KR100828936B1 - 단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 각종 생체분자와 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 및 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하는 금-나노입자와 염을 이용하여, 특정 생체분자를 동정하고 정량하는 분석방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체분자 분석방법은, 분석대상이 되는 핵산을 제외한 표적생체분자와 기지의 단일가닥핵산 압타머를 수용액에 첨가하여 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산 사이의 특이적 결합에 의한 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성시키는 단계; 상기 수용액에 금-나노입자를 첨가하여 상기 표적생체분자와 복합체를 형성하지 아니하고 남아 있는 상기 단일가닥핵산과 상기 금-나노입자를 반응시켜 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 수용액에 염을 첨가하여 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하고 있는 상기 금-나노입자의 분산 상태에 기초한 상기 수용액의 색상변화를 분석하는 단계; 를 포함하고: 이로써 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산의 특이적 결합으로부터 상기 표적생체분자를 동정하고 상기 반응용액의 색상변화로부터 상기 표적생체분자를 정량하는 것을 특징으로 한다.

Description

단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자 분석방법{Method for Analysis of Biological Molecule Using Single-Stranded Nucleic Acid Aptamer and Gold Nano-Particle}

도1은 다양한 수의 대장균에 100ng 단일가닥핵산 압타머를 처리하고 금-나노입자 및 염을 첨가하여 일어나는 색깔 변화를 보여주는 도면,

도2는 다양한 수의 대장균에 250ng 단일가닥핵산 압타머를 처리하고 금-나노입자 및 염을 첨가하여 일어나는 색깔 변화를 보여주는 도면,

도3은 다양한 양의 VEGF 단백질에 250ng 단일가닥핵산 압타머를 처리하고 금 나노입자 및 염을 첨가하여 일어나는 용액의 색깔 변화를 스펙트로미터로 스캐닝 한 결과의 그래프들,

도4는 도3으로부터 유도된 단백질 양에 따른 용액의 변색 패턴을 보여주는 그래프.

(기술분야)

본 발명은 생체분자의 분석방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 각종 생체분자와 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 및 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하는 금-나노입자와 염을 이용하여, 특정 생체분자를 동정하고 정량하는 분석방법에 관한 것이다.

(배경기술)

특정물질을 동정하고 그 정량적 변화를 분석하는 방법은, 물리학 및 생화학의 발달에 따라 꾸준히 발달하고 있으며, 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 자동화 등에 관련하여 보다 효율적인 방법의 개발에 대한 요구는 계속되고 있다.

특정물질을 분석하는 방법은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 전체 과정의 일부분이지만 미생물 및 바이러스 동정, 세포, 단백질, 유기물질 분석 등에 매우 유용하며, 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.

핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(시토신, 티미딘, 우라실)으로 되어 있다.

핵산은 단일가닥이나 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들 간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하며, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.

일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.

핵산은 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들을 선별되고 있다.

특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 이렇게 선별된 산물인 핵산을 일반적으로 압타머(aptamer)라고 한다(Craig et al., 1990, Science, 249, 505-510). 이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.

특정물질의 동정 및 분석은 물리, 화학적인 성질을 이용하여 많이 수행되고 있으며, 물질상호간의 특이성 및 친화력을 이용한 분석은 통상적으로 면역학적인 방법을 바탕으로 개발된 방법으로 수행되고 있다.

금-나노입자는 용액에 분산되었을 때 입자의 크기에 따라서 흡수스펙트럼에서 서로 다른 최대흡수파장이 있다. 예를 들면 약 13nm의 지름을 지니는 금-나노입자가 수용액에서 잘 분산되었을 때는 약 530nm의 최대흡수파장을 가지고 그 용액은 적색을 띄게 되지만, 입자가 모여서 집합체(또는 집합: aggregation)가 되었을 때는 최대흡수파장이 장파장으로 이동하게 되어 그 용액의 색은 보라색을 띄게 된다.

