BRPI0409557B1

BRPI0409557B1 - Proteína recombinante inibidora de calicreína, sequência de dna, vetor de expressão, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, método de produção da proteína recombinanete e kits de diagnóstico

Info

Publication number: BRPI0409557B1
Application number: BRPI0409557-0A
Authority: BR
Inventors: David Deperthes; Sylvain Cloutier
Original assignee: Université de Lausanne
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2004-04-05
Publication date: 2019-07-23
Also published as: CA2521410A1; CN1798838A; AU2004225718B2; NO20055210L; KR101296367B1; PL1616007T3; US8975370B2; JP2006523097A; EP1616007B1; PT1616007E; AU2004225718A1; IL171158A; JP4754478B2; SI1616007T1; DK1616007T3; SG161106A1; EP1616007A1; NO20055210D0; WO2004087912A8; US20060269536A1

Abstract

proteína recombinante inibidora de calicreína e seu método de produção, seqüência de dna, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica e seu uso e kits de diagnóstico a presente invenção refere-se a uma proteína inibidora quimérica de uma protease que compreende uma seqüência polipeptídica inibidora e pelo menos uma seqüência polipeptídica de um sítio de interação entre enzima e substrato específico para protease. outros objetos da presente invenção são o fornecimento de uma seqüência de dna isolada e purificada que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease, um vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a mencionada seqüência de dna isolada e purificada, uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica transformada com este vetor de expressão e um método de produção de uma proteína inibidora quimérica.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma proteína quimérica inibidora de uma protease que compreende uma sequência polipeptídica inibidora e pelo menos uma sequência polipeptídica de um sítio de interação enzima-substrato específica para a protease.

[002] Outros objetos da presente invenção são o fornecimento de uma sequência de DNA isolada e purificada que codifica a proteína quimérica inibidora de uma protease, um vetor de expressão que compreende a mencionada sequência de DNA isolada e purificada, uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica transformada com tal vetor de expressão e um método de produção de uma proteína quimérica inibidora.

Antecedentes da Invenção [003] Dentre todas as proteínas expressas por organismos vivos, as proteases encontram-se entre as mais críticas na mediação dos processos de vida e morte celular. De fato, as interações iniciais entre a protease e o substrato e subseqüente divisão repousam na base de amplo espectro de eventos biológicos essenciais que incluem trombose, coagulação e apoptose.

[004] Proteólise desregulada ou desequilíbrio entre as proteases e as antiproteases foi pesquisado intensamente com base na suspeita de que poderia ser um fator fundamental em muitas patologias em que as proteases tenham sido envolvidas, tais como câncer, doenças autoimunes, inflamações e doenças infecciosas. Estudos diferentes realizados com agentes antiproteolíticos em modelos de câncer e doenças inflamatórias (tais como artrite reumatóide e enfisema) também demonstraram interessante melhoria de

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2/53 resultados, fortalecendo a terapia antiproteolítica e o papel de equilíbrio entre as proteases e as anti-proteases.

[005] Em câncer de próstata, por exemplo, que é um dos cânceres mais comuns diagnosticados em homens norte-americanos, acreditase que as proteases desempenham papel fundamental no comportamento maligno de células cancerosas, incluindo rápido crescimento de tumores, invasão e metástase.

[006] A proteína calicreína glandular humana (hK2) é uma serinoprotease similar à tripsina, expressa predominantemente no epitélio da próstata. Isolada primeiramente a partir de plasma seminal humano, hK2 recentemente surgiu como um marcador de diagnóstico para câncer de próstata (Deperthes et al, 1995, Isolation of Prostatic Kallikrein hK2, Also Known as hGK-1, in Human Seminal Plasma, Biochim. Biophys. Acta 1245, 311 -6).

[007] Além de seu papel como marcador, suas atividades proteolíticas sugerem que a hK2 poderia contribuir com o andamento do câncer. Várias funções potenciais para tal enzima foram propostas, incluindo a ativação do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase e desativação do inibidor 1 ativador de plasminogênio, ativação do pro-PSA, degradação da fibronectina e degradação da proteína de ligação de fator de crescimento similar a insulina (IGF-BP) (para análise, vide Cloutier et al, 2004, Development of Recombinant Inhibitors Specific to Human Kallikrein 2 Using Phase-Display Selected Substrates, Eur. J. Biochem. 3, 607-13).

[008] Demonstrou-se recentemente que a calicreína hK2 pode formar um complexo específico com o inibidor de protease, conhecido como PI6, em cânceres e, particularmente em câncer de próstata. Com base na descoberta de tal complexo específico, as Patentes US 6.284.873 e US 6.472.143 fornecem um método de diagnóstico para determinar a presença ou a ausência de câncer ou necrose de tecidos.

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3/53 [009] Considerando a sua expressão específica em tecido da próstata e o envolvimento de todos os seus substratos potenciais no desenvolvimento de câncer, a hK2 também é considerada um alvo terapêutico em potencial (Darson et al, 1997, Human Glandular Kallikrein 2 (hK2) Expression in Prostatic Intraepithelial Neoplasia and Adenocarcinoma: a Novel Prostate Câncer Marker, Urology 49, 857-62). Portanto, o desenvolvimento de inibidores de protease específicos e de longa duração, especialmente inibidores de calicreína, seria útil.

[010] Tais possíveis inibidores de protease podem ser selecionados dentre a família da serpina (inibidoras de serino protease), que é uma família grande de proteínas relacionadas com a regulagem de processos fisiológicos complexos. Tais proteínas de cerca de 45 kDa podem ser subdivididas em dois grupos, um que é inibidor e outro é não-inibidor.

[011] Serpinas contêm um laço flexível exposto de sítio reativo ou laço de serpina reativo (RSL), que é relacionado com a interação com a suposta proteinase alvo. Após a ligação à enzima e divisão da ligação que pode ser partida P1-P1' do RSL, é formado um complexo covalente (Huntington et al, 2000, Structure of a Serpin-Protease Complex Shows Inhibition by Deformation, Nature 407, 923-6). A formação de tal complexo induz uma redisposição conformacional importante e, de tal forma, captura irreversivelmente a protease alvo. A especificidade inibidora de serpinas é grandemente atribuída à natureza dos resíduos nas posições P1-P'1 e o comprimento do RSL. A mudança do domínio de RSL ou do sítio reativo de serpinas é uma abordagem para compreender o processo inibidor entre um serpina e uma enzima e desenvolver inibidores específicos (Dufour et al, 2001, The Contribution of Arginine Residues Within the P6-P1 Region of Alpha 1Antitrypsin to its Reaction with Furin, J. Biol. Chem. 276, 38971-9 e Plotnick et al, 2002, The Effects of Reactive Site Location on the Inhibitory Properties of

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4/53 the Serpin Alpha (l)-Antichymotrypsin, J. Biol. Chem. 277, 29927-35).

[012] Várias serpinas, tais como inibidor da proteína C, a2 antiplasmina, antitrombina-III, a1-antiquimotripsina (ACT) ou inibidor de protease 6 foram identificadas como inibidores de hK2 (Saedi et al, 2001, Human Kallikrein 2 (hK2), but not Prostate-Specific Antigen (PSA), Rapidly Complexes with Protease Inhibitor 6 (PI-6) Released from Prostate Carcinoma Cells, Int. J. Cancer 94, 558-63). A formação de complexos relativamente lenta entre hK2 e ACT é principalmente atribuída aos resíduos Leu 358 - Ser 359 nas posições P1-P'1 do RSL, ligação de peptídeo desfavorável para tal enzima similar a tripsina.

[013] Até o momento, somente seleções de novos inibidores de calicreína, que inibem especificamente a calicreína do plasma, e seu uso em métodos terapêuticos e de diagnóstico foram descritos (Patentes US 6.057.287, US 6.333.402, US 5.994.125 e US 5.795.865). Entretanto, tais patentes descrevem a produção de inibidores que são homólogos a domínios Kunitz inibidores de tripsina pancreática bovina e especialmente proteínas que são homólogas a domínios Kunitz inibidores da coagulação associada a lipoproteína (LACI), que inibem especificamente calicreínas do plasma.

[014] Além de serem específicos para calicreína do plasma, tais inibidores são moléculas bastante pequenas e unem-se a calicreína do plasma de maneira reversível. Uma das principais desvantagens de tal abordagem é que o uso de proteínas que inibem os seus alvos de maneira reversível corre o risco de que a descomplexação da protease restaure a sua atividade.

[015] Portanto, uma vantagem do uso de inibidores maiores, conforme descrito no presente, é que ele gera a formação de complexos covalentes que inibem a protease alvo de maneira irreversível. Uma vantagem adicional da presente invenção é que grandes complexos covalentes são conhecidos por serem rapidamente eliminados de circulação.

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Descrição Resumida da Invenção [016] O objeto da presente invenção é, portanto, o de fornecer uma proteína inibidora de protease com alta especificidade para a mencionada protease e seu uso em uma composição farmacêutica. Tal proteína inibidora é quimérica pelo fato de compreender uma sequência polipeptídica inibidora e pelo menos uma sequência polipeptídica de um sítio de interação enzimasubstrato específico para a protease.

[017] Outro objeto da presente invenção é o de fornecer uma sequência de DNA isolada e purificada que codifica a proteína quimérica inibidora de uma protease, um vetor de expressão tal que compreende a mencionada sequência de DNA isolada e purificada e uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica transformada com tal vetor de expressão.

[018] Um objeto adicional da presente invenção é o de fornecer um método de produção da proteína quimérica inibidora q de uma protease. Tal método compreende as etapas de:

a. seleção de uma sequência polinucleotídica que codifica um sítio de interação enzima-substrato específico para uma protease;

b. introdução da mencionada sequência polinucleotídica em uma sequência que codifica a proteína inibidora de uma serina ou cisteína protease, de forma a obter uma sequência quimérica;

c. permissão da expressão da mencionada sequência quimérica em um sistema de expressão celular sob condições apropriadas; e

d. recuperação da proteína inibidora quimérica de uma protease.

Breve Descrição das Figuras [019] A Figura 1 representa a análise de SDS-PAGE sob condições redutoras de ACT recombinante purificado. Variante 6.1 (linha 1) e ACT do tipo selvagem (linha 2).

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6/53 [020] A Figura 2 exibe a estequiometria de inibição (SI) de hk2 por rACTWT e suas variantes. A SI foi determinada utilizando análise de regressão linear para extrapolar a razão I/E (ou seja, a intercepção x).

[021] As Figuras 3A e B exibem a formação de um complexo entre hK2 e inibidores recombinantes. As setas indicam hK2 (E), inibidor (I) e complexo hK2-ACT (E-I).

[022] As Figuras 4A e B exibem a inibição de hK2 por rACTWT e suas variantes sob condições de pseudoprimeira ordem. A interação de hK2 e serpinas recombinantes foi medida sob condições de pseudoprimeira ordem utilizando o método de curva de progresso.

[023] A Figura 5 corresponde à determinação da pureza dos inibidores por análise de SDS-PAGE sob condições redutoras de inibidores desenvolvidos nos Exemplos 1 e 2.

[024] As Figuras 6A e B exibem análise Western Blot da reação inibidora entre ACT recombinante e as calicreínas humanas hK2 (Figura 6A) e PSA (Figura 6B).

[025] A Figura 7A exibe as sequências de DNA e proteína de MD820.

[026] A Figura 7B exibe as sequências de DNA e proteína de MD62.

[027] A Figura 7C exibe as sequências de DNA e proteína de MD83.

[028] A Figura 7D exibe as sequências de DNA e proteína de MD67.

[029] A Figura 7E exibe as sequências de DNA e proteína de MD61.

[030] A Figura 7F exibe as sequências de DNA e proteína de MD518.

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7/53 [031] A Figura 7G exibe as sequências de DNA e proteína de MDCI.

[032] A Figura 8 representa comparação de sequências de RSL de inibidores de ACT e MD. Os resíduos em tipo normal são comuns para ACTWT, resíduos sublinhados e em negrito correspondem à mutação de RSL de variantes de ACT. O suposto sítio de divisão em serpinas é marcado por asteriscos entre os resíduos P1 e P1’.

[033] A Figura 9 representa o mapa de vetor de expressão de pQE9.

[034] A Figura 10A exibe a inibição de crescimento de tumor por MD 62. Células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos brutos e tratadas em seguida com MD 62 (5 ou 25 pg/injeção).

[035] A Figura 10B exibe a inibição de crescimento de tumor por MD 67. Células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos brutos e tratadas em seguida com MD 67 (5 ou 25 pg/injeção).

