ME00549B - Upotreba inhibitora il-18 za liječenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za pripremu leka zalečenje i/ili prevenciju srčanih bolesti, pre svega ishemične srčane bolesti. Kombinacija IL-18 inhibitora i/ili TNF antagoniste takođe se uključuju u lečenje i/ili prevenciju srčanih bolesti.

Description

KORIŠĆENJE INHIBITORA 1L-18 ZA LEČENJE l/ILI PREVENCIJU SRČANIH

OBOLJENJA

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na polje kardiovaskularnih bolesti. Još specifičnije, odnosi se na upotrebu inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju kardiovaskularnih bolesti, pre svega ishemičnog oboljenja srca.

STANJE TEHNIKE

Citokin interleukin 18 (IL-18) je inicijalno opisan kao interferon-y (IFN-y) indukujući faktor (Nakamura et al., 1989). On je rani signal u razvoju odgovora T-limfocit pomažućih ćelija tipa 1 (TH1). IL-18 deluje zajedno sa IL-12, IL-2, antigenima, mitogenima, i verovatno drugim faktorima, da indukuje produkciju IFN-y. IL-18 takođe pojačava produkciju GM-CSF i IL-2, pojačava anti-CD3 indukovanu proliferaciju T ćelija i pojačava Fas-posredovano ubijanje prirodnih ćelija ubica.

Zreli IL-18 se produkuje iz svojih prekursora pomoću IL-1β konvertujućeg enzima (ICE, kaspaze-1).

IL-18 receptor se sastoji od bar dve komponente koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja visokog i niskog afiniteta za IL-18 nađena su u mišjim IL-12 stimulisanim T ćelijama (Yoshimoto et al., 1998), što govori o složenom lančanom receptorskom kompleksu. Do sada su identifikovane dve receptorske podjedinice, gde su obe pripadale receptorskoj porodici IL-1 (Parnet et al., 1996; Kim et al., 2001). Provođenje signala IL-18 uključuje aktivaciju NF-kB (DiDonato et al., 1997). Receptorski kompleks IL-18 sastoji se od dva receptorska lanca: lanca koji vezuje ligand i koji se naziva IL-18R« i lanca za provođenje (transdukciju) signala koji se naziva IL-18R6 lanac. Lanac IL-18R je inicijalno izolovan kao površinski ćelijski protein koji se vezuje za radioaktivno obeleženi IL-18; Ovaj protein je purifikovan i njegova sekvenca amino kiselina je otkrila identičnost sa prethodno zabeleženim "orphan" receptorom nazvanim protein srodan IL-1 R (IL-1 Rrp) (Torigoe et al., 1997).

U novije vreme, jedan rastvorljivi protein sa visokim afinitetom za IL-18 izolovan je iz urina čoveka, kao i iz humane i mišje cDNK, a kloniran je i humani gen (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Ovaj protein označen je IL-18 vezujući protein (IL-18BP).

IL-18BP nije ekstraćelijski domen jednog od poznatih IL18 receptora, već sekretovani, prirodno cirkulišući protein. On pripada novoj porodici sekretovanih proteina, u koje dalje spadaju i nekoliko Poxvirus-enkodiranih proteinsa (Novick et al., 1999). Urinarni kao i rekombinantni IL-18BP specifično vezuju IL-18 visokim afinitetom i moduliraju biološki afinitet IL-18.

Gen IL-18BP je bio lokalizovan za humani hromozome 11 q13, i nikakvo eksonsko kodirnje za tranmembranski domen nije nađeno u genomskoj sekvenci 8. 3kb. Do sada je kod ljudi pronađeno četiri "splice" (koje se nastajvljaju jedna na drugu) varijante ili izoforma IL-18BP generisanih alternativnim mRNK nadovezivanjem. One su nazvane IL-18BP a, b, c i d, i sve imaju isti N-završetak i različit C-završetak (Novick et al, 1999). Ovi izoformi se razlikuju po svojoj sposobnosti da vezuju IL-18. Od njih četiri, za hlL-18BP izoforme a i c je poznato da imaju neutralizujuća svojstva za IL-18. Humani IL-18BP izoform unakrsno reaguje sa mišjim IL-18.

Srčana oboljenja se definišu kao bolesti koje zahvataju srčani mišić ili krvne sudove srca (The Merck Manual Home Edition, www. merck. com). Vaskularni poremećaj je problem sa krvnim sudovima kao što je loša cirkulacija izazvana začepljenjem. Srčane bolesti se nazivaju i kardiovaskularnim bolestima..