이러한 원리를 사용하여, 금-나노입자 표면에 염기배열의 순서를 알고 있는 단일가닥 DNA를 붙이고 상보적인 염기서열을 지니는 DNA와 반응시켜 이중가닥핵산이 형성되게 함으로써 금-나노입자들의 집합을 유발시키면, 용액의 색은 표적 DNA가 없을 때는 적색을 나타내지만 표적 DNA가 있을 때에는 보라색을 띄게 되는 것이 보고되었다(J. Am. Chem. Soc., 125, 1643 (2003)).

또한, 단일가닥핵산과 이중가닥핵산이 금-나노입자에 흡착되어 복합체를 형성하면, 특정한 염에서 전자의 단일가닥핵산은 그 정전기적인 반발력으로 분산 상태를 유지하여 적색을 유지하지만 후자의 이중가닥핵산은 집합체를 형성하여 보라색이 된다.

이와 같은 핵산, 금-나노입자 및 염의 특성을 이용하여 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 분석하는 비색분석법(colorimetric method)이 개발되었다(PNAS., 101, 14036 (2004)). 이런 분석방법은 금-나노입자, 단일가닥핵산 혹은 상보적인 가닥의 변형이 필요 없고, 혼성화 반응과 감지가 서로 분리되어 있어서 탐침을 표면에 고 정하는 것에 따른 입체적인 제한에서 오는 혼성화 반응속도의 저하 등의 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 목적은, 단일가닥핵산 압타머와 생체분자의 특이적인 결합 및 단일가닥핵산과 금-나노입자의 복합체의 염에 의한 변색현상을 이용하여, 특정 생체분자를 동정하고 정량할 수 있는 분석방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라 생체분자 분석방법이 제공된다.

본 발명에 따른 생체분자 분석방법은, 분석대상이 되는 핵산을 제외한 표적생체분자와 기지의 단일가닥핵산 압타머를 수용액에 첨가하여 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산 사이의 특이적 결합에 의한 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성시키는 단계; 상기 수용액에 금-나노입자를 첨가하여 상기 표적생체분자와의 복합체를 형성하지 아니하고 남아 있는 상기 단일가닥핵산과 상기 금-나노입자를 반응시켜 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 수용액에 염을 첨가하여 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하고 있는 상기 금-나노입자의 분산 상태에 기초한 상기 수용액의 색상변화를 분석하는 단계; 를 포함하며, 이로써 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산의 특이적 결합으로부터 상기 표적생체분자를 동정하고 상기 반응용액의 색상변화로부터 상기 표적생체분자를 정량한다.

바람직하게, 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성시키는 단계 전에 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 제거한다.

상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체 형성단계는, 분석 대상이 되는 핵산을 제외한 상기 표적생체분자와 상기 표적생체분자에 특이적으로 결합하는 기지의 단일가닥핵산 압타머 사이에 그 특이적 결합에 의한 복합체를 형성시킴으로써, 상기 표적생체분자가 어떤 물질인지 동정할 수 있는 근거를 제공하고, 또한 상기 표적생체분자를 정량할 수 있는 근거가 되는 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체가 형성되게 하는 단계이다.

상기 단일가닥핵산 압타머는 수용액 중에서 열역학적으로 안정하고 일정한 이차구조를 유지하는 안정 구조체와 그렇지 못한 불안정 구조체가 평형을 이루는 상태로 존재한다. 이런 평형상태에서 두 종류 구조체의 비율은 반응용액의 구성요소 및 온도 등에 의해 결정된다.

이와 같은 평형 상태의 상기 단일가닥핵산 압타머 수용액에 상기 표적생체분자를 첨가하면, 상기 표적생체분자는 상기 단일가닥핵산의 안정 구조체와 반응하여 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성하게 되며, 따라서 상기 표적생체분자와 복합체를 형성하지 아니하고 남아 있는 상기 단일가닥핵산에는 상기 표적생체분자와 복합체를 형성하지 아니한 불안정 구조체가 상대적으로 많이 존재하게 된다. 즉, 상기 표적생체분자의 량에 의존하여 복합체를 형성하지 않고 남아 있는 단일가닥핵산에서의 안정 구조체와 불안정 구조체의 상대적 비율이 달라지는 것이다.

