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KR20180030045A - 소르틸린에 결합하고 프로그라눌린의 결합을 억제하는 항체 - Google Patents

소르틸린에 결합하고 프로그라눌린의 결합을 억제하는 항체 Download PDF

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KR20180030045A
KR20180030045A KR1020187001192A KR20187001192A KR20180030045A KR 20180030045 A KR20180030045 A KR 20180030045A KR 1020187001192 A KR1020187001192 A KR 1020187001192A KR 20187001192 A KR20187001192 A KR 20187001192A KR 20180030045 A KR20180030045 A KR 20180030045A
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Abstract

본 발명은 결핍 수준의 프로그라눌린(PGRN)의 교정에 유용한 것으로 나타난 모노클로날 항-소르틸린 항체에 관한 것이다. 특히, 이들 항체는 이마관자엽 치매(FTD) 및 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료에서 이용될 수 있다.

Description

소르틸린에 결합하고 프로그라눌린의 결합을 억제하는 항체
본 발명은 결핍 수준의 프로그라눌린(PGRN)의 교정에 유용한 모노클로날 항-소르틸린 항체에 관한 것이다. 특히, 이들 항체는 이마관자엽 치매(FTD) 및 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료에서 이용될 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 신경변성 장애, 예컨대 알츠하이머병(AD)을 치료하는 데에도 유용할 수 있는 것으로 예상되었다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원에는 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 따른 하나 이상의 서열 목록이 포함되며, 이는 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체(파일명 0993_ST25.txt, 2016년 6월 22일 생성, 144 kB 크기)에 개시되고, 이 파일은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
소르틸린은 프로-뉴로트로핀의 친-아폽토시스 효과를 매개하며 뉴로트로핀 수용체의 수송 및 정렬을 매개하는 것으로 보고된 수용체이다(Nykjaer et al, 2012, Trends Neurosci. 2012;35(4):261-70; Glerup et al, Handb Exp Pharmacol, 2014;220:165-89, Carlo et al, J Mol Med (Berl). 2014 Sep;92(9):905-11). 그 고친화도 결합 부위가 소르틸린 분자에서 베타 프로펠러 터널 내부에 있는 것으로 x-선 결정측정학에 의해 확인된 뉴로텐신을 포함하는 여러 소르틸린 리간드가 확인되었다(Quistgaard et al, Nat Struct Mol Biol. 2009 Jan; 16(1):96-8; Quistgaard et al, Protein Sci. 2014 Sep;23(9):1291-300). 보다 최근에, 소르틸린은 성장 인자 프로그라눌린에 대한 고친화도 수용체로서 작용하는 것으로 나타났다(PGRN, Hu et al. Neuron. 2010 Nov 18;68(4):654-67).
PGRN((프로에피텔린, 그라눌린-에피텔린 전구체, PC-세포-유래 성장 인자, 아크로그라닌))은 항염증 및 신경영양-유사 작용을 갖는 분비되는 글리코실화 단백질이다(최근 리뷰에 대해서는, 문헌[Nguyen, Trends Endocrinol Metab. 2013 Dec;24(12):597-606)]을 참고한다. PGRN은 단백분해에 의해 그라눌린으로 절단되지만, PGRN 및 그라눌린의 생리적 역할 및 이들 수용체의 정체에 관해 많은 부분이 밝혀지지 않고 남아있다. PGRN은 세포 주기 조절 및 세포 운동성(He, Z. & Bateman, A., J. MoI. Med. 57:600-612 (2003); Monami, G., et al., Cancer Res. (5(5:7103-7110 (2006)), 상처 치유, 염증(Zhu, J., et al., Cell 777:867-878 (2002)), 성장 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 유도(Tangkeangsiπsin, W. & Serrero, G, Carcinogenesis 25.1587-1592 (2004)), 및 종양신생(He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med. 81:600-612 (2003), Monami, G., et al., Cancer Res (5(5:7103-7110 (2006); Serrero, G., Biochem Biophys. Res. Commun. 505-409-413 (2003), Lu, R & Serrero, G., Proc. Natl Acad Sci U.SA 98 142-147 (2001); Liau, L M., et al., Cancer Res. 60:1353-1360 (2000))을 포함하는 몇몇 세포 기능에 관여되었다. PGRN은 TNF 수용체에 결합하는 것으로 보고되었으나(Tang W et al., Science 2011, 332(6028):478-84) 상기 관찰은 다른 연구자들의 이의 대상이 되었다(Chen et al., J Neurosci. 2013, 33(21):9202-9213).
소르틸린에 대한 PGRN의 결합은 뉴로텐신 부위에 맵핑되었으며, PGRN C-말단 도메인(Zheng et al. PLoS One. 2011;6(6):e21023; Lee et al. Hum Mol Genet. 2013)을 통해서만 뉴로텐신과 유사한 방식으로 매개되는 것으로 보고되었으며, 이에 따라 뉴로텐신은 소르틸린과 PGRN 및 다른 리간드의 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다. 결합 시, 소르틸린은 PGRN의 리조솜에 의한 제거를 매개함으로써 세포외 PGRN 수준을 조절한다(Hu et al. 2010). 따라서, 소르틸린의 녹다운 또는 과발현은 세포 배양에서 세포외 PGRN 수준을 조절하는 것으로 나타났으며(Carrasquillo et al. Am J Hum Genet. 2010 Dec 10;87(6):890-7) 마우스에서, 소르틸린 결핍은 PGRN 수준을 증가시키고 PGRN +/- 마우스에서 혈장 및 뇌 PGRN-수준을 회복시키는 것으로 보고되었다(Hu et al. 2010). 흥미롭게도, 소르틸린 근처의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)은 감소된 혈장 PGRN 및 증가된 소르틸린 mRNA 수준과 연관되었다(Carrasquillo et al. Am J Hum Genet. 2010 Dec 10;87(6):890-7). 이러한 관찰은 소르틸린이 세포외 PGRN의 주요 조절인자임을 제시한다.
PGRN은 이마관자엽 치매(FTD), 행동 및 의미연결 변화를 특징으로 하는 진행성 치매뿐만 아니라 이마관자엽 변성(FTLD) 및 TAR DNA 결합 단백질-43(TDP-43)을 함유하는 신경 봉입체 또는 타우 봉입체와 연관되었다(Baker et al, 2006, Nature. 2006 Aug 24;442(7105):916-9; Cruts et al, Nature 442: 920-924 (2006); Am J Hum Genet. 2010 Dec 10;87(6):890-7,M et al, Trends in Genetics 24: 186-194 (2008)). 대부분의 산발성 및 선천성 FTD 케이스는 ALS와 유사한 TDP-43 병리(약 50%)를 나타내며 일부 연구자들은 공통 병리 및 유전 인자 그리고 증상학에서의 일부 중복으로 인해 FTD-TDP43 및 ALS가 질환 스펙트럼을 구성한다고 여긴다(Ito D Neurology. 2011 Oct 25;77(17):1636-43; Boxer AL et al, Alzheimers Dement. 2013 Mar;9(2):176-88; Rademakers et al, Nat Rev Neurol. 2012 August; 8(8): 423-434). FTD에 있어서 이용 가능한 질환-변경 치료 옵션은 존재하지 않는다. TDP-43 병리를 갖는 이마관자엽 치매 환자의 하위세트는 그라눌린 유전자(GRN)에서 기능 손실 돌연변이를 가져서 PGRN 홑배수체-부족이 일어난다. 현재까지, 모두 감소된 PGRN 수준 및/또는 기능을 일으키는 그라눌린 유전자에서의 69가지 상이한 돌연변이가 FTD와 연관되었으며, 혈장 및 뇌에서 세포외 PGRN의 증가는 질환 공정에 대항할 것으로 여겨진다.
PGRN 돌연변이는 또한 알츠하이머병(AD)에 연관되어(Sheng et al., 2014, Gene. 2014 Jun 1;542(2):141-5; Brouwers et al., 2008, Neurology. 2008 Aug 26;71(9):656-64) PGRN 결핍이 AD 병리에서 중요한 역할을 담당할 수 있음을 제시하였다. 또한, 마우스 AD 모델에서 PGRN의 신경보호 효과가 관찰되어(Minami et al, 2014, Nat Med. 2014 Oct;20(10):1157-64) 증강된 PGRN이 AD 및 가능하게는 다른 신경변성 질병에서 유익할 수 있다는 관점에 대한 뒷받침을 제공하였다.
본 출원에서는 세포 모델에서 그리고 마우스에서 PGRN을 조절할 수 있는 항-인간 소르틸린 항체의 생성 및 동정을 기재한다. 이들 항체는 놀랍게도 소르틸린 상에서 소위 뉴로텐신-부위인 이전에 보고된 프로그라눌린 결합 부위와 먼 영역에 결합하지만, 소르틸린-PGRN 상호작용을 억제할 수 있고 이에 따라 세포외 PGRN을 증가시킬 수 있다.
본 발명자들은 6개의 소르틸린 결합 영역을 정의하였고, 놀랍게도 가장 유효한 항체가 하나의 영역("영역 D")에 결합함을 확인하였다. PGRN은 신경보호 및 항염증 효과를 가지므로, 본 발명자들의 발견은 소르틸린을 표적으로 하는 이러한 항체가 FTD/FTLD를 포함하는 범위의 신경변성 장애의 치료에서 유익한 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 이러한 환자의 하위그룹은 PGRN을 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 수반하여 홑배수체-부족을 야기한다. 따라서 소르틸린 항체는 다른 TDP-43 단백병증 및 PGRN 수준이 ALS와 AD를 포함하는 TDP43-기능 및 병리에 영향을 미칠 수 있는 질환을 앓는 환자에 대해 유사한 치료 유익성을 가질 수 있다.
본 발명의 발명자들은 소르틸린에 대한 PGRN의 결합을 억제할 수 있고, 놀랍게도 SEQ ID NO:170에 정의되는 "D-영역"으로 명명된 신규한 소르틸린 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하였다. 본 발명자들에 의해 확인된 몇몇 항체는 D-영역 항체와 유사한 특성을 가지며, 실험 증거는 이들도 D-영역 내에 결합함을 시사하여, 이러한 항체는 본원에서 D+ 항체로 언급된다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 이러한 항체, 이러한 항체를 포함하는 조성물 및/또는 키트, 및 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 소르틸린의 D-영역에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 질환에는 i.a. FTD, ALS 및 TDP43 단백병증, 예컨대 AD가 포함된다.
도 1은 소르틸린 영역 결합, PGRN-결합 및 PGRN-수준에 대한 효과 및 항체 간 교차-차단에 기반하여 인간 항체의 영역 할당의 생성 개요를 제공한다.
소르틸린-결합 항체는 그 서열이 단백질의 선택된 영역 내 테트라오돈(tetraodon) 소르틸린 서열에 해당하는 셔플 구축물에 대한 결합에 기반하여 선택되고 영역 A~E로 할당되었다(실시예 1, 도 2).
소르틸린-PGRN 결합을 억제한(HTRF 분석에 의해 측정됨) 20개 항체를 선택하였다(실시예 10, 도 5 및 도 6 참고). 이들 항체 중 15개는 D-영역 항체인 반면, 3개는 D+ 항체였다(도 6). 후속 교차-차단 분석은 18개의 D-영역 및 D+ 항체를 나타내었다(D+ 항체는 D-영역 항체에 비해 셔플 구축물에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는다). 그럼에도 불구하고 D+ 항체는 상기 개략된 것과 같이 결합 영역 A~E로 확실히 할당될 수 없지만, D-영역 항체와 유사한 기능적 특징(세포 검정 등)을 공유하며, 모두 서로 교차-차단하여 이들이 동일한 소르틸린 영역과 상호작용함을 뒷받침하였다(실시예 9, 도 7). 다른 영역 클래스의 소르틸린 항체를 HTRF 소르틸린-PGRN 결합 검정에서 시험하는 경우, 41개 중 2개 항체만이 억제 효과를 나타내었다. 이들 두 항체 중 하나는 D 및 D+와 교차-차단하였으나, 비전형적 셔플 구축물 결합 패턴을 가진 반면(이것이 hB01~05 영역에 결합한 것을 제외하고는 D-유사), 다른 항체는 PGRN-소르틸린 결합을 억제한 다른 항체들과 교차-차단하지 않아서, 이것이 다른 소르틸린 영역에 결합한다는 결론을 뒷받침하였다.
이러한 관찰은 D-영역에 의해 정의된 소르틸린 내 영역에 대해 결합하는 항체가 소르틸린-PGRN 결합을 억제할 가능성을 가짐을 나타낸다.
그 중 18개가 D-영역 및 D+ 항체인 19개의 교차-차단 항체는 세포 검정에서 세포외 PGRN을 증가시켰다(실시예 13, 도 10 및 도 11). 이들 항체 중 3개를 생체내 시험하였으며, 혈장 PGRN을 증가시키는 것으로 나타났다(도 13, 실시예 15).
도 1에서 상자는 항체의 선택 단계를 예시한다. A~E는 각각의 소르틸린-결합 항체가 실시예 1 및 SEQ ID NO:171 ~179에 기재된 셔플 구축물에 기반하여 할당된 영역을 나타낸다. "기타"는 하나의 영역에 할당될 수 없고, A- 및 B-영역 간 계면에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. Tet는 테트라오돈-소르틸린에도 결합하는 항체를 나타낸다.
나타낸 인간 항체에 부가하여, 마우스 항-인간 소르틸린 항체 세트를 생성하고 유사하게 특성규명하였다. 이들 항체 중 2개는 D 영역으로 할당되었고 인간 D-영역 및 D+ 항체와 교차 차단하여 소르틸린-PGRN 결합을 억제하고 세포외 PGRN을 증가시키는 것으로 나타났다(도 4 참고).
도 2는 소르틸린 셔플 구축물에 대한 결합에 기반한 항체의 영역 할당을 나타낸다.
패널 A는 실시예 1에 기재된 항체의 영역 할당을 위해 이용된 셔플 구축물의 선형 예시를 나타낸다. 아미노산 잔기가 테트라오돈 소르틸린 서열로부터의 대응하는 아미노산(검은색으로 표시됨)(SEQ ID NO:173)으로 교환된 인간 소르틸린 서열(SEQ ID NO:169)(섹션은 회색으로 표시됨)에 기반하여 소르틸린 셔플 구축물을 생성하였다(실시예 1~3).
패널 B는 A에서 선형으로 예시된 셔플 구축물의 예측 구조를 나타낸다. 진한 잔기는 셔플 구축물에서 대응하는 테트라오돈 서열로 변화된 잔기를 나타낸다.
패널 C는 각각 D-영역 및 E 영역 클래스로 할당된 항체의 결합 패턴을 예시한다. "+"는 주어진 셔플 구축물에 대한 결합을 나타내며 "-"는 결합의 부재를 나타낸다. 상이한 셔플 구축물에 대한 결합 패턴에 기반하여, 항체를 영역으로 할당하였다. 생성되는 항체 영역 클래스를 A~E로 나타낸다. 예시된 D 및 E 영역 항체에 있어서, 둘 다 "+"로 나타내는 인간 서열(모두 회색)에 결합하였고 어느 것도 "-"로 나타내는 테트라오돈 서열(모두 검은색)에 결합하지 않은 반면, E 영역 항체는 hB45678 셔플 구축물에 결합했지만 D 영역 항체는 결합하지 않아서 패널 A에 예시된 바와 같이 결합의 편재화를 일으켰다. D 영역 항체에 있어서, 다음 셔플 영역: hsort, hB06-10, B12390에 대한 결합이 관찰되었다. 항체는 hB01-05, B45678, tet에는 결합하지 않았다. D+ 항체에 있어서, 다음 셔플 영역: hsort, B12390에 대한 결합이 관찰되었다. 항체는 hB01-05, hB06-10, B45678, tet에는 결합하지 않았다. F 결합 패턴은 D+ 항체에 있어서 hB06-10에 대한 결합이 관찰되지 않은 것을 제외하고 D 결합 패턴과 유사하였다.
항체는 2개를 제외하고, 전체 테트라오돈 소르틸린 단백질에 결합하지 않았다. 테트라오돈 서열에 결합할 수 있는 2개 항체는 "tet"로 표시되었다. "기타"는 하나의 영역에 할당될 수 없는 항체를 나타낸다.
도 3은 인간 D-영역 및 D+ 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 실시예 8에 기재된 Octet 384RED를 이용한 바이오레이어 간섭계에 의한 소르틸린 셔플 구축물에 대한 결합 친화도(EC50, ng/ml). 음영 없음은 0.1~10 ng/ml의 EC50을 나타내며, 밝은 회색 음영은 EC50 >10 ng/ml을 나타내고, 회색 음영은 결합 없음(NB)을 나타낸다. 결합 패턴에 기반한 영역 할당을 도 2에 예시한다. 셔플 구축물을 도 2에 예시하며 서열은 SEQ ID NO:171 ~179에 제공한다. mAb = 모노클로날 항체.
도 4는 실시예 8에 기재된 Octet 384RED를 이용한 바이오레이어 간섭계에 의해 수득되는 소르틸린 셔플 구축물에 대한 마우스 항-인간 항체의 결합 친화도(EC50, ng/ml)를 나타낸다. 음영 없음은 결합을 나타내며 회색 음영은 결합 없음(NB)을 나타낸다. 결합 패턴에 기반한 영역 할당을 도 2에 예시한다.
도 5는 소르틸린 PGRN 결합에 대한 소르틸린 항체의 효과를 나타낸다. D 영역 소르틸린 인간 모노클로날(humAb) 항체 45(검은 원)는 결합을 방해하지 않은 대조군 소르틸린 E 영역 항체(검은 삼각형) 및 IgG 대조군, IgG1-b12(흰 삼각형)와 대조적으로, 소르틸린에 대한 PGRN 결합을 예방하였다. 항체의 결합은 동종성 시간차 형광(HTRF)을 이용하여 소르틸린에 대한 PGRN 결합의 변위를 측정함으로써 결정하였다(실시예 10). 항체의 용량-반응 평가는 3-배 희석 곡선에서 50 pM 내지 1 μM을 커버하는 10개 농도로 수행하였다. 절반-최대 억제 농도(IC50)값은 XLfit 4(IDBS, UK)에서 S자형 농도 반응(가변 경사)을 이용한 비-선형 회귀에 의해 계산하였다.
도 6 도 5에 나타낸 동종성 시간차 형광(HTRF) 분석에 의해 결정된 소르틸린-PGRN 결합에 대한 항체 효과의 요약. 종합하면, 62개 항체를 시험하였다 - 15개 D-영역 항체 및 3개 D+ 항체가 소르틸린-PGRN 결합을 억제하는 것으로 나타났고 IC50값을 결정하였다. 2개의 추가 항체(E 및 기타 영역)에 있어서, 억제 효과가 관찰되었다. 나머지 모든 항체는 시험에서 음성이었다. * 항체가 용량-반응 곡선에 피팅하기 너무 약함. 1 μM에서 6% 억제. ** 대조군(ctrl) 항체가 용량-반응 곡선에 피팅하기 너무 약함. 1 μM에서 37% 억제.
이러한 관찰은 D-영역 또는 D+ 할당을 특징으로 하는 소르틸린 항체가 PGRN에 대한 소르틸린의 결합을 직접 억제하며 소르틸린-PGRN 결합을 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 항체 간 교차-차단을 나타낸다. 인간 항체 및 마우스 항체를 모두 하나의 실험에서 시험하였으며, 여기서 각각의 항체를 인간 야생형(WT) 소르틸린에 결합시켰다(도 7). 이후 모든 다른 항체를 사전 형성된 소르틸린:항체 복합체로의 결합에 대해 시험하였다(실시예 9). 선택된 15개의 D-영역 및 3개의 D+ 인간 항체(HTRF PGRN-소르틸린 검정에서 이들의 효과에 기반함(도 5 및 도 6) 및 2개의 마우스 D 영역 항체는 모두 인간 WT 소르틸린에 대해 서로의 결합을 억제하였다.
항체들은 하나의 교차 차단 A 영역 항체, 영역 할당이 알려지지 않은 하나의 항체("기타") 및 D+ 항체 548에 대한 부분적 차단을 제외하고, 다른 영역 클래스로 지정된 항체와 교차-차단하지 않았다(각각 표에서 AbA1-x, AbE1-x 및 Abtet로 넘버링된 A-영역, E-영역 및 테트라오돈 인식 항체에 대해 예시된 바와 같음). 이들 데이터는 HTRF 검정에서 소르틸린-PGRN 결합을 억제할 수 있는 D-영역 및 D+ 항체가 모두 소르틸린에서 동일 영역과 상호작용함을 뒷받침한다.