Ishemična bolest srca je uobičajeni uzrok disfunkcije srca i najčešći uzrok smrti u zapadnom svetu. Obično je uzrokovana ateromom koronarnih arterija. U lezije miokarda spadaju ishemična fibroza i akutni infarkt. U normalnim okolnostima, protok krvi u koronarnim arterijama je potpuno usklađen sa metaboličkim potrebama srčanog mišića. Do ishemične bolesti srca dolazi kada dotok krvi postane nedovoljan, bilo zbog slabljenja dovoda krvi ili zato što miokard postaje hipertrofisan, pa traži bolje snabdevanje krvlju. Koronarni protok je normalno nezavisan od aortnog pritiska. Postoji jedan efikasan autoregulatorni mehanizam koji kontroliše protok krvi kroz koronarni krvni sud.

Kada se u nekoj većoj koronarnoj arteriji razvije opstrukcija, obično zbog ateroskreroze ili arterioskleroze, koronarni krvni protok se u početku zadržava, jer se smanjuje periferni otpor distalno od same opstrukcije. Kada se lumen krvnog suda okludira za više od 75%, razvija se ishemija, posebno ako je loše razvijena koronarna kolateralna cirkulacija.

Srčani mišić je metabolički izuzetno aktivan, i na mitohondrije otpada preko 30% zapremine pojedinih vlakana. Aerobni metabolizam je ključni, jer su male rezerve visokoenergetskih fosfata. Do smrti srčanog mišića dolazi kada su nivoi tkivnog adenozin trifosfata (ATP) veoma niski i kada anaerobna glikoliza praktično prestaje. Kao i kod drugih tkiva, tačan uzrok smrti nije siguran, ali letalne ozlede srčanog mišića su povezane sa membranskim oštećenjem i iznenadnim ulaskom kalcijuma u ćelijsku citoplazmu. Posle kraćeg perioda ishemije, protok krvi kroz srce može da se ponovo uspostavi (reperfuzija). Međutim, posle jednog kritičnog intervala, reperfuzija više nije moguća, verovatno kao rezultat edema kapilarnih endotelnih ćelija.

Ateroskleroza je uzrok ogromne većine koronarnih arterijskih bolesti. Ishemična bolest srca može takođe da potiče od niske perfuzije koronarnih arterija. Čest uzrok je i moždani udar, posebno kao posledica hemoragije.

Kao što je gore naglašeno, ishemična bolest srca je uzrokovana odsustvom ravnoteže između protoka krvi kroz miokard i metaboličkim potrebama samog miokarda. Protok krvi može dodatno da se smanji superimponovanim događajima kao što su vazospazam, tromboza ili cirkulatorne promene koje dovode do hipoperfuzije.

Perfuzija koronarnih arterija zavisi od diferencijala pritiska između ušća (aortni dijastoini pritisak) i koronarnog sinusa (pritisak u desnoj pretkomori). Koronarni protok krvi se smanjuje u sistoli zbog Venturijevog efekta na koronarnim otvorima i kompresije intramuskularnih arterija tokom ventrikularne kontrakcije. U faktore koji smanjuju koronarni protok krvi spadaju smanjeni aortni dijastoini pritisak, intraventrikularni pritisak i kontrakcija miokarda, koronarna arterijska stenoza, stenoza aortnih valvula i regurgitacija, i povećani pritisak u desnoj pretkomori.

Trombolitička terapija agensima kao što su steptokinaza ili aktivator tkivnog plazminogena (TPA) često se koriste za liziranje nedavno oformljenog tomba. Takva terapija sa liziranjem ugruška može da dovede do ponovnog uspostavljanja protoka krvi u većini slučajeva. Ovo pomaže da se spreči teže oštećenje miokarda, ako se primeni rano (znači za manje od jednog sata) tokom ovog događaja i može bar da pomogne da se smanji dalje oštećenje.

Angina pektoris je kompleks simptoma ishemičnog oboljenja srca koje se odlikuje paroksizmalnim napadima bola u grudima, obično substernalno ili prekordijalno. Uzrokuje se inshemijom miokarda koja još nije tolika da izazove infarkt. Može doći do iznenadne srčane smrti obično u roku od jednog sata po ovakvim srčanom događaju sa simptomima ili bez njih. Svake godine ovo pogađa 300. 000 - 400. 000 ljudi.

U druge forme srčanih oboljenja spadaju alkoholna kardiomiopatija, prolaps aotne valvule, stenoza aortne valvule, aritmije, kardiogeni šok, kongenitalno srčano oboljenje, dilatacijska kardiomiopatija, srčani napad, srčana insuficijencija, srčani tumor, stenoza kardijalnih pulmonalnih valvula, hipertrofijska kardiomiopatija, idiopatska kardiomiopatija, ishemično oboljenje srca, ishemijska kardiomiopatija, mitralna regurgitacija, prolaps mitralne valvule, peripartalna kladiomiopatija, stabilna angina.

