KR20070116641A

KR20070116641A - 화학요법에 대한 반응자의 측정

Info

Publication number: KR20070116641A
Application number: KR1020077024114A
Authority: KR
Inventors: 울리히 브렌샤이트 (사망); 아스트리트 헬러; 페레나 루츠; 요아힘 모엑스; 캐롤 워드
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2007-12-10
Anticipated expiration: 2026-05-10
Also published as: RU2007145514A; CA2605151A1; AU2006245962B2; US20070054330A1; JP2012021997A; AR053272A1; JP4847518B2; IL185631A0; BRPI0609096A2; KR100962162B1; EP1889066A1; RU2416096C2; AU2006245962B8; NO20074389L; CN102854315A; JP2008538817A; US20100196931A1; WO2006119980A1; IL185631A; MX2007013973A

Abstract

본 발명은, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현을 측정함으로써, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 환자에서의 폐암 진행을 억제하기 위한 조성물을 선정하거나 또는 후보약제를 유도하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질이 사용된다.

Description

화학요법에 대한 반응자의 측정 {DETERMINATION OF RESPONDERS TO CHEMOTHERAPY}

본 발명은, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현을 측정함으로써, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 환자에서의 폐암 진행을 억제하기 위한 조성물을 선정하거나 또는 후보약제 (candidate agent) 를 유도하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질이 사용된다.

erbB1 유전자에 의해 인코딩되는 EGFR 은 인간 악성종양과 인과 관계로 연관되어 왔다. 특히, 유방암, 방광암, 폐암, 두경부암 및 위암뿐 아니라 아교모세포종에서 EGFR 의 증가된 발현이 관찰되어 왔다. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 170-kD 당단백질은 N-말단 세포외 도메인, 소수성 막 통과 도메인, 및 키나아제 도메인을 포함하는 C-말단 세포내 영역으로 이루어진다. EGFR 리간드-유도 이합체화는 고유 RTK 도메인 (Src 상동성 도메인 1, SH1) 을 활성화시키고, 세포질 도메인의 비촉매적 꼬리 내 6 개의 특이적 EGFR 타이로신 잔기 상에서 자가 인산화를 일으킨다.

암 세포 내 EGFR 활성화의 세포 효과에는 증식의 증가, 세포 운동성, 접착, 침범, 혈관형성의 촉진, 및 세포자멸사의 억제에 의한 세포 생존의 증강이 포함된다. 활성화된 EGFR 은 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 케스케이드의 자극을 통해 종양 세포 증식을 유도한다. EGFR 에 대한 리간드 결합시, SOS 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자는 Grb2 연결기 단백질을 통해 형질막으로 동원되고, 이는 소형 G-단백질 Ras 상에서 GDP 와 GTP 의 교환을 자극하고, 이어서 Raf, MEK 및 ERK 로 이루어진 MAPK 케스케이드를 활성화시킨다. 활성화된 ERK (pMAPK, pERK1/2) 는 이후 전사 인자, 예컨대 ELK-1 또는 c-Myc 를 인산화 및 활성화시키고, 세포 성장을 촉진한다.

다중 성장 인자 경로는 다중 키나아제의 활성화를 통한 NSCLC 세포의 진행 및 생존에 기여한다. EGFR 은 또한 포스파티딜리노시톨-3-키나아제 (PI3K)/Akt 경로 및 STAT 경로를 통한 신호화에 의해 암 세포 생존을 증강시킨다. Akt 는 또한 인슐린 성장 인자-1, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 및 인터루킨 3 및 6 을 포함하는 기타 성장 인자에 의해서도 자극된다. Akt1-3 의 세 아이소형은 활성화 도메인 내 잔기 T308 및 COOH-말단 도메인 내 S473 에서 유사한 방식으로 모두 인산화된다 (pAKT).

엘로티니브 (타르세바

) 는 잠재적 표피 성장 인자 수용체 (HER1/EGFR) 타이로신-키나아제 억제제 (TKI) 로서, 단일 제제로 사용될 경우, 이전의 화학요법에서 실패한 비-소-세포 폐암 (NSCLC) 환자에게 생존 유익을 제공한다 (WO 01/34574). 타르세바

의 효능은 각종 시험에서 연구되었다. 이의 화학명은 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민이다.

TALENT 시험은 겜시타빈 및 시스플라틴 (이러한 동시화학방사선요법은 비-US 표준 의료였음) 을 엘로티니브 (타르세바

) 와 함께 150 mg/일로, 또는 플라세보와 함께 투여받은 일선의 NSCLC 환자에서의 플라세보-조절 상 III 연구였다. 일차 종점은 생존 기간이었고, 이차 종점은 진행 시간, 반응률; 반응 기간; 악동학 및 악력학 매개변수, 및 삶의 질이었다. HER1/EGFR 및 HER2 발현율이 또한 평가되었다. 표준 안정성 분석이 수행되었다. TALENT 시험의 전반적 결과는 부정적이었다. 일차 및 이차 종점에 있어서, 엘로티니브 (타르세바

) ＋ 화학요법 (겜시타빈 및 시스플라틴) 는 겜시타빈 및 시스플라틴 단독과 비교할 때 증명될 수 있는 이점을 갖지 못했다 (Gatzemeier, U., 등, Proc Am Soc Clin Oncol 23 (2004) 617 (Abstract 7010)). 엘로티니브 ＋ 카르보플라틴 및 파클리탁셀을 이용한 US-기준 TRIBUTE 연구에서도 동일한 결과가 보여졌다 (Herbst, R.S., 등, J Clin Oncol (2004) ASCO Annual Meeting Proceedings. Post-Meeting Edition; 22 (July 15 Suppl.) (Abstract 7011)). 비-소-세포 폐암 (NSCLC) (BR.21; NCIC/OSIP) 에 대한 제 2 - 또는 제 3 요법으로서의 단일-제제 엘로티니브의 랜덤화된, 플라세보-조절 상 III 연구는, 생존면에서 플라세보 (4.7 개월) 와 비교할 때 엘로티니브 (6.7 개월) 에서 통계적으로 상당한 향상을 발견했다.