[036] A Figura 11 exibe a inibição do crescimento de tumor por MD CI. Células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos brutos e tratadas em seguida com MD CI (5 ou 50 pg/injeção).

Descrição Detalhada da Invenção [037] A presente invenção refere-se a uma proteína quimérica inibidora de uma protease que compreende uma sequência polipeptídica inibidora e pelo menos uma sequência polipeptídica de um sítio de interação enzima-substrato específica para a mencionada protease.

[038] “Proteína inibidora quimérica” designa uma proteína que compreende dois ou mais polipeptídeos, que são de diferentes origens, ou

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8/53 seja, que não ocorrem juntos na natureza.

[039] Da forma utilizada no presente, os termos “proteína”, “polipeptídeo”, “polipeptídico”, “peptídeo” e “peptídico” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados entre si por uniões de peptídeos entre os grupos alfaamino e carbóxi de resíduos adjacentes.

[040] A proteína quimérica de acordo com a presente invenção é um inibidor de protease e é composta de uma sequência polipeptídica inibidora e, pelo menos, uma sequência polipeptídica de um sítio de interação enzimasubstrato para a mencionada protease. A sequência polipeptídica do sítio de interação enzima-substrato confere propriedades altamente seletivas do inibidor em direção a uma protease específica e tal sequência polipeptídica é selecionada com base na protease a ser inibida.

[041] Tipicamente, tal sequência polipeptídica do sítio de interação de enzima-substrato pode ser uma sequência do sítio ativo do substrato. “Sequência do sítio ativo do substrato” designa uma sequência encontrada sobre um substrato e que é um sítio de reconhecimento preferencial para uma protease. O reconhecimento da sequência de locais ativos do substrato por uma protease pode gerar a ativação, desativação ou a degradação do substrato e, na maior parte do tempo, tal interação de alta afinidade envolve o reconhecimento não apenas de uma sequência específica, mas também de sua conformação tridimensional.

[042] Também é englobada pela presente invenção uma quimera molecular da sequência dos sítios ativos do substrato. Por “quimera molecular”, designa-se uma sequência de polinucleotídeos que pode incluir uma parte funcional da sequência dos sítios ativos do substrato e que será obtida, por exemplo, por métodos de química da proteína conhecidos por técnicos no assunto.

[043] Combinações específicas da sequência dos sítios ativos do

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9/53 substrato ou seus fragmentos ou subporções também são consideradas na presente invenção.

[044] “Fragmentos” designam sequências que compartilham pelo menos 40% de aminoácidos de comprimento com a sequência correspondente do sítio ativo de substrato. Tais sequências podem ser utilizadas desde que exibam as mesmas propriedades da sequência nativa da qual se derivam. Preferencialmente, tais sequências compartilham mais de 70%, preferencialmente mais de 80%, particularmente mais de 90% de aminoácidos em comprimento com a sequência correspondente do sítio ativo do substrato.

[045] Tais fragmentos podem ser preparados por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica, tais como a síntese química.

[046] A presente invenção também inclui variantes da sequência dos sítios ativos do substrato. O termo “variantes” designa polipeptídeos que contêm sequências de aminoácidos que diferem até certo ponto de um polipeptídeo de sequência nativa, ou seja, sequências de aminoácidos que variam da sequência nativa por substituições de aminoácidos conservadoras, em que um ou mais aminoácidos são substituídos por outros com as mesmas características e papéis de conformação. As variantes das sequências de aminoácidos possuem substituições, exclusões e/ou inserções em certas posições dentro da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa. As substituições de aminoácidos conservadoras são definidas no presente como trocas dentro de um dos cinco grupos a seguir:

I. Resíduos alifáticos, não-polares ou levemente polares pequenos: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly.

II. Resíduos polares carregados positivamente: His, Arg, Lys.

III. Resíduos polares carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gln.

IV. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

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V. Resíduos não-polares alifáticos grandes: Met, Leu, Ile, Val, Cys.

[047] Preferencialmente, o substrato de acordo com a presente invenção é uma serpina; em tal caso, a sequência de locais ativos do substrato pode ser uma sequência do Laço de Serpina Reativo, seus fragmentos, uma de suas quimeras moleculares, uma de suas combinações e/ou suas variantes.

[048] “Laço de Serpina Reativo” ou “Laço de Sítio Reativo”, ou RSL, designa um laço de sítio reativo flexível exposto encontrado em serpina e que está envolvido na interação com a suposta protease alvo. A partir do resíduo no lado do aminoácido da ligação rompida e movendo-se para longe da ligação, os resíduos são convencionalmente denominados P1, P2, P3 etc. Os resíduos que seguem a ligação rompida são denominados P1', P2', P3' etc. Normalmente, o RSL é composto de seis a doze resíduos de aminoácidos.

[049] Tal sequência de RSL pode ser selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID N° 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22, seus fragmentos, suas quimeras moleculares, suas combinações e/ou suas variantes.

[050] A sequência de RSL pode também ser selecionada entre as possibilidades a seguir, exibidas na Tabela I.

Tabela I

Posições no RSL que podem ser modificadas

Posição no laço de sítio reativo
P5	P4	P3	P2	P1	P'1	P'2	P'3	P'4
		S	S	R	T	E
		K	T	R	S	N
	I	S	P	R	S
	G	V	F	R	S
	G	T	V	R	S
	S	T	K	R	S
		L	G	R	S	L

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Posição no laço de sítio reativo
		R	G	R	S	E
			R	R	S	I	D
		V	L	R	S	P
		P	F	R	S	S
				R	S	G	S	V
	A	R	A	R	S
		S	D	R	T	A
		K	L	R	T	T
				R	A	A	M	M
			T	R	A	P	M
		D	V	R	A	A
		P	G	R	A	P
	V	E	S	R	A
			A	R	A	S	E
	T	L	Q	R	V
	R	L	E	R	V
			E	R	V	S	P
	S	S	F	R	V
				R	V	G	P	V
	P	S	A	R	M
		R	G	R	M	A
		T	V	R	M	P
			L	R	M	P	T
			H	R	M	S	S
				R	P	Q	H	L
			V	R	P	L	H
		S	G	R	L	A
	G	T	L	R	F
		Q	W	R	N	S
				R	N	D	K	L
			M	R	N	L	A

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Posição no laço de sítio reativo
			T	R	D	S	R
	T	G	S	R	D
	I	M	S	R	Q
	E	Q	H	R	Q	M	G
L	Y	T	S	K
	P	F	R	K	I

[051] Sequência de aminoácidos de resíduos P4-P3' em RSL (Laço de Serpina Reativo) correspondente ao peptídeo de substrato potencial.

[052] Os espaços em branco indicam que não é necessário modificação na ordem para obter especificidade de substrato para hK2.

[053] Normalmente a protease é selecionada a partir do grupo que compreende enzimas calicreína, quimotripsina (Chtr), uroquinase (uPa) e elastase de neutrófilos humanos (HNE). Preferencialmente, a protease é uma calicreína humana; de preferência superior tal calicreína humana é hK2 (também conhecida como hGK-1).

[054] HK2 pertence à família de genes de calicreína que é composta de quinze membros, mas somente o Antígeno Específico da Próstata (PSA ou hK3) e a hK2 são expressos em alto nível pela próstata. Um papel fisiológico potencial da hK2 é a degradação proteolítica do gel de captura do esperma formado imediatamente após a ejaculação, particularmente a divisão de semenogelinas e fibronectina. Além disso, demonstrou-se em teste in vitro que a hK2 pode aumentar a ação mitogênica do fator de crescimento similar à insulina (IGF) por meio da hidrólise da proteína de ligação de IGF. Estudos in vitro também demonstraram que a hK2 ativa a prouroquinase, gera substâncias similares a bradiquinina a partir de quininogenes (potencial ativação cruzada de receptores de EGF por meio de receptores de B2 bradiquinina) e converte proPSA em uma forma ativa. Tais atividades da hK2 representam argumentos a favor do papel potencial de hK2 na degradação de proteínas matriz

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13/53 extracelulares e, conseqüentemente, o destacamento e migração de células de câncer de próstata. Além disso, a hK2 poderá aumentar o desenvolvimento de câncer de próstata por meio de liberação do fator mitogênico e da ativação de receptores do crescimento.

[055] Caso a protease a ser inibida seja uma protease de cisteína, tal protease é selecionada a partir do grupo que compreende catepsinas (subtipos K, L e S), a tiol proteinase de pró-hormônio e a família de caspase (Caspases 1, 3, 4 e 8).

[056] Proteases de cisteína, que são enzimas proteolíticas que utilizam um resíduo de cisteína para sua atividade catalítica, podem ser agrupadas em pelo menos trinta famílias de proteínas. Cada família contém proteínas com sequências de aminoácidos similares e motivos de sequências evolutivamente conservadas que refletem as estruturas tridimensionais similares do membro da família.

[057] A sequência polipeptídica inibidora da proteína inibidora quimérica é normalmente uma protease de serina ou cisteína.

[058] Caso a sequência polipeptídica inibidora seja de uma protease de serina, tal sequência polipeptídica inibidora é preferencialmente uma sequência de serpina, seus fragmentos, uma de suas quimeras moleculares, uma combinação de tais e/ou suas variantes.

[059] Tal sequência de serpina pode ser selecionada a partir do grupo que compreende a a-1-antiquimotripsina (ACT), inibidor de proteína C (PCI), a-1-antiproteinase (AAT), precursor de proteína relacionada a a-1antitripsina (ATR) humano, inibidor de a-2-plasmina (AAP), precursor de antitrombina-III humano (ATIII), inibidor de protease 10 (PI10), precursor de proteína 2 de ligação a colágeno humano (CBP2), inibidor de protease 7 (PI7), leuserpina 2 inibidora de protease (HLS2), inibidor de protease C1 de plasma humano (C1 INH), inibidor de elastase de monócito/neutrófilo (M/NEI), inibidor 3 ativador de

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14/53 plasminogênio (PAI3), inibidor de protease 4 (PI4), inibidor de protease 5 (PI5), inibidor de protease 12 (PI12), precursor de inibidor 1 ativador de plasminogênio humano endotelial (PAI-1), inibidor 2 ativador de plasminogênio humano placentário (PAI2), precursor de fator derivado de epitélio de pigmento humano (PEDF), inibidor de protease 6 (PI6), inibidor de protease 8 (PI8), inibidor de protease 9 (PI9), antígeno 1 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-1), antígeno 2 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-2), globulina de ligação a T4 (TBG), Megsin e inibidor de protease 14 (PI14), seus fragmentos, suas quimeras moleculares, suas combinações e/ou suas variantes.

[060] Como a maior parte de tais serpinas possui nomes diferentes, incluímos abaixo uma tabela que resume as suas especificações.

Tabela II

Serpina	Número de acesso	Sequência de RSL
PI ou AAT, A1AT_Precursor de a/fa-1-antitripsina humana (inibidor de a/fa-1 protease) (a/fa-1 -antiproteinase)	Sp\|P01009\|	GTEAAGAMFLEAIPMSIPPE
PIL ou ATR, A1AU_precursor de proteína relacionada à a/fa1-antitripsina	Sp\|P20848\|	GTEATGAPHLEEKAWSKYQT
PLI ou AAP, A2AP_precursor de a/fa-2-antiplasmina humano (inibidor de a/fa-2-plasmina) (a/fa-2-PI) (a/fa-2-AP)	Sp\|P08697\|	GVEAAAATSIAMSRMSLSSF
AACT, AACT_precursor de a/fa-1 -antiquimotripsina humana (ACT)	Sp\|P01011\|	GTEASAATAVKITLLSALVE
AT3, ANT3_precursor de antitrombina III humana (ATIII)	Sp\|P01008\|	GSEAASTAVVIAGRSLNPN
PI10, BOMA_bomapina humana (inibidor de protease 10)	Sp\|P48595\|	GTEAAAGSGSEIDIRIRVPS