동일하거나 상이한 영역(도 2에 예시된 셔플 구축물에 대한 결합에 기반한 영역) 유래 소르틸린 항체 간 교차 차단을 항체-소르틸린 결합과의 간섭을 분석하여 결정하였다. 항체의 소르틸린-ECD-His에 대한 결합을 Octet 384RED를 이용하여 바이오레이어 간섭계에 의해 측정하였다(실시예 9). 왼쪽 열은 일차(고정화된) 항체를 나타내며 상부 열은 이차 항체(고정화된 항체에 대해 시험되는 항체)를 나타낸다. 소르틸린-ECD-His에 대한 일차 및 이차 항체 모두의 결합은 0.1 초과의 반응 값을 생성할 것이며, 두 항체가 모두 단백질의 상이한 영역에 결합하고 있었음을 시사한다. 0.1 미만의 반응 값은 이차 항체의 결합 부재 및 고정화된(일차) 항체에 의한 효과적인 교차 차단을 나타내며, 이는 두 항체가 모두 소르틸린의 동일 영역에 결합함을 제시한다.
도 8은 소르틸린에 대한 선택적 소분자 리간드 AF38469의 결합에 대한 D-영역 및 D+ 소르틸린 항체의 효과를 나타낸다. AF38469에 대한 결합 부위는 뉴로텐신의 결합 부위와 유사한 것으로 나타났으며, X-선 결정측정학에 의해 특성규명되었다(
Figure pct00001
et al. Bioorg Med Chem Lett. 2014 Jan 1;24(1):177-80). PGRN은 동일한 부위에 결합하는 것으로 보고되었고(Lee et al. Hum Mol Genet. 2013) 각각 D-영역 및 D+에 결합하는 항체 45 및 68은 소르틸린에 대한 AF38469의 결합을 억제하지 않았다. 상기 데이터는 이러한 항체가 AF38469에 대한 결합 부위와 구별되는 소르틸린에 대한 결합 부위를 가짐을 제시한다. 따라서, 항체 45 및 68은 소르틸린에서 지금까지 추정된 PGRN 결합 부위와 구별되는 결합 부위를 통해 PGRN-소르틸린 결합을 억제한다.
도 9 PGRN의 세포 결합 및 세포내이입에 대한 항체 45 및 68의 효과(실시예 12). 항체 45 및 68은 소르틸린 과발현 세포에 의한 PGRN의 결합 및/또는 세포내이입을 억제하였다. 뉴로텐신(NT, 10 uM)의 첨가는 예상된 바와 같이 감소된 형광으로 반영되는 PGRN의 결합 또는 세포내이입을 유사하게 감소시킨 반면, 이소형 대조군 항체 B12는 PGRN 형광 수준에 영향을 미치지 않았다.
시험할 항체(100 nM)를 30분 동안 S18 세포에 첨가한 후 4 hr 동안 재조합 PGRN을 첨가하였다. 이어서 세포를 고정하고, PGRN에 대해 염색하고, Cellomics에 의해 분석하였다. PGRN 형광을 세포 당 평균 형광으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 데이터를 원-웨이 Anova에 이어 Dunnett 분석으로 분석하고, 모든 군을 PGRN과 비교하였다. *p<0.05; **p<0.01
도 10 소르틸린 과발현 HEK 세포 배양(S18)으로부터 배지 중 ELISA에 의해 추정된 세포외 PGRN 수준. 소르틸린 D-영역(45, 811) 및 D+(68) 항체는 PGRN 수준을 증가시켰고 소르틸린 리간드 뉴로텐신의 유사한 효과가 관찰된 반면, 대조군 항체 B12는 아무 효과를 갖지 않았다. 이러한 관찰은 D-영역 및 D+ 소르틸린 항체가 PGRN의 소르틸린-매개 제거를 억제할 수 있고 이에 따라 세포외 PGRN을 증가시킬 수 있었음을 시사한다. 모든 항체는 100 nM로 시험하였다. 뉴로텐신은 10 uM로 시험하였다. PGRN 수준은 대조군에 대해 정상화하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 데이터를 원-웨이 Anova에 이어 Dunnett 분석으로 분석하고, 모든 군을 CTRL과 비교하였다. *p<0.05; **p<0.01(실시예 13).
도 11은 실시예 13에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된 인간 소르틸린 과발현 HEK 세포에서 세포외 PGRN에 대한 항체의 효과를 나타낸다. 모든 선택된 D-영역 항체 및 3개의 선택된D+ 항체는 세포외 PGRN을 증가시켰다. PGRN 수준은 상술된 바와 동일하게 분석하였다. PGRN 수준을 미처리 대조군에 대해 정상화하고 %로 제공한다. 2개 항체를 인간 소르틸린에 대해 마우스에서 유도하였고(1F2F4 & 5E1F6) 나머지는 인간 항체이다. Ab=모노클로날 항체.
도 12(상부 및 하부 패널)는 뉴론으로 분화한 iPSC 세포에서 세포외 PGRN에 대한 소르틸린 항체의 효과를 나타낸다(실시예 14). 소르틸린 D-영역 항체 45 및 D+ 항체 68은 PGRN 수준을 증가시킨 반면, 대조군 항체 B12 및 항-HEL은 효과를 갖지 않았다.
뉴론으로 분화한 iPSC 세포를 96웰 플레이트 내로 평판접종하였다. 1주 후, 항체를 세포에 첨가하였다. 48 hr 또는 96 hr에 세포로부터 배지를 수집하고 인간 PGRN ELISA(Enzo Life sciences)에 의해 분석하고 샘플을 제조업체의 지침에 따라 분석하였다. 소르틸린 인간 항체 45 및 68은 두 시점에서 모두 배지 중 PGRN 수준을 증가시켰다. 대조군 이소형 항체 B12 및 항-Hel(음성 대조군)은 세포외 PGRN을 변화시키지 않았다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 데이터는 원-웨이 Anova에 이어 Dunnett 분석에 의해 분석하였다. *p<0.05; **p<0.01(실시예 14)
도 13(패널 A~C)은 소르틸린 인간 항체로 처리된 인간 소르틸린 발현 녹-인(KI) 마우스에서의 혈장 PGRN 수준을 나타낸다(실시예 15). 소르틸린 항체 45는 혈장 PGRN 수준을 증가시킨 반면, 대조군 항체는 효과를 갖지 않았다.
A 시간 경과 연구: PGRN의 증가된 혈장 수준이 항체 45(D 영역)의 주사 후 관찰되었다. 마우스에 45(n=5) 또는 대조군(n=3) 항체를 10 mg/kg 용량으로 sc 주사하였다. 각 군을 상이한 시점에 희생시켰다. 대조군 항체(항-Hel)로 처리된 마우스에서는 혈장 PGRN에 변화가 없었던 반면, 45로 처리된 마우스에서는 PGRN 수준에서 점차적 증가가 존재하였다. 효과는 24 내지 48 hr에 피크로 나타났고 4~7일까지 점차 감소하였다.
B 아만성 연구: 마우스를 10 mg/kg의 45 및 대조군 항체(항-Hel)로 주 2회 처리하였다. 샘플을 매주 볼 피로부터 수집하였다. 혈장 PGRN은 1주차에 상승하였고 대조군 항체로 처리된 동물에 비해 전체 연구에 걸쳐 대략 동일한 수준으로 유지되었다(n=20).
C 용량 반응 연구: 상이한 용량(4개 용량: 0.1, 0.4, 2 및 10 mg/kg)의 소르틸린(45) 및 대조군 항체(항-Hel)를 주사하고 마우스를 2일차에 희생시켰다. 혈장 PGRN은 45(10 및 2 mg/kg)로 처리된 마우스에서 상승하였다. 더 낮은 용량(0.4 및 0.1 mg/kg)은 혈장 PGRN에 대해 효과를 갖지 않았다. 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 데이터는 투-웨이 Anova에 이어 Bonferroni 분석에 의해 분석하였다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001(실시예 15).
도 14는 예측된 소르틸린 구조 상에 부여된, 소르틸린 셔플 구조물에 기반한 소르틸린 영역의 예시를 제공한다. 영역은 인간 서열로부터 테트라오돈 서열로의 선택된 아미노산 잔기의 변화가 그 영역 클래스 항체에 대한 결합을 억제하는 소르틸린 단백질 섹션을 구성한다. 화살표는 뉴로텐신 및 PGRN의 보고된 고친화도 결합 부위를 나타낸다(Quistgaard Nat Struct Mol Biol. 2009 Jan;16(1):96-8, Lee et al, Hum Mol Genet. 2013).
도 15a(패널 1~6) 및 15b(패널 1~3)는 항체 45, 68 및 811의 입체형태 에피토프를 커버하는 대표적 펩타이드를 나타낸다. 펩타이드 115~125를 제외하고, 나타낸 펩타이드는 모두 0.5D보다 큰 교환으로부터의 보호를 나타낸다. 펩타이드 115~125는 항체 45, 68 또는 811의 존재에 의해 영향을 받지 않은 펩타이드의 예이며, 이에 의해 입체형태 결합 에피토프의 일부가 아니다(실시예 16).
도 16a(패널 1~6) 및 16b(패널 1~3)는 항체 30의 입체형태 에피토프를 커버하는 대표적 펩타이드를 나타낸다. 펩타이드 563~572, 펩타이드 646-656 및 펩타이드 704~714를 제외하고, 나타낸 펩타이드는 모두 0.5D보다 큰 교환으로부터의 보호를 나타낸다. 이들 세 펩타이드는 항체 30의 존재에 의해 영향을 받지 않은 펩타이드의 예이며, 이에 의해 입체형태 결합부의 일부가 아니다( 실시예 16).
도 17은 절차를 위한 미세투석의 예를 나타낸다.
도 18a는 경시적으로(24 h) 자유롭게 움직이는 hSORT1 마우스 해마에서 PRGN 수준에 대한 미세투석 실험 24 h 전 항체 45 또는 PBS(50 mg/kg, 10 ml/kg, s.c.)의 시간 경과:전신 투여 효과를 나타낸다(실시예 17).
도 18b는 밀기-당기기 미세투석에 의해 평가되는, 각각 3.3 ± 0.3 ng/ml 및 1.1 ± 0.1 ng/ml의, mab#45- 및 PBS-처리 마우스에서 자유롭게 움직이는 hSORT1 마우스의 해마에서의 풀링된 24 h 투석:기본 PRGN의 결과를 나타낸다( 실시예 17).
도 18c는 동물에 mab#45(n= 10) 또는 PBS(n=8)를 처리한 1d 후, 24 h 동안 2 h마다 측정된 자유롭게 움직이는 hSORT1 마우스의 해마에서 PRGN 수준(평균 ± SEM)을 나타내는 표를 제시한다( 실시예 17).
본원에서 이용되는 "소르틸린"이라는 용어는 소르틸린 단백질과의 동의어이다(예를 들어, UniProt에서 Q99523, 1 및 2로 확인됨). 소르틸린의 아미노산 넘버링을 아래에 나타내는 SEQ ID NO:169에 대해 제공하며, 메티오닌(M)이 아미노산 1이다:
Figure pct00002
본원에서 이용되는 "D 영역"이라는 용어는 아래 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO:170에서의 아미노산으로 구성되는 소르틸린 상 영역(SEQ ID NO:169의 잔기 523~610에 해당함)을 나타내려는 것이다:
Figure pct00003
D 영역 항체에 있어서, 다음 셔플 영역: hsort, hB06-10, B12390에 대한 결합이 관찰되었다. 항체는 hB01-05, B45678, tet에는 결합하지 않았다. D+ 항체에 있어서, 다음 셔플 영역: hsort, B12390에 대한 결합이 관찰되었다. 항체는 hB01-05, hB06-10, B45678, tet에는 결합하지 않았다. "D+"로 명명된 항체에 있어서, hB06-10에 대한 결합이 D+ 항체에 대해 관찰되지 않은 것을 제외하고, "D" 영역 항체에 대한 것과 유사한 결합 패턴이 관찰되었다. 셔플 구축물에 대한 상이한 결합 패턴에도 불구하고, D+ 항체는 D-영역 항체와 기능적 특징(세포 검정 등)을 공유하였다.
소정 D 및 D+ 결합 항체는 SEQ ID NO:185 , 186 또는 187에 정의된 바와 같은 특정 영역에 결합한다. 따라서, 본 발명은 소정 구현예에서 SEQ ID 170의 D 영역 서열, 및 SEQ ID NO:185 , 186 또는 187의 해당 영역 내에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 결합에 의해, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 PGRN 수준에 영향을 미치고, 이에 따라 PGRN과 연관된 질환, 예컨대 FTD, ALS 및 AD를 치료하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 D 및 D+ 항체의 결합을 추가 분석함으로써, 일부 항체에 대해 인근 영역(A 영역)에 대한 부분적 결합이 확인되었다. 상기 영역은 SEQ ID NO:180 및 아래에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:169의 아미노산 78~254에 해당한다:
Figure pct00004
상기 영역에는 "A 영역"이라는 용어가 주어진다.
따라서 소정 구현예에서, 본 발명은 상기 및 SEQ ID No 170, 185, 186 또는 187에 정의되는 D 영역에 결합하고 SEQ ID NO 180에서 확인되는 A 영역에 대한 친화도를 추가로 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. A 영역 내에서, 소정 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO 181, 182, 183 또는 184에서 확인되는 A 영역 아미노산에 대한 친화도를 갖는다.
PGRN(프로에피텔린, 그라눌린-에피텔린 전구체, PC-세포-유래 성장 인자, 아크로그라닌)은 전구체 PGRN으로부터 단백분해적으로 절단될 수 있는, 6~25 kDa 범위의 소형 그라눌린 모티프의 7.5개 반복체를 갖는 68.5 kDa 분비 당단백질을 인코딩한다(He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med. 81:600-6X2 (2003)). 비-신경 세포에서, PGRN은 다양한 이벤트, 예컨대 세포 주기 조절 및 세포 운동성(He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med. 57:600-612 (2003); Monami, G., et ah, Cancer Res. (5(5:7103-7110 (2006)), 상처 치유, 염증(Zhu, J., et ah, Cell 777:867-878 (2002)), 성장 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 유도(Tangkeangsiπsin, W. & Serrero, G, Carcinogenesis 25.1587-1592 (2004)), 및 종양신생(He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med. 81:600-612 (2003), Monami, G., et al., Cancer Res (5(5:7103-7110 (2006); Serrero, G., Biochem Biophys. Res. Commun. 505-409-413 (2003), Lu, R & Serrero, G., Proc. Natl Acad Sa U.SA 98 142-147 (2001); Liau, L M., et al., Cancer Res. 60:1353-1360 (2000))와 연관되었다.
PGRN 돌연변이는 홑배수체-부족을 일으키며(Baker, M., et ah, Nature 442:916-919 (2006); Cruts, M., et ah, Nature 442:920-924 (2006)) 거의 50%의 선천성 FTD 케이스에 존재하는 것으로 알려져서, PGRN 돌연변이를 FTD에 대한 주요한 유전적 기여인자로 만든다(Cruts, M. & Van Broeckhoven, C, Trends Genet. 24:186-194 (2008); Le Ber, I., et ah, Brain 129:3051-3065 (2006)). PGRN 돌연변이의 기능-상실 이종접합성 특징은 건강한 개체에서, PGRN 발현이 FTD의 발생으로부터 건강한 개체를 보호하는 데 있어서 용량-의존적인 중추적 역할을 담당함을 시사한다.
본 발명의 맥락에서 "항체"(Ab)라는 용어는 면역글로불린 분자 또는 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 분자("항원")의 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자의 단편을 나타낸다. 자연 발생 항체는 전형적으로 보통 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 이루어지는 사량체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(본원에서 VH로 약칭) 및 보통 3개 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어지는 중쇄 불변 도메인으로 이루어진다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입), IgM 및 IgE를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(본원에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 도메인(CL)으로 이루어진다. 경쇄에는 카파 사슬 및 람다 사슬이 포함된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 전형적으로 항원 인식에 관여하는 반면, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 면역계의 다양한 세포(예컨대, 효과기 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 명명되는 보다 보존된 서열을 갖는 도메인이 분산된, "상보성 결정 영역"으로 명명되는 고가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 도메인 및 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 자연에서 발생할 수 있는 것과 구별되는 물리적 환경에서 존재하기 위해 "단리된" 또는 아미노산 서열이 자연 발생 항체와 상이하도록 변형된 항체 및 이의 항원-결합 단편이 특히 관련된다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 대한 특이적 결합이 가능한 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 보통 분자의 표면 기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며 보통 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태 및 선형 에피토프는 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 항상 변성 용매의 존재 하에 소실된다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여되는 아미노산 잔기 및 결합에 직접 관여되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적으로 항원-결합 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(다시 말하면, 아미노산 잔기는 특이적으로 항원-결합 펩타이드의 풋프린트(footprint) 내에 있음).
본원에서 이용되는 "항체의 항원-결합 단편"이라는 용어는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 단편, 부분, 영역 또는 도메인(이것이 어떻게(예컨대, 절단을 통해, 재조합적으로, 합성적으로 등) 제조되는지와 무관하게)을 의미하며, 이에 따라 "항원-결합"이라는 용어는, 예를 들어 "항체의 항원-결합 단편"이 "항체의 에피토프-결합 단편"과 동일함을 의미하기 위해 "에피토프-결합"과 동일함을 의미하려는 것이다. 항원-결합 단편은 이러한 항체의 CDR 도메인의 1, 2, 3, 4, 5 또는 모든 6개를 함유할 수 있고, 이러한 에피토프에 결합할 수 있지만, 이러한 에피토프에 대해 이러한 항체와 상이한 특이성, 친화도 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 그러나 바람직하게는, 항원-결합 단편은 이러한 항체의 CDR 도메인의 모든 6개를 함유할 것이다. 항체의 항원-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬(예컨대, scFv)의 일부이거나, 이를 포함할 수 있고, 또는 각각 아미노-말단 및 카복실 말단을 갖는, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬의 일부이거나, 이를 포함할 수 있다(예컨대, 디아바디, Fab 단편, Fab2 단편 등). 항원-결합력을 나타내는 항체의 단편은, 예를 들어, 온전한 항체의 프로테아제 절단에 의해 수득될 수 있다. 보다 바람직하게는, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH가 별도 유전자에 의해 자연적으로 인코딩되지만, 또는 이러한 유전자 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 이의 인코딩 cDNA)가 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 연합하여 1가 항원-결합 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조될 수 있도록 하는 가요성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예컨대, 문헌[Bird et al. , (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883] 참고). 대안적으로, 단일 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 함께 연합하도록 하기에 너무 짧은(예컨대, 약 9개 잔기 미만인) 가요성 링커를 채택함으로써, 이중특이적 항체, 디아바디, 또는 유사한 분자를 형성할 수 있다(여기서 2개의 이러한 폴리펩타이드 사슬은 함께 연합하여 2가 항원-결합 분자를 형성함)(예를 들어, 디아바디의 설명에 대해서는 문헌[PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)] 참고). 본 발명 내에서 포괄되는 항원-결합 단편의 예에는 (i) Fab' 또는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편, 또는 WO2007059782에 기재된 바와 같은 1가 항체; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 도메인에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 본질적으로 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (v) 본질적으로 VH 도메인으로 구성되며 또한 도메인 항체로 불리는 dAb 단편(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989))(Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;2i(ll) :484-90); (vi) 카멜리드 또는 나노바디(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5_(l): l ll-24) 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH가 별도 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 도메인이 페어링하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해, 연결될 수 있다(단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음, 예를 들어 문헌[Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참고). 본 발명의 맥락에서 이들 및 다른 유용한 항체 단편이 본원에서 추가로 논의된다. 또한 항체라는 용어에는, 달리 명시되지 않는 한, 또한 항체-유사 폴리펩타이드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 임의의 공지된 기법, 예컨대 효소 절단, 펩타이드 합성, 및 재조합 기법에 의해 제공되는 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편(항원-결합 단편)이 포함됨이 이해되어야 한다. 생성되는 항체는 임의의 이소형을 보유할 수 있다. 본원에서 이용되는 "이소형"은 중쇄 불변 도메인 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 클래스(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)를 나타낸다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적 기법을 이용하여 수득된다; 원하는 에피토프에 결합할 수 있는 적합한 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있다.
"이중특이적 항체"라는 용어는 각각 독립적 표적을 표적으로 하는 2개의 독립적 항원-결합 단편을 함유하는 항체를 나타낸다. 이들 표적은 상이한 단백질 상에 존재하는 에피토프 또는 동일한 표적 상에 존재하는 상이한 에피토프일 수 있다. 이중특이적 항체 분자는 모체 단일특이적 2가 항체 분자의 HC의 불변 도메인에서 보상 아미노산 변화를 이용하여 제조될 수 있다. 생성되는 헤테로이량체 항체는 2개의 상이한 모체 단일특이적 항체로부터 기여되는 하나의 Fab를 함유한다. Fc 도메인에서의 아미노산 변화는 경시적으로 안정한 이중특이성을 갖는 이종이량체 항체의 증가된 안정성으로 이어진다 (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6 546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10 571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5 646-654 (2013)). 이중특이적 항체에는 또한 ScFv 융합을 이용하여 생성되는 분자가 포함될 수 있다. 이어서 2개의 단일특이적 scfv가 안정한 이종이량체를 형성할 수 있는 Fc 도메인에 독립적으로 연결되어 단일 이중특이적 분자를 생성한다(Mabry et al., PEDS 23:3 115-127 (2010)). 이중특이적 분자는 이중 결합능을 갖는다.
"항-소르틸린 항체" 또는 "소르틸린 항체"(그 기재된 맥락에 따라, 본원에서 상호 교환적으로 이용됨)란 소르틸린, 및 특히 소르틸린 D 영역, SEQ ID NO:170에 특이적으로 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편이다. 소르틸린 D 영역에 결합하는 항-소르틸린 항체는 보통 22 nM 이하, 예컨대 22 nM 내지 1 nM, 10 nM 내지 1 nM 또는 5 nM 내지 1 nM의 친화도(IC50)로 D-영역 내의 3, 4, 5, 6 또는 7개 연속 아미노산의 입체형태 에피토프 또는 선형 에피토프(예를 들어 SEQ ID NO:185 , 186 또는 187)에 결합할 것이다. 일부 구현예에 따르면, 항-소르틸린 항체는 A 영역(SEQ ID NO:180 , 181, 182, 183 또는 184)에 결합할 수도 있지만, 이의 주요한 생물학적 기능은 D 영역으로의 결합에 의해 달성되는 것으로 여겨짐이 강조된다.
확인된 결합 부위는 예를 들어 소르틸린에 대한 선택적 소분자 리간드 AF38469의 결합으로 나타낸 바와 같이 다소 고유한 것이다. AF38469에 대한 결합 부위는 뉴로텐신의 결합 부위와 유사한 것으로 나타났으며, X-선 결정측정학에 의해 특성규명되었다(
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et al. Bioorg Med Chem Lett. 2014 Jan 1;24(1):177-80). PGRN은 동일한 부위에 결합하는 것으로 보고되었다(Lee et al. Hum Mol Genet. 2013). 각각 D-영역 및 D+에 결합하는 항체 45 및 68은 소르틸린에 대한 AF38469의 결합을 억제하지 않았다. 상기 데이터는 이러한 항체가 AF38469 및 뉴로텐신에 대한 결합 부위와 구별되는 소르틸린에 대한 결합 부위를 가짐을 제시한다. 따라서 소정 구현예에서, 본 발명은 소르틸린에 특이적으로 결합하고 소르틸린에 대한 PGRN의 결합을 억제할 수 있지만, 그 결합이 소르틸린에 대한 뉴로텐신 또는 AF38469의 결합을 억제하거나 실질적으로 억제하지 않는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이는, 예를 들어 신틸레이션 근접 검정(SPA)을 이용하여 소르틸린에 대한 결합의 변위를 이용하여 나타낼 수 있다(실시예 11). 상기 발견을 설명하는 하나의 방식은 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 소르틸린의 표면적에 대해 결합하는 반면, 뉴로텐신과 같은 소분자는 결합 포켓 내부에 결합한다는 것일 수 있다.
본원에서 이용되는 "인간 항체"("humAb" 또는 "HuMab"로 약술할 수 있음)라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래되는 가변 및 불변 도메인을 갖는 항체를 포함하려는 것이다. 본 발명의 인간 항체에는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 또는 생체내 유전자 재배열 동안 또는 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)가 포함될 수 있다.
본원에서 이용되는 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자 조제물을 나타낸다. 통상적인 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 소정 구현예에서, 모노클로날 항체는 하나를 초과하는 Fab 도메인으로 이루어짐으로써 하나를 초과하는 표적에 대한 특이성을 증가시킬 수 있다. "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 임의의 특정 제조 방법(예컨대, 재조합, 트랜스제닉, 하이브리도마 등)에 의해 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 항체, 및 이의 소르틸린 항원-결합 단편은 바람직하게는 인간 유래일 것이고, 또는 예를 들어 마우스 항체(1F2, 5E1로 표시됨)에 있어서는, 특히 치료 목적을 위해 채택되는 경우, "인간화"일 것이다. "인간화"라는 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린에서 유래되는 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반하는 잔여 면역글로불린 구조를 가지는, 재조합 기법을 이용해서 일반적으로 제조되는 분자를 나타낸다. 항원-결합 부위는 인간 불변 도메인에 융합된 전체 비-인간 항체 가변 도메인, 또는 인간 가변 도메인의 적절한 인간 프레임워크 영역에 그래프팅된 이러한 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 이러한 인간화 분자의 프레임워크 잔기는 야생형일 수도 있고(예컨대, 완전 인간) 또는 이들은 그 서열이 인간화를 위한 기본으로 작용한 인간 항체에서 확인되지 않는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 변형될 수도 있다. 인간화는 분자의 불변 도메인이 인간 개체에서 면역원으로서 작용할 가능성을 경감시키거나 제거하지만, 외래 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 남아있다(LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 다른 접근은 인간-유래 불변 도메인을 제공할 뿐만 아니라 이들을 최대한 인간 형태에 가깝게 재형상화하기 위해 가변 도메인도 변형하는 데 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인은 주어진 종에서 비교적 보존되고 CDR에 대한 골격을 제공하는 것으로 추정되는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 인접하는, 관심 항원에 대해 반응하여 변하며 결합능을 결정하는 3개의 상보성-결정 영역(CDR)을 함유하는 것으로 알려져 있다. 특정 항원에 대해 비인간 항체가 제조되는 경우, 가변 도메인은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비인간 항체에서 유래되는 CDR을 그래프팅하여 "재형상화" 또는 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 상기 접근의 적용은 문헌[Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR -Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti- p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154]에서 보고되었다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구현예에서, 인간화 항체는 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"에서 유래되는" 하나 이상의 CDR로도 명명되는, 원래 항체에 대해 변경되는 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 갖는다. 항원을 인간화하는 능력은 널리 공지되어 있다(예컨대, US 특허 번호 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557 참고).
"항체 "XX"라는 용어는 그 각각의 SEQ ID NO로 정의되는, 경쇄, 경쇄 가변 도메인, 또는 경쇄 가변 도메인 CDR1~3, 및 그 각각의 SEQ ID NO로 정의되는, 중쇄, 중쇄 가변 도메인, 또는 중쇄 가변 도메인 CDR1~3을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어 항체 "5E1")을 표시하려는 것이다. 소정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이의 SEQ ID NO로 정의되는 이의 전체 중쇄 가변 도메인 및 이의 SEQ ID NO로 정의되는 이의 경쇄 가변 도메인으로 정의되는 것으로 포함된다.
상기 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®) 또는 문헌[Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917]을 따른다.
본원에서 이용되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이것이 대안적 에피토프 대비 해당 에피토프와 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 기간으로 및/또는 더 큰 친화도 또는 결합력으로 반응하거나 연합하는 경우, 다른 분자의 영역(즉, 에피토프)과 "특이적으로" 결합하는 것으로 언급된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 분자보다 그 표적(소르틸린)에 대해 적어도 10배 더 강력하게; 바람직하게는 적어도 50배 더 강력하게 그리고 보다 바람직하게는 적어도 100배 더 강력하게 결합한다. 바람직하게는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 생리적 조건 하에, 예를 들어, 생체내에서 결합한다. 따라서, "소르틸린에 대해 특이적으로 결합하는"이란, 이러한 특이성으로 및/또는 이러한 조건 하에 소르틸린에 대해 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 능력이 포함된다. 이러한 결합의 결정에 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 예시적 방법이 동반되는 실시예에 기재되어 있다. 본원에서 이용되는 소정 항원에 대한 항체 결합의 맥락에서의 "결합"이라는 용어는, 예를 들어 리간드로서 항원을 및 분석물질로서 항체를 이용하는 BIAcore® 3000 또는 T200 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정되는 경우, 전형적으로 약 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하의 KD에 해당하는 친화도를 갖는 결합을 나타내며 소정 항원 또는 가깝게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원(예컨대, BSA, 카제인)으로의 결합에 대한 그 친화도보다 적어도 10배 미만, 예컨대 적어도 100배 미만, 예를 들어 적어도 1,000배 미만, 예컨대 적어도 10,000배 미만, 예를 들어 적어도 100,000배 미만인 KD에 해당하는 친화도로 소정 항원에 결합한다. 친화도가 더 낮은 양은 항체의 KD에 의존하며, 이에 따라 항체의 KD가 매우 낮은(즉, 항체가 매우 특이적인) 경우, 비특이적 항원에 대한 친화도보다 항원에 대한 친화도가 더 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다. 특히, 본 발명은, 예를 들어 Octet 384RED 를 이용하는 바이오레이어 간섭계에 의해 결정되는 경우, 22 nM 이하, 예컨대 22 nM 내지 1 nM, 10 nM 내지 1 nM 또는 5 nM 내지 1 nM에 해당하는 결합 친화도를 나타내는 항-소르틸린 항체에 관한 것이다(실시예 8).
본 발명의 소정 구현예에서, 본 발명은 소르틸린으로의 결합에 대해 humAb 항체 45 또는 humAb 항체 68과 경쟁할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:170에 정의된 바와 같은 소르틸린의 D 영역으로의 결합에 대해 항체 45와 경쟁할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 경쟁적 결합 억제는 당분야에 널리 공지된 검정 및 방법을 이용하여, 예를 들어 고정화된 인간 소르틸린을 갖는 BIAcore® 칩을 이용하고 시험할 항체 폴리펩타이드를 포함하고 및 포함하지 않고 기준 항체(예컨대 항체 "45" 또는 "68")와 인큐베이션하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 페어식 맵핑 접근이 이용될 수 있고, 여기서 기준 항체(예컨대 항체 "45" 또는 "68")가 BIAcore® 칩 표면에 고정화되고, 인간 소르틸린 항원이 고정화된 항체에 결합된 후, 제2 항체가 인간 소르틸린에 대한 동시적 결합력에 대해 시험된다(그 개시가 본원에 참조로 포함되는, 'BIAcore® Assay Handbook', GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012 참고).
본원에서 이용되는 "kd"(초-1 또는 1/s)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 상기 값은 koff값으로도 불린다.
본원에서 이용되는 "ka"(M-1 x 초-1 또는 1/M초)라는 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 연합 속도 상수를 나타낸다.
본원에서 이용되는 용어 "KD"(M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내며, kd를 ka로 나눠서 수득된다.
본원에서 이용되는 용어 "KA"(M-1 또는 1/M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 연합 평형 상수를 나타내며, ka를 kd로 나눠서 수득된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 다음 특성을 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(i) 0.5~10 nM, 예컨대 1~5 nM 또는 1~2 nM의 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능.
"소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능"이라는 용어에는 실시예 10에 개시된 시간차 형광 검정(HTFR)을 이용하여 50 nM 미만 그러나 바람직하게는 10 nM 내지 0.2 nM의 IC50으로 PGRN에 대한 결합 억제력을 갖는 항체가 포함된다.
"소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능"이라는 용어에는 실시예 13에 개시된 ELISA 검정에 의해 측정되는 적어도 25%, 예컨대 25% 내지 500%, 25% 내지 400% 또는 25% 내지 200%의 배지 중 PGRN 농도를 증가시키는 능력이 포함된다.
"소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능"에는 실시예 12에 개시된 셀로믹스 기반 검정에 의해 측정되는 PGRN의 세포내 농도를 적어도 10% 그러나 바람직하게는 20 내지 100%만큼 감소시키는 능력이 포함된다.
"인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능"에는 실시예 15에 개시된 ELISA 검정에 의해 측정되는 혈장 중 PGRN의 농도를 적어도 25% 그러나 바람직하게는 50 내지 500%만큼 증가시키는 능력이 포함된다.
뇌 내 PGRN을 증가시키는 능력은 또한 예를 들어 미세투석에 의해 검정될 수 있음이 예상된다. 따라서 "뇌내 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능"이란 미세투석에 의해 측정되는 뇌내 PGRN의 농도를 적어도 25% 그러나 바람직하게는 50 내지 500%만큼 증가시키는 능력이 포함된다.
일부 항체에서, CDR의 일부, 즉 SDR로 명명되는, 결합을 위해 요구되는 CDR 잔기의 하위세트만이 인간화 항체에서 결합을 보유하기 위해 필요하다. 관련 에피토프와 접촉하지 않고 SDR에 있지 않는 CDR 잔기는 이전 연구(예를 들어 CDR H2에서의 잔기 H60~H65가 종종 요구되지 않음)에 기반하여 Chothia 고가변 루프 밖에 놓인 Kabat CDR 영역으로부터(문헌[Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917 참고), 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로, 또는 문헌[Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity," Mol. Immunol. 41:863-872]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 이러한 인간화 항체에서, 하나 이상의 공여체 CDR 잔기가 부재하거나 전체 공여체 CDR이 생략되는 위치에서, 그 위치를 점유하는 아미노산은 수신체 항체 서열에서 대응하는 위치(Kabat 넘버링에 의해)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함될 CDR에서의 공여체 아미노산에 대한 수신체의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 밸런스를 반영한다. 이러한 치환은 인간화 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고 이에 따라 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도 변화를 유도할 수 있고, 친화도의 현저한 감소가 바람직하게 회피된다. CDR 내의 치환 위치 및 치환할 아미노산은 또한 실험적으로 선택될 수 있다.
CDR 잔기의 단일 아미노산 변경이 기능적 결합의 손실을 일으킬 수 있다는 사실(Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983)은 대안적인 작용성 CDR 서열의 체계적 확인 수단을 제공한다. 이러한 변이체 CDR을 수득하기 위한 하나의 바람직한 방법에서, CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 돌연변이되어(예를 들어 무작위 돌연변이화를 통해 또는 부위-지정 방법(예컨대, 돌연변이된 유전자위를 인코딩하는 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄-매개 증폭)에 의해) 치환된 아미노산 잔기를 갖는 CDR을 제조한다. 원래의 (기능적) CDR 서열에서 관련 잔기의 정체를 치환된(비기능적) 변이체 CDR 서열의 정체와 비교함으로써, 그 치환에 대한 BLOSUM62.iij 치환 스코어가 확인될 수 있다. BLOSUM 시스템은 신뢰되는 정렬을 위해 서열 데이터베이스를 분석하여 생성되는 아미노산 치환 매트릭스를 제공한다(Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol. 219, 555-565. 현재, 가장 진보된 BLOSUM 데이터베이스는 BLOSUM62 데이터베이스(BLOSUM62.iij)이다. 표 1은 BLOSUM62.iij 치환 스코어를 제공한다(스코어가 높을수록 치환이 더 보존적이며, 이에 따라 치환이 기능에 영향을 미치지 않을 가능성이 더 높다). 예를 들어, 생성되는 CDR을 포함하는 항원-결합 단편이 소르틸린에 결합하지 못하는 경우, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 불충분하게 보존적인 것으로 간주되고, 더 높은 치환 스코어를 갖는 새로운 후보 치환이 선택되어 제조된다. 따라서 예를 들어, 원래 잔기가 글루타메이트(E)이고, 비-기능적 치환 잔기가 히스티딘(H)인 경우, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 0일 것이고, 보다 보존적인(예컨대 아스파르테이트, 아스파라긴, 글루타민, 또는 라이신으로의) 변화가 바람직하다.
[표 1]
Figure pct00006
따라서 본 발명은 개선된 CDR을 확인하기 위한 무작위 돌연변이화의 이용을 고려한다. 본 발명의 맥락에서, 보존적 치환은 다음 3개 표 중 하나 이상에서 반영되는 아미노산 클래스 내의 치환에 의해 정의될 수 있다:
[표 2]
Figure pct00007
[표 3]
Figure pct00008
[표 4]
Figure pct00009
보다 보존적인 치환 그룹에는 발린-류신-이소류신, 페닐알리닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이 포함된다.
아미노산의 추가 그룹은 또한, 예컨대 문헌[Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W. H. Freeman and Company]에 기재된 원리를 이용하여 제형화될 수 있다.
파지 디스플레이 기술이 CDR 친화도를 증가시키기 위해(또는 감소시키기 위해) 대안적으로 이용될 수 있다. 친화도 성숙으로 불리는 상기 기술은 돌연변이화 또는 "CDR 워킹"을 채택하며 재선택은 최초 또는 모체 항체와 대비되는 경우, 항원에 대해 더 높은(또는 더 낮은) 친화도로 결합하는 CDR을 갖는 항체를 확인하기 위해 표적 항원 또는 이의 항원성 항원-결합 단편을 이용한다(예컨대, 문헌[Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903]참고). 단일 뉴클레오티드가 아닌 전체 코돈의 돌연변이화는 아미노산 돌연변이의 반-무작위화 레퍼토리를 생성한다. 라이브러리는 단일 CDR에서 단일 아미노산 변경에 의해 상이하며 각각의 CDR 잔기에 대한 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유하는 각각의 변이체 클론의 풀로 구성되어 구축될 수 있다. 항원에 대해 증가된(또는 감소된) 결합 친화도를 갖는 돌연변이체는 고정화된 돌연변이체를 표지된 항원과 접촉시켜 스크리닝될 수 있다. 당분야에 공지된 임의의 스크리닝 방법이 항원에 대해 증가되거나 감소된 친화도를 갖는 돌연변이체 항체를 확인하기 위해 이용될 수 있다(예컨대, ELISA)(문헌[Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994] 참고). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹이 가능하게 이용될 수 있다(문헌[Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551] 참고).
이러한 친화도 성숙을 달성하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌[ Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti- Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR -H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM- CSF Antibodies By Targeted CDR -Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144; 및 Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034]에 기재되어 있다.
따라서, 포괄된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR 변이체의 서열은 치환; 예를 들어, 치환된 4개 아미노산 잔기, 3개 아미노산 잔기, 2개 아미노산 잔기 또는 1개 아미노산 잔기를 통해 모체 항체의 CDR의 서열과 상이할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, CDR 영역에서의 아미노산이 아래 3개 표에 정의된 바와 같은, 보존적 치환으로 치환될 수 있음이 또한 고려된다.
"트랜스제닉 비-인간 동물"이라는 용어는 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스유전자 또는 트랜스-염색체(동물의 자연적 게놈 DNA 내로 통합되건 통합되지 않건)를 포함하고 완전 인간 항체를 발현할 수 있는 게놈을 갖는 비-인간 동물을 나타낸다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 소르틸린 항원 및/또는 소르틸린 발현 세포로 면역화되는 경우 마우스가 인간 항-소르틸린 항체를 제조하도록 인간 경쇄 트랜스유전자 및 인간 중쇄 트랜스유전자 또는 인간 중쇄 트랜스-염색체를 가질 수 있다. 인간 중쇄 트랜스유전자는 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 HuMAb 마우스, 예컨대 HCo7 또는 HCo12 마우스의 경우에서와 같이, 마우스의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있거나, 인간 중쇄 트랜스유전자는 WO02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스-염색체 KM 마우스에 대한 경우에서와 같이, 염색체-외로 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스-염색체 마우스(본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 총칭됨)는 V-D-J 재조합 및 이소형 스위칭을 거침으로써 주어진 항원에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소형(예컨대 IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)을 제조할 수 있다.
트랜스제닉, 비인간 동물은 또한 이러한 특이적 항체를 인코딩하는 유전자를 도입하여, 예를 들어 유전자를 동물의 모유 중 발현되는 유전자로 작동 가능하게 연결시킴으로써, 특정 항원에 대한 항체 제조를 위해 이용될 수 있다.
본원에서 이용되는 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 질환 또는 장애의 진행 또는 중증도의 완화, 지연, 약화 또는 역전, 또는 이러한 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 부작용의 완화, 지연, 약화 또는 역전을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, "치료" 또는 "치료하는"은 추가로 유익하거나 요망되는 임상 결과를 수득하기 위한 접근을 의미하며, 여기서 "유익하거나 요망되는 임상 결과"에는 비제한적으로, 부분적이건 전체적이건, 검출 가능하건 검출 불가능하건 무관하게, 증상의 경감, 장애 또는 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않은) 질환 또는 장애 상태, 질환 또는 장애 상태의 진행 지체 또는 지연, 질환 또는 장애 상태의 완화 또는 억제, 및 질환 또는 장애의 차도가 포함된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 적용되는 경우 "유효량"은 비제한적으로 임상 결과를 포함하는 의도되는 생물학적 효과 또는 요망되는 치료 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 시기 동안, 충분한 양을 나타낸다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 적용되는 경우 "치료 유효량"이라는 어구는 장애 또는 질환 상태의, 또는 장애 또는 질환 증상의 진행 완화, 억제, 안정화, 역전, 지연, 약화 또는 지체를 위해 충분한, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 표시하려는 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 다른 화합물과의 조합으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여를 제공한다. 이러한 경우, "유효량"은 의도되는 생물학적 효과를 유도하기 충분한 조합의 양이다.
본 발명의 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요인, 및 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개체에서 요망되는 반응을 일으키는 능력에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과를 치료적으로 유익한 효과가 능가하는 양이다.
항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.
상기 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®) 또는 문헌[Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917]을 따른다.