비-소형 세포 폐암에서의 바이오마커 및 특정 EGFR 억제제 약물에 대한 이들 의 관계에 대한 조사가 다양한 연구에서 이루어졌다. 문헌 [Han, 등, Int J Cancer 113 (2005) 109-115] 에서는 65 명의 환자를 게피티니브 (Iressa™, EGFR TKI) 단일요법으로 연구했다. 이들은 화학요법-내성 비-소형 세포 폐암에서 게피티니브에 대하여 반응 예측 마커로서 EGFR 다운스트림 분자를 분석했다. 문헌 [Cappuzzo, F. 등, JNCl 96 (2004) 1133-1141] 은 106 명의 환자를 게피티니브 (Iressa; EGFR TKI) 단일요법으로 연구했다. 이들은 진행 비-소-세포 폐암 환자에게서 Akt 인산화 및 게피티니브 효능을 조사했고, 게피티니브를 투여받은 P-Akt-양성 종양 환자가 P-Akt-음성 종양 환자보다 상기 요법으로부터 더 이익을 얻음을 발견했다. 문헌 [Vicent, S. 등, Br J Cancer 90 (2004) 1047-1052] 은 111 명의 NSCLC 환자를 연구했다. 이들은 pERK 가 비-소-세포 폐암에서 활성화되고, 진행 종양과 연관됨을 발견했다. 문헌 [Han, S.W. 등, J Clin Oncol 23 (2005) 2493-2501] 은 90 명의 환자를 게피티니브 (EGFR TKI) 단일요법으로 연구했다. 이들은 게피티니브로 치료한 비-소-세포 폐암 환자에서 표피 성장 인자 수용체 돌연변이의 예측 및 예후 충격을 분석했다. 문헌 [Mukohara, T. 등, 폐암 41 (2003) 123-130] 은 신보강 화학요법 또는 방사선을 경험한 60 명의 환자, 20 명의 환자 (시기 당) 를 연구했다. EGFR 발현은 pERK 및 pAkt 발현과 서로 관련되었다. 샘플 크기는 상기 저자들이 언급한 바와 같이 너무 작았다. 문헌 [Raben, D. 등, Int J Radiation Oncology Biol. Phys 59 (2004) 27-38] 은 비-소-세포 폐암에 대한 표적 요법을 연구했다. 문헌 [Ono, M. 등, Mol Cancer Ther 3 (2004) 465-472] 은 9 개의 NSCLC 세포주를 검정하고, 게피티니브로 치료했 다. 문헌 [Hirsch, F. R. 등, Curr Opin Oncol 17 (2005) 118-122] 은 게피티니브 내성에 대한 잠재적 마커로서 Akt 및 MAPK 의 인산화 상태를 재검토하고 있다. 문헌 [Meert, 등, Clinical Cancer Research 9 (2003) 2316-2326] 은 EGFR 억제제 활성도면에서 NSCLC 세포주를 연구했다. EGFR 및 Her2 발현 수준의 어느 것도 EGFR 억제제에 대한 민감도와 무관했다. 문헌 [Brognard, J. 등, Cell Death and Differentiation 9 (2002) 893-904] 은 19 개의 NSCLC 세포주를 분석했고, 여기서 17 개가 Erk1/2 의 인산화 및 구성성 활성도를 나타냈다. 문헌 [David, O. 등, Clinical Cancer Research 10 (2004) 6865-6871] 은 pAkt 의 과도발현이 NSCLC 내 예후 인자와 독립적임을 개시하고 있다. 문헌 [Kakiuchi, S. 등, Human Molecular Genetics 13 (2004) 3029-3043] 은 33 명의 NSCLC 환자의 유전체 와이드 cDNA 마이크로어레이를 연구했다. 모두에게 단일치료적 세팅으로의 게피티니브가 제공되었다. Akt/pAkt 발현 수준, EGFR 유전자 상태 또는 pEGFR 염색 및 게피티니브 반응 사이의 상관 관계에 대한 어떠한 증거도 찾지 못했다. 문헌 [Kim, R.H. 등, Cancer Cell 7 (2005) 263-273] 은 DJ-1 발현, 종양원이 pAkt 수준과 동일함을 개시하고 있다. 문헌 [Balsara, B.R. 등, Carcinogenesis 25 (2004) 2053-2059] 은 TMA pAkt 발현이 있는 110 명의 NSCLC 환자를 연구했다. 생존면에 있어서, pAKT 음성 및 양성 사이에 어떠한 큰 차이도 없었다. 문헌 [Hirami, Y. 등, Cancer Letters 214 (2004) 157-164] 은 비-소형 세포 폐암에서 표피 성장 인자 수용체, pAkt 및 저산소증-유도 인자-1알파의 관계를 연구했다. 문헌 [Lee, S.H. 등, APMIS 110 (2002) 587-592] 은 43 명의 LN 전이 NSCLC 환자를 연구했다. NSCLC 에서의 Akt 활성화는 종양 진행보다는 종양 발생에서 역할을 한다. 문헌 [Engelman, J.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2004) 3788-3793] 은 게피티니브-민감성 비-소형 세포 폐암 세포주에서 erbB-3 이 포스포이노시타이드 3-키나아제 활성을 매개함을 분석했다. 문헌 [David, O., J Cell Mol Med 5 (2001) 430-433] 은 폐암에서 신규한 진단용 마커로서의 Akt 및 PTEN 의 역할을 논의하고 있다. 문헌 [Mantha, A. 등, Clin. Cancer Res. 11 (2005) 2398-2407] 은 표피 성장 인자 수용체의 기능을 억제하는 메발로네이트 경로의 표적화를 연구했다.

EGFR 양성 암과 연관된 예후 마커는 WO 2004/046386 에서 연구되었다. EGFR 억제제 약물에 대한 반응에 대한 유전자 발현 마커는 US 2004/0157255 에 개시되어 있다. 표피 성장 인자 수용체 조정자에 대한 민감도를 측정하기 위한 방법 및 바이오마커가 WO 2004/063709 에 개시되어 있다. WO 01/00245 는 인간화 항-ErbB2 항체, 및 암을 항-ErbB2 항체, 예컨대 인간화 항-erbB2 항체로 치료하는 방법을 기술하고 있다.

본 발명의 요약

EGFR 억제제 요법, 특히 EGFR 억제제와 화학요법제의 복합요법에 대한 민감도 측정을 위한 방법의 필요성은 여전히 존재한다.

그러므로, 본 발명의 한 구현예에서는, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현 측정을 포함하며, 여기서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부에 대한 표시 (indication) 가 된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 민감한지의 여부를 측정하기 위해 인산화 AKT 단백질에 결합하는 항체 또는 인산화 MAPK 단백질에 결합하는 항체를 사용한다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 환자에서의 폐암 진행을 억제하는 조성물을 선정하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 하기를 포함한다:

a) 환자로부터의 EGFR 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 민감한 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 분취량들을 복수의 시험 조성물의 존재 하에 별도로 노출;

b) 시험 조성물과 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 시험 조성물과 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준을 비교,

c) 시험 조성물과 접촉하지 않은 분취량과 비교하여 시험 조성물을 포함하는 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준을 변경시키는 시험 조성물 중 하나를 선정, 여기서 시험 조성물과 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 시험 조성물과 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에서의 10 % 이상의 차이가 시험 조성물의 선정을 위한 표시가 됨.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 후보약제를 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) EGFR 억제제 및 화학요법제에 대해 민감한 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 분취량과 후보약제의 접촉,

(b) 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정, 및 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

(c) 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준과 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 비교에 의해 후보약제의 효과 관찰,

(d) 상기 관찰된 효과로부터의 상기 약제의 유도, 여기서 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에서의 10 % 이상의 차이가 후보약제의 효과의 표시가 됨.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 본 발명에 따른 방법에 의해 유도되는 후보약제 및 본 발명에 따른 약제를 포함하는 약학 제제가 제공된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 본 발명에 따른 약제가 폐암 진행의 억제를 위한 조성물의 제조에 사용된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 본 발명의 방법의 단계 및 하기를 포함하는 약물의 제조 방법이 제공된다:

(i) 상기 약물을 대상체에 치료적 유효량으로 제공하기 위해, 상기 단계 (c) 에서 확인된 후보약제 또는 이의 유사체 또는 유도체를 충분한 양으로 합성; 및/또는

(ii) 상기 단계 (c) 에서 확인된 약물 후보약제 또는 이의 유사체 또는 유도체를 약학적으로 허용가능한 담체와 배합.

본 발명의 또다른 구현예에서는, Akt 단백질, MAPK 단백질, 인산화 Akt 단백질, 인산화 MAPK 단백질, 인산화 AKT 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를, 환자에서의 폐암 진행을 억제하기 위한 조성물을 선정하거나 또는 후보약제를 유도하기 위해 사용한다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 인산화 MAPK 및/또는 인산화 Akt 단백질에 대항하는 항체를 포함하는 키트가 제공된다.

용어 "생물학적 샘플" 은 일반적으로 개체, 체액, 세포주, 조직 배양, 또는 기타 공급원으로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 체액은, 예를 들어, 림프, 혈청, 혈장, 뇨, 정액, 윤활액 및 척수액이다. 본 발명에 따르면, 생물학적 샘플은 폐암 세포 및 비-폐암 세포 (기타 세포) 를 포함한다. 포유동물로부터 체액 및 조직생검을 수득하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.

용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준" 이란 일반적으로 본 발명에 따른 샘플 내 아미노산 생성물 또는 단백질의 양, 바람직하게는 샘플 내 인산화 아미노산 생성물 또는 인산화 단백질의 양을 나타낸다. "발현" 이란 유전자 코딩된 정보가, 세포 내에서 존재하고 작업하는 구조로 전환되는 절차 (본 발명에 따른 이들의 인산화를 포함) 를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "발현된 유전자" 에는 mRNA 로 전사된 후, 단백질로 번역되고, 번역 후 변경된, 예를 들어, 인산화된 것들이 포함된다. 완벽성을 위하여, 이 용어는 또한, RNA 로는 전사되지만 단백질로는 번역되지 않는 발현된 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 전이 및 리보솜 RNA). 상기 용어 "과도발현" 및 "과소발현" 은, 대조군으로 사용된 샘플에서의 기준 발현 수준과 비교했을 때 발현 수준에서의 상향 또는 하향 편차를 각각 의미한다. 그러므로, "과도발현" 은 또한 "증가된 발현" 이고, "과소발현" 은 "감소된 발현" 이다.

본원에서의 용어 "항체" 란 가장 넓은 의미로 사용되며, 상세하게는 무손상 단클론 항체, 다클론 항체, 둘 이상의 무손상 항체로부터 형성되는 다특이성 항체 (예를 들어, 양특이성 항체) 및 항체 단편 (단, 이들은 바람직한 생물학적 활성도를 나타내어야 함) 을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 란 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 수득되는 항체를 의미하는 것으로, 즉, 개체군을 이루는 개별 항체들이 동일하다 (소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이는 제외). 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일한 항원 부위에 대항한다. 더욱이, 여러 결정기 (에피토프) 들에 대항하는 여러 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항한다. 이들의 특이성에 더하여, 단클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식 어구로서의 "단클론" 은, 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내는 것으로, 항체 생성의 요구에 따라 임의의 특정 방법에 의해 조립되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌 (Kohler, G. 등, Nature 256 (1975) 495) 에 먼저 기술되었던 하이브리도마 방법에 의해 만들어지거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, U.S. 특허 4,816,567 참조) 에 의해 만들어질 수 있다. "항체 단편" 은 무손상 항체의 일부를 구성한다.