상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체 형성단계는, 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체의 형성단계를 거친 수용액에 금-나노입자를 첨가함으로써 상기 표적생체분자와 복합체를 형성하지 않고 남아 있는 상기 단일가닥핵산이 상기 금-나 노입자에 흡착되어 복합체를 형성하도록 하는 단계이다.

상기 색상변화 분석 단계는, 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체의 형성이 완료된 상기 수용액에 염을 첨가하여 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하고 있는 상기 금-나노입자의 분산 상태에 기초한 상기 수용액의 색상변화에 근거하여 상기 표적생체분자의 양을 판단하는 단계이다.

상기 표적생체분자의 양이 상대적으로 많으면 상기 단일가닥핵산 중에서 보다 많은 양의 안정 구조체가 상기 표적생체분자와 복합체를 형성할 것이므로, 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성하지 아니하고 용액 중에 남아 있는 단일가닥핵산에는 불안정 구조체의 비율이 상대적으로 높을 것이며, 여기에 상기 금-나노입자를 첨가하여 형성한 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체에는 정전기적인 반발력을 일으키는 불안정 구조체 단일가닥핵산이 상대적으로 많이 포함될 것이므로, 금-나노입자가 분산 상태를 유지하게 되어 염이 첨가된 용액의 색상은 적색을 띄게 된다.

반대로 상기 표적생체분자의 양이 상대적으로 적으면 상기 표적생체분자-단일가닥핵산 복합체의 형성이 적어서 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성하지 않고 남아 있는 단일가닥핵산 중에 안정 구조체의 상대적인 비율이 높아질 것이며, 여기에 상기 금-나노입자를 첨가하여 형성한 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체에는 정전기적 반발력이 낮은 안정 구조체 단일가닥핵산이 상대적으로 많이 포함될 것이므로 복합체가 집합체를 형성하게 되어 염이 첨가된 용액의 색깔은 보라색으로 변하게 된다.

상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체가 형성된 후의 용액에 염을 첨가하여 일어나는 색깔변화는 공지의 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 분석방법은 핵산을 제외한 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산의 특이적 결합에 의해 상기 표적생체분자를 동정하고, 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체의 분산 상태에 기초한 용액의 색상변화로부터 상기 표적생체분자를 정량하게 된다.

즉, 미생물, 세포 및 단백질을 포함하는 핵산을 제외한 각종 생체분자들을 동정하고 정량하기 위해서, 상기 생체분자들에 특이적으로 결합하는 각종 단일가닥핵산 압타머들을 미리 선정하여 확보하고, 다양한 량의 상기 생체분자들과 다양한 량의 단일가닥핵산들에 대하여 생체분자-단일가닥핵산 복합체 형성과 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체 형성을 거친 후에 금-나노입자에 의한 색상변화 결과를 획득함으로써, 단일가닥핵산, 핵산을 제외한 생체분자 및 금-나노입자의 다양한 량에 대응하는 색상변화의 표준 데이터를 확보할 수 있으며, 이런 표준 데이터와 미지의 생체분자(표적생체분자)에 대하여 본 발명의 분석방법을 적용한 결과의 데이터를 대비하여 분석하면, 핵산을 제외한 미지의 상기 생체분자를 동정 및 정량할 수 있게 되는 것이다.

이하, 실시예와 첨부도면을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예 1: 대장균에 특이적인 단일가닥핵산 압타머의 선별

본 발명에 따른 분석방법의 분석대상(표적생체분자)으로서 대장균을 선택하였고, 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산의 선별을 위해 셀렉스(SELEX) 표준방법을 수행하였다(Bock LC et al.; Nature, 355(6360), pp564-6, 1992).

아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사를 통하여 단일가닥의 RNA 라이브러리를 제조하였다.

5'-GGG AGA GCG GAA GCG TGC TGG GCC N₄₀ CAT AAC CCA GAG GTC GAT GGA TCC CCC C-3'(여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이며 N₄₀은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.)

PCR에 이용되는 FW 프라이머(5'-GGG GGA ATT CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GAA GCG TGC TGG G- 3')(서열번호 1)는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5'말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다. PCR의 RE 프라이머(5'-GGG GGG ATC CAT CGA CCT CTG GGT TAT G-3')(서열번호 2)는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3'말단과 염기결합을 할 수 있다. 그리고 상기 FW와 RE 프라이머는 이후의 클로닝을 위해 각각 EcoRI과 BamHI등의 제한효소 절단 염기서열을 함유하고 있다.

셀렉스에 사용한 핵산라이브러리는 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 분자 라이브러리이며, DNA 핵산라이브러리 전사체 및 PCR 프라이머를 상기와 같이 설계 제작하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로 준비하였다.

1,000 pmoles 단일가닥핵산 전사체, 2,500 pmoles의 상기 PCR 프라이머 쌍(서열번호 1 및 서열번호 2의 상기 FW 프라이머 및 RE 프라이머)을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다.

2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 분자 라이브러리는 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 검색하였다.

상기에서 합성된 단일가닥핵산을 1회는 10¹⁵ 염기서열/1㎖의 농도로, 다음 회부터는 200 pmol/200㎕의 농도로 선택버퍼(50 mM Tris·Cl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0.1% NaN₃)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다. 단일가닥핵산을 10⁶개의 대장균 DH-5α(Amershambiosciences 사) 가 있는 선택버퍼에서 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.

대장균과 결합하는 단일가닥핵산은 원심분리하여 분리한 후, 1㎖ 선택버퍼(0.2% BSA 포함)로 세척하였다. 용액I(선택버퍼, 10mM EDTA)를 상기 반응물에 처리하여 단일가닥핵산을 분리한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전으로 단일가닥핵산을 완전히 분리하여 위에서 열거한 서열번호 1 및 서열번호 2의 상기 프라이머로 이용하여 증폭함으로써 다음 선택 과정을 위한 핵산을 제조, 정제하였다.

같은 과정의 선택 과정을 여러 번 더 반복한 후 처음보다 낮은 농도의 표적과 반응을 시키거나 세척 과정을 더욱 여러 번 수행하여 표적 대장균과 매우 특이적으로 그리고 높은 친화력을 가진 단일가닥핵산을 분리 및 추출하였다.

최종 18회를 수행한 후, 최종 분리된 단일가닥핵산을 상기 FW-프라이머 및 RE-프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 이중가닥핵산을 합성하였다. 이 PCR 산물을 T-벡터에 클로닝하여, 대장균(표적생체분자)과 높은 결합력이 있는 단일가닥핵산 압타머의 염기서열은 결정하였으며, 결정된 염기서열은 상기 N₄₀의 염기서열이 'UAC ACU GCG UGC UUN CGA CUU CUG GUC CCA UCA UUC GAA U'인 서열(서열번호 3)이었다.

실시예 2: 선별된 단일가닥핵산 압타머를 이용한 표적생체분자(대장균)의 분석

단일가닥핵산 압타머 전사체 및 PCR 프라이머를 설계 제작하여 PCR 및 생체외 전사 방법으로, 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 실시예1에서 선별된 염기서열의 단일가닥핵산 압타머를 준비하였다.

1,000 pmoles 단일가닥핵산 전사체, 2,500 pmoles의 상기 PCR 프라이머쌍(서열번호 1 및 서열번호 2의 상기 FW 프라이머 및 RE 프라이머)을 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3), 3 mM MgCl₂, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)에서 PCR를 수행한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 분자의 단일가닥핵산 압타머를 생체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 200 pmoles 이중가닥 DNA 전사체, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 1 mM ATP, GTP 및 3 mM 2'F-CTP, 2'F-UTP를 37℃에서 6 ~ 12시간 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제하였다.

표적생체분자인 대장균(DH-5 α)을 12시간동안 배양한 후, 희석하여 준비하였으며 표준방법에 따라 cfu(colony forming unit)를 측정하였다. 대장균(표적생체분자)을 멸균 증류수를 이용하여 희석하는 방법으로 0, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ 및 10⁶개수로 준비한 후, 앞서 제작된 100 ~ 400 ng의 RNA 단일가닥핵산 압타머를 투입하여 30분간 반응시켜 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성하였다.