항체 5E1:
따라서, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 1F2:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:16의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:15의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 068:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:24의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:23의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 1320:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:32의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:31의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 93-05:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:40의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:39의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 93-01:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:48의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:47의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 924:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:52의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:56의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:55의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 1276:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:64의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:63의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 849:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:65의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:67의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:68의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:70의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:72의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:71의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 531-02:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:73의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:75의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:76의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:78의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:80의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:79의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 548-01:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:81의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:83의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:84의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:85의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:88의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:87의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 548-02:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:92의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:93의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:96의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:95의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 1289-02:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:97의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:98의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:100의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:101의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:104의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:103의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 811-02:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:105의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:106의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:107의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:108의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:110의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:112의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:111의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 566-01:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:113의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:114의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:115의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:116의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:117의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:120의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:119의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 562:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:121의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:122의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:123의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:124의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:125의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:126의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:128의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:127의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 193:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:129의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:130의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:131의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:132의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:133의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:134의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:136의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:135의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 88:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:137의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:138의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:139의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:140의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:141의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:142의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:144의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:143의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 045:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:145의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:146의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:147의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:148의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:149의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:150의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:152의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:151의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 044:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:153의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:154의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:155의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:156의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:157의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:158의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:160의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:159의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체 002:
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:161의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:162의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:163의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:164의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:165의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:166의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
바람직하게는, 모노클로날 항체는 SEQ ID NO:168의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:167의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
하나의 구현예에 따르면, 상기 언급된 항체는 상기 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3(VH 및/또는 VL) 서열과 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
또한 항체는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조성물에 있을 수 있다. 본 발명의 항체는 치료법에서 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 FTD 또는 ALS 또는 TDP43 단백질병증, 예컨대 알츠하이머병(AD)의 치료에서 이용될 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 치료는 만성일 수 있고, 환자는 적어도 2주, 예컨대 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 치료받을 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어 문헌[Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 최초 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되는 모노클로날 항체일 수 있거나, 재조합 DNA 방법 또는 다른 방법에 의해 제조되는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 적합한 원천으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체는, 예를 들어, 표면 상에 항원, 또는 관심 항원을 인코딩하는 핵산을 발현하는 세포 형태로, 관심 항원으로 면역화된 마우스로부터 수득되는 쥐과 비장 B 림프구 세포로부터 제조되는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유류, 예컨대 래트, 토끼, 개, 양, 염소, 영장류 등의 항체-발현 세포에서 유래되는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 소르틸린에 대해 유도되는 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스에는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 불리는 마우스가 포함된다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ 및 K 사슬 유전자위를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 및 불변(μ 및 Y) 및 경쇄 가변 및 불변(κ) 사슬 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자위를 함유한다(Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내며, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자가 클래스 스위치 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgG, κ 모노클로날 항체를 생성한다(Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌; 문헌[Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) 및 Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)]에서 리뷰로 다뤄짐). HuMAb 마우스의 제조는 문헌[Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 상세히 기재되어 있다. 또한 US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187을 참고한다.
HCo7, HCo12, HCo17 및 HCo20 마우스는 이의 내인성 경쇄(카파) 유전자에 JKD 손상(문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재됨), 이의 내인성 중쇄 유전자에 CMD 손상(WO 01/14424의 실시예 1에 기재됨), 및 KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스유전자를 갖는다(문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재됨). 추가로, HCo7 마우스는 HCo7 인간 중쇄 트랜스유전자를 가지며(US 5,770,429에 기재됨), HCo12 마우스는 HCo12 인간 중쇄 트랜스유전자를 가지고(WO 01/14424의 실시예 2에 기재됨), HCo17 마우스는 HCo17 인간 중쇄 트랜스유전자를 가지고(WO 01/09187의 실시예 2에 기재됨) 및 HCo20 마우스는 HCo20 인간 중쇄 트랜스유전자를 갖는다. 생성되는 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 유전자위의 손상을 위한 동종접합성 배경에서 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스유전자를 발현한다.
KM 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었고 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었다. 상기 마우스 계통은 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자, KCo5를 수반한다. 상기 마우스 계통은 또한 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체 14 단편 hCF(SC20)로 이루어진 인간 중쇄 트랜스염색체를 수반한다. HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c 및 HCo20-Balb/c 마우스는 WO 09/097006에 기재된 바와 같이 HCo12, HCo17 및 HCo20을 KCo5[J/K](Balb)와 교배하여 생성될 수 있다.
KM 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었고 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동종접합성으로 손상되었다. 상기 마우스 계통은 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자, KCo5를 수반한다. 상기 마우스 계통은 또한 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 염색체 14 항원-결합 단편 hCF(SC20)로 이루어진 인간 중쇄 트랜스염색체를 수반한다.
이러한 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포는 널리 공지된 기법에 따라 인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 인간 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 다른 종에서 유래되는 본 발명의 항체는 또한 관심 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 트랜스제닉인 다른 비-인간 포유류 또는 식물의 생성 및 이로부터 회수 가능한 형태로의 항체 제조를 통해 트랜스유전자를 이용해서 생성될 수 있다. 포유류에서의 트랜스제닉 제조에 관해, 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유류의 모유에서 제조되고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 및 US 5,741,957을 참고한다.
본 발명의 항체는 임의의 이소형일 수 있다. 이소형의 선택은 전형적으로 요망되는 효과기 기능, 예컨대 ADCC 유도에 의해 가이드될 것이다. 예시적 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 도메인, 카파 또는 람다가 이용될 수 있다. 요망되는 경우, 본 발명의 항-소르틸린 항체의 클래스는 공지된 방법에 의해 스위치될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이던 본 발명의 항체는 본 발명의 IgG 항체로 클래스 스위치될 수 있다. 또한, 클래스 스위칭 기법은 하나의 IgG 서브클래스를 다른 서브클래스로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 효과기 기능은, 예컨대, 다양한 치료 용도를 위해 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 이소형 스위칭에 의해 변화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체, 예를 들어 IgG1, κ이다. 항체는 그 아미노산 서열이 다른 이소형에 비해 해당 이소형과 가장 상동성인 경우, 특정한 이소형인 것으로 언급된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 특히 IgG1, κ 항체이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 항원-결합 단편 또는 단일쇄 항체이다.
항체 및 이의 항원-결합 단편은, 예컨대 통상적 기법을 이용하여 항원-결합 단편화에 의해 수득될 수 있고, 항원-결합 단편은 전체 항체에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 항원-결합 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 생성되는 F(ab')2 항원-결합 단편은 디설파이드 가교를 환원시키도록 처리되어 Fab' 항원-결합 단편을 제조할 수 있다. Fab 항원-결합 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리하여 수득될 수 있다; Fab' 항원-결합 단편은 IgG 항체의 펩신 소화로 수득될 수 있다. F(ab') 항원-결합 단편은 또한 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합을 통해 후술되는 Fab'의 결합에 의해 제조될 수 있다. Fab' 항원-결합 단편은 F(ab')2의 힌지 도메인의 디설파이드 결합을 절단하여 수득되는 항체 항원-결합 단편이다. Fab'-항원-결합 단편은 F(ab')2 항원-결합 단편을 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리하여 수득될 수 있다. 항체 항원-결합 단편은 또한 재조합 세포에서 이러한 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)] 참고). 예를 들어, F(ab')2 항원-결합 단편 부분을 인코딩하는 키메라 유전자에는 CH1 도메인 및 H 사슬의 힌지 도메인을 인코딩하는 DNA 서열에 이어, 번역 중지 코돈이 포함되어, 이러한 절단된 항체 항원-결합 단편 분자를 산출할 수 있다.
하나의 구현예에서, 항-소르틸린 항체는 1가 항체, 바람직하게는 힌지 영역이 결실된 WO2007059782(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 1가 항체이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 1가 항체이며, 여기서 상기 항-소르틸린 항체는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 구축된다: i) 상기 1가 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로, 상기 구축물은 선택된 항원 특이적 항-소르틸린 항체의 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 선택된 항원 특이적 항체의 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동 가능하게 연결되고, IgG1 서브타입의 경우, CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 CL 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 또는 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 CL 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 디설파이드 결합 또는 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산을 함유하지 않도록 변형되는 단계; ii) 상기 1가 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로, 상기 구축물은 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 인간 Ig의 불변 CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 힌지 영역에 대응하는 영역, 및 Ig 서브타입에 의해 요구되는 바에 따라 CH 영역의 다른 영역, 예컨대 CH3 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 또는 동물 인간에게 투여되는 경우 인간 Ig의 CH 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩타이드와 디설파이드 결합 또는 공유 또는 안정한 비-공유 중쇄-간 결합의 형성에 참여하는 임의의 아미노산 잔기를 함유하지 않도록 변형되며, 상기 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오타이드 서열은 함께 작동 가능하게 연결되는 단계; iii) 상기 1가 항체를 제조하기 위한 세포 발현 시스템을 제공하는 단계; iv) (iii)의 세포 발현 시스템의 세포에서 (i) 및 (ii)의 핵산 구축물을 공동 발현하여 상기 1가 항체를 제조하는 단계.
유사하게, 하나의 구현예에서, 항-소르틸린 항체는 다음을 포함하는 1가 항체이다:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 도메인 또는 상기 도메인의 항원-결합 부분, 및
(ii) 면역글로불린의 CH 도메인 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이의 도메인으로서, CH 도메인 및 이의 도메인은 힌지 도메인에 대응하는 도메인, 및 면역 글로불린이 IgG4 서브타입이 아닌 경우, CH 도메인의 다른 도메인, 예컨대 CH3 도메인이 폴리클로날 인간 IgG의 존재 하에 동일한 CH 도메인과 디설파이드 결합 또는 동일한 CH 도메인과 다른 공유 또는 안정한 비-공유 중쇄간 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않도록 변형된 도메인.
추가 구현예에서, 1가 항체의 중쇄는 전체 힌지 영역이 결실되도록 변형되었다.
다른 추가 구현예에서, 1가 항체의 서열은 이것이 N-연결 글리코실화를 위한 임의의 수신체 부위를 포함하지 않도록 변형되었다.
본 발명에는 또한 "이중특이적 항체"가 포함되며, 여기서 항-소르틸린 결합 영역(예컨대, 항-소르틸린 모노클로날 항체의 소르틸린-결합 영역)은 하나를 초과하는 에피토프를 표적으로 하는 2가 또는 다가 이중특이적 스캐폴드의 일부이다(예를 들어, 제2 에피토프는 이중특이적 항체가 생물학적 장벽, 예컨대 혈액 뇌 장벽을 통과해서 개선된 트랜스사이토시스를 나타내도록, 활성 수송 수용체의 에피토프를 포함할 수 있음). 따라서 다른 추가 구현예에서, 항-소르틸린 항체의 1가 Fab는 상이한 단백질을 표적으로 하는 추가적인 Fab 또는 scfv로 연결되어 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 이중특이적 항체는 이중 기능, 예를 들어 항-소르틸린 결합 도메인에 의해 부여되는 치료 기능 및 생물학적 장벽, 예컨대 혈액 뇌 장벽을 거친 수송을 증강시키는 수용체 분자에 결합할 수 있는 수송 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항체, 및 이의 항원-결합 단편에는 또한 단일쇄 항체가 포함된다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv 도메인이 연결된 펩타이드이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 단일쇄 Fv(scFv)를 제공하며, 여기서 본 발명의 항-소르틸린 항체의 Fv 내 중쇄 및 경쇄는 단일 펩타이드 사슬에서 가요성 펩타이드 링커(전형적으로 약 10, 12, 15개 이상의 아미노산 잔기)로 연결된다. 이러한 항체의 제조 방법은, 예를 들어 문헌[US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)]에 기재되어 있다. 단일쇄 항체는 단일 VH 및 VL만 이용되는 경우 1가, 2개의 VH 및 VL이 이용되는 경우 2가, 또는 2개를 초과하는 VH 및 VL이 이용되는 경우 다가일 수 있다.
본원에 기재되는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 수의 변형된 아미노산의 도입 및/또는 이러한 콘쥬게이션된 치환제와의 연합에 의해 변형될 수 있다. 상기 맥락에서의 적합성은 일반적으로 비-유도체화된 모체 항-소르틸린 항체와 연관되는 소르틸린 선택성 및/또는 소르틸린 특이성을 적어도 실질적으로 보유하는 능력에 의해 결정된다. 하나 이상의 변형된 아미노산의 도입은, 예를 들어, 폴리펩타이드 혈청 반감기의 증가, 폴리펩타이드 항원성의 감소, 또는 폴리펩타이드 보관 안정성의 증가에서 유리할 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합적 제조 동안 번역과 함께 또는 번역 후에 변형(예컨대, 포유류 세포에서 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 글리코실화)되거나 합성 수단에 의해 변형된다. 변형된 아미노산의 비제한적 예에는 글리코실화 아미노산, 황산화 아미노산, 프레닐화(예컨대, 파네실화, 게라닐-게라닐화) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 아실화 아미노산, PEG화 아미노산, 바이오틴화 아미노산, 카복실화 아미노산, 인산화 아미노산 등이 포함된다. 아미노산의 변형에서 당업자를 가이드하기 적절한 참고문헌은 문헌을 통해 제공된다. 예시적 프로토콜은 문헌[Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ]에서 확인된다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 바이오틴화 아미노산, 지질 모이어티에 콘주게이션된 아미노산, 또는 유기 유도체화제에 콘주게이션된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어 이의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 콘주게이션에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적 중합체, 및 이를 펩타이드에 부착하는 방법은, 예를 들어 US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 및 US 4,609,546에 예시된다. 추가적인 예시적 중합체에는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예컨대, 분자량 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2,000 내지 약 20,000, 예컨대 약 3,000~12,000 g/mol을 갖는 PEG)이 포함된다.
본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 추가로 진단 방법에서 또는 진단 조영 리간드로서 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 방사선표지 아미노산을 포함하는 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 방사선표지 항-소르틸린 항체는 진단 및 치료 목적 모두를 위해 이용될 수 있다(방사선표지 분자에 대한 콘주게이션은 다른 가능한 특징임). 이러한 표지의 비제한적 예에는 비제한적으로 비스무스(213Bi), 탄소(11C, 13C, 14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co, 60Co), 구리(64Cu), 디스프로슘(165Dy), 에르븀(169Er), 불소(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 금(198Au), 홀뮴(166Ho), 수소(3H), 인듐(111In, 112In, 113In, 115In), 요오드(121I, 123I, 125I, 131I), 이리듐(192Ir), 철(59Fe), 크립톤(81mKr), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브덴(99Mo), 질소(13N, 15N), 산소(15O), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 칼륨(42K), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루비듐(81Rb, 82Rb), 루테늄(82Ru, 97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 나트륨(24Na), 스트론튬(85Sr, 89Sr, 92Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Tl), 주석(113Sn, 117Sn), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb, 177Yb), 이트륨(90Y) 및 아연(65Zn)이 포함된다. 방사선표지 아미노산 및 관련 펩타이드 유도체의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) 및 US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 및 US 5,697,902] 참고. 예를 들어, 방사선동위원소는 클로라민 T 방법에 의해 콘주게이션될 수 있다(Lindegren, S. et al. (1998) " Chloramine -T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate," Nucl. Med. Biol. 25(7):659-665; Kurth, M. et al. (1993) "Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor," J. Med. Chem. 36(9):1255-1261; Rea, D.W. et al. (1990) "Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors," Cancer Res. 50(3 Suppl):857s-861s).
본 발명은 또한, 모두 광학 검출에 적합한, 형광 표지(예컨대 희토류 킬레이트(예컨대, 유로퓸 킬레이트)), 플루오레신-유형 표지(예컨대, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 5-카복시플루오레신, 6-카복시플루오레신, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신), 로다민-유형 표지(예컨대, ALEXA FLUOR® 568(Invitrogen), TAMRA® 또는 단실 클로라이드), VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME™(Perkin Elmer), 피코에리트린; 움벨리페론, 리싸민(Lissamine); 시아닌; 피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red), BODIPY FL-SE®(Invitrogen) 또는 이의 유사체를 이용하여 검출 가능하게 표지되는 항-소르틸린 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 화학발광 표지가 채택될 수 있다(예컨대, 루미놀, 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린). 이러한 진단 및 검출은 또한 비제한적으로 다양한 효소, 비제한적으로 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하는 효소를 포함하는 검출 가능한 성분으로, 또는 보철기 복합체, 예컨대 비제한적으로 스트렙타비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴으로 본 발명의 진단 분자를 커플링하여 달성될 수 있다.
화학발광 표지가 채택될 수 있다(예컨대, 루미놀, 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린). 이러한 진단 및 검출은 또한 비제한적으로 다양한 효소, 비제한적으로 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하는 효소를 포함하는 검출 가능한 성분으로, 또는 보철기 복합체, 예컨대 비제한적으로 스트렙타비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴으로 본 발명의 진단 분자를 커플링하여 달성될 수 있다. 상자성 표지가 또한 채택될 수 있고, 바람직하게는 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일-광자 방출 전산화 단층촬영(SPECT)을 이용하여 검출된다. 이러한 상자성 표지에는 비제한적으로 알루미늄(Al), 바륨(Ba), 칼슘(Ca), 세륨(Ce), 디스프로슘(Dy), 에르븀(Er), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 홀뮴(Ho), 이리듐(Ir), 리튬(Li), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 몰리브덴(M), 네오디뮴(Nd), 오스뮴(Os), 산소(O), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh), 루테늄(Ru), 사마륨(Sm), 나트륨(Na), 스트론튬(Sr), 테르븀(Tb), 툴륨(Tm), 주석(Sn), 티탄(Ti), 텅스텐(W), 및 지르코늄(Zi)의 상자성 이온, 및 특히, Co+2, CR+2, Cr+3, Cu+2, Fe+2, Fe+3, Ga+3, Mn+3, Ni+2, Ti+3, V+3, 및 V+4, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비-방사활성 상자성 금속 이온을 함유하는 화합물이 포함된다.
따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-소르틸린 항체 또는 이의 소르틸린-결합 단편은 형광 표지, 화학발광 표지, 상자성 표지, 방사선동위원소 표지 또는 효소 표지로 표지될 수 있다. 표지된 단편의 항체는 대상체의 뇌에서 상기 소르틸린의 존재 또는 양의 검출 또는 측정에서 이용될 수 있다. 상기 방법은 항-소르틸린 항체 또는 상기 소르틸린에 결합된 소르틸린-결합 단편의 생체내 조영의 검출 또는 측정을 포함할 수 있고, 상기 항-소르틸린 항체 또는 이러한 소르틸린에 결합된 소르틸린-결합 단편의 생체외 조영을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 도메인의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편의 재조합적 제조를 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터(적합한 발현 제어 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는 임의의 적합한 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예에는 SV40 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합에서 유래되는 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터가 포함된다. 하나의 구현예에서, 항-소르틸린 항체를 인코딩하는 핵산은, 예를 들어 선형 발현 요소를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터(예를 들어, 문헌[Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)]에 기재됨), 압축 핵산 벡터(예를 들어, US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재됨), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "밋지(midge)" 최소-크기 핵산 벡터에(예를 들어, 문헌[Schakowski et al., MoI Ther 3, 793-800 (2001)]에 기재됨), 또는 침전 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaPO4-침전 구축물로서(예를 들어, 문헌[WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)]에 기재됨) 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 이의 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참고).
하나의 구현예에서, 벡터는 박테리아 세포에서 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예에는 발현 벡터, 예컨대 BlueScript(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET 벡터(Novagen, Madison, WI) 등)가 포함된다.
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서 발현에 적합한 임의의 벡터가 채택될 수 있다. 적합한 벡터에는, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터가 포함된다(문헌[ F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D. et al. Methods Mol. Biol. 824, 329-358 (2012), Celik, E. et al. Biotechnol. Adv. 30(5), 1108-1118 (2012), Li, P. et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 142(2), 105-124 (2007), Boeer, E. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol. 178, 359-366 (2002), 및 Holliger, P. Methods Mol. Biol. 178, 349-357 (2002)]에서 리뷰로 다뤄짐).
본 발명의 발현 벡터에서, 항-소르틸린 항체를 인코딩하는 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 촉진 요소를 포함하거나 이와 연관될 수 있다. 이러한 요소의 예에는 강력 발현 프로모터(예컨대, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, 대장균에서의 플라스미드 산물을 위한 복제 기원, 선별 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위(예컨대, 폴리링커)가 포함된다. 핵산은 또한 구성적 프로모터와 대비되는 유도성 프로모터, 예컨대 CMV IE를 포함할 수 있다(당업자는 이러한 용어가 실제로 소정 조건 하의 유전자 발현 정도의 서술자임을 인식할 것이다).
추가 양태에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본원에서 정의된 바와 같은 본 발명의 이중특이적 분자를 제조하는, 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예컨대 트랜스펙토마(transfectoma)에 관한 것이다. 숙주 세포의 예에는 효모, 박테리아, 및 포유류 세포, 예컨대 CHO 또는 HEK 세포가 포함된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 통합되지 않은 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공하며, 이는 본 발명의 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 코딩하는 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-소르틸린 항체의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 본원에서 상술된 본 발명의 하이브리도마 또는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 본 발명의 항체를 정제하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에서 이용되는 용어인, 본원에서 정의된 바와 같은 항-소르틸린 항체를 포함하며, 소르틸린에 결합할 수 없거나 조제물의 항-소르틸린 작용성을 실질적으로 변경하지 않는 자연-발생 항체가 실질적으로 없는 조제물에 관한 것이다. 따라서, 이러한 조제물은 항-소르틸린 항체 및 조제물의 항-소르틸린 항체의 작용성을 변경하지 않는 다른 항체의 혼합물을 포함하는, 자연-발생 혈청, 또는 이러한 혈청의 정제된 유도체를 포괄하지 않으며; 여기서 상기 작용성은 다음과 같다:
(i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능; 뇌에서 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능 및/또는
(vi) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD) 및/또는 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료 제공능.
본 발명은 특히 자연 발생 항-소르틸린 항체의 구조 대비 그 아미노산 서열에(임의의 그 CDR, 가변 도메인, 프레임워크 잔기 및/또는 불변 도메인에) 구조적 변화를 갖는 이러한 항-소르틸린 항체의 조제물에 관한 것이며, 여기서 상기 구조적 변화는 항-소르틸린 항체 모노클로날 항체가 상기 자연 발생 항-소르틸린 항체에 의해 나타나는 작용성 대비 현저히 변경된 작용성(즉, 작용성에서 20% 초과 차이, 40% 초과 차이, 60% 초과 차이, 80% 초과 차이, 100% 초과 차이, 150% 초과 차이, 2배 초과 차이, 4배 초과 차이, 5배 초과 차이, 또는 10배 초과 차이)을 나타내도록 유도하고; 이러한 작용성은 다음과 같으며 특히 이러한 변경된 작용성은 구조적 변화의 결과이고, 이에 따라 이로부터 분리 불가능하다:
(i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(vi) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능;
(vii) 뇌에서 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능 및/또는
(vi) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD), 근위축 측삭 경화(ALS) 및/또는 알츠하이머병(AD)의 치료 제공능.
자연 발생 항체의 "실질적으로 없는"이라는 용어는 상기 조제물에서 상기 자연 발생 항체의, 또는 조제물의 소르틸린-결합 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 조제물 내 상기 자연 발생 항체의 농도 도입의 완전 부재를 나타낸다. 항체는 이것이 자연 발생 대응부를 갖지 않거나 이에 자연적으로 수반되는 성분으로부터 분리되거나 정제된 경우, "단리된" 것으로 언급된다.
상기 조제물과 관련되는 "자연 발생 항체"라는 용어는 이의 면역계의 기능에 대한 자연적 결과로서, 살아있는 인간 또는 다른 동물 내에서 야기되는 항체(자연-발생 자가항체 포함)를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 조제물은 항-소르틸린 항체 및 소르틸린에 의해 보유되지 않는 에피토프에 결합할 수 있는 고의로 첨가된 추가 항체를 함유하는 이러한 조제물을 배제하지 않으며, 실제로 명시적으로 포괄한다. 이러한 조제물에는 특히 조제물이 이마관자엽 치매(FTD) 및/또는 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료에서 증강된 유효성을 나타내는 이의 구현예가 포함된다.
본 발명의 이의 항원-결합 단편의 항체는 상이한 세포주, 예컨대 인간 세포주, 포유류 비-인간 세포주, 및 곤충 세포주, 예를 들어 CHO 세포주, HEK 세포주, BHK-21 세포주, 쥐과 세포주(예컨대 골수종 세포주), 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주, HKB-11 세포주, CAP 세포주 및 HuH-7 인간 세포주(Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13., 그 내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 제조될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은
(i) 둘 다 본원에서 정의된 바와 같은 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이러한 항-소르틸린 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 본원에 정의된 용어인 조제물, 및
(ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 통상적 기법에 따른 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제, 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013]에 개시된 것들과 함께 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제는 본 발명의 선택된 화합물 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 약학적 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 에피토프 결합에 대한 본 발명의 선택된 화합물 또는 약학적 조성물의 요망되는 생물학적 특성에 대한 현저한 부정적 영향의 부재(예컨대, 실질적 영향 미만(10% 이하 상대 억제, 5% 이하 상대 억제 등))에 기반하여 결정된다.
본 발명의 약학적 조성물에는 또한 희석제, 충전에, 염, 완충제, 세제(예컨대, 비이온성 세제, 예컨대 Tween-20 또는 Tween-80), 안정화제(예컨대, 당 또는 단백질-비함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 약학적 조성물 내 도입에 적합한 다른 물질이 포함될 수 있다. 희석제는 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학적 조성물 또는 제형물에는 또한 다른 담체, 또는 무독성, 비치료, 비-면역원성 안정화제 등이 포함될 수 있다. 조성물에는 또한 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 예컨대 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예컨대, 라텍스 작용화 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 액체 응집물(예컨대, 오일 액적 또는 리포좀)이 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 채택되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 아마이드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 채택되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 다른 약물, 채택되는 특정 조성물과 병용되는 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 등 의학 분야에 널리 공지된 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 근거할 것이다.
약학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 비경구, 국소, 경구 또는 비강내 수단을 포함하는 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여된다. 본원에서 이용되는 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"이라는 어구는 보통 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 낭내, 안구내, 심장내, 피내, 복강내, 힘줄내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 두개내, 흉강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다. 생체내 및 시험관내 본 발명의 화합물 투여의 추가적인 적합한 경로는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
약학적으로 허용 가능한 담체에는 본 발명의 화합물과 생리적으로 상용성인 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 채택될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 및 참기름, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트래거캔스 고무 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충액이 포함된다. 다른 담체는 약학 분야에 널리 공지되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 이용은 당분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 이용이 고려된다.
적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 항산화제, 예를 들어 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페놀 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 조성물에 등장화제, 예컨대 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 나트륨 클로라이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 선택된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 아주반트, 예컨대 보존제, 수화제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 함유할 수 있고, 이는 약학적 조성물의 보관 수명 또는 효과를 증강시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형물로 제조될 수 있다. 이러한 담체에는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다중무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 단독으로 또는 왁스 또는 당분야에 널리 공지된 다른 물질과 함께 포함될 수 있다. 이러한 제형물의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참고한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적으로 허용 가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 이용은 당분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 이용이 고려된다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물 내로 포함될 수 있다.
주사용 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로-에멀젼, 리포좀, 또는 다른 규칙화된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 수성 또는 비수성 용매 또는 분산 매질, 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 여러 경우에서, 바람직하게는 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 항체 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시켜 일으킬 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 성분, 예컨대 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 포함시킨 후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 요구되는 다른 성분, 예컨대 상기 열거된 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 포함시켜 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중 요구되는 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 포함시킨 후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법의 예는 활성 성분 + 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본원에 기재되는 상기 치료 및 이용 방법에서의 투여량 요법은 최적의 요망되는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 시사되는 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 이용되는 투여량 단위 형태는 치료받을 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적 개별 단위를 나타낸다; 각각의 단위는 요구되는 약학적 담체와 연합되어 요망되는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 사양은, (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성 치료를 위한 이러한 활성 화합물 배합 분야에 내재적인 제한에 의해 지정되고, 이에 직접 의존한다.
항-소르틸린 항체에 대한 유효 투여량 및 투여량 요법은 치료받을 질환 또는 질병에 의존하며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1~10 mg/kg/체중, 예컨대 약 0.1~5 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.1~2 mg/kg/체중, 예컨대 약 0.1~1 mg/kg/체중, 예를 들어 약 0.15, 약 0.2, 약 0.5, 약 1, 약 1.5 또는 약 2 mg/kg/체중이다.
당분야의 일반 숙련도를 갖는 의사 또는 수의사는 요구되는 약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준에서 약학적 조성물에 채택되는 항-소르틸린 항체 용량으로 시작하여 요망되는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상술된 요인에 의존할 것이다. 투여는, 예컨대 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하일 수 있고, 예를 들어 표적 부위에 근접하여 투여될 수 있다. 요망되는 경우, 약학적 조성물의 유효 1일 용량은 선택적으로 단위 투여량 형태로, 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 별도 투여되는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 하위용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독 투여될 수 있지만, 화합물을 상술된 바와 같은 약학적 조성물로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 표지 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 질환 또는 장애를 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하기 위한 진단 목적을 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 비제한적으로 FTD, ALS 또는 TDP43 단백병증, 예컨대 알츠하이머병(AD)을 포함하는 신경변성 또는 인지 질환 또는 장애의 검출 또는 진단을 제공한다: (a) 소르틸린에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 이용하여 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 피로글루타메이트화 Aβ 단편의 존재를 검정하는 단계; 및 (b) 항원 수준을 대조군 수준, 예컨대 정상 조직 샘플에서의 수준과 비교함으로써, 항원의 대조군 수준 대비 항원의 검정된 수준에서의 증가가 질환 또는 장애를 시사하거나, 질환 또는 장애의 중증도를 시사하는 단계.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당분야에 널리 공지된 면역조직화학 방법을 이용하여 생물학적 샘플에서 소르틸린 또는 소르틸린의 항원-결합 단편을 검정하기 위해 이용될 수 있다. 단백질 검출에 유용한 다른 항체-기반 방법에는 면역검정, 예컨대 효소 연관 면역검정(ELISA) 및 방사선면역검정(RIA) 및 메조스케일 탐색 플랫폼 기반 검정(MSD)이 포함된다. 적합한 항체 표지가 이러한 키트 및 방법에서 이용될 수 있고, 당분야에 공지된 표지에는 효소 표지, 예컨대 알칼리성 포스파타제 및 글루코스 옥시다제; 방사선동위원소 표지, 예컨대 요오드(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(121In), 및 테크네튬(99mTc); 및 발광 표지, 예컨대 루미놀 및 루시퍼라제; 및 형광 표지, 예컨대 플루오레신 및 로다민이 포함된다.
표지 항-소르틸린 항체 또는 이의 소르틸린-결합 단편의 존재는 진단 목적을 위해 생체내 검출될 수 있다. 하나의 구현예에서, 진단은 a) 이러한 표지 분자의 유효량을 대상체에 투여하는 단계; b) 표지 분자가 Aβ 침적 부위(존재하는 경우)에서 농축되도록 허용하고, 비결합 표지 분자가 배경 수준으로 제거되도록 허용하기 위해 투여 후 일정 시간 간격 동안 대기하는 단계; c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 d) 배경 수준을 초과하는 표지 분자의 검출은 대상체가 질환 또는 장애를 가짐을 시사하거나 질환 또는 장애의 중증도를 시사하도록 대상체에서 표지 분자를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예에 따르면, 분자는 당업자에게 공지된 특정 조영 시스템을 이용하여 검출에 적합한 조영 모이어티로 표지된다. 배경 수준은 검출된 표지 항체의 양을 특정 조영 시스템에 대해 이전에 결정된 표준 값과 비교하는 단계를 포함하는, 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 진단 방법에서 이용될 수 있는 방법 및 시스템에는 비제한적으로 전산화 단층촬영(CT), 전신 스캐닝, 예컨대 양전자 방출 단층촬영(PET), 자기 공명 조영(MRI), 및 초음파측정이 포함된다.
추가 양태에서, 본 발명은 의약에서 이용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 치료에서 이용하기 위한, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 양태의 용도 및 방법에서, 질환은 FTD; ALS; 또는 TDP43 단백병증, 예컨대 AD인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 이들 양태의 용도 및 방법에서, 치료는 만성이고, 바람직하게는 적어도 2주, 예컨대 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
[표 5]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
명백히 사전-공개된 문헌의 본 명세서 내 기재 또는 논의는 반드시 그 문헌이 당분야의 기술수준의 일부를 이루며 일반적인 공통 지식이라는 인정으로 간주되어서는 안 된다.
구현예
텍스트 및 실시예로부터 자명할 바와 같이, 본 발명은 추가로 아래의 구현예에 관한 것이다.
1. 소르틸린에 특이적으로 결합하고, 소르틸린에 대한 PGRN의 결합을 억제할 수 있는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 구현예 1에 있어서, 항체가 온전한 항체를 포함하거나 이로 구성되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 항원-결합 단편이 Fv 단편(예컨대 단일쇄 Fv 또는 디설파이드-결합 Fv); Fab-유사 단편(예컨대 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편); 및 도메인 항체(예컨대 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)로 구성되는 군으로부터 선택되는 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:170에 정의되는 소르틸린의 D 영역에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 SEQ ID NO:170에 정의되는 소르틸린의 D 영역의 적어도 3개 연속 아미노산, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개 연속 아미노산에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
(i) 0.5~10 nM, 예컨대 1~5 nM 또는 1~2 nM의 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD)
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능.
8. 구현예 7에 있어서, 항체 또는 이의 단편의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능이 소르틸린에 대한 PGRN 결합의 10% 이상; 예를 들어, 20% 이상; 또는 30% 이상 감소를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
9. 구현예 7 또는 8에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편 상기 항체 또는 이의 단편의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능이 22 nM 이하, 예컨대 22 nM 내지 1 nM, 또는 10 nM 내지 1 nM, 또는 5 nM 내지 1 nM의 IC50으로의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소 및/또는 억제를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 또는 인간화인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 표 5에서 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 하나 이상의 경쇄 CDR 1~3, 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
12. 구현예 11에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 경쇄 CDR 1~3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
13. 구현예 11 또는 12에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 표 5에서 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 하나 이상의 중쇄 CDR 1~3, 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
16. 구현예 15에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 중쇄 CDR 1~3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
17. 구현예 15 또는 16에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VH 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
18. 구현예 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 바와 같은 VL 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VL의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 도메인 및 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VH의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VL의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 및 표 5에 정의된 각각의 항체에 대해 기재된 VH의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 소르틸린으로의 결합에 대해 구현예 20에서 정의되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 Fc 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
24. 구현예 22에 있어서, 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기, 지방산 및 덱스트란으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
26. 구현예 25에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 형광 표지; 화학발광 표지; 상자성 표지; 방사선-동위원소 표지; 또는 효소 표지로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
27. 구현예 25 또는 26에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 방사선동위원소를 포함하거나 이로 구성되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
28. 구현예 26 또는 27에 있어서, 방사선동위원소가 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 123I 및 201Tl로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
29. 구현예 25에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 상자성 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
30. 구현예 29에 있어서, 상자성 동위원소가 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
31. 구현예 25 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 조영 기법, 예컨대 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 조영에 의해 검출 가능한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
32. 구현예 25 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 연결 모이어티를 통해 간접적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 연결되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
33. 구현예 32에 있어서, 연결 모이어티가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편: 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA) 유도체; 데페록사민(DFO); 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 유도체; S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA) 유도체; 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA) 유도체.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
35. 구현예 34에 있어서, cDNA 분자인 핵산 분자.
36. 구현예 34 또는 35의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
37. 구현예 34 내지 36 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
38. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 인코딩된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 구현예 37에서 정의된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조제물로서, 상기 조제물에 소르틸린에 결합할 수 없거나 조제물의 항-소르틸린 작용성을 실질적으로 변경하지 않는 자연 발생 항체가 실질적으로 없고, 상기 작용성이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조제물:
(i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능; 및/또는
(vi) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD) 및/또는 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료 제공능.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나의 모노클로날 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조제물로서, 상기 모노클로날 항체가 자연 발생 항-소르틸린 항체의 구조 대비 그 아미노산 서열에서 구조적 변화를 보유하며, 상기 구조적 변화는 상기 모노클로날 항체가 상기 자연 발생 항-소르틸린 항체에 의해 나타나는 작용성 대비 변경된 작용성을 나타내도록 유도하고, 상기 작용성은 다음과 같은 조제물:
(i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
(ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
(iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
(iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
(v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능; 및/또는
(vi) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD) 및/또는 근위축 측삭 경화(ALS)의 치료 제공능.
41. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 구현예 39 또는 40의 조제물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
42. 구현예 1 내지 33, 39 또는 40 중 어느 하나에 있어서, 의약에서 이용하기 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조제물.
43. 구현예 1 내지 33, 39 또는 40 중 어느 하나에 있어서, 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료에서 이용하기 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조제물.
44. 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서, 구현예 1 내지 33, 39 또는 40 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조제물의 용도.
45. 구현예 43 또는 44에 있어서, 질환이 FTD; ALS; TDP43 단백병증, 예컨대 AD로 구성되는 군으로부터 선택되는, 이용하기 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 용도.
46. 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체 또는 이의 단편, 구현예 39 또는 40의 조제물, 또는 구현예 41의 약학적 조성물의 유효 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
47. 구현예 43, 44 또는 46 중 어느 하나에 있어서, 질환이 FTD; ALS; 또는 TDP43 단백병증, 예컨대 AD로 구성되는 군으로부터 선택되는, 이용하기 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 용도, 또는 방법.
48. 구현예 46 또는 47에 있어서, 치료가 만성인, 이용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 용도; 또는 방법.
49. 구현예 48에 있어서, 만성 치료가 적어도 2주, 예컨대 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안인, 이용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는 용도; 또는 방법.
50. 구현예 1 내지 33, 또는 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 소르틸린에 특이적으로 결합하고 소르틸린에 대한 PGRN의 결합을 억제할 수 있지만, 그 결합이 소르틸린에 대한 뉴로텐신 또는 AF38469의 결합을 억제하거나 실질적으로 억제하지 않는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 조제물, 또는 약학적 조성물.
51. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 구현예 39 또는 40의 조제물, 또는 구현예 41의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
본 발명의 소정 양태를 구현하는 바람직한 비제한적 실시예가 이제 수반되는 도면을 참조하여 기재될 것이다.
실시예
실시예 1~3은 소르틸린 구축물의 생성을 기재한다.
실시예 1은 셔플 구축물을 개시한다. 실시예 2는 소르틸린 구축물의 발현을 개시한다. 실시예 3은 소르틸린 구축물의 정제를 개시한다.
실시예 4~7은 소르틸린 항체의 생성을 기재한다.
실시예 4는 면역화 및 하이브리도마를 개시한다. 실시예 5는 서열 분석을 개시한다. 실시예 6은 항체의 정제를 개시한다. 실시예 7은 마우스 항체의 생성을 개시한다.
실시예 8~17은 소르틸린 항체의 특성규명을 기재한다.
실시예 8은 소르틸린에 대한 결합을 개시한다. 실시예 9는 소르틸린 항체의 교차 차단력을 개시한다. 실시예 10은 HTRF PGRN-소르틸린 결합을 개시한다. 실시예 11은 NTS 결합을 개시한다. 실시예 12는 세포 PGRN 결합 및 세포내이입을 개시한다. 실시예 13은 세포외 PGRN 수준을 개시한다. 실시예 14은 iPSC PGRN 수준을 개시한다. 실시예 15는 혈장 PGRN 수준을 개시한다. 실시예 16은 HDX에 의한 에피토프 맵핑을 개시한다. 실시예 17은 뇌에서 PGRN의 미세투석을 개시한다.
실시예 1
하이브리도마 스크리닝 공정 및 항체 패널의 다양화로서 모두 이용하기 위해, 소위 "셔플 구축물"을 설계하고, 구축하고, 제조하여, 유의미하게 감소된 서열 상동성을 갖는 인간 소르틸린 및 멀리 관련된 종(테트라오돈(tetraodon)) 둘 다에서 유래된 아미노산 서열을 함유하는 키메라 소르틸린 분자 세트를 제조하였다. 논리는 전반적인 소르틸린 구조 및 이러한 키메라 구축물의 작용성이 보유될 것이지만, 소정 키메라 구축물에 대한 항체의 결합 손실은 결합에서 특정한 교환 영역의 관여를 시사할 것이라는 것이다. 가용성 세포외 영역(ECD, aa 1~755) 구축물을 BAP 태그(바이오틴 수신체 펩타이드)로 태그화하여, 바이오틴 리가제 또는 His 태그의 공동 발현에 의한 단백질의 "시험관내" 바이오틴화를 구현함으로써 용이한 정제를 구현하였다. 다음 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 제조하였다: SORT-ECDBAP, SORT-ECDBAP-hB01-05, SORT-ECDBAP-hB06-10, SORT-ECDBAP-hB12390, SORT-ECDBAP-hB45678, SORT-ECDBAP-tetra, SORT, SORT-tetra.
소르틸린 서열은 SEQ ID NO:169 ~180에서 확인될 수 있고, 도 2는 소르틸린 셔플 구축물로의 결합에 기반한 항체 영역 할당의 도식적 제시를 나타낸다.
실시예 2
항체 발현의 경우, 실시예 4, 5 및 6에 기재된 바와 같은 적절한 중쇄 및 경쇄 벡터를 HEK-293F 세포에서 공동-발현시켰다.
실시예 3: His-태그화 소르틸린의 정제
SORTECDHis를 HEK-293F 세포에서 발현시켰다. 단백질 내 His-태그는 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피로의 정제를 구현한다. 이 공정에서 NiNTA Superflow 카트리지(Qiagen)를 50 mM NAH2PO4, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸 pH 8.0으로 평형화한다. 컬럼에 체류 시간 1분으로 His 태그화 단백질을 로딩한다. 컬럼을 50 mM NAH2PO4, 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸 pH 8.0으로 세척한다. 단백질을 50 mM NAH2PO4, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸 pH 8.0으로 용출한다. 이후 단백질을 10.000 mwco의 컷오프를 갖는 Slide-A-Lyzer(Thermo Scientific)를 이용하여 PBS에 대해 투석한다. 투석 후 단백질을 0.2마이크론 SFCA 필터(Thermo Scientific)를 이용하여 멸균 여과한다.