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Serpina	Número de acesso	Sequência de RSL
CBP2, CBP2_precursor de proteína 2 de união de colágeno humana (coligina 2)	Sp\|P50454\|	GNPFDQDIYGREELRSPKLF
PI7 ou PN1, GDN_precursor de nexina derivado de GLIA humana (GDN) (protease nexina I) (PN-1) (inibidor de protease 7)	Sp\|P07093\|	GTKASAATTAILIARSSPPW
HCF2, precursor cofator II de heparina humana (HC-II) (inibidor de protease leuserpina 2) (HLS2)	Sp\|P05546\|	GTQATTVTTVGFMPLSTQVR
C1 NH ou C1IN, IC1_precursor inibidor de protease C1 de plasma humano (C1 INH)	Sp\|P05155\|	GVEAAAASAISVARTLLVFE
ELANH2 ou PI2, ILEU_inibidor de elastase de leucócito humano (LEI) (inibidor de elastase de monócito/neutrófilo) (M/NEI) (EI)	Sp\|P30740\|	GTEAAATAGIATFCMLMPE
PCI ou PLANH3 ou PROCI, IPSP_precursor inibidor de serino protease de plasma humano (PCI) (inibidor de proteína C) (inibidor 3 ativador de plasminogênio) (PAI3)	Sp\|P05154\|	GTRAAAATGTIFTFRSARLN
PI4 ou KST, KAIN_precursor de calistatina humana (inibidor de calicreína) (inibidor de protease 4)	Sp\|P29622\|	GTEAAAATTFAIKFFSAQTN
PI5, MASP_precursor de maspina humana (inibidor de protease 5)	Sp\|P36952\|	GGDSIEVPGARILQHKDELN
PI12, NEUS_precursor de neuroserpina humana (inibidor de protease 12)	Sp\|Q99574\|	GSEAAAVSGMIAISRMAVLY

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Serpina	Número de acesso	Sequência de RSL
PAI1 ou PLANH1, sp\|P05121\|PAI1_precursor inibidor-1 ativador de plasminogênio humano, endotelial (PAI-1)	Sp\|P05121\|	GTVASSSTAVIVSARMAPEE
PAI2 ou PLANH2, PAI2_inibidor-2 ativador de plasminogênio humano (PAI-2) (monócito ARG-serpina) (inibidor de uroquinase)	Sp\|P05120\|	GTEAAAGTGGVMTGRTGHGG
PEDF, PEDF_precursor de fator derivado de epitélio de pigmento humano (PEDF) (EPC-1)	Sp\|P36955\|	GAGTTPSPGLQPAHLTFPLS
PI6 ou PTI, PTI6_inibidor de trombina placentária humana (antiproteinase citoplásmica) (CAP) (inibidor de protease 6)	Sp\|P35237\|	GTEAAAATAAIMMMRCARFV
PI8, PTI8_antiproteinase 2 citoplásmica humana (CAP2) (CAP-2) (inibidor de protease 8)	Sp\|P50452\|	GTEAAAATAVVRNSRCSRME
PI9, PTI9_antiproteinase 3 citoplásmica humana (CAP-3) (inibidor de protease 9)	Sp\|P50453\|	GTEAAAASSCFVVAECCMES
SCCA1, SCC1_antígeno 1 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-1) (proteína T4-A)	Sp\|P29508\|	GAEAAAATAVVGFGSSPAST
SCCA2, SCC1_antígeno 2 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-2) (leupina)	Sp\|P48594\|	GVEAAAATAVVVVELSSPST

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Serpina	Número de acesso	Sequência de RSL
TBG, THBG_precursor de globulina de ligação de tiroxina humana (globulina de ligação de T4)	Sp\|P05543\|	GTEAAAVPEVELSDQPENTF
Megsina	Gi\|4505149\|ref\|N P 003775.1\|	GTEATAATGSNIVEKQLPQS
PI14, pancpin, TSA2004	Gi\|3724282\|dbj\|B AA33766.1\|	GSEAATSTGIHIPVIMSLAQ

[061] Como exemplo de proteínas inibidoras quiméricas de acordo com a presente invenção, os Depositantes descobriram, surpreendentemente, seis novas proteínas inibidoras quiméricas específicas para a protease hK2, conforme resumido abaixo na Tabela III, tais inibidores são:

Tabela III

Inibidores quiméricos	Outro nome	SEQ ID N° (proteína)
rACT8.20	MD820	2
rACT6.2	MD62	4
rACT8.3	MD83	6
rACT6.7	MD67	8
rACT6.1	MD61	10
ACT5.18	MD518	12

[062] Tais proteínas inibidoras quiméricas foram obtidas por meio da modificação do RSL de a1-antiquimotripsina (rACT), que é conhecida por inibir grande variedade de enzimas humanas tais como quimotripsina, quimase de células mastro, catepsina G, calicreínas prostáticas hK2 e PSA (hK3), a fim de modificar a especificidade de tal serpina. Sequências de peptídeos, selecionadas como substratos para a enzima hK2 por meio de tecnologia de exibição de fagos conforme explicado em detalhes no Exemplo 1, foram

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18/53 utilizadas para substituir a união que pode ser rompida e os resíduos de aminoácidos vizinhos do RSL. Inibidores recombinantes foram produzidos em bactérias e purificados por meio de cromatografia de afinidade.

[063] Em comparação com rACT do tipo selvagem, que inibiu hK2 muito lentamente (12 a 16 horas), concluiu-se que os rACTs modificados formam um complexo covalente muito rapidamente em poucos minutos. Três das seis variantes de rACT foram específicas para hK2 com constantes de alta associação (vide Tabelas V e VI). Em incubação com excesso de inibidores ([I]o/[E]o de 100:1) por trinta minutos, hK2 é completamente inibido por rACT6.2, rACT8.3, rACT6.7 e rACT6.1, enquanto rACT8.20 e rACT5.18 inibiram 95% e 73% da atividade enzimática, respectivamente. Sob tal condição, rACT do tipo selvagem não exibiu atividade de inibição para hK2. Dentre tais variantes, duas (rACT8.3 e rACT5.18) são específicas para hK2, não inibindo nenhuma outra enzima testada. Duas outras variantes, rACT6.7 e rACT6.2, inibiram também PK a 36% e 100%, respectivamente. Como ACT do tipo selvagem, a variante rACT8 .20 inibiu as duas proteases similares a quimotripsina Chtr e PSA, mas adicionalmente também PK e HNE. Nenhum dos serpinas recombinantes exibiu atividade inibidora contra a calicreína hK1 e uPA.

[064] Além disso, os Depositantes também concluíram que a substituição dos resíduos P3-P3' posicionados na estrutura de RSL de rACTWT por meio de codificação de pentapeptídeos de substrato para o RSL de inibidor de proteína C (PCI) gera a produção de um inibidor quimérico (MDCI) que é capaz de inibir calicreínas hK2 e hK3.

[065] Portanto, o inibidor quimérico de uma protease pode ser selecionado a partir do grupo que compreende MD820, MD62, MD61, MD67 e MDCI. Preferencialmente, tal proteína inibidora quimérica é MD62 ou MD61.

[066] Sabe-se que valor de Estequiometria de Inibição (SI) superior a um é geralmente interpretado como o comportamento do substrato

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19/53 de serpina. Em tal esquema, após a formação de complexo de Michaelis inicial e divisão no RSL, a maior parte do complexo é decomposta em enzima ativa e inibidor dividido, que é definitivamente desativado. Os Depositantes analisaram reações de hK2 e variantes de ACT para a divisão não formadora de complexos do inibidor, incubando as amostras em excesso de 10:1 vezes entre inibidor e protease. Tais condições, próximas ou abaixo dos valores SI calculados das variantes de ACT testadas (vide Tabela VI), normalmente favorecem a proteólise de serpinas ou complexos de serpina e protease. Surpreendentemente, os Depositantes observaram discrepância para tal hipótese, pois a degradação de ACTs variantes por hK2 não foi observada, apesar dos altos valores de SI. Sem desejar restrições à teoria, possível explicação para a falta de degradação de ACT é a condição sob a qual foi realizada a determinação de SI. Complexos de ACTs e hK2 covalentes estão se formando in vitro muito lentamente. Isso ocorre de acordo com a observação dos Depositantes de que, após trinta minutos de incubação a 25°C, nenhuma inibição de hK2 com ACT do tipo selvagem foi detectada (Tabela V) e que, mesmo após incubação prolongada a 37°C, hK2 formou complexo apenas parcialmente com ACT do tipo selvagem (Figura 3).

[067] Os Depositantes também determinaram a especificidade destes novos inibidores para outras proteases. A avaliação foi realizada sob as mesmas condições para todas as proteases (condições pseudo-fisiológicas), a fim de garantir melhor tradução para aplicações in vivo adicionais. A permuta de sítio de divisão de RSL por substratos selecionados de exibição de fago de hK2 modificou ACT do tipo selvagem em inibidores altamente sensíveis para hK2. Além disso, dois de tais inibidores exibiram reatividade exclusiva com hK2 e não com outras enzimas estudadas conhecidas por dirigirem substratos biológicos similares, tais como calicreína de plasma, hK1, PSA, uroquinase (uPA) e elastase de neutrófilos humanos (HNE). De conhecimento dos

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Depositantes, este é o primeiro relatório que menciona o desenvolvimento de inibidor específico para hK2.

[068] De forma interessante, rACTs.20 (MD820) inibe, além de hK2, também quimotripsina e, mais fracamente, calicreína de plasma e elastase humana, o que representa ampla especificidade de inibição.

[069] A sequência polipeptídica inibidora da proteína inibidora quimérica pode também ser selecionada a partir de uma protease de cisteína, pois existe agora uma série de casos bem documentados de inibição de proteases de cisteína por serpinas (Gettins, P. G. W., 2002, Serpin Structure, Mechanism and Function em Chem. Rev., 102, 4751-4803). Tais exemplos incluem a inibição de catepsinas K, L e S pelo antígeno 1 de carcinoma de células escamosas de serpina, inibição de tiol proteinase pró-hormonal pela a1-antiquimotripsina e a inibição de membros da família de caspase, incluindo caspase 1 (enzima conversora de interleucina 1 β), caspase 3 e caspase 8 pelo serpina viral crmA e caspases 1,4 e 8 pelo serpina humano PI9.

[070] Ao empregar-se técnicas recombinantes para preparar uma proteína inibidora quimérica de uma protease de acordo com a presente invenção, moléculas de ácidos nucléicos ou seus fragmentos que codificam os polipeptídeos são preferencialmente utilizadas.

[071] Portanto, a presente invenção também se refere a uma sequência de DNA isolada e purificada que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease conforme descrito acima.

[072] “Sequência de DNA isolada e purificada” designa o estado em que estará a molécula de ácido nucléico que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease de acordo com a presente invenção ou ácido nucléico que codifica tal proteína inibidora quimérica de uma protease, de acordo com a presente invenção. O ácido nucléico será livre ou substancialmente livre de material com o qual é naturalmente associado, tal

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21/53 como outros polipeptídeos ou ácidos nucléicos com os quais é encontrado no seu ambiente natural, ou no ambiente no qual é preparado (tal como cultivo celular) quando tal preparação for por meio de tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo.

[073] O DNA que pode ser utilizado no presente é qualquer sequência de poli-desoxinucleotídeo, que inclui, por exemplo, DNA de fita dupla, DNA de fita única, DNA de fita dupla em que uma ou as duas fitas são compostas de dois ou mais fragmentos, DNA de fita dupla em que uma ou as duas fitas possuem cadeia principal de fosfodiéster não interrompida, DNA que contém uma ou mais partes de fita única e uma ou mais partes de fita dupla, DNA de fita dupla em que as fitas de DNA são totalmente complementares, DNA de fita dupla em que as fitas de DNA são ao menos parcialmente complementares, DNA circular, DNA fechado covalentemente, DNA linear, DNA covalentemente reticulado, cDNA, DNA sintetizado quimicamente, DNA semi-sintético, DNA biossintético, DNA isolado naturalmente, DNA digerido por enzimas, DNA dividido, DNA marcado, tal como DNA radiomarcado e DNA marcado por fluorocromo, DNA que contém uma ou mais espécies de ácido nucléico que não seja de ocorrência natural.

[074] As sequências de DNA que codificam a proteína inibidora quimérica de uma protease, ou um de seus fragmentos, podem ser sintetizadas por meio de métodos químicos padrões, tais como o método de fosfotriéster ou por meio de métodos de síntese automatizada e métodos de PCR.

[075] A sequência de DNA isolada e purificada que codifica a proteína inibidora quimérica de acordo com a presente invenção pode também ser produzida por meio de métodos enzimáticos. De tal forma, enzimas de restrição, que dividem moléculas de ácido nucléico em sequências de reconhecimento previamente definidas, podem ser utilizadas para isolar sequências de ácido nucléico de moléculas de ácido nucléico maiores que

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22/53 contêm a sequência de ácido nucléico, tais como DNA (ou RNA) que codifica a proteína inibidora quimérica ou um de seus fragmentos.

[076] Também é englobado pela presente invenção um ácido nucléico na forma de polirribonucleotídeo (RNA), incluindo, por exemplo, RNA de fita única, RNA de fita dupla, RNA de fita dupla em que uma ou as duas fitas são compostas de dois ou mais fragmentos, RNA de fita dupla em que uma ou as duas fitas possuem cadeia principal de fosfodiéster não interrompida, RNA que contém uma ou mais partes de fita simples e uma ou mais partes de fita dupla, RNA de fita dupla em que as fitas de RNA são totalmente complementares, RNA de fita dupla em que as fitas de RNA são apenas parcialmente complementares, RNA reticulado covalentemente, RNA digerido por enzima, RNA dividido, mRNA, RNA quimicamente sintetizado, RNA semisintético, RNA biossintético, RNA isolado naturalmente, RNA marcado, tal como RNA radiomarcado e RNA marcado com fluorocromo, RNA que contém uma ou mais espécies que não seja de ocorrência natural de ácido nucléico.

[077] A sequência de DNA isolada e purificada que codifica um inibidor quimérico de protease é selecionada preferencialmente a partir do grupo que compreende SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11 e SEQ ID N° 13.

[078] A presente invenção também inclui variantes das sequências mencionadas acima, ou seja, sequências de nucleotídeos que variam da sequência de referência por substituições de nucleotídeos conservadores, em que um ou mais nucleotídeos são substituídos por outro com as mesmas características.

[079] Ainda outra preocupação da presente invenção é o fornecimento do vetor de expressão que compreende a sequência isolada e purificada que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease, conforme descrito acima. A seleção do vetor de expressão depende

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23/53 diretamente, como é bem conhecido na técnica, das propriedades funcionais desejadas, tais como expressão de proteína inibidora quimérica e a célula hospedeira a ser transformada ou transfectada.

[080] Além disso, o vetor de expressão pode compreender adicionalmente um promotor operacionalmente ligado à sequência de DNA isolada e purificada. Isso significa que a sequência de DNA isolada e purificada ligada que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease de acordo com a presente invenção encontra-se sob o controle de uma sequência reguladora apropriada que permite a expressão, ou seja, a transcrição e tradução da sequência de DNA isolada e purificada inserida.

[081] Da forma utilizada no presente, o termo “promotor” designa qualquer sequência reguladora adicional conhecida na técnica, tal como um promotor e/ou um amplificador, locais de poliadenilação e junções de divisão normalmente empregadas para a expressão do polipeptídeo ou pode incluir adicionalmente uma ou mais sequências de direcionamento separadas e pode codificar opcionalmente um marcador selecionável. Os promotores que podem ser utilizados, desde que tais promotores sejam compatíveis com a célula hospedeira, são, por exemplo, promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como os vírus de polioma, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma (tal como vírus de papiloma bovino), vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus (tal como promotor precoce imediato de citomegalovírus humano ou murino), retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus 40 dos Símios (tal como promotores precoce e posterior de SV40) ou promotores obtidos a partir de promotores mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou promotor de imunoglobulina ou promotores de choque de calor.

[082] Os amplificadores que podem ser utilizados são, por exemplo, sequências amplificadoras conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina) ou

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24/53 amplificador de um vírus de célula eucariótica, tal como o amplificador SV40, o amplificador promotor precoce de citomegalovírus, o polioma e amplificadores de adenovírus.

[083] Ampla variedade de combinações do vetor hospedeiro e da expressão pode ser empregada na expressão das sequências de DNA de acordo com a presente invenção. Os vetores de expressão úteis podem consistir, por exemplo, de segmentos de sequências de DNA sintéticas, cromossômicas e não-cromossômicas. Os vetores apropriados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos tais como RP4; DNAs de fagos, tais como os numerosos derivados de fago X, tais como NM989, e outro DNA de fago, tal como M13 e DNA de fago de fita única filamentoso; plasmídeos de levedura tais como o plasmídeo 2μ ou seus derivados; vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de insetos ou de mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fagos, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e similares.

[084] De preferência superior, o vetor de expressão é pQE-9.

[085] Outra preocupação da presente invenção é o fornecimento de uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica transformada ou transfectada com um vetor de expressão descrito no presente.

[086] A expressão “célula transfectada”, “célula transformada” ou “célula transfectada/transformada” indica a célula em que o DNA extracelular foi introduzido e, de tal forma, abriga o DNA extracelular. O DNA poderá ser introduzido na célula de tal forma que o ácido nucléico possa ser reproduzido na forma de integrante cromossômico ou como elemento cromossômico adicional.

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25/53 [087] A transformação ou transfecção de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas apropriadas com um vetor de expressão que compreende uma sequência de DNA isolada e purificada de acordo com a presente invenção é realizada por meio de métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vetor utilizado. Com relação a tais métodos, vide, por exemplo, Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, e métodos disponíveis comercialmente.

[088] As proteínas inibidoras quiméricas descritas no presente são preferencialmente produzidas, de forma recombinante, em um sistema de expressão celular.

[089] Ampla variedade de células hospedeiras unicelulares é útil na expressão das sequências de DNA de acordo com a presente invenção. Tais hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como linhagens de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras e células animais, tais como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W e L-M, células de rim de Macaco Verde Africano (tais como COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de insetos (tais como Sf9) e células humanas e células vegetais em cultivo de tecido. Preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, de maior preferência uma célula de E. coli.

[090] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende a proteína inibidora quimérica descrita no presente como agente ativo, opcionalmente em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[091] Preferencialmente, além de pelo menos uma proteína inibidora quimérica conforme descrito no presente, a composição farmacêutica pode conter um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como

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26/53 excipientes, veículos e/ou auxiliares que possibilitam o processamento dos compostos ativos em preparação que pode ser utilizada farmaceuticamente.

[092] Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenol, butilorbenzila; alquilparabens, tais como metil ou propilparaben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais, tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

[093] A forma de administração da composição farmacêutica pode ser sistêmica ou local. A administração de tal composição pode ocorrer, por exemplo, por várias vias parenterais, tais como vias subcutânea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, bucal ou por meio de dispositivo implantado e pode também ser fornecida por meios peristálticos.

[094] A composição farmacêutica que compreende uma proteína inibidora quimérica, conforme descrito no presente, como agente ativo pode também ser incorporada ou impregnada a uma matriz bio-absorvível, em que a

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27/53 matriz é administrada na forma de uma suspensão de matriz, gel ou suporte sólido. Além disso, a matriz pode ser compreendida de bio-polímero.

[095] Podem ser preparadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anti-corpo, matrizes tais que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou micro-cápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de (poli)2-hidroxietila ou álcool (poli)vinílico), polilactídeos (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de [gama] etila, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT^® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[096] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente conseguido, por exemplo, por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

[097] Compreende-se que a dosagem apropriada de proteína inibidora quimérica de acordo com a presente invenção dependerá da idade, sexo, saúde e peso do paciente, tipo de tratamento concorrente, se houver, e da natureza do efeito desejado.

[098] A forma de dosagem apropriada dependerá da doença, da proteína inibidora quimérica e do modo de administração; as possibilidades incluem pastilhas, cápsulas, pastilhas expectorantes, cremes dentais, supositórios, inaladores, soluções, ungüentos e depósitos parenterais.

[099] Como as modificações de aminoácidos dos aminoácidos da proteína inibidora quimérica também são englobadas na presente invenção, estas podem ser úteis para reticular a proteína inibidora quimérica em uma

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28/53 matriz insolúvel em água ou os demais veículos macro-moleculares, ou para aumentar a solubilidade, adsorção e permeabilidade ao longo da barreira do cérebro e sangue. Tais modificações são bem conhecidas na técnica e podem alternativamente eliminar ou atenuar qualquer possível efeito colateral indesejável da proteína e similares.

[0100] Embora uma composição farmacêutica preferida de acordo com a presente invenção compreenda uma proteína inibidora quimérica como agente ativo, uma composição farmacêutica alternativa pode conter uma sequência de DNA isolada e purificada que codifica a proteína inibidora quimérica de uma protease, conforme descrito no presente, como agente ativo. Tal composição farmacêutica pode incluir a sequência de DNA isolada e purificada única, um vetor de expressão que compreende a mencionada sequência de DNA isolada e purificada, um vetor de expressão que compreende a mencionada sequência de DNA isolada e purificada ou uma célula hospedeira previamente transfectada com um vetor de expressão descrito no presente. Neste último exemplo, a célula hospedeira será preferencialmente isolada do paciente a ser tratado, a fim de evitar qualquer problema de antigenicidade. tais abordagens de terapia genética e celular são especialmente bem apropriadas para pacientes que necessitem da administração repetida da composição farmacêutica, pois a mencionada sequência de DNA isolada e purificada, vetor de expressão ou célula hospedeira transfectada anteriormente com um vetor de expressão podem ser incorporadas à célula do paciente que produzirá em seguida a proteína de forma endógena.

[0101] O presente relatório descritivo também fornece um método de tratamento ou prevenção de uma disfunção associada a proteólise em mamíferos que compreende a administração ao mencionado mamífero da composição farmacêutica conforme descrito no presente.

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29/53 [0102] O presente método de tratamento ou prevenção de disfunção associada a proteólise pode ser útil caso a disfunção seja uma disfunção em que a atividade de hK2 calicreína é prejudicial, tal como um câncer, doença autoimune, disfunção inflamatória tal como Hipertrofia Prostática Benigna ou disfunção infecciosa.

[0103] O termo “câncer” designa ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de cânceres que podem ser tratados incluem, mas sem limitar-se a câncer de próstata, câncer de mama ou câncer metastático.

[0104] Em métodos preferidos, o mamífero é paciente humano e a proteína inibidora quimérica administrada é selecionada a partir dos exemplos de serpina recombinantes da Tabela III, que inibe especificamente a protease de hK2.

[0105] Também é englobado pelo escopo da presente invenção o uso da composição farmacêutica descrita no presente para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma disfunção associada a proteólise em mamíferos, caso a disfunção seja uma disfunção em que a atividade de calicreína de hK2 seja prejudicial, tal como câncer, doença autoimune, disfunção inflamatória tal como Hipertrofia Prostática Benigna ou disfunção infecciosa.

[0106] Exemplos de cânceres incluem, mas sem limitar-se a eles, câncer de próstata, câncer de mama ou câncer metastático.

[0107] As proteínas inibidoras quiméricas de acordo com a presente invenção serão geralmente utilizadas em quantidade para atingir o propósito desejado. Para uso no tratamento ou prevenção de disfunção, as proteínas inibidoras quiméricas ou as suas composições farmacêuticas são administradas ou aplicadas em quantidade terapeuticamente eficaz. “Quantidade terapeuticamente eficaz” é a quantidade eficaz para melhorar ou evitar os sintomas, ou prolongar a sobrevivência do paciente sendo tratado. A

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30/53 determinação de quantidade terapeuticamente eficaz encontra-se dentro das capacidades dos técnicos no assunto, especialmente à luz do relatório descritivo detalhado fornecido no presente.

[0108] Para administração sistêmica, quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de testes in vitro. Uma dose pode ser formulada, por exemplo, em modelos animais para atingir faixa de concentração circulante que inclui a IC50 conforme determinado em cultivo celular. Tais informações podem ser utilizadas para determinar mais precisamente doses úteis em seres humanos.

[0109] Doses iniciais podem também ser estimadas a partir de dados in vivo, tais como modelos animais, utilizando métodos que são bem conhecidos na técnica. Os técnicos comuns no assunto poderão facilmente otimizar a administração a seres humanos com base em dados de animais e, naturalmente, dependerá do paciente sendo tratado, do peso do paciente, da severidade da disfunção, da forma de administração e do julgamento do médico prescrevente.

[0110] A presente invenção também engloba um método de produção de uma proteína inibidora quimérica de protease, em que o mencionado método compreende as etapas de:

(a) seleção de uma sequência polinucleotídica que codifica um sítio de interação enzima-substrato específica para protease;

(b) introdução da mencionada sequência polinucleotídica em uma sequência que codifica uma proteína inibidora de uma protease de serina ou cisteína, de forma a obter uma sequência quimérica;

(c) permissão da expressão da mencionada sequência quimérica em um sistema de expressão celular sob condições apropriadas; e (d) recuperação da proteína inibidora quimérica de uma protease.

[0111] A seleção de uma sequência polinucleotídica que codifica

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31/53 um sítio ativo de substrato específico para uma protease pode ser realizada por meio dos diferentes métodos a seguir, tais como exibição de substratos para seleção de protease, como retrovírus de leucemia murina que exibe um peptídeo diretamente a partir de células vivas, de forma a evitar a passagem em bactérias (Buchholz et al, 1998) ou método similar, utilizando bibliotecas de vírus Sindbis quiméricos que também foi empregada para a seleção in vivo de locais de divisão de protease utilizando células de mamíferos transfectadas com a enzima de interesse (Pacini et al, 2000, In vivo Selection of Protease Cleavage Sites by Using Chimeric Sindbis Virus Libraries, J. Virol. 74, 22: 10563-70).