Infarkt miokarda je drugi oblik ishemične bolesti srca. U patogenezu mogu da spadaju okluzivni intakoronarni tromb, t. j. ugrušak koji se nalazi na ulcerisanom illi raspuklom stenotičnom plaku. Okluzivni intrakoronarni tomb uzrokuje 90% transmuralnih akutnih infarkta miokarda. Vazospazam može da bude sa ili bez ateroskleroze i eventualne veze sa agregacijom trombocita. Infarkt miokarda može da bude povezan i sa embolijom.

Makroskopski morfološki izgled infarkta miokarda može da se razlikuje. Transmuralni infarkt uključuje ćelu debljinu zida leve komore od endokardijuma do epikardijuma. Subendokardijalni infarkt uključuje multifokalna polja nekroze ograničena na unutrašnju 1/3-1/2 zida leve komore. U komplikacije infarka miokarda mogu da spadaju aritmije i poremećaji provodljivosti, s mogućom "iznenadnom smrću", širenje infarkta, ili ponovni infarkt, kongestivna srčana insuficijencija (plućni edem), kardiogeni šok, perikarditis, muralna tromboza, sa mogućom embolizacijom, ruptura zida miokarda, s mogućom tamponadom, ruptura papilarnog mišića, s mogućom valvularnom insuficijencijom, stvaranje ventrikularne aneurizme.

Infarkt miokarda (Ml) se definiše kao ishemična nekroza miokarda obično uzrokovana naglim smanjenjem koronarnog protoka krvi u jedan segment miokarda.

Kod > 90% pacijenata sa akutnim Ml, akutni tromb, često praćen rupturom plaka, okludira arteriju (prethodno delimično okludiranu aterosklerotskim plakom) koja prokrvljuje oštećenu oblast. Izmenjena funkcija trombocita indukovana endotelijalnom pramenom u aterosklerotskom plaku navodno doprinosi trombogenezi. Spontana tromboliza nastaje kod oko 2/3 pacijenata tako da posle 24 h trombotična okluzija postoji i zadržava se kod samo oko 30%.

Infarkt miokarda je ponekad uzrokovan arterijskom embolizacijom (na pr. mitralnom ili aortnom stenozom, infektivnim endokarditisom, i marantičkim endokarditisom). Infarkt miokarda je zabeležen kod pacijenata sa koronarnim spazmom i inače normalnim koronarnim arterijama. Kokain uzrokuje intenzivni spazam koronarnih arterija, pa korisnici mogu da se jave sa kokainom indukovanom anginom pektoris ili infarktom miokarda. Obdukciona ispitivanja i koronarna angiografija su pokazali da kokainom izazvana koronarna tromboza može da nastane i kod normalnih koronarnih arterija ili da bude superimponovana na već postojeći aterom.

Infarkt miokarda je prevashodno bolest leve komore, ali oštećenje može da se proširi i na desnu komoru (RV) ili na pretkomore. Infarkt desne komore obično nastaje od okluzije desne koronarne ili dominantne leve cirkumfieksne arterije i odlikuje se visokim pritiskom punjenja desne komore. Često sa težom trikuspidalnom regurgitacijom i smanjenim minutnim volumenom. Do određene ventrikularne disfunkcije dolazi kod oko polovine pacijenata s inferiorno-posteriornim infarktom, što dovodi do hemodinamske abnormalnosti u 10 do 15%.

Sposobnost srca da nastavi da funkcioniše kao pumpa odnosi se direktno na obim miokardijalnog oštećenja.

Transmuralni infarkti zahvataju ćelu debljinu miokarda od epikardijuma do endokardijuma i obično se odlikuje abnormalnim Q talasima na EKG. Ne-transmuralni ili subendokardijanil infarkti se ne prostiru kroz ventrikularni zid i uzrokuju samo abnormalnosti na ST segmentu i T talasima. Subendokardijalni infarkti obično zahvataju unutrašnju trećinu miokardijuma gde je tenzija zida najveća, a miokardijalni protok najosetljiviji na cirkulatorne promene. Oni mogu i da prate produžnu hipotenziju. Budući da transmuralna dubina nekroze ne može da s klinički precizno utvrdi, infarkti se bolje klasifikuju korišćenjem EKG principa kao Q talasni i ne-Q talasni. Zapremina uništenog miokarda može da se proceni obimom i dužinom trajanja povećanja CK.