본 발명에 따른 관심 항원, 즉 인산화 MAPK 또는 인산화 pAKT 단백질에 "결합하는" 항체는, 항원의 존재를 검지하는데 유용하도록 충분한 친화력을 갖는 항원에 결합할 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 항체는 인산화 MAPK 또는 인산화 pAKT 단백질에 결합하는 것으로, 이는 통상 비-인산화 MAPK 또는 비-인산화 pAKT 단백질과는 전혀 다르게 인산화 MAPK 또는 인산화 pAKT 단백질에 우선적으로 결합하거나, 또는 비-인산화 MAPK 또는 비-인산화 pAKT 단백질과 두드러지게 교차반응하지 않는다. 이러한 구현예에서, 비-인산화 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 형광 활성 세포 선택 (FACS) 분석 또는 방사선 면역 침강법 (RIA) 에 의해 측정할 때 10 % 미만일 것이다. 즉, 이는 특히 인산화 MAPK 또는 인산화 pAKT 단백질에 결합하고, 특히 비-인산화 MAPK 또는 비-인산화 pAKT 단백질에는 결합하지 않거나 또는 모두가 결합하지는 않을 것이다.

"화학요법제" 는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로서, 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN™), 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 메틸라멜라민 및 에틸렌이민; 질소 머스타드, 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아스, 예컨대 카르무스틴, 클로로조톡신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리쉐아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신스, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신스, 페플로마이신, 포피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충액, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK

; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 데카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL

, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) 및 도세탁셀 (TAXOTERE

, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르암부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신스; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 제어 또는 억제하는 항-호르몬 약제가 상기 정의에 포함되며, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타아제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston) 을 포함하는 항-에스트로겐제; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린을 포함하는 항-안드로겐제; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. "화학요법제" 는 그 자체가, 상기 암 조합의 치료에 유용한 화합물의 배합물일 수 있어서, 즉 상기 배합물이 겜시타빈/시스-플라틴뿐 아니라, 예를 들어, 시스-플라틴/파클리탁셀, 시스-플라틴/도세탁셀, 시스-플라틴/비노렐빈, 겜시타빈/카르보플라틴 또는 카르보플라틴/도세탁셀일 수 있다.

용어 "EGFR 억제제" 란 EGFR 에 결합하고, 임의로는, EGFR 활성화를 억제하는 치료제를 의미한다. 이러한 약제의 예로서 EGFR 에 결합하는 항체 및 소형 분자가 포함된다. EGFR 에 결합하는 항체의 예로서 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (US 4,943,533, Mendelsohn 등, 참조) 및 이의 이형체, 예컨대 키메라화된 225 (C225 또는 세툭시마브; ERBUTIX

) 및 재형상화된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, Imclone Systems Inc., 참조); 유형 11 돌연변이 EGFR 에 결합하는 항체 (US 5,212,290); US 5,891,996 에 기술된 바와 같은, EGFR 에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR 에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF (WO 98/50433, Abgenix, 참조) 가 포함된다. 항-EGFR 항체는 세포살상형 약제와 컨쥬게이션되어, 면역컨쥬게이트를 생성할 수 있다 (예를 들어, EP 0 659 439 A2, Merck Patent GmbH 참조). EGFR 에 결합하는 소형 분자의 예로서 ZD 1839 또는 게피티니브 (IRESSA™; Astra Zeneca), CP-358774 (타르세바

; Genentech/OSI) 및 AG 1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) 이 포함된다. 본 명세서에서 특히 바람직한 것은 EGFR 타이로신 키나아제 억제제, 특히 소형 분자 EGFR 타이로신 키나아제 억제제, 예를 들어, 타르세바

이다. "소형 분자" 는, 예를 들어, 분자량이 약 10,000 g/몰 미만, 바람직하게는 약 5,000 g/몰 미만인 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 바람직하게는, "소형 분자" 가 분자량이 약 5,000 g/몰 미만, 바람직하게는 약 1,000 g/몰 미만, 더욱 바람직하게는 500 g/몰 미만인 화합물, 즉 유기 또는 무기 화합물, 및 그러한 화합물의 염, 에스테르 및 기타 약학적으로 허용가능한 형태이다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 구현예에서, EGFR 억제제는 분자량이 약 5,000 g/몰 미만, 바람직하게는 약 1,000 g/몰 미만인 화합물 및 그러한 화합물의 염, 에스테르, 및 기타 약학적으로 허용가능한 형태인 EGFR 타이로신 키나아제 억제제이다. 즉, EGFR 억제제는 EGFR 타이로신 키나아제 활성을 억제하고 분자량이 약 5,000 g/몰 미만, 바람직하게는 약 1,000 g/몰 미만, 더욱 바람직하게는 500 g/몰 미만인 화합물 및 그러한 화합물의 염, 에스테르, 및 기타 약학적으로 허용가능한 형태이다.

"겜시타빈" 은, 데옥시시티딘의 피리미딘 유사체 (여기서, 데옥시리보오스 부분은 2'-위치에서 2 개의 불소 원자를 포함함) 인 화학요법제 2',2'-디플루오로데옥시시티딘 (dFdC) 이다 (Heinemann, V. 등, Cancer Res 48 (1988) 4024 참조). 이는 Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, USA 사의 Gemzar

로서 시중에서 판매된다.

본 명세서에 걸쳐 사용되는 "시스-플라틴" 은 화학요법제인 시스-디암민디클로로백금 (US 5,562,925 참조) 으로서, Bristol-Myers Squibb Company, New York, NY, USA 사의 Platinol

로 시중에서 판매된다. "시스-플라틴" 은, 시스 위치에서 2 개의 염소 원자 및 2 개의 암모니아 분자에 의해 둘러싸이는 백금 중심 원자를 포함하는 중금속 착물이다.

본 발명에 따르면, "인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 민감한" 이란 표현은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 단독으로의 치료에서와는 대조적으로 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법 치료에 대하여는 민감함을 의미한다. "민감한" 이란 또한 "~ 에 대하여 반응하는" 또는 "~ 에 대한 반응을 보이는" 으로서 이해될 수 있는데, 특히 이때의 반응은 폐암 환자에게 유익한 것이다. 따라서, 폐암 환자가 표피 성장 인자 수용체 억제제 단독으로의 치료에서와는 대조적으로 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법 치료에 대하여는 민감한지의 여부가 측정될 수 있다. 이는 이러한 치료가 환자에게 유익할 것임을 의미한다.

"MAPK" 단백질은 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 또는 세포외 신호-제어 키나아제 (ERK) 로서 알려진 잘 보존된 세포질 세린/트레오닌 단백질 키나아제과의 맴버이다. 이 단백질과는 다수의 하위군을 갖는다. ERK 는, 삼투 스트레스, 열 쇼크, 전구-염증성 사이토킨, 호르몬 및 미토겐을 포함하는 매우 다양한 세포외 신호에 대한 반응에서 활성화되고, 타이로신- 또는 트레오닌-인산화된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "MAPK 단백질" 은, 바람직하게는 MAPK1 및 MAPK3 을 포함하거나 또는 바람직하게는 MAPK1 및 MAPK3 으로 이루어지는 MAPK 단백질과의 맴버를 나타낸다. MAPK1 (ERK2) 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1) 및 MAPK3 (ERK1) (SEQ ID NO: 2) 이다. 이들 아미노 아미노산 서열은 mRNA 서열에 의해 인코딩된다 (즉 MAPK1 은 cDNA 서열 SEQ ID NO: 3 및 4 에 의해 그리고 MAPK3 은 SEQ ID NO: 5 에 의해 인코딩됨). MAPK1 내 원발성 인산화 부위는 Thr185 및 Tyr185 이고, MAPK3 내 원발성 인산화는 Thr202 및 Tyr204 이다. 이들 인산화 부위는 또한, 본 발명에서 사용되는 항체, 즉 바람직하게는 MAPK1 및 MAPK3 의 인산화 형태에 대항하는 다클론 항체 혈청에 의해 인지된다.

