[go: up one dir, main page]

KR20060010740A - 프로테아제 억제 단백질 및 그 이용 - Google Patents

프로테아제 억제 단백질 및 그 이용 Download PDF

Info

Publication number
KR20060010740A
KR20060010740A KR1020057018938A KR20057018938A KR20060010740A KR 20060010740 A KR20060010740 A KR 20060010740A KR 1020057018938 A KR1020057018938 A KR 1020057018938A KR 20057018938 A KR20057018938 A KR 20057018938A KR 20060010740 A KR20060010740 A KR 20060010740A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protease
leu
inhibitor
protein
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020057018938A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101296367B1 (ko
Inventor
데이비드 디퍼스
실바인 클라우티에
Original Assignee
유니베르시떼 드 로잔느
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니베르시떼 드 로잔느 filed Critical 유니베르시떼 드 로잔느
Publication of KR20060010740A publication Critical patent/KR20060010740A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101296367B1 publication Critical patent/KR101296367B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 억제 폴리펩티드 서열 및 적어도 하나의 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열을 포함하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 다른 목적은 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열, 상기 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터, 이 발현 벡터에 의하여 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포 및 키메라 억제 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
폴리펩티드, 프로테아제, 억제 단백질, 발현 벡터, DNA서열, 숙주 세포

