linioma (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 5.

Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg 1 5 10

175 873 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 6.

(i) Charakterystyka sekwencji ;

(A) Długość : 9 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 6:

Asp Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys1 5 9 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 7.

(i) Charakterystyka :

(A) Długość : 23 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) „Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 7:

Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr 15 10 15

Tal Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg 20 23 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym . 8.

(i) Charakterystyka sekwencj i (A) Długość : 4 aminokwasy (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 8:

Asn Ser Tyr Lys 1 4 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 9.

(i) Charakterystyka sekwencjί i (A) Długość : 32 aminokwasy (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencj : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 9:

Tyr leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser? Ala Val Asp Ser 15 10 15

Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe 20 25 30

Asn Arg 32

175 873 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym . 10. (i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 6 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 10:

Glu Pro Ala Ile Val Arg 1 5 6 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym .11. (i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 4 aminokwasy (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwenecj: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym .11:

Phe Phe Ser Arg 1 4 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 12. (i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 5 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 12:

Phe Thr Glu Val Arg 1 5 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 13. (i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 31 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencj : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 13:

Glu

Phe

Ala

Ile

Val

Pro

Leu

His

Ala

Ala

Pro

Gly

Asp

Ala

Val

1

5

10

15

Ala

Glu

Ile

Asp

Ala

Leu

Tyr

Asp

Val

Tyr

Leu

Asp

Val

Gln

Glu

20

25

30

Lys

31

(2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 14. (i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 28 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 14:

175 873

Trp Gly leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly 15 10 15

Cys Ser Tyr Yal Arg Pro Ser Gin Trp Ser Ser Ile Arg 20 25 28 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 15.

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość : 28 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 15’ leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gin Trp leu Ile Pro Asp Ser Ala 15 W 15

Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Aso Arg 20 25 28 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym 16.

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość : 9 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia : liniowa (xi) Opis sekwencji : Sekwencja o numerze identyfikacyjnym . 16:

Ile Yal Val Ala Gly Met Leu Leu Arg 1 5 9 (2) Informacje dotyczące sekwencji o numerze identyfikacyjnym : 17.

(i) Charakterystyka sekwencji :

(A) Długość : 38 aminokwasów (B) Typ : aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym : 17:

Gly Ala Yal Yal Pro Asp Ser Ala Leu Pro The Asn The Gin Ala 15 10 15

Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gin Leu Ala Gin Ala Ile Ser Asp His 20 25 30

Tyr Pro Yal Glu Yal Met Leu Lys 35 38

175 873

101

201

301

101

401

135

501

168 •601

201

701

235

801

268

901

301

1001

335

TCCTGCACAG

AGGACGTGTC

SerCysThrG

ATATTCCAGA

TATAAGGTCT

IleProAs

GGCCCTACTG

CCGGGATGAC

GTGCAGATCC

CACGTCTAGG

YalGlnlleL

CACCAGACAC

GTGGTCTGTG

ProAspTh

GGACAGCTAC

CCTGTCGATG

AspSerTyr

AGGGAGTTTG

TCCCTCAAAC

ArgGluPheA

GCTTGGAGGA

CGAACCTCCT

LeuGluAs

CCAGTGGCTG

GGTCACCGAC

GlnTrpLeu

GTTCCCGACT

CAAGGGCTGA

YalProAspS

TGAA<

ACTT

Ly

GAGC ,CTCG >P«Al

GCAGTGCCTT

CGTCACGGAA lySerAlaLe

TTCTTGACAG

AAGAACTGTC pSerOP*Gln

CAGGGGGCCG

GTCCCCCGGC

TGAGCCGCTA

ACTCGGCGAT euSerArgTy

CTATCACTAC

GATAGTGATG rTyrHisTyr

TACTACGATG

ATGATGCTAC

TyrTyrAspA

CCATTGTTCC

GGTAACAAGG

IalleYalPr

CGTCATGTTG

GCAGTACAAC pValMetLeu

ATCCCCGACA

TAGGGGCTGT

IleProAspS

CGGCTCTTCC

GCCGAGAAGG erAlaLeuPr

AGCCCCTCCC

TCGGGGAGGG aAlaProPro

GAAGTGCTTC

CTTCACGAAG uLysCysPhe

CATTCTCGTC

GTAAGAGCAG

HisSerArgH

TGTCCCTGAA

ACAGGGACTT

LeuLy

TGACATCGCC

ACTGTAGCGG rAspIleAla

GTGGTCAGTG

CACCAGTCAC

YalYalSerG

ATGGCTGCGA

TACCGACGCT spGlyCysGl

CCTGCATGCG

GGACGTACGC oLeuHisAla

ATGGGCGACT

TACCCGCTGA

MetGlyAspP

GCGCTGACAC

CGCGACTGTG erAlaAspTh

CTTTAACTTC

GAAATTGAAG oPheAsnPhe

CACACCAGTT

GTGTGGTCAA

HisThrSerO

TTCAGAGACC

AAGTCTCTGG

PheArgAspL

ATCTCTGAGG

TAGAGACTCC isLeuOP*Gl

GATCGCAGCC

CTAGCGTCGG sIleAlaAla

CTGGTCCAGG

GACCAGGTCC

LeuV&XGlnG

AGCCACTGGG

TCGGTGACCC luProLeuGl

GCCCTGCGGG

CGGGACGCCC uProCysGly

GCCCCGGGGG

CGGGGCCCCC

AlaProGlyA

TCAATGCGGG

AGTTACGCCC heAsnAlaGl

CACAGCTACA

GTGTCGATGT rThrAlaThr

CAGGCTGCCT

GTCCGACGGA

GlnAlaAlaT

GAACTGCAG

CTTGACGTC

P«ThrAla

TTTCTTCATA

AAAGAAGTAT euSerSerAM

ACATCACCAT

TGTAGTGGTA yHisHisHis

TTCAACATCC

AAGTTGTAGG

PheAsnlleG

AGGTCAGAGA

TCCAGTCTCT luValArgAs

ACGGAACAGC

TGCCTTGTCG yArgAsnSer

AACGACACCT

TTGCTGTGGA

AsnAspThrP

ACCGAGTAGC

TGGCTCATCG spArgValAl

CTGCAGCTAT

GACGTCGATA yCysSerTyr

CCCACGCACT

GGGTGCGTGA

ProThrHisC

ATGGCCTGAG

TACCGGACTC yrGlyLeuSe

FIG. IA

175 873

GACTACTTTT TTTTCTTTAA GCAGCAAAAG GAGAAAATTG CTGATGAAAA AAAAGAAATT CGTCGTTTTC CTCTTTTAAC «ThrThrPhe PheSerLeuS erSerLysAr gArgLysLeu

CATCTCAGGlA TG|AGGGGC|AT GjAAGCTGCTG GGGGCGCTGC GTAGAGTCCT ACTCCCCGTA CTTCGACGAC CCCCGCGACG HisLeuArgM etArgGlyMe tLysLeuLeu GlyAlaLeuL

AGACATTTGG GGAGACCAAG TCTGTAAACC CCTCTGGTTC InThrPheGI yGluThrLys

CAGCCACCTG ACTGCCGTGG GTCGGTGGAC TGACGGCACC pSerHisLeu ThrAlaValG

TATAAGGAGC GCTACCTGTT ATATTCCTCG CGATGGACAA TyrLysGluA rgTyrLeuPh

TCAACCGAGA GCCAGCCATT AGTTGGCTCT CGGTCGGTAA heAsnArgGl uProAlalle

CGAGATCGAC GCTCTCTATG GCTCTAGCTG CGAGAGATAC aGluIleAsp AlaLeuTyrA

GTGAGACCCT CCCAGTGGTC CACTCTGGGA GGGTCACCAG ValArgProS erGlnTrpSe

GTGCCTATGA CAGGATCGTG CACGGATACT GTCCTAGCAC ysAlaTyrAs pArgIleVal

TGACCAACTG GCCCAAGCCA ACTGGTTGAC CGGGTTCGGT rAspGlnLeu AlaGlnAlal

ATGTCCAATG CCACCCTCGT TACAGGTTAC GGTGGGAGCA MetSerAsnA laThrLeuVa

GGAAGCTGCT GGACAACCTC CCTTCGACGA CCTGTTGGAG lyLysLeuLe uAspAsnLeu

CGTGTACAGG CCTGACCAGG GCACATGTCC GGACTGGTCC eValTyrArg ProAspGlnV

GTCAGGTTCT TCTCCCGGTT CAGTCCAAGA AGAGGGCCAA ValArgPheP heSerArgPh

ACGTCTACCT GGATGTCCAA TGCAGATGGA CCTACAGGTT spValTyrLe uAspValGln

ATCCATCCGC CTGTGGACAA TAGGTAGGCG GACACCTGTT rSerlleArg LeuTrpThrS

GTTGCAGGGA TGCTGCTCCG CAACGTCCCT ACGACGAGGC ValAlaGlyM etLeuLeuAr

TCAGTGACCA CTATCCAGTG AGTCACTGGT GATAGGTCAC leSerAspHi sTyrProVal

TCATCAAAGG

AGTAGTTTCC

SerSerLysAsp

TGGCACTGGC

ACCGTGACCG euAlaLeuAla

CAGCTACATT

GTCGATGTAA lSerTyrlle

AATCAGGATG

TTAGTCCTAC

AsnGlnAspAla

TGTCTGCGGT

ACAGACGCCA alSerAlaVal

CACAGAGGTC

GTGTCTCCAG eThrGluVal

GAGAAATGGG

CTCTTTACCC

GluLysTrpGly

GCCCCACCTT

CGGGGTGGAA erProThrPhe

AGGCGCCGTT

TCCGCGGCAA gGlyAlaVal

GAGGTGATGC

CTCCACTACG

GluYalMetLeu

175 873

Aktywność właściwa

FIG. 2

175 873

Τ I 3,Τ I 7

O m

Lo <0

ε k o PO

Czas

Tl

TI2J5

LO OJ (D)T7-8_t7.„ θ

(D)T77?;