Ishemjska kardiomiopatija je još jedna bolest u okviru ishemičnog oboljenja srca gde može postojati i prethodni infarkt miokarda, ali ova bolest je posledica teške koronarne ateroskleroze koja zahvata sve glavne grane. Rezultat je neadekvatno vaskularno snabdevanje, koje dovodi do gubitka miocita. Gubitak miocita u kombinaciji sa fibrozom u obliku intersticijalnih depozita kolagena dovodi do smanjenja komplijanse, što uz prateću srčanu dilataciju dovodi do preopterećenosti preostalih miocita. Ovo održava proces s kompenzacijom kontinuirane miocitne hipertrofije. Može doći i do kompenzacije hiperplazijom kao i hipertrofijom, što objašnjava ogromnu veličinu (2 do 3 veću od normalne) takvog srca. Na kraju, srce više ne može da se kompenzuje, pa dolazi do srčane insuficijencije sa aritmijom i/ili ishemičnim događajima. Na taj način dolazi do spore, progresivne srčane insuficijencije sa istorijom prethodnog infarkta miokarda ili anginalnnog bola, ili bez ovih znakova. Ishemična kardiomiopatija je odgovorna za čak 40% mortaliteta kod ishemične bolesti srca.

Tokom ishemije, kao i reperfuzije srca, proizvode se brojni endogeni medijatori, kao što su mali molekul sekundarnih prenosnika, koji utiču na miokardijalnu funkciju. U roku od nekoliko minuta po ishemičnoj epizodi, kontraktilna snaga miokarda se smanjuje a ukupni oporavak kontraktilne snage u mnogome zavisi od trajanja ishemičnog perioda (Daemen et al., 1999). Na primer, tokom jednog ishemičnog događaja, Ca2+ homeostaza se remeti, generišu se kiseonički slobodni radikali i dolazi do sinteze azot oksida (NO) i dolazi do oslobađanja. Uz to, Dolazi i do lokalne produkcije citokina, posebno TNFct i IL-1[3 (Bolli, 1990). Kod intaktnog srca, ti citokini doprinose ishemijom indukovanoj miokardijalnoj disfunkciji tako što indukuju gensku ekspresiju inducibilne NO sintaze (iNOS)(Daemen et al., 1999), ciklooksigenaze-2 (COX-2) i fofolipaze A2 kao i vaskularnih adhezionih molekula i nekoliko hemokina. Kao rezultat, dolazi do momentalne depersije miokardijalne kontraktilne snage posredovano malim molekulima posrednika posle čega sledi infiltracija neutrofila posredovana citokinima, što dodatno oštećuje srčani mišić. Ispitivanja na srcima životinja u odsustvu krvi i krvnih proizvoda obrađuju TNFa (Flerskovvitz et al., 1995) i IL-1β tokom ishemičnog događaja. Kardiomiociti takođe gube kontraktilnu snagu zbog delovanja ovih endogenih citokina (Meldrum et al., 1998).

Najveći broj eksperimentalnih podataka koji se odnose na disfunkciju miokarda posredovnu TNFa i IL-1β dobijen je iz studija na životinjama. Međutim, humano miokardno tkivo dobijeno od pacijenata koji se podvrgavaju elektivnom

kardiopulmonarnom bajpasu ispitivano je u kontrolisanim, ex vivo uslovima (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). U ovom eksperimentalnom modelu, humane atrijalne trabekule su suspendovane u beskrvnom, fiziološki oksigenisanom puferskom kupatilu i onda izlagani epizodi simulirane ishemije. Za to vreme, dramatično opala kontraktilna snaga kada se tkiva ponovo izlažu kiseoniku, se vraća ali u smanjenom obimu (smanjenje od 60-70%) i dokazi o miokardijalnom oštećenju se opažaju oslobađanjem kreatin kinaze (CK) (Gurevitch et al., 1996; Cleveland et al., 1997). Kada se bioaktivnost TNF specifično neutralizuje tokom ishemije /reperfuzije (l/R), opaža se veći povraćaj kontraktilne snage što govori da endogena miokardna TNF aktivnost doprinosi kontraktilnoj disfunkciji indukovanoj ishemijskim događajem (Cain et al., 1999).

Daemen et al. (1999) su ispitivali oštećenje tkiva kao poledicu ishemije praćeno reperfuzijom korišćenjem mišjeg modela bubrežne ishemije. Oni su pokazali da ushodna bubrežna regulacija IL-18 mRNK koincidira sa aktivacijom kaspaze-1 prvog dana po ishemiji. IFN-γ i IL-12 mRNK su potom ushodno regulisani šestog dana po ishemiji. Kombinovana, ali ne odvojena, in vivo neutralizacija IFN-γ indukujućih citokina IL-12 i IL-18 smanjila je IFN-gama-zavisnu ushodnu regulaciju MHC klase I i II u sličnoj meri kao neutralizacija IFN-γ.

Međutim, do sada nije opisano da IL-18 igra ulogu u srčanim oboljenjima.

KRATKI PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da inhibitor IL-18 značajno poboljšava kontraktilnu funkciju srca u modelu ishemija/reperfuzija suprafuziranog miokarda pretkomore čoveka. Inhibicija kaspaze-1 (ICE) takođe smanjuje depresiju kontraktilne snage po ishemiji i reