KR20060029771A - 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고정부위(X)-특정물질 인식부위(V)-고정부위(Y) 또는 형광물질(F)-특정물질 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 프로브를 제작하고, 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 제작된 프로브를 반응시켜 특정물질-프로브 복합체를 제조한 다음, 상기 복합체를 세척 및 분리 한 후, 분리된 복합체에서 프로브를 해리시켜 해리된 프로브를 탐색하는 단계로 구성된 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정물질-프로브 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도가 결정되며, 특정물질에 따라 복합체의 양이 결정되므로, 복합체에서 해리된 프로브를 분석하여 특정물질을 동정하고 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명은 압타머인 단일가닥핵산을 이용하여 시료에서 특정물질에 대한 탐색 및 분석할 수 있는 매우 유용한 방법을 제공한다.
단일핵산가닥, 동정, 정량, 분석방법
Description
도 1은 본 발명의 단일가닥핵산 프로브 및 PCR 기기 분석을 이용하여 대장균을 동정하는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 단일가닥핵산 프로브 및 형광측정기기 분석을 이용하여 대장균을 동정하는 모식도이고,
도 3은 본 발명의 단일가닥핵산 프로브 및 PCR 기기 분석을 이용하여 대장균의 정량적 분석을 살펴본 전기영동 사진이고,
도 4는 본 발명의 단일가닥핵산 프로브 및 형광측정기기 분석을 이용하여 대장균의 정량적 분석을 살펴본 그래프이다.
본 발명은 특정물질의 동정 및 정량적 분석방법에 관한 것이며, 보다 상세하 게는 압타머인 단일가닥핵산은 주어진 환경에 따라 특정물질과 복합체를 형성하는 압타머 성질 또는 핵산 성질을 갖는 기능을 이용하여 특정물질에 대한 탐색 및 분석하는 단순하고 새로운 방법에 관한 것이다.
특정물질의 동정 및 정량적인 변화에 대한 탐색 및 분석하는 기술은 물리학 및 생화학의 발달로 많이 개발되었으나 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다. 특정물질을 분석하는 방법은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 전 과정의 한 부분이며 이런 방법은 미생물 및 바이러스 동정, 세포, 단백질, 유기물질 분석 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.
특정물질의 동정 및 분석은 물리, 화학적인 성질을 이용하여 많이 수행되고 있으며 물질상호간의 특이성 및 친화력을 이용한 분석은 통상적으로 면역학적인 방법을 바탕으로 개발된 방법으로 수행되고 있다. 면역학적인 방법은 항원-항체 반응에 따라 항체가 시료에 있는 특정한 항원과 결합하여 복합체를 형성하며 이 때 표지된 이차 항체를 사용하여 항원-항체 복합체를 분석하는 기법이다. 예를 들면, ELISA는 일차 항체를 고체매질에 고정하며 항원이 있는 시료와 반응시킨 후, 이 복합체를 인지하는 표지된 이차 항체를 처리하여 특정항원에 대한 분석하는 방법이다. 표지된 이차 항체가 고체매질에 고정된 일차항체-항원 복합체를 인지하여 결합하면 표지체가 고체매질에 결합하게 된다. ELISA에 사용하는 프로브는 형광지시약, 디옥시제닌(dioxygenin), 호올스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등으로 표지한다.
핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체이며 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)이다. 핵산은 단일가닥 혹은 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다. 일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥 핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들이 선별되고 있다. 특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법은 셀렉스 (SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 선별된 산물인 핵산을 압타머(aptamer)라 하며(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990), SELEX를 통하여 자연상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다. 이와 같이 선별된 단일가닥핵산을 바탕으로 특정물질을 동정 및 분석하는 기술은 분자적 비콘(molecular beacon, Li JJ et al.; Biochem Biophys Res Commun.,
292(1), pp31-40, 2002), 열량측정법(calorimetric method, Stojanovic MN, Landry DW.; J. AM. CHEM. SOC.,
124, pp9678-9679, 2002), 전기화학형광법 및 효소법(Electrochemiluminescence and enzymatic method, Bruno JG, Kiel JL.; Biotechniques; 32(1), pp178-80, pp182-3, 2002) 등을 이용하여 개발되고 있으나, 단일가닥핵산의 압타머 성질과 핵산 성질에 기초하여 특정물질을 동정 및 분석하는 기술이 구체적으로 보고된 바는 없다.