[0112] Também é idealizado um sistema de leveduras, GASP (teste genético para proteólise específica de local), que consiste na fusão de substratos aleatórios em uma proteína de membrana integral, permitindo a ligação do substrato à levedura de membrana, em que fatores de transcrição citoplasmáticos podem unir-se ao promotor de um gene relator (Kang et al, 2001, An Improved Strategy for a Genetic Assay for Site-Specific Proteolysis, Mol. Cell. 30; 11 (2): 263-6).

[0113] Emergiu recentemente uma série de bibliotecas químicas combinatórias para determinar a especificidade de substratos de protease. Estas incluem bibliotecas de substratos fluorogênicos combinatórios e bibliotecas combinatórias sintéticas de varrimento posicional.

[0114] Outro método, denominado biblioteca de peptídeos imobilizados, permite a determinação da especificidade de substrato relativa (kcat/km) para cada membro da biblioteca por meio da medição da intensidade de fluorescência na fase de solução e para identificar a união que pode ser rompida por meio de seqüenciamento de Edman (Hu et al, 2002, Rapid Determination of Substrate Specificity of Clostridium Histolyticum BetaCollagenase Using an Immobilized Peptide Library, J. Biol. Chem. 8, 277 (10):

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8366-71).

[0115] Caso a especificidade de substrato de uma protease seja determinada por meio de tecnologia de exibição de fagos, um biblioteca de peptídeos aleatória exibida por fagos com exaustiva diversidade é gerado e selecionado com protease purificada. Tal técnica conhecida foi adaptada ao caso específico conforme descrito no presente, a fim de construir uma biblioteca aleatória exibida por fagos que incluísse toda a combinação de aminoácidos possíveis de comprimento definido de aminoácidos. De tal forma, são construídos bibliotecas grandes por meio da exibição de sequências aleatórias sobre a extremidade de fagos filamentosos, amplificadas e selecionadas em direção a uma protease para testar rapidamente a sua especificidade.

[0116] Segundo os Exemplos 1 e 2, os Depositantes construíram uma biblioteca de pentâmeros contendo 1,8 x 10⁸ transformadores independentes que poderiam ser então considerados completos pois, teoricamente, todas as 3,2 x 10⁶ sequências de pentâmeros aleatórias possíveis foram representadas. As sequências de fagos confirmaram adicionalmente a aleatoriedade dos insertos de pentâmero. Em seguida, os fagos que exibem os pentapeptídeos aleatórios são fundidos a um ligante (6x His) e são imobilizados sobre um suporte de afinidade, neste caso matriz NiNTA. Após a incubação com a protease (no caso dos Exemplos 1 e 2, a protease foi hK2), os fagos que expressam substratos sensíveis são liberados da fase sólida. Os fagos liberados são utilizados para infectar bactérias Fpositivas a serem tituladas e amplificadas. Tais fagos são purificados em seguida por meio de precipitação, amplificados e imobilizados em seguida a suporte por afinidade para proceder a uma nova rodada de seleção. Tal seleção de pentapeptídeos foi repetida oito vezes no total, a fim de obter uma sequência polinucleotídica de alta especificidade. Os fagos da última rodada

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33/53 são clonados por meio de colocação em placas sobre placas Petri e o DNA de fagos individuais é amplificado na região que codifica um sítio ativo de substrato para determinar as sequências divididas pela enzima.

[0117] Sequências polinucleotídicas que codificam um sítio ativo de substrato são introduzidas em seguida em uma sequência que codifica um inibidor de protease de serina, tal como em uma sequência que codifica rACT, de forma a obter uma sequência quimérica. Dois locais de restrição silenciosos Sac II e Mlu I incorporaram anteriormente 18 bp acima no fluxo e 18 bp abaixo no fluxo de códon P1 em domínio RSL de rACT permitiram a subclonagem da sequência polinucleotídica selecionada que codifica um sítio ativo de substrato.

[0118] Os inibidores quiméricos recombinantes são produzidos, por exemplo, em linhagens de E. coli TG1 em condições de cultivo apropriadas. As condições de cultivo apropriadas podem ser compreendidas de 10 a 40°C durante dez a trinta horas, dependendo dos inibidores quiméricos recombinantes a serem expressos. Surpreendentemente, os Depositantes demonstraram que, no caso dos Exemplos 1 e 2, uma temperatura de 16°C durante 16 horas permite a expressão e a produção de variantes totalmente intactas de rACTs.

[0119] Por fim, inibidores quiméricos recombinantes podem ser recuperados do meio de cultivo, quando o inibidor quimérico recombinante é secretado, ou extraídos do sistema de expressão celular quando o inibidor quimérico recombinante não é secretado, e purificado por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como cromatografia de líquidos de alto desempenho, eletroforese de gel, cromatografia de afinidade, ultra-filtragem, troca de íons e similares. As condições reais utilizadas para purificar um inibidor quimérico recombinante específico dependerão, em parte, de fatores tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade etc. e serão evidentes para os técnicos no assunto.

[0120] Para purificação por cromatografia de afinidade, qualquer

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34/53 anti-corpo que se una especificamente ao inibidor quimérico recombinante ou à marca His pode ser utilizado. Outras moléculas de afinidade tais como Ni²⁺nitrilo-triacético ligado a esferas de agarose e que se unem especificamente à marca His também são idealizadas na presente invenção.

[0121] As proteínas inibidoras quiméricas podem ser adicionalmente testadas para determinar a sua capacidade de inibição da atividade da protease. Isso pode ser realizado por meio de qualquer método convencional tal como o método de Scatchard (Scatchard, 1949, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-669). Tal método descreve um método clássico de medição e análise da união que foi aplicada à união de proteínas e necessita de proteína relativamente pura e da capacidade de distinguir proteína unida de não-unida.

[0122] Um segundo método apropriado para medir a afinidade de proteínas inibidoras quiméricas para enzimas é a medição da capacidade das proteínas inibidoras quiméricas de reduzir a velocidade da ação da enzima. Tal método necessita, dependendo da velocidade em que a enzima divide os substratos e da disponibilidade de substratos cromogênicos ou fluorogênicos, de proteínas inibidoras quiméricas relativamente puras.

[0123] Preferencialmente, as proteínas inibidoras quiméricas de acordo com a presente invenção inibem a atividade de protease com afinidade mais alta que os seus parceiros de tipo selvagem.

[0124] As proteínas inibidoras quiméricas descritas no presente são preferencialmente produzidas de forma recombinante em um sistema de expressão celular. Tal sistema pode ser uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica.

[0125] Uma ampla variedade de células hospedeiras unicelulares é útil na expressão das proteínas quiméricas inibidoras de acordo com a presente invenção. Tais hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como linhagens de E. coli, Pseudomonas,

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Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras e células animais, tais como células CHO, YB/20, NOS, SP2/0, R1.1, B-W e L-M, células de rins de Macaco Verde Africano (tais como COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de insetos (tais como Sf9) e células humanas e células vegetais em cultivo de tecidos. Preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo que compreende os gêneros Bacillus, Escherichia, Salmonella e Erwinia. De maior preferência, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de E. coli.

[0126]A transformação ou transfecção de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas apropriadas com um vetor de expressão que compreende uma sequência de DNA isolada e purificada de acordo com a presente invenção é realizada por meio de métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vetor utilizado. Com relação a tais métodos, vide, por exemplo, Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory e métodos disponíveis comercialmente.

[0127] Um objeto adicional da presente invenção é o fornecimento de um kit de diagnóstico para a detecção de uma protease, in vivo ou in vitro, em uma amostra que compreende uma sequência de DNA isolada e purificada selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, uma de suas sequências complementares, seus fragmentos e/ou suas variantes.

[0128] Alternativamente, a presente invenção também idealizou um kit de diagnóstico para detecção de uma protease em uma amostra que compreende uma proteína quimérica inibidora de uma protease de acordo com a presente invenção. A mencionada proteína inibidora quimérica de uma protease pode ser selecionada, por exemplo, a partir do grupo que compreende MD820, MD 62, MD 61, MD67 e MD CI.

[0129] Da forma utilizada no presente, o termo “amostra” indica

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36/53 qualquer amostra apropriada que pode conter uma protease ou uma sequência que codifica uma protease, à qual pode-se unir a proteína inibidora quimérica ou a sequência de DNA isolada e purificada que codifica a mencionada proteína inibidora quimérica.

[0130] O kit de diagnóstico pode incluir um sistema que permite a detecção de uma protease, em que a detecção do sinal dependerá da quantidade de protease presente. O sinal pode ser detectado visual ou instrumentalmente. Possíveis sinais podem incluir a fabricação de produtos coloridos, fluorescentes ou luminescentes, alteração das características de absorção ou emissão de radiação por um produto ou componente de teste e precipitação ou aglutinação de um produto componente. O mencionado componente pode ser uma marca, tal como radioisótopo, fluoroforo, enzima, coenzima, substrato de enzima, composto denso de elétrons ou uma partícula aglutinável e pode ser acoplado à proteína inibidora quimérica ou à sequência de DNA isolada e purificada presente neste kit de diagnóstico.

[0131] Por fim, o presente relatório descritivo também fornece um método de tratamento ou prevenção de uma disfunção associada a proteólise em mamíferos, que compreende a administração ao mencionado mamífero de uma composição farmacêutica que compreende um serpina do tipo selvagem recombinante como agente ativo.

[0132] O método de tratamento ou prevenção de disfunção associada a proteólise mencionado acima pode ser útil caso a disfunção seja uma disfunção em que a atividade de calicreína de hK2 é prejudicial, tal como câncer, doença autoimune, disfunção inflamatória tal como Hipertrofia Prostática Benigna ou disfunção infecciosa.

[0133] O relatório descritivo acima será mais completamente compreendido com referência aos Exemplos a seguir. Tais Exemplos são, entretanto, exemplos de métodos de prática da presente invenção e não se

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37/53 destinam a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos Exemplo 1 Desenvolvimento de Inibidores de ACT Recombinantes Específicos para hK2 Humano Utilizando Substratos Selecionados de Exibição de Fagos Material [0134] hK2 e hK3 (PSA) foram purificados a partir de sêmen humano conforme descrito anteriormente (Frenette, G., Gervais, Y., Tremblay,

R. R., Dube, J. Y., 1998, Contamination of Purified Prostate-Specific Antigen Preparations by Kallikrein hK2, J. Urol. 159, 1375-8), anticorpos mono-clonais anti-hK2 e anti-PSA foram presente do Professor R. R. Tremblay, Universidade de Laval, Canadá. Quimotripsina humana (Chtr), ativador de plasminogênio de uroquinase (uPA), calicreína humana hK1, calicreína de plasma humano (PK), elastase de neutrófilos humanos (HNE) e ACT comercial (a1-antiquimotripsina de plasma humano) foram adquiridos da Calbiochem. Z-Phe-Arg-AMC, SucAla-Ala-Pro-Phe-AMC, Z-Gly-Gly-Arg-AMC, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC foram adquiridos da Calbiochem. Substrato fluorescente CFP-TFRSA-YFP foi desenvolvido conforme descrito anteriormente (Mahajan, N. P. et al, 1999, Novel Mutant Green Fluorescent Protein Protease Substrates Reveal the Activation of Specific Caspases During Apoptosis, Chem. Biol. 6, 401-9). O cDNA para a1-antiquimotripsina humana (ACT) foi presente generoso do Dr. Harvey Rubin (Universidade da Pensilvânia).

Mutagênese Dirigida a Local [0135] Após a subclonagem de cDNA de ACT em vetor de expressão pQE-9 (Qiagen, Alemanha, Figura 9) e a introdução de uma marca His6 no terminal N de rACTWT, dois locais de restrição, Sac II e Mlu I, foram incorporados a 18 bp acima no fluxo e 18 bp abaixo no fluxo de códon P1 no domínio RSL, respectivamente. Estes locais foram criados por meio de

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38/53 mutação silenciosa utilizando os oligonucleotídeos 5’GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3’ para Sac II e 5’GCACAATGGTACGCGTC TCCACTAATG-3’ para local Mlu I e seguindo o protocolo de mutagênese de rápida mudança fornecido pela Stratagene.

