KR20030070143A - 심장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되는 ｉｌ-18저해물질 - Google Patents
심장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되는 ｉｌ-18저해물질 Download PDFInfo
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Abstract
본원 발명은 심장 질환, 특히 허혈성 심장 질환의 치료 또는 예방하는 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. IL-18 저해물질 및/또는 TNF 길항물질의 혼합물 역시 심장 질환의 치료 및/또는 예방에 고려된다.
Description
사이토킨 인터루킨 18(IL-18)은 초기에는 인터페론(IFN-γ) 유도 인자로 알려졌었다(Nakamura et al., 1989). 이는 T-림프구 보조 1형 세포(TH1) 반응의 발생에서 초기 신호다. IL-18은 IL-12, IL-2, 항원, 유사분열물질, 다른 인자와 함께 IFN-γ의 생산을 유도하는 역할을 한다. 또한, IL-18은 GM-CSF와 IL-2의 생산을 향상시키고 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 강화시키며 고유 킬러 세포의 Fas-매개된 살해 능력을 증가시킨다.
성숙 IL-18은 IL-1β전환 효소(ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다.
IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작동하는 적어도 2개의 요소로 구성된다. 뮤린 IL-12 촉진된 T 세포에서 IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합 부위가 발견되었는데(Yoshimoto et al., 1998), 이는 다중적인 체인 수용체 복합체를 암시한다. 지금까지 2개의 수용체 아단위가 확인되었는데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 계통에 속한다(Parnet et al., 1996; Kim et al., 2001). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(DoDonato et al., 1997). IL-18 수용체 복합체는 2개의 수용체 사슬: IL-18Rα 사슬이라고 하는 리간드-결합 사슬 및 IL-18Rβ 사슬이라고 하는 신호-전달 사슬로 구성된다. IL-18R 사슬은 방사성표지된 IL-18에 결합하는 세포 표면 단백질로 처음 분리되었다; 상기 단백질은 정제되었고, 이의 아미노산 서열은 IL-1R-관련된 단백질(IL-1Rrp)이라고 하는 기존의 고아 수용체(orphan receptor)와 상동성을 보였다(Torigoe et al., 1997).
최근에, IL-18에 대하여 높은 친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람 유전자 및 사람과 생쥐의 cDNA가 클론되었다(Novick et al., 1999; WO99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)로 명명되었다.
IL-18BP는 공지된 IL-18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아니고 분비되고 자연적으로 순환하는 단백질이다. 이는 신규한 계통의 분비 단백질에 속하는데, 여기에는 몇몇 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(Novick et al., 1999). 재조합 IL-18BP와 소변 IL-18BP는 높은 친화성으로 IL-18과 특이적으로 결합하고 IL-18의 생물학적 활성을 조절한다.
IL-18BP 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다. IL-18BP의 4가지 접합 변이체 또는 동소체는 사람에서 발견되어 각각 IL-18BP a, b, c, d로 명명되었는데, 이들은 동일한 N-말단을 공유하지만 C-말단에서는 상이하다(Novick et al., 1999). 이들 동소체는 IL-18에 결합하는 능력에서 서로 상이하다. 이들 중에서, hIL-18BP 동소체 a와 C는 IL-18에 대하여 중화 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 사람 IL-18BP 동소체 a는 뮤린 IL-18과 교차-반응한다.
심장 질환은 심장 근육 또는 심장 혈관에 영향을 주는 질환이다(The Merck Manual Home Edition, ). 혈관 질환은 막힘으로 유발되는 순환기 장애와 같은 혈관 문제이다. 심장 질환은 또한 심혈관 질환으로 불린다.
허혈성 심장 질환은 심부전의 일반적 원인으로, 서양 사회에서 가장 빈번한 사망 원인이다. 일반적으로, 이는 관상동맥 죽종에 기인한다. 심근 병변에는 허혈성 섬유증과 급성 경색이 포함된다. 정상적인 상태하의 관상동맥에서 혈류는 심근의 대사 수요에 거의 대응한다. 허혈성 심장 질환은 혈액 공급이 불충분할 때 발생하는데, 그 이유는 혈류 공급 자체가 손상되거나 또는 심근이 비대해져 혈액 공급의 수요가 증가하기 때문이다. 정상상태에서 관상 혈류는 대동맥압과 무관하다. 관상 혈관상(vascular bed)을 통과하는 혈류를 조절하는 효율적인 자가조절 기전이 존재한다.
주로 죽상경화증 또는 동맥경화증으로 인해 주요 관상동맥에 폐색이 진행될 때 관상 혈류는 초기에 보호되는데, 그 이유는 이런 폐색에서 원심의 말초 저항이 감소하기 때문이다. 혈관강(vessel lumen)이 75%이상 페색될 때, 특히 관상 측부 순환이 불량하면 허혈이 진행된다.
심근은 대사적으로 극히 활발하고, 미토콘드리아가 개별 섬유 부피의 30%이상을 차지한다. 고에너지 인산염의 예비가 매우 부족하기 때문에, 호기성 대사가 필수적이다. 심근 사멸은 조직 아데노신 삼인산염(ATP) 수준이 매우 낮고 혐기성 해당(glycolysis)이 실질적으로 중단될 때 진행된다. 다른 조직에서처럼, 사멸의 정확한 원인은 불확실하지만, 치명적인 심근 손상은 막 손상 및 칼슘의 세포질로의 갑작스런 유입과 연관한다. 짧은 기간의 허혈후, 심장 혈류가 재-확립(재관류)될 수 있다. 하지만, 상당한 시차이후에는 모세관 내피세포의 팽창으로 인하여 재관류가 불가능하다.
죽상경화증은 관상동맥 질환의 상당 부분을 차지한다. 허혈성 심장 질환 역시 적은 관상동맥 관류로 유발될 수 있다. 쇼크, 특히 출혈로 인한 쇼크가 이의 주원인이다.
전술한 바와 같이, 허혈성 심장 질환은 심근의 혈류와 심근의 대사 수요간 불균형에 의해 유발된다. 혈류는 연축, 혈전증, 또는 저관류를 유발하는 순환 변화(circulatory change)와 같은 중첩된 현상으로 더욱 감소될 수 있다.
관상동맥 관류는 오스티아(대동맥 확장압)와 관상정동맥(우심방압)간 차별적인 압력에 좌우된다. 관상 혈류는 관상 오리피스에서 벤투리 효과 및 심실 수축동안 근육내 동맥의 압축으로 인해 심장수축동안 감소한다. 관상 혈류를 감소시키는 인자에는 감소된 대동맥 확장압, 증가된 심실내압과 심근 수축, 관상동맥 협착, 대동맥판 협착증과 폐쇄부전, 증가된 우심방압이 포함된다.
스트렙토키나아제 또는 조직 플라스미노겐 활성물질(TPA)과 같은 작용제를 사용한 혈전용해 요법은 최근에 형성된 혈전을 용해하는데 주로 이용된다. 이런혈전용해 요법은 대부분의 경우에 혈류를 재-확립할 수 있다. 이는 초기 과정(1시간이내)의 현저한 심근 손상을 예방하는데 유효하며, 적어도 추가적인 손상을 감소시킬 수 있다.
협심증은 일반적으로 흉골하 또는 전흉부에서 흉통의 발생으로 특성화되는 허혈성 심장 질환의 복합 증상이다. 이는 경색을 유발하지 않는 심근 허혈에 의해 유발된다. 심장 급사가 발생할 수 있는데, 이는 심장 질환후 1시간내 또는 증상없이 심장 원인의 예상치 못한 죽음이다.