이에 본 발명자들은 단일가닥핵산인 압타머와 시료를 반응 및 세척과정을 수행한 다음, 특정물질-압타머 복합체에서 단일가닥핵산을 해리시킨 후, 핵산분석기법으로 특정물질 동정 및 정량적인 변화를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 압타머인 단일가닥핵산이 주어진 환경에 따라 특정물질과 복합체를 형성하는 압타머 성질 또는 핵산 성질을 갖는 기능을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량적인 변화를 확인함에 따라 이를 이용하여 미생물, 세포, 단백질을 포함한 다양한 생체분자에 대한 탐색 및 분석하는 시스템을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 고정부위(X)-특정물질 인식부위(V)-고정부위(Y) 또는 형광물질(F)-특정물질 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 프로브를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 상기 제 1단계에서 제작된 프로브를 반응시켜 특정물질-프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체를 60~100℃ 증류수에 5~10분간 처리하여 프로브를 해리시키는 제 4단계; 및 (ⅴ) 상기 해리된 프로브를 탐색하는 제 5단계로 구성된 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다.
상기 특정물질은 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 효소 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 대장균에 대한 압타머인 단일가닥핵산의 염기서열에서 기초한 프로브, 프로브와 대장균의 결합반응시 사용되는 단일가닥핵산 또는 0.2% BSA가 포함된 분석시약, 대장균-프로브 복합체의 분리에 사용되는 시약, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 포함하는 대장균의 동정 및 정량분석을 위한 분석키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 (ⅰ) 고정부위(X)-특정물질 인식부위(V)-고정부위(Y) 또는 형광물질(F)-특정물질 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 프로브를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 상기 제 1단계에서 제작된 프로브를 반응시켜 특정물질-프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체를 60~100℃ 증류수에 5~10분간 처리하여 프로브를 해리시키는 제 4단계; 및 (ⅴ) 상기 해리된 프로브를 탐색하는 제 5단계로 구성된 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다. 본 발명은 도 1에 도식한 바와 같이, 프로브가 셀렉스 선택버퍼에서 특정물질과 복합체를 형성한 다음, 형성된 복합체에서 분리된 프로브를 핵산분석기법으로 분석하는 특정물질의 동정 및 정략적인 분석방법으로서, 미결합 프로브를 측정하여 시료를 분석할 수도 있다.
본 발명의 제 1단계는 단일가닥핵산 프로브를 제작하는 단계이다. 구체적으로, 본 발명은 고정부위(X)-특정물질 인식부위(V)-고정부위(Y) 또는 형광물질(F)-특정물질 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산 프로브를 제공한다.
본 발명은 단일가닥핵산인 프로브(probe) 제작은 특정물질을 인식하는 압타머의 염기서열 및 탐색단계시의 분석방법을 고려하여 제작하는 바, PCR (polymerase chain reaction) 기법으로 분석하는 경우는 고정부위(X)-특정물질 인 식부위(V)-고정부위(Y)인 세 부분으로 구성되는 단일가닥핵산을 제작하고, 형광분석기법으로 분석하는 경우는 형광부위(F)-특정물질인식부위(V)인 두 부분으로 구성되는 단일가닥핵산을 제작한다.
상기 특정물질 인식부위(V)는 SELEX에 의해 선별된 단일가닥핵산의 염기서열을 기초하며 바람직하게는, 특정물질을 인식하는 부위를 포함하는 타겟프로브에 상보적인 단일가닥핵산이고, 16 내지 60 bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산으로, 본 발명에서 SELEX 표준방법(Bock LC et al.; Nature, 355(6360), pp564-6, 1992)으로 선택된 단일가닥핵산인 압타머(aptamer)들 중 본 발명자들에 의해 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 분리하여 분석한 서열번호 3 내지 26의 염기서열을 포함한다(대한민국 특허출원번호 제 2002-0064027호).
탐색단계에서 PCR 기법을 사용하는 경우, 프로브의 고정부위(X 또는 Y)는 프로브의 증폭 정도에 매우 커다란 영향을 미치는 요소로 이의 염기서열구성의 결정은 매우 중요한 단계이다. 프로브의 고정부위는 특징적인 염기로 구성되어 있으며 PCR 단계에서 프라이머(primer)와 결합하는 적절한 Tm 값을 유지해야 한다. 이에 따라 PCR 산물의 형성 정도는 오염되지 않은 자신의 시그날(signal)값을 유지할 수 있도록 해야 한다. 고정부위의 염기서열은 기본적으로 확인하고자 하는 특정물질에 대해 각 하나씩의 염기서열을 디자인하거나 공동적으로 사용할 수 있다. 실제 고정부위의 설계에서 고려해야 할 점들은 길이, 염기 조성(base composition), 비상보적 염기서열의 포함 여부, 그리고 자기-상보성(self-complementarity) 등이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 예를들면, 서열번호 27로 기재되는 X 서열(5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3') 및 서열번호 28로 기재되는 Y 서열(5'-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3')인 것이 바람직하다.
탐색단계에서 형광측정기법을 사용하는 경우, 상기 프로브의 표지물질(F)로는 방사성 동위원소, 플로레신(Fluorescein), Cy3 또는 Cy5 등과 같은 형광물질 또는 바이오틴 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 형광물질을 사용한다. 상기 특정물질은 세균(bacteria), 진균류(fungi), 바이러스(virus), 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 효소 등을 포함한다. 상기 세포주 및 조직은 원핵생물 또는 진핵생물에서 유래한 것을 포함하며, 진핵생물은 인간, 동물, 식물을 의미한다. 바람직하게는 상기 특정물질은 대장균이다. 대장균(Escherichia coli)은 온혈 동물의 장내에 상주하는 세균으로서, 그램음성편모를 가지고 있는 간균이다. 보통 장 내에서는 병원성을 갖지 않지만 요도나 담도에 들어 가서 방광염, 신우염, 담낭염을 일으키는 경우가 있으며 또 소아에서는 급성 장염을 일으킨다. 대변 오염의 지표가 되며, 수질검사에 많이 이용된다.
본 발명의 제 2단계는 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 프로브를 반응시켜 특정물질-프로브 복합체를 제조하는 단계이다. 이때, 반응용액은 프로브가 특정물질과 잘 결합할 수 있는 염의 조성, 비특이적 결합을 방지하는 요소 등으로 구성된다. 상기 분석시약으로 이의 구성요소는 (ⅰ) pH에 대한 완충작용을 위한 20 내지 100mM, 바람직하게는 50mM의 트리스(Tris)·염산(pH 7.4), (ⅱ) 단일가닥핵산 의 이차구조안정화에 관련된 물질로 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘을 각각 0 내지 200mM로 함유하며, 바람직하게는 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘를 함유하고, (ⅲ) 0.05 내지 0.2%의 소듐 아지드를 함유하며, 바람직하게는 0.1% 소듐 아지드를 함유하고, (ⅳ) 비특이적 결합 저해용으로 0.1 내지 0.3%, 바람직하게는 0.2%의 우혈청알부민 또는 비특이적인 결합을 저해하는 핵산으로 이는 프로브의 특이성을 고려하여 결정된 핵산이다. 상기 분석시약은 앞서 언급된 기본적인 4가지 구성요소 중 세가지 이상을 포함하여 이루어진 시약이다. 바람직하게는 50mM 트리스·염산(pH 7.4), 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 0.1% 소듐 아지드 및 0.2% 우혈청알부민이 첨가된 용액을 포함하는 분석시약을 사용한다. 반응온도는 SELEX 수행온도보다 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는 20 내지 37℃의 온도에서 반응을 수행한다. 보편적으로 단백질 및 단일가닥 핵산을 과량으로 처리하여 타겟 프로브의 비특이적인 결합을 방지하며, 바람직하게는 타겟 프로브의 효모 tRNA(yeast tRNA), 살몬스펌 DNA(salmon sperm DNA) 또는 인간 태반 DNA(human placental DNA)를 사용할 수 있다.