Construção da Biblioteca de Exibição de Fagos de Substrato [0136] As bibliotecas de fago de substrato foram geradas utilizando um fagomídeo pH0508b modificado (Lowman et al, 1991, Selecting High-Affinity Binding Proteins by Monovalent Phage Display, Biochemistry 12, 10832-8). A construção consiste de uma marca His6 em qualquer extremidade de uma região rica em repetições Gly-Gly-Gly-Ser que precede o domínio carboxil-terminal (códons 249 a 406) do gene M13 III. Os pentâmeros aleatórios foram gerados por meio de extensão de PCR dos oligonucleotídeos modelo com locais de restrição apropriados posicionados nos dois lados dos códons degenerados: 5’

TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGT CGGTCATAGCAGTCGCTGCA-3’ (em que N é qualquer nucleotídeo e S é G ou C), utilizando primers 5’ biotinilados correspondentes às regiões ladeadoras: 5’ TGAGCTAGTCTAGATAGGTG-3’ e 5’-TGCAGCGACTGCTATGA-3’. Modelos de PCR são digeridos e purificados conforme descrito anteriormente (Smith, G. P., Scott, J. K., 1993, Libraries of Peptides and Proteins Displayed on Filamentous Phage, Methods Enzymol. 217, 228-57), inseridos em vetor pH0508b digerido por XbaI/SalI e eletroporados em XL1-Azul (F-). A extensão da biblioteca foi estimada a partir da eficiência de transformação determinada pela colocação em placas de pequena parcela das células transformadas sobre placas Luria-Bertani contendo ampicilina e tetraciclina (100 e 15 gg*ml-1, respectivamente). O restante das células transformadas foi utilizado para preparar uma biblioteca de fagos por meio de incubação por uma noite por adição de um fago auxiliar M13K07 sob concentração que gera multiplicidade

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39/53 de infecções de cem unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Fagos foram recolhidos do sobrenadante e purificados por meio de precipitação em poli(etileno glicol). Destes, 200 clones foram selecionados arbitrariamente para seqüenciamento, para verificar a aleatorização da biblioteca.

Seleção de Bibliotecas de Pentapeptídeos Exibidas por Fagos [0137] Esta nova biblioteca de pentapeptídeos foi submetida a oito rodadas de seleção com hK2. Cem microlitros de Ni²⁺-ácido nitrilotriacético acoplado a esferas de sefarose (resina de Ni²⁺-ácido nitrilotriacético) foram lavados com 10 ml de NaCl/Pi contendo 1 mg*ml^-1 BSA. Partículas de fagos (10¹¹) foram adicionadas à resina equilibrada de Ni²⁺-ácido nitrilotriacético e mantidas em união com suave agitação por três horas a 4°C. A resina foi lavada em seguida (NaCl/Pi/BSA 1 mg*ml^-1, 5 mM de imidazol, 0,1% Tween 20) para remover fagos não unidos e equilibrada em seguida em NaCl/Pi. O fago de substrato foi exposto a 27 nM (concentração final) de hK2 por 45 minutos a 37°C. Também foi realizada uma seleção de controle sem protease. Os fagos divididos liberados no sobrenadante foram amplificados utilizando XL1-Azul de Escherichia coli e utilizados em seguida para rodadas subseqüentes de seleção. Após oito rodadas de extração, cerca de quinze clones individuais foram tomados da quinta, sexta e oitava rodada de seleção e DNA de plasmídeo foi isolado e seqüenciado na região que codifica o substrato.

Construção e Expressão de ACT de tipo Selvagem Recombinante e suas Variantes [0138] Seis variantes, que correspondem a uma mudança do laço de sítio reativo em posições entre P3 e P3' (vide Tabela IV abaixo), foram geradas por extensão de PCR dos oligonucleotídeos modelo:

rACT8.20, 5'TACCGCGGTCAAAATCACCCTCCGTTCTCGAGCAGTGGAGACGCGT GA-3';

rACT6.3: 5'TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA-3';

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40/53 rACTs.a,5’TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA-3’:

rACTe.y,5’TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA-3’:

rACTe.i,5’TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA-3’:

rACT5.i8,5’TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA-3’ (em que as sequências sublinhadas codificam novos locais de divisão no laço de sítio reativo), utilizando os primers correspondentes às regiões ladeadoras: 5’TACCGCGGTCAAAATC-3’ e 5’-TCACGCGTGTCCAC-3’. Produtos de PCR foram digeridos com enzimas de restrição Sac II e Mlu I e subclonados em seguida em construção de rACTWT digerida. Serpinas recombinantes foram produzidos em linhagem de E. coli TG1. Células foram cultivadas a 37°C em meios 2 x TY (16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl por litro) contendo 100 μg/ml de ampicilina até A600 = 0,5. Isopropiltio-3-galactosida (IPTG) foi adicionada em seguida até concentração final de 0,5 mM, permitindo a expressão de serpinas recombinantes por 16 horas a 16°C. As células de 100 ml de cultivo foram colhidas por centrifugação, novamente suspensas em PBS frio e passadas em seguida através de prensa francesa para recuperar as proteínas citoplasmáticas solúveis totais. Fragmentos celulares foram removidos por centrifugação e esferas de agarose com afinidade de Ni²⁺-nitrilotriacético foram adicionadas ao sobrenadante por noventa minutos a 4°C para unir serpinas recombinantes. A resina foi lavada em seguida com 50 mM de Tris pH 8,0, 500 mM de NaCl, 25 mM de imidazol e as proteínas unidas foram eluídas por dez minutos com 50 mM de Tris pH 8,0, 500 mM de NaCl e 150 mM de imidazol. Após completar-se a purificação, rACT foi dialisado contra 50 mM de Tris pH 8,0, 500 mM de NaCl, 0,05% Triton X-100 por 16 horas a 4°C. A concentração de

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41/53 proteínas foi determinada para cada purificação por teste de Bradford e normalizada por densitometria de géis SDS-PAGE manchados com Azul de Coomassie (Laemmli, U. K., 1970, Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227, 680-5).

Tabela IV

Alinhamento de RSL (Laço de Serpina Reativo) de al-ANTiQUiMOTRiPSiNA (ACT) de Serpina Recombinante e Suas Variantes

Serpina

Peptídeo de substrato selecionado^a

P6

P5

P4

P3

P2

P1

P'1

P'2

P'3

P'4

P'5

P'6

rACTWT

V

K

I

T

L

L*

S

A

L

V

E

T

rACT8.20

LRfSRA

V

K

I

T

L

R*

S

R

A

V

E

T

rACT6.2

RRfSID

V

K

I

T

R

R*

S

I

D

V

E

T

rACT8.3

RGRfSE

V

K

I

R

G

R*

S

E

L

V

E

T

rACT6.7

KLRfTT

V

K

I

K

L

R*

T

L

V

E

T

rACT6.1

MTRfSN

V

K

I

M

T

R*

S

N

A

V

E

T

ACT5.18

ERfVSP

V

K

I

T

E

R*

V

S

P

V

E

T

^a Peptídeos de substratos selecionados por calicreína hK2 utilizando uma biblioteca de pentapeptídeos aleatórios exibida por fago.

[0139] Os resíduos do tipo plano são comuns para rACTWT, os resíduos em negrito e sublinhados correspondem a peptídeos de substratos reposicionados em RSL de variantes de ACT. A união que pode ser unida por hK2 em peptídeos de substrato é designada por Φ e o suposto sítio de divisão em serpinas é marcado por asteriscos entre os resíduos P1-P1’.

Testes de Inibição e Estequiometria de Inibição (SI) [0140] Os valores de estequiometria de inibição (SI) foram determinados para inibição de rACTWT e suas variantes com hK2 e outras enzimas diferentes. Foi realizado um teste inicial com excesso molar de rACT

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42/53 (cem vezes) sobre enzimas hK2, PSA, hK1, quimotripsina (Chtr), calicreína de plasma (PK), uroquinase (uPA) e elastase de neutrófilos humanos (HNE). A reação foi conduzida por trinta minutos a 25°C (90 minutos a 37°C para PSA) em tampão de reação (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,05% Triton X-100, 0,01% BSA) e a atividade de enzima residual foi medida por meio da adição de substratos fluorescentes (Z-Phe-Arg-AMC para hK1, hK2 e PK, SucAla-Ala-Pro-Phe-AMC para Chtr, Z-Gly-Gly-Arg-AMC para uPA, MeOSuc-AlaAla-Pro-Val-AMC para HNE e CFP-TFRSA-YFP para PSA). A atividade de enzima na presença de inibidores foi comparada com reação não inibida. Para reações em que se observou inibição, SI foi determinado por meio da incubação de diferentes concentrações de serpinas recombinantes. Utilizando análise de regressão linear da atividade fracional (velocidade de reação de enzima inibida/velocidade de reação de enzima não inibida) contra a razão molar entre o inibidor e a enzima ([I0]/[E0]), foi obtida a estequiometria de inibição, correspondente à intercepção das abscissas.

CINÉTICA [0141] As constantes de velocidade de associação para interações de hK2, quimotripsina, PK e HNE com diferentes rACTs foram determinadas sob condições de pseudoprimeira ordem, utilizando o método de curva de andamento (Morrison, J. F., Walsh, C. T., 1988, The Behavior and Significance of Slow-Binding Enzyme Inhibitors, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, 201-301). Sob estas condições, quantidade fixa de enzima (2 nM) foi misturada com diferentes concentrações de inibidor (0 a 800 nM) e excesso de substrato (10 pM). Cada reação foi elaborada em tampão de reação (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,05% Triton X-100, 0,01% BSA) a 25°C por 45 minutos e a velocidade de formação de produto foi medida utilizando um leitor de microplacas de 96 cavidades de fluorescência FLx800 (Biotek, Estados Unidos). Neste modelo, a inibição é considerada irreversível ao longo do curso

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43/53 da reação e o progresso da atividade enzimática é expresso pela formação de produto (P), começando em velocidade (vz) e é inibida ao longo do tempo (t) em velocidade de primeira ordem (kobs), constante de velocidade que depende somente da concentração de inibidor.

P = (vz/kobs) x [1 - e^(-kobst)] Equação 1 [0142] Para cada inibidor, foi calculado kobs para quatro concentrações diferentes de inibidores, por meio de regressão não linear dos dados utilizando a Equação 1. Por meio de plotagem do kobs contra a concentração de inibidor [I], constante de velocidade de segunda ordem, k’, igual à inclinação da curva (k’ = Akobs/A[I]), foi determinada. Devido à competição entre inibidor e o substrato, a Equação 2 abaixo é utilizada para corrigir a constante de velocidade de segunda ordem k' levando-se em conta a concentração de substrato [S] e o Km da enzima para o seu substrato, gerando ka.

ka = (1 + [S] / Km) x k' Equação 2 [0143] O Km de hK2 para Z-FR-AMC, quimotripsina para SucAAPF-AMC, PK para Z-FR-AMC e HNE para MeOSuc-AAPV-AMC foram de 67 pM, 145 pM, 170 pM e 130 pM, respectivamente.

Análise de Manchas Western de Formação de Complexos e Degradação de Inibidor [0144]Calicreína hK2 foi incubada por três horas a 37°C com ACTs recombinantes diferentes em razão [I]o:[E]o de 100:1 em 50 mM de Tris, 200 mM de NaCl, 0,05% Triton X-100. Amostras de proteína foram aquecidas a 95°C por cinco minutos, separadas por SDS-PAGE (12% acrilamida razão 19:1 T:C) e eletromanchadas em seguida sobre nitrocelulose Hybond-ECL (Amersham Pharmacia). Os complexos livre-hK2 e hK2-ACT foram detectados utilizando um anticorpo monoclonal anti-hK2 de camundongo e um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra

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44/53 conjugado com fosfatase alcalina. Western Blot foi visualizado utilizando o kit de detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech). hK2 também foi incubado com ACT8.3 ou ACT6.7 por trinta minutos a 25°C (condições cinéticas) em razão [I]o:[E]o de 10:1 em 50 mM de Tris, 200 mM de NaCl, 0,05% Triton X-100. As proteínas foram detectadas por meio de Western Blot, utilizando um anticorpo monoclonal anti-His6 seguido por detecção com o anticorpo secundário e protocolo descritos acima.

Produção de ACTs Variantes e de Tipo Selvagem Recombinante Solúveis [0145]a1-antiquimotripsina de serpina de tipo selvagem foi utilizada para desenvolver inibidores específicos da calicreína hK2. Os resíduos P3-P3' localizados na estrutura de SRL de rACTwt foram substituídos por pentapeptídeos de substrato, previamente selecionados por tecnologia de exibição de fagos conforme descrito acima. Seis variantes de rACT exibidas na Tabela I foram projetadas e construídas. A união que pode ser rompida em peptídeos de substrato foi alinhada de acordo com Leu-358Ser-359 em RSL do serpina. rACTwT e suas variantes foram expressos em TG1 de E. coli como proteínas de fusão contendo uma marca His em posição N-terminal. Cada um deles foi produzido em baixa temperatura, permitindo o acúmulo de proteína principalmente em forma solúvel ativa. Purificado sob condições nativas, o nível de produção variou de 1,0 a 2,5 mg/l. A pureza de serpinas purificados, tais como a Variante 6.1 (linha 1) e ACT do tipo selvagem (linha 2), conforme estimado por análise de SDSPAGE é de mais de 98% (Figura 1).

Variantes de rACT são Principalmente Específicas para Calicreína hK2 [0146] Um quadro de enzimas que inclui elastase de neutrófilos humanos, proteinases similares a quimotripsina (Chtr, PSA ou hK3) e similares a tripsina (hK2, hK1, PK, uPA) foram selecionadas para determinar a especificidade inibidora de variantes de rACT (Tabela V).

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45/53

Tabela V

Perfil Inibidor de rACTwt e suas Variantes

Protease	ACT8.20 (LRi SRA) ^a	ACT6.2 (RRi SID) ^a	ACT8.3 (RGRi SE) ^a	ACT6.7 (KLRi TT) ^a	ACT6.1 (MTRi SN) ^a	ACT5.18 (ERi VSP) ^a	ACTwt (LLi AS)^a
MD 820	MD 62	MD 83	MD 67	MD 61	MD 518
Inibição % ^b
HK2	95	100	100	100	100	73	0
Chtr	66	0	0	0	0	0	100
PK	54	100	0	36	100	0	0
HNE	30	0	0	0	60	0	15
PSA (hK3)	45	0	0	0	0	0	80
hK1	0	0	0	0	0	0	0
Uroquinase	0	0	0	0	0	0	0

^a Sequência de aminoácidos dividida em RSL (Laço de Serpina

Reativo) de ACTs recombinantes correspondente a peptídeo de substrato selecionado por hK2.

^b Protease e serpinas foram incubados por trinta minutos a 25°C (90 minutos a 37°C para PSA) em razão [I]o/[E]o de 100:1. O percentual de inibição corresponde a 100 x (1-(velocidade na presença de inibidor/velocidade de controle não inibido)).

[0147] Incubação com excesso de inibidores ([I]o/[E]o de 100:1) por trinta minutos, hK2 é completamente inibido por rACT6.2, rACT8.3, rACT6.7 e rACT6.1, enquanto rACT8.20 e rACT5.18 inibiu 95% e 73% da atividade enzimática, respectivamente. Sob esta condição, rACT do tipo selvagem não exibiu atividade inibidora para hK2. Dentre estas variantes, duas (rACT8.3 e rACT5.18) são específicas para hK2, não inibindo nenhuma outra enzima testada. Duas outras variantes, rACT6.7 e rACT6.2, inibiram PK a 36% e 100%, respectivamente. Como ACT do tipo selvagem, a variante rACT8.20 inibiu as duas proteases similares a quimotripsina Chtr e PSA, mas adicionalmente

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46/53 também PK e HNE. Nenhum dos serpinas recombinantes exibiu atividade inibidora contra a calicreína hK1 e uPA.

Estequiometrias de Inibição de ACTs Variantes para hK2 são Drasticamente Aprimoradas em Comparação com ACT do Tipo Selvagem [0148] A determinação da estequiometria de inibição foi realizada sob condições fisiológicas de pH e resistência iônica para todas as enzimas, para garantir a comparação mais valiosa. ACT do tipo selvagem recombinante gerou valor SI de 2 (Tabela VI) com quimotripsina que é idêntico ao valor obtido com ACT comercial sob condições similares (dados não exibidos).

Tabela VI

Comparação de Estequiometria e Valores de Inibição e Constantes de Velocidade de Segunda Ordem (Ka) para Reação de rACTwt e suas Variantes com hK2 e Outras Proteinases

Proteas e	ACT8.20 (lrí SRA)^c MD820	ACT6.2 (rrí SID)^cMD62	ACT8.3 (rgrí SE)^c MD83	ACT6.7 (klrí TT)^c MD67	ACT6.1 (MTRf SN)^c MD61	ACT5.18 (ERf VSP)^C MD518	ACTwt (LLf SA)^c MD820
S/	(ka)^b M^-1 s^- 1	S/	ka^b _M-1 _s- 1	S/	ka^b _M-1 _s- 1	S/	ka^b _M-1 _s- 1	S/	ka^b _M-1 _s- 1	S/	ka^b _M-1 s^-1	S/	ka^b _M-1 s^-1
HK2	105	1779	25	6261	34	2439	9	8991	19	3442	139	595	-	-
Chtr	134	905												61
														295
PK	150	424	18	6217	_-	_-	277	201	16	8024	_-	_-	_-	_-
HNE	334	158	_-	_-	_-	_-	_-	_-	159	1192	_-	_-	_-	_-

^a Os valores SI relatados foram determinados utilizando análise de regressão linear para extrapolar a razão I/E (vide Figura 1).

^b Constantes de velocidade de segunda ordem para reações de

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47/53 serpina e proteinase foram medidas sob condições de pseudoprimeira ou segunda ordem, conforme descrito em “Procedimento Experimental”.

^c Sequência de aminoácidos de resíduos P3-P3' em RSL (Laço de Serpina Reativo) de ACT recombinante correspondente a peptídeo de substrato selecionado por hK2.

- Nenhuma atividade inibidora detectável.

[0149] A fim de determinar os valores SI de todas as variantes recombinantes, os Depositantes incubaram hK2 (5 nM) com cinco concentrações diferentes (6,25 a 500 nM) de rACT8.20 (x), rACT6.2 (□), rACT8.3 (Δ), rACT6.7 (0), rACT6.1 (X), rACT5.18 (o), rACTWT (+), a 25°C por trinta minutos em tampão de reação. As atividades residuais (velocidade) para hK2 foram testadas por meio de adição do substrato fluorescente (10 pM) Z-FR-AMC. A velocidade fracional corresponde à razão entre a velocidade de enzima inibida (vi) e a velocidade do controle não inibido (vo). O SI foi determinado utilizando análise de regressão linear para extrapolar a razão I/E (ou seja, a intercepção x).

[0150] Conforme exibido na Figura 2, todas as variantes recém construídas de ACT exibiram valores SI mais baixos com hK2 que ACT do tipo selvagem. Dentre essas variantes rACT6.7, rACT6.1 e rACT6.2 apresentaram os valores mais baixos de estequiometria de inibição para hK2 (9, 19 e 25, respectivamente). Embora rACT6.2 e rACT6.1 também apresentassem os valores SI mais baixos (18 e 16) para PK, o SI para rACT6.7 foi muito mais alto (277). Os dois ACTs recombinantes específicos para hK2, rACT8.3 e rACT5.18 apresentaram razão SI mais alta de 34 e 139, respectivamente. O valor SI de inibidor rACT8.20 foi de mais de 100 para todas as proteases testadas, incluindo hK2.

ACTs Variantes Formam Complexos Estáveis com hK2 sem Degradação de Inibidores [0151] hK2 foi incubado por três horas a 37°C com rACT8.20,

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48/53 rACT6.2, rACT8.3, rACT6.7, rACTe.i, rACT5.i8 e rACT do tipo selvagem, sob razão I:E de 100:1. Análise Western Blot dos produtos de reação de rACTs com hK2 (rACT8.20 (linha 1), rACT6.2 (linha 2), rACT8.3 (linha 3), rACT6.7 (linha 4), rACT6.1 (linha 5), rACT5.18 (linha 6) e rACT do tipo selvagem (linha 7)) foi realizada sob condições redutoras utilizando um anticorpo anti-hK2 de camundongo para determinar o destino dos inibidores após a interação com a enzima. A Figura 3A demonstra que, ao incubar-se hK2 com variantes de ACT, hK2 livre (E) desapareceu completamente para formar um complexo covalente (EI). Este complexo covalente demonstrou alta estabilidade, pois não se rompeu ao longo de um período de incubação de 16 horas (dados não exibidos). ACT do tipo selvagem inibiu hK2 mais lentamente, que principalmente não teve complexo formado após três horas de incubação. Valores de SI elevados medidos com hK2 não se deveram à degradação não formadora de complexo de inibidores variantes de ACT.

[0152] Posteriormente, ACT8.3 (linha 1) ou ACT6.7 (linha 3) foram incubados com hK2 (linha 2 e 4, respectivamente, sobre o Western Blot) sob condições cinéticas (trinta minutos a 25°C) em razão I:E de 10:1. A formação de complexos foi analisada por Western Blot sob condições redutoras utilizando uma marca anti-his monoclonal de camundongo (Figura 3B). Todas as proteínas inibidoras tiveram complexo formado com hK2 ou presentes em forma não dividida, o que indica que o possível processo de substrato para a interação entre serpina e enzima é marginal.

ACTs Variantes Exibiram Constantes de Associação mais Altas com hK2 [0153] A velocidade de reação inibidora com ACTs variantes foi determinada para cada protease exibindo reatividade com esses inibidores. Com este propósito, a interação de hK2 e serpinas recombinantes foi medida sob condições de pseudoprimeira ordem utilizando o método de curva de progresso. hK2 (2 nM) e o substrato Z-FR-AMC (10 pM) foram adicionados a

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49/53 quantidades variáveis (20 n a 800 nM) de inibidores rACT8.20 (0), rACT5.18 (+) (Figura 4A) e inibidores rACT6.2 (o), rACT8.3 (□), rACT6.7 (Δ), rACT6.1 (x) (Figura 4B). Curvas de progresso representativas foram submetidas a análise de regressão não linear utilizando eq 1 e a velocidade (kobs) foi plotada contra as concentrações de serpina. Após a determinação de kobs, constantes de associação (ka) foram calculadas utilizando Km das proteases para os seus substratos correspondentes (Tabela VI). O valor ka de ACT do tipo selvagem com quimotripsina foi idêntico ao de dados publicados (Cooley et al, 2001, The Serpin MNEI Inhibits Elastase-Like and Chymotrypsin-Like Serine Proteases Through Efficient Reactions at Two Active Sites, Biochemistry 40, 15762-70). O rACT6.7 recombinante exibiu ka mais alto (8991 M-1s-1) com hK2, enquanto o obtido com PK foi 45 vezes menor. Por outro lado, rACT6.2 recombinante gerou ka equivalente com hK2 e PK, demonstrando falta de discriminação entre as duas proteases. Os valores ka de inibidores recombinantes específicos de hK2 rACT8.3 e rACT5.18 foram mais baixos, 2439 e 595 M-1s-1, respectivamente, enquanto ACT8.20 não específico exibiu ka de 1779 M’¹s’¹, para hK2, superior em comparação com Chtr, PK e HNE. Um dos serpinas recombinantes, rACT6.1, estava reagindo em velocidade mais alta com PK que com hK2.

Exemplo 2

Desenvolvimento de Inibidores de ACT Recombinantes Específicos para Proteases hK2 e hK3 Humanas [0154] Os resíduos P3-P3' localizados na estrutura de RSL de rACTWT foram substituídos por codificação de pentapeptídeos de substrato para o RSL de Inibidor de Proteína C (PCI) (Tabela VII), conforme descrito no Exemplo 1.

[0155] Os resíduos de tipo plano são comuns para rACTWT, resíduos em negrito e sublinhados correspondem a peptídeos de substrato

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50/53 reposicionados em RSL de variantes de ACT. A união que pode ser rompida em peptídeos de substrato é designada por 4 e suposto sítio de divisão em serpinas é marcado por asteriscos entre os resíduos P1-P1'.

[0156] Resumidamente, para produzir a proteína recombinante ACTpci (MDCI), células TG1 foram transformadas com as construções correspondentes seguidas por crescimento em meios de cultivo apropriados. As células foram induzidas em seguida até densidade ideal para expressar inibidores recombinantes por 16 horas a 16°C. O inibidor recombinante ACTPCI foi extraído de bactérias de citoplasma e separado por cromatografia de afinidade utilizando coluna Ni-NTA conforme descrito para o exemplo anterior.

Análise de Expressão de ACT Recombinante por SDS-PAGE [0157] A pureza dos diferentes inibidores desenvolvidos nos Exemplos 1 e 2 foi testada por análise de SDS-PAGE sob condições redutoras, conforme exibido na Figura 5.