용어 "Akt" 단백질은, Akt1/PKB알파, Akt2/PKB베타 (Staal, S.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 5034-5037) 및 Akt3/PKB감마 (Nakatani, K. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 257 (1999) 906-910; US 6,881,555) 로서 각각 명명된 세 맴버를 갖는 제 2 전령 조절 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 Akt/PKB 하위과의 단백질을 나타낸다. 아이소형들은 동종유래이고, 포스파티딜리노시톨 3'-OH 키나아제 (PI3K) 신호계에 대한 반응으로 인산화에 의해 활성화된다. PI3K/ Akt/PKB 경로는 종양발생에서도 세포 생존/세포 사멸의 제어를 위해 중요한 것으로 보인다 (Dudek, H. 등, Science 275 (1997) 661-665). 본 발명에서 사용되는 용어 "Akt 단백질" 은, 바람직하게는 Akt1, Akt2 및 Akt3 을 포함하거나 또는 바람직하게는 Akt1, Akt2 및 Akt3 으로 이루어지는 Akt 단백질과의 맴버를 나타낸다. Akt1/PKBα 의 인산화는 두 부위 Thr³⁰⁸ 및 Ser⁴⁷³ 상에서 일어난다 (Meier, R., 등, J. Biol. Chem. 272 (1997) 30491-30497). 등가 인산화 부위가 Akt2/PKB베타 (Thr³⁰⁹ 및 Ser⁴⁷⁴) 및 Akt3/PKB감마 (Thr³⁰⁵ 및 Ser⁴⁷²) 에 나타난다. 용어 "인산화 Akt" 단백질은 인산화된 "Akt" 단백질, 바람직하게는 앞서 기술한 부위에서 인산화된 것을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 용어 "MAPK 단백질" 은, MAPK1 및 MAPK3 을 포함하거나 또는 바람직하게는 MAPK1 및 MAPK3 으로 이루어지는 MAPK 단백질과의 맴버를 나타낸다. Akt1 은 또한 인간 RAC-알파 세린/트레오닌-단백질 키나아제 (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-알파), 단백질 키나아제 B (PKB) (C-AKT) 로 알려져 있고, Akt1 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6 이다. AKT2 는 또한 인간 RAC-베타 세린/트레오닌-단백질 키나아제 (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-베타), 단백질 키나아제 Akt-2 또는 단백질 키나아제 B, 베타 (PKB 베타) 로 알려져 있고, Akt2 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7 이다. AKT3 은 또한 인간 RAC-감마 세린/트레오닌-단백질 키나아제 (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-감마), 단백질 키나아제 Akt-3 또는 단백질 키나아제 B, 감마 (PKB 감마) (STK-2) 로 알려져 있고, Akt3 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8 이다.

본 발명의 상세한 설명

당업계에서의 분사 생물학 및 핵산 화학의 통상의 기술은 문헌에 보고되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Gait, MJ. (ed.), Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach, IRL Press, 1984; Hames, B.D., 및 Higgins, SJ. (eds.), Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach, IRL Press, 1985; 및 series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.] 을 참조할 수 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 삽입된다. 앞서 기술되었거나 또는 이후 기술될, 본원에 언급된 모든 특허, 특허원 및 공보는 본원에 참고로 삽입된다.

본 발명의 한 구현예에서는, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현 측정을 포함하며, 여기서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부에 대한 표시가 된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현이 하기에 의해 측정된다:

a) 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

b) 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감하지 않은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

c) 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이의 측정에 의한, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현의 측정.

바람직하게는, 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 10 % 이상이다. 더욱 바람직하게는, 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 25 % 이상이다. 또다른 구현예에서는, 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 적어도 50 %, 75 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 또는 1,000 % 이다. 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 10,000 또는 50,000 % 까지일 수 있다. 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 바람직하게는 10 % 내지 10,000 %, 더욱 바람직하게는 25 % 내지 10,000 %, 50 % 내지 10,000 %, 100 % 내지 10,000 %, 더더욱 바람직하게는 25 % 내지 5,000 %, 50 % 내지 5,000 %, 100 % 내지 5,000 % 이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 생물학적 샘플은 원발성 폐 종양 또는 전이 (근격 또는 원격) 일 수 있는데, 이는, 예를 들어, 폐생검에 의하거나 또는 생검을 통해 기타 기관으로부터 수득될 수 있다. 전이는 또한, 예를 들어, 간 또는 림프절로부터의 원격 전이일 수 있다. 이러한 원격 전이는 또한 폐암 세포를 폐로부터의 전이 기원으로서 포함한다는 것을 주목해야 한다.

또다른 바람직한 구현예에서, 암은 폐암이 아닌 또다른 암, 예를 들어, 췌장암이다. 그러나, 고체 종양을 갖는 다른 암이 또한 가능하며, 예를 들어, 난소, 결장직장, 머리 및 목, 콩팥 세포 암종, 신경아교종 및 위장관 암, 특히 위암일 수 있다.

또다른 바람직한 구현예에서, EGFR 억제제는 EGFR 타이로신 키나아제 억제제, 특히 소형 분자 EGFR 타이로신 키나아제 억제제, 예를 들어, 타르세바

이다. 그러므로, 즉, 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, EGFR 억제제는 엘로티니브 또는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민이다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 화학요법제는 겜시타빈 및/또는 시스-플라틴이다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 인산화 AKT 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현은, 인산화 단백질에 특이적으로 결합하고 바람직하게는 비-인산화 단백질에는 전혀 결합하지 않거나 또는 비특이적으로 결합하는 시약을 사용하여 측정한다. 바람직하게는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편이 인산화 AKT 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 비-인산화 AKT 단백질 또는 비-인산화 MAPK 단백질에는 전혀 결합하지 않거나 또는 비특이적으로 결합한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 인산화 AKT 단백질은 Akt1 단백질의 아미노산 위치 473 에 해당하는 아미노산 위치에서 인산화되고, 또는 MAPK 단백질이 MAPK1 의 아미노산 위치 202 및 204 에 해당하는 아미노산 위치에서 인산화된다. 바람직하게는, MAPK 단백질의 아미노산 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 2 이고, AKT 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6, 7 또는 8 이다.

매우 여러 유형의 면역 검정이 본 발명의 방법에 사용될 수 있는데, 예를 들어, 효소면역측정법 (ELISA), 형광면역측정법 (FIA), 화학면역측정법 (CLIA), 방사선면역측정법 (RIA) 및 면역 블롯팅이 있다. 이용할 수 있는 여러 면역분석법의 리뷰를 위하여 문헌 [Lottspeich 및 Zorbas (eds.), Bioanalytik, 1st edition 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany] 을 참조할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 단백체학, 흐름세포측정, 면역세포화학, 면역조직화학 및 효소면역측정법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 발현 수준을 측정한다.

본 발명의 바람직한 한 구현예에서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현이 하기에 의해 측정된다:

a) 생물학적 샘플의 면역조직화학적 염색,

b) 생물학적 샘플 내 세포 염색의 시각적 조사시 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에 대하여, 숫자 1, 2, 3 및 4 로부터 선택하여 등급을 지정, 여기서 발현 수준의 최고 검출 등급 (highest detectable grade) 이 지정됨,

c) 면역조직화학적으로 염색된 생물학적 샘플 내에서 최고 검출 등급을 갖는 세포의 백분율을 측정,

d) 숫자 100 과, 면역조직화학적으로 염색된 생물학적 샘플 내에서 최고 검출 등급을 갖는 세포의 백분율 및 지정된 등급을 곱함, 및

e) 상기 단계 d) 의 곱셈의 결과가 100 을 초과하는 경우, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현 측정.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법이 폐암 환자에게 유익한지의 여부를 측정하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 환자로부터의 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현의 측정을 포함하며, 여기서 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도 발현은, 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법으로부터 환자가 유익을 얻는지의 표시가 된다. 앞서 기술된 모든 기타 바람직한 구현예는 본 구현예에서도 동일하게 적용된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 환자로부터의 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현이 하기에 의해 측정된다:

a) 환자로부터의 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 측정,

b) 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법으로부터 유익을 얻지 못한 폐암 환자로부터의 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 측정,

c) 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이를 측정하여, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현을 측정. 상기 용어 "유익" 은 환자가 표피 성장 인자 수용체 억제제 단독으로의 치료에서와는 대조적으로 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법으로부터의 치료에서 유익을 얻지 못함을 의미한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 인산화 AKT 단백질에 결합하는 항체 또는 인산화 MAPK 단백질에 결합하는 항체는, 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 민감한지의 여부를 측정하는데 사용된다.