본 발명의 제 3단계는 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-프로브 복합체를 세척 및 분리하는 단계이다. 이는 막 여과법, 흡착법 혹은 원심 분리법 등 다양한 방법으로 분리할 수 있다. 상기 제 2단계에서 특정물질로서의 시료가 미생물 및 세포인 경우는, 프로브 용액을 시료가 포함된 선택버퍼에 혼합하여 실온 혹은 37℃에서 30분간 반응한 후, 바로 원심분리법 혹은 0.42 ㎛ 막을 이용한 여과방법으로 복 합체를 0 내지 1 x 셀렉스버퍼, 증류수 또는 0 내지 500mM EDTA 용액으로 세척하여 비결합 프로브 및 결합력에 따라 프로브를 제거하여 제 4단계의 해리반응에 사용할 수도 있다. 단백질인 경우는 프로브와 단백질 복합체 및 비결합 프로브를 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈막 혹은 PVDF (polyvinylidiene fluoride)필터를 이용한 여과방법, 단백질을 표지하는 방법 혹은 단백질시료를 ELISA 플레이트에 흡착시켜 수행하는 흡착법 등으로 분리할 수도 있다.
본 발명의 제 4단계는 세척되어 분리된 특정물질-프로브 복합체에서 프로브를 해리시키는 단계이다. 상기 제 3단계에서 수득된 특정물질-프로브 복합체를 60 ~ 100℃인 증류수에 5 ~ 10분간 처리하여 복합체에서 프로브를 해리시킨다.
특정물질-프로브 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도가 결정되며 이로부터 특정물질을 동정하여 정량할 수 있다. 프로브의 특정물질 인식부위와 특정물질의 특이성 및 결합력은 특정물질-프로브 복합체의 결합정도를 결정하고 특정물질의 양은 특정물질-프로브 복합체의 양을 결정한다. 복합체에서 해리되는 프로브는 특정물질-프로브 복합체의 양에 의해 결정되며 프로브 분석은 핵산분석기법으로 결정한다. 따라서 핵산분석결과를 분석하여 특정물질의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
본 발명의 제 5단계는 해리된 프로브를 탐색하는 단계로서, 프로브의 종류에 따라 도 1 및 도 2와 같은 다양한 방법을 선택할 수 있다.
도 1는 PCR 기법에 기초한 측정방법으로, 대장균과 프로브를 반응시킨 다음, 여과법에 의해 대장균-프로브 복합체를 분리하여 프로브를 해리시킨 후, 해리된 프로브를 프로브의 고정부위에 상응하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 증폭하여 증폭산물을 전기영동 방법을 포함한 다양한 기술로 측정하는 방법이다.
도 2는 대장균과 표지된 프로브를 반응시킨 후, 여과법에 의해 대장균-프로브 복합체를 분리하여 프로브를 해리시킨 다음, 해리된 표지프로브를 큐빅(형광측정용 튜브)에 넣은다. 형광측정기에 이를 장착하여 램프에서 조사되는 빛이 여기필터(excitation filter)를 통하여 큐빅에 조사된다. 큐빅에서 나오는 형광은 방출필터(emission filter)를 통하여 측정되는 형광값을 이용하여 특정물질을 분석할 수 있다.
상기 방법으로 미생물, 세포 및 단백질을 포함하는 생체분자에 대한 탐색 및 분석할 수 있는 시스템으로 유용성을 갖게 된다.
또한, 본 발명은 대장균에 대한 특이적 결합 염기서열을 포함하는 프로브로 제작된 단일가닥핵산, 프로브와 대장균의 결합반응시 사용되는 단일가닥핵산 또는 0.2% BSA가 포함된 분석시약, 대장균-프로브 복합체를 분리하는 막, 대장균-프로브 복합체의 해리시 사용되는 용액, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 포함하는 대장균 동정 및 정량분석을 위한 분석키트를 제공한다.