Avaliação dos Inibidores [0158] Estes inibidores foram adicionalmente analisados para determinar a sua especificidade e afinidade de inibição das calicreínas humanas hK2 e hK3 (Figuras 6) e calicreína de plasma, tripsina, uroquinase, elastase, trombina, hK14 e calicreína humana 8 (Tabela VIII). Estas duas enzimas possuem diferentes especificidades enzimáticas (hK2: similar a tripsina, hK3: similar a quimotripsina), mas são naturalmente inibidas por ACT. Embora ACT seja considerado o inibidor de hK3 natural na circulação sangüínea, a sua inibição de hK2 é mais fraca.

[0159] Análise da reação inibidora entre rACTs e as calicreínas humanas foi realizada por Western Blot conforme exibido nas Figuras 6. Para cada variante de ACT, 1 gg de inibidor foi incubado com 100 ng de hK2 ou hK3 durante uma hora a 37°C sob condições fisiológicas.

[0160] Os resultados da detecção utilizando o anticorpo

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51/53 monoclonal anti-hK2 9D5 são exibidos na Figura 6A.

[0161] Linha 1: somente hK2, 2: ACT comercial + hK2, 3: ACT de tipo selvagem + hK2, 4: MD820 + hK2, 5: MDCI + hK2, 6: MD62 + hK2, 7: MD61 + hK2.

[0162] A Figura 6B exibe a detecção de complexo de hK3 e ACT utilizando anticorpo anti-His (marca presente sobre proteínas ACT recombinantes).

[0163] Linha 1: PSA, 2: PSA + ACT, 3: ACT do tipo selvagem + PSA, 4: MD820 + PSA, 5: MDCI + PSA, 6: MD62 + PSA, 7: MD61 + PSA.

[0164] As mudanças de aminoácidos dentro do laço reativo utilizando sequências de substratos selecionados pela especificidade de hK2 transformaram ACT em um inibidor altamente específico para hK2 (MD820, MD61, MD62) sem inibir hK3. Estes resultados confirmam os exibidos anteriormente na Tabela IV. Somente MDCI, com base no laço reativo do inibidor da Proteína C (PCI), é capaz de inibir as duas calicreínas testadas (hK2 e hK3).

[0165] MD61 e MD62 são inibidores com afinidade muito alta para hK2, inibindo toda a proteína hK2 em menos de três minutos (sob as mesmas condições) em comparação com a1-antiquimotripsina comercial ou de tipo selvagem, que necessita de mais de doze horas de incubação para inibir a mesma quantidade de hK2 (dados não exibidos).

Tabela VIII

Perfil Inibidor de MDci

Protease	% inibição ^b	SI	ka M¹ s^-1
Quimotripsina	98	1	86216
Calicreína de plasma	100	4,6	25900
Tripsina	100	1	1126025
Uroquinase	0	-	-
Elastase	0	-	-
Trombina	0	-	-
hK14	100	3,2	287000

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Protease	% inibição ^b	si	ka M¹ s^-1
Calicreína 8 humana	~25	~180

Exemplo 3

Inibição do Crescimento de Tumores por Inibidores de MD

3.1 Inibição do Crescimento de Tumores por Inibidores MD62 e MD67 [0166] A linhagem de células de adenocarcinoma de próstata humana independente de andrógenos DU-145 foi obtida através da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos. Tecnologia retroviral foi utilizada para obter célula DU145 transfectada com gene hK2 (DU145/hK2).

[0167] Células DU145/hK2 em crescimento exponencial foram recolhidas e novamente suspensas sob concentração de 7,5 x 10⁷ células/ml em DMEM (Invitrogen) contendo 1 ou 10 pg de inibidores. Esta suspensão celular foi misturada com matrigel (BD Biosciences) em razão 1:2 e injetada por via subcutânea (3 x 10⁶ células/40 pl) no flanco direito e esquerdo de camundongos brutos suíços atímicos machos com oito semanas de idade (dois camundongos por grupo). Cada camundongo foi inoculado em dois lugares.

[0168] Nos dias 6, 12 e 18 após a inoculação do tumor, 50 ou 10 pg de MD62, MD67 ou 100 pg ou 10 pg de ACT-WT foram injetados por via subcutânea. Nos dias 24, 30, 33, 36, 39 e 41 após a inoculação do tumor, 25 ou 5 pg de inibidores (MD62 e MD67) ou 50 pg ou 5 pg de ACT-WT foram injetados por via subcutânea.

[0169] A Figura 10A exibe a inibição do crescimento de tumores por MD 62. As células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos brutos e tratadas em seguida com MD 62 (5 ou 25 pg por injeção).

[0170] A Figura 10B exibe a inibição do crescimento de tumores por MD 67. As células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos

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53/53 brutos e tratadas em seguida com MD 67 (5 ou 25 pg por injeção).

3.2 Inibição do Crescimento de Tumores por Inibidor de MDCI [0171] A linhagem de células de adenocarcinoma de próstata humana independente de andrógenos DU-145 foi obtida através da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos. Tecnologia retroviral foi utilizada para obter célula DU145 transfectada com gene hK2 (DU145/hK2).

[0172] Células DU145/hK2 em crescimento exponencial foram recolhidas e novamente suspensas sob concentração de 7,5 x 10⁷ células/ml em DMEM (Invitrogen) contendo 1 ou 10 pg de inibidores. Esta suspensão celular foi misturada com matrigel (BD Biosciences) em razão 1:2 e injetada por via subcutânea (3 x 10⁶ células/40 pl) no flanco direito e esquerdo de camundongos brutos suíços atímicos machos com oito semanas de idade (dois camundongos por grupo). Cada camundongo foi inoculado em dois lugares. Nos dias 6, 12 e 18 após a inoculação do tumor, 100 pg ou 10 pg de MDCI ou ACT-WT foram injetados por via subcutânea. Nos dias 24, 30, 33, 36, 39 e 41 após a inoculação do tumor, 50 pg ou 5 pg de MDCI ou ACT-WT foram injetados por via subcutânea.

[0173] A Figura 11 exibe a inibição de crescimento de tumores por MD CI. As células de câncer de próstata DU-145 (3 x 10⁶ células), transfectadas com calicreína humana 2, foram implantadas em camundongos brutos e tratadas em seguida com MD CI (5 ou 50 pg por injeção).

Claims

1. PROTEÍNA RECOMBINANTE INIBIDORA DE

CALICREÍNA, caracterizada por compreender uma sequência de serpina, em que o Laço de Serpina Reativo P6-P6' da mencionada sequência de serpina compreende pelo menos um sítio ativo de substrato que consiste em uma sequência pentapeptídica selecionada entre SSRTE, KTRSN, ISPRS, GVFRS, GTVRS, ETKRS, LGRSL, RGRSE, RRSID, VLRSP, PFRSS, RSGSV, ARARS, SDRTA, KLRTT, RAAMM, TRAPM, DVRAA, PGRAP, VESRA, ARASE,

TLQRV, RLERV, ERVSP, SSPRV, RVGPY, PSARM, RGRMA, TVRMP,

LRMPT, HRMSS, RPQEL, VRPLE, SGRLA, GTLRF, QWRNS, RNDKL,

MRNRA, TRDSR, TGSRD, IMSRQ, LTTSK, PFRKI específica para mencionada calicreína.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela calicreína ser uma proteína de calicreína hK2.

sequência de serpina é selecionado a partir do grupo que compreende as SEQ ID N° 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, seus fragmentos, suas quimeras moleculares, suas combinações e/ou suas variantes.

3. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela sequência de serpina ser selecionada a partir do grupo que compreende α-1-antiquimotripsina (ACT), inibidor de proteína C (PCI), α-1-antiproteinase (AAT), precursor de proteína relacionada a α-1-antitripsina humana (ATR), inibidor de α-2-plasmina (AAP), precursor de anti-trombina-III humana (ATIII), inibidor de protease 10 (PI10), precursor de proteína 2 de ligação a colágeno humano (CBP2), inibidor de protease 7 (PI7), leuserpina 2 inibidora de protease (HLS2), inibidor de protease C1 de plasma humano (C1 INH), inibidor de elastase de monócito/neutrófilo (M/NEI), inibidor 3 ativador de plasminogênio (PAI3), inibidor de protease 4 (PI4), inibidor de protease 5 (PI5), inibidor de protease 12 (PI12), precursor de inibidor 1 ativador

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2/5 de plasminogênio humano endotelial (PAI-1), inibidor 2 ativador de plasminogênio humano placentário (PAI2), precursor de fator derivado de epitélio de pigmento humano (PEDF), inibidor de protease 6 (PI6), inibidor de protease 8 (PI8), inibidor de protease 9 (PI9), antígeno 1 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-1), antígeno 2 de carcinoma de células escamosas humanas (SCCA-2), globulina de ligação a T4 (TBG), Megsin e inibidor de protease 14 (PI14), seus fragmentos, suas quimeras moleculares, suas combinações e/ou suas variantes.

4. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela mencionada proteína recombinante inibidora de uma calicreína ser selecionada a partir do grupo que compreende as SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10 e 14.

5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela mencionada proteína recombinante inibidora de calicreína ser SEQ ID NO: 4 ou 8.

6. PROTEÍNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por pelo menos uma sequência de sítio ativo de substrato específica para a mencionada calicreína ser um peptídeo de substrato selecionado pela calicreína utilizando uma biblioteca de pentapeptídeos aleatórios exibidos pelo fago.

7. SEQUÊNCIA DE DNA, isolada e purificada, caracterizada por codificar a proteína recombinante inibidora de uma calicreína, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. SEQUÊNCIA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela mencionada sequência ser selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13.

9. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender

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3/5 a sequência de DNA isolada e purificada, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 7 a 8.

10. VETOR, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender adicionalmente um promotor operacionalmente ligado à sequência de DNA isolada e purificada.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a proteína recombinante inibidora de calicreína, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, como um agente ativo e, opcionalmente, em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

12. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 11, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma disfunção associada a proteólise em um mamífero.

13. USO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela disfunção ser uma disfunção na qual a atividade de calicreína hK2 é prejudicial.

14. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a

13, caracterizado pela disfunção ser um câncer, uma doença autoimune, uma disfunção inflamatória ou uma disfunção infecciosa.

15. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo câncer ser câncer de próstata, câncer de mama ou câncer metastático.

16. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela disfunção inflamatória ser a Hipertrofia Prostática Benigna.

17. MÉTODO DE PRODUÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE, inibidora de calicreína, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender as etapas de:

(a) seleção de uma sequência polinucleotídica que codifica um sítio ativo de substrato específico para a mencionada calicreína, em que a

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4/5 mencionada sequência consiste em uma sequência pentapeptídica selecionada entre SSRTE, KTRSN, ISPRS, GVFRS, GTVRS, ETKRS, LGRSL, RGRSE, RRSID, VLRSP, PFRSS, RSGSV, ARARS, SDRTA, KLRTT, RAAMM, TRAPM, DVRAA, PGRAP, VESRA, ARASE, TLQRV, RLERV, ERVSP, SSPRV, RVGPY, PSARM, RGRMA, TVRMP, LRMPT, HRMSS, RPQEL, VRPLE, SGRLA, GTLRF, QWRNS, RNDKL, MRNRA, TRDSR, TGSRD, IMSRQ, LTTSK, PFRKI específica para mencionada calicreína, fragmentos biologicamente ativos da mesma, uma quimera molecular da mesma e/ou uma combinação das mesmas;

(b) introdução da mencionada sequência pentapeptídica em uma sequência que codifica uma sequência de serpina, de forma a obter uma proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína;

(c) permissão da expressão da mencionada proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína em um sistema de expressão celular, sob condições apropriadas; e (d) recuperação da proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelas condições apropriadas consistirem no cultivo do sistema de expressão celular sob uma temperatura entre 10 e 40°C durante 10 a 30 horas.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelas condições apropriadas consistirem em uma temperatura de 16°C durante

16 horas.

20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

17 a 19, caracterizado pela etapa (d) ser realizada por meio da separação após a extração da proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína do sistema de expressão celular.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado

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5/5 pela separação da proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína ser realizada por cromatografia de afinidade.

22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pela proteína recombinante inibidora da mencionada calicreína ser adicionalmente analisada para sua capacidade de inibição da atividade da mencionada calicreína.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo sistema de expressão celular ser uma célula bacteriana.

24. KIT DE DIAGNÓSTICO, para a detecção de calicreína em uma amostra, caracterizado por compreender qualquer sequência de DNA isolada e purificada apropriada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, e/ou uma de suas sequências complementares.

25. KIT DE DIAGNÓSTICO, para a detecção de calicreína em uma amostra, caracterizado por compreender a proteína recombinante inibidora de calicreína, conforme descrita em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.