인간 야생형(WT) 소르틸린 발현 벡터로 HEK293 세포를 형질감염시켜 S18-HEK 세포주를 생성하였다. 안정한 형질감염 세포를 선택 제제의 존재 하 계대 후 유도하였다. 개별 클론을 희석 클로닝에 의해 선택하였다. 클론을 QPCR을 이용하여 소르틸린 mRNA 발현에 대해 특성규명하였다. 이어서 최고 발현 클론을 항-소르틸린 폴리클로날 항체(폴리클로날 염소 소르틸린 바이오틴화 Ab, Cat.No: BAF2934 (R&D Systems))를 이용해서 FACS(Guava, Millipore)에 의해 분석하여 소르틸린의 표면 발현 수준을 결정하였다.
실시예 4
A - 트랜스제닉 마우스의 면역화 절차
HuMAb 마우스 계통 Hco12, HCo17, Hco20, Hco12-BALB/c 및 Hco17-BALB/c 및 HCo20-BALB/c의 면역화로 항체 HuMab 소르틸린을 유도하였다(인간 모노클로날 항체; Medarex Inc., San Jose, CA, USA). 이들 마우스는 마우스 면역글로불린(Ig) 중쇄 및 마우스 카파 경쇄에 대해 이중 녹아웃이며, 이는 완전 쥐과인 항체 발현을 실질적으로 불활성화한다. 인간 Ig 중쇄 및 인간 Ig 카파 경쇄 유전자위의 삽입에 의해 트랜스제닉이고 인간 VH(중쇄의 가변 도메인) 및 VL(경쇄의 가변 도메인)의 유전자 수가 상이한 다양한 마우스 계통을 만들었다. HCo12-BALB/c 마우스는 KCo5-BALB/c(카파 경쇄 트랜스제닉) 마우스와의 교배에 의해 유도하였다.
48마리 마우스를 20 ㎍ SORTECDHis(SEQ ID NO: 179)로 복강내(IP) 및 동일한 단백질로 피하(SC, 꼬리 기부에서)로, 14일 간격으로 교대 면역화하였다. 4회 IP 및 4회 SC의 최대 8회 면역화를 수행하였다.
하나의 프로토콜에서, 최초 면역화는 완전 프로인트 아주반트(CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 중 SORTECDHis로 수행하였고, 다음 면역화는 불완전 프로인트 아주반트(IFA) 중에 수행하였다. 두 번째 프로토콜에서는 모든 면역화 단계에 아주반트로서 SAS를 이용하였다. 혈청 역가가 충분한 것으로 나타나면(적어도 2회 순차적으로, 2주 1회, 스크리닝 이벤트에서 항원 특이적 스크리닝 검정에서 1/50 이하의 혈청 희석이 양성으로 나타나면), 마우스를 추가로 융합 4일 및 3일 전에, 100 ㎕ PBS 중 10 ㎍ SORTECDHis 단백질로 정맥내(IV) 2회 추가접종하였다.
B - HuMab 하이브리도마-생성
상기 정의된 바와 같이 충분한 항원-특이적 역가가 발생한 HuMAb 마우스를 희생시키고, 복부 대동맥 및 대정맥에 인접한 비장 및 림프절을 수집하였다. 비장세포 및 림프절 세포와 마우스 골수종 세포주의 융합은 본질적으로 제조업체의 지침에 따라, CEEF 50 Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA)을 이용하여 전기융합에 의해 수행하였다. 융합 세포를 HyQ mADCF-Mab(Perbio) 중 10% 태아 클론 I 소 혈청(Perbio), 1 mM 나트륨 피루베이트(Cambrex), 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신(Cambrex), 50 μM 2-머캅토에탄올(Invitrogen), 600 ng/mL 인터류킨 6(IL-6)(Strathmann), 1 x HAT(Sigma) 및 0.5 mg/mL 카나마이신(Invitrogen)을 함유하는 융합 배지에 접종하였다. 10일 후, 상청액을 수확하고, 세포를 HyQ mADCF-Mab 중 10% 태아 클론 I 소 혈청, 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신, 600 ng/mL IL-6 및 1 x proHT(Cambrex)를 함유하는 수확 배지로 리프레시화하였다. 하이브리도마 배양 상청액을 일차 스크리닝 검정 및 SORTECDBAP(SEQ ID NO 171), SORTECDBAPhB06-10(SEQ ID NO 176), SORTECDBAPhB12390(SEQ ID NO 177)에 커플링된 스트렙타비딘 비드에 의해 스크리닝하여 인간(또는 키메라) 항-소르틸린 항체를 제조하는 하이브리도마를 검출하였다. 최적 일차 웰로부터의 하이브리도마 세포를 40% CloneMedia(Genetix, Hampshire, UK) 및 60% HyQ 2x 완전 배지(Hyclone, Waltham, USA)로 제조된 반고체 배지에 접종하였다. 각각의 일차 웰에 대해, Genetix 검은색 6-웰 플레이트의 한 웰을 접종하였다. 각각의 웰로부터, 25개 서브클론을 ClonePix 시스템(Genetix)을 이용하여 피킹하였다. 서브클론을 수확 배지 중에서 피킹하였다. 7일 후, 서브클론 상청액을 다시 소르틸린-특이적 인간 IgG 결합에 대해 스크리닝하고, 인간 IgG 농도를 Octet 384red(Fortebio, Menlo Park, USA)를 이용하여 측정하였다. 각각의 일차 웰로부터, 최적 서브클론을 선택하여 600 ng/mL IL-6, 0.5 U/mL 페니실린, 0.5 U/mL 스트렙토마이신 및 1 x proHT만 함유하는 증식 배지에 증식시켰다. 서브클론을 하나의 96-웰 플레이트의 웰로부터 하나의 24-웰 플레이트의 웰로, 4개의 24-웰 플레이트의 웰로, 6개의 6-웰 플레이트의 웰로 증식시켰다. 상기 공정에 의해 유도된 클론을 일차 클론(PC)으로 명명하였다.
본 발명의 항-소르틸린 HuMab 항체를 확인하여 서열 분석을 하였다.
실시예 5: 소르틸린 -특이적 HuMab 가변 도메인의 서열 분석 및 발현 벡터 내 클로닝
총 RNA를 0.2 내지 5x106 하이브리도마 세포로부터 제조하고 5'-RACE-상보성 DNA(cDNA)를 제조업체의 지침에 따라, SMART RACE cDNA Amplification 키트(Clontech)를 이용하여 100 ng 총 RNA로부터 제조하였다. VH 및 VL 코딩 영역을 PCR에 의해 증폭하고, 결찰 독립적 클로닝에 의해 p33G1f 및 p33Kappa 발현 벡터(인간 IgG1/카파 불변 도메인 인코딩 서열 함유) 내에 인 프레임으로 직접 클로닝하였다(Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74). 각각의 항체에 있어서, 16개의 VL 클론 및 16개의 VH 클론을 서열분석하였다. 정확한 개방 해독틀(ORF)을 갖는 클론을 추가 연구 및 발현을 위해 선택하였다. 모든 조합의 중쇄 및 경쇄의 벡터를 293fectin을 이용하여 FreestyleTM 293-F 세포에서 일시적으로 공동-발현하였다.
생성 서열을 본원에서 서열 목록에 나타낸다(SEQ ID NO:1 ~168). CDR 서열은 공개된 가이드라인에 따라 정의하였다.
실시예 6: 항체의 정제
배양 상청액을 0.2 ㎛ 데드-엔드 필터를 통해 여과하고, 5 mL 단백질 A 컬럼(rProtein A FF, Amersham Bioscience) 상에 로딩하고, 0.1 M 시트르산-NaOH, pH 3으로 용출하였다. 용출액을 2 M Tris-HCl, pH 9로 즉시 중화하고, 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4(B.Braun)에 대해, O/N(하룻밤 동안) 투석하였다. 투석 후, 샘플을 0.2 ㎛ 데드-엔드 필터를 통해 멸균 여과하였다. 순도를 SDS-PAGE에 의해 결정하고, 농도를 혼탁측정 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 정제된 항체를 분취하고 -80℃에서 보관하였다. 해동되면, 정제된 항체 분취물을 4℃에서 보관하였다. 질량 분광측정을 수행하여 하이브리도마에 의해 발현되는 항체 중쇄 및 경쇄의 분자량을 확인하였다.
실시예 7: 마우스 항체(1F2 및 5E1)의 생성
면역원
키메라성 면역원 h소르틸린-FC(SEQ ID NO:169의 인간 소르틸린 AA(78~756)) 및 SEQ ID NO:169의 인간 IgG1-FC AA(104~330)를 코딩하는 합성 유전자를 pcDNA3.1 내로 클로닝하고 Invitrogen의 프리스타일 시스템을 이용하여 발현을 위해 이용하였다. 인간 항체를 위해 상술된 항체 정제에 대한 표준 절차를 이용하여 단백질-A 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 항원을 정제하였다.
하이브리도마 생성
h소르틸린-FC를 면역원으로 이용하였고 5마리 BALB/c 마우스를 면역화하였다. 만족스러운 면역 반응을 갖는 마우스를 세포 융합 및 하이브리도마 생성을 위해 선택하였다. 코팅 항원으로 h소르틸린-ECD를 이용하는 ELISA에 의해 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 9개 모체 클론에서 유도된 총 18개 하이브리도마 세포주를 생성하였다.
발현
하이브리도마를 처음에 완전 성장 배지, 10% FBS+항생제 함유 DMEM 중에 성장시킨 후 발현 실험을 위해 CDhybridoma 배지(Invitrogen)로 적응시켰다.
정제
공급업체(GE healthcare)에서 권장되는 표준 절차에 따라 단백질-G 세파로스에 의해 하이브리도마 세포 배양 상청액으로부터 마우스 모노클로날 항체를 정제하였다.
실시예 8: 소르틸린의 재조합 세포외 영역에 대한 소르틸린 특이적 HuMab 및 마우스 항체의 친화도
소르틸린에 대한 항-소르틸린 HuMab 항체의 결합 동역학을 Octet 384RED를 이용하여 결정하였다(Fortebio, Menlo Park, USA). 2 ㎍/ml의 HuMab 용액을 샘플 희석제(ForteBio, art. No. 18-5028) 중 희석에 의해 제조하였다. Prot A 센서(ForteBio, art.no. 18-0004)를 적어도 600초 동안 동역학 완충액(PBS 중 1:10 샘플 희석제)으로 사전 수화시켰다. 이후 센서를 600초 동안 HuMab 용액으로 고정화하였다. 120초 동안 동역학 완충액 중에 침지시켜 기준선 반응을 수득하였다. SORTECD 구축물의 연합을 1000초 인큐베이션 동안 수행하였다. 여기에 100초 동안 동역학 완충액 중 해리가 뒤따랐다. 해리 후, 센서를 재생시키고(10 mM 글리신 pH 1.0) 5초 동안 3회 중화하였다(동역학 완충액). 모든 HuMab을 4개 농도의 SORTECD 구축물(10, 5, 2.5 및 1.25 ㎍/ml)을 이용하여 분석하였다. 분자량 76.8 kDA을 SORTECDHis에 대해 이용하였다. 데이터를 전체 완전 피팅(global full fit)을 이용하여 ForteBio Analysis 6.4 소프트웨어로 피팅시켰다. 결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.
실시예 9: 항-소르틸린 HuMab의 항체 교차 차단
항체 교차-차단 연구를 Octet 384RED(Fortebio, Menlo Park, USA)를 이용하여 수행하였다. 2 ㎍/ml의 HuMab 항체 용액을 샘플 희석제(ForteBio, art. No. 18-5028) 중 희석에 의해 제조하였다. 아민 반응성 센서(ForteBio, art.no. 18-0008)를 HuMab의 면역화를 위해 이용하였다. 아민 반응성 센서로의 커플링 전에, HuMab를 MES pH 6.0 완충액(18-5027) 중에 희석하였다. 커플링은 다음과 같이 30℃ 및 1000 rpm에서 수행하였다: 아민 반응성 센서를 PBS 중에 사전 수화시킨 후 EDC/NHS(ForteBio. Art.no. 18-1033/18-1034) 활성화 용액(제조업체의 지침에 따라)으로 300초 동안 활성화하였다. 활성화된 센서를 600초 동안 HuMab으로 고정화하였다. 고정화된 센서를 에탄올아민(ForteBio, cat no. 18-1039)으로 잔여 아민 반응성에 대해 켄칭하였다. 켄칭 후, 센서를 사용 전까지 PBS 중에 배치하였다. 교차 차단 분석은 30℃ 및 1000 rpm에서 기준선 반응을 확립하며 시작하였다. 120초 동안 샘플 희석제 중 침지시켜 기준선 반응을 수득하였다. SORTECDHis의 연합을 300초 동안 수행한 후 바로 300초 동안 HuMab의 연합을 수행하였다. HuMab의 연합 후, 센서를 재생시키고(10 mM 글리신 pH 1.0) 5초 동안 3회 중화하였다(샘플 희석제). 데이터를 ForteBio Analysis 6.4 소프트웨어를 이용하여 처리하였다.
항체는 상이한 소르틸린 셔플 구축물에 대한 이의 결합 프로필에 기반하여 그룹화하였다(도 2, 도 3 및 도 4). 영역 D(및 영역 F)로부터의 모든 항체가 인간 야생형 소르틸린 ECD 상에서 동일한 영역에 결합함을 확인하기 위해, 야생형 인간 소르틸린 ECD에 대한 서로의 결합을 차단하는 이들의 능력을 Octet384 red를 이용한 교차 차단 연구에서 특성규명하였다. 예를 들어, 동일 영역으로부터의 항체를 시험한 경우, 일차 항체는 이차 항체의 결합을 차단할 것이고, 반대도 마찬가지일 것이다. 반면, 상이한 영역으로부터의 항체를 시험한 경우, 일차 항체에 의해서는 하나의 영역만 차단되고 나머지 영역은 이차 항체가 결합하기 위해 이용 가능하므로, 교차 차단이 존재하지 않을 것이다. 도 7은 모든 D-영역 및 D+ 항체가 서로 교차 차단함을 나타내어 셔플 구축물에 기반한 영역 D 및 D+에 대한 항체의 분류를 확인시켜준다. 또한, 이러한 데이터는 키메라성 소르틸린 구축물이 원상태 인간 야생형 소르틸린 ECD에 대해 유사성을 보유함을 또한 확인시켜주었다.
실시예 10: 항- 소르틸린 항체의 존재 하 소르틸린 - PGRN 리간드 결합의 특성규명.
동종성 시간차 형광(HTRF, CisBio) 검정을 이용하여 소르틸린에 대한 PGRN 결합의 변위를 측정함으로써 항체에 대한 IC50값을 결정하였으며, 도 5 및 도 6을 참고한다.
실험을 Greiner 384웰, 흰색, 저부피 마이크로타이터 플레이트(784075, Greiner)에서 총 부피 20 ㎕의 검정 완충액(50 mM 포스페이트, pH 7.0, 0.1% BSA) 중 수행하였다.
항체를 50 nM HIS-태그화된 소르틸린 ECD 및 4 nM PGRN(SULU20110924)과 실온에서 15분 동안 사전 인큐베이션한 후 콘주게이트 완충액(50 mM 포스페이트, pH 7.0, 0.8 mM KF, 0.1% BSA) 중 희석된 7 nM 항-6HIS-d2 및 0.7 nM 항-PGRN-Eu 크립테이트(Cisbio)를 첨가하였다. 20 μM 뉴로텐신을 양성 대조군으로 이용하였고 완충액 중 DMSO를 음성 대조군으로 이용하였다.
검정 플레이트를 실온에서 60분 동안 및 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 EnVision 판독장치(Perkin Elmer)에서 판독하였다.
표지되지 않은 뉴로텐신 및 DMSO 블랭크를 각각 검정 설정을 위한 양성 및 음성 대조군으로 이용하였다. 항체의 용량-반응 평가를 3-배 희석 곡선에서 1 μM 내지 50 pM을 커버하는 10개 농도로 수행하였다.
절반-최대 억제 농도(IC50)를 XLfit 4(IDBS, UK)에서 S자형 농도 반응(가변 경사)을 이용한 비-선형 회귀에 의해 계산하였다(도 5 및 6).
실시예 11: 항- 소르틸린 항체의 존재 하 소르틸린 - 뉴로텐신 결합의 특성규명.
소르틸린 특이적 화합물 AF38469(
Figure pct00015
et al, Bioorg Med Chem Lett. 2014 Jan 1;24(1):177-80, 2014)에 대한 IC50을 신틸레이션 근접 검정(SPA)을 이용하여 소르틸린에 대한 3H-뉴로텐신 결합의 변위를 측정함으로써 결정하였다.
384-웰 흰색 불투명 Optiplate(6007299, Perkin Elmer)에서 총 부피 40 ㎕로 검정 완충액(50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0.1% BSA, 0.1% Tween-20) 중 실험을 수행하였다.
150 nM HIS-태그화 소르틸린을 1 μM 소르틸린 특이적 항체(IgG1-6003-045 또는 IgG1-6003-068)를 포함하거나 포함하지 않고, 또는 인간 IgG1 이소형 대조군을 포함하여 실온에서 15분 동안 사전-인큐베이션한 후, 단백질 용액을 50 μM 내지 2.5 nM의 농도 시리즈로 AF38469를 함유하는 웰에 첨가하였다. 혼합물을 진탕장치 상에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 5 nM 3H-뉴로텐신 및 Ni-킬레이트 조영 비드(RPNQ0266, Perkin Elmer)를 첨가하였다. 검정을 동일 조건 하에 60분 동안 추가 인큐베이션하였다.
6 h 후, 플레이트를 ViewLux(360초 노출 시간) 상에서 판독하였다. 미표지 뉴로텐신 및 DMSO 블랭크를 각각 양성 및 음성 대조군으로 이용하였다.
AF38469에 대한 용량-반응 평가는 3-배 희석 곡선에서 50 μM 내지 2.5 nM의 10개 농도로 수행하였다. 절반-최대 억제 농도(IC50)는 XLfit 4(IDBS, UK)에서 S자형 농도 반응(가변 경사)을 이용한 비-선형 회귀에 의해 계산하였다. 결과를 도 8에서 확인할 수 있다.
실시예 12: 항- 소르틸린 항체의 존재 하 세포 표면 상에서 소르틸린 - PGRN 리간드 결합의 특성규명.
소르틸린이 일시적 형질감염된 세포 및 안정한 세포주 S18-HEK 세포(인간 소르틸린 과발현 HEK 세포)를 모두 본 검정에서 이용하였다. 세포를 트립신처리하고 96웰 플레이트에서 웰 당 42,000 세포 밀도로 평판접종하였다. 일시적으로 형질감염된 세포의 경우, 세포를 96웰 플레이트에서 형질감염 24 hr 후 평판접종하였다. 다음 날, 배지를 완전 교환하고, 배지 중 희석된 시험 화합물을 30분 동안 세포에 첨가한 후 4 hr 동안 PGRN을 첨가하였다. 연구 말기에(4.5 hr 후), 세포를 고정하고 PGRN에 대해 염색하였다. 모든 염색 플레이트를 Cellomics Array Scan(Thermo Fischer)에 의해 분석하고, PGRN/세포/웰에 대한 평균 염색 세기를 분석을 위해 이용하였다.
검정에서 이용된 PGRN을 배지로부터 수확한 후 HEK 293 세포에서 PGRN 발현 플라스미드의 일시적 형질감염 후 배지로부터 수확하였다. PGRN 수준은 PGRN ELISA 키트(R&D)를 이용하여 측정하였다.
세포에 첨가된 PGRN은 쉽게 결합되고 세포내이입되어, 소르틸린 형질감염된 웰에서 증가된 형광 신호를 생성하였다. 뉴로텐신의 첨가는 PGRN에 대한 소르틸린 결합을 예방하였고, PGRN 형광 세기는 대조군 수준과 유사하여, PGRN이 뉴로텐신의 존재 하에 결합되고 세포내이입되지 않았음을 시사하였다.
두 소르틸린 HumAb(45 및 68)는 모두 뉴로텐신과 유사한 유효성으로 PGRN의 섭취를 차단하였다. 이소형 대조군 항체, B12는 PGRN 세포내이입 또는 결합에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았다. 결과를 도 9에서 확인할 수 있다.
실시예 13: 세포외 PGRN 수준에 대한 항체의 효과
HEK293 세포 및S18-HEK 세포는 모두 어떠한 자극 없이도 배지 내로 PGRN을 연속 분비하는 것으로 나타났다.
항체 및 대조군 제제를 S18-HEK 세포에 첨가하여 PGRN 상에서의 효과를 평가하였다. 공지된 펩타이드 소르틸린 리간드인 뉴로텐신, 또는 인간 항체, 45, 68 및 811의 S18-HEK 세포에 대한 첨가는 세포 배양 배지에서 PGRN의 증가로 이어졌다. 2개의 소르틸린 인간 항체(45 및 68)는 뉴로텐신과 유사한 효과를 가지며 PGRN 수준을 각각 202% 및 201%까지 상승시켰다. 항체 811은 대조군 B12에 비해 배지 중 PGRN을 146%까지 증가시켰고, 이소형 대조군 항체는 모든 본 연구에서 음성 대조군으로 이용하였고, PGRN 수준에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다. 이러한 관찰은 시험된 소르틸린 항체가 PGRN의 소르틸린-매개 내재화를 억제함으로써, 세포외 PGRN을 증가시켰음을 시사한다.
1일차에, S18-HEK 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 24 hr 후, 배지를 배지 단독(대조군) 또는 시험 화합물이 보충된 배지로 완전 대체하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 화합물은 10 uM로 및 항체는 100 nM로 시험하였다. 배지를 3일차에 수집하고 PGRN ELISA(R&D)를 이용하여 분석하였다. 세포 생활성을 Cell TiterGlo(Pro Mega)에 의해 평가하여 화합물의 세포독성 효과를 평가하였다. 배지 중 PGRN 수준을 ELISA에 의해 분석하고 값을 대조군 웰에 대해 정상화하였다. 결과를 도 10에서 확인할 수 있다.
실시예 14: iPSC에서 세포외 PGRN에 대한 ELISA 검정
유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)를 인간 섬유아세포(정상 인간 피부 섬유아세포 18세 남성; Lonza)의 비-통합 재프로그래밍에 의해 다른 문헌(Rasmussen et al., Stem Cell Reports. 2014 Sep 9;3(3):404-13.)에 기재된 바와 같이 생성하였다. NHDF K1_shp53 세포주를 이러한 연구를 위해 이용하였다. iPSC를 먼저 mTESR 배지 중에 생성한 후 Pluripro(Cell Guidance System)에서 단층으로 배양하였다. 세포를 0일차에 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 디쉬 상에 재평판접종하고 이를 500 ng/mL noggin 및 10 μM SB431542를 포함하는 N3 배지(0.5% N2, 1% B27 + RA, 0,5 mM GlutaMAX, 0,5& NEA, 50 μM 2-머캅토에탄올 및 2.5 mg/mL 인슐린이 보충된 50% DMEM/F12 + 50% Neurobasal 배지) 중에 배양하여 뉴론 분화를 개시하였다. 배지를 매일 리프레시화하였다. noggin/SB431542 유도 11일 후, 세포를 디스파제로 분할하고 N3 배지 중 폴리-L-오르니틴/라미닌 상에 재-평판접종하였다. 이 시점부터 계속, N3 배지를 2~3일마다 리프레시화하고 세포를 아큐타제를 이용하여 대략 10~14일마다 분할하였다.
뉴론으로 분화한 iPSC 세포를 96웰 플레이트 내로 평판접종하였다. 1주 후, 항체를 세포에 첨가하였다. 48 hr 또는 96 hr에 세포로부터 배지를 수집하고 인간 PGRN ELISA(Enzo Life sciences)에 의해 분석하고 샘플을 제조업체의 지침에 따라 분석하였다.
시험한 소르틸린 인간 항체(45 및 68)는 48 hr 및 96 hr에 배지 중에서 다양한 수준에서 PGRN 수준을 증가시켰다. B12 및 항-Hel은 대조군 이소형 항체이다(음성 대조군). 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 데이터는 원-웨이 Anova에 이어 Dunnett 분석에 의해 분석하였다. *p<0.05; **p<0.01. 결과를 도 12에서 확인할 수 있다.
실시예 15
혈장 중 PGRN 수준에 대한 항체의 효과를 분석하기 위해, 인간화 소르틸린 KI 마우스에 피하 주사에 의해 소르틸린 항체 또는 이소형 대조군의 단회 또는 다회 주사(10 mg/kg)를 제공하였다. 동물을 마취하고 투여 후 다양한 시점에 희생시키고, 혈장 PGRN 수준을 ELISA에 의해 결정하였다.
A. 시간 경과 연구: 마우스를 항체(소르틸린 humab 또는 대조군 ab)로 처리하고 상이한 시점에 희생시켰다. 대조군 항체(항-Hel)로 처리된 마우스는 혈장 PGRN에서 변화를 나타내지 않은 반면, 소르틸린 humab 45로 처리된 마우스에서는 24 내지 48 hr에 피크를 이루는 것으로 나타난 후 4일경부터 점차 감소하는 PGRN 수준 증가가 존재하였다. PGRN 수준은 7일차에 여전히 상승되어 있었다.
B. 아만성 연구: 시간 경과 연구로부터의 데이터에 기반하여, 아만성 연구(4주)를 위한 일정한 항체 수준을 유지하기 위해, 소르틸린 KI 마우스에 소르틸린 인간 항체 45 또는 이소형 대조군 항체를 10 mg/kg, s.c.로 주 2회 투여하였다. 혈액 샘플을 연구 시작 시 및 매주 수집하여 혈장 PGRN 변화를 추적하였다. 연구 시작 시의 혈장 PGRN 수준은 두 동물군에서 모두 유사하였다. 1주차부터 소르틸린 항체45로 처리된 마우스에서 더 높은 수준의 혈장 PGRN이 나타났고, 연구를 통해 상승된 채 유지된다. 대조군 ab로 처리된 마우스는 혈장 PGRN에서 임의의 증가를 나타내지 않았고, 기준선 수준(0주차)으로 유지되었다.
C. 용량 반응 연구: 상이한 용량(4개 용량: 10, 2, 0.4 및 0.1 mg/kg)의 소르틸린(45) 및 대조군 항체(항-Hel)를 주사하고 2일차에 마우스를 희생시켰다. 혈장 PGRN은 소르틸린 humab으로 처리된 마우스에서 10 mg/kg 및 2 mg/kg로 상승하였고, 더 낮은 용량은 혈장 PGRN에 대한 효과를 갖지 않았으며, 이는 혈장 PGRN 수준에 대한 소르틸린 항체의 용량 의존적 효과를 뚜렷이 나타낸다. 대조군 항체로 처리된 마우스는 PGRN 수준에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
마우스를 0,4 ml Avertin IP로 마취하고 심장혈을 수집하여 500 ul kEDTA 바이알로 옮겼다. 샘플을 4℃에서 15분 동안 3600G에서 원심분리할 때까지 얼음 상에 유지하였다. 혈장을 마이크론성 바이알 내로 피펫팅하고 -20℃에서 냉동하였다. 샘플 중 PGRN을 제조업체의 지침에 따라 PGRN ELISA 키트(Adipogen)를 이용하여 측정하였다. 결과를 도 13에서 확인할 수 있다.
실시예 16: 수소/중수소 교환에 이어 질량 분광측정에 의한 프로그라눌린 -소르틸린 상호작용을 표적으로 하는 항체의 에피토프 맵핑
수소/중수소 교환에 이어 질량 분광측정(HDX-MS)에서, 단백질 내 골격 아마이드 수소의 교환 속도를 측정한다. 이에 의해, 프롤린 잔기를 제외한 전체 단백질 골격의 입체형태 역학을 탐침조사할 수 있다. 교환 반응의 속도는 골격 아마이드의 수소 결합 상태에 의해 그리고 더 적은 정도로 그 용매 접근성에 의해 결정된다. 예컨대 리간드의 존재에 의해 유도되는, 이들 두 파라미터에서의 미묘한 변화가 중수소 도입에서의 변화로서 관찰될 수 있다.
중수소 도입에서의 변화를 세부-위치확인하기 위해, 단백질을 산 안정형 프로테아제(예컨대 펩신)로 처리하고, 이는 전형적으로 10개 내지 15개 아미노산의 국소 영역을 생성한다. 리간드의 존재 하에 교란을 나타내는 영역은 결합 계면에 직접 관여되거나 결합 이벤트에 의해 알로스테리 영향을 받는다.
항체의 에피토프 맵핑
소르틸린의 세포외 영역(SEQ ID NO:188)의 중수소 도입을 mAb45, mAb68, mAb811 및 D 영역에 결합하지 않는 mAb30으로 명명된 항체의 부재 및 존재 하에 측정하였다. 측정이 안정-상태 조건에서 수행되었음을 보장하기 위해, 복합체를 25℃에서 15분 동안 평형화한 후 교환 반응을 개시하였다. 단백질 샘플을 중수소화 완충액(99% D2O, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pDread = 7.6) 내로 1:9(v/v) 희석에 의해 교환 반응을 개시하였다. 다양한 시점(15초, 1분, 10분, 1 h 및 8 h) 후, 교환 반응을 빙냉 켄칭 완충액(2 M 글리신, 0.8 M 트리스-(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), pH = 2.3)의 1:1(v/v) 희석에 의해 켄칭하여 pH를 2.46으로 감소시켰다. 켄칭된 샘플을 즉시 -80℃ 냉동기 안에 배치하고 분석 시까지 보관하였다. 소르틸린 샘플을 중수소화된 변성 완충액(6 M 구아니디늄 클로라이드, 99% D2O, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pDread = 7.6) 내로 1:9(v/v)로 희석한 후 16 h 동안 25℃에서 인큐베이션하여 완전 중수소화된 대조군 샘플을 제조한 후, 이들을 전술된 바와 같이 켄칭하고 취급하였다.
켄칭된 샘플을 해동하고 홈-패킹된 펩신 컬럼(내부 부피 60 ㎕, 펩신 비드는 Thermo Scientific Inc.에서 입수)이 장착된 냉각(0℃) 역상 UPLC-HDX-시스템(Waters Inc., USA) 내로 주입하였다. 여기서, 중수소화된 단백질 샘플로 20℃에서 온라인 펩신 소화를 거치고, 생성 펩신분해 펩타이드를 역상 UPLC에 의해 분리하였다. 펩타이드를 질량 분광측정계(Synapt G2 질량 분광측정계, Waters Inc, UK) 내로의 전기분무 이온화에 의해 이온화하고, 여기서 펩타이드는 이온 이동성에 의해 추가 분리한 후 최종 질량을 결정한다.
데이터 독립적(MSe) 및 데이터 의존적 획득의 조합을 이용한 일렬 질량 분광측정에 의해 완전 환원되고 비-중수소화된 샘플 상에서 펩타이드의 확인을 수행하였다.
데이터 분석
펩타이드의 확인
획득된 질량 스펙트럼을 GFP에 대해 잠긴 질량을 교정하고 PLGS 3.0에서 분석하였고, 이는 전구체 및 단편 이온을 로컬 단백질 데이터베이스와 매칭시켰다. 모든 펩타이드 확인은 주의하며 수동 평가하였다.
중수소화 도입의 결정: 획득된 질량 스펙트럼을 GFP에 대해 잠긴 질량을 교정하고 소프트웨어 DynamX 3.0(Waters Inc., USA)을 이용하여 항체의 부재 또는 존재 하에 모든 소르틸린 펩타이드에 대한 중수소 도입을 결정하였다.
펩타이드는 항체 존재 하에 0.5D를 초과하는 교환으로부터의 보호가 관찰된 경우, 결합 에피토프의 일부인 것으로 간주하였다.
[표 1]
Figure pct00016
실시예 17: 깨어서 자유롭게 움직이는 동물의 뇌에서 프로그라눌린 수준을 평가하기 위한 미세투석
밀기-당기기 미세투석 방법을 이용하여 깨어서 자유롭게 움직이는 마우스로부터 뇌 ISF 프로그라눌린(PRGN)을 평가하였다. 마우스를 조절되는 온도(22±1.5℃) 및 습도 조건(55~65%)에 단독-수용하고 12:12시간 명/암 사이클(06:00 h에 조명 켬)에 유지하였다. 음식 및 물은 자유롭게 이용 가능하였다. 본 연구를 인간 소르틸린 녹-인(hSORT1) 마우스(22주령)의 해마에서 수행하였다. 해마에서 미세투석을 구현하기 위해, 마우스를 이소플루란으로 마취하고, 뇌내 가이드 캐뉼라(CMA)를 뇌 내로 정위 임플란트하여, 해마에서 미세투석 탐침을 Paxinos 및 Franklin 2001의 도해에 따라 배치하였다(탐침 팁의 좌표: 3.1 mm 정수리점 후방 및 2.8 mm 정수리점 측방 및 경막 대비 1.3 mm). 가이드 캐뉼라의 고정을 위해 아크릴 시멘트를 이용하였다. 캐뉼라의 임플란트 후, 마우스를 투석 전 7일 동안 수술에서 회복하게 두었다. 수술일을 포함하는 처음 5일 동안, 동물은 진통 및 항생제 치료(리마딜 및 노로목스 프로롱가툼(Rimadyl and Noromox Prolongatum))를 받았다. 튜브를 통해 액체를 당겨냄으로써, 탐침으로부터의 관류액 손실을 방지하기 위해, 미세투석 실험 시작 24 h 전에 펌프를 또한 출구 튜브로 연결하였다. 관류 완충액으로, 25% 소 알부민 분획 V(Sigma)를 인공 CSF(aCSF; (mM): 147 NaCl, 2.7 KCl, 1.2 CaCl2, 0.85 MgCl2)로 이용 당일에 0.2%로 희석하고 0.1-㎛ 막을 통해 여과하였다. 펌프의 실제 유속을 탐침이 연결되지 않은 채 결정하였다. 주어진 시기 동안 샘플링 이전 및 이후 샘플 튜브를 칭량하고, 유속을 계산하였다. 이어서 펌프를 1 ㎕/분의 일정 흐름을 갖도록 설정하였다. 실험 기간에 걸쳐 120분 샘플링 방식을 이용하여 12개 샘플(12 h 수집)을 수집하였다(도 17, 절차용). 실험 종료 시, 동물로부터 혈액을 채취하고, 동물을 관류시키고 뇌를 수집하였다. 투석물, 혈장 및 뇌를 ELISA에 의한 PRGN 결정 시까지 -80℃에 보관하였다.
24 h 동안 2 h마다의 PRGN 수준 측정을 도 17에 도시한다. 2개의 투석물 수집 개시 후 24 h을 제외하고, 매 시기마다, PBS로 처리된 동물로부터와 비교하는 경우, 증가된 mab #45로 처리된 동물에서 PRGN 수준이 유의미하게 증가한다(도 18a). PRGN 수준은 해마에서 탐침 삽입 후 4 h 부터 16 h까지 경시적으로 안정하다. 최초 투석물에서 PRGN은 해마 내로의 탐침 삽입으로 인해 상승했을 수 있다. PRGN 수준은 탐침 삽입 후 18 h/20 h 이상 감소하는 것으로 분석되며, 이는 두 군에서 모두 일어났으므로(그리고 이전의 다른 밀기-당기기 연구에서 관찰되었으므로), 탐침 막의 응집으로 인한 것일 수 있다.
각 동물에 대해 그리고 이어서 풀링된 모든 동물에 대해, 항체 또는 비히클 처리 24 h 후 12개 투석 샘플의 평균 ± SEM을 기준선으로 취했다(도 18b). mab #45 및 PBS로 처리된 동물 간의 차이를 페어링하지 않은 t-테스트로 분석하였다. mab #45로 처리된 동물에서 PRGN의 기본 수준은 PBS로 처리된 동물과 비교하는 경우 유의미하게 증가하였다(p<0.001, F10.0, DFn, 9 Dfd 7; 3.3 ± 0.3 ng/ml, n=10 대 1.1 ± 0.1 ng/ml, n=8)(도 18b).