Description

프로테아제 억제 단백질 및 그 이용{INHIBITOR PROTEINS OF A PROTEASE AND USE THEREOF}
본 발명은 억제 폴리펩티드 서열 및 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 적어도 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 프로테아제의 키메릭 억제 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프로테아제의 키메릭 억제 단백질을 암호화하는 정제 분리된 DNA 서열, 상기 정제되고 분리된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터, 이 발현 벡터에 의하여 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포 및 키메릭 억제 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
생물체에 의해 구현되는 모든 단백질에 있어서, 프로테아제는 살아있거나 죽은 세포의 전달 통로 내에서 가장 중요한 것 중 하나이다. 사실 프로테아제 및 기질 사이의 초기 상호작용과 수반하여 일어나는 절단은 혈전증, 응고, 아폽토시스(apoptosis)를 포함하는 본질적 생물학적 활동의 거대한 스펙트럼에 기초가 된다.
미조절된(dysregulated) 단백질분해, 또는 프로테아제 및 항프로테아제 사이의 불균형은 프로테아제가 암, 자가면역증, 염증 및 감염성 질환과 같은 것과 관련된다는 많은 병리학상의 중요요소일 수 있다는 의심에 기초하여 집중적으로 연구되 고 있다. 암 및 (류마티스 관절염 및 폐기종과 같은) 염증성 질환 모델에 있어서 항단백질분해제에 관한 다른 연구들이 흥미로운 개선된 결과를 보여주고 있는데, 이는 항단백질분해 요법과 프로테아제 및 항프로테아제 간의 균형적 역활을 강화하는 데 있다.
예를 들면, 미국 남성에게서 가장 일반적으로 진단되는 암 중 하나인 전립선암에 있어서, 프로테아제는 빠른 종양의 성장, 침입 및 전이를 포함하는 암 세포의 악성거동에 중추적 역활을 담당한다고 알려져 있다.
인간 림프샘 칼리크레인(glandular kallikrein)(hK2) 단백질은 전립선 상피에서 현저하게 발현되는 트립신 유사 세린 프로테아제이다. 처음으로 인간 정낭장액으로부터 분리된, hK2가 전립선암의 진단표지로서 최근에 알려지고 있다(deperthes et al, 1995 "Isolation of prostatic kallikrein hK2, also known as hGK-1, in human seminal plasma" Biochim biophys Acta 1245, 311-6)
표지로서 그 역활 외에도, 그것의 단백질분해 활성도는 hK2가 암의 진행에 기여할 수 있다고 암시하고 있다. 이 효소의 몇 가지 잠재적 기능으로 우로키나제(urokinase)형 플라스미노겐(plasminogen) 활성제의 활성 및 플라스미노겐 활성 억제자-1의 비활성을 포함하여, 프로-PSA의 활성, 피브로넥틴(fibronectin)의 분해 및 인슐린과 같은 성장 인자 결합 단백질(IGF-BP)의 분해가 제안되고 있다(Cloutier et al ., 2004 "Development of recombinant inhibitors specific to human kallikrein 2 using phase-display selected substrates" Eur J biochem 3, 607-13을 참조).
칼리크레인 hK2는 암, 특히 전립선암에서 PI-6로 알려진 프로테아제 억제자를 가지는 특이적인 복합체(complex)를 형성할 수 있다고 최근에 알려졌다. 이 특이적인 복합체의 발견에 기초하여, 미국 특허 6,284,873 및 6,472,143은 암 또는 조직의 괴사의 존재 또는 부존재를 판단하는 진단방법을 제공한다.
이 단백질분해 조직의 특이적인 발현과 암 개발에서 그 모든 잠재적 기질과의 관련성을 계산하기 위해, hK2는 또한 잠재적 치료 타겟으로 고려되었다(Darson et al. 1997 "Human glandular kallikrein 2(hK2) expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: a novel prostate cancer marker" Urology 49, 857-62). 따라서 특이적이고 오래 유지되는 프로테아제 억제자, 특히 칼리크레인 억제자의 개발은 유용할 것이다.
이러한 프로테아제 억제자 후보는 복합체 생리과정 조절을 결정하는 단백질의 큰 패밀리(family)인, 세르핀(세린 프로테아제 억제자, serine protease inhibitors)계(family) 중에서 선택될 수 있다. 약 45 kDa의 이들 단백질은 억제성을 가지는 것과 억제성을 가지지 않는 것의 두 개 군으로 세분될 수 있다.
세르핀은 잠정 타겟 프로테이나아제의 상호작용을 결정하는 노출된 유연한 반응성 부위 루프 또는 반응성-세르핀 루프(RSL)를 포함한다. 효소결합과 RSL의 P1-P1' 끊어지기 쉬운 결합의 절단에 이어서, 공유결합 복합체가 형성된다(Huntington et al . 2000 "Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation Nature 407, 923-6). 이 복합체의 형성은 주요 입체형 태 재배열을 유도하고, 이에 따라 타겟 프로테아제를 비가역적으로 가두어버린다. 세르핀의 억제 특이성은 P1-P1' 위치 잔기들의 성질과 RSL 길이에 크게 영향을 미친다. RSL 도메인 또는 세르핀의 반응 부위의 변화는 세르핀과 효소 간의 억제 과정을 이해할 수 있고, 특이성 억제자를 개발시킬 수 있다(Dufour et al . 2001 "The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha 1-antitrypsin to its reaction with furin J Biol Chem 276, 38971-9 and Plotnick et al . 2002 "The effects of reactive site location on the inhibitory properties of the serpin alpha(1)-antichymotrypsin" J Biol Chem 277, 29927-35).
단백질 C 억제자, α2 항플라스민, 항트롬빈-Ⅲ, α1-항키모트립신(ACT), 또는 프로테아제 억제자 6과 같은 몇 가지 세르핀은 hK2 억제자로 동일시할 수 있다(Saedi et al . 2001 "Human kallikrein 2 (hK2), but not prostate-specific antigen (PSA), rapidly complexes with protease inhibitor 6 (PI-6) released from prostate carcinoma cells" Int J Cancer 94, 558-63). hK2 및 ACT 사이의 비교적 느린 복합체 형성은 트립신 유사 효소의 비호의적 펩티드 결합, RSL의 P1-P1'의 위치에서 Leu 358-Ser 359 잔기를 형성시키는데 주요하게 기여한다.
지금까지 플라스마 칼리크레인을 특이적으로 억제하는 신규한 칼리크레인 억제자의 선택과, 치료 및 진단 방법에서 이의 이용이 개시되어 있다 (미국특허 US 6,057,287, US 6,333,402, US 5,994,125, 및 US 5,795,865). 그러나 이 특허들은 소 이자 트립신 억제자 쿠니츠(Kunitz) 도메인과 동종인 억제자와, 특히 플라스마 칼리크레인을 특이적으로 억제하는 리프로프로테인(liproprotein)관련 응고괴사 억제자(LACI) 쿠니츠 도메인과 동종인 단백질의 생산을 기재하고 있다.
플라스마 칼리크레인에 특이적일 뿐만 아니라, 이들 억제자들은 상당히 작은 분자들이고, 가역 수단 내에서 플라스마 칼리크레인과 결합한다. 이러한 접근의 중요한 약점 중 하나는 가역 수단 내에서 이들 타겟을 억제하는 단백질의 이용은 프로테아제의 분해(decomplexation)가 그것의 활성을 가두어버릴 위험이 있다.
따라서 여기에 기재된 바와 같이 많은 억제자를 이용하는 장점 중 하나는 이것이 비가역 수단에서 프로테아제 타겟이 되는 것을 막는 공유결합 복합체의 형성을 유도한다는 것이다. 본 발명의 다른 장점은 많은 공유결합 복합체들이 순환에서 빠르게 제거된다는 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 프로테아제에 대하여 높은 특이성을 가지는 프로테아제 억제 단백질 및 이의 약학적 조성물로서의 용도를 제공한다. 이 억제 단백질은 억제 폴리펩티드 서열 및 적어도 하나의 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열을 포함하는 키메라이다.
본 발명의 다른 목적은 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열, 상기 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터, 이 발현 벡터에 의하여 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 제공하기 위 한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 이 방법은
a) 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계;
b) 키메릭 서열을 얻기 위하여 세린 또는 시스테인 프로테아제의 억제 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계;
c) 적절한 조건하에서 세포 발현계에서 상기 키메라 서열의 발현을 허용하는 단계; 및
d) 상기 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 억제 폴리펩티드 서열 및 적어도 하나의 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열을 포함하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질에 관한 것이다.
"키메라 억제 단백질"은 예를 들어 자연에서는 존재하지 않는, 다른 기원을 가지는 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 말한다.
여기서 사용되는 "단백질", "폴리펩티드", "폴리펩티딕(polypeptidic)", "펩티드" 및 "펩티딕(peptidic)"은 알파-아미노와 인접 잔기의 카르복실 그룹 간의 펩티드 결합에 의해 다른 것과 연결되는 아미노산 잔기 계열을 의미하도록 여기서 호환성 있게 이용된다.
본 발명의 키메라 단백질은 프로테아제의 억제자이고, 억제 폴리펩티드 사슬 및 적어도 하나의 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열은 특정한 프로테아제에 대하여 억제자로 높은 선택적 특성이 있고, 이 폴리펩티드 서열은 억제되는 프로테아제를 기초로 하여 선택된다.
일반적으로 이 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열은 기질 활성부위 서열일 수 있다. "기질 활성부위 서열"은 기질에 기초한 서열이고 프로테아제에 대하여 선 인식되는 부위 서열을 말한다. 프로테아제에 의한 기질 활성부위 서열의 인지는 기질의 활성, 비활성 및 분해를 유도할 수 있고, 대부분은 이와 같은 고친화적 상호작용은 특이적 서열의 인식뿐만 아니라 이것의 3차 입체형태의 인식과 관련된다.
또한, 기질 활성부위 서열의 분자 키메라도 본 발명에 포함된다. "분자 키메라"는 기질 활성부위 서열의 기능적 부분을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 예정되며 이는 당해 기술분야의 당업자에게 알려진 단백질 화학 기법술에 의하여 얻어질 수 있다.
또한, 본 발명은 기질 활성부위 서열의 특정한 조합, 이의 단편 또는 이의 서브포션(subportion)도 고려한다.
"단편"이란 기질 활성부위의 각 서열 길이에 있어 적어도 40% 아미노산을 공유하는 서열을 말한다. 이들 서열은 이들이 유도하는 자연 서열과 동일한 특성을 나타내는 한 사용할 수 있다. 바람직하게는 이들 서열이 기질 활성부위의 각 서열의 길이에 있어서 적어도 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 아미노산을 공유하는 것이다.
이들 단편은 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려진, 예를 들면 화학적 합성과 같은 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 기질 활성부위 서열의 변이체를 포함한다. "변이체(variant)"는 자연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 다른 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미하는 것으로, 하나 이상의 아미노산이 같은 성질과 입체적 특성이 있는 또 다른 것으로 치환되는 보존적 아미노산 치환에 의하여 자연 서열과 달라진다. 아미노산 서열 변이체는 자연 아미노산 서열 내의 특정 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입되어 있다. 본 명세서 내에서 보존적 아미노산 치환은 다음의 다섯 군 중 하나 내에서의 교환으로 정의된다: :
Ⅰ. 작은 지방족, 무극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
Ⅱ. 극성, 양극 하지 잔기: His, Arg, Lys
Ⅲ. 극성, 음극 하지 잔기 및 이의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln
Ⅳ. 큰 방향족 잔기: Phe, Try, Trp
Ⅴ. 큰 방향족 무극성 잔기 : Met, Leu, Ile, Val, Cys.
바람직하게는 본 발명의 기질은 세프핀이며, 이 경우 기질 활성부위 서열은 반응성 세르핀 루프 서열, 이의 단편, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체이다.
"반응성 세르핀 루프" 또는 "반응성 부위 루프" 또는 RSL은 세르핀에 발견되는 노출된 유연한 반응성 부위 루프로 정의되고, 잠정적 타켓 프로테아제와 상호작용에 영향을 준다. 끊어지기 쉬운(scissile) 결합의 아미노산기 상의 잔기에서, 이 결합에서 멀어져가면, 잔기는 통상적으로 P1, P2, P3 등으로 불린다. 끊어지기 쉬운 결합을 따라 잔기는 P1', P2', P3'등으로 불린다. 일반적으로 이 RSL은 6 내지 12 아미노산 잔기로 구성된다.
이 RSL 서열은 서열번호 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22, 이의 단편, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, RSL 서열은 표 Ⅰ에 나타난 가능성 중에서 선택될 수 있다.
표 1
변경될 수 있는 RSL 내에서의 위치
Figure 112005056139913-PCT00001
RSL(반응성 세르핀 루프) 내의 P4-P3' 잔기의 아미노산 서열은 잠재 기질 펩티드에 해당한다.
빈칸은 hK2에 기질 특이성을 얻기 위하여 요구되는 수정(modification)이 없다는 것을 의미한다.
일반적으로 프로테아제는 칼리크레인, 키모트립신(Chtr), 우로키나아제(uPA) 및 인간 뉴트로필(neutrophile) 엘라스타아제(HNE) 효소를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게 프로테아제는 인간 칼리크레인이고, 가장 바람직하게 이 인간 칼리크레인은 hK2(hGK-1로도 알려져 있는)2이다.
HK2는 15 멤버(member)로 구성된 칼리크레인 유전자 군(gene family)에 속하지만, 단지 전립선 특이 항원(PSA 또는 hK3) 및 hK3 만이 전립선에 의하여 높은 수준으로 발현된다. hK2의 잠재적 생리 역활 중 하나는 사정 후 즉시 형성되는 정자-포착(sperm-entrapping) 겔의 단백질분해, 특히 정낭 분비물(semenogelins) 및 섬유결합소를 절단(cleavage)하는 것이다.
hK2는 IGF 결합 단백질 단백질분해에 의하여 인슐린과 같은 성장 인자(IGF)의 분열촉진 활동을 강화할 수 있는 시험관 내(in vitro) 시험을 하였다. 또한, 시험관 내 연구에서 hK2는 프로우로키나아제를 활성화하여, 키니노겐(kininogen)(B2 브라디키닌(bradykinin) 수용체를 통해 EGF-수용체의 잠재적 교차활성(cross-activation))으로부터 브라드키닌과 같은 기질을 형성하고, 활성 형태에서 프로PSA를 전환시킨다는 것을 알았다. 이들 hK2 활성도는 세포 외부 기질(matrix) 단백질분해에서 hK2의 잠재적 역활을 나타내고 그 결과 전립선암 세포의 이탈 및 이동을 초래한다. 또한, hK2는 분열촉진 인자의 제거 및 성장 수용체의 활성화에 의해 전립선암의 개발을 촉진시킬 수 있다.
억제될 프로테아제가 시스테인 프로테아제인 경우, 이 프로테아제는 카텝신(cathepsins)(K, L 및 S 아형(subtype)), 프로호르몬 티올 프로토이나제(protoinase) 및 카스파스(caspase) 패밀리(카스파스 1, 3, 4 및 8)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
시스테인 잔기를 촉매 활성으로 이용하는 단백질분해 효소인 시스테인 프로테아제는 적어도 30 단백질 패밀리로 그룹화할 수 있다. 각 패밀리는 유사한 아미노산 서열을 가지고 패밀리 개체의 유사한 3차 구조를 반영하는 진화론적으로 보존된 서열 모티브(motif)를 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 키메라 억제 단백질의 억제 폴리펩티드 서열은 일반적으로 세린 또는 시스테인 프로테아제이다.
억제 폴리펩티드 서열이 세린 프로테아제에서 연유하는 경우, 이 억제 폴리펩티드 서열은 세르핀 서열, 이의 단편, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체가 바람직하다.
이 세르핀 서열은 α-1 항키모트립신(α-lantichymotrypsin, ACT), 단백질 C 억제자(PCI), α-1 항프로테이나제(lantiproteinase, AAT), 인간 α-1 항트립신-관련 단백질 전구체(ATR), α-2-플라스민(α-2-plasmin) 억제자, 인간 항-트롬빈-Ⅲ 전구체(ATⅢ), 프로테아제 억제자 10(PI10), 인간 콜라겐-결합 단백질 2 전구체(CBP2), 프로테아제 억제자 7(PI7), 프로테아제 억제자 뉴세르핀(leuserpin) 2(HLS2), 인간 플라스마 프로테아제 C1 억제자(C1 INH), 모노사이트(monocyte)/뉴트로필 엘라스타아제 억제자(M/NEI), 플라스미노겐(plasminogen) 활성 억제자-3(PAI3), 프로테아제 억제자 4(PI4), 프로테아제 억제자 5(PI5), 프로테아제 억제자 12(PI12), 인간 플라즈미노겐 활성 억제자-1 전구체 내피(endothelial)(PAI-1), 인간 프라즈미노겐 활성 억제자-2 태반(placental)(PAI2), 인간 상피세포(pigment epithelium)-유도 인자 전구체(PEDF), 프로테아제 억제자 6(PI6), 포로테아제 억제자 8(PI8), 프로테아제 억제자 9(PI9), 인간 편성 상피 세포 암종 항원(squamous cell carcinoma antigen) 1(SCCA-1), 인간 편상상피 세포 암종 항원 2(SCCA-2), T4-결합 글로불린(TBG), 메그신(Megsin) 및 프로테아제 억제자 14(PI14), 이의 단편, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 세르핀의 대부분은 다른 이름을 가지고 있기 때문에 이의 상세 내역을 요약한 아래 표를 포함시켰다.
표 2
세르핀 첨가번호 RSL 서열
PI 또는 AAT, A1AT_인간 알파-1-항트립신 전구체 (알파-1 프로테아제 억제자) (알파-1- 항프로테아제) sp|P01009| GTEAAGAMFLEAIPMSIPPE
PIL 또는 ATR, A1AU_인간 알파-1-항트립신-관련 단백질 전구체 sp|P20848| GTEATGAPHLEEKAWSKYQT
PLI 또는 AAP, A2AP_인간 알파-2-항플라스민 전구체 (알파-2-플라스킨 억제자) (알파-2-PI) (알파-2-AP) sp|P08697| GVEAAAATSIAMSRMSLSSF
AACT, AACT_인간 알파-1-항키모트립신 전구체 (ACT) sp|P01011| GTEASAATAVKITLLSALVE
AT3, ANT3_인간 항트롬빈-III 전구체 (ATIII) sp|P01008| GSEAAASTAVVIAGRSLNPN
PI10, BOMA_인간 보마핀(BOMAPIN) (프로테아제 억제자 10) sp|P48595| GTEAAAGSGSEIDIRIRVPS
CBP2, CBP2_인간 콜라겐-결합 단백질 2 전구체 (COLLIGIN 2) sp|P50454| GNPFDQDIYGREELRSPKLF
PI7 또는 PN1, GDN_인간 GLIA 유도된 넥신 전구체 (GDN) (프로테아제 넥신 I) (PN-1) (프로테아제 억제자 7) sp|P07093| GTKASAATTAILIARSSPPW
HCF2, HEP2_인간 헤파린 보조인자 II 전구체 (HC-II) (프로테아제 억제자 뉴세르핀(LEUSERPIN) 2) (HLS2) sp|P05546| GTQATTVTTVGFMPLSTQVR
C1NH 또는 C1IN, IC1_인간 플라스마 프로테아제 C1 억제 전구체 (C1 INH) sp|P05155| GVEAAAASAISVARTLLVFE
ELANH2 또는 PI2, ILEU_인간 백혈구 엘라스타아제 억제자 (LEI) (모노사이트/뉴트로필 엘라스타아제 억제자) (M/NEI) (EI) sp|P30740| GTEAAAATAGIATFCMLMPE
PCI 또는 PLANH3 또는 PROCI, IPSP_인간 플라스마 세린 프로테아제 억제자 전구체 (PCI) (단백질 C 억제자) (플라스미노겐 활성 억제자-3) (PAI3) sp|P05154| GTRAAAATGTIFTFRSARLN
PI4 또는 KST, KAIN_인간 칼리크레인 전구체 (칼리크레인 억제자) (프로테아제 억제자 4) sp|P29622| GTEAAAATTFAIKFFSAQTN
PI5, MASP_인간 마스핀 전구체 (프로테아제 억제자 5) sp|P36952| GGDSIEVPGARILQHKDELN
PI12, NEUS_인간 뉴로세르핀 전구체 (프로테아제 억제자 12) sp|Q99574| GSEAAAVSGMIAISRMAVLY
PAI1 또는 PLANH1, sp|P05121|PAI1_인간 플라스미노겐 활성 억제자-1 전구체, 내피(ENDOTHELIAL) (PAI-1) sp|P05121| GTVASSSTAVIVSARMAPEE
PAI2 또는 PLANH2, PAI2_인간 플라스미노겐 활성 억제자-2, 태반 (PAI-2) (모노사이트 ARG-세르핀) (우로키나아제 억제자) sp|P05120| GTEAAAGTGGVMTGRTGHGG
PEDF, PEDF_인간 상피세포-유도 인자 전구체 (PEDF) (EPC-1) sp|P36955| GAGTTPSPGLQPAHLTFPLD
PI6 또는 PTI, PTI6_인간 태반 트롬빈 억제자 (세포질 항프로테아제) (CAP) (프로테아제 억제자 6) sp|P35237| GTEAAAATAAIMMMRCARFV
PI8, PTI8_인간 세포질 항프로테아제 2 (CAP2) (CAP-2) (프로테아제 억제자 8) sp|P50452| GTEAAAATAVVRNSRCSRME
PI9, PTI9_인간 세포질 항프로테아제 3 (CAP3) (CAP-3) (프로테아제 억제자 9) sp|P50453| GTEAAAASSCFVVAECCMES
SCCA1, SCC1_인간 편평세포암종 항원 1 (SCCA-1) (단백질 T4-A) sp|P29508| GAEAAAATAVVGFGSSPAST
SCCA2, SCC2_인간 편평세포암종 항원 2 (SCCA-2) (뉴핀(LEUPIN)) sp|P48594| GVEAAAATAVVVVELSSPST
TBG, THBG_인간 티록신-결합 글루불린 전구체 (T4-BINDING GLOBULIN) sp|P05543| GTEAAAVPEVELSDQPENTF
메그신(MEGSIN) gi|4505149|ref|NP_003775.1| GTEATAATGSNIVEKQLPQS
PI14, 판핀(pancpin), TSA2004　 gi|3724282|dbj|BAA33766.1| GSEAATSTGIHIPVIMSLAQ
본 발명에 따른 키메릭 억제 단백질의 실시예에서, 출원인은 표 3에서 요약된 것과 같이 프로테아제 hK2에 특이적인 6 가지 신규한 키메릭 억제 단백질을 놀랍게도 발견하였으며, 이들 억제자는 다음과 같다:
표 3
Figure 112005056139913-PCT00002
이들 키메릭 억제 단백질은 키모트립신, 비만 세포 카이메이스(chymase), 카텝신 G(cathepsin G), 전립선 칼리크레인 hK2 및PSA(hK3)와 같은 인간 효소의 큰 패널을 억제하는 것으로 알려진, α1-항키모트립신(rACT)의 RSL을 변성함으로써 얻어지고, 이는 세르핀의 특이성을 바꾸기 위해서이다. 실시예 1에서 구체적으로 설명된 것과 같이 파지 디스플레이 기술에 의하여 효소 hK2에 대한 기질로 선택된 펩티드 서열은 RSL 의 끊어지기 쉬운 결합 및 주위 아미노산 잔기를 대체하여 이용된다. 재조합 억제자는 박테리아 내에서 형성되고 친화 크로마토그래피에 의하여 정제된다.
hK2를 매우 느리게(12 내지 16시간) 억제하는 야생 rACT와 비교하면, 조제 rACT들은 몇 분 내에 매우 빨리 공유결합 복합체를 형성하는 것을 알 수 있었다. 이들 6가지 rACT 변이체는 높은 결합상수로 hK2에 특이성을 가졌다(표 5 및 6 참조). 30분 동안 과량의 억제자(100:1의 [I]o/[E]o)로 배양시켰을 때, hK2는 rACT8 .20 및 rACT5 . 18의에 의하여 각각 효소 활성 95% 및 73%로 억제된 것에 반해, rACT6 .2, rACT8 .3, rACT6 .7 및 rACT6 .1에 의하여 완전히 억제되었다. 이 조건 하에서 야생 rACT는 hK2에 대하여 전혀 억제 활성을 나타내지 않았다. 이들 변이체 중에서 두 가지(rACT8 .3 및 rACT5 .18)는 hK2에 특이적인 다른 억제 실험 효소가 없었다. 두 가지 다른 변이체들, rACT6 .7 및 rACT6 .2는 각각 36% 및 100%의 PK로 억제되었다. 야생형 ACT로서 변이체 rACT8 .20은 PK 및 HNE 뿐만 아니라 두 개의 키모트립신-유사 프로테아제 Chtr 및 PSA도 억제하였다. 재조합 세르핀 중 어느 것도 칼리크레인 hK1 및 uPA에 대해 억제 활성을 나타내지 않았다.
또한, 출원인은 rACTWT의 RSL구조에 위치한 P3-P3' 잔기를 단백질 C 억제자(PCI)의 RSL에 대해 암호화하는 기질 펜타펩티드로 대체함으로써 칼리크레인 hK2 및 hK3를 억제할 수 있는 키메릭 억제자(MDCI)를 생산할 수 있었다.
그러므로 프로테아제의 키메라 억제자는 MD820, MD62, MD61, MD67 및 MDCI를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 이 키메라 억제 단백질은 MD62 또는 MD61이다.
우수한 억제 화학양론(Stoichiometry of Inhibition, SI)치는 일반적으로 세르핀의 기질의 특성으로 설명된다고 알려져 있다. 이것은, 초기 미키엘리스(Michaelis) 복합체의 형성과 RSL의 분할 후, 대부분의 복합체는 활성효소로 쪼개지고 억제자와 결합하여 완전히 비활성화된다. 출원인은 샘플을 프로테아제에 대해서 10:1배 과량의 억제자를 배양함으로써 억제자의 복합체 형성하지 않음을 ACT 변이체와 hK2 반응을 통해서 분석하였다. 실험된 ACT 변이체(표 6)의 측정된 SI값 근접 또는 이하인 이들 조건은 일반적으로 세르핀 또는 세르핀-프로테아제 복합체의 단백질분해로 적합하다. 놀랍게도 출원인은 hK2에 의한 변이체 ACT의 분해가 높은 SI값에도 불하고 측정되지 않기 때문에 이 가설이 불일치한다는 것을 알았다. SI 측정을 수행하는 조건이 ACT 분해의 부족에 대하여 설명이 가능하다. 공유결합 ACTs-hK2 복합체는 매우 천천히 시험관 내에서 형성된다. 이는 25℃에서 30분 배양한 후 야생형 ACT가 hK2를 억제함이 검출되지 않고(표 5), 37℃에서 더 긴 시간 배양된 후에서도 hK2가 야생형 ACT에 의해 단지 부분적으로 복합체(도 3)를 형성하는 것과 일치한다.
출원인인 신규한 억제자가 다른 포로테아제의 대해서도 특이성이 있음을 검토하였다. 이 실험은 생체 내에서의 응용을 증명하기 위해 다른 프로테아제에 대해서 동일한 조건(가성-생리적 조건, pseudo-physiological conditions)에서 수행되었다. hK2 파지 디스플레이 선택된 기질에 대한 RSL 절단 부위(RSL cleavage site)의 치환(permutation)은 야생형 ACT의 hK2에 대한 억제 활성을 띠도록 바꾸었다. 더욱이 이들 두 가지 억제자는 hK2에 대하여 유일한 반응성을 나타내고 플라스마 칼리크레인, hK1, PSA, 우로키나아제(uPA), 및 인간 뉴트로필 엘라스타아제(HNE)와 같은 유사한 생물학적 기질 타겟으로 알려진 다른 연구된 효소에는 반응성을 나타내지 않았다. 출원인의 지식으로 본 발명이 hK2의 특이 억제자의 개발을 언급하는 최초의 보고서이다.
흥미롭게도 rACT8.20(MD820)는 hK2 뿐만 아니라 키모트립신도 억제하며, 더욱 약하나 플라즈마 칼리크레인 및 인간 엘라스테아제도 억제하며, 이는 넓은 억제 특이성을 보여준다.
키메라 억제 단백질의 억제 폴리펩티드 서열은 또한 세르핀에 의한 시스테인 프로테아제의 지금까지 기록으로 충분히 입증된 사례들에 있는 시스테인 프로테아제로부터 선택될 수 있다(Gettins P.G.W., 2002 "Serpin structure, mechanism, and function in Chem . Rev, 102, 4751-4803). 이 실시예들은 세르핀 편상상피 세포 암종 항원1에 의한 카텝신(cathepsin) K, L 및 S의 억제자, α-1 항키모트립신에 의한 프로호르몬 티올 프로테이나아제의 억제자, 및 카스파아제(caspase) 1(인터루킨(interleukine) 1β 전환 효소), 카스파아제 3, 및 바이러스 세르핀 crmA에 의한 카스파아제 8 및 인간 세르핀 PI9에 의한 카스파아제 1, 4 및 8 포함하는 카스파아제 패밀리의 억제자 멤버를 포함한다.
재조합 기술이 본 발명에 따른 프로테아제의 키메릭 억제 단백질을 제조하기 위해 수행되었을 때, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편이 사용됨이 바람직하다.
따라서 본 발명은 또한 상술한 바와 같이 프로테아제의 키메릭 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열에 관한 것이다.
"분리 정제된 DNA 서열"은 본 발명의 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 또는 본 발명의 프로테아제의 키메릭 억제 단백질을 암호화하는 핵산이 본 발명에 따라 존재하는 상태를 가리킨다. 핵산은 자연적 환경 또는 재조합 DNA 기술에 의해 시험관 내 혹은 생체 재(in vivo)에서 제조될 때 제조 환경(예, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드나 핵산과 같이 이들이 자연적으로 연합되는 물질이 없거나 실질적으로 없는 상태일 것이다.
본 명세서에서 사용된 DNA는 이중사슬 DNA, 단일사슬 DNA, 하나 혹은 두 사슬이 두 개 이상의 단편으로 구성되는 이중사슬 DNA, 하나 혹은 두 사슬이 중단되지 않은 포스포디에스테르 골격을 가지는 이중 사슬 DNA, 하나 이상의 단일 사슬 부분 단백질 및 하나 이상의 이중 사슬 단백질을 포함하는 DNA, DNA 사슬이 완전히 상보적인 이중 사슬 DNA, DNA 사슬이 부분적으로만 상보적인 이중 사슬 DNA, 환형 DNA, 공유결합되어 닫힌 DNA(covalently-closed DNA), 선형 DNA, 상호 공유결합으로 연결된 DNA(covalently cross-linked DNA), cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, 반합성된 DNA(semi-synthetic DNA), 생합성된 DNA, 자연적으로 분리된 DNA, 효소 처리된 DNA, 잘라낸 DNA(sheared DNA), 방사능 표지된 DNA 및 형광 크롬(fluorochrome) 표지된 DNA와 같이 표지된 DNA, 하나 이상의 비자연적으로 생성된 핵산 종을 포함하는 DNA를 포함하여 어떠한 폴리디옥시뉴클레오티드도 사용될 수 있다.
프로테아제의 키메라 억제 단백질, 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열은 예를 들면 포스포트리에스터(phosphotriester)법 또는 자동 합성법 및 PCR법과 같이 표준 화학 기술에 의해 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열은 또한 효소적 기법에 의하여 생산될 수 있다. 그러므로, 미리 정의된 인식 서열에서 핵산 분자를 자르는 제한효소는, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디 혹은 그 부분을 암호화하는 DNA(RNA)와 같은 핵산 서열을 포함하는 보다 큰 핵산 분자로부터 핵산 서열을 분리하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 예를 들면 이중사슬 RNA, 단일사슬 RNA, 하나 혹은 두 사슬이 두 개 이상의 단편으로 구성되는 이중사슬 RNA, 하나 혹은 두 사슬이 중단되지 않은 포스포디에스테르 골격을 가지는 이중 사슬 RNA, 하나 이상의 단일 사슬 부분 단백질 및 하나 이상의 이중 사슬 단백질을 포함하는 RNA, RNA 사슬이 완전히 상보적인 이중 사슬 RNA, RNA 사슬이 부분적으로만 상보적인 이중 사슬 RNA, 환형 RNA, 공유결합되어 닫힌 RNA(covalently-closed RNA), 선형 RNA, 상호 공유결합으로 연결된 RNA(covalently cross-linked RNA), cRNA, 화학적으로 합성된 RNA, 반합성된 RNA(semi-synthetic RNA), 생합성된 RNA, 자연적으로 분리된 RNA, 효소 처리된 RNA, 잘라낸 RNA(sheared RNA), 방사능 표지된 RNA 및 형광 크롬(fluorochrome) 표지된 RNA와 같이 표지된 RNA, 하나 이상의 비자연적으로 생성된 핵산 종을 포함하는 RNA를 포함하여 어떠한 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 형태의 핵산을 포함한다.
프로테아제의 키메라 억제자를 암호화하는 분리 정제된 DNA는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 이미 언급된 서열의 변이체, 즉, 같은 성질을 가지는 다른 뉴클레오티드에 의하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환되는 보존적 뉴클레오티드 치환에 의하여 참조 서열과 달라지는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다.
본 발명의 다른 관점은, 상술한 바와 같이, 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다. 발현 벡터의 선택은 당해 기술분야에 널리 알려진 것과 같이 예를 들면 키메라 억제 단백질 발현 및 형질전환(transformed) 또는 트랜스펙션된(transfected)된 호스트세포를 소망하는 기능적 특성에 직접적으로 의존된다.
나아가, 이 발현벡터는 상기 분리 정제된 DNA 서열이 작동되게 연결되어 있는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 이것은 본 발명의 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는, 분리 정제된 DNA 서열이, 발현 즉, 삽입된 분리되고 정제된 DNA 서열의 전사 및 번역을 허락하는 적절한 조절 서열의 통제를 받고 있음을 의미한다.
본 명세서 내에서 사용된 "프로모터(promoter)"는 당해 기술분야에 알려진 임의의 첨가 조절 서열을 말하고, 예를 들면 폴리펩티드의 발현을 위해 일반적으로 채용된 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 부위 및 스플라이스 결합(splice junction)일 수 있고, 하나 이상의 분리 타겟팅 서열을 더 포함할 수 있고, 선택적으로 선택가능한 표지를 암호화할 수 있다. 유용한 프로모터는 숙주 세포와 양립할 수 있는 프로모터로서 예를 들면 바이러스 유전체로부터 얻어지는 프로모터가 있으며, 이 바이러스로는 폴리오마(polyoma) 바이러스 (아데노바이러스(Adenovirus) 2와 같은) 아데노바이러스, (소 유두종 바이러스와 같은) 유두종 바이러스, 조류 육아종 바이러스, (생쥐 또는 인간 거대세포바이러스 즉각 초기 프로모터와 같은) 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, B형-간염 바이러스, 및 (SV 초기 또는 후기 프로모터와 같은) 원숭이 바이러스 40와 같다. 또한 이 프로모터로 액틴(actin) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 열 충격 프로모터와 같이 이종 포유동물 프로모터로부터 얻어지는 프로모터가 있다.
사용된 인핸서(enhancer)로 예를 들면 (글루불린, 엘라스타아제, 알부민, a-태아단백질 및 인슐린) 포유류 유전자로 알려진 인핸서 서열 또는 예를 들면 SV40 인핸서, 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마, 및 아테노 바이러스 인핸서와 같은 진핵세포 바이러스의 인핸서가 있다.
본 발명의 DNA 서열을 발현함에 있어, 수많은 다양한 호스트/발현벡터 조합이 가능하다. 유용한 발현벡터는 염색체의 부분, 비염색체 부분 및 합성 DNA 서열로 구성된다. 적절한 벡터는 SV40 유도체 및 알려진 박테리아 플라스미드 예를 들어, 대장균 플라스미드 col El, pCRl, pBR322, pMB9 및 그 유도체, RP4 등의 플라스미드; NM989 등의 파지 X의 수많은 유도체와 같은 파지 DNA 및 M13 등의 다른 파지 DNA 및 필라멘트 단일 사슬 파지 DNA; 2u 플라스미드 또는 그 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로 생성되는 파지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열 등을 채택하여 변형되는 플라스미드와 같은 벡터를 포함한다.
본 발명의 다른 관점에서는 여기 기재된 발현 벡터를 형질전환 또는 트렌스펙티드된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 제공한다.
"세포 트랙스펙션된" 또는 "세포 형질전환된" 또는 "트랜스펙션된/형질전환된 세포"는 세포외부 DNA가 도입되어 이 세포외부 DNA를 가지고 있는 세포를 의미한다. 이 DNA는 세포 속에 도입되어 핵산이 염색체 인태그란트(integrant) 또는 외부 염색체 요소(element)로서 반복되도록 한다.
본 발명에 따른 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 가지는 적절한 진핵 또는 원핵 숙주 세포의 형질전환 또는 트랜스펙션은 사용된 벡터의 유형에 전형적으로 의존한다는 잘 알려진 방법에 의해 이루어진다. 이들 방법과 관해서는 Maniatis et al . 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory and commercially available method의 예를 참조하라.
본 명세서에 기재된 키메라 억제 단백질은 세포 발현계 내에서 조합적으로 얻어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현하기에 유용한 단세포 숙주세포가 많다. 이러한 숙주는 잘 알려진 진핵 및 원핵 숙주를 포함하며, 이에는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스 스트레인, 효모와 같은 곰팡이 및 CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (예, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, 및 BMT10)와 같은 동물세포, 곤충세포(Sf9 등) 및 조직 배양 중의 인간 세포 및 식물세포가 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 대장균 세포이다.
또한 본 발명은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 캐리어(carrier)와 조합하여 상기 기재된 바의 키메라 억제 단백질을 활성제(active agent)로서 포함하는 약학적 조성물을 지시한다.
바람직하게는 여기에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 키메라 억제 단백질에 부가하여, 상기 약학적 조성물은 부형제(excipient)와 같은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 캐리어, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 상기 활성 화합물의 프로세싱을 촉진하는 캐리어 및/또는 보조제를 포함할 수 있다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 용량과 농도에서 리시피언트에게 독성이 없으며, 완충용액으로 인산, 시트르산 및 다른 유기산을; 항산화제로 아스코르브산 및 메티오닌(methionine)을; 보존제(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl orbenzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol 등); 저분자량(10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; Zn-단백질 착물과 같은 금속 착물(comlexes); 및/또는 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
약학적 조성물의 투여 형태는 전신용 또는 국소용일 수 있다. 예를 들면 이와 같은 조성물은 피하, 정맥, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 비강 내, 경피, 협측 경로 또는 삽인된 장치와 같은 다양한 비경구적 경로에 의하여 투여될 수 있고, 또한 연동 수단에 의하여 전달될 수 있다.
활성제와 같이 상기 기재된 키메라 억제 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 생흡수 될 수 있는 기질(bioabsorbable matrix) 내에 삽입(incoporated)되거나 포획(impregnated)될 수 있는데, 상기 기질은 기질의 서스펜션, 겔 또는 고체 지지체의 형태로 투여된다. 더욱이 상기 기질은 생체 고분자를 포함할 수 있다.
지효성 제제(Sustained-release preparations)가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 기질(semi permeable matrices of solid hydrophobic polymers)을 포함하며, 상기 기질은 필름 또는 마이크로캡슐 등의 모양으로 형성된 형태를 가진다. 지효성 기질의 예로서 폴리에스테르, 하이드로겔 (poly(2-hydroxyethyl-methacrylate 등), 또는 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactides) (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-글루탐산 및 [감마]에틸-L-글루탐산의 코폴리머, 비분해성 에틸렌비닐아세트산, LUPRON DEPOT(TM)과 같은 분해성 젖산-글리콜산 코폴리머 (젖산-글리콜산 코폴리머와 류프로라이드 아세트산으로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티릭산을 포함한다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제형(formulation)은 무균이어야 한다. 이는 예를 들면 무균 여과막을 통한 여과에 의하여 용이하게 수행될 수 있다.
본 발명의 키메라 억제 단백질의 적정 투여량(dosage)은 나이, 성별, 건강상태 및 대상자의 몸무게, 동시 치료의 유형-이것이 존재하고 상기 효과가 기대된다면-에 따라 달라질 것이다.
상기 적정한 투여량의 형태는 질병, 키메라 억제 단백질, 및 투여 방법; 알약, 캡슐, 정제(lozenge), 치과용 연고, 좌약, 흡입제, 용액, 연고 및 비경구적 저장고(depot)를 포함할 가능성에 따라 달라질 것이다.
또한 키메라 억제 단백질의 아미노산 변형이 본 발명에 포함되기 때문에, 이는 불용성 기질 또는 다른 매크로분자 캐리어에 키메라 억제 단백질을 교차결합하거나 용해도, 흡착도 및 뇌혈관 장벽을 가로지르는 투과성을 향상시키는데 유용할 수 있다. 이러한 변형은 당해 기술분야에 널리 알려진 것이고, 단백질과 그 유사물의 바람직하지 않은 발생가능한 부작용을 제거하거나 또는 감퇴시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 약학적 조성물은 활성제로서 키메라 억제 단백질을 포함하지만, 다른 약학적 조성물은 활성제로서, 상기 기재된 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이 약학적 조성물은 오로지 분리 정제된 DNA 서열만, 상기 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 상기 기재된 발현 벡터로 이미 트랜스펙션된 숙주 세포를 포함한다. 마지막 예에서, 숙주 세포는 여하한 항원성 문제를 피하기 위하여 치료 대상 환자로부터 분리되는 것이 바람직할 것이다. 이러한 유전자 및 세포 요법 접근은, 상기 분리 정제된 DNA 서열, 발현 벡터, 발현 벡터로 이미 트랜스펙션된 숙주 세포가 환자의 세포에 끼어들어가 단백질을 내부적으로 생산할 수 있기 때문에, 상기 약학적 조성물의 반복적인 투여를 요하는 환자들을 위하여 더 적합하다.
또한, 본 발명에는 여기에 기재된 바의 약학적 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 단백질 분해와 관련되는 장애(proteolysis-associated disorder)를 치료 또는 예방하는 방법이 개시되어 있다.
단백질 분해와 관련되는 장애를 치료 또는 예방하는 본 방법은 상기 장애가 암, 자가면역 질환, 양성전립선 비대와 같은 염증성 질환, 또는 감염성 질환과 같이 hK2 칼리크레인 활성이 유해한 장애인 경우에 유용하다.
"암"은 세포 성장이 조절되지 않는 것을 전형적인 특징으로 하는 포유류에서의 생리적인 상태를 가리키거나 기술한다. 치료될 수 있는 암의 예로 전립선암, 유방암 또는 전이성 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직한 방법에서 상기 포유류는 사람 환자이고, 투여되는 키메라 억제 단백질은 hK2 프로테아제를 특이적으로 억제하는 표 3의 재조합 세르핀 예로부터 선택된다.
또한, 본 발명의 범위는 암, 자가면역 장애, 양성 전립선 비대와 같은 염증성 장애, 또는 감염성 장애와 같이 hK2 칼리크레인 활성이 유해한 장애인 경우, 포유류의 단백질 분해와 관련되는 질환의 예방용 또는 치료용 의약의 제조를 위하여상기 기재된 약학적 조성물을 사용하는 것을 포함한다.
암의 예로 전립선암, 유방암 또는 전이성암을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키메라 억제 단백질은 일반적으로 의도한 목적을 달성하기 위한 양만큼 사용될 것이다. 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여, 키메라 억제 단백질 또는 이의 약학적 조성물은 치료적으로 유효한 양이 투여 또는 적용된다. "치료적으로 유효한 양"은 증상을 개선 또는 예방하거나, 치료 대상의 생존을 연장시키는데 유효한 양이다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 특히 여기에 제시된 상세한 설명의 견지에서 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진자의 능력 범위 안에 있다.
전신 투여를 위하여 치료적으로 유효한 양 또는 투여량(dose)은 시험관 내 분석(in vitro assay)으로부터 초기에 평가될 수 있다. 예를 들면, 투여량은 세포 배양에서 결정되는 것과 같이 IC50을 포함하는 순환 농도 범위에 이르게 하는 동물 모델에서 공식화 할 수 있다. 이러한 정보는 사람에 대한 유효한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
또한 초기 투여량은 예를 들면 당해 기술분야에서 널리 알려진 기술을 사용하여 동물 실험 등의 생체 내 데이타(in vivo data)로부터 평가될 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 동물 데이터에 기초하여 사람에 대한 투여량을 용이하게 최적화할 수 있고, 이것은 물론 치료 받는 대상, 상기 대상의 체중, 장애의 중증도, 투여방법 및 처방 의사의 판단에 의존할 것이다.
또한 본 발명은,
a) 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계,
b) 키메라 서열을 얻기 위하여 세린 또는 시스테인 프로테아제의 억제 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;
c) 적절한 조건에서 세포발현계 내에서 상기 키메라 서열의 발현을 허용하는 단계; 및
d) 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 생산하는 방법을 포함한다.
프로테아제에 특이적인 기질 활성 자리를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음의 여러 기법, 예를 들면 살아있는 세포 유래의 펩타이드를 전시하여 박테리아 내에서 passage를 회피(Buchholz et al., 1998)하는 쥐 백혈병 레트로바이러스와 같은 프로테아제 선별을 위한 기질 전시 혹은 관심있는 효소로 트랜스펙션된 포유류 세포를 이용하여 프로테아제 절단 부위를 인비보에서 선별하기 위하여 사용되는 키메릭 Sindbis 바이러스 라이브러리를 이용한 유사한 방법(Pacini et al, 2000 "In vivo selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries" J. Virol . 74, 22: 10563-70)으로 선택할 수 있다.
또한, 효모 시스템, 무작위 기질(random substrate)을 인테그랄 막 단백질에 융합시키고 상기 기질을 효모 막에 부착시켜 세포질 전사 인자가 리포터 유전자의 프로모터에 결합할 수 있게 하는 GASP(genetic assay for site specific proteolysis)가 본 발명의 범위 내에 있다(Kang et al ., 2001 "An improved strategy for a genetic assay for site-specific proteolysis"Mol . Cell . 30; 11(2): 263-6).
최근 프로테아제 기질 특이성을 결정하기 위하여 다수의 조합 화학 라이브러리(combinatorial chemical libraries)가 나타났다. 이들은 조합적 플루오로제닉 기질 라이브러리(combinatorial fluorogenic substrate libraries) 및 위치 스캐닝-합성 조합 라이브러리(positional scanning-synthetic combinatorial libraries )를 포함한다.
고정된 펩티드 라이브러리로 명명된 또다른 방법에 의하면, 라이브러리의 각 구성원의 상대 기질 특이성(kcat/Km)을 용액상에서 형광 강도를 측정하여 결정할 수 있고, 에드만(Edman) 시퀀싱에 의해 끊어지기 쉬운 결합을 확인할 수 있다(Hu et al . 2002 "Rapid determination of substrate specificity of clostridium histolyticum beta-collagenase using an immobilized peptide library" J. Biol . Chem. 8, 277 (10):8366-71).
프로테아제의 기질 특이성이 파지 디스플레이 기법에 의하여 결정되는 경우, 완전한 다양성을 가지는 파지-디스플레이 무작위 펩티드 라이브러리(phage-displayed random peptide library )가 생성되고 정제된 프로테아제에 의해 스크리닝 된다. 이 알려진 기술은 정해진 길이의 아미노산의 모든 가능한 아미노산 조합을 포함하는 파지-디스플레이 무작위 라이브러리를 구축하기 위하여 여기에 기재된 바와 같은 특별한 경우에 적합하게 된다.
따라서 대규모 라이브러리는 필라멘트 파지에 최대한 무작위 서열(random sequence)을 전시함으로써 구축되고, 이것의 특이성을 신속히 분석하기 위하여 프로테아제와 관련하여 스크리닝 된다.
실시예 1 및 2에 따르면, 출원인은 이론상 3.2×106 개의 모든 가능한 무작위 펜타머(random pentamer) 서열이 제시되기 때문에, 완벽한 것으로 판단될 수 있는 1.8×108 개의 독립된 형질전환체를 포함하는 펜타머 라이브러리를 구축하였다. 파지의 서열은 펜타머 인서트의 무작위성을 더욱 확인시켜 주었다. 그러므로 무작위 펜타펩티드를 전시하는 파지는 리간드(6x His)에 융합되고 친화 지지체 상, 이 경우에는 Ni-NTA 기질에 고정되었다. 프로테아제와 배양한 후, (실시예 1 및 2의 경우에는 상기 프로테아제가 hK2) 민감한 기질을 발현하는 파지는 고체상으로부터 분리된다. 이 분리된 파지는 F-양성(positive) 박테리아를 감염하고 계수(titration)하여 증폭하기 위하여 사용된다. 이들 파지는 침전시켜 정제하고, 증폭한 후 다음 회의 선별을 진행하기 위하여 친화성 지지체에 고정된다. 펜타펩티드의 이러한 선별은 특이성이 높은 폴리뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 총 8번 반복한다. 마지막 회에서 파지는 페트리 디쉬 위에 플레이팅(plating)하여 클로닝되었고, 개개의 파지 DNA는 효소에 의해 절단되는 서열을 결정하기 위해 기질 활성 자리를 코딩하는 영역을 증폭하였다.
키메라 서열을 얻기 위하여, 기질 활성 자리를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 세린 프로테에제의 억제자를 암호화하는 서열, 예를 들면, rACT를 암호화하는 서열에 도입된다. 2개의 사일런트 제한 부위(restriction site) Sec Ⅱ 및 Mlu Ⅱ가 이전에 rACT의 RSL 도메인 내 P1 코돈의 18bp 상류 및 18bp 하류에 삽입되고 기질 활성 자리를 암호화하는 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 서브클로닝 하도록 허용한다.
재조합 키메라 억제제는 예를 들어, 적절한 배양 조건에서 TG1 대장균 스트레인에서 생성된다. 적절한 배양 조건은 발현되는 재조합 키메라 억제제에 따라 10 - 30 시간 동안 10 - 40℃ 사이를 포함할 수 있다. 놀랍게도, 본 출원인은 실시예 1 및 2의 경우, 16시간 동안 16℃온도 조건이 온전히 무손상의 rACT의 변이체의 발현 및 생산을 허용한다는 것을 보여주었다.
마지막으로, 상기 재조합 키메라 억제제가 분비되면 배양 배지로부터 회수되고, 분비되지 않으면, 세포발현계로부터 추출하여 HPLC(high performance liquid chromatography), 젤 전기영동, 친화크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 이온교환 등의 공지 기술에 의해 정제할 수 있다.
특정 재조합 재조합 키메라 억제제를 정제하는데 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하(net charge), 소수성, 친수성 등의 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에게 명백하다. 친화 크로마토그래피 정제를 위하여, 재조합 키메라 억제제 또는 His 태그에 특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다. 아가로오즈 비드(agarose bead)와 연결된 Ni2 +-니트릴로트리아세트산 및 His 태그에 특이적으로 결합하는 물질과 같이 다른 친화성 분자가 또한 본 발명에서 예견된다.
키메라 억제 단백질은 프로테아제의 활성을 억제하는 능력 분석을 위해 더 분석될 수 있다. 이는 스케차드법(Scatchard, 1949 Ann NY Acad Sci 51: 660-669)과 같은 여하한 일반적인 방법에 의할 수 있다. 이 방법은 단백질 결합에 적용되는 결합을 측정하고 분석하는 전통적인 방법을 기술하고 있으며, 상대적으로 순수한 단백질이 요구되고, 결합되지 않은 단백질과 결합된 단백질을 구별할 수 있는 능력을 요구한다.
효소에 대한 키메라 억제 단백질의 친화도를 측정하기 위해 적절한 두 번째 방법은 상기 효소의 작용을 늦추게 하는 키메라 억제 단백질의 능력을 측정하는 것이다. 이 방법은 상기 효소가 기질을 절단하는 속도 및 크로모제닉(chromogenic) 또는 플루오로제닉(fluorogenic) 기질의 이용가능성에 따라서 상대적으로 순수한 키메릭 억제 단백질을 요구한다.
바람직하게는 본 발명의 키메라 억제 단백질은 이들의 야생형 카운터파트 보다 높은 친화성을 가지고 프로테아제 활성을 억제한다.
여기 개시된 키메라 억제제 단백질은 세포발현계에서 재조합되어 바람직하게 생성된다. 이 계는 진핵 또는 원핵 숙주 세포일 수 있다.
본 발명의 키메라 억제자 단백질을 발현하기에 유용한 단세포 숙주 세포가 많다. 이러한 숙주는 잘 알려진 진핵 및 원핵 숙주를 포함하며, 이에는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스 스트레인, 효모와 같은 곰팡이 및 CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (예, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, 및 BMT10)와 같은 동물세포, 곤충세포(Sf9 등) 및 조직 배양 중의 인간 세포 및 식물세포가 있다.
바람직하게는, 상기 숙주 세포는 바실러스 속, 에스케리키아 속, 살모넬라 속, 및 에르위니아(Erwinia) 속을 포함하는 군으로부터 선택되는 박테리아 세포이며, 보다 바람직하게는 상기 박테리아 숙주 세포는 대장균 세포이다.
본 발명에 따른 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로, 적절한 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션 시키는 것은, 사용되는 벡터의 유형에 따라 널리 알려진 방법에 의해 수행된다. 이들 방법에 대해서는 예를 들면 Maniatis et al . 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 및 상업적으로 이용가능한 방법을 참조할 것.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo), 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 이들의 상보 서열, 이들의 단편 및/또는 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 시료(specimen) 내에서 프로테아제를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는 것이다.
또는, 본 발명은 본 발명에 따른 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 포함하는, 시료 내 프로테아제를 검출하기 위한 진단 키트도 또한 제공한다. 상술한 프로테아제 키메라 억제 단백질은 예를 들면 MD820, MD 62, MD 61, MD 67 및 MD CI를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "시료(specimen)"는 프로테아제 또는 프로테아제를 암호화하는 서열을 포함하는 여하한 적절한 샘플, 키메라 억제 단백질 또는 상기 키메라 억제 단백질을 코딩하는 분리 정제된 DNA 서열이 결합하는 샘플을 말한다.
상기 진단 키트는 신호 검출이 존재하는 프로테아제 양에 의존하는, 프로테아제를 검출할 수 있는 시스템을 포함한다. 이 신호는 가시적으로 또는 기구를 이용하여 검출될 수 있다.
가능한 신호는 발색, 형광 혹은 발광 산물의 생성, 분석 성분 또는 산물에 의한 방사능을 흡수하거나 방출하는 특징의 변화 및 성분 산물의 침전 또는 점착(agglutionation)을 포함한다. 상기 성분은 방사성 동위원소, 플루오로포어(fluorophore), 효소, 조효소, 효소 기질, 전자 밀집 화합물 또는 점착가능한 입자 등의 표지이며, 본 발명의 진단 키트에서 분리 정제된 DNA 서열 또는 키메라 억제 단백질에 연결될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 활성제로서 재조합 야생형 세르핀을 포함하는 약학적 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류의 단백질분해와 관련된 장애 를 치료 또는 예방하는 방법을 또한, 제공한다.
상기 언급된 단백질분해와 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법은 상기 장애가 암, 자가면역질환, 양성 전립선 비대와 같은 염증성 질환 또는 감염성 질환과 같이 hK2 칼리크레인 활성이 유해한 장애인 경우에 유용할 수 있다.
선행하는 기술(description)은 하기 실시예들을 참조하여 더욱 이해될 것이다. 이들 실시예는 그러나 본 발명을 실시하는 예시적 방법일 뿐이고 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
도 1은 정제된 재조합 ACT의 환원조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 변이체(varient) 6.1(통로(lane) 1) 및 야생형 ACT(통로 2).
도 2는 rACTWT에 의한 hk2의 화학양론 억제(SI) 및 이것의 변이체을 나타낸다. SI는 I/E 비율를 외삽입한 선형회귀 분석을 이용하여 결정된다.
도 3A 및 B는 hK2 및 억제자 재조합 간의 복합체 형성을 나타낸다. 화살표들은 hK2(E), 억제자(I), 및 hK2-ACT 복합체(E-I)를 지시한다.
도 4A 및 B는 위일차(pseudo-first order) 조건 하에서 rACTWT에 의한 hK2 억제자 및 이것의 변이체을 나타낸다. hK2의 상호작용 및 재조합 세르핀이 진행곡선법을 이용한 위일차 조건하에서 측정되었다.
도 5는 실시예 1 및 2에서 전개된 억제자를 환원조건 하에서 SDS-PAGE 분석에 의하여 억제자의 순도 결과에 해당한다.
도 6A 및 B는 ACT 재조합 및 인간 칼리크레인 hK2(도 6A)와 PSA(도 6B) 간의 억제 반응을 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석한 것을 나타낸다.
도 7A는 DNA 및 MD820 단백질 서열을 나타낸다.
도 7B는 DNA 및 MD62 단백질 서열을 나타낸다.
도 7C는 DNA 및 MD83 단백질 서열을 나타낸다.
도 7D는 DNA 및 MD67 단백질 서열을 나타낸다.
도 7E는 DNA 및 MD61 단백질 서열을 나타낸다.
도 7F는 DNA 및 MD518 단백질 서열을 나타낸다.
도 7G는 DNA 및 MDCI 단백질 서열을 나타낸다.
도 8은 ACT의 RSL 서열 및 MD 억제자의 비교를 나타낸다. 단순형(plain type) 잔기은 ACTWT에서 공통적이고, 블록 및 밑줄이 그어진 잔기은 ACT 변이체의 RSL에서 돌연변이에 해당한다. 세르핀 내의 잠정 절단기는 P1-P1' 잔기 간의 별표 에 의해 표시된다.
도 9는 pQE9 발현 벡터 맵을 나타낸다.
도 10A는 MD 62에 의한 종양성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2에 의하여 전이된 전립선 암 세포 DU-145(3×106 세포)를 누드 마우스에 이식하였고, MD 62(5 또는 25㎍/주사(injection))로 치료하였다.
도 10B는 MD 67에 의한 종양성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2에 의하여 전이된 전립선 암 세포 DU-145(3×106 세포)를 누드 마우스에 이식하였고, MD 67(5 또는 25㎍/주사)로 치료하였다.
도 11은 MD CI에 의한 종양성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2에 의하여 전이된 전립선 암 세포 DU-145(3×106 세포)를 누드 마우스에 이식하였고, MD CI(5 또는 50㎍/주사)로 치료하였다.
실시예 1:
선택된 기질의 파지 디스플레이를 이용하여 인간 hK2 에 특이적인 재조합 ACT 억제자의 개발
재료
hK2 및 hK3(PSA)는 이전에 상술한 바와 같이(Frenette G, Gervais Y, Tremblay RR, Dube JY. 1998 "Contamination of purified prostate-specific antigen preparations by kallikrein hK2 J Urol 159, 1375-8)인간 정액으로부터 정제되었고, 항-hK2 및 항-PSA 단일클론 항체들은 캐나다, 라발(Laval) 대학, RR Tremblay 교수로부터 기증되었다. 인간 키모트립신(Chtr), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(uPA), 인간 칼리크레인 hK1, 인간 플라스마 칼리크레인(PK), 인간 뉴트로필 엘라스테아제(HNE) 및 상업적 ACT(인간 플라스마 α1-항키모트립신 )은 Calbiochem으로부터 구매되었다. Z-Phe-Arg-AMC, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC, Z-Gly-Gly-Arg-AMC, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC는 Calbiochem로부터 구매되었다. CFP-TFRSA-YFP 형광체 기질은 상술한 바와 같이(Mahajan NP et al . 1999 "Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis" Chem Biol 6, 401-9) 개발되었다. 인간 α1-항키모트립신(ACT)에 대한 cDNA는 (펜실베니아 대학) Harvey Rubin 박사로부터 많이 기증되었다.
부위특이 돌연변이( Site - directed Mutagenesis )
ACT cDNA을 pQE-9 발현 벡터(Qiagen, 독일, 도 9) 내에 서브클로닝 및 rACTWT의 N-말단위치에 His6 테그를 도입한 후, 2 제한 부위인 Sac Ⅱ 및 Mlu Ⅰ은 각각 RSL 도메인 내의 P1 코돈의 18bp 업스트림(upstream) 및 18bp 다운스트림(downstream)에 결합되었다. 이들 부위는 Sac Ⅱ에 대해서는 5'-GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3' 올리고뉴클레오티드와 Mlu Ⅰ에 대해서는 5'- GCACAATGGTACGCGTC TCCACTAATG-3' 올리고뉴클레오티드 및 스트라테젠(Stratagene)에 의해 공급되는 퀵체인지(quickchange) 돌연변이 프로토콜(protocol)을 사용한 침묵 돌연변이에 의해 생성되었다.
기질 파지 디스플레이 라이브러리의 구성
기질 파지 라이브러리는 변형된 pH0508b 파지미드(phagemid)(Lowman et al. 1991 "Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display" Biochemistry 12, 10832-8)를 사용하여 형성되었다. M13 유전자 Ⅲ의 카르복시-말단 도메인(코돈 249-406)에 선행하는 Gly-Gly-Gly-Ser-repeat-rich 부위의 일단에 His6 태그가 구성된다. 무작위 펜타머(pentamer)는 프랭킹 영역에 상응하는 5' 비오티릴레이트(biotinylated) 프라이머를 이용하여:
5'TAGTCTAGATAGGTG-3' 및 5'-TGCAGCGACTGCTATGA-3'
축퇴된(degenerate) 코돈의 양쪽에 위치된 적절한 제한효소 부위를 가지는 주형 올리고뉴클레오티드의 PCR 신장에 의하여 생성되었다:
5'TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGTCATAGCAGTCGCTGCA-3'(여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고 S는 G 또는 C )
PCR 주형은 이전에 상술한 바와 같이(Smith G.P, Scott J.K. 1993 "Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage" Methods Enzymol . 217, 228-57) 소화되고(digested) 정제되었으며, pH0508b 벡터에 소화된 XabⅠ/SalⅠ내로 삽입되고, XL1-Blue(F-) 내로 전기천공되었다. 라이브러리 정도는 암피실린(ampicillin) 및 테트라사이클린(tetracycline)(각각 100 및 15㎍·mL-1)을 가지는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 평판 상에 형질전환된 세포의 작은 부분을 깔아서(plating) 결정된 변환 효율로부터 추정되었다. 형질전환된 세포의 나머지는 mL 당 100 플라크형성 단위(p.f.u)의 감염 다중도를 주는 농도에서 M13K07 보조파지를 첨가하여 밤새도록 배양시켜 파지 라이브러리를 제조하는데 이용하였다. 파지들은 상등액(supernatant)으로부터 수집되고 폴리(에틸렌 글리콜) 침전에 의해 정제되었다. 물론 200 클론은 라이브러리의 무작위를 입증하기 위해 염기서열분석을 위해 임의로 선택되었다.
파지-디스플레이 펜타펩티드 라이브러리 스크린법
이 신규한 펜타펩티드 라이브러리는 hK2를 8회 선별하는 것을 조건으로 하였다. 세파로스 비드(sepharose beads)(Ni2 +-니트릴로트리아세트산 수지)와 커플화된 백 마이크로리터 Ni2 +-니트릴로트리아세틱산은 1mg·mL-1 BSA를 포함하는 10mL NaCl/Pi로 세척되었다. 파지 입자(1011)는 평형된 Ni2+-니트릴로트리아세트산 수지에 첨가되었고 4℃에서 3시간 동안 부드럽게 교반하면서 결합되었다. 이 수지는 미결합 파지들을 제거하기 위하여 (NaCl/Pi/BSA 1mg·mL-1, 5mM 이미다졸, 0.1% Tween 20) 세척된 다음 NaCl/Pi내에서 평형화되었다. 기질 파지는 37℃에서 45분 동안 27nM (최종 농도) hK2에 노출되었다. 또한 프로테아제 없는 제어 선택이 수행되었다. 상등액으로 방출된 절단 파지는 XL1-Blue 대장균을 이용하여 증폭되었고, 수반되는 수회 선택에 이용되었다. 8회 패닝(panning) 후, 약 15개 개별 클론은 5번째, 6번째 및 8번째 회에 선택되었고 플라스미드 DNA는 기질에 암호화된 영역 상에 독립되어 서열화되었다.
재조합 야생형 ACT 및 이의 변이체의 구성 및 발현
P3 및 P3'(아래 도 4 참조) 사이에 위치하는 반응성 부위 루프 상의 변화에 대응하는 6개 변이체는 프랭킹 지역(flanking regions)에 상응하는 프라이머를 이용하여:
5'-TACCGCGGTCAAAATC-3' 및 5'-TCACGCGTGTCCAC-3' 주형 올리고뉴클레오티드의 PCR 신장에 의하여 생성되었다:
rACT8 .20, 5'-TACCGCGGTCAAAATCACCCTCCGTTCTCGAGCAGTGGA
GACGCGT GA-3';
rACT6 .3, 5'-TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGT GGAGACGCGTGA-3';
rACT8 .3, 5'-TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTG
GAGACGCGTGA-3';
rACT6 .7, 5'-TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAG
TGGAGACCGCTGA-3';
rACT6 .1, 5'-TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGT
GGAGACGCGTGA-3';
rACT5 .18, 5'-TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTG
GAGACGCGTGA-3'
(여기서 밑줄친 서열은 반응성 부위 루프에서 새로운 절단(cleavage) 부위를 암호화함).
PCR 생성물은 Sac Ⅱ 및 Mlu Ⅰ 제한 효소로 소화되었고 소화된 rACTWT 구조 내에서 부차클론화되었다. 재조합 세르핀은 TG1 대장균주 내에서 형성되었다. 세포는 A600=0.5에서 100㎍/ml 암피실린(ampicillin)을 포함하는 2 x TY 배지(16g 트립톤, 10g 효모 추출, L 당 5g NaCl) 내에서 37℃에서 성장되었다. 이소프로필티오-β-갈락토시드(Isopropylthio-β-galactoside, IPTG)는 16℃에서 16시간동안 재조합 세르핀의 발현하도록 최종 농도가 0.5mM 되도록 첨가되었다. 100ml 배양으로부터 세포를 원심분리에 의하여 모으고, 차가운 PBS 내에 재현탁하고, 총 용해 세포질 단백질을 회수하기 위하여 프렌치 가압기로 가압하였다. 세포 조각(debris)은 원심분리에 의하여 제거되었고 Ni2 +-니트릴로트리아세틱 친화 아가로스 비드는 재조합 세르핀과 결합하기 위하여 4℃에서 90분 동안 상등액에 첨가되었다. 수지를 그 후 세척용액(50mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 25mM 이미다졸)으로 세척하였고, 결합 단백질은 다음의 용액(50mM Tris pH8.0, 500mM NaCl 및 150mM 이미다졸)으로 세척 분리하였다. 정제 후 rACT는 4℃에서 16시간 동안 50mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 0,05% 트리톤 X-100로 투석되었다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 검사에 의하여 각 정제가 결정되었고 쿠마시 블루(Coomassie Blue)-염색된 SDS-PAGE 겔의 농도계측에 의하여 노르말화되었다(Laemmli UK . 1970 "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227, 680-5).
표 4
재조합 세르핀 α1-항키모트립신(ACT) 및 이의 변이체의 RSL(반응성 세르핀 루프)의 정렬
Figure 112005056139913-PCT00003
a 파지-디스플레이 무작위 펜타펩티드 라이브러리를 이용한 칼리크레인 hK2에서 선택된 기질 펩티드.
단순형 잔기는 rACTWT에 일반적인 것이고, 블록 및 밑줄 잔기는 ACT 변이체의 RSL 내에 재위치된 기질 펩티드에 해당한다. 기질 펩티드 내의 hK2의한 끊어지기 쉬운 결합은 ↓로 표시되었고 세르핀 내의 잠정 절단 부위는 P1-P1' 잔기 사이에 별표로 표시되었다.
억제성 분석 및 억제 화학양론( SI )
억제 화학양론(SI) 값은 hK2 및 다른 효소를 가지는 rACTWT 및 이의 변이체의 억제에 대해 측정되었다. 초기 시험은 hK2, PSA, hK1, 키모트립신(Chtr)에 걸친 rACT(100 배(fold))의 몰 과잉에 의하여 만들어졌다. 반응은 완충 용액(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0,05% 트리톤 X-100, 0,01% BSA) 내에서 25℃에서 30분(PSA의 경우 37℃에서 90분) 동안 수행되었고, 잔여 효소 활성도는 형광체 기질을 첨가하여 측정되었다(hK1, hK2 및 PK의 경우 Z-Phe-Arg-AMC, Chtr의 경우 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMCr, uPA의 경우 Z-Gly-Gly-Arg-AMC, HNE의 경우 MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC , 및 PSA의 경우 CFP-TFRSA-YFP). 억제자의 존재 내에서 효소의 활성도가 억제자가 없는 반응과 비교되었다. 억제가 관찰된 반응에서 SI는 재조합 세르핀을 다른 농도에 배양함으로써 확인되었다. 분획 활성도(억제 효소 반응의 속도/비억제 효소 반응의 속도)와 효소 억제자의 몰비([I0]/[E0])간의 선형 회귀 분석을 사용 하여, 가로좌표 억제에 상응하는 억제 화학양론을 얻었다.
동역학
hK2, 키모트립신, PK 및 HNE과 다른 rACT간의 상호작용에 대한 결합속도상수는 진행 곡선법을 이용한 위일차(pseudo-first) 조건 하에서 결정되었다(Morrison JF , Walsh CT . 1988 "The behavior and significance of slow-binding enzyme inhibitors" Adv . Enzymol . Relat. Areas Mol . Biol 61, 201-301). 이들 조건 하에서 효소의 고정량(2nM)은 다른 농도의 억제자(0 - 800nM) 및 과잉 기질(10μM)과 혼합되었다. 각 반응은 45분 동안 25℃에서 반응완충용액(50mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 0,05% 트립톤 X-100, 0,01% BSA) 내에서 제조되었으며, 생성물 형성속도는 FLx800 형광 96-우수 마이크로평판 리더기(Biotek, 미국)를 이용하여 측정되었다. 이 모델에서, 억제는 반응 코스에 걸쳐 비가역적이라고 사료되고 효소 활성도의 진행은 생성물 형성(P), 초기 속도(v2)에 의해 표현되고, 일차속도(k obs)에서 경과시간(t)에 걸쳐 억제되고, 속도상수는 억제자 농도에만 의존한다.
P = (v z/k obs) [1 - e(- k obs t )] 식 1
각 억제자대해서, 4개의 다른 농도에 대한 k obs는 식 1을 사용한 데이타의 비선형 회귀에 의하여 측정하였다. k obs를 억제자 농도 [I]에대해서 플롯팅에 의하여, 곡선의 기울기(k = Dk obs / D[I])인 이차 속도 상수, k'을 얻었다. 억제자 및 기질 사이의 경쟁으로 인하여, 아래 식 2는 기질 농도 [S] 및 이 기질의 효소에 대한 Km을 고려하여 이차 속도 상수 k'를 정정하여 하기의 k a를 얻었다.
k a = (1 + [S] / Km) k' 식 2
hK2의 Z-FR-AMC에 대한, 키모트립신의 Suc-AAPF-AMC에 대한, PK의 Z-FR-AMC에 대한 및 HNE의 MeOSuc-AAPV-AMC에 대한 Km은 각각 67μM, 145μM, 170μM 및 130μM이었다.
복합체 형성 및 억제자 절단의 웨스턴 블롯 ( Western blot ) 분석
칼리크레인 hK2는 50mM Tris, 200mM NaCl, 0,05% 트립톤 X-100 내에서 100:1의 [I]0:[E]0 비로 다른 재조합 ACT와 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 단백질 샘플들은 5분 동안 95℃에서 가열되었고, SDS-PAGE(12% 아크릴아미드 19:1 T:C 비)에 의해 분리되며, Hybond-ECL (Amersham Pharmacia) 니트로셀룰로오즈 내에서 전기 블롯트되었다. 자유-hK2 및 hK2-ACT 복합체는 생쥐의 항-hK2 단일클론 항체 및 알카리성 인산절단효소 결합된 산양 항-생쥐 이차 항체를 이용하여 검출되었다. 웨스턴 블롯은 ECL 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 가시화되었다. 또한 hK2는 50mM Tris, 200mM NaCl, 0,05% 트립톤 X-100에서 10:1의 [I]0:[E]0 비에서 25℃에서 30분(열역학 조건) ACT8 .3 또는 ACT6 .7로 배양되었다. 단백질은 상술한 이차항체 및 프로토콜을 가지고 검출에 따른 항-His6 단일클론 항체을 이용하여, 웨 스턴 블롯에 의하여 검출되었다.
가용성 재조합 야생형 및 변이체 ACT 의 생성
야생형 세르핀 α1-항키모트립신은 칼리크레인 hK2에 특이적인 억제자를 개발하는데 이용되었다. rACTWT의 RSL 구조에 위치된 잔여 P3-P3'은 상술한 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 의하여 미리 선택된 기질 펜타펩티드에 의하여 치환되었다. 표 1에 기재된 rACT 6개 변이체들은 설계 및 구성되었다. 펩티드 기질 내에서 끊어지기 쉬운 결합은 세프핀의 RSL 내에서 Leu-358-Ser-359에 따라 정렬되었다. rACTWT 및 이의 변이체은 N-말단 위치에서 His 태그를 포함하는 융합(fusion) 단백질로 대장균 TG1 내에서 발현되었다. 이들 각각은 주로 활성 가용성 형태로 주요하게 단백질 축적되도록 저온에서 생성되었다. 자연조건 하에서 정제되는 경우, 생성물의 수준은 1.0 내지 2.5mg/L로 다양하였다. 정제된 세르핀의 순도는 예를 들어, 변이체 6.1 (통로 1) 및 야생형 ACT (통로 2)와 같이 SDS-PAGE 분석에 의해 추정된 것과 같이 98% 이상이었다(도 1).
칼리크레인 hK2 에 주요 특이적인 rACT 변이체
인간 뉴트로필 엘라스타아제, 키모트립신유사(Chtr, PSA 또는 hK3) 및 트립신유사(hK2, hK1, PK, uPA) 프로테이나아제를 포함하는 효소 패널은 rACT 변이체의 억제 특이성을 결정하기 위하여 선별되었다(표 5).
표 5
rACTWT 및 이의 변이체의 억제 프로필
Figure 112005056139913-PCT00004
a 아미노산 서열은 hK2에 의해 선택된 기질 펩티드에 상응하는 재조합 ACT의 RSL(반응성 세르핀 루프)내에서 절단되었다.
b 프로테아제 및 세르핀은 100:1의 [I]0:[E]0 비에서 25℃에서 30분(PSA를 위해 37°에서 90분) 동안 배양되었다. 억제 퍼센트는 100 x (1-(억제자 존재 하의 속도/비억제된 제어 속도))에 상응한다.
30분 동안 과량의 억제자(100:1의 [I]0:[E]0)로 배양된 hK2는 rACT6.2, rACT8.3, rACT6.7 및 rACT6.1에 의하여 완전히 억제되었고, 반면에 rACT8.20 및 rACT5.18,은 각각 95% 및 73% 효소 활성도로 억제되었다. 이 조건 하에서, 야생형 rACT는 hK2에 대해서 억제 활성도를 나타내지 않았다. 이들 변이체 중, 둘(rACT8.20 및 rACT5 .18)은 다른 실험된 효소를 억제함이 없이 hK2에 특이성을 나타냈다. 두 가지 다른 변이체, rACT6 .7 및 rACT6 .2는 각각 36% 및 100%의 억제를 PK에 대해서 나타냈다. 야생형 ACT로서, 변이체 rACT8 .20은 두 가지 키모트립신-유사 프로테아제 Chtr 및 PSA 뿐만 아니라 PK 및 HNE도 억제하였다. 재조합 세르핀의 어느 것도 칼리크레인 hK1 및 uPA에 대한 억제 활성도를 나타내지 않았다.
hK2 에 대한 변이체 ACT 의 억제 화학양론은 야생형 ACT 와 비교하여 현저히 향상
억제자의 화학양론적 결과는 가장 가치있는 비교를 확인하기 위하여 모든 효소의 pH 및 이온 강도의 생리적 조건 하에서 이루어졌다. 재조합 야생형 ACT는 키모트립신과의 SI값이 2 였으며(표 6), 이는 유사한 조건하에서 상업적 ACT과 얻어진 값과 동일하였다(데이타 나타나지 않았음).
표 6
rACTWT 및 이의 변이체와 hK1 및 다른 프로테아제와의 반응에 대한 억제치 및 이차 속도 상수(Ka) 의 화학양론 비교
Figure 112005056139913-PCT00005
a 보고된 SI값은 I/E 비를 추정하기 위한 선형 회귀 분석을 이용하여 측정되었다.
c hK2에 의한 선택된 기질 펩티드에 상응하는 재조합 ACT의 RSL(반응 세르핀 루프) 내의 P3-P3' 잔기의 아미노산 서열.
c 재조합 ACT의 RSL(반응성 세르핀 루프) 내의 P3-P3' 잔기의 아미노산 서열은 hK2에 의한 선택된 기질 펩티드에 상응한다.
-, 억제 활성도가 검출되지 않았음.
모든 재조합 변이체의 SI 값을 얻기 위하여, 출원인은 반응 완충용액에서 30 분 동안 25℃에서, rACT8 .20(x), rACT6 .2(□), rACT8 .3(△), rACT6 .7(◇), rACT6 .1(*), rACT5.18(○), rACTWT(+)의 다른 농도(6.25 - 500nM)에서 hK2(5nM)를 배양한다. hK2를위한 잔기 활성도(속도)는 형광 기질(10μM) Z-FR-AMC 첨가에 의하여 검사되었다.
부분속도는 비억제 제어(Vo) 속도에 대한 억제 효소의 속도(Vi)의 비에 상응한다. SI는 I/E 비를 외삽입(예를 들면 x 삽입)으로 산정하여 선형 회귀 분석을 사용하여 얻었다. 도 2에 도시된 바와 같이 모든 신규하게 구성된 ACT의 변이체는 야생형 ACT보다 hK2와의 SI 값이 더 낮게 나타났다. 이들 변이체 중 rACT6 .7, rACT6 .1 및 rACT6 .2는 hK2에 대해 가장 낮은 화학양론의 억제값(각각 9, 19 및 25)을 나타냈다. 반면에 rACT6 .2 및 rACT6 . 7는 PK에 대해 가장 낮은 SI값(18 및 16)을 나타냈고, rACT6.7의 SI값은(277) 훨씬 높게 나타났다. hK2에 특이성이 있는 두 가지 재조합 ACT, vrACT8 .3 및 rACT5 . 18는 각각 34 및 139의 더 높은 SI비를 나타냈다. rACT8 .20 억제자의 SI값은 hK2를 포함한 모든 실험 프로테아제에 대해서 100을 초과하였다.
억제자 절단 없이 hK2 와 안정된 복합체를 형성하는 변이체 ACT
hK2는 100:1의 I:E 비로 rACT8 .20, rACT6 .2, rACT8 .3, rACT6 .7, rACT6 .1, rACT5.18 및 야생형 rACT와 37℃에서 3시간 배양되었다. hK2 (rACT8 .20(통로 1), rACT6.2(통로 2), rACT8 .3(통로 3), rACT6 .7(통로 4), rACT6 .1(통로 5), rACT5 .18(통로 6) 및 야생형 rACT(통로 7))를 가지는 rACT의 반응 결과의 웨스턴 블롯 분석은 효소와의 상호작용 후 억제자의 운명을 결정하기 위하여 생주 항-hK2 항체를 이용한 환원 조건하에서 수행하였다. 도 3A는 hK2가 ACT 변이체와 배양될 때, 자유 hK2(E)는 공유결합 복합체(EI)를 형성하기 위하여 완전히 제거되었다. 이 공유결합 복합체는 16시간 배양 기간(데이타는 나타나지 않음) 이상 해체되지 않도록 높은 안정성을 나타내었다. 야생형 ACT는 3 더 천천히 hK2를 억제하여, 시간 배양 후 대부분은 복합체를 형성하지 않았다. hK2로 측정된 높은 SI값은 ACT 변이체 억제자의 절단를 형성하는 비복합체에 기인하지 않는다.
더욱이 rACT8 .3(통로 1) 및 rACT6 .7(통로 3) 상에서 10:1의 I:E비에서 운동 조건(25℃에서 30분) 하에서 hK2(웨스턴 블롯 상의 각각 통로 2 및 4)와 배양되었다. 복합체 형성은 생쥐 단일클론 항-his 태그를 이용한 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다(도 3B). 모든 억제 단백질은 hK2로 복합화되거나 절단 상태로 존재하였고, 이는 세르핀-효소 상호작용에 대한 가능한 기질 경로를 나타났다.
hK2 의 가장 높은 결합 상수를 나타내는 변이체 ACT
변이체 ACT와의 억제 반응속도는 이들 억제자와 반응성을 나타내는 각 프로테아제에 의하여 결정된다. 결국, hK2 및 재조합 세리핀의 상호작용은 진행 곡선법을 이용한 위일차(pseudo-first) 조건 하에서 측정되었다. hK2(2nM) 및 Z-FR-AMC(10μM) 기질은 다양한 양의 억제자(20n - 800nM), rACT8.20(◇), rACT5.18(+)(도 4A) 및 억제자 rACT6.2(○), rACT8.3(□), rACT6.7(△), rACT6.1(x)(도 4B)에 첨가되었다. 대표적 전행 곡선은 식 1을 이용한 비선형 회귀분석을 행하였고 속도(kobs)는 세르핀 농도에 대하여 플롯트되었다. kobs를 얻은 후, 결합 상수(ka)는 이의 해당하는 기질에서 프로테아제의 Km을 이용하여 계산되었다. 키모트립신을 가지는 야생형 ACT의 ka값은 공개된 데이타(Cooley et al . 2001 "The serpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteases through efficient reactions at two active sites" Biochemistry 40, 15762-70))와 동일하였다. 재조합 rACT6 . 7는 hK2와 최고의 ka(8991 M-1S-1)를 나타내었으며, 반면에 PK에서 얻어진 hK2는 45배 나빴다.대조적으로 재조합 rACT6.2는 hK2 및 PK와의 ka가 동일하였으며, 이는 두 프로테나아제 사이의 차별성의 부족을 강조한다. hK2 특이성 재조합 억제자 rACT8.3 및 rACT5 .18의 ka값은 각각 2439 및 595M-1S-1로 낮았고, 반면에 비특이성 rACT8.20는 Chtr, PK 및 HNE와 비교하여 우수한 ka인 1779M-1S- 1를 나타내었다. 재조합 세르핀 중 하나, rACT6 . 2은 hK2에서 보다 PK에서 더 고속으로 반응하였다.
실시예 2
인간 hK2 및 hK3 프로테아제에 특이적인 재조합 ACT 억제자의 개발
rACTWT의 RSL 구조에 위치하는 잔기 P3-P3'는 실시예 1에 기재된 바와 같이, 단백질 C 억제자(PCI)(표 7)의 RSL을 암호화하는 기질 펜타펩타이드로 대체되었다.
표 7
재조합 세르핀 ACT , PCI 및 ACT PCI 의 RSL 정렬
Figure 112005056139913-PCT00006
단순형 잔기는 rACTWT에 일반적인 것이고, 블록 및 밑줄 잔기는 ACT 변이체의 RSL 내에 재위치된 기질 펩티드에 해당한다. 기질 펩티드 내의 끊어지기 쉬운 결합은 ↓로 표시되었고 세르핀 내의 잠정 절단 부위는 P1-P1' 잔기 사이에 별표로 표시되었다.
간단하게, 재조합 단백질 ACTPCI (MDCI)를 생산하기 위해서, TG1 세포를 상응하는 구축물로 적절한 배양 배지에서 성장시켰다. 세포를 16시간 동안 16 ℃에서 최적 밀도로 유도하여 재조합 억제자를 발현시켰다. 재조합 억제자 ACTPCI 는 박테리아 세포질로부터 추출하여 이전 실시예에서 기재된 바와 같이 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 친화 크로마토그래피로 분리하였다.
SDS - PAGE 에 의한 재조합 ACT 발현 분석
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 2에서 개발된 여러 억제자의 순도는 환원성 조건하에서 SDS-PAGE 분석으로 테스트하였다.
억제자의 평가
상기 억제자들은 인간 칼리크레인 hK2 및 hK3 (도 6) 및 플라스마 칼리크레인, 트립신, 유로키나아제, 엘라스타아제, 트롬빈, hK14 및 인간 칼리크레인 8 (표 8)을 억제하는 특이성 및 친화도를 평가하기 위하여 추가로 분석하였다.
상기 두 효소는 다른 효소적 특이성(hK2: 트립신 유사, hK3: 키모트립신 유사)을 가지지만, ACT에 의하여 자연적으로 억제된다. ACT가 혈액 순환에서 자연적인 hK3 억제자로 고려되지만, hK2에 대한 억제는 좀더 약하다.
rACTs 및 인간 칼리크레인 사이의 억제작용은 도 6에 나타난 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. ACT의 각 변이체를 위해, 생리적인 조건하에서 1μg의 억제자와 100 ng의 hK2 또는 hK3 를 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.
모노클로날 항체 항 hK2 9D5를 이용한 탐지 결과가 도 6A에 나타나 있다.
라인 1　: hK2 only, 2　: 상업용 ACT + hK2, 3　: 야생형 ACT + hK2, 4　: MD820 + hK2, 5　: MDCI + hK2, 6　: MD62 + hK2, 7　: MD61 + hK2,
도 6B는 항체 항-His(재조합 ACT 단백질 위에 존재하는 태그)를 이용한 hK3-ACT 복합체의 탐지를 보여준다)
라인 1: PSA, 2: PSA + ACT, 3: 야생형 ACT + PSA, 4　: MD820 + PSA, 5　: MDCI + PSA, 6　: MD62 + PSA, 7　: MD61 + PSA.
hK2 특이성을 위해 선택되는 기질 서열을 이용한 반응성 루프 내 아미노산의 변화는 hK3을 억제하지 않고 ACT를 hK2 (MD820, MD61, MD62)에 매우 특이적인 억제자로 변화시켰다. 이러한 결과는 이전에 표 4에 나타낸 것들을 확인시켜 준다.
야생형 또는 상업적인 α1-항키모트립신-이것은 같은 양의 hK2를 억제하기 위하여 12 시간 이상의 배양 시간을 요구한다(데이타 없음)-과 비교할 때 단지 MDCI, MD61 및 MD62 만이 3분 이하(같은 조건하)에서 모든 hK2 단백질을 억제하면서 hK2에 매우 높은 친화도를 가지는 억제자이다.
표 8
MD CI 의 억제 프로필
Figure 112005056139913-PCT00007
실시예 3 :
MD 억제자에 의한 종양 성장의 억제
3.1 MD 62 및 MD 67 억제자에 의한 종양 성장의 억제
안드로겐-비의존성 인간 전립선 아데노카시노마 세포주 DU-145 를 American Type Culture Collection으로부터 얻었다. hK2 유전자로 형질전환된 DU-145 세포(DU145/hK2)를 얻기 위하여 레트로바이러스 기법이 이용되었다.
대수적으로 성장하는 DU145/hK2 세포를 모으고 1 또는 10ug의 억제자를 포함하고 있는 DMEM (Invitrogen)에서 7.5 x 107 세포/ml 의 농도로 재현탁 하였다. 상기 세포 현탁액은 마트리겔(BD Biosciences)과 1:2 비로 섞어 8주령의 웅성 athymic Swiss 누드 마우스(2 마리/군)의 좌우측 측면에 피하 주사(3 x 106 세포 /40ml) 하였다. 각 마우스는 두 부위에 접종하였다. 종양 접종 후 6, 12 및 18 일에 50 또는 10mg의 MD62, MD67 또는 100mg 또는 10mg 의 ACT-WT를 피하 주사하였다. 종양 접종 후 24, 30, 33, 36, 39 및 41일에 25 또는 5mg 의 억제자 (MD62 및 MD67) 또는 50 mg 또는 5 mg 의 ACT-WT를 피하 주사하였다.
도 10A는 MD 62에 의한 종양 성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2로 형질전환된 전립선 암세포 DU-145(3 x 106 세포)를 누드 마우스에 이식하고 MD 62(5 또는 25mg/주사)로 처리하였다.
도 10B는 MD 67에 의한 종양 성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2로 형질전환된 전립선 암세포 DU-145(3 x 106 세포)를 누드 마우스에 이식하고 MD 67(5 또는 25mg/주사)로 처리하였다.
3.2 MD CI 억제자에 의한 종양 성장 억제
안드로겐-비의존성 인간 전립선 아데노카시노마 세포주 DU-145 를 American Type Culture Collection으로부터 얻었다. hK2 유전자로 형질전환된 DU-145 세포(DU145/hK2)를 얻기 위하여 레트로바이러스 기법이 이용되었다.
대수적으로 성장하는 DU145/hK2 세포를 모으고 1 또는 10ug의 억제자를 포함하고 있는 DMEM (Invitrogen)에서 7.5 x 107 세포/ml 의 농도로 재현탁 하였다. 상기 세포 현탁액은 마트리겔(BD Biosciences)과 1:2 비로 섞어 8주령의 웅성 athymic Swiss 누드 마우스(2 마리/군)의 좌우측 측면에 피하 주사(3 x 106 세포/40ul) 하였다. 각 마우스는 두 부위에 접종하였다. 종양 접종 후 6, 12 및 18 일에 100mg 또는 10mg 의 MDCI 또는 ACT-WT를 피하 주사하였다. 종양 접종 후 24, 30, 33, 36, 39 및 41일에 50 mg 또는 5 mg 의 MDCI 또는 ACT-WT를 피하 주사하였다.
도 11은 MD CI에 의한 종양 성장 억제를 나타낸다. 인간 칼리크레인 2로 형질전환된 전립선 암세포 DU-145(3 x 106 세포)를 누드 마우스에 이식하고 MD CI(5 또는 50mg/주사)로 처리하였다.
<110> Universite de Lausanne <120> Chimeric inhibitor proteins of a protease and use therefor <130> IPF6961 <150> US 60/460,345 <151> 2003-04-04 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variants, MD 820 <400> 1 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcacc ctccgttctc gagcagtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 2 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variants, MD 820 <400> 2 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Thr Leu Arg Ser Arg Ala Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 3 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variant, MD 62 <400> 3 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcacc aggaggtcta tcgatgtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 4 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variant, MD62 <400> 4 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Thr Arg Arg Ser Ile Asp Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 5 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variant, MD 83 <400> 5 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcagg gggagatctg agttagtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 6 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variant, MD 83 <400> 6 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Arg Gly Arg Ser Glu Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 7 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variant, MD 67 <400> 7 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcaag cttagaacaa cattagtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 8 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variant, MD 67 <400> 8 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Lys Leu Arg Thr Thr Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 9 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variant, MD 61 <400> 9 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcatg acaagatcta acgcagtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 10 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variant, MD 61 <400> 10 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Met Thr Arg Ser Asn Ala Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 11 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variants, MD 518 <400> 11 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcacc gagcgtgtct cgcccgtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 12 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variants, MD 518 <400> 12 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Thr Glu Arg Val Ser Pro Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 13 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence ACT variants, MD CI <400> 13 atgagaggat cccatcacca tcaccatcac tctagacacc ctaacagccc acttgacgag 60 gagaatctga cccaggagaa ccaagaccga gggacacacg tggacctcgg attagcctcc 120 gccaacgtgg acttcgcttt cagcctgtac aagcagttag tcctgaaggc ccctgataag 180 aatgtcatct tctccccact gagcatctcc accgccttgg ccttcctgtc tctgggggcc 240 cataatacca ccctgacaga gattctcaaa ggcctcaagt tcaacctcac ggagacttct 300 gaggcagaaa ttcaccagag cttccagcac ctcctgcgca ccctcaatca gtccagcgat 360 gagctgcagc tgagtatggg aaatgccatg tttgtcaaag agcaactcag tctgctggac 420 aggttcacgg aggatgccaa gaggctgtat ggctccgagg cctttgccac tgactttcag 480 gactcagctg cagctaagaa gctcatcaac gactacgtga agaatggaac tagggggaaa 540 atcacagatc tgatcaagga ccttgactcg cagacaatga tggtcctggt gaattacatc 600 ttctttaaag ccaaatggga gatgcccttt gacccccaag atactcatca gtcaaggttc 660 tacttgagca agaaaaagtg ggtaatggtg cccatgatga gtttgcatca cctgactata 720 ccttacttcc gggacgagga gctgtcctgc accgtggtgg agctgaagta cacaggcaat 780 gccagcgcac tcttcatcct ccctgatcaa gacaagatgg aggaagtgga agccatgctg 840 ctcccagaga ccctgaagcg gtggagagac tctctggagt tcagagagat aggtgagctc 900 tacctgccaa agttttccat ctcgagggac tataacctga acgacatact tctccagctg 960 ggcattgagg aagccttcac cagcaaggct gacctgtcag ggatcacagg ggccaggaac 1020 ctagcagtct cccaggtggt ccataaggct gtgcttgatg tatttgagga gggcacagaa 1080 gcatctgctg ccaccgcggt caaaatcacc tttagatctg cattagtgga gacgcgtacc 1140 attgtgcgtt tcaacaggcc cttcctgatg atcattgtcc ctacagacac ccagaacatc 1200 ttcttcatga gcaaagtcac caatcccaag caagcctaa 1239 <210> 14 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence ACT variants, MD CI <400> 14 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Arg His Pro Asn Ser 1 5 10 15 Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg Gly Thr 20 25 30 His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala Phe Ser 35 40 45 Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Pro Asp Lys Asn Val Ile Phe 50 55 60 Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu Gly Ala 65 70 75 80 His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Leu Lys Phe Asn Leu 85 90 95 Thr Glu Thr Ser Glu Ala Glu Ile His Gln Ser Phe Gln His Leu Leu 100 105 110 Arg Thr Leu Asn Gln Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met Gly Asn 115 120 125 Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys Asn Gly 165 170 175 Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Ser Gln Thr 180 185 190 Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Met 195 200 205 Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu Ser Lys 210 215 220 Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu Thr Ile 225 230 235 240 Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu Leu Lys 245 250 255 Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln Asp Lys 260 265 270 Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys Arg Trp 275 280 285 Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu Pro Lys 290 295 300 Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr 325 330 335 Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Ala Val Leu 340 345 350 Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala Val Lys 355 360 365 Ile Thr Phe Arg Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe 370 375 380 Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile 385 390 395 400 Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala 405 410 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of ACT wild type <400> 15 Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD820 <400> 16 Val Lys Ile Thr Leu Arg Ser Val Glu 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of ACT 62 <400> 17 Val Lys Ile Thr Arg Ser Ile Asp Val Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD83 <400> 18 Val Lys Ile Arg Gly Arg Ser Glu Leu Val Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD 67 <400> 19 Val Lys Ile Leu Arg Thr Thr Leu Val Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD 61 <400> 20 Val Lys Ile Met Thr Arg Ser Asn Ala Val Glu 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD 518 <400> 21 Val Lys Ile Thr Glu Arg Ser Pro Val Glu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL of MD CI <400> 22 Val Lys Ile Thr Glu Arg Ser Pro Val Glu 1 5 10

Claims (38)

  1. a) 억제 폴리펩티드 서열; 및
    b) 적어도 하나이상의 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열을 포함하는 프로테아제의 키메라(chimeric) 억제 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 기질-효소 상호작용 부위의 폴리펩티드 서열은 기질 활성 부위(substrate active site) 서열, 이의 단편(fragments), 이의 분자 키메라(chimera), 이의 조합(combination) 및/또는 이의 변이체(variant)인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 기질 활성 부위 서열은 반응성 세르핀 루프(Reactive Serpin Loop) 서열, 이의 단편들, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체들인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 반응성 세르핀 루프 서열은 서열번호 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 이의 단편들, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체들을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제는 칼리크레인(kallikrein), 키모트립신(chymotrypsin, Chtr), 우로키나아제(urokinase, uPA), 및 인간 뉴트로필(neutorphile) 엘라스타아제(elastase)(HNE) 효소를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 칼리크레인은 hK2 칼리크레인 단백질인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제 폴리펩티드 서열은 세린(serine) 또는 시스테인(cysteine) 프로테 아제의 억제 폴리펩티드 서열인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 억제 폴리펩티드 서열은 세르핀(serpin) 서열, 이의 단편들, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체들인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 세르핀 서열은 α-1 항키모트립신(α-1 antichymotrypsin, ACT), 단백질 C 억제자(PCI), α-1 항프로테나제(α-1 antiproteinase, AAT), 인간 α-1 항트립신-관련 단백질 전구체(ATR), α-2-플라스민(α-2-plasmin) 억제자, 인간 항-트롬빈(thrombin)-Ⅲ 전구체(ATⅢ), 프로테아제 억제자 10(PI10), 인간 콜라겐-결합 단백질 2 전구체(CBP2), 프로테아제 억제자 7(PI7), 프로테아제 억제 뉴세르핀(leuserpin) 2(HLS2), 인간 플라스마 프로테아제 C1 억제자(C1 INH), 모노사이트(monocyte)/뉴트로필(neutrophil) 엘라스타아제 억제자(M/NEI), 플라즈미노겐(plasminogen) 활성 억제자-3(PAI3), 프로테아제 억제자 4(PI4), 프로테아제 억제자 5(PI5), 프로테아제 억제자 12(PI12), 인간 플라즈미노겐 활성 억제자-1 전구체 내피(endothelial)(PAI-1), 인간 프라즈미노겐 활성 억제자-2 태반(placental)(PAI2), 인간 상피세포(pigment epithelium)-유도 인자 전구체(PEDF), 프로테아제 억제자 6(PI6), 포로테아제 억제자 8(PI8), 프로테아제 억제자 9(PI9), 인간 편상상피 세포 암종 항원(squamous cell carcinoma antigen) 1(SCCA-1), 인간 편상상피 세포 암종 항원 2(SCCA-2), T4-결합 글로불린(TBG), 메그신(Megsin) 및 프로테아제 억제자 14(PI14), 이의 단편들, 이의 분자 키메라, 이의 조합 및/또는 이의 변이체들을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제 키메라 억제 단백질은 MD 820, MD 62, MD 61, MD 67 및 MD CI를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 프로테아제 키메라 억제 단백질은 MD 62 또는 MD 67인 것을 특징으로 하는 프로테아제의 키메라 억제 단백질.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 암호화하는 분리 정제된 DNA 서열.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리 정제된 DNA 서열.
  14. 청구항 12 내지 13 중 어느 한 항의 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 분리 정제된 DNA 서열에 작동되게 연결된 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 청구항 14 또는 15의 발현 벡터로 트랜스펙션된 진핵 또는 원핵 숙주 세포.
  17. 활성제(active agent)로서 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 포함하고, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 조합되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 청구항 17의 약학적 조성물을 포유류에 투여하는 것을 포함하는 상기 포유류 내에서 단백질 분해와 관련된 질환(proteolysis-associated disorder)을 치료 또는 예방하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 질환은 hK2 칼리크레인 활성의 유해로 인하여 생기는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서,
    상기 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환인 것을 특징 으로 하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암 또는 전이성암인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 20에 있어서,
    상기 염증성 질환은 양성 전립선 비대증(Benign Prostatic Hypertrophy)인 적을 특징으로 하는 방법.
  23. 포유류의 단백질 분해와 관련된 질환를 치료 또는 예방하기 위한 청구항 17의 약학적 조성물의 용도.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 질환은 hK2 칼리크레인 활성의 유해로 인하여 생기는 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  25. 청구항 23 또는 24에 있어서,
    상기 질환은 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암 또는 전이성암인 것을 특징으로 하는 용도.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 염증성 질환은 양성 전립선 비대증(Benign Prostatic Hypertrophy)인 적을 특징으로 하는 용도.
  28. a) 프로테아제에 특이적인 기질-효소 상호작용 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계;
    b) 키메릭 서열을 얻기 위하여 세린 또는 시스테인 프로테아제의 억제 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;
    c) 적절한 조건하에서 세포 발현계에서 상기 키메라 서열의 발현을 허용하는 단계; 및
    d) 상기 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 청구항 1 내지 11항 중 어느 한 항의 프로테아제의 키메라 억제 단백질을 생산하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 단계 a)는 파지-디스플레이 라이브러리 스크리닝(phage-displayed library screening)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 28 및 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적절한 조건은 온도 10 내지 40 ℃에서 10 내지 30시간 동안 세포 발현계에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 적절한 조건은 온도 16℃에서 16시간 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 청구항 28 내지 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)는 세포 발현계에서 상기 프로테아제의 키메라 억제 단백질의 추출 후 분리에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 프로테아제의 키메라 억제 단백질의 분리는 친화성 크로마토그래피에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 28 내지 33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제의 키메라 억제 단백질은 프로테아제의 활성을 억제할 수 있는 능력에 대해 더 효력 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 28 내지 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 발현계는 진핵 세포 또는 원핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 원핵 제포는 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 이들의 상보서열, 이의 단편들 및/또는 이의 변이체들을 포함하는 군으로부터 선택된 적합하고 분리 정제된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내에 프로테아제 검출을 위한 진단 키트.
  38. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 포르테아제의 키메라 억제자를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내에 프로테아제 검출을 위한 진단 키트.
KR1020057018938A 2003-04-04 2004-04-05 프로테아제 억제 단백질 및 그 이용 Expired - Lifetime KR101296367B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46034503P 2003-04-04 2003-04-04
US60/460,345 2003-04-04
PCT/IB2004/001040 WO2004087912A1 (en) 2003-04-04 2004-04-05 Inhibitor proteins of a protease and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060010740A true KR20060010740A (ko) 2006-02-02
KR101296367B1 KR101296367B1 (ko) 2013-08-14