본 발명은 단일가닥핵산인 프로브를 이용하여 시료에서 미생물, 세포 및 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석하는 시스템을 제공한다.
상기 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석하는 시스템은 본 발명의 단일가닥핵산인 프로브, 분석시약, 프로브를 탐색하는 방법으로 구성된다.
상기 생체분자는 세균 및 바이러스와 같은 미생물, 세포주, 이로부터 분리된 단백질 또는 효소 등을 포함한다.
상기 단일가닥핵산인 프로브는 고정부위-특정물질인식부위-고정부위 혹은 형광물질-특정물질인식부위로 구성된 단일가닥핵산를 의미하며, 상기 관련 시약은 상기 선택버퍼, 0.2% 우혈청알부민(BSA)을 함유한 선택버퍼 또는 단일핵산가닥을 함유한 분석시약을 포함하며, 신호물질을 탐색하는 방법은 핵산분석기법을 사용할 수 있으며 확보된 자료를 다양한 생물정보학적인 방법으로 분석하여 이용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예로 형광측정법 및 PCR 분석기법을 의미하며, 상기 동정 및 분석하는 시스템을 사용하여 생체 분자를 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예 1. 단일가닥핵산의 선정
SELEX 라이브러리, 프라이머 및 단일가닥핵산은 다음과 같이 준비하였다. HPLC 정제된 SELEX 라이브러리는 18개의 뉴클레오티드인 프라이머 결합 서열을 사이에 60개의 뉴클레오티드가 임의로 배열된 염기서열(5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (N)60 AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3': MWG-Biotech AG)로 구성되었다. 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머(5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3')와 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머(5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3')를 이중가닥 혹은 단일가닥 DNA의 합성을 위한 PCR(polymerase chain reaction) 수행시, 반응 프라이머로 사용하였다. 한편, 본 발명의 단일가닥핵산 프로브의 고정부위는 서열번호 27로 기재되는 X 서열(5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3') 및 서열번호 28로 기재되는 Y 서열(5'-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3')을 사용하였다.
표적물질에 대한 단일가닥핵산인 압타머(aptamer)의 선정은 SELEX 표준방법으로 수행하였다(Bock L.C. et al., Nature, 355(6360), pp564-6, 1992). 압타머는 특정물질에 대한 특이 결합력을 보이는 올리고뉴클레오티드로, 선택(selection) 과정을 반복함으로써 고도로 특이적인 염기서열을 얻을 수 있게 된다.
상기에서 합성된 단일가닥핵산을 첫회는 1015 염기서열/1㎖의 농도로, 다음 회부터는 200 pmol/200 ㎕의 농도로 선택버퍼(50 mM Tris·Cl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2 % BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다. 단일가닥핵산을 106개의 대장균이 있는 선택버퍼에 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 대장균과 결합하는 단일가닥핵산은 원심분리하여 분리한 후, 1 ㎖ 선택버퍼(0.2% BSA 포함)로 세척하였다. 용액 I(선택버퍼, 10mM EDTA)을 상기 반응물에 처리하여 단일가닥핵산을 분리한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전으로 단일가닥핵산을 완전히 분리하였다. 두 번째 과정을 수행하기 위해, 에탄올 침전으로 얻은 단일가닥핵산에 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 비대칭 PCR (asymmetric PCR)을 수행하여, 다시 단일가닥핵산을 준비한 후 상기 기술한 방법을 반복적으로 수행하였다.
셀렉스과정을 최종 8회를 수행한 후, 최종 분리된 단일가닥핵산을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 이중가닥핵산을 합성하였다. 이 PCR 산물을 T-벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정한 후, 대장균과 높은 결합력이 있는 단일가닥핵산 E18를 선정하였다(서열번호 20; 대한민국 특허출원번호 제 2002-0064027호).