그리고 반응용액에 100 ul ~ 500 ul의 0.01% 금-나노입자(Sigma-Aldrich, USA)를 바로 첨가하거나, 또는 원리분리법 또는 여과법으로 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 제거하여 얻은 상징액에 상기 금-나노입자를 첨가하여 10분간 반응시킴으로써, 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성하였다.

마지막으로 염으로서 100 ~ 350 ul의 1N NaCl를 첨가하여 용액의 색깔을 관찰하였으며 그 결과는 도1 내지 도2와 같다.

도1에서 알 수 있는 바와 같이, 100 ng 단일가닥핵산 압타머가 첨가한 경우 표적생체분자(대장균)가 1,000개 미만인 경우는 용액 색깔이 보라색이 있었고, 표적생체분자(대장균)가 1,000개 이상인 경우에 용액 색깔이 적색을 띄었다.

그리고 도2에서 보는 바와 같이, 250 ng 단일가닥핵산 압타머가 첨가된 경우 대장균(표적생체분자)이 10,000개 미만인 경우 용액 색깔이 보라색이 있었고, 대장균이 10,000개 이상인 경우에 용액 색깔이 적색을 띄었다.

결국, 단일가닥핵산 압타머와 표적생체분자인 대장균의 복합체가 형성될 경우에 표적생체분자의 양에 따라 표적생체분자와 미결합된 단일가닥핵산의 안정/불안정 구조체의 비율이 변하게 되고, 이에 따라서 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체에 의한 용액 색깔이 상이하게 나타나게 되므로, 이로부터 표적생체분자(예, 대장균)의 양(수)을 결정할 수 있게 되는 것이다.

즉, 용액의 색깔변화 존재 및 밀도는 표적생체분자(대장균)와 단일가닥핵산 압타머 간의 선택성, 특이성 및 결합력에 따라 결정되며, 이로부터 표적생체분자를 동정하고 그 양을 결정할 수 있으므로, 색깔변화 존재 및 밀도를 분석하여 분석 대성이 되는 생체분자의 종류와 정량적인 변화를 확인할 수 있게 되는 것이다.

실시예3: 단일가닥핵산 압타머를 이용한 표적생체분자(단백질)의 분석

본 실시예에서는 표적생체분자로서 단백질 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)를 사용하였으며, 이에 대한 결합력이 높은 단일가닥핵산리간드의 서열은 5'-ACC CUG AUG GUA GAC GCC GGG GUG-3'이다(미국특허 5,811,533 참조)(서열번호 4). 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 단일가닥핵산 압타머는 실시예 2와 동일하게 준비하였다.

시료인 VEGF 단백질(R & D Systems사, Minneapolis Minn.)에 멸균증류수를 이용하여 1ug/mL 농도인 표준용액을 준비하였으며 희석방법으로 사용할 시료를 만들었다. 상기 방법으로 제작된 100 ~ 400 ng의 RNA 단일가닥핵산 압타머와 30분간 반응시킨 후, 바로 100 ul ~ 500 ul의 0.01% 금 나노입자(Sigma-Aldrich, USA)를 첨가하여 얻은 용액에 금 나노입자를 첨가하여 10분간 반응시켰다. 상기 반응용액에 100 ~ 350 ul의 1N NaCl를 첨가하여 용액의 색깔을 관찰하였다. 색깔의 변화정도를 스펙트로미터에서 520nm 및 700nm의 두 파장에서 흡광도를 측정하여 두 값의 비율을 신호 값으로 정하여 커브를 작성하였다.

도3에 도시된 바와 같이, 250 ng 단일가닥핵산 압타머를 첨가한 경우, VEGF 단백질의 양적 변화에 따른 색깔의 변화(즉 흡광도의 변화)는 도3a 내지 도 3d와 같으며, 이로부터 선정된 단일가닥핵산 압타머와 표적단백질의 특이적인 결합 및 양적인 변화에 따른 색깔의 변화 즉, 흡광도의 변화가 있음을 관찰할 수 있었다.

상기의 결과로부터 얻은 신호값(signal ratio: 520 nm 흡광도/700 nm 흡광도)은 VEGF 단백질이 1 ng/mL의 경우는 0.15이고, 20 ng/mL의 경우는 0.20이고, 30 ng/mL의 경우는 0.4이고, 50 ng/mL의 경우는 1.2이고, 100 ng/mL의 경우는 2.1이 며, 500 ng/mL의 경우는 3.2 이며, 이를 그래프로 작성하면 도4와 같다.

즉, 표적생체분자로서 대장균을 사용한 실시예2와 마찬가지로 표적생체분자로서 단백질을 사용할 경우에도 단일가닥핵산 압타머와 VEGF 단백질의 복합체가 형성되어 미결합 압타머의 구조체 비율이 변하게 되고, 이에 따라서 용액 색깔 및 흡광도의 변화가 있게 되며, 이런 변화는 VEGF 단백질의 양과 상관관계를 가지게 되므로, 단일가닥핵산 압타머와 단백질간의 특이적 결합과 흡광도 변화(변색)로부터 단백질(예, VEGF)을 동정하고 정량할 수 있게 되는 것이다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 생체분자 분석방법에 의하면, 분석대상이 되는 표적생체분자와 단일가닥핵산 압타머 사이의 특이적 결합에 의한 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체의 형성, 상기 표적생체분자와의 복합체를 형성하지 아니하고 남아 있는 상기 단일가닥핵산과 상기 금-나노입자의 반응에 의한 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체의 형성, 및 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하고 있는 상기 금-나노입자의 분산 상태에 기초한 염에 의한 반응 수용액의 색상변화분석을 통해 상기 표적생체분자를 신속하고 안전하게 동정하고 정량할 수 있게 된다.

또한 본 발명에 따른 분석방법에 의하면, 동정과 정량이 흔하게 실행되는 미생물, 세포 및 단백질을 포함하는 각종 생체분자들에 대하여 이들과 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머들을 확보하고, 본 발명의 분석방법을 통해 이들 단일가닥핵산 압타머, 생체분자 및 금-나노입자의 다양한 량에 대응하는 색상변화의 표준 데이터를 마련해 두면, 미지의 생체분자(표적생체분자)에 대한 본 발명의 분석 방법의 결과를 상기 표준 데이터와 대비하여 분석하는 것으로써 각종 미지의 생체분자를 동정 및 정량할 수 있게 되며, 이런 본 발명의 분석방법은 분석키트로 마련하여 보급할 수 있을 것이며, 이를 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 사용되는 생체분자의 동정이나 정량에 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

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Claims (2)

1. 분석대상이 되는 핵산을 제외한 표적생체분자와 기지의 단일가닥핵산 압타머를 수용액에 첨가하여 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산 사이의 특이적 결합에 의한 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 형성시키는 단계;

   상기 수용액에 금-나노입자를 첨가하여 상기 표적생체분자와 복합체를 형성하지 아니하고 남아 있는 상기 단일가닥핵산과 상기 금-나노입자를 반응시켜 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성시키는 단계; 및

   상기 수용액에 염을 첨가하여 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성하고 있는 상기 금-나노입자의 분산 상태에 기초한 상기 수용액의 색상변화를 분석하는 단계; 를 포함하고:

   이로써 상기 표적생체분자와 상기 단일가닥핵산의 특이적 결합으로부터 상기 표적생체분자를 동정하고 상기 반응용액의 색상변화로부터 상기 표적생체분자를 정량하는 것을 특징으로 하는, 단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자 분석방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단일가닥핵산/금-나노입자 복합체를 형성시키기에 앞서 형성되어 있는 상기 표적생체분자/단일가닥핵산 복합체를 제거하는 것을 특징으로 하는, 단일가닥핵산 압타머와 금-나노입자를 이용한 생체분자 분석방법.

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