KR100670799B1 - 단일가닥핵산의 이중기능을 이용한 특정물질의 동정 및분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일가닥핵산을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 캡쳐프로브들을 고체 기판 위에 고착시켜 어레이를 제작하고, 분석시약의 처리에 의해 특정물질-타겟프로브 복합체를 제조한 후, 상기 특정물질-타겟프로브 복합체를 친화력에 따라 세척하여 분리하고, 혼성화용액을 첨가하여 타겟프로브를 해리시킨 후, 캡쳐프로브와 표지된 타겟프로브를 반응시킨 다음, 상기 타겟프로브에 표지된 물질을 탐색하는 단계로 구성된 단일가닥핵산 어레이를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정물질-타켓프로브 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도가 결정되며 이로부터 특정물질을 동정하고 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다. 따라서, 본 발명은 단일가닥핵산 어레이 및 타겟프로브를 이용하여 시료에서 동시에 여러 종류의 특정물질에 대한 탐색 및 분석할 수 있는 매우 유용한 방법을 제공한다.

단일핵산가닥, 어레이, 동정, 정량, 분석방법

Description

단일가닥핵산의 이중기능을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법{Method for identification and analysis of certain molecules using the dual function of single strand nucleic acid}

도 1 은 압타머인 단일가닥핵산이 셀렉스 선택버퍼에서는 특정물질과 복합체를 형성하거나 핵산혼성화용액에서는 상보적인 단일가닥핵산과 이중가닥핵산을 형성하는 이중기능에 대한 도이고,

도 2 은 단일가닥핵산을 이용하여 제작된 어레이의 도면이며,

도 3 는 어레이에 부착된 단일가닥핵산의 형상의 도면이고,

도 4 a는 압타머프로브 방법으로 시료를 분석하는 순서에 대한 도이며,

도 4 b는 안티압타머프로브 방법으로 시료를 분석하는 순서에 대한 도이고,

도 5 는 어레이의 스팟(spot)을 분석하는 레이저형광유발시스템의 도면이며,

도 6 는 어레이의 스팟을 분석하는 타원편광분석 탐지 시스템(ellipsometric detection system)의 도면이고,

도 7 은 단일가닥핵산 어레이에 고정된 캡쳐프로브인 단일가닥핵산의 배열에 대한 도면이며,

도 8a 는 단일가닥핵산 어레이 및 단일가닥핵산으로 대장균 100 cfu 분석한 결과도이고,

도 8b 는 단일가닥핵산 어레이 및 단일가닥핵산으로 대장균 10,000 cfu 분석한 결과도이다.

본 발명은 특정물질의 동정 및 정량적 분석방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 압타머인 단일가닥핵산이 주어진 환경에서 특정물질과 복합체를 형성하거나, 또는 상보적인 단일가닥핵산과 이중가닥핵산을 형성하는 이중기능을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량적인 변화에 대한 탐색 및 분석하는 단순하고 새로운 방법에 관한 것이다.

특정물질의 동정 및 정량적인 변화에 대한 탐색 및 분석하는 기술은 물리학 및 생화학의 발달로 많이 개발되었으나 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다. 특정물질을 분석하는 방법은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 전 과정의 한 부분이며 이런 방법은 미생물 및 바이러스 동정, 세포, 단백질, 유기물질 분석 등에 유용하게 사용할 수 있어 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.

핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체이며 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)이다. 핵산은 단일가닥 혹은 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다. 일반적으로 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소적 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.

핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥 핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들을 선별되고 있다. 특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법은 셀렉스 (SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 선별된 산물인 핵산을 압타머(aptamer)라 하며(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990), SELEX를 통하여 자연상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다. 이와 같이 선별된 단일가닥핵산을 바탕으로 특정물질을 동정 및 분석하는 기술은 분자적 비콘(molecular beacon, Li JJ et al.; Biochem Biophys Res Commun., 292(1), pp31-40, 2002), 열량측정법(calorimetric method, Stojanovic MN, Landry DW.; J. AM. CHEM. SOC., 124, pp9678-9679, 2002), 전기화학형광법 및 효소법(Electrochemiluminescence and enzymatic method, Bruno JG, Kiel JL.; Biotechniques; 32(1), pp178-80, pp182-3, 2002) 등을 이용하여 개발되고 있으나, 어레이 방식에 기초하여 특정물질을 동정 및 분석하는 기술이 구체적으로 보고된 바는 없다.

특정물질의 동정 및 분석은 물리, 화학적인 성질을 이용하여 많이 수행되고 있으며 물질상호간의 특이성 및 친화력을 이용한 분석은 통상적으로 면역학적인 방법을 바탕으로 개발된 방법으로 수행되고 있다. 면역학적인 방법은 항원-항체 반응에 따라 항체가 시료에 있는 특정한 항원과 결합하여 복합체를 형성하며 이 때 표지된 이차 항체를 사용하여 항원-항체 복합체를 분석하는 기법이다. 예를 들면, ELISA는 일차 항체를 고체매질에 고정하며 항원이 있는 시료와 반응시킨 후, 이 복합체를 인지하는 표지된 이차 항체를 처리하여 특정항원에 대한 분석하는 방법이다. 표지된 이차 항체가 고체매질에 고정된 일차항체-항원 복합체를 인지하여 결합하면 표지체가 고체매질에 결합하게 된다. ELISA에 사용하는 프로브는 형광지시약, 디옥시제닌(dioxygenin), 호올스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 알 칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등으로 표지한다.

최근에는 단백질을 대량 고속으로 분석하기 위해 단백질칩(Protein chip)이 개발되어 사용되고 있다. 단백질칩은 항체의 배열 상태를 알고 있기 때문에 특정물질의 구분 및 정량에 대한 탐색 및 분석이 가능하다. 단백질칩의 제작 방법은 항체를 마이크로어레이어(Microarrayer)를 이용하여 스팟팅(spotting)하여 고정하는 방법이 있다. 단백질칩 감지기술은 단백질칩이 하나의 칩으로 가능한 많은 정보를 제공하기 위해 좁은 면적에 고밀도로 여러 항체들이 집적되어 있는 상태에서 발생하는 매우 약한 신호를 감지할 수 있어야 한다. 또한 단백질에 대한 생체정보가 늘어남에 따라 그 집적도가 더욱 높아질 추세로 발달하고 있어 이를 정량적으로 빠르고 정확하게 검출하는 새로운 방법이 요구되고 있다. 현재까지 검출방법은 주로 레이저 유발 형광법(laser induced fluorescence)이 많이 쓰이고 있으며 전기화학적 검출 방법 등이 개발되고 있다. 상기와 같이 다양한 과정을 통해 단백질칩을 이용한 특정 단백질의 구분 및 정량에 대한 탐색 및 분석하는 방법들이 개발되어 있지만 고가의 기기 및 시약을 사용하고 있으며 복잡한 과정을 수행해야 하는 등의 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 압타머인 타겟프로브와 시료를 반응 및 세척과정을 수행하고 특정물질-타겟프로브 복합체를 단일가닥핵산이 부착된 유리 슬라이드에서 반응 및 세척과정을 수행한 후, 레이저 유발 형광법으로 특정물질 동정 및 정량적인 변화를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 압타머인 단일가닥핵산이 주어진 환경에서 특정물질과 복합체를 형성하거나, 또는 상보적인 단일가닥핵산과 이중가닥핵산을 형성하는 이중기능을 이용하여 특정물질의 동정 및 정량적인 변화를 확인함에 따라 이들 이용하여 미생물, 세포, 단백질을 포함한 다양한 생체분자에 대한 탐색 및 분석하는 시스템을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 반응기(X)-스페이서 부위(R)-타겟프로브 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 캡쳐프로브들을 고체 기판 위에 고착시켜 어레이를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 타겟프로브를 반응시켜 특정물질-타겟프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-타겟프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체에 혼성화용액을 첨가하고 95℃에서 5분간 처리하여 타겟프로브를 해리시키는 제 4단계; (ⅴ) 캡쳐프로브와 표지된 타겟프로브를 반응시키는 제 5 단계; 및 (ⅵ) 상기 타겟프로브에 표지된 물질을 탐색하는 제 6단계로 구성된 단일가닥핵산 어레이를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다.

상기 특정물질은 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 가능하다.

또한, 본 발명은 대장균에 대한 압타머인 단일가닥핵산의 염기서열에서 기초한 단일가닥핵산인 캡쳐프로브로 제작된 어레이, 타겟프로브와 대장균의 결합반응시 사용되는, 단일가닥핵산 또는 0.2% BSA이 포함된 분석시약, 혼성화용액, Cy-5가 부착된 5'-프라이머, 3'-프라이머를 포함하는 대장균 동정 및 정량분석을 위한 분석키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 (ⅰ) 반응기(X)-스페이서 부위(R)-타겟프로브 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 캡쳐프로브들을 고체 기판 위에 고착시켜 어레이를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 타겟프로브를 반응시켜 특정물질-타겟프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-타겟프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체에 혼성화용액을 첨가하고 95℃에서 5분간 처리하여 타겟프로브를 해리시키는 제 4단계 (ⅴ) 캡쳐프로브와 표지된 타겟프로브를 반응시키는 제 5 단계; 및 (ⅵ) 상기 타겟프로브에 표지된 물질을 탐색하는 제 6단계로 구성된 단일가닥핵산 어레이를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법을 제공한다. 본 발명은 도 1에 도식한 바와 같이, 압타머인 단일가닥핵산이 셀렉스 선택버퍼에서 특정물질과 복합체를 형성하거나, 또는 핵산 혼성화용액에서 상보적인 단일가닥핵산과 이중가닥핵산을 형성하는 이중기능을 이용하는 특정물질의 동정 및 정략적인 분석방법이다.

본 발명의 제 1단계는 단일가닥핵산인 캡쳐프로브들이 부착된 어레이를 제작하는 단계이다. 구체적으로, 본 발명은 단일가닥핵산 어레이에 고정할 캡쳐 프로브(capture probe)로, 반응기(X)-스페이서 부위(R)-타겟프로브 인식부위(V)인 세 부분으로 구성되는 단일가닥핵산을 제공한다.

캡쳐프로브는 혼성화 정도에 매우 커다란 영향을 미치는 요소로 이의 염기서열구성의 결정은 매우 중요한 단계이다. 어레이를 구성하는 각각의 프로브는 특징적인 염기로 구성되어 이의 결합체들은 적절한 Tm 값을 유지해야 한다. 이에 따라 결합체의 혼성화정도는 형광이 표지된 다른 타켓프로브에 의해 오염되지 않은 자신의 시그날 값을 유지할 수 있도록 해야 한다.

상기 타겟프로브 인식부위(V)는 SELEX에 의해 선별된 단일가닥핵산의 염기서열을 기초하며 바람직하게는, 특정물질을 인식하는 부위를 포함하는 타겟프로브에 상보적인 단일가닥핵산이고, 50 내지 100bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산으로, 본 발명에서 SELEX 표준방법(Bock LC et al.; Nature, 355(6360), pp564-6, 1992)으로 선택된 단일가닥핵산인 압타머(aptamer)들 중 본 발명자들에 의해 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 분리하여 분석한 염기서열을 포함한다(대한민국 특허출원번호 제 2002-0064027호).

스페이서(spacer) 부위(R)의 염기서열은 기본적으로 확인하고자 하는 특정물질에 대해 각 하나씩의 염기서열을 디자인하거나 공동적으로 사용할 수 있다. 실제 스페이서의 설계에서 고려해야 할 점은 서열의 길이, 염기 조성(base composition), 비상보적 염기서열의 포함 여부, 및 자가-상보성(self- conplementarity) 등이다. 상기 스페이서 부위는 기판 표면에 부착할 때 발생하는 문제를 고려한 부위이며, 스페이서로는 10 내지 30bp의 염기서열을 갖는 단일가닥핵산 및 5 내지 20 아미노산서열을 갖는 펩티드를 포함하고, 본 발명의 바람직한 실시예로 서열번호 1의 염기서열을 제공한다.

또한, 상기 반응기(X) 부분은 어레이의 기판에 단일가닥핵산을 부착시키는 반응기가 결합된 부위이며, 반응기는 아민(amine)기, 티올(-SH)기, 비오틴(biotin) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 단일가닥핵산 캡쳐 프로브는 핵산의 5'을 아민기로 변형시킨 5'-프라이머(서열번호 1), 서열번호 3 내지 26의 단일가닥핵산염기서열 및 3'-프라이머(서열번호 2)로 구성된 단일가닥핵산이며, 이는 SELEX 표준방법으로 선택된 단일가닥핵산들 중 대장균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산을 분리한 후, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머로 PCR을 반복적으로 수행함으로써 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 단일가닥핵산 어레이의 제작에 사용되는 기판은 유리, 실리콘 등의 무기물이나 아크릴계나 PET(polyethylene terephtalate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene) 등의 고분자 물질로 제작된 것을 포함하며, 바람직하게는 유리로 제작된 슬라이드 글라스이다. 이때, 기판은 알데히드 또는 폴리 L-리신(lysine) 등으로 코팅된 것을 사용한다.

더욱 상세하게는, 유리 슬라이드 표면에 고정시킬 단일가닥핵산(capture probe)은 SELEX 표준 방법으로 선정된 단일가닥핵산이 클로닝된 플라스미드를 주형으로, 5'-프라이머 및 5'쪽을 아민기로 변형된 3'-프라이머로 PCR를 수행하여 준비한다. PCR 산물 정제 키트로 비결합된 프라이머를 제거하고, 슬라이드에 고정시킬 캡쳐 프로브인 핵산을 준비한다. 유리 슬라이드는 알데히드로 도말된 슬라이드를 사용하여 도 6과 같이 단일가닥핵산이 배열된 어레이를 제작한다. 어레이의 제작은 핀(pin) 방식인 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system, GenPak사)을 사용하고, 스팟 간격(spot spacing)은 스팟 중심 사이(center-to-center)가 350 내지 400㎛가 되도록 한다. 각각의 단일가닥핵산을 3×SSC 완충액에 녹여 농도를 조절하고, 이때 어레이어 안의 습도는 70 내지 80%으로 유지하여 스팟팅(spotting)을 수행한다. 스팟팅된 슬라이드들은 습도유지챔머(humidified chamber)에서 방치한 후, 80℃에서 2 내지 4시간 방치하여 굽는(baking)과정을 수행한다. 당업계에 공지된 방법으로 단일가닥핵산을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심 분리하여 건조시킨 다음, 사용 전까지 빛이 차단된 상태로 보관을 한다.

기존에 공지된 다양한 방법(M. schena; DNA microarray; a practical approach, Oxford, 1999)으로 단일가닥핵산이 배열된 어레이(도 1)를 제작할 수 있으며 단일가닥핵산이 어레이 부착된 형상은 도 2와 같다.

본 발명의 제 2단계는 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 타겟프로브를 반응시켜 특정물질-타겟프로브 복합체를 제조하는 단계이다. 이때, 타겟프로브는 특정물질과 결합하는 압타머인 단일가닥핵산으로 표지를 하여 준비되는 경우와 압타 머인 단일가닥핵산의 염기서열에 상보적인 단일가닥핵산을 표지하여 준비하는 경우가 있으며, 탐색단계에서 신호를 원활히 인지할 수 있는 여러 종류의 표지물질을 사용할 수 있다. 전자의 경우, 타겟프로브는 SELEX를 통해 선별된 단일가닥핵산 또는 타겟 물질과 특이적 결합을 할 수 있는 구조를 보유한 단일가닥핵산이고, 이를 위해 핵산의 이차구조를 모델링하는 MFOLD 프로그램을 사용하여 이차구조 및 구조체 자유에너지를 확인한 후, 가장 안정도가 높은 이차구조를 갖는 단일가닥핵산을 선정한다.

상기 타겟프로브의 표지물질로는 방사성 동위원소, 플로레신(Fluorescein), Cy3 또는 Cy5 등과 같은 형광물질 또는 바이오틴 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 형광물질을 사용한다. 상기 특정물질은 세균(bacteria), 진균류(fungi), 바이러스(virus), 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로, 상기 세포주 및 조직은 원핵생물 또는 진핵생물에서 유래한 것을 포함하며, 진핵생물은 인간, 동물, 식물을 의미한다.

반응단계의 구체적인 내용은 타겟프로브가 특정물질과 결합하는 압타머인 단일가닥핵산으로 표지를 하여 준비되는 경우 분석하는 순서는 도 4a이고 압타머인 단일가닥핵산의 염기서열에 상보적인 단일가닥핵산을 표지하여 준비하는 경우 분석하는 순서는 도 4b이며, 전자를 압타머프로브(aptamer probe) 방법, 후자를 안티압타머프로브(antiaptamer probe) 방법이라고 명명하였다.

이때, 압타머프로브 방법은 특정물질과 표지된 압타머인 타겟프로브 간의 반 응이며, 안티압타머프로브 방법은 특정물질과 미표지된 압타머산의 반응으로, 반응용액은 단일가닥핵산이 특정물질과 잘 결합할 수 있는 염의 조성, 비특이적 결합을 방지하는 요소 등으로 구성된다.

상기 분석시약으로 이의 구성요소는 (ⅰ) pH에 대한 완충작용을 위한 20 내지 100 mM, 바람직하게는 50 mM의 트리스·염산(pH 7.4), (ⅱ) 단일가닥핵산의 이차구조안정화에 관련된 물질로 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘을 각각 0 내지 200mM로 함유하며, 바람직하게는 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘를 함유하고, (ⅲ) 0.05 내지 0.2%의 소듐 아지드를 함유하며, 바람직하게는 0.1% 소듐 아지드를 함유하고, (ⅳ) 비특이적 결합 저해용으로 0.1 내지 0.3%, 바람직하게는 0.2%의 우혈청알부민 또는 비특이적인 결합을 저해하는 핵산으로 이는 프로브의 특이성을 고려하여 결정된 핵산이다. 상기 분석시약은 앞서 언급된 기본적인 4가지 구성요소 중 세가지 이상을 포함하여 이루어진 시약이다. 반응온도는 SELEX 수행온도보다 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는 20 내지 37℃의 온도에서 반응을 수행한다. 보편적으로 단백질 및 단일가닥 핵산을 과량으로 처리하여 타겟 프로브의 비특이적인 결합을 방지하며, 바람직하게는 타겟 프로브의 효모 tRNA(yeast tRNA), 살몬스펌 DNA(salmon sperm DNA) 또는 인간 태반 DNA(human placental DNA)를 사용할 수 있다.

본 발명의 제 3단계는 특정물질-타겟프로브 복합체에서 친화력이 낮은 타겟프로브를 제거하는 단계로 상기에서 제조된 특정물질-타겟프로브 복합체를 세척 및 분리하는 단계이다. 이는 막 여과법, 흡착법 혹은 원심 분리법 등으로 분리할 수 있다. 상기 제2단계에서 사용한 특정물질 시료가 미생물 및 세포인 경우는, 타겟 프로브 용액을 시료가 포함된 선택버퍼에 혼합하여 실온 혹은 37℃에서 30분간 반응한 후, 바로 원심분리법 혹은 0.42 ㎛ 막을 이용한 여과방법으로 복합체를 다양한 농도의 셀렉스버퍼, 증류수 혹은 0.05M EDTA 등으로 세척하여 비결합 타겟 프로브 및 결합력에 따라 타겟 프로브를 제거하여 2차 반응에 사용할 수도 있다. 이때, 세척버퍼는 0.01 내지 1 x 셀렉스 버퍼 또는 1 내지 500 mM EDTA 용액인 것이 바람직하다. 그러나, 특정물질 시료가 단백질인 경우는 단일가닥핵산과 단백질 복합체 및 비결합 단일가닥핵산을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오즈막 필터를 이용한 여과방법, 단백질을 표지하는 방법 혹은 단백질시료를 ELISA 플레이트에 흡착시켜 수행하는 흡착법 등으로 분리할 수도 있다.

본 발명의 4단계는 분리된 특정물질-타겟프로브 복합체에 혼성화용액을 첨가하고 95℃에서 5분간 가열하여 복합체를 특정물질 및 타겟프로브로 해리하는 단계이다.

압타머프로브 방법은 해리된 특정물질-타겟프로브 복합체를 제 5단계에 사용하며, 안티압타머프로브 방법은 상기 원리분리방법으로 분리된 상징액에 압타머인 단일가닥핵산에 상보적인 단일가닥핵산을 표지하여 첨가하고 1 내지 30분간 반응시킨 후, 반응물을 제 5단계에 사용한다. 제 5단계 반응은 단일가닥핵산인 캡쳐 프로브가 부착된 어레이를 혼성화용액에서 전혼성화시킨 다음, 어레이에 제 4단계 반응산물을 처리하여 반응시킨 후, 세척 및 건조하는 단계이다.

본 발명의 제 5단계는 캡쳐프로브와 표지된 타겟프로브를 반응시키는 단계이다. 본 단계에서 가장 중요한 것은 혼성화율과 혼성화물의 안정성이다. 이들에 영향을 주는 외부적인 요인으로는 온도, 이온강도(ionic strength), 포름아미드(formamide)와 기타 폴리머 등이 있으며, 내재적인 요인은 DNA의 길이와 서열 복잡성(sequence complexity), 및 혼합된 상태의 혼성화(mixed phase hybridization)라면 고정되어 있는 DNA의 환경 등이다.

본 발명의 단일가닥핵산이 부착된 어레이를 이용한 생체분자에 대한 동정 및 정량적 분석에 있어서, 단일가닥핵산인 캡쳐 프로브와 타겟 프로브간의 특이적 결합을 위한 핵산 혼성화 용액을 제공한다. 이때, 혼성화 용액은 (ⅰ) 0.5 내지 1.5 M 염화나트륨, (ⅱ) 0.1 내지 1.0 M의 sodium citrate, (ⅲ) 비특이적인 결합을 저해하는 물질인 0.1 내지 0.3%의 우혈청알부민, 0.1 내지 1.0% SDS, 0.1 내지 10 배의 덴하르트 용액(Denhart solution) 또는 0.1 내지 1% 비지방 건조 우유(nonfat dried milk), (ⅳ) 비특이적인 결합을 저해하는 핵산, (v) 30 내지 60 % (v/v) 포름아미드를 포함한다. 바람직하게는, 1 M 염화나트륨, 0.3 M sodium citrate, 0.5% SDS 또는 100ug/ml salmon sperm DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산을 포함한다. 혼성화(Hybridization)가 완료된 후에 어레이를 0.01X SSC, 0.2% SDS 등으로 22 ~ 70 ℃상온에서 30분간 세척하고 다시 증류수로 30초간 세척한후 암조건 하에서 건조한다. 세척 조건의 최적화시에는 첫 번째 세척용액이 가장 중요하므로 이 단계에서 여러 가지 세척액을 사용하여 강도(stringency)를 조절한다. 세척용액의 조성을 예로 들면, 1X SSC + 0.2% SDS, 1X SSC + 0.2% SDS, 0.5X SSC + 0.2% SDS, 0.01X SSC + 0.2% SDS 등이 있다.

특정물질-타겟프로브 복합체 혹은 타겟프로브- 캡쳐 프로브 이중구조체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도가 결정되며 이로부터 특정물질을 동정하여 정량할 수 있다. 압타머인 단일가닥핵산과 특정물질의 특이성 및 결합력은 복합체의 결합정도를 변화시키고 특정물질-단일가닥핵산 복합체의 종류와 양을 결정한다. 어레이상에서 복합체에서 해리되는 단일가닥핵산 즉 타겟프로브는 타겟프로브-캡쳐프로브 이중구조체의 종류 및 양에 영향을 주며 형성된 이중구조체에서 발생하는 형광정도를 결정한다. 따라서 형광정도를 분석하여 특정물질의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.

본 발명의 제 6단계는 타겟 프로브에 표지된 물질을 탐색하는 단계로서, 타겟 프로브에 표지하는 물질의 종류에 따라 도 5 및 도 6 등 같은 다양한 방법을 선택할 수 있다. 도 5는 어레이(7)을 플레이트(6)에 올려 놓은 후, 램프 11에서 조사되는 빛이 여기필터(excitation filter)(10)를 통하여 분광기(9)에 도달한다. 빛은 렌즈(8)를 통해서 어레이(7)에 조사된다. 어레이(7)에서 나오는 형광은 렌즈( 8)을 통해서 분광기(9)에 모인 후, 방출필터(emission filter)(12)를 통하여 CCD카메라(13)에 도달한다. 이 카메라는 CPU(14)에 연결되어 VCR(15)과 모니터(16 )에 이미지를 형성시켜 특정물질을 분석할 수 있다. 도 6는 타원편광분석법(ellipsometry) 에 기초한 측정방법으로, 엘립소메트리는 반사되는 빛의 파장에 대한 편광 변화를 측정하는 방법이다. 스팟(spot)내의 캡쳐 프로브들과 특정물질의 결합으로 스팟 부위의 밀도가 증가하여 표면에서 반사되는 표면-편광 라이트 빔(plane-polarized light beam)의 편광이 변화되며, 이를 용액 내에서 바로 모니터링하는 것이 가능하다. 전형적인 방법은 헬륨-네온 레이져(He-Ne laser)(17)에서 조사되는 단색 빛은 편광자(polarizer)(18)에 의해 표면-편광(plane polarized)으로 전환되어 시료의 표면에 조사된 후, 검출기(detector)(21)에 도달된다. 보상기(Compensator)(19)는 타원형으로 편광된 굴절빔(elliptically polarized reflected beam)을 표면편광으로 전환시킨다. 분석기(analyzer)(29)에 의해 상응하는 각도가 측정되어, 타원편광분석 파라메터(ellipsometric parameter)인 프사이(Psi)와 델타(Delta)가 계산되며, 이로부터 캡쳐 프로브에 결합된 특정물질을 확인할 수 있다(Azzam et al., Ellipsometry and Polarized Light, North-Holland Publishing Company: Amsterdam, 1977).

또한, 본 발명은 대장균에 대한 특이적 결합 염기서열을 포함하는 캡쳐프로브로 제작된 단일가닥핵산 어레이, 타겟프로브와 대장균의 결합반응시 사용되는, 단일가닥핵산 또는 0.2% BSA이 포함된 분석시약, 타겟프로브와 캡쳐프로브간의 결합반응시 사용되는 혼성화용액, 5'-프라이머, Cy-5가 부착된 3'-프라이머를 포함하는 대장균 동정 및 정량분석을 위한 분석키트를 제공한다.

본 발명은 단일가닥핵산이 부착된 어레이를 이용하여 시료에서 미생물, 세포 및 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석하는 시스템을 제공한다.

상기 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석하는 시스템은 본 발명의 단일가닥핵산이 고정된 어레이, 분석시약, 표지물질을 탐색하는 방법으로 구성된다. 상기 생체분자는 세균 및 바이러스와 같은 미생물, 세포주, 이로부터 분리된 단백질 또는 효소 등을 포함한다.

상기 단일가닥핵산이 고정된 어레이는 반응기-스페이서 부위-타겟프로브 인식부위로 구성된 본 발명의 단일가닥핵산(capture probe)이 슬라이드 글라스 위에 고착된 어레이를 의미하며, 상기 관련 시약은 상기 선택버퍼, 0.2% 우혈청알부민(BSA)을 함유한 선택버퍼 또는 단일핵산가닥을 함유한 분석시약을 포함하며, 신호물질을 탐색하는 방법은 레이저유발 형광법 또는 타원편광분석탐지법을 사용할 수 있고 확보된 자료를 다양한 생물정보학적인 방법으로 분석하여 이용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예로 레이저유발 형광법을 의미하며, 상기 동정 및 분석하는 시스템을 사용하여 생체 분자를 분석할 수 있다.

이하, 실시예와 첨부도면을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

실시예 1. 단일가닥핵산의 선정 및 단일가닥 핵산 어레이의 제작

단일가닥핵산의 선정은 본 발명자들에 의해 선출원된 특허출원 제10-2002- 0064027호에 기재된 방법과 동일하게 실시하였으며, 하기 표 1 및 표 2의 단일가닥 핵산을 분리하였다.

구분	단일가닥핵산(ata cca gct tat tca att(N60)aga tag taa gtg caa tct)의 N60의 염기서열
E1	CTT TCT TAC TCG GAT GAT CCT CTT GTG GTC GTC ATA GTC GTT GAA TAC GCT ATT GGG TTG
E2	GGT GTG GCA AGG GGT AAC GGT GCG GGA ACG CTA TTC TCG TGT GAT GGT GTA GCC TTG GAA
E3	AGT TCG ATG AGG GTG ACA CCG CCA GGA GTG TTT GCT AGA CTT GAG GAA AGG GGC CCG GTG
E4	ACC CGT CGA TAA TGA CTG AAC TTC CTC TAT CTT AAA GGG GGT GCG CTT GTT GGG AAG GAG
E5	GGG TAA GGG GAT GTT TCT GGG ATT CAA GCG CCT GAT TCT GAG GTG GGC CTC CGC TAC GAG
E6	TCT GTA TTT GTA CGC ACC GAA GAT AAG AGA GGG AGT GGA TGG GCT GAA ATG GAG GAC AGG
E7	CAT GGG CGG GCC GCG GTC TAT TCG GGA TTA TTG CGG ATC CAA GCG TTT TTG GTG TAT GAG
E8	TCA GGG TGT GAA GTT CTT CCG CGC TAG TGG CTT GTA TGT TAT GGA TAA TAC CGC CTC ATG
E9	GTC GGG GTT GCA AGG CGT CGT AGC GTG TAT TTG TGA TGG TGA GGA GGT GAA AGG CTG TGA
E10	GCG TAT GGG CGG GTC ATT AGG ACA ATT TAA CCA CTC GCG AAA GGG GGC AGC TTG AGT TGG
E11	ATT GTC TGT GTG ACT AGT CGG TCT AGT GTG GGG GAG AAG AGT AAA CAA TCG GCG GTG AAG
E12	TTA CCA CTG AGT TAA TTT GTA CGG TCT GCG GTG TAC TTT AAG TAT GAA GGG GAC TAC ACA
E13	GCT ATC AAT ATT ATA GAG GCG GTC GGG GTA GTG TCA TCG TGG ATA TTT TTT ATG GGC GGG
E14	TAG GAG AGC GGG AGC TGA GAA CTT AGA GGC GCC GAT ACA CGA GGA CGG ATT TCT CAA TGG
E15	GAC GTA TTA CAG TTA AGT TGG CGC CAT TCG ATT TCT GAT CAC CGG CCG GCA TCA GAG GGG
E16	ATA CCA GCT TAT TCA ATT ATA CCA GCT TAT TCA ATT TTG TGG GTG GAT TGG TTG GTG TAG
E17	CCG TAA GTC CGG TCT TCC TTG CTG AGT CGC CCT TTC AGG TGC CCA AGC TAC GTG CTG AGA
E18	TTG GTG GGG AGG GCC AGT TAG GTC TAA TTT CCG ACG CGC AAG AAT GTC TAC TCA GGT CCG

구분	단일가닥핵산(ata cca gct tat tca att(N60)aga tag taa gtg caa tct)의 N60의 염기서열
N1	GTC TAC AAA GGC GAG ACA TGT GCT GTA AAC GTT TTT GTA ATA AGA GTC CGC GTT AAT CCG
N2	CTG CTA CGC GAG GCG GGT AAA TTC GGT GGG CTA GAG GCG AGC GAC ATA GTA GTG TAG GGA
N3	TAT TTG TAG GGG GCT ACT GGT TAA CGT AAT TGG TCT TTA AGG AGG TTT AGT CGG TGG GTG
N4	TAT AAA GGC GGG GTG CAT AGT TGG GAC GGG AGA ATC TTT GGG GCG ATG TTT TTG GGT GCG
N5	TCC GGG AGA CGG GTG GTG CGT GTG CCT TTC GAT AGT TAA CGG GGA TGA CCA AAT GCA TAG
N6	TCG CAG TTG TGG CTA ATG GGT GAG AGG GAG TGA GTG TTC TAT AAA TAA TTC GAA AAG TCC

실시예 2. 단일가닥핵산 어레이의 제작

유리 슬라이드 표면에 고정시킬 단일가닥핵산(capture probe)은 선정된 단일가닥핵산이 클로닝된 플라스미드를 주형(template)으로 하여 5'-프라이머 및 5'쪽을 아민기(amine group)로 변형시킨 3'-프라이머로 표준 PCR를 수행하여 준비하였다. 분리한 1 pg 플라스미드, PCR 반응 용액, 100 pM 5'-프라이머, 100 pM 3'-프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)에서 표준 PCR 방법으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 20 초 조건으로 30회 사이클을 반복 수행하여 이중가닥핵산을 합성하였다. PCR 산물 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen사)의 프로토콜에 준하여 비결합된 프라이머를 제거하고, 슬라이드에 고정시킬 캡쳐 프로브를 준비하였다. 유리 슬라이드는 알데히드로 도말된 슬라이드인 CSS (BMS사)를 사용하여 도 7과 같이 단일가닥핵산이 배열된 어레이를 제작하였다. 어레이의 제작은 핀(pin) 방식인 마이크로어레이어 시스템(Microarrayer system, GenPak사)을 사용하였고, 스팟 간격(spot spacing)은 스팟 중심 사이(center-to-center)가 370㎛가 되도록 하였다. 각각의 단일가닥핵산을 3×SSC 완충액에 녹여 농도를 조절하였다. 이때 어레이어 안의 습도는 70%로 유지하여 스팟팅(spotting)을 수행하였다. 스팟팅된 슬라이드들은 습도유지챔머(humidified chamber)에서 15분간 방치한 후, 80℃에서 2 내지 4시간 방치하여 굽는(baking)과정을 수행하였다. 공지된 방법으로 단일가닥핵산을 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 슬라이드를 바로 원심 분리하여 건조시킨 다음, 빛이 차단된 상태로 보관을 하였다.

실시예 3. 특정물질과 타겟프로브 복합체의 제조

타겟 프로브(Target probes)으로 사용된 단일가닥핵산은 SELEX로 선정된 단 일가닥핵산인 E1내지 E18 및 N1 내지 N6이 클로닝된 플라스미드를 주형으로 하여 5'쪽에 형광표지체인 Cy5(sulfoindocyanine)가 부착된 5'-프라이머(서열번호 1) 및 3'-프라이머(서열번호 2)를 사용하여 비대칭 PCR로 준비하였다. 분리한 1 pg 플라스미드, PCR 반응 용액[10 pM Cy5가 부착된 5'-프라이머, 1 pM 3'-프라이머, dNTP 혼합물(5mM dATP, 5mM CTP, 5mM dGTP, 5 mM dTTP)]에서 표준 비대칭 PCR 방법으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 20 초 조건으로 30 사이클 반복 수행하여 단일가닥핵산에 형광을 표지하였다. PCR 산물 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen사)의 프로토콜에 준하여서 비결합된 염기와 프라이머를 제거하였다.

특정물질 시료는 대장균을 희석하여 준비하였으며 표준방법에 따라 콜로니 형성단위(colony forming unit, cfu)를 측정하였다.

구체적으로, 정제된 타겟 프로브 용액과 시료가 포함된 150㎕ 선택버퍼(0.2% BSA 포함)를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응한 후, 대장균-타겟프로브 복합체를 원심분리 방법으로 선택버퍼 혹은 50 mM EDTA로 3회 세척하고 반응산물을 15,000xg, 5분간 원심 분리하여 수확하였다. 이에 혼성화 용액을 첨가하여 95℃에 5분간 가열한 다음 얼음에 처리하였다.

실시예 4. 복합체의 분리 및 캡쳐프로브와 타겟프로브의 반응

상기 실시예 2에서 준비된 단일가닥핵산이 부착된 유리 슬라이드에 혼성화용액를 처리하여 42℃에서 30분간 반응시켰다. 이때 혼성화 용액은 1 M 염화나트륨, 0.3 M sodium citrate, 0.5% SDS 또는 100㎍/㎖ 살몬스펌 DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산을 포함한다. 전혼성화가 끝난 유리 슬라이드에 실시예 3에서 준비된 용액을 처리하여 42℃에서 12시간동안 혼성화(Hybridization)를 수행한 후, 어레이를 세척용액으로 세척하였다. 이때, 세척용액의 조성은 예로 들면, 1X SSC + 0.2% SDS, 1X SSC + 0.2% SDS, 0.5X SSC + 0.2% SDS, 0.01X SSC + 0.2% SDS 순의 단계이며 각각 단계마다 42℃에서 30분간 수행하였다.

실시예 5. 탐색 및 분석

상기 실시예 4의 세척이 종료된 후, 유리 슬라이드를 원심분리로 건조한 후, 사용한 형광염료를 여기(excitation)하기 위한 적절한 파장의 레이저(Cy5, 635 nm)를 갖는 레이저 스캐너(laser scanner, GenePix4000, Axon사)를 이용하여 탐색하였다. 형광이미지는 다중-이미지-태그된 이미지 파일(multi-image-tagged image file, TIFF) 포맷으로 저장한 후, 적절한 화상분석(image analysis) 소프트웨어(GenePix Pro 3.0, Axon사)로 분석하였다(도 3). 스팟(spot)당 시그날 강도(signal intensity, 단위: quanta)는 주위배경의 기본 시그날을 뺀 것을 사용하는데, 여기서 배경 시그날은 특정 스팟의 주위에 있는 4개 스팟의 주변 시그날로 구성된 지역적 배경(local background)을 의미한다. 스팟이 가지고 있는 화소(pixel)의 90% 이상이 배경 시그날 + 2 표준편차(S.D.; standard deviation)를 초과하는 시그날 강도를 보일 때 데이타 분석에 포함시키며, 위 조건을 충족시키지 못하면 데이터에 포함시키지 않는 스팟(bad spot)으로 분류하고, 분석에 포함하지 않는 것이 일반적이다. 표지 효율(Labeling efficient)에 따른 편차(variation)는 내부표준(internal standard, IS)의 시그날을 이용하여 평준화(e.g., Normalized Intensity = Probe Intensity / IS intensity)하며, 단일표지(monolabeling)를 한 경우에는 Cy5 채널의 시그날 강도(signal intensity)로 그 결과를 기록하며 스팟팅(spotting)이 두 배 이상으로 된 경우는 평균값을 사용한다. 프로브의 시그날 강도 (signal intensity, S)는 스팟이 갖는 픽셀(pixel)들에 대해서 각각의 시그날 강도를 구한 다음 이들의 중심값(median)을 사용한다(median value of pixel-by-pixel). 시그날 강도(S)는 내부표준(IS)을 이용해서 표지효율에 따른 편차를 평준화한다.

S'(normalized value) = S (Cy5-reference) × (Cy5-IS).

이상의 방법으로 픽셀 밀도의 분석 결과와 실제 시료량 사이의 관계를 규명하여 그 상관관계를 작성하여 어레이 형광 데이타로부터 시료내 대장균의 수를 정량할 수 있는 방법을 제공할 수 있으며, 스팟의 패턴을 클러스터링(clustering) 방법 등으로 분석하여 사용할 수 있다.

형광정도는 캡쳐프로브(capture probes) 와 타겟프로브(target probe)가 형성하는 이중가닥에 의한 스팟에 따라 다양하게 표시된다. 특정물질-타겟프로브 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도 및 결합양이 결정된다. 특정물질-타겟프로브 복합체에서 해리되는 타겟프로브 와 캡쳐프로브의 염기서열은 타겟프로브-캡쳐프로브 이중가닥의 안정성에, 그리고 타겟프로브의 양은 형광정도에 영향을 준다. 따라서 형성된 스팟의 형광정도를 분석하여 특정물질의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.

이상의 테스트 결과는 도 8a 및 8b와 같으며, 도식된 바와 같이 단일가닥핵산이 부착된 유리 슬라이드에서 대장균에 대한 압타머가 부착된 부위 (E1 내지 18, 서열번호 3 내지 20)에서는 형광이 있나, 음성 대조구 (N1 내지 6, 서열번호 21 내지 26)는 형광이 없었다. 또한, 리스테리아균(Listeria monocytogenes, ATCC #19118)을 시료로 하여 동일한 방법으로 검사한 결과, 형광을 확인할 수 없었다. 이상의 결과로부터 SELEX로 선정된 E1 내지 18(서열번호 3 내지 20)의 염기서열은 대장균에 대한 특이적인 결합력이 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 대장균 100 cfu의 경우(도 8a) 및 대장균 10,000 cfu의 경우 (도 8b)의 비교한 결과, 형광정도가 대장균 10,000 cfu의 경우가 100 cfu 경우보다 상대적으로 높아 형광정도의 차이는 대장균의 cfu의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 캡쳐프로브에 타겟프로브의 이중가닥이 형성되어 이 이중가닥 수에 따라 형광정도가 상이하며 이는 미생물의 수와 상관관계가 있으며 이를 이용하여 미생물의 수를 결정할 수 있었다.

상기의 방법으로 다양한 물질에 대한 인식부위를 가진 단일가닥핵산이 부착된 어레이를 이용하여 한 시료에서 다양한 물질의 동정 및 정량적인 변화를 탐색 및 분석할 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명은 압타머인 단일가닥핵산은 주어진 환경에 따라 특정물질과 복합체를 형성하거나, 또는 상보적인 단일가닥핵산과 이중가닥핵산을 형 성하는 이중기능을 이용한 특정물질의 동정과 정량적인 변화까지 확인할 수 있는 분석방법은 미생물, 세포, 단백질을 포함하는 생체분자 등에 대한 탐색 및 분석 등에 사용할 수 있어 궁극적으로는 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용될 수 있다.

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Claims (8)

1. (ⅰ) 반응기(X)-스페이서 부위(R)-타겟프로브 인식부위(V)로 구성된 단일가닥핵산인 캡쳐프로브들을 고체 기판 위에 고착시켜 어레이를 제작하는 제 1단계; (ⅱ) 분석시약의 처리에 의해 특정물질과 타겟프로브를 반응시켜 특정물질-타겟프로브 복합체를 제조하는 제 2단계; (ⅲ) 상기 제 2단계에서 제조된 특정물질-타겟프로브 복합체를 세척 및 분리하는 제 3단계; (ⅳ) 분리된 복합체에 혼성화용액을 첨가하고 95℃에서 5분간 처리하여 타겟프로브를 해리시키는 제 4단계; (ⅴ) 캡쳐프로브와 표지된 타겟프로브를 반응시키는 제 5단계; 및 (ⅵ) 상기 타겟프로브에 표지된 물질을 탐색하는 제 6단계로 구성된 단일가닥핵산 어레이를 이용한 특정물질의 동정 및 정량방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 분석시약은

   (ⅰ) 20 내지 100mM 트리스·염산(pH 7.4),

   (ⅱ) 각각 1 내지 200mM의 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘, 또는 이들의 혼합용액,

   (ⅲ) 0.05 내지 0.2%의 소듐 아지드,

   (ⅳ) 0.1 내지 0.3%의 우혈청알부민 또는 비특이적인 결합을 저해하는 핵산을 포함하는 셀렉스 선택버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 분석시약은 50mM 트리스·염산(pH 7.4), 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨 또는 1mM 염화마그네슘, 0.1% 소듐아지드, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계의 특정물질은 세균, 진균류, 바이러스, 세포주, 조직, 이로부터 분리된 단백질, 탄수화물, 지질, 다당체, 당단백, 호르몬, 수용체, 항원, 항체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 제 3단계의 세척버퍼는 0.01 내지 1 x 세렉스버퍼 또는 1 내지 500 mM EDTA 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 제 4단계의 핵산 혼성화용액은

   (ⅰ) 0.5 내지 1.5 M 염화나트륨,

   (ⅱ) 0.1 내지 1.0 M의 소듐 시트레이트,

   (ⅲ) 비특이적인 결합을 저해하는 물질인 0.1 내지 0.3%의 우혈청알부민, 0.1 내지 1.0% SDS, 0.1 내지 10 배의 덴하르트 용액(Denhart solution) 또는 0.1 내지 1% 비지방 건조 우유(nonfat dried milk),

   (ⅳ) 비특이적인 결합을 저해하는 핵산,

   (v) 30 내지 60 % (v/v) 포름아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 핵산 혼성화 용액은 1 M 염화나트륨, 0.3 M 소듐 시트레이트, 0.5% SDS 또는 100㎍/㎖ 살몬스펌 DNA, 0.2% 우혈청알부민 또는 단일가닥핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
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