바람직하게는, 상기 단계 c) 에서의 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 25 % 이상이다. 더욱 바람직하게는, 상기 단계 c) 에서의 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 50 % 이상이다. 또다른 구현예에서는, 상기 단계 c) 에서의 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 적어도 75 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 또는 1,000 % 이다. 상기 단계 c) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 10,000 또는 50,000 % 까지일 수 있다. 상기 단계 c) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 바람직하게는 10 % 내지 10,000 %, 더욱 바람직하게는 25 % 내지 10,000 %, 50 % 내지 10,000 %, 100 % 내지 10,000 %, 더더욱 바람직하게는 25 % 내지 5,000 %, 50 % 내지 5,000 %, 100 % 내지 5,000 % 이다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 후보약제를 유도하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 하기를 포함한다:

바람직하게는, 상기 단계 d) 에서의 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 25 % 이상이다. 더욱 바람직하게는, 상기 단계 d) 에서의 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 50 % 이상이다. 또다른 구현예에서는, 상기 단계 d) 에서의 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 적어도 75 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 또는 1,000 % 이다. 상기 단계 d) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 10,000 또는 50,000 % 까지일 수 있다. 상기 단계 d) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이는 바람직하게는 10 % 내지 10,000 %, 더욱 바람직하게는 25 % 내지 10,000 %, 50 % 내지 10,000 %, 100 % 내지 10,000 %, 더더욱 바람직하게는 25 % 내지 5,000 %, 50 % 내지 5,000 %, 100 % 내지 5,000 % 이다.

바람직한 구현예에서 상기 후보약제는 억제 후보제 (candidate inhibitory agent) 또는 증강 후보제 (candidate enhancing agent) 이다.

본 발명의 또다른 구현예에서는 본 발명에 따른 방법에 의해 유도되는 후보약제가 제공된다.

또다른 구현예에서는 본 발명에 따른 약제를 포함하는 약학 제제가 제공된다.

또다른 구현예에서는 본 발명에 따른 약제가 폐암 진행의 억제를 위한 조성물의 제조에 사용된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 본 발명의 단계 및 하기를 포함하는 약물의 제조 방법이 제공된다:

또다른 구현예에서는, Akt 단백질, MAPK 단백질, 인산화 Akt 단백질, 인산화 MAPK 단백질, 인산화 Akt 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질에 선택적으로 결합하는 항체가, 환자에서의 폐암 진행을 억제하기 위한 조성물을 선정하거나 또는 후보약제를 유도하는데 사용된다.

본 발명의 또다른 구현예에서는, 인산화 MAPK 및/또는 인산화 Akt 단백질에 대항하는 항체를 포함하는 키트가 고안된다. 당업계에 공지된 이러한 키트는 플라스틱 웨어 (plastics ware) (이는, 예를 들어, 96 또는 384 웰 포멧의 미량 역가판 또는 단지 통상의 반응관 (예를 들어, Eppendorf, Hamburg, Germany 사제) 으로서 증폭 절차 도중에 사용될 수 있음) 및 본 발명에 따른 방법 (바람직하게는 면역분석법, 예를 들어, 효소면역측정법 (ELISA), 형광면역측정법 (FIA), 화학면역측정법 (CLIA), 방사선면역측정법 (RIA) 및 면역 블롯팅) 의 수행을 위한 기타 모든 시약을 추가로 포함한다. 이용할 수 있는 여러 면역분석법 및 시약의 리뷰를 위하여 문헌 [Lottspeich 및 Zorbas (eds.), Bioanalytik, 1st edition 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany] 을 참조할 수 있다.

하기 실시예, 참고 문헌, 서열 목록 및 도면이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 진정한 범주는 청구항에 개시된다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않고서 개시되는 과정에서 변경이 이루어질 수 있음이 이해된다.

도 1: 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (A) 또는 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료에 무작위적으로 선정된 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

은, 사건이 일어나기 전에 관찰이 종결이 되었을 때 중도 절단된 관찰 시간을 나타냄).

도 2: 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (A) 또는 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료에 무작위적으로 선정된, 바이오마커 데이터를 갖는 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 3: 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (A) 또는 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료에 무작위적으로 선정된 환자 전체 중에서의 진행/사망까지의 시간 (PFS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 4: 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (A) 또는 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료에 무작위적으로 선정된 환자 전체 중에서의 진행/사망까지의 시간 (PFS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

은, 사건이 일어나기 전에 관찰이 종결이 되었 을 때 중도 절단된 관찰 시간을 나타냄).

도 5: pMAPK H-점수 < 100 인 환자와 pMAPK H-점수 ≥ 100 (H) 인 환자를 비교하는, 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 으로 치료한 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 6: 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (A) 과 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료를 비교하는, pMAPK H-점수 < 100 인 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 7: 각각 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (LA, HA) 과 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 (H) 치료를 비교하는, pMAPK H-점수 < 100 및 pMAPK H-점수 ≥ 100 인 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 8: 각각 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (LA, HA) 과 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 (H) 치료를 비교하는, pMAPK H-점수 < 100 및 pMAPK H-점수 ≥ 100 인 바이오마커 환자 전체 중에서의 진행/사망까지의 시간 (PFS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 9: pAKT1 H-점수 < 300 (L) 및 pAKT1 H-점수 ≥ 300 (H) 를 비교하는, 플 라세보/겜시타빈/시스플라틴 치료된 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 10: pAKT1 H-점수 < 300 (L) 및 pAKT1 H-점수 ≥ 300 (H) 를 비교하는, 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 치료된 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

도 11: 각각 엘로티니브/겜시타빈/시스플라틴 (LA, HA) 과 플라세보/겜시타빈/시스플라틴 (H) 치료를 비교하는, pAKT1 H-점수 < 300 및 pAKT1 H-점수 ≥ 300 인 바이오마커 환자 전체 중에서의 사망까지의 시간 (OS) 분석에 대한 Kaplan-Meier 곡선 (

실시예 1

종양 조직 샘플에 대한 바이오마커 분석

임상 연구를 위한 탐색 종양 바이오마커 분석의 목적은 타르세바

치료의 양성 또는 음성 임상 결과를 최적으로 예측하는 마커의 조합 또는 이들 마커를 확인하는 것이었다. 상기 연구의 임상 결과는, 타르세바

를 이용한 치료로부터 유익을 더욱 유도하는 환자 개체군을 어떻게 선정할지에 대한 가설을 제공해주지 못했기 때문에, 타르세바

복합요법에서 특이적으로 유익한 환자 (하위 군) 대 화학요법-단독의 대조군에서 특이적으로 유익한 환자 (하위 군) 의 사이를 구별해주는 마커의 확인이 특히 강조되었다. 추가적으로, 타르세바

와의 특이적 복합요법으로부터 불리한 효과를 얻는 환자 (하위 군) 대 화학요법-단독의 대조군으로부터 불리한 효과를 얻는 환자 (하위 군) 의 사이를 구별하는 마커의 확인을 연구했다.

이 연구의 목적은 EGFR 신호계 경로, 예를 들어, EGFR, HER2, pAKT 및 pMAPK 에 관한 종양-특이적 바이오마커를 분석하는 것이다.

바이오마커 데이터는 임상 데이터 (전반적 및 요법-특이적 분석) 와 서로 관련이 있었다.

재료 및 방법:

임상 샘플:

141 명의 환자의 샘플 아집단에 대해서 바이오마커 분석을 수행했는데, 이를 위해 초기 진단으로부터 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직 블록을 얻었다.

IHC 시험용 항체:

항체	표적 단백질	슬라이드 전처리	희석
Abcam ab8932 (Abcam, Cambridge, United Kingdom 사로부터 입수가능)	pAKT (Akt 의 인산화 Ser 473 에 대항하는 항체)	압력 용기 120 ℃/5분 시트레이트 완충액 pH 9	1:450
Zymed 36-8800 (Zytomed GmbH, Berlin, Germany 또는 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 사로부터 입수가능)	pMAPK (ERK1+2 Thr202/Tyr204)	압력 용기 120 ℃/5분 시트레이트 완충액 pH 6	1:150

pMAPK IHC 프로토콜:

1. Paraffin-Array-블록으로부터 3 ~ 4 um 두께의 단면을 절단.

2. 유리 슬라이드 상에 단면을 두고, 이들을 하룻밤 동안 건조.