v_ eMoaaz psoąbCąo T

| 1		1* '	ττ-τ~τ~γ~Γ*τ”	1 ·» Γ
O		o	O	o
o		o	O	o
o		m	O	m
OJ		—	—

?—r

2500 ηνω

175 873

ΝΗ2

I

C=NH

NH

CH2

CH2

CH2

CH

I

CH2

N-C-C-N-C

II I

O CH2 c=o

N-C-C-...

II

NH2 »Asn =Ser

NH2 I
1 C=NH
NH
CH2
CH2 I	CH I
1 CH2 0	1 CH2

N-C-C-N-C-C-N-C-C-...

II I II

O CH2 O c o

CH

-Ser

3*74 7 5

NH2

C=NH

NH

I

CH2

CH2 CH

I

CH2

N-C-C-N-C-CH2

II I o c=o

O CH2

-(5-N-C-C-.

II

CH

3^^74-^75

175 873

LC A 280,4 450,80 OF 5 002DNA3oD

ηνω

Czas (min.

175 873

, ’ £ „O ~ PO tn

r-p-r o	U | 1 Γ o	rrj-rr O	ł γ | ϊ r· O	1 Τ Ί 1 »1 O o	-τρ-Γ o	11,11 o	τ τ [ rn o	1 J 1 1 o	o
o	o	o	o	o	o	o	o	o	o
«η	o	n	o	tn	n	o	n	o	n
CM	CM	=			CM	CM	—	=

nw

175 873

CM

LC A 280,4 450,80 OF I O 8 i B30AoD

LO A 280,4 450,80 0Fi0NE33A_eD

O

O o

o b-*

CO

CO

OJ >1

N (0

Q

Λ cn <

+J

C ns +J

. o

—)

I” » 1 I | 1 1 i j—i—r—i 1—I —i- Ί 1—r

CO φ ¢- CM O . O CM

- in

Czas (min.

175 873

co

Μ fi

0J >1 fi (O

S

O

T3 •H ε

fi

N

O

Ό

U

Φ

N

Cl

O

N s

>Ί fi

UJ s

o

Ό •H ε

fi

N fi

Ό

Φ •ri fi u

Φ

N

Cl

O

N s

o

CM c

•r|

UJ fi

N

O

50-i i ł fίΐ~’ΓΊ .ίΊ· pt ϊ fi | ι r'i

O O o o o ro CM

175 873

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób rozdz ielznia mmszaniny dnzamidzwanej i nied ezamidzwanej ludzkiej DNezy, znamienny tym, że poddaje się tą mieszaninę chromatografii na (i) żywicy lub na innym stałym nośniku ze związanym z tym nośnikiem polimerem Kationowym takim jak heparyna lub nie ulegający hydrolizie analog DNA, lub na (ii) czułkowej żywicy kationitowed.
2. 2 Oczyszczona ndzdmidowdnd ludzka DNaza o sekwencji amlnokwasowdd przedstawionej na wykazie sekwencji jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11 o kodującej te aminokwasy sekwencji DNA przedstawionej na wykazie sekwencji jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2.
3. 3. Preparat farmaceutyczny do leczenia dolnych drdg oddechowych, obejmujący czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalne zarobki, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera ndzamidowaną ludzką DNazę a jako zardbkę zawiera jałowy roztwdr soli wapnia w izotonicznym roztworze chlorku sodowego.
4. 4. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 3, znamienny tym, że jako zardbkę zawiera roztwdr chlorku wapnia w roztworze chlorku sodowego.
5. 5. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera 1,0 mM roztwdr chlorku wapniowego w 150 mM roztworze chlorku sodowego o pH 7.
6. 6. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 3, znamienny tym, że zasadniczo nie zawiera ludzkich białek innych od ludzkiej DNazy.
7. 7. Preparat farmaceutyczny według zastrz 3 albo 4, znamienny tym, że ma postać areozolu.
8. 8. bposdb przechowywania ludzkiej DNazy, znamienny tym, że sporządza się preparat złożony z niddezdminowdndd ludzkiej DNazy w postaci roztworu wodnego o pH około 4,5-6,8 i przechowuje się otrzymany preparat przez czas dłuższy od około 3 tygodni.