<110> H. 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Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Gly Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Thr Tyr His Cys 85 90 95 Thr Arg His Asp Asp Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 (Lambda) CDR1 Light Chain <400> 9 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 (Lambda) CDR2 Light Chain <400> 10 Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 (Lambda) CDR3 Light Chain <400> 11 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Phe Trp Val 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 (Lambda) CDR1 Heavy Chain <400> 12 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 (Lambda) CDR2 Heavy Chain <400> 13 Ile Ile Ser 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Phe 180 185 190 Thr Ala Asn His Asn Gly Ser Cys Ser Asn Asp Arg Gly Met Leu Glu 195 200 205 Leu Glu Arg Thr Thr Asp Tyr Gly Lys Ser Phe Lys Thr Val Ala Ser 210 215 220 Lys Ile Tyr Ser Phe Gly Leu Gly Gly Lys Phe Leu Phe Ala Ser Val 225 230 235 240 Met Thr Gly Lys Gly Thr Leu Arg Ala Ile His Val Ser Val Asp Asp 245 250 255 Gly Asp Thr Trp Asn Met Ala Gln Leu Pro Pro Val Gly His Glu Gln 260 265 270 Phe Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Asn Asp Glu Met Val Phe Met His Val 275 280 285 Asp Glu Pro Gly Asp Ser Gly Phe Gly Thr Ile Tyr Val Ser Asp Asp 290 295 300 Arg Gly Thr Val Tyr Ser Lys Ser Leu Glu Arg His Leu Tyr Thr Thr 305 310 315 320 Thr Gly Gly Glu Thr Asp Phe Ile Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val 325 330 335 Phe Thr Thr Ser Ile Leu Ala Glu Asp Lys Ser Val Gln Ser Val Ile 340 345 350 Ser Phe Asp Gln Gly Gly Glu Trp Val Pro Leu Arg Lys Pro Ala Asp 355 360 365 Ser Lys Cys Asp Ala Thr Ala Arg Asp Pro Glu Lys Cys Ser Leu His 370 375 380 Ile His Ala Ala Tyr Ser Ile Ala Thr Gly Leu Asn Val Pro Met Leu 385 390 395 400 Pro Leu Ser Glu Pro Asn Ala Val Gly Leu Val Leu Ala His Gly Ser 405 410 415 Val Gly Asp Ala Ile Ser Val Met Arg Pro Asp Val Tyr Val Ser Asp 420 425 430 Asp Gly Gly Tyr Thr Trp Ile Lys Ala Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr 435 440 445 Thr Ile Leu Asp Ser Gly Gly Ile Ile Val Ala Ile Glu His Ser Ser 450 455 460 Arg Pro Ile Asn Val Ile Lys Phe Ser Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Thr Phe Thr Arg Asp Pro Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala 485 490 495 Ser Glu Pro Gly Ala Arg Ser Met Asn Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr 500 505 510 Glu Ser Phe Leu Thr Ser Gln Trp Val Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys 515 520 525 Asp Ile Leu Glu Arg Asn Cys Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu 530 535 540 Ala His Ser Thr Asp Pro Glu Asp Tyr Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly 545 550 555 560 Tyr Lys Glu Gln Phe Leu Arg Leu Arg Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn 565 570 575 Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser 580 585 590 Leu Glu Asp Phe Leu Cys Asp Phe Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp 595 600 605 Ser Lys Cys Val Glu Gln Pro Glu Leu Lys Gly His Asp Leu Glu Phe 610 615 620 Cys Leu Tyr Gly Arg Glu Glu His Leu Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys 625 630 635 640 Ile Pro Gly Asp Lys Cys Gln Gly Gly Val Asn Pro Val Arg Glu Val 645 650 655 Lys Asp Leu Lys Lys Lys Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys 660 665 670 Gln Asn Ser Lys Ser Asn Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn 675 680 685 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 690 695 700 <210> 178 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortilin SORTECDBAP_hB45678 <400> 178 Arg Ser Thr Glu Gln Gly Glu Ser Cys Ser Gly Leu Leu Gly Ala Asp 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Gly Asn Thr His Gln His Ile Phe Asn Asp Leu Ser 20 25 30 Gly Ser Val Ser Leu Ala Trp Val Gly Asp Gly Thr Gly Val Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Gln Val Pro Ile Phe Met Ile Thr Ile Gly Gln 50 55 60 Ser Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Ser Phe Glu Asp Val 65 70 75 80 Thr Asn Leu Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Ser Asp Phe Gly Ile Ala 85 90 95 Ile Gly Pro Glu Asn Ser Gly Lys Val Ile Leu Thr Ala Asp Val Ser 100 105 110 Gly Ser His Gly Ser Arg Ile Phe Val Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ser 115 120 125 Phe Thr His Gln Glu Leu Pro Phe Val Pro Leu Met Gln Ile Thr Tyr 130 135 140 Asn Pro Glu Asn Ser Asn Val Leu Leu Ala Leu Ser Asn Lys Asn Glu 145 150 155 160 Leu Trp Leu Ser Glu Asp Phe Gly Thr Asn Trp Lys Lys Leu Tyr Asp 165 170 175 Ala Val Cys Leu Ala Lys Trp Gly Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe Thr 180 185 190 Thr Tyr Ala Asn Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Leu 195 200 205 Trp Arg Thr Ser Asp Leu Gly Lys Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val Lys 210 215 220 Ile Tyr Ser Phe Gly Leu Gly Gly Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Ala Asp Lys Asp Thr Thr Arg Arg Ile His Val Ser Thr Asp Gln Gly 245 250 255 Asp Thr Trp Ser Met Ala Gln Leu Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln Phe 260 265 270 Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Asn Asp Asp Met Val Phe Met His Val Asp 275 280 285 Glu Pro Gly Asp Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg 290 295 300 Gly Ile Val Tyr Ser Lys Ser Leu Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr 305 310 315 320 Gly Gly Glu Thr Asp Phe Thr Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr 325 330 335 Ile Thr Ser Val Leu Ser Glu Asp Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr 340 345 350 Phe Asp Gln Gly Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser 355 360 365 Glu Cys Asp Ala Thr Ala Lys Asn Lys Asn Glu Cys Ser Leu His Ile 370 375 380 His Ala Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Lys Leu Asn Val Pro Met Ala Pro 385 390 395 400 Leu Ser Glu Pro Asn Ala Val Gly Ile Val Ile Ala His Gly Ser Val 405 410 415 Gly Asp Ala Ile Ser Val Met Val Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp Asp 420 425 430 Gly Gly Tyr Ser Trp Thr Lys Met Leu Glu Gly Pro His His Tyr Ala 435 440 445 Ile Leu Asp Ser Gly Gly Leu Leu Val Ala Val Glu Gln Asn Ala His 450 455 460 Gln Gly Val Asn Gln Ile Lys Phe Ser Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp 465 470 475 480 Gly Val Tyr Asn Phe Thr Lys Asp Pro Ile Phe Phe Thr Gly Leu Ala 485 490 495 Ser Glu Pro Gly Ala Arg Ser Met Asn Val Ser Leu Trp Gly Tyr Arg 500 505 510 Ser Ser Leu Phe His Gln Tyr Trp Ile Ser Phe Thr Ile Asp Phe Arg 515 520 525 Asp Leu Ile Thr Arg Asn Cys Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu 530 535 540 Ala His Ser Thr Asp Pro Glu Asp Tyr Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly 545 550 555 560 Tyr Lys Glu Gln Phe Leu Arg Leu Arg Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn 565 570 575 Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser 580 585 590 Leu Glu Asp Phe Leu Cys Asp Phe Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp 595 600 605 Ser Lys Cys Val Glu Gln Pro Glu Leu Lys Gly His Asp Leu Glu Phe 610 615 620 Cys Leu Tyr Gly Arg Glu Glu His Leu Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys 625 630 635 640 Ile Pro Gly Asp Lys Cys Gln Gly Gly Val Asn Pro Val Arg Glu Val 645 650 655 Lys Asp Leu Lys Lys Lys Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys 660 665 670 Gln Asn Ser Lys Ser Asn Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn 675 680 685 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 690 695 700 <210> 179 <211> 763 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortilin SORTECD_HIS <400> 179 Met Glu Arg Pro Trp Gly Ala Ala Asp Gly Leu Ser Arg Trp Pro His 1 5 10 15 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Pro Pro Ser Thr Leu 20 25 30 Ser Gln Asp Arg Leu Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Pro 35 40 45 Arg Trp Ser Gly Pro Ile Gly Val Ser Trp Gly Leu Arg Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Gly Gly Ala Phe Pro Arg Gly Gly Arg Trp Arg Arg Ser Ala Pro 65 70 75 80 Gly Glu Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val Ala Lys Leu 85 90 95 Ala Asn Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu Val Leu Thr 115 120 125 Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln Ser Lys Leu 130 135 140 Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile Thr Asp Leu 145 150 155 160 Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala Ile Gly Pro 165 170 175 Glu Asn Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser Gly Gly Ser 180 185 190 Arg Gly Gly Arg Ile Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys Asn Phe Val 195 200 205 Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met Tyr Ser Pro 210 215 220 Gln Asn Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn Gly Leu Trp 225 230 235 240 Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu Ile His Lys Ala Val 245 250 255 Cys Leu Ala Lys Trp Gly Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe Thr Thr Tyr 260 265 270 Ala Asn Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu Leu Trp Arg 275 280 285 Thr Ser Asp Leu Gly Lys Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val Lys Ile Tyr 290 295 300 Ser Phe Gly Leu Gly Gly Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val Met Ala Asp 305 310 315 320 Lys Asp Thr Thr Arg Arg Ile His Val Ser Thr Asp Gln Gly Asp Thr 325 330 335 Trp Ser Met Ala Gln Leu Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln Phe Tyr Ser 340 345 350 Ile Leu Ala Ala Asn Asp Asp Met Val Phe Met His Val Asp Glu Pro 355 360 365 Gly Asp Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp Arg Gly Ile 370 375 380 Val Tyr Ser Lys Ser Leu Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr Thr Gly Gly 385 390 395 400 Glu Thr Asp Phe Thr Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val Tyr Ile Thr 405 410 415 Ser Val Leu Ser Glu Asp Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile Thr Phe Asp 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro Glu Asn Ser Glu Cys 435 440 445 Asp Ala Thr Ala Lys Asn Lys Asn Glu Cys Ser Leu His Ile His Ala 450 455 460 Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Lys Leu Asn Val Pro Met Ala Pro Leu Ser 465 470 475 480 Glu Pro Asn Ala Val Gly Ile Val Ile Ala His Gly Ser Val Gly Asp 485 490 495 Ala Ile Ser Val Met Val Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp Asp Gly Gly 500 505 510 Tyr Ser Trp Thr Lys Met Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr Thr Ile Leu 515 520 525 Asp Ser Gly Gly Ile Ile Val Ala Ile Glu His Ser Ser Arg Pro Ile 530 535 540 Asn Val Ile Lys Phe Ser Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp Gln Thr Tyr 545 550 555 560 Thr Phe Thr Arg Asp Pro Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Ser Glu Pro 565 570 575 Gly Ala Arg Ser Met Asn Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr Glu Ser Phe 580 585 590 Leu Thr Ser Gln Trp Val Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys Asp Ile Leu 595 600 605 Glu Arg Asn Cys Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu Ala His Ser 610 615 620 Thr Asp Pro Glu Asp Tyr Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly Tyr Lys Glu 625 630 635 640 Gln Phe Leu Arg Leu Arg Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn Gly Arg Asp 645 650 655 Tyr Val Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser Leu Glu Asp 660 665 670 Phe Leu Cys Asp Phe Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp Ser Lys Cys 675 680 685 Val Glu Gln Pro Glu Leu Lys Gly His Asp Leu Glu Phe Cys Leu Tyr 690 695 700 Gly Arg Glu Glu His Leu Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys Ile Pro Gly 705 710 715 720 Asp Lys Cys Gln Gly Gly Val Asn Pro Val Arg Glu Val Lys Asp Leu 725 730 735 Lys Lys Lys Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys Gln Asn Ser 740 745 750 Lys Ser Asn His His His His His His His His 755 760 <210> 180 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A region <400> 180 Ser Ala Pro Gly Glu Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Asn Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg 20 25 30 Gly Ser Val Ser Leu Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu 35 40 45 Val Leu Thr Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln 50 55 60 Ser Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile 65 70 75 80 Thr Asp Leu Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala 85 90 95 Ile Gly Pro Glu Asn Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser 100 105 110 Gly Gly Ser Arg Gly Gly Arg Ile Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys 115 120 125 Asn Phe Val Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met 130 135 140 Tyr Ser Pro Gln Asn Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn 145 150 155 160 Gly Leu Trp Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu Ile His 165 170 175 Lys <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A region amino acids 109-114 <400> 181 Arg Gly Ser Val Ser Leu 1 5 <210> 182 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A region amino acides 126-153 <400> 182 Val Leu Thr Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln 1 5 10 15 Ser Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn 20 25 <210> 183 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A region amino acides 126-144 <400> 183 Val Leu Thr Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln 1 5 10 15 Ser Lys Leu <210> 184 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A region amino acides 154-159 <400> 184 Phe Lys Asp Ile Thr Asp 1 5 <210> 185 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D region amino acids 570-572 <400> 185 Thr Gly Leu 1 <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D region amino acids 588-597 <400> 186 Phe Thr Glu Ser Phe Leu Thr Ser Gln Trp 1 5 10 <210> 187 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D region amino acids 593-597 <400> 187 Leu Thr Ser Gln Trp 1 5 <210> 188 <211> 696 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences used for HDX experiments <400> 188 Ser Ala Pro Gly Glu Asp Glu Glu Cys Gly Arg Val Arg Asp Phe Val 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Asn Asn Thr His Gln His Val Phe Asp Asp Leu Arg 20 25 30 Gly Ser Val Ser Leu Ser Trp Val Gly Asp Ser Thr Gly Val Ile Leu 35 40 45 Val Leu Thr Thr Phe His Val Pro Leu Val Ile Met Thr Phe Gly Gln 50 55 60 Ser Lys Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Gly Lys Asn Phe Lys Asp Ile 65 70 75 80 Thr Asp Leu Ile Asn Asn Thr Phe Ile Arg Thr Glu Phe Gly Met Ala 85 90 95 Ile Gly Pro Glu Asn Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Ala Glu Val Ser 100 105 110 Gly Gly Ser Arg Gly Gly Arg Ile Phe Arg Ser Ser Asp Phe Ala Lys 115 120 125 Asn Phe Val Gln Thr Asp Leu Pro Phe His Pro Leu Thr Gln Met Met 130 135 140 Tyr Ser Pro Gln Asn Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Ser Thr Glu Asn 145 150 155 160 Gly Leu Trp Val Ser Lys Asn Phe Gly Gly Lys Trp Glu Glu Ile His 165 170 175 Lys Ala Val Cys Leu Ala Lys Trp Gly Ser Asp Asn Thr Ile Phe Phe 180 185 190 Thr Thr Tyr Ala Asn Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Ala Leu Glu 195 200 205 Leu Trp Arg Thr Ser Asp Leu Gly Lys Ser Phe Lys Thr Ile Gly Val 210 215 220 Lys Ile Tyr Ser Phe Gly Leu Gly Gly Arg Phe Leu Phe Ala Ser Val 225 230 235 240 Met Ala Asp Lys Asp Thr Thr Arg Arg Ile His Val Ser Thr Asp Gln 245 250 255 Gly Asp Thr Trp Ser Met Ala Gln Leu Pro Ser Val Gly Gln Glu Gln 260 265 270 Phe Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Asn Asp Asp Met Val Phe Met His Val 275 280 285 Asp Glu Pro Gly Asp Thr Gly Phe Gly Thr Ile Phe Thr Ser Asp Asp 290 295 300 Arg Gly Ile Val Tyr Ser Lys Ser Leu Asp Arg His Leu Tyr Thr Thr 305 310 315 320 Thr Gly Gly Glu Thr Asp Phe Thr Asn Val Thr Ser Leu Arg Gly Val 325 330 335 Tyr Ile Thr Ser Val Leu Ser Glu Asp Asn Ser Ile Gln Thr Met Ile 340 345 350 Thr Phe Asp Gln Gly Gly Arg Trp Thr His Leu Arg Lys Pro Glu Asn 355 360 365 Ser Glu Cys Asp Ala Thr Ala Lys Asn Lys Asn Glu Cys Ser Leu His 370 375 380 Ile His Ala Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Lys Leu Asn Val Pro Met Ala 385 390 395 400 Pro Leu Ser Glu Pro Asn Ala Val Gly Ile Val Ile Ala His Gly Ser 405 410 415 Val Gly Asp Ala Ile Ser Val Met Val Pro Asp Val Tyr Ile Ser Asp 420 425 430 Asp Gly Gly Tyr Ser Trp Thr Lys Met Leu Glu Gly Pro His Tyr Tyr 435 440 445 Thr Ile Leu Asp Ser Gly Gly Ile Ile Val Ala Ile Glu His Ser Ser 450 455 460 Arg Pro Ile Asn Val Ile Lys Phe Ser Thr Asp Glu Gly Gln Cys Trp 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Thr Phe Thr Arg Asp Pro Ile Tyr Phe Thr Gly Leu Ala 485 490 495 Ser Glu Pro Gly Ala Arg Ser Met Asn Ile Ser Ile Trp Gly Phe Thr 500 505 510 Glu Ser Phe Leu Thr Ser Gln Trp Val Ser Tyr Thr Ile Asp Phe Lys 515 520 525 Asp Ile Leu Glu Arg Asn Cys Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Ile Trp Leu 530 535 540 Ala His Ser Thr Asp Pro Glu Asp Tyr Glu Asp Gly Cys Ile Leu Gly 545 550 555 560 Tyr Lys Glu Gln Phe Leu Arg Leu Arg Lys Ser Ser Val Cys Gln Asn 565 570 575 Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Lys Gln Pro Ser Ile Cys Leu Cys Ser 580 585 590 Leu Glu Asp Phe Leu Cys Asp Phe Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Asn Asp 595 600 605 Ser Lys Cys Val Glu Gln Pro Glu Leu Lys Gly His Asp Leu Glu Phe 610 615 620 Cys Leu Tyr Gly Arg Glu Glu His Leu Thr Thr Asn Gly Tyr Arg Lys 625 630 635 640 Ile Pro Gly Asp Lys Cys Gln Gly Gly Val Asn Pro Val Arg Glu Val 645 650 655 Lys Asp Leu Lys Lys Lys Cys Thr Ser Asn Phe Leu Ser Pro Glu Lys 660 665 670 Gln Asn Ser Lys Ser Asn Ser Gly Ser Ala Met Ile Glu Gly Arg Gly 675 680 685 Val Gly His His His His His His 690 695

Claims (109)

  1. 소르틸린에 특이적으로 결합하고 소르틸린에 대한 PGRN의 결합을 억제하거나 감소시킬 수 있는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fv 단편(예컨대 단일쇄 Fv 또는 디설파이드-결합 Fv); Fab-유사 단편(예컨대 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편); 및 도메인 항체(예컨대 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    온전한 항체로 구성되는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 서브타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:170에 의해 정의되는 소르틸린의 D 영역에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:185 , 186 또는 187 중 어느 하나에 의해 정의되는 소르틸린의 D 영역에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:180에 의해 정의되는 소르틸린의 A 영역에 추가적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:181 , 182, 183 또는 184 중 어느 하나에 의해 정의되는 소르틸린의 A 영역에 추가적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:170에 정의되는 소르틸린의 D 영역 내의 적어도 3개 연속 아미노산, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개 연속 아미노산에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 항원-결합 단편이 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 0.5~10 nM, 예컨대 1~5 nM 또는 1~2 nM의 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
    b. 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
    c. 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
    d. 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
    e. 뇌에서 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능, 및/또는
    f. 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능이 시간차 형광 검정(HTFR)을 이용하여 50 nM 미만, 그러나 바람직하게는 10 nM 내지 0.2 nM의 IC50으로인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능이 22 nM 이하, 예컨대 22 nM 내지 1 nM, 또는 10 nM 내지 1 nM, 또는 5 nM 내지 1 nM의 IC50으로의 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소 및/또는 억제를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간, 인간화, 재조합 또는 키메라 항체인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:1을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:2을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:5를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:6을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:8을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:7을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제15항 및 제16항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:9를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:10을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:11을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:12를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:13을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:14를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:16을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:15를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제19항 및 제20항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:17을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:18을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:19를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:20을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:21을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:22를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:24를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:23을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제22항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제23항 및 제24항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:25를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:26을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:27을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:28을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:29를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:30을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:32를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:31를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 제26항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제27항 및 제28항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:33을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:34를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:35를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:36을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:37을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:38을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:40을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:39를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 제30항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제31항 및 제32항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:41을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:42를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:43을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:44를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:45를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:46을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:48을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:47을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 제34항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제35항 및 제36항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:49를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:50을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:51을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:52를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:53을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:54를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:56을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:55를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 제38항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제39항 및 제40항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:57을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:58을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:59를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:60을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:61을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:62를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:64를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:63을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  45. 제42항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제43항 및 제44항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:65를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:66을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:67을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:68을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:69를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:70을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:72를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  48. 제46항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:71을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  49. 제46항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제47항 및 제48항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  50. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:73을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:74를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:75를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:76을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:77을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f.SEQ ID NO:78을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:80을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  52. 제50항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:79를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  53. 제50항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제51항 및 제52항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  54. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:81을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:82를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:83을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:84를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:85를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:86을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:88을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  56. 제54항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:87을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  57. 제54항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제55항 및 제56항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  58. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:89를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:90을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:91을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:92를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:93을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:94를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:96을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  60. 제58항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:95를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  61. 제58항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제59항 및 제60항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  62. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:97을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:98을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:99를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:100을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:101을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:102를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:104를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:103을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  65. 제62항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제63항 및 제64항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  66. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:105를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:106을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:107을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:108을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:109를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:110을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:112를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  68. 제66항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:111을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  69. 제66항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제67항 및 제68항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  70. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:113을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:114를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:115를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:116을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:117을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:118을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  71. 제70항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:120을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  72. 제70항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:119를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  73. 제70항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제71항 및 제72항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  74. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:121을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:122를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:123을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:124를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:125를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:126을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:128을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:127을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  77. 제74항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제75항 및 제76항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  78. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:129를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:130을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:131을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:132를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:133을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:134를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  79. 제78항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:136을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  80. 제78항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:135를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  81. 제78항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제79항 및 제80항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  82. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:137을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:138을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:139를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:140을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:141을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:142를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  83. 제82항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:144를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  84. 제82항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:143을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  85. 제82항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제83항 및 제84항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  86. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:145를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:146을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:147을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:148을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:149를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:150을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  87. 제86항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:152를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  88. 제86항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:151을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  89. 제86항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제87항 및 제88항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  90. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:153을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:154를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:155를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:156을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:157을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:158을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  91. 제90항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:160을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  92. 제90항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:159를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  93. 제90항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제91항 및 제92항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  94. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. SEQ ID NO:161을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR1;
    b. SEQ ID NO:162를 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR2;
    c. SEQ ID NO:163을 포함하는 경쇄 가변 도메인 L-CDR3;
    d. SEQ ID NO:164를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR1;
    e. SEQ ID NO:165를 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR2; 및
    f. SEQ ID NO:166을 포함하는 중쇄 가변 도메인 H-CDR3.
  95. 제94항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:168을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  96. 제94항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO:167을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  97. 제94항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제95항 및 제96항에서 정의되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 모두 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조제물로서, 상기 조제물에 소르틸린에 결합할 수 없거나 조제물의 항-소르틸린 작용성을 실질적으로 변경하지 않는 자연 발생 항체가 실질적으로 없고, 상기 작용성이 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조제물:
    (i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
    (ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
    (iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
    (iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
    (v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능;
    (vi) 뇌에서 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능 및/또는
    (vii) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD), 근위축 측삭 경화(ALS) 또는 알츠하이머병(AD)의 치료 제공능.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조제물로서, 상기 모노클로날 항체가 자연 발생 항-소르틸린 항체의 구조 대비 그 아미노산 서열에서 구조적 변화를 보유하며, 상기 구조적 변화는 상기 모노클로날 항체가 상기 자연 발생 항-소르틸린 항체에 의해 나타나는 작용성 대비 변경된 작용성을 나타내도록 유도하고, 상기 작용성은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조제물:
    (i) 소르틸린에 대한 결합 친화도(KD);
    (ii) 소르틸린에 대한 PGRN의 결합 감소능 및/또는 억제능;
    (iii) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 제거 감소능 및/또는 억제능;
    (iv) 소르틸린-발현 세포에 의한 PGRN의 세포내이입 감소능 및/또는 억제능;
    (v) 인간-소르틸린-발현 녹-인 마우스에서 혈장 중 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능;
    (vi) 뇌에서 PGRN의 양 및/또는 농도 증가능, 또는
    (vii) 만성적으로 투여되는 경우, 이마관자엽 치매(FTD), 근위축 측삭 경화(ALS) 및/또는 알츠하이머병(AD)의 치료 제공능.
  100. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제98항 또는 제99항의 조제물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  101. 의약에서의 이용을 위한 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제98항 또는 제99항의 조제물, 또는 제100항의 약학적 조성물.
  102. 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 치료에서 이용하기 위한 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제98항 또는 제99항의 조제물, 또는 제100항의 약학적 조성물.
  103. 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제98항 또는 제99항의 조제물, 또는 제100항의 약학적 조성물의 용도.
  104. 환자의 뇌에서 감소된 PGRN 수준과 연관된 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제98항 또는 제99항의 조제물, 또는 제100항의 약학적 조성물의 유효 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  105. 질환이 FTD; ALS; 또는 TDP43 단백병증, 예컨대 AD인,
    제102항에 따른 용도를 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제103항에 따른 용도, 또는 제104항에 따른 방법.
  106. 치료가 만성이고, 바람직하게는 적어도 2주, 예컨대 적어도 1개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 1년인,
    제102항에 따른 용도를 위한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제103항에 따른 용도, 또는 제104항에 따른 방법.
  107. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제98항 또는 제99항의 조제물, 또는 제100항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  108. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포주, 예컨대 인간 세포주, 포유류 비-인간 세포주, 곤충, 효모 또는 박테리아 세포주에서 생산되거나 제조된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  109. 제108항에 있어서,
    CHO 세포주, HEK 세포주, BHK-21 세포주, 쥐과 세포주(예컨대 골수종 세포주), 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주, HKB-11 세포주, CAP 세포주 및 HuH-7 인간 세포주에서 생산된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
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