다른 형태의 심장 질환에는 알코올성 심근증, 대동맥 판 탈출증, 대동맥 판 협심증, 부정맥, 심인성 쇼크, 선천성 심장 질환, 확장성 심근증, 심장 마비, 심부전, 심장 종양, 심장판막 폐 협심증, 비대성 심근증, 특발성 심근증, 허혈성 심장 질환, 허혈성 심근증, 승모판 역류증, 승모판 탈출증, 주산기 심근증, 안정형 협심증이 포함된다.
심근 경색은 다른 형태의 허혈성 심장 질환이다. 병인에는 관상내 혈전, 즉 궤양이 생성되거나 갈라진 협착성 플라크에서 혈전이 포함될 수 있다. 폐색성 관상내 혈전은 경벽성(transmural) 급성 심근 경색의 90%를 유발한다. 연축은 관상 죽상경화증을 수반하거나 또는 이를 수반하지 않고 혈소판 응집과 연관할 수도 있다. 색전증(emboli) 역시 심근 경색에서 나타날 수 있다.
심근 경색의 전체적인 형태학적 외형은 변화될 수 있다. 경벽성 경색은 심장내막에서 심장외막까지 좌심실벽의 완전한 비후(thickness)를 수반한다. 심장내막하(subendocardial) 경색은 좌심실벽의 내부 1/3-1/2에 한정된 다병변 괴사 부위를 수반한다. 심근 경색의 합병증에는"급사"의 가능성이 있는 부정맥과 전도장애, 경색이나 재경색의 연장, 선천성 심장질환(폐 부종), 심인성 쇼크, 심낭염, 색전술의 가능성이 있는 혈관막내 혈전증, 심낭압진의 가능성이 있는 심근벽 파열, 심판막 부전증의 가능성이 있는 유두근 파열, 심실 뇌동맥류 형성이 포함될 수 있다.
심근 경색(MI)은 심근의 일부에 관상 혈류의 갑작스런 감소에 기인하는 허혈성 심근 괴사로 정의된다.
급성 MI 환자중 >90%에서, 플라크 파열과 자주 연관되는 급성 혈전은 손상된 부위를 공급하는 동맥(죽상경화성 플라크에 의해 이미 부분적으로 폐색됨)을 폐색한다. 죽상경화성 플라크에서 내피 변화에 의해 유도된 변형 혈소판 기능은 혈전생성의 원인이 되는 것으로 추정된다. 자발적 혈전용해가 환자중 대략 2/3에서 진행되기 때문에, 혈전성 폐색은 대략 30%에서만 관찰된다.
심근 경색은 때때로 동맥 색전술(예, 승모판이나 대동맥 협착증, 감염성 심내막염, 쇠약성 심내막염에서)에 의해 유발된다. 심근 경색은 관상 연축 또는 정상 관상동맥을 갖는 환자에서 보고되었다. 코카인은 격렬한 관상동맥 연축을 유발하여, 사용자에게 코카인-유도된 협심증 또는 심근 경색을 초래할 수 있다. 부검 조사 및 관상 혈관조영술에서 코카인-유도된 관상 혈전증은 정상적인 관상동맥에서 발생하거나 기존의 죽종에 중첩될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
심근 경색은 주로 좌심실에 발병하지만, 손상이 우심실(RV) 또는 심방으로 확대될 수 있다. 일반적으로, 우심실 경색은 우관상동맥 또는 지배적 좌회선 동맥의 폐색으로 유발되고 심각한 삼첨판 역류 및 감소된 심박 출량을 동반하는 높은우심실 충전압력(filling pressure)으로 특성화된다. 약간의 우심실 기능장애는 아래-뒤(inferior-posterior) 경색 환자의 대략 절반에서 발생하고 10 내지 15%에서 혈행역학적 비정상을 유발한다.
펌프로서의 기능을 지속하는 심장의 능력은 심근 손상과 직접적으로 연관한다.
경벽성 경색은 심장내막에서 심장외막까지 심근의 완전한 비후(thickness)를 수반하고, 일반적으로 ECQ에서 비정상적 Q파로 특성화된다. 비경벽성 또는 심장내막하 경색은 심실벽으로 확대되지 않고 단지 ST 분절과 T-파 비정상만을 유발한다. 일반적으로, 심장내막하 경색은 심근의 내부 1/3에서 진행되는데, 여기서 벽 긴장도는 최대이고 심근 혈류는 순환계 변화에 가장 취약하다. 이들은 연장된 저혈압에 뒤이어 발생할 수도 있다. 괴사의 경벽성 깊이를 임상적으로 정확하게 측정할 수 없기 때문에, 경색은 ECG에 의해 Q파와 비-Q파로 좀더 효과적으로 분류된다. 파괴된 심근 부피는 CK 상승의 정도와 지속 기간으로 측정할 수 있다.
허혈성 심근증은 허혈성 심장 질환에서 또 다른 질환이다. 이런 질환에서 이미 심근 경색이 존재했을 수도 있지만, 상기 질환은 모든 주요 지맥에서 심각한 관상 죽상경화증에 기인한다. 결과는 부적절한 혈액 공급인데, 이는 근세포 손실을 초래한다. 간질 콜라겐 침착 형태의 섬유증과 결부된 근세포 손실은 감소된 컴플라이언스를 유발하는데, 이는 심장 확장을 수반하고 남아있는 근세포의 과부하를 초래한다. 이런 과정은 지속적인 근세포 비대(hypetrophy)에 의한 보상으로 지속된다. 비대뿐만 아니라 증식을 통한 보상도 있을 수 있는데, 이는 확대된 크기(정상 크기의 2 내지 3배)의 심장을 설명할 수 있다. 최종적으로, 심장은 더 이상 보상 능력을 상실하고, 심부전은 부정맥 및/또는 허혈성 질환으로 귀결된다. 따라서, 심근 경색 또는 협심증통의 전력에 상관없이 느리게 진행되는 심부전이 임상적으로 존재한다. 허혈성 심근증은 허혈성 심장 질환에서 사망률의 40% 정도를 차지한다.
심장의 재관류와 허혈동안, 소형 분자 2차 메신저와 같은 다수의 내생적 매개물질이 만들어지는데, 이들은 심근 기능에 영향을 준다. 수분간의 허혈성 에피소드이내에 심근 수축력이 소멸되는데, 수축력의 전반적인 회복은 허혈 단계의 지속 기간에 좌우된다(Daemen et al., 1999). 가령, 허혈 단계동안 Ca2+항상성이 교란되고, 산소-유래된 유리 라디칼이 만들어지며, 산화질소(NO) 합성과 방출이 진행된다. 이에 더하여, 사이토킨, 특히 TNFα와 IL-1β가 국소적으로 생산된다(Bolli, 1990). 손상되지 않은 심장에서, 이들 사이토킨은 유도성 NO 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2)와 포스포리파제 A2 및 혈관 유착 분자와 여러 케모킨에 대한 유전자 발현을 유도함으로써 허혈-유도된 심근 기능장애의 원인이 된다. 결과적으로, 소형 분자 메신저에 의해 매개된 심근 수축력의 즉각적인 저하 및 이후 사이토킨-매개된 호중구 침윤이 나타나고, 이들은 심장을 더욱 손상시킨다. 혈액 또는 혈액 산물의 부재하에 조사된 동물 심장에서 추가적인 손상은 허헐 단계동안 TNFα(Herskowitz et al., 1995)와 IL-1β를 생성한다. 심근세포 역시 이들 내생적 사이토킨의 작용에 의해 수축력을 상실한다(Meldrum et al.,1998).
TNFα와 IL-1β 매개된 심근 기능장애와 관련된 대부분의 실험 데이터는 동물 연구로부터 유래된다. 하지만, 선택적 심폐 우회로 수술을 받은 환자로부터 얻은 사람 심근 조직을 통제된ex vivo조건하에 조사하였다(Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). 본 실험 모델에서, 사람 심방골주(atrial trabeculae)는 혈액-없는 생리적으로 산소화된 완충액에 부유시키고, 이후 모의된 허혈 에피소드에 노출시킨다. 이 기간동안, 수축력은 극적으로 감소한다; 조직이 산소에 재-노출되면 수축력은 회복되긴 하지만 축소되고(60-70% 감소), 심근 손상의 증거는 크레아틴 키나아제의 방출로 관찰된다(Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). TNF 생활성이 허혈/재관류(I/R)동안 특이적으로 중화될 때 좀더 증가된 수축력 회복이 관찰되는데, 이는 내생적 심근 TNF 활성이 허혈 현상에 의해 유도된 수축 장애의 원인이 됨을 암시한다(Cain et al., 1999).
Daeman et al.(1999)은 신장 허혈의 뮤린 모델을 이용하여 허혈 및 이후의 재관류에 의한 조직 손상을 연구하였다. 이들은 신장 IL-18 mRNA 상향 조절이 허혈후 1일에 카스파제-1 활성화와 동시에 진행된다는 것을 보였다. IFN-γ와 IL-12 mRNA는 허혈후 6일에 후속으로 상향-조절되었다. IFN-γ 유도 사이토킨 IL-12와 IL-18의 협력적in vivo중화는 IFN-감마-의존성 MHC I군과 Ⅱ군 상향-조절을 IFN-γ 중화에서와 유사한 정도로 감소시켰다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 IL-18 저해물질이 사람 심근의 허혈/재관류 모델에서 심장의 수축력을 실질적으로 향상시킨다는 발견에 기초한다. 카스파제-1 저해물질(ICE) 역시 허혈과 재관류이후 수축력 저하를 완화시킨다.
게다가, 뮤린 심근 경색 모델에서 IL-1 저해물질의 투여는 증진된 생존 및 기능의 현저한 향상을 결과하였다.
이들 연구 결과는 IL-18 저해물질이 심근 장애의 치료 또는 예방에 적합하다는 것을 입증한다.
따라서, 본원 발명은 심장 질환, 특히 허혈성 심장 질환 및/또는 심부전의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
또한, 본원 발명은 IL-18 저해물질을 병든 조직이나 세포에 전달하는 유전자치료 방식을 적용하기 위하여, 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다.
본원 발명은 심혈관 질환 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 심장 질환, 특히 허혈성 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
도 1은 허혈-유도된 심근 수축 장애에 대한 IL-18BP의 효과를 도시한다.
(A) 허혈성 손상에 대한 동역학적 반응. 균형(eq)이후, 대조(Ctrl) 골주(trabeculae)는 전체 실험 과정동안 정상(normoxic) 조건하에 초과융해(superfusion)되었다. 골주는 IL-18BP(5 ㎍/㎖)의 존부하에 허혈/재관류를 실시하였다. 수직축은 실험 개시 시점(0시)에 상대적인 확장력(developed force) 비율을 나타낸다. 데이터는 단일 환자의 골주로부터 유래된 것으로, 90분 시점에서 확장력의 평균 변화를 측정하는데 이용되는 방법의 전형이다.
(B) 1 또는 5 ㎍/㎖ IL-18BP로 IL-18 중화이후의 허혈후 확장력. 결과는 재관류 완결이후 Ctrl에 상대적인 확장력의 평균 변화 비율로 표시한다. 괄호안의 숫자는 IL-18BP(㎍/㎖)를 표시한다. N=6.*I/R(허혈/재관류)과 비교하여 p<0.01.
도 2는 심근 IL-18 단백질 함량을 도시한다. 골주는 정상 조건하에 90분간 초과융해후(대조) 또는 30분간 허혈(I/R)후 균일화시켰다. 골주는 동일한 개체로부터 유래되었다. IL-18 수준은 수직축에 pg/㎖로 표시한다. N=4.*p<0.01
도 3은 대조와 허혈성 심방 조직에서 일정한 IL-18과 IL-18BP mRNA 수준을 도시한다. IL-18과 IL-18BP mRNA 수준은 RT-PCR로 측정하였다. 데이터는 평가된 2명의 개체중 한 개체로부터 유래된다. A는 에티듐브롬화물 염색된 아가로즈 겔을도시하는데, 여기서 PCR 산물이 분리되었고, B는 대조(GAPDH)에 대한 폴드(fold) 변화로 PCT 산물 함량의 정량 결과를 도시한다.
도 4는 허헐후 확장력에 대한 ICE 저해의 효과를 도시한다. 결과는 허혈/재관류(I/R)이후 대조(Ctrl)에 상대적인 확장력의 평균 변화 비율로 나타낸다. 괄호안의 숫자는 ICEi 농도(㎍/㎖)를 표시한다. N=7.*I/R(허혈/재관류)과 비교하여 p<0.01.
도 5는 I/R이후 조직 크레아틴 키나아제(CK) 활성을 도시한다. CK는 조직의 습식 중량 ㎎당 활성 단위로 나타낸다. 실험 조건은 수평축에 표시한다. Ctrl과 I/R, N=6; IL-18BP(5 ㎍/㎖), N=5; ICEi(10과 20 ㎍/㎖), N=5 각각;*I/R(허혈/재관류)과 비교하여 p<0.05.
도 6은 TNFα(1 ng/㎖)의 첨가에 앞서, 15분동안 10 ㎍/㎖로 배양된 골주의 100%(n=5)로 설정된 균형 기간이후의 확장력에 상대적인 확장력의 평균 변화를 도시한다. TNFα와 IL-18BP를 각 변화 중탕에 첨가하였다.
도 7은 정상 조건하에 IL-18에 대한 사람 심방골주의 시간에 따른 반응을 도시한다. 성숙 IL-18(100 ng/㎖)을 90분 전체 실험 기간동안 심방골주에 첨가하였다. 수직축은 기선(baseline) 확장력으로부터 평균 변화 비율을 표시한다. 기선은 균형 기간의 종결 시점에 측정하였다(나타내지 않음). (n=6). 나머지 실험 기간동안 동일한 간격으로 대조와 비교하여*P<0.05,**P<0.001.
도 8은 I/R, TNFα(1 ng/㎖), TNFα(10 ng/㎖) + IL-18BP에 노출이후 근세포 조직 크레아틴 키나아제 활성의 보존을 도시한다. CK 활성은 조직의 습식 중량 ㎎당 CK 활성 단위로 나타낸다(n=6).
본원 발명은 IL-18 저해물질이 심장 질환, 특히 허혈성 심장 질환에 유익한 효과를 발휘한다는 발견에 기초한다. 하기의 실시예에 도시된 바와 같이, 여러 상이한 IL-18 저해물질이 심근의 허혈후 확장력에 현저한 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다.
이에 더하여, IL-18 저해물질은 심근 경색의 생체내 모델에서 검사되었는데, 진전된 생존 및 현저하게 향상된 심실 기능을 결과하였다.
따라서, 본원 발명은 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
본원 발명에서, "심장 질환"에는 심장의 기능장애를 비롯한 여러 질환이 포함된다. 이들은 일반적으로 심혈관 질환이라고도 한다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, 심장 질환은 허혈성 심장 질환이다.
본원에서 "허혈성 심장 질환"에는 "본원 발명의 배경 기술"에 상세하게 기술된 허혈성 심장 질환을 비롯한 여러 유형의 허혈성 심장 질환 및 허혈성 심장 질환과 관련된 심혈관 질환이나 장애가 포함된다.
본원 발명에 따른 용도는 장기적인 치료에 적합하고, 따라서 만성 심장 질환에 특히 적합하다. 본원 발명의 적절한 구체예에서, 허혈성 심장 질환은 만성이다. 협심증은 장기간 허혈성 심장 질환을 앓은 환자의 가장 일반적인 임상적 특징이다. 심근 경색의 선행 에피소드이후 손상된 좌심실 기능은 좌심실 장애 및 궁극적으로 울혈성 심부전을 유발할 수 있다. 따라서, 본원 발명은 협심증의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
다른 적절한 구체예에서, 허혈성 심장 질환은 급성이고, 바람직하게는 심근 경색이다.
일반적으로, 급성 심근 질환 또는 심근 경색은 심근, 특히 좌심실의 괴사를 수반한다. 이는 중첩된 혈전 또는 플라크 출혈로 인한 관상동맥 죽종에 주로 기인한다. 괴사는 염증성 침윤, 괴사성 근육으로부터 혈액으로 방출된 섬유성 복구 효소, 백혈구증가증을 동반하는데, 이들은 진단적으로 유용하다. 급성 심근 경색의 합병증에는 부정맥, 심부전, 혈심낭을 유발하는 심근 파열, 색전증을 유발하는 혈관막내 혈전, 심장 동맥류등이 포함된다. 다른 합병증에는 급사, 부정맥, 지속적인 통증, 협심증, 심부전, 승모판막 폐쇄부전, 심낭염, 심장 파열(심실 통증, 격막 또는 유두근), 혈관막내 혈전증, 심실 동맥류, 드레슬러 증후군(흉부 통증, 열병, 삼출), 폐 색전증이 포함된다. 본원 발명에 따른 약물은 심근 경색의 이들 합병증의 치료 및/또는 예방에도 사용될 수 있다.
다른 적절한 구체예에서, 심장 질환은 심부전이다. 심부전은 심장이 정상적인 대사에 필요한 속도로 혈액을 공급할 수 없는 질환 상태이다. 거의 모든 형태의 심부전에서 심장 출력이 감소하는데, 이는 동맥 저충전(underfilling)이라고 하는 1단계 저관류를 유발한다. 신체는 유체를 유지함으로써 증가하는 혈액 부피를 보상한다. 심부전은 급성 또는 만성일 수 있다. 초기 단계에서 심부전의 임상적 증상이 일방으로 보일 수도 있지만, 우심실과 좌심실에 의해 공유되는 심실간 격막으로 인하여 한 심방의 부전은 필연적으로 다른 심방의 부전을 유발한다. 심부전은 허혈성 심장 질환에 기인할 수 있다. 이는 다른 질환, 예를 들면 전신 고혈압, 심장판막 질환, 또는 울혈성 심부전을 유발하는 폐 질환에 기인할 수도 있다.
심부전은 울혈성 심부전일 수 있는데, 이는 혈류역학, 신장, 신경호르몬 반응의 특징적인 패턴을 유발하는 증후성 심근 장애이다. 심부전의 임상적 증상은 좌심실 부전 또는 우심실 부전일 수 있다. 심부전은 심장수축이나 심장확장 장애, 또는 둘 모두에 의해 나타난다. 심장수축과 심장확장의 종합적 비정상이 일반적이다.
다른 적절한 구체예에서, 심장 질환은 심근증이다. 심근증은 심실 심근의구조적 또는 기능적 비정상이다.
본원 발명에서 "예방"은 특정 효과의 완전한 예방을 의미할 뿐만 아니라, 발병 이전이나 발병 초기에 이런 효과를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방, 약화, 감소 또는 소멸시키는 것을 의미한다.
본원 발명에서 "치료"는 발병이후 병리학적 발생의 약화, 감소 또는 소멸을 비롯한 질환의 진행에 대한 임의의 유익한 효과를 의미한다.
본원 발명에서 "IL-18 저해물질"은 IL-18 생산을 약화, 감소, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방/차단하는 방식으로 IL-18 생산을 조절하는 임의의 분자를 의미한다.
생산 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 본원 발명에 따른 이런 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18유전자의 발현 저해물질, IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 안티센스 mRNA, 정확한 접힘을 손상시키는 단백질, IL-18의 성숙이나 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질, 일단 합성된 IL-18을 분해시키는 프로테아제, 카스파제-1 저해물질과 같이 성숙 IL-18을 만들기 위하여 프로-IL-18을 절단하는 프로테아제의 저해물질 등일 수 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 예로써 IL-18 길항제일 수 있다. 길항제는 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 담당하는 IL-18이나 IL-18 결합부위를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과 특이성으로 IL-18 분자 자체와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항제는 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호 경로를 저해할 수도 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자, IL-18 수용체를 차단하는 약물, 다클론이나 단클론 항체와 같은 IL-18 항체, 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 약물이나 분자일 수도 있는데, 이들은 IL-18에 의해 매개되는 세포내 혹은 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 ICE-저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 한가지에 대한 항체, IL-18 수용체 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항제, IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능유도체, 활성 단편 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택된다.
"IL-18 결합단백질"은 본원에서 IL-18BP와 동의어로 사용된다. 여기에는 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18 결합단백질의 접합변이체 또는 동소체를 비롯하여 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질이 포함된다. 특히, 본원 발명에서 IL-18BP의 사람 동소체 a와 c가 유용하다. 본원 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 만들 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다.
본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 1개이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하였을 때 생성된 산물의 능력에 큰 변화가 없다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 공지된 적절한 기술을 활용하여 만들 수 있다.
본원 발명에서 뮤테인에는 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 본원 발명에 따른 IL-18BP 또는 바이러스 IL-18BP를 인코드하는 DNA나 RNA와 혼성화되는 DNA나 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al., supra.). 제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm이하의 12-20℃ 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS. 당업자가 인지하는 바와 같이 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).
임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한 가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에, 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용될 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사능면역검사 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.
적절한 구체예에서, 이런 뮤테인은 WO 99/09063에서 규정된 바와 같이 IL-18BP 또는 바이러스-인코드된 IL-18BP 상동체의 서열과 적어도 40% 동일성 또는 상동성을 갖는다. 좀더 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성 또는 상동성을 갖는다.
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인, 또는 이를 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 내용에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.
본원 발명에 따른 뮤테인에 대한 적절한 변화는 "보존성" 치환이다. IL-18BP 폴리펩티드 혹은 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산이 포함된다(16). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있는데, 특히 30개 이하, 적절하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고, 기능적 구조에 중요한 아미노산(시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드이나 단백질의 뮤테인 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산의 치환체를 만드는 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 가령 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 리신이 치환된 경우는 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에서 제시한다.
"융합단백질"은 체액에서 연장된 머무름 시간을 갖는 다른 단백질과 융합된 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린 또는 이의 단편과 융합될 수 있다.
본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성 성질을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다.
가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 차단하고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일ㆍ이차아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드, 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
본원 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 분취물"에는 단독으로 또는 관련된 분자 혹은 이에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 조합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 단 이런 단편은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18이나 이의 수용체, IL-18R을 지향하는 항체이다. IL-18 아단위, 다시 말하면 IL-18Rα와 β를 지향하는 항체가 본원 발명에 사용될 수 있다.
본원 발명의 따른 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체이다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특성화된다. 본원 발명에 사용될 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병리 질환이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특성화된다.
중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화된 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를생산한다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특징지어지는 면역글로불린 분자다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 일반적으로 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체로, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 잔존한다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).
따라서, 다른 적절한 구체예에서 IL-18이나 IL-18R 항체는 인화 항체이다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.
다른 적절한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다.
완전한 사람 항체를 제조하는 한가지 방법은 생쥐 체액 면역계의 "인화", 다시 말하면 내생적 Ig 유전자가 불활화된 생쥐에 사람 면역글로불린(Ig) 좌위의 도입으로 사람 Ig을 생산할 수 있는 생쥐 종(이종유전자도입생쥐)의 생산으로 구성된다. Ig 좌위는 물리적 구조와 유전자 재배열 및 광범위한 면역 반응을 궁극적으로 유도하는데 필요한 발현 과정의 측면에서 복합적이다. 항체 다양성은 Ig 좌위에존재하는 서로 상이한 V, D, J 유전자간 조합 재배열에 의해 주로 발생한다. 이들 좌위는 또한, 산재된 조절 요소를 보유하는데, 이들은 항체, 발현 대립인자 배제, 분류군 전환(class switching), 친화도 증진을 조절한다. 재배열되지 않은 사람 Ig 전이유전자의 생쥐 도입은 생쥐 재조합 조작이 사람 유전자에도 적합함을 입증하였다. 또한, 다양한 이소타입의 항원 특이적 hu-mAB를 분비하는 하이브리도마는 항원으로 이종유전자도입생쥐 면역화에 의해 수득될 수 있다.
완전한 사람 항체 및 이들의 생산 방법은 당분야에 공지되어 있다(Mendez et al(1997); Buggemann et al(1991); Tomizuka et al.,(2000); Patent WO 98/24893).
본원 발명의 좀더 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18BP, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 이들의 순환 치환된 유도체이다. 이들 동소체, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 단편은 IL-18BP의 활성보다 좀더 높은 활성, 바람직하게는 좀더 높은 안정성 또는 좀더 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 대량으로 좀더 용이하게 생산 또는 정제된다.
IL-18BP의 서열 및 이의 접합변이체/동소체는 (Kim et al., 2000)뿐만 아니라, WO 99/09063 또는 (Novick et al., 1999)에서 구할 수 있다.
IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에 의한 내약성 또는 면역원성을 향상시킬수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킬 수 있다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.
따라서, 본원 발명의 적절한 구체예에서 IL-18 저해물질, 특히 IL-18BP는 PEG화된다.
본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부분으로 구성되는 융합단백질로, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 삼중항 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열간에 도입된 펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 링커 서열 Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
적절한 구체예에서, IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 바람직하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063(실시예 11)에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동소체는 본원 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동소체 IgG2혹은 IgG4, 또는 다른 Ig(IgM, IgA)의 생산에도적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 혹은 동종-)일 수 있다.
본원 발명의 또 다른 구체예에서, IL-18 저해물질은 TNF 길항물질과 병용한다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.
대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호 길항물질"). 이들 길항물질은 심장 질환의 치료에서 단독으로 사용하거나 또는 IL-18 저해물질과 병용한다.
TNF 길항물질은 시험관내에서 영향을 쉽게 받는 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 면역글로불린 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 이용된 TNF 몰농도의 0.1 내지 100배 몰농도의 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF가 없거나 길항물질만 있는 대조군이 포함된다(Tucci et al., 1992).
격리 길항물질은 본원 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI과 TNF-RII가 본원 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절두형은 본원 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에 기술한다.
TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(Engelmann et al., 1990). 본원 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 IL-18 저해물질의 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.
다른 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본원 발명에 따라 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.
수용체의 분자의 유도체, 단편, 영역, 생물학적 활성 부분은 본원 발명에 사용될 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 균등물이나 유도체는 폴리펩티드, 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이는 충분한 크기를 가지며 막-결합된 TNF 수용체와의 상호작용을 저해 혹은 차단하는 정도의 친화성으로 TNF와 결합할 수 있다.
IL-18 저해물질은 TNF 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
본원 발명에 따라, 약물은 IL-18 저해물질과 함께, 심장 질환의 치료에 공지된 작용제, 예를 들면 질산염(예, 니트로글리세린), 이뇨제, ACE 저해물질, 디기탈리스, 베타-차단제 또는 칼슘 차단제를 추가로 함유할 수 있다. 활성 성분은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 대략 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 대략 1 내지 10 ㎎/㎏, 또는 2 내지 5 ㎎/㎏의 함량으로 사용된다.
적절하게는, 본원 발명에 따른 IL-18 저해물질은 피하 또는 근육내 루트를 통하여 전신 투여된다,
더 나아가, 본원 발명은 심장 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, IL-18 저해물질이 필요한 부위에 이를 전달하는데 유전자 치료 방식이 고려된다. 심장 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여, IL-18 저해물질의 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터는 병든 조직에 직접 주사하여, 유전자 치료 벡터의 전신 투여와 관련된 문제, 예를 들면 벡터의 희석, 표적 세포나 조직으로의 도달과 표적화, 부작용을 회피할 수 있다.
정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본원 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).
당업자가 인지하는 바와 같이 동일 기술을 활용하여, 다시 말하면 네거티브조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현을 차단하고, 따라서 IL-18 발현을 하향-조절 또는 예방하는 것이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이 IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 이용과 동일한 효과를 갖는다.
또한, 본원 발명은 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18의 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18 저해물질은 선택적으로 TNF 저해물질의 치료요법적 효과량과 함께, 제약학적 조성물로 투여될 수 있다.
IL-18BP 및 이의 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 순환 치환된 유도체는 제약학적 조성물의 바람직한 활성 성분이다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 부형제에 녹인 주사용 단위 약형 형태로 만들 수 있다.
본원 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반체와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.
장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반체(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.
본원 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).
치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준의 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.
"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 변한다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.
본원 발명에 따라, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 100 ㎎, 대략 0.01 내지 10 ㎎, 대략 0.1 내지 5 ㎎, 1 내지 3 ㎎, 또는 2 ㎎ 함량으로 사용된다.
본원 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로를 통한 투여다. 본원 발명에서 좀더 바람직한 투여 경로는 근육내 투여다. IL-18 저해물질을 작용 부위에 직접 투여하기 위하여, 이의 국소 투여도 바람직하다.
다른 적절한 구체예에서, IL-18의 저해물질은 매일 또는 격일로 투여된다.
일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 지속 방출 형태로 제공한다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기분량이나 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시될 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 발병동안 또는 발병이전에 실시될 수 있다.
본원 발명에 따른 IL-18 저해물질은 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 TNF 저해물질 및/또는 다른 심장보호제에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 예방이나 치료 목적으로 투여될 수 있다. 다른 치료 약물과 동시에 투여되는 활성 약물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.
본원 발명은 제약학적 조성물의 제조 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질 및/또는 TNF 길항물질의 효과량을 제약학적으로 수용가능한 담체와 혼합하는 단계로 구성된다.
본원 발명은 또한, 심장 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 선택적으로 TNF 길항물질의 제약학적 효과량과 함께, IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
본원의 상세한 설명에 비추어, 본원 발명은 과도한 실험없이 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 광범위한 등가의 파라미터, 농도, 조건에서 동일하게 실시할 수 있다.
본원 발명을 특정 구체예와 연계하여 기술하였지만, 추가적인 개변이 가능하다. 본 출원에는 본원 발명의 원칙을 전반적으로 따르고 본원 발명이 속하는 분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 본원 발명의 임의 변용, 활용 또는 적용이 포함된다.
논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본원 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 설시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체내용은 순전히 참고로 한다.
특정 구체예의 전술한 설명에서는 본원 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에서 사용된 용어는 본원을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.
실시예 1: IL-18의 저해는 시험관내에서 심근 허혈성 장애를 감소시킨다.
재료와 방법
시약. N-말단(His)6을 보유하는 IL-18BPa 동소체는 중국 햄스터 난소 세포에서 발현시키고 균일하게 정제하였다. IL-18BPa-(His)6의 능력은 이미 보고되었다(Kim et al., 2000). ICE 저해물질(ICEi) Ac-Try-Val-Ala-Asp-클로로메틸케톤(YVAD)은 Alexis Biochemicals(San Diego)에서 구매하고 DMSO에 10 ㎎/㎖로 용해시켰다. ICEi는 사용에 앞서 Tyrode 용액에 희석하였다. 사람 말초혈 단핵 세포에서, ICEi는 ELISA(Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ) 측정에서 성숙 IL-1β의 엔도톡신-유도된 분비를 92% 정도 감소시킨다.
분리된 심방골주. 심폐기를 이용한 선택적 관상동맥 우회 수술을 받은 환자는 우심방에 캐뉼러의 삽입이 필요하다. 이 시점에서, 우심방이(right atrialappendage)를 통상적으로 절개하고 떼어낸다. 골주는 떼어낸 조직으로부터 수득하였다. 사람 심방 조직은 4℃에서, 산소화된 변형 Tyrode 완충용액에 위치시켰다. 변형 Tyrode 용액은 탈이온화 증류수로 매일 준비하는데, 5.0 mmol/ℓD-글루코오스, 2.0 mmol/ℓ CaCl2, 118.0 mmol/ℓ NaCl, 4.0 mmol/ℓ KCl, 1.2 mmol/ℓ MgSO4ㆍ7H2O, 25.0 mmol/ℓ NaHCO3, 1.2 mmol/ℓ NaH2PO4를 함유하였다. 기질-없음 Tyrode 용액은 삼투압을 유지하기 위하여 7 mmol/ℓ 염화콜린을 함유하였다. 달리명시하지 않으면, 화학약품과 시약은 Sigma로부터 구매하였다. 2 내지 4개의 골주(4-7 mm 길이와 <1.0 mm 직경)는 힘 변환기에 부착시키고 변형 Tyrode 용액의 가열된(37℃) 30-㎖ 중탕(bath)에 담갔다; 92.5% O2/7.5% CO2혼합물은 정상상소상태(normoxia)동안 버블링(bubbling)하였다. 이 가스 혼합물은 >350 mmHg(1 mmHg=133 Pa)의 O2분압, 36-40 mmHg의 CO2분압, 7.35-7.45의 pH를 제공하였다. 각 파라미터는 자동화 혈액 가스 분석기로 정기적으로 검사하였다. 장기(organ) 중탕 온도는 전체 실험동안 37℃에 유지시켰다. 모의 허혈동안, 가스 혼합물은 92.5% N2/7.5% CO2로 전환되었다. 상기 혼합물은 <50 mmHg의 O2분압을 발생시켰다. 완충용액은 30분 모의 허혈 기간을 제외하고 매 20분마다 교체하였다.
실험 설계
골주는 90분동안 균형화시켜 기선 신장력(stretch force)을 1,000 ㎎으로 증가시키고 확장력을 안정화시켰다. 250 ㎎이상의 확장력을 발생시키지 못한 골주는 본 연구에서 배제하였다. 90분간 균형동안, 조율(pacing)은 필드 자극(field stimulation)을 위한 백금 전극(Radnoti Glass, Monrovia, CA)으로 실시하였다. 전극은 골주의 양 편에 위치시키고 한계보다 20%이상 높은 전압에서 6-ms 펄스로 자극하며(Grass SD9 자극장치, Warwick, RI) 정상산소상태(normoxia)동안 1Hz로, 허혈동안 3Hz로 조율하였다. 수축은 힘 변환기(Grass FT03)로 모니터하고 자동화된 전치증폭기와 디지털변환기(MacLab Quad Bridge, MacLab/8e, AD Instrument, Milford, MA)로 기록하며 매킨토시 컴퓨터로 계속 모니터하였다.
균형후, 단일 환자에서 얻은 골주는 3가지 실험 조건에서 조사하였다: 대조 조건은 90분간 정상(normoxic) 초과융해로 구성되었다. I/R은 30분간 모의 허혈 및 이후 45분간 재관류로 구성되었다; 세 번째 조건은 항-사이토킨 개입으로 구성되었다. 후자 경우에, 항-사이토킨은 허혈의 발병 직전에 초과융해 중탕에 첨가하고 전체 45분간 재관류동안 존재하였다.
보존된 골주 CK 활성
최종 재관류 조직(90분) CK 활성은 전술한 바와 같이 측정하였다(Kaplan et al., 1993). 조직은 100 vol 차가운 등장성 추출 완충액(Cleveland et al., 1997, Kaplan et al., 1993)에 균일화시켰다. 분석은 자동화 분광광도계를 이용하여 CK 키트(Sigma)로 실시하였다. 결과는 ㎎(조직의 습식 중량)당 CK 활성 단위로 나타낸다.
RNA 분리 및 역전사-병합된 PCR
새로운 골주는 TRi-시약(Molecular Research Center, Cincinnati)에 균일화시키고, 전체 RNA는 클로로포름 추출과 이소프로판올 침전으로 분리하였다. RNA는 디에틸-피로카르보네이트-처리된 물에 용해시키고 DNase-처리하며 GeneQuant(Amersham Pharmacia Biotech)로 정량하였다. cDNA 방법은 이미 보고되었다(Reznikov et al., 2000). 각 PCR은 다음의 순서로 실시되었다: 95℃에서 15분동안 사전가열; 94℃에서 40초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분간 사이클; 72℃에서 10분간 최종 신장 단계. 최적 사이클 회수는 35회로 결정되었다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH), 사람 IL-18(Reznikov et al.,2000), 사람 IL-18BPa(Kim et al., 2000)에 대한 프라이머는 이미 보고되었다. PCR 산물은 0.5 ㎎/㎖ 브롬화에튬으로 0.5x TBE(50 mM Tris/45 mM 붕산/0.5 mM EDTA, pH 8.3)를 함유하는 1.5% 아가로즈 겔에서 분리하고 UV 조명으로 가시화시며 사진촬영을 하였다. 농도법(densotimetry)은 네거티브 영상(IMAGEQUANT 소프트웨어, Molecular Dynamics)에서 실시하고, IL-18과 IL-18BP PCR 산물의 상대적 흡수도는 GADPH에서 얻은 흡수도에 대하여 교정하였다.
IL-18 확인
새로운 골주는 CK 측정을 위하여 전술한 바와 같이 균일화시켰다. IL-18은 액상 전기화학발광(ECL, Igen, Gaithersburg, MD)으로 분석하였다. 생쥐 항-혈청 IL-18mAb(R&D Systems)는 루테늄(Igen)으로 표지하였다. 게다가, 친화성-정제된 염소 항-사람 IL-18 항체(R&D)는 비오틴(Igen)으로 표지하였다. 비오틴화된 항체는 0.25% BSA, 0.5% Tween-20, 0.01% 아지드(ECL 완충액)를 함유하는 PBS(pH 7.4)에서 1 ㎍/㎖ 최종 농도로 희석하였다. 분석 튜브당, 25 ㎕ 비오틴화된 항체는 25㎕ 스트렙타비딘-피복된 상자성(paramagnetic) 비드(Dynal, Great Neck, NY)와 함께, 활발한 교반으로 실온에서 30분동안 1 ㎍/㎕로 사전배양하였다. 검사 시료(25 ㎕) 또는 표준을 튜브에 첨가하고, 후속으로 25 ㎕ 루텐일화 항체(ECL 완충액에서 최종 농도 1 ㎍/㎕로 희석)를 첨가하였다. 이후, 튜브는 24시간동안 교반하였다. 반응은 튜브당 200 ㎕ PBS를 첨가하여 중단시키고, 화학발광의 총합은 Origen Analyzer(Igen)로 측정하였다. IL-18의 검출 한계는 16 pg/㎖이다.