3. 자일렌 내에서 슬라이드를 탈파라핀화시키고, 에탄올 시리즈를 흘려내림:

- 자일렌, 하룻밤 동안

- 자일렌, 2 × 10 분

- 무수 에탄올, 2 × 10 분

- 96 % 에탄올, 2 × 5 분

- 80 % 에탄올, 1 × 5 분

- 70 % 에탄올, 2 × 5 분

- PBS 완충액, 10 분 (완충액을 1 또는 2 회 바꿈)

4. 항원 회수/샘플 전처리

압력 용기, 1 × 시트레이트 완충액 pH 6 (Biocyc GmbH, 주문 번호 400300692) 내 120 ℃ 에서 5 분. TBS/PBS (1:10) 완충액 내에서 5 분 동안 세정

5. 과산화효소 차단

- 슬라이드를 3 % H₂O₂ 내에서 10 분 동안 인큐베이션.

- TBS/PBS 완충액 내에서 2 × 5 분 세정.

6. 항체 인큐베이션

- Tris-완충액 또는 기타 차단 용액 내에 희석된 정상 혈청 (1.5 %) 내에 슬라이드를 넣음.

- 슬라이드 상에 1:150 으로 희석된 원발성 항체 (Zymed Rabbit 항 포스포-ERK1+2, 목록 번호 36-8800) 를 두고, 3O ℃ 의 가습 챔버 내에서 2 시간 동안 인큐베이션.

- TBS/PBS 완충액 내에서 2 × 5 분 세정.

- 슬라이드 상에 Envision Polymer HRP (Dako) 를 두고, 3O ℃ 의 가습 챔버 내에서 30 분 동안 인큐베이션.

- TBS/PBS 완충액 내에서 2 × 5 분 세정.

7. 검출

- 0.05 M Tris 완충액 pH 7.6 을 이용해 슬라이드를 20 분 동안 세정.

- DAB-Chromogen (Liquid DAB Dako, 코드 번호 K3467) 을 이용해 슬라이드를 5 분 동안 덮고, 이를 5 ~ 10 분 동안 인큐베이션.

- 색조 반응을 정지시키기 위해 슬라이드를 탈염수로 5 분 동안 세정.

- 헤마톡실린 (

, Medite GmbH) 을 이용해 대조염색.

- 물로 헹굼.

- HCL-에탄올 내에서 분화.

- 수중에서 5 분 동안 ,,블루 (blue)''.

- 에탄올 시리즈를 흘려올림.

- 자일렌.

- 덮음.

pAKT IHC 프로토콜:

하기를 제외하고는, pMAPK 에서와 같은 프로토콜

- 4 와 비교: 시트레이트 완충액 pH 9 (Dako, 코드 번호 S2367) 내에서 샘플 전처리.

- 6 과 비교: 1:450 (6 과 비교) 으로 희석된 원발성 항체 (abcam AKT 포스포 S473).

IHC 데이터 보고:

한 명의 병리학자가 모든 면역염색을 평가했다. 핵염색 강도 (pAKT, pMAPK) 를 시각적 검사에 의해 4 단계 척도 (0, 1, 2, 3) 로서 평가했다. 핵염색 강도에 더하여, 양성 세포의 백분율, 및 분석 실패의 이유 (즉, 조직점 내 종양 세포의 부족 또는 TMA 슬라이드 상에서의 조직점의 부족) 를 기록했다.

탐색 통계적 분석:

바이오마커 데이터의 통계적 분석은, 각각의 마커에 의해 별도로 및/또는 적절한 조합에 의해, 임상적 유익 및/또는 독성을 예측하는 잠재성을 탐색하는 것을 목적으로 한다.

경험에 따르면, 많은 바이오마커는 환자들에게 걸쳐 그리고 환자 내에서 편중 통계 분포를 보였다. 변동 프로세스가 승법적 구조를 갖는다는 점에서, 이러한 편중성에는 어느 정도의 생화학적 배경도 흔히 존재한다. 선형 통계적 접근 (예를 들어, 회귀) 이 이용되는 경우, 편중 분포는 문제가 된다. 통계 모형에서 공변량으로서 이용되는 경우, 편중성은 또한 결과를 불명료하게 만들 수 있다. 그러므로, 이들 측정치를 근사적 정규 형상을 갖는 분포로 변환시킬 적절한 변환을 찾을 것이 요구된다. 바이오마커 분야에서의 전형적인 선택은 log(x+c) 형태의 변환이다. 이러한 변환은, 순위 또는 절사에 근거한 비-매개변수 분석이 변환에 의해 변하지 않도록, 값들의 차수를 변화시키지 않는다. 이러한 변환은 또한, 예를 들어, 판별 해석 및 주성분 분석과 같은 선형 다변량 접근이 이용될 경우, 필수적이다.

여러 마커의 기초 통계 및 상호의존성을 기술적으로 조사했다. 예를 들어, IHC 에 관한 여러 측정 접근을 비교하는 방법론적 분석을, 신뢰도 및 효력에 관하여 수행했다. 타르세바

에 대한 유익은 임상적 종점 생존 시간 (또는 사망까지의 시간, TTD), PFS 시간 (진행까지의 시간, TTP/D), 목적 반응, 최적 반응 (CR/PR/SD/PD) 에 의해 정의된다.

이들 분석에서 나타나는 p-값은 부차적 의미로 해석되지 않을 것이고; 이들은 능률적인 후보 예측법에 대한 탐색을 유도하기 위한 특별한 기술적 수단으로 보여질 것이다. 마커는, 임상적 종점의 예측 (예를 들어, 절사에 대한 수색) 을 위한 이들의 잠재성에 관한 단변량 수준에 대하여 평가했다. 또한, 마커의 조합을 연구하기 위해 다변량 기술 (예를 들어, 선형 판별 해석, 다중 회귀 분석, 윤번이 있는 주성분 분석, 군집 분석, CART 방법론) 을 적용했다. 임상적 공변량과 바이오마커 및 반응의 상관관계를 조사했다. 바이오마커로부터 유래된 후보 그룹을 시간 대 사건 변수에 대하여 확인했다 (Kaplan-Meier 곡선, Cox 비례적 위험 모형, 로그순위 시험).

결과:

전체적 연구 개체군과 비교한 TMA 샘플 아집단의 분석

바이오마커 분석을 위한 샘플을 갖는 환자 아집단을, 기본 환자 특징 및 임상적 결과 매개변수에 관하여 전체적 연구 개체군과 비교했다. 그 요약을 하기 표에 나타내었다.

	주요 임상 개체군		IHC/FISH 바이오마커 데이터를 갖는 환자 아집단
	플라세보 (N=582)	타르세바 (N=580)	플라세보 (N=70)	타르세바 (N=71)
연령 (세)	59.1	59.9	57.5	59.1
남성 (%)	75.3	78.6	80.0	74.6
질병 상태 IV (%)	67.2	64.8	74.3	80.3
샘암종 (%)	37.6	37.9	41.4	46.5
전위 부위의 #	3.7	3.7	3.4	4.0
영향받은 기관의 #	2.5	2.5	2.1	2.4
최장 지름 합	92.8	95.4	80.1	93.5
평균 증상 부담	26.5	26.7	24.3	25.3
반응자 (%)	38.3 (N=418)	42.4 (N=396)	42.3 (N=52)	43.5 (N=46)
위험률 TTD	1.035		1.217
위험률 TTP	0.980		1.262

발견:

바이오마커 데이터를 갖는 환자 아집단은 BO16411 연구 개체군을 대표하지 못했다. 주요 개체군 및 바이오마커 하위 군 사이의 TTD 및 TTP 의 위험률에서 차이가 있었다. 바이오마커 하위 군의 타르세바

-치료 환자는 주요 임상 개체군과 비교할 때 더 나쁜 예후를 가졌다. 몇몇 기준 공변량에 의하면, 바이오마커 하위 군 - 및 이 하위 군 내에서 특히 타르세바

-관련 환자가 주요 연구 개체군과 비교하여 더욱 병적인 환자 구성을 나타내는 것이다. KM 플롯 (도 1 내지 4) 도 마찬가지로 고려되어야 한다.

pMAPK IHC 분석의 결과

pMAPK IHC 데이터는 추가적 통계 분석에 적합하기 위한 충분한 산점도를 보였다.

pMAPK 발현 및 임상 결과 사이의 상관관계를 결정하기 위하여, 기술적 통 계 분석에 의해 절사값을 확립했다: Franklin H-점수를 염색 강도 및 염색된 종양 세포의 백분율을 조합하여 측정했다 (pMAPK_hsco = ( pMAPK_Nuclear_Staining + 1 ) * pMAPK_Nuclear_Pos_Cells; 범위: 0-400). "양성" pMAPK 염색은 H-점수 ≥ 100 으로 정의되었고, 그렇지 않은 경우, 염색은 "음성" 이었다.

Kaplan-Meier 플롯을 도 5 내지 8 에 나타내었다.