실시예 2. 프로브의 제작
프로브(probe)는 핵산분석방법을 고려하여 제작하며 PCR 기법의 경우, 선정된 단일가닥핵산이 클로닝된 플라스미드를 주형(template)으로 하여 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 표준 비대칭 PCR를 수행하여 준비하였다. 분리한 1 pg 플라스미드, PCR 반응 용액[10 pM 정방향 프라이머, 1 pM 역방향 프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)]에서 표준 비대칭 PCR 방법으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 20초의 조건으로 30 사이클 반복 수행하여 프로브를 제작하였다. PCR 산물 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen사)의 프로토콜에 준하여 비결합된 프라이머를 제거하여 최종적으로 프로브를 준비하였다. 형 광측정기법인 경우는 선정된 압타머의 5'말단에 Cy-3를 표지하여 HPLC 정제하는 방법으로 준비하였다.
실시예 3. 반 응
반응은 1차 반응, 2차 반응 및 3차 반응의 세 단계로 수행되었다. 시료는 대장균(Promega 사)를 희석하여 준비하였으며 표준방법(Sambrook J., Fritsh E. F., and Maniatis T. 1989. Molecular cloning(2nd edition). Cold spring Harbor Laboratory Press. 3:A.1-A.6)에 따라 콜로니형성단위(colony forming unit, cfu)를 측정하였다.
1차 반응으로, 정제된 프로브 용액과 시료가 포함된 150㎕ 선택버퍼(0.2% BSA 포함)를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 2차반응으로, 대장균-프로브 복합체를 원심분리 방법으로 선택버퍼로 3회 세척하고 반응산물을 15,000xg, 5분간 원심 분리하여 수확하였다. 또는 여과방법으로 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈막 혹은 PVDF (polyvinylidiene fluoride)필터를 이용하여 반응액을 여과하고 선택버퍼로 3회 세척하였다. 3차 반응으로, 원심분리법의 경우는 특정물질-프로브 복합체가 있는 펠렛에 1,000㎕ 증류수에 넣으며 여과법인 경우, 막을 1,000㎕ 증류수에 넣고 60 ~ 100 ℃에서 5 ~ 10분간 처리한 다음, 용액을 취하였다.
실시예 4. 탐색 및 분석
4-1. PCR 방법에 의한 탐색 및 분석
상기 실시예 3에서 해리된 프로브를 PCR 방법에 의해 분석하는 경우는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 이중가닥핵산을 합성하였다. 해리된 프로브, PCR 반응 용액, 100 pM 정방향 프라이머, 100 pM 역방향 프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)에서 표준 PCR 방법으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 20초 조건으로 8회 사이클을 반복 수행하여 이중가닥핵산을 합성한 후, 2% 아가로스겔에서 전기영동하였다.
전기영동 결과, 밴드정도는 대장균 시료의 양에 비례하여 형성되었다. 대장균과 프로브의 대장균 인식부위 간의 특이성 및 결합력에 따라 대장균-프로브 복합체의 결합정도가 결정되며 또한, 대장균의 양에 따라 결합양이 결정된다. 대장균-프로브 복합체에서 해리되는 프로브의 양은 PCR 산물의 양을 결정한다. 따라서 형성된 밴드의 정도를 분석하여 대장균 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
상기 실험 결과를 도 3와 나타내었으며, 도식된 바와 같이 프로브 및 대장균 반응군에서 밴드가 형성되었으며 리스테리아균(Listeria monocytogenes, ATCC #19118)을 시료로 하여 동일한 방법으로 검사한 결과, 벤드를 확인할 수 없었다. 또한, 대장균 100 cfu의 경우 및 대장균 10,000 cfu의 경우의 비교한 결과, 밴드 정도가 대장균 10,000 cfu의 경우가 100 cfu 경우보다 상대적으로 높아 밴드밀도의 차이는 대장균의 cfu의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 대장균-프로브 복합체는 형성되어 대장균 수에 따라 밴도밀도가 상이하며 이는 미생물의 수와 상관관계가 있으며 이를 이용하여 미생물의 수를 결정할 수 있었다. 압타머와 PCR 기술을 이용한 미생물 검사의 검사한계(Limits of detection)는 이론적으로 1 cfu 미 생물도 검출이 가능하나 상기 실시예에서는 100 cfu이다.