심폐기의 캐뉼러 삽입동안 얻은 공초점 검경 사람 심방 조직은 1 ㎝ 플라스틱 홀더(Meldrun et al., 1998)에 위치시키고 봉매(embedding)하며 드라이아이스로 냉각된 이소펜탄에서 조직-동결 배지(Triangle Biomedical Science, Durham, NC)에 동결시켰다. 동결 절편(5 ㎛)은 Leica CM 1850 저온유지장치(Leica, Deefield, IL)에서 절단하였다. 슬라이드는 4% 파라포름알데하이드에 10분동안 고정시키고 대기-건조시키며 10% 정상 염소 혈청으로 보충된 PBS에서 20분동안 배양하였다. 절편은 1:100 희석된 토끼 항-사람 IL-18 항체(Peprotech, Rocky Hill, NJ) 또는 네거티브 대조인 1 ㎍/㎖ 비면역 토끼 IgG에 배양하였다. 항체는 1% BAS를 함유하는 PBS에 희석하였다. 4℃에서 하룻밤동안 배양후, 절편은 PBS에 녹인 0.5% BSA로 3회 세척하였다. 이후, 절편은 Alexa488(Molecular Probes)에 공액된 이차 염소 항-토끼 항체와 함께, 실온에서 60분동안 암실에 배양하였다. 핵은 1 ㎍/100 ㎖ 비스벤지이미드(Sigma)로 푸른색으로 염색하였다. 염색후, 절편은 세척하고 Leica DM RXA(Leica) 공초점 레이저 스캐닝 장치로 검사하고 매킨토시용 SLIDEBOOK 소프트웨어(Intelligence Imaging Innovations, Denver)로 분석하였다.
통계학적 분석
데이터는 평균 ±SEM으로 나타낸다. 각 환자의 조직에서 확장력의 평균 변화는 90분에서 대조값과 비교하여 계산하였다. 군간 차이의 통계학적 유의성은 Bonderroni-Dunn 사후 분석으로 측정하였다. 통계학적 분석은 STAT-VIEW 4.51 소프트웨어(Abacus Concepts, Calabasas, CA)로 실시하였다.
결과
허혈후 확장력에 대한 IL-18BP를 사용한 내생적 IL-18의 중화 효과
도 1A는 I/R 손상에 대한 골주의 동적 반응을 도시한다. 최종 15분동안 균형이 나타나는데, 이는 실험 기간의 시작시점에서 100%로 표준화시켰다. 대조 골주는 전세 실험동안 정상(normoxic) 조건하에 초과융해(suprafusion)한다. 도시된 바와 같이, 대조 골주에서 확장력은 감소(10%)한다. 허혈된 골주는 수축 기능에서 급속한 감소를 보인다; 재관류에서, 수축력은 대조 확장력의 대략 25%까지 회복된다. 대조적으로, 허혈에 노출되지만 IL-18이 존재하는 골주는 대조 확장력의 55%까지 회복되었다. 여러 환자로부터 얻은 심장 조직의 I/R 반응을 평가하기 위하여, 90분에 대조 골주의 확장력 수준은 각 환자 시료에서 100%로 설정하고, 실험군에서 확장력의 상대적 변화 비율을 계산하였다.
도 1B에 도시된 바와 같이, 처리되지 않은 골주(I/R)에서 허혈후 확장력은 대조의 평균 35%로 감소하였다. 하지만, IL-18BP의 존재하에 이런 감소는 각각 1 ㎍/㎖에서 대조의 평균 66.2%, 5 ㎍/㎖에서 대조의 76%로 완화되었다. 이들 결과는 I/R이 ICE로 내생적 전구물질 IL-18을 가공한 이후 생물학적 활성 IL-18의 방출을 유도한다는 것을 암시한다. 따라서, IL-18은 새로 수득된 심방 조직에서 측정되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 기초 IL-18은 우심방에 심폐기 캐뉼러의 삽입이전에 수득된 골주에 존재하였다. 90분 균형, 30분 허혈, 45분 재산소화이후, 골주는 균일화시키고, IL-18 수준을 측정하였다. I/R이후 조직에서 IL-18은 4.5배 증가하였다(도 2).
이에 더하여, 이들 조직에서 IL-18과 IL-18BP에 대한 정상-상태(steady-state) mRNA 수준을 측정하였다. 새로 수득된 허혈전 심방 균질액에서 IL-18과IL-18BP에 대한 기초 유전자 발현이 관찰되었다(도 3A, B). IL-18 단백질에서 증가와 유사하게, I/R은 정상-상태(steady-state) IL-18 mRNA 수준에 추가적인 증가(4.7배 증가)를 유도하였다. IL-18BP 유전자 발현 역시 새로 수득된 심방 조직에서 관찰되었는데, I/R이후에 약간(1.3배) 증가하였다.
사람 심근에서 IL-18의 위치
ECL 측정에서 IL-18 단백질 및 IL-18 mRNA가 새로 수득된 심근 균질액에 존재하기 때문에, IL-18의 위치를 확인하는데 조직화학적 염색이 이용되었다. 심방 조직은 심폐기 캐뉼러 삽입 직전에 수득하고 즉시 스냅 동결하였다(나타내지 않음). IL-18은 내재된 심근 대식세포 및 혈관내피세포에서 관찰되었다. 대식세포와 내피세포에서 이들 IL-18은 수술-관련된 허혈이 진행되기 전에 존재하고 임의의 외래 물질과의 접촉없이 존재한다. 내재된 대식세포와 내피세포에서 IL-18의 위치는 건강한 개체로부터 새로 수득된 사람 말초 단핵구에서 구성적 작동전구물질 IL-18에 관한 기존 연구(Puren et al., 1999)의 결과와 일치한다. 따라서, 작동전구물질 IL-18은 허혈성 심장 질환으로 관상동맥 우회수술이 예정된 환자의 심근에 존재한다고 결론내릴 수 있다.
허혈후 확장력에 대한 ICE 저해의 효과
IL-18BP가 허혈-유도된 심근 장애를 효과적으로 완화시켰기 때문에, 작동전구물질 IL-18의 성숙 IL-18로의 전환 저해 역시 허혈-유도된 심근 장애를 완화시킨다고 가정하였다. 따라서, 특정 ICE 저해물질 YVAD는 허혈의 발병에 앞서 초과융해 중탕에 첨가하였다. YVAD 첨가에 의한 ICE 저해는 전체 허혈 기간 및 재관류동안 지속하였다. ICE의 YVAD-매개된 저해는 I/R에서 대조의 35%에서 10 ㎍/㎖에서 60%, 20 ㎍/㎖에서 75.8%로 수축력의 향상에서 입증된 바와 같이, 허혈-유도된 심근 장애의 완화를 결과하였다(도 4). 이들 결과는 사람 심근에서 생물학적 활성 IL-18이 ICE에 의한 작동전구물질 IL-18의 결과물이라는 사실을 뒷받침한다. 이에 덧붙여, 이들 결과는 심근 허혈이 잠복성 ICE를 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다.
세포 생존력의 보존
CK의 세포내 수준을 이용하여 I/R이후 세포 생존력의 정도를 평가하였다. 본 분석에서, CK값이 높을수록, 생존 세포의 개체수가 더 많았다. 각 항-사이토킨 개입은 세포 생존력의 보존을 결과하였다. 도 5에 입증된 바와 같이, IL-18BP와 ICE 저해(10과 20 ㎍/㎖)는 I/R후 세포내 CK 수준을 ㎎(습식 조직)당 각각 1,399에서 5,921, 5,675, 6,624, 4,662로 증가시켰다. 이들 관찰 결과는 IL-18의 I/R-유도된 활성화의 저해가ex vivo모델에서 심근세포 생존력을 보존시킨다는 것을 시사한다.
TNFα유도된 심근 기능의 중화 효과
도 6에 도시된 바와 같이, 골주의 확장력(DF)은 외생적 TNFα에 90분간 노출후 18% 정도 감소하였다. TNFα의 첨가에 앞서 10분동안 IL-18BP와의 배양으로 외생적 TNFα에 노출된 사람 심근에서 수축 기능에 대한 내생적 IL-18의 중화 효과는 확장력(DF)의 감소 크기를 축소시켰다(도 6). 90분후, 확장력은 대조군에서 18% 정도 감소한 반면, TNF-노출된 골주에서는 대조와 비교하여 58% 정도 증가하였다.하지만, IL-18BP의 존재하에 TNFα-노출된 골주에서 확장력은 대조와 비교하여 30% 정도만 감소하였다. 이들 데이터는 심근 수축 기능저하에 대한 TNFα의 직접적인 효과가 적어도 부분적으로 생물학적 활성 내생적 IL-18에 의해 매개된다는 것을 시사한다.