발견:

화학요법/플라세보로 치료한 환자에 있어서, "양성" pMAPK 발현은 더 나쁜 예후와 연관되는데 (TTD: HR 4.882, p=0.0001), 반면, ,,음성'' pAKT 발현은 더 긴 생존과 연관되는 것으로 보인다.

경향: ,,양성 pMAPK'' 환자는 화학요법/타르세바

복합요법으로부터 유익을 얻을 수 있다 (HR 0.500, p: 0.0516) (----)

pAKT IHC 분석의 결과

pAKT IHC 데이터는 추가적 통계 분석에 적합하기 위한 충분한 산점도를 보였다.

pAKT 발현 및 임상 결과 사이의 상관관계를 결정하기 위하여, 기술적 통계 분석에 의해 절사값을 확립했다: Franklin H-점수를 핵염색 강도 및 염색된 종양 세포의 백분율을 조합하여 측정했다 (pAKT_hsco = (pAKT_Nuclear_Staining + 1) * pAKT_Nuclear_Pos_Cells; 범위: 0-400). "양성" pAKT 염색은 H-점수 ≥ 300 으로 정의되었고, 그렇지 않은 경우, 염색은 "음성" 이었다.

Kaplan-Meier 플롯을 도 9 내지 11 에 나타내었다.

IHC 및 임상 데이터의 상관관계

발견:

화학요법/플라세보로 치료한 환자에 있어서, "양성" pAKt 발현은 더 나쁜 예후와 연관되며 (TTD HR 2.258, p=0.0573), 반면, ,,음성'' pAKT 발현은 더 긴 생존과 연관되는 것으로 보인다.

화학요법/ 타르세바

복합요법으로 치료한 환자에서와 유사한 차이가 발견되지 않았다.

<110> Hoffmann-La Roche AG <120> Determination of responders to chemotherapy <130> 23128 <150> EP05010244.1 <151> 2005-05-11 <150> EP05011070.9 <151> 2005-05-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly 1 5 10 15 Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly 20 25 30 Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys 35 40 45 Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr 50 55 60 Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His 65 70 75 80 Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu 85 90 95 Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu 100 105 110 Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr 115 120 125 Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn 130 135 140 Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr 145 150 155 160 Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro 165 170 175 Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp 180 185 190 Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser 195 200 205 Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn 210 215 220 Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile 245 250 255 Asn Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys 260 265 270 Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp 275 280 285 Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val 290 295 300 Glu Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser 305 310 315 320 Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp 325 330 335 Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala 340 345 350 Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser 355 360 <210> 2 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile 35 40 45 Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg 50 55 60 Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg 85 90 95 His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp 115 120 125 Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 145 150 155 160 Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr 165 170 175 Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 195 200 205 Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys 210 215 220 Ser Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His 245 250 255 Ile Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile 260 265 270 Ile Asn Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys Thr 275 280 285 Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys Ala Leu 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg Ile Thr 305 310 315 320 Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro 325 330 335 Thr Asp Glu Pro Val Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu 340 345 350 Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Phe Gln Glu Thr 355 360 365 Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 370 375 <210> 3 <211> 2934 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60 gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120 cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180 gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240 atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300 gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360 tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420 caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480 gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540 gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600 ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660 cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720 tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780 acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840 aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900 atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaacacatt 960 ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct 1020 aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca 1080 aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140 aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt 1200 gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag 1260 gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct 1320 taaatttgtc aggacaaggg ctcagaggac tggacgtgct cagacatcgg tgttcttctt 1380 cccagttctt gacccctggt cctgtctcca gcccgtcttg gcttatccac tttgactcct 1440 ttgagccgtt tggaggggcg gtttctggta gttgtggctt ttatgctttc aaagaatttc 1500 ttcagtccag agaattcctc ctggcagccc tgtgtgtgtc acccattggt gacctgcggc 1560 agtatgtact tcagtgcacc ttactgctta ctgttgcttt agtcactaat tgctttctgg 1620 tttgaaagat gcagtggttc ctccctctcc tgaatccttt tctacatgat gccctgctga 1680 ccatgcagcc gcaccagaga gagattcttc cccaattggc tctagtcact ggcatctcac 1740 tttatgatag ggaaggctac tacctagggc actttaagtc agtgacagcc ccttatttgc 1800 acttcacctt ttgaccataa ctgtttcccc agagcaggag cttgtggaaa taccttggct 1860 gatgttgcag cctgcagcaa gtgcttccgt ctccggaatc cttggggagc acttgtccac 1920 gtcttttctc atatcatggt agtcactaac atatataagg tatgtgctat tggcccagct 1980 tttagaaaat gcagtcattt ttctaaataa aaaggaagta ctgcacccag cagtgtcact 2040 ctgtagttac tgtggtcact tgtaccatat agaggtgtaa cacttgtcaa gaagcgttat 2100 gtgcagtact taatgtttgt aagacttaca aaaaaagatt taaagtggca gcttcactcg 2160 acatttggtg agagaagtac aaaggttgca gtgctgagct gtgggcggtt tctggggatg 2220 tcccagggtg gaactccaca tgctggtgca tatacgccct tgagctactt caaatgtggt 2280 ttatacctcg cagatacaag aatctttatg aatatacaat tctttttcct tctacagctt 2340 agctccgtct tttcaaccac gaacatttaa aacccgacct actagcactg ttctgtcctc 2400 aagtactcaa atatttctga tactgctgag tcagactgtc agaaaaagct agcactaact 2460 cgtgtttgga gctctatcca tattttactg atctctttaa gtatttgttc ctgccactgt 2520 gtactgtgga gttgactcgg tgttctgtcc cagtgcggtg cctcctcttg acttccccac 2580 tgctctctgt ggtgagaaat ttgccttgtt caataattac tgtaccctcg catgactgtt 2640 acagctttct gtgcagagat gactgtccaa gtgccacatg cctacgattg aaatgaaaac 2700 tctattgtta cctctgagtt gtgttccacg gaaaatgcta tccagcagat catttaggaa 2760 aaataattct atttttagct tttcatttct cagctgtcct tttttcttgt ttgatttttg 2820 acagcaatgg agaatgggtt atataaagac tgcctgctaa tatgaacaga aatgcatttg 2880 taattcatga aaataaatgt acatcttcta tcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2934 <210> 4 <211> 1514 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60 gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120 cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180 gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240 atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300 gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360 tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420 caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480 gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540 gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600 ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660 cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720 tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780 acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840 aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900 atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaccacatt 960 ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct 1020 aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca 1080 aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag 1140 aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt 1200 gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag 1260 gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct 1320 taaatttgtc aggtacctgg agtttaatac agtgagctct agcaagggag gcgctgcctt 1380 ttgtttctag aatattatgt tcctcaaggt ccattatttt gtattctttt ccaagctcct 1440 tattggaagg tattttttta aatttagaat taaaaattat ttagaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaa 1514 <210> 5 <211> 1866 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgttcctcgg cgccgccggg gccccagagg gcagcggcag caacagcagc agcagcagca 60 gcgggagtgg agatggcggc ggcggcggct caggggggcg ggggcgggga gccccgtaga 120 accgaggggg tcggcccggg ggtcccgggg gaggtggaga tggtgaaggg gcagccgttc 180 gacgtgggcc cgcgctacac gcagttgcag tacatcggcg agggcgcgta cggcatggtc 240 agctcggcct atgaccacgt gcgcaagact cgcgtggcca tcaagaagat cagccccttc 300 gaacatcaga cctactgcca gcgcacgctc cgggagatcc agatcctgct gcgcttccgc 360 catgagaatg tcatcggcat ccgagacatt ctgcgggcgt ccaccctgga agccatgaga 420 gatgtctaca ttgtgcagga cctgatggag actgacctgt acaagttgct gaaaagccag 480 cagctgagca atgaccatat ctgctacttc ctctaccaga tcctgcgggg cctcaagtac 540 atccactccg ccaacgtgct ccaccgagat ctaaagccct ccaacctgct cagcaacacc 600 acctgcgacc ttaagatttg tgatttcggc ctggcccgga ttgccgatcc tgagcatgac 660 cacaccggct tcctgacgga gtatgtggct acgcgctggt accgggcccc agagatcatg 720 ctgaactcca agggctatac caagtccatc gacatctggt ctgtgggctg cattctggct 780 gagatgctct ctaaccggcc catcttccct ggcaagcact acctggatca gctcaaccac 840 attctgggca tcctgggctc cccatcccag gaggacctga attgtatcat caacatgaag 900 gcccgaaact acctacagtc tctgccctcc aagaccaagg tggcttgggc caagcttttc 960 cccaagtcag actccaaagc ccttgacctg ctggaccgga tgttaacctt taaccccaat 1020 aaacggatca cagtggagga agcgctggct cacccctacc tggagcagta ctatgacccg 1080 acggatgagc cagtggccga ggagcccttc accttcgcca tggagctgga tgacctacct 1140 aaggagcggc tgaaggagct catcttccag gagacagcac gcttccagcc cggagtgctg 1200 gaggccccct agcccagaca gacatctctg caccctgggg cctggacctg cctcctgcct 1260 gcccctctcc cgccagactg ttagaaaatg gacactgtgc ccagcccgga ccttggcagc 1320 ccaggccggg gtggagcatg ggcctggcca cctctctcct ttgctgaggc ctccagcttc 1380 aggcaggcca aggccttctc ctccccaccc gccctcccca cggggcctcg ggagctcagg 1440 tggccccagt tcaatctccc gctgctgctg ctgctgcgcc cttaccttcc ccagcgtccc 1500 agtctctggc agttctggaa tggaagggtt ctggctgccc caacctgctg aagggcagag 1560 gtggagggtg gggggcgctg agtagggact cagggccatg cctgcccccc tcatctcatt 1620 caaaccccac cctagtttcc ctgaaggaac attccttagt ctcaagggct agcatccctg 1680 aggagccagg ccgggccgaa tcccctccct gtcaaagctg tcacttcgcg tgccctcgct 1740 gcttctgtgt gtggtgagca gaagtggagc tggggggcgt ggagagcccg gcgcccctgc 1800 cacctccctg acccgtctaa tatataaata tagagatgtg tctatggctg aaaaaaaaaa 1860 aaaaaa 1866 <210> 6 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 7 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Asn Glu Val Ser Val Ile Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Ser Asp 20 25 30 Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Glu Ala Pro Asp Gln Thr 35 40 45 Leu Pro Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Glu Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Val Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Ser Pro Asp Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Met Arg Ala Ile Gln Met Val Ala Asn Ser Leu Lys Gln 100 105 110 Arg Ala Pro Gly Glu Asp Pro Met Asp Tyr Lys Cys Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Asp Ser Ser Thr Thr Glu Glu Met Glu Val Ala Val Ser Lys Ala Arg 130 135 140 Ala Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys 145 150 155 160 Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg 165 170 175 Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp 180 185 190 Glu Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg 195 200 205 His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg 210 215 220 Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His 225 230 235 240 Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly 245 250 255 Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val 260 265 270 Tyr Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His 275 280 285 Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly 290 295 300 Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu 305 310 315 320 Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu 325 330 335 Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn 340 345 350 Gln Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg 355 360 365 Phe Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu 370 375 380 Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala 385 390 395 400 Lys Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp 405 410 415 Val Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser 420 425 430 Glu Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile 435 440 445 Thr Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu 450 455 460 Asp Gln Arg Thr His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ile Arg 465 470 475 480 Glu <210> 8 <211> 479 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp 20 25 30 Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro 35 40 45 Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr 50 55 60 Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr 65 70 75 80 Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu 85 90 95 Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln 100 105 110 Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile 115 120 125 Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr 130 135 140 Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly 145 150 155 160 Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met 165 170 175 Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His 180 185 190 Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu 195 200 205 Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val 210 215 220 Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu 225 230 235 240 Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val 245 250 255 Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu 260 265 270 Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr 275 280 285 Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met Lys 290 295 300 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp 305 310 315 320 Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met 325 330 335 Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu 340 345 350 Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr 355 360 365 Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp 370 375 380 Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met 385 390 395 400 Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys 405 410 415 Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr 420 425 430 Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro 435 440 445 Pro Glu Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg 450 455 460 Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu 465 470 475