4-2. 형광측정법에 의한 탐색 및 분석
해리된 프로브를 형광측정기에 의해 분석하는 경우는 형광측정장치(Turner Biosystem 사, PicofluorTM, Handheld Dual Channel Fluorometer)로 형광을 측정하였다. 기기를 대장균 시료만 있는 실험구를 0으로 설정하고, 시료에 동량의 프로브를 넣은 실험구를 999로 설정한 다음, 시료와 프로브를 반응시킨 비교구를 측정하였다.
형광분석 결과, 형광정도는 특정물질의 양에 비례하여 다양하게 나타났다. 대장균과 프로브의 대장균 인식부위 간의 특이성 및 결합력에 따라 대장균-프로브 복합체의 결합정도가 결정되고, 대장균의 양에 따라 결합양이 결정된다. 대장균-프로브 복합체에서 해리되는 프로브의 양은 형광정도에 영향을 준다. 따라서 형광정도를 분석하여 대장균 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
상기 실험 결과를 도 4에 나타내었으며, 도식된 바와 같이 프로브 및 대장균 반응군에서 형광이 형성되었으며 대장균 100 cfu의 경우 및 대장균 10,000 cfu의 경우의 비교한 결과, 형광정도가 대장균 10,000 cfu의 경우가 100 cfu 경우보다 상대적으로 높아 형광정도의 차이는 대장균의 cfu의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 대장균-프로브 복합체는 형성되어 대장균 수에 따라 형광정도가 상이하며 이는 미생물의 수와 상관관계가 있으며 이를 이용하여 미생물의 수를 결정할 수 있었다. 압타머와 형광측정기술을 이용한 미생물 검사의 검사한계(Limits of detection)는 이론적으로 1 cfu 미생물도 검출이 가능하나 상기 실시예에서는 100 cfu이다.
상기의 방법으로 다양한 물질에 대한 인식부위를 가진 프로브를 이용하여 한 시료에서 다양한 물질의 동정 및 정량적인 변화를 탐색 및 분석할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명은 압타머인 단일가닥핵산은 주어진 환경에 따라 특정물질과 복합체를 형성하는 압타머 성질 또는, 핵산 성질을 갖는 기능을 이용하여 특정물질의 동정과 정량적인 변화까지 확인할 수 있는 분석방법 및 시스템은 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석 등에 사용할 수 있어 궁극적으로는 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용될 수 있다.
<110> KIM, Sung Chun
<120> Method for identifying and analyzing certain molecules using by a
single strand nucleic acid probe
<160> 28
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'-primer
<400> 1
ataccagctt attcaatt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'-primer
<400> 2
agattgcact tactatct 18
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E1 : nucleic acid lignd to E. coli
<400> 3
ctttcttact cggatgatcc tcttgtggtc gtcatagtcg ttgaatacgc tattgggttg 60
60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 4
ggtgtggcaa ggggtaacgg tgcgggaacg ctattctcgt gtgatggtgt agccttggaa 60
60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 5
agttcgatga gggtgacacc gccaggagtg tttgctagac ttgaggaaag gggcccggtg 60
60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E4 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 6
acccgtcgat aatgactgaa cttcctctat cttaaagggg gtgcgcttgt tgggaaggag 60
60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E5 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 7
gggtaagggg atgtttctgg gattcaagcg cctgattctg aggtgggcct ccgctacgag 60
60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E6 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 8
tctgtatttg tacgcaccga agataagaga gggagtggat gggctgaaat ggaggacagg 60
60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E7 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 9
catgggcggg ccgcggtcta ttcgggatta ttgcggatcc aagcgttttt ggtgtatgag 60
60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E8 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 10
tcagggtgtg aagttcttcc gcgctagtgg cttgtatgtt atggataata ccgcctcatg 60
60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> E9 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 11
gtcggggttg caaggcgtcg tagcgtgtat ttgtgatggt gaggaggtga aaggctgtga 60
60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> E10 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 12
gcgtatgggc gggtcattag gacaatttaa ccactcgcga aagggggcag cttgagttgg 60
60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E11 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 13
attgtctgtg tgactagtcg gtctagtgtg ggggagaaga gtaaacaatc ggcggtgaag 60
60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E12 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 14
ttaccactga gttaatttgt acggtctgcg gtgtacttta agtatgaagg ggactacaca 60
60
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E13 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 15