확장력에 대한 내생적 IL-18의 효과
심근 수축 기능에 대한 외생적 IL-18의 직접적인 효과를 측정하였다. IL-18은 90분간 균형후 초과융해된 골주에 첨가하고, 각 중탕은 교체하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, IL-18은 전체 실험기간동안 확장력의 느리지만 점진적인 감소를 유도한다. IL-18에 대한 90분간 지속적인 노출후, 확장력은 42% 정도 감소하였다. 이들 데이터는 TNFα와 유사한 외생적 IL-18이 심근 진정제로 작용한다는 것을 입증한다.
흥미롭게도, IL-18은 TNFα만큼 강력한 심근 진정제가 아니다.
세포 생존력의 보존
카제아제는 아폽토시스와 종종 연관한다. TNFα에 노출된 골주에서 세포 생존력을 평가하기 위하여, 조직 세포내 크레아틴 키나아제(CK)를 측정하였다. 본 분석에서, 높은 CK 수준은 생존 세포를 시사한다. 도 8에 도시된 바와 같이, 90분간 정상(normoxic) 초과융해가 진행된 대조 골주는 습식 조직 중량 ㎎당 6801±276 단위의 CK 활성을 보유하였다. 대조적으로, 30/45분 I/R 손상 또는 90분간 TNFα노출을 받은 골주는 각각 1774±181과 3246±217 단위/㎎으로 감소된 수준의 보존된 CK를 보였다. IL-18BP의 존재하에 TNFα에 노출된 골주는 조직 ㎎당 5605±212단위/㎎를 보유하였다. 흥미롭게도, TNFα로 처리된 골주가 I/R 골주와 비교하여 훨씬 높은 보존된 CK 수준을 보였다. 실험 종결시점에서 확장력의 크기가 I/R과 TNFα에서와 유사하다는 점에 비추어, 이는 예상치 못했던 발견이다.
실시예 3: 생체내 방법에서 IL-18BP는 심근 경색으로부터 보호한다
뮤린 IL-18BP 발현 플라스미드의 생체내 근육내 전기전달
C57BL/6 생쥐는 3-주 간격으로, IL-18BP에 대한 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드(즉, WO 01/85201에서 밝힌 pcDNA3-IL18BP)를 3회 주사하였다. 대조 생쥐는 대조 결여 플라스미드(empty plasmid)를 주사하였다. 전술한 바와 같이 분리된 뮤린 IL-18BP 동소체 cDNA(등록 번호 # Q9ZOM9)(KIm et al., 2000)은 시토메갈로바이러스 프로모터(Invitrogen)의 조절하에 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3의 EcoR1/Not1 부위에 서버클론하였다. 대조 플라스미드는 치료 cDNA가 결핍된 유사한 구조체이다. 대조군은 31마리 생쥐로 구성되었고, IL-18BP를 섭취한 실험군은 27마리 생쥐로 구성되었다.
IL-18BP 또는 대조 발현 플라스미드(60 ㎍)는 전술한 바와 같이 마취된 생쥐의 경골 두측 근육에 주사하였다(Mallat et al., 1999). 간단히 말하면, 경피 전기 펄스(200 V/㎝의 스퀘어 파장 전기 펄스, 2Hz에서 20 mesc 지속)는 다리의 각 측면에 4.2 내지 5.3 mm 이격되어 위치하는 2개의 스테인레스 강철판 전극을 사용한 PS-15 전기펄스장치(Genetronics, France)로 전달하였다.
좌심실에 경색 유도
IL-18BP 플라스미드 또는 결여 플라스미드의 투여 24시간후, 생쥐는 자일라진(xylazine)과 케타민의 IP 주사로 마취시키고 환기시키며 개흉술(thoracotomy)을 실시하였다. 이후, 좌측 주요 관상동맥은 심근 경색을 유도하기 위하여 8-0 프롤렌 봉합선으로 영구적으로 결찰하고, 그 다음 흉부를 폐쇄하고, 동물은 마취에서 회복시켰다. 수술전 치사율은 20%미만이었다. 수술후 치사율은 대조군에서 48%이었고 실험군에서 26%이었으며 결찰후 4-5일에 거의 발생하였다.
결찰 7일후 생쥐는 재마취시키고, 폐쇄된 흉부 상태의 좌심실(LV) 크기는 초음파심박동기록장치를 이용한 초음파심박동기록으로 평가하였다. LV 계수 단축(fractional shortening)은 측정된 말단 심장확장과 말단 심장수축 직경으로부터 계산하였다. 초음파심박동기록 측정의 종결시점에서, 심장은 떼어내고 고정시키고, 이후 절편으로 절단하였다. 그 다음, 조직학적 절편은 경색 크기 측정을 위하여 씨리어스 레드(sirius red)로 염색하였다.
결과
살아남은 생쥐에서 결찰 7일후 좌심실의 확장 직경은 다음과 같다:
IL-18BP로 처리된 생쥐(n=20)에서 0.53+0.01 mm vs. 대조 생쥐(n=16)에서 0.59+0.01 mm, p<0.01.
살아남은 생쥐에서 결찰 7일후 좌심실의 수축 직경은 다음과 같다:
IL-18BP로 처리된 생쥐에서 0.45+0.02 mm vs. 대조 생쥐에서 0.52+0.02, p<0.01.
좌심실의 계수 단축: IL-18BP로 처리된 생쥐에서 15+1% vs. 대조 생쥐에서 11+1%, p<0.01.
결론: IL-18BP는 좌심실의 완전 관상동맥 결찰로 유도된 심근 경색이후 생쥐의 치사율을 50% 정도 감소시킨다. 이에 더하여, 좌심실의 감소된 수축과 확장 직경에서 보인 바와 같이 좌심실의 기능이 현저하게 향상되었다.
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Claims (25)
- 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도.
- 제 1 항에 있어서, 심장 질환은 허혈성 심장 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 심장 질환은 만성인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 심장 질환은 협심증인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 심장 질환은 급성인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 5 항에 있어서, 심장 질환은 심근 경색인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 심장 질환은 심부전인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 심장 질환은 심근증인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1 저해물질(ICE), IL-18에 대한 항체, Il-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 결합 단백질, 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 수용체 α에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 수용체 β에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항 내지 12 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 항체는 인화 항체 또는사람 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합 단백질, 또는 IL-18의 생물 활성을 저해하는 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 하나 또는 복수의 부위에서 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 14 항에 있어서, 융합된 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9 항 또는 14 항에 있어서, 기능적 유도체는 아미노산 잔기에서 하나 또는 복수의 측쇄로 존재하는 하나 또는 복수의 기능기에 부착되는 적어도 한가지 성분(moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 17 항에 있어서, 성분은 폴리에틸렌 성분인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 종양 괴사 인자(TNF) 길항물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 19 항에 있어서, IL-18 저해물질은 TNF 길항물질과 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 19 항 또는 20 항에 있어서, TNF 길항물질은 TBPI 또는 TBPII인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 1 내지 10 ㎎/㎏ 또는 2 내지 5 ㎎/㎏의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 심장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도.
- 심장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 세포내 내생적 생산을 유도 또는 강화하는 발현 벡터의 용도.
- 심장 질환의 치료 방법에 있어서, IL-18 저해물질의 효과량을 이를 필요로 하는 숙주에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
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