Claims

인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하는 방법으로서, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현 측정을 포함하며, 여기서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 수용체 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부에 대한 표시 (indication) 가 되는 방법.
제 1 항에 있어서, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현이 하기에 의해 측정되는 방법:

a) 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

b) 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감하지 않은 인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

c) 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이의 측정에 의한, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현의 측정.
제 2 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 10 % 이상인 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 b) 에서 측정된 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 차이가 25 % 이상인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 원발성 폐 종양 또는 전이인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 억제제가 엘로티니브 또는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈 또는 시스-플라틴인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화 Akt 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현을, 인산화 단백질에 특이적으로 결합하는 시약을 이용하여 측정하는 방법.
제 8 항에 있어서, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편이 인산화 AKT 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질에 특이적으로 결합하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화 AKT 단백질이 Akt1 단백질의 아미노산 위치 473 에 대응하는 아미노산 위치에서 인산화되거나, 또는 MAPK 단백질이 MAPK1 의 아미노산 위치 202 및 204 에 대응하는 아미노산 위치에서 인산화되는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, MAPK 단백질의 아미노산 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 2 이고, AKT 단백질의 아미노산 서열이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6, 7 또는 8 인 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준을, 단백체학, 흐름세포측정, 면역세포화학, 면역조직화학 및 효소면역측정법으로 이루어진 군으로부터 선정되는 방법을 이용하여 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현이 하기에 의해 측정되는 방법:

a) 생물학적 샘플의 면역조직화학적 염색,

b) 생물학적 샘플 내 세포 염색의 시각적 조사시 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에 대하여, 숫자 1, 2, 3 및 4 로부터 선택한 등급을 지정, 여기서 발현 수준의 최고 검출 등급 (highest detectable grade) 이 지정됨,

c) 면역조직화학적으로 염색된 생물학적 샘플 내에서 최고 검출 등급을 갖는 세포의 백분율을 측정,

d) 숫자 100 과, 면역조직화학적으로 염색된 생물학적 샘플 내에서 최고 검출 등급을 갖는 세포의 백분율 및 지정된 등급을 곱함, 및

e) 상기 단계 d) 의 곱셈의 결과가 100 을 초과하는 경우, 생물학적 샘플 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 과도발현 측정.
인간 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플이 표피 성장 인자 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 대해 민감한지의 여부를 측정하기 위한, 인산화 AKT 단백질에 결합하는 항체 또는 인산화 MAPK 단백질에 결합하는 항체의 용도.
하기를 포함하는, 환자에서의 폐암 진행을 억제하는 조성물을 선정하는 방법:

a) 환자로부터의 EGFR 억제제 및 화학요법제의 복합요법에 민감한 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 분취량들을 복수의 시험 조성물의 존재 하에 별도로 노출;

b) 시험 조성물과 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/ 또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 시험 조성물과 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준을 비교,

c) 시험 조성물과 접촉하지 않은 분취량과 비교하여 상기 시험 조성물을 포함하는 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준을 변경시키는 시험 조성물 중 하나를 선정, 여기서 시험 조성물과 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 시험 조성물과 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 AKT 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에서의 10 % 이상의 차이가 시험 조성물의 선정을 위한 표시가 됨.
하기를 포함하는, 후보약제를 유도하는 방법:

a) EGFR 억제제 및 화학요법제에 대해 민감한 폐암 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 분취량과 후보약제의 접촉,

b) 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정, 및 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 측정,

c) 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준과 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준의 비교에 의해 후보약제의 효과 관찰,

(d) 상기 관찰된 효과로부터의 상기 약제의 유도, 여기서 후보약제와 접촉한 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준 및 후보약제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플의 분취량 내 인산화 Akt 단백질 및/또는 인산화 MAPK 단백질의 발현 수준에서의 10 % 이상의 차이가 후보약제 효과의 표시가 됨.
제 16 항에 있어서, 상기 후보약제가 억제 후보제 (candidate inhibitory agent) 인 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 후보약제가 증강 후보제 (candidate enhancing agent) 인 방법.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 유도되는 후보약제.
제 19 항에 따른 약제를 포함하는 약학 제제.
폐암 진행의 억제를 위한 조성물의 제조를 위한 제 19 항에 따른 약제의 용 도.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 방법의 단계 및 하기를 포함하는, 약물을 제조하는 방법:

i) 상기 약물을 대상체에 치료적 유효량으로 제공하기 위해, 상기 단계 (c) 에서 확인된 후보약제 또는 이의 유사체 또는 유도체를 충분한 양으로 합성; 및/또는

ii) 상기 단계 (c) 에서 확인된 약물 후보약제 또는 이의 유사체 또는 유도체를 약학적으로 허용가능한 담체와 배합.
환자에서의 폐암 진행을 억제하기 위한 조성물을 선정하거나 또는 후보약제를 유도하기 위한, 인산화 Akt 단백질 또는 인산화 MAPK 단백질에 선택적으로 결합하는 항체, Akt 단백질, MAPK 단백질, 인산화 Akt 단백질, 인산화 MAPK 단백질의 용도.
인산화 MAPK 및/또는 인산화 Akt 단백질에 대항하는 항체를 포함하는 키트.