gctatcaata ttatagaggc ggtcggggta gtgtcatcgt ggatattttt tatgggcggg 60
60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E14 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 16
taggagagcg ggagctgaga acttagaggc gccgatacac gaggacggat ttctcaatgg 60
60
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E15 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 17
gacgtattac agttaagttg gcgccattcg atttctgatc accggccggc atcagagggg 60
60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E16 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 18
ataccagctt attcaattat accagcttat tcaattttgt gggtggattg gttggtgtag 60
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E17 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 19
ccgtaagtcc ggtcttcctt gctgagtcgc cctttcaggt gcccaagcta cgtgctgaga 60
60
<210> 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> E18 : nucleic acid ligand to E. coli
<400> 20
ttggtgggga gggccagtta ggtctaattt ccgacgcgca agaatgtcta ctcaggtccg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N1
<400> 21
gtctacaaag gcgagacatg tgctgtaaac gtttttgtaa taagagtccg cgttaatccg 60
60
<210> 22
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<223> N2
<400> 22
ctgctacgcg aggcgggtaa attcggtggg ctagaggcga gcgacatagt agtgtaggga 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> N3
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tatttgtagg gggctactgg ttaacgtaat tggtctttaa ggaggtttag tcggtgggtg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> N4
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tataaaggcg gggtgcatag ttgggacggg agaatctttg gggcgatgtt tttgggtgcg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> N5
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tccgggagac gggtggtgcg tgtgcctttc gatagttaac ggggatgacc aaatgcatag 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> N6
<400> 26
tcgcagttgt ggctaatggg tgagagggag tgagtgttct ataaataatt cgaaaagtcc 60
60
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X region for single strand nucleic acid probe of present
invention
<400> 27
ataccagctt attcaatt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y region for single strand nucleic acid probe of present
invention
<400> 28
agatagtaag tgcaatct 18
Claims (8)
- (ⅰ) 고정부위(X)-특정물질 인식부위(V)-고정부위(Y) 또는 형광물질(F)-특정물질 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 프로브를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 상기 제 1단계에서 제작된 프로브를 반응시켜 특정물질-프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체를 60~100℃ 증류수에 5~10분간 처리하여 프로브를 해리시키는 제 4단계; 및 (ⅴ) 상기 해리된 프로브를 탐색하는 제 5단계로 구성된 단일가닥핵산 프로브를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 분석시약은(ⅰ) 20 내지 100mM 트리스·염산(pH 7.4),(ⅱ) 각각 0 내지 200mM의 염화칼륨, 염화나트륨 또는 염화마그네슘, 그리고 이들의 혼합용액,(ⅲ) 0.05 내지 0.2%의 소듐 아지드,(ⅳ) 0.1 내지 0.3%의 우혈청알부민 또는 비특이적인 결합을 저해하는 핵산을 포함하는 셀렉스 선택버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 분석시약은 50mM 트리스·염산(pH 7.4), 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨 또는 1mM 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 특정물질은 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 특정물질은 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 3단계의 세척버퍼는 0 내지 1 x 세렉스버퍼 또는 0 내지 500 mM EDTA 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 5단계의 탐색은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)기법 또는 형광측정기법인 것을 특징으로 하는 방법.
- 대장균에 대한 특이적 결합 염기서열을 포함하는 프로브로 제작된 단일가닥핵산, 프로브와 대장균의 결합반응시 사용되는 단일가닥핵산 또는 0.2% BSA가 포함된 분석시약, 대장균-프로브 복합체를 분리하는 막, 대장균-프로브 복합체의 해리시 사용되는 용액, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 포함하는 대장균 동정 및 정량분석을 위한 분석키트.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20140118680A (ko) * | 2013-03-27 | 2014-10-08 | 김성천 | 생체분자와 단일가닥핵산의 결합정보를 생성하기 위한 기준물질 및 핵산칩, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 생체분자 분석방법 및 장치 |
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