Family

ID=33131923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057018938A Expired - Lifetime KR101296367B1 (ko) 2003-04-04 2004-04-05 프로테아제 억제 단백질 및 그 이용

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8975370B2 (ko)
EP (1) EP1616007B1 (ko)
JP (1) JP4754478B2 (ko)
KR (1) KR101296367B1 (ko)
CN (1) CN1798838B (ko)
AU (1) AU2004225718B2 (ko)
BR (1) BRPI0409557B8 (ko)
CA (1) CA2521410C (ko)
CY (1) CY1114526T1 (ko)
DK (1) DK1616007T3 (ko)
ES (1) ES2431548T3 (ko)
IL (1) IL171158A (ko)
MX (1) MXPA05010574A (ko)
NO (1) NO334459B1 (ko)
PL (1) PL1616007T3 (ko)
PT (1) PT1616007E (ko)
SG (1) SG161106A1 (ko)
SI (1) SI1616007T1 (ko)
WO (1) WO2004087912A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2290098A1 (en) 2002-01-28 2011-03-02 Ambion, Inc. Preparing crude biological extracts using protease, suitable for preparing cDNA
WO2006090282A2 (en) * 2005-02-28 2006-08-31 Universite De Lausanne Recombinant inhibitor proteins of an hk14 protease and use thereof
US7964350B1 (en) 2007-05-18 2011-06-21 Applied Biosystems, Llc Sample preparation for in situ nucleic acid analysis
CA2712512C (en) * 2008-01-21 2018-08-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of serine protease inhibitors in the treatment of skin diseases
US8211637B2 (en) * 2008-12-19 2012-07-03 Life Technologies Corporation Proteinase K inhibitors, methods and compositions therefor
WO2010103475A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Med Discovery Sa Use of serine protease inhibitors in the treatment of neutropenia
US8652793B2 (en) * 2011-05-26 2014-02-18 Baxter International Inc. Solid phase-bound elastase-binding assay for the measurement of alpha1-antitrypsin activity
CN103044542B (zh) * 2012-08-17 2015-08-19 常熟理工学院 鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用
CN117169519B (zh) * 2023-10-26 2024-01-30 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于检测样本中tt3和/或tt4的解离剂和试剂盒

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
DK0462207T3 (da) * 1989-03-06 2001-06-18 Univ Texas t-Pa mutanter resistente mod deres respektive inhibitorer
US5612194A (en) * 1989-06-23 1997-03-18 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of producing effective recombinant serine protease inhibitors and uses of these inhibitors
US5827662A (en) 1989-06-23 1998-10-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for detecting genetic mutations resulting in protease inhibitor insufficiencies
US5723316A (en) * 1989-06-23 1998-03-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania α-1-antichymotrypsin analogues having chymase inhibiting activity
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
DE69533472T2 (de) 1994-01-11 2006-01-12 Dyax Corp., Cambridge Kallikreinhemmende "kunitz-domäne"-proteine und derivaten davon
US6284873B1 (en) 1999-03-12 2001-09-04 Hybritech Incorporated Complex of human kallikrein 2 (hK2) and protease inhibitor-6 (PI-6) in prostate tumor tissue and methods of using the complex

Also Published As

Publication number Publication date
CA2521410A1 (en) 2004-10-14
CN1798838A (zh) 2006-07-05
AU2004225718B2 (en) 2009-11-05
NO20055210L (no) 2005-12-23
KR101296367B1 (ko) 2013-08-14
PL1616007T3 (pl) 2013-12-31
US8975370B2 (en) 2015-03-10
JP2006523097A (ja) 2006-10-12
EP1616007B1 (en) 2013-07-24
PT1616007E (pt) 2013-10-28
AU2004225718A1 (en) 2004-10-14
IL171158A (en) 2011-05-31
JP4754478B2 (ja) 2011-08-24
SI1616007T1 (sl) 2013-12-31
DK1616007T3 (da) 2013-10-28
SG161106A1 (en) 2010-05-27
EP1616007A1 (en) 2006-01-18
NO20055210D0 (no) 2005-11-04
WO2004087912A8 (en) 2005-01-20
US20060269536A1 (en) 2006-11-30
CA2521410C (en) 2014-06-03
BRPI0409557B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0409557A (pt) 2006-04-18
BRPI0409557B1 (pt) 2019-07-23
WO2004087912A1 (en) 2004-10-14
MXPA05010574A (es) 2006-03-09
NO334459B1 (no) 2014-03-10
CY1114526T1 (el) 2016-10-05
ES2431548T3 (es) 2013-11-26
CN1798838B (zh) 2012-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2894354B2 (ja) 組換えｄｎａ技術によつて産生されたウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異型、それらの方法、発現ベクターおよび組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用
CZ284911B6 (cs) Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu
CN110522905A (zh) 丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗皮肤病中的用途
SI9520043A (en) Methods of producing effective recombinant serine protease inhibitors and uses of these inhibitors.
CZ164694A3 (en) Human variant of kunitz-type protease inhibitor
KR101296367B1 (ko) 프로테아제 억제 단백질 및 그 이용
JP2916228B2 (ja) 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用
US7183391B2 (en) Kunitz domain polypeptide zkun10
CA2430973A1 (en) Multifunctional protease inhibitors and their use in treatment of disease
Bourbonnais et al. Production of full-length human pre-elafin, an elastase specific inhibitor, from yeast requires the absence of a functional yapsin 1 (Yps1p) endoprotease
BG63276B1 (bg) Метод за производство на модифициран инхибитор палидипин на колагениндуцирано тромбоцитно натрупване
US5827662A (en) Methods for detecting genetic mutations resulting in protease inhibitor insufficiencies
WO2006090282A2 (en) Recombinant inhibitor proteins of an hk14 protease and use thereof
JP2798573B2 (ja) ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製剤
AU2014252354A1 (en) Potent inhibitors of human matriptase derived from McotI-II variants
US20240409614A1 (en) Variants of alpha-1-antitrypsin
Debowski Natural proteinaceous inhibitors of serine proteases
WO2008077478A1 (en) Preparation and use of variants of the kunitz domain 2 of the human placental bikunin gene
Lai Molecular and cellular studies of Drosophila neuroserpin Spn4A and its polymer-forming mutants
CA2459272A1 (en) Novel serine protease inhibitory protein mt0039
WO2001047958A2 (en) Kunitz domain polypeptide zkun10
JP2003174890A (ja) 新規セリンプロテアーゼ阻害蛋白質ｍｔ００３９
EP1683865A2 (en) Mammalian proteins and in particular CD200

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20051004

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20090403

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20110401

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20120103

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20110401

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20120202

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20120103

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20130604

Appeal identifier: 2012101001249

Request date: 20120202

PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20120202

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20120202

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20110701

Patent event code: PB09011R02I

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20130604

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20120306

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20130807

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20130808

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160516

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20160516

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170614

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170614

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180516

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180516

Start annual number: 6

End annual number: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190529

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190529

Start annual number: 7

End annual number: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200810

Start annual number: 8

End annual number: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210806

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220704

Start annual number: 10

End annual number: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230706

Start annual number: 11

End annual number: 11

PC1801 Expiration of term

Termination date: 20241005

Termination category: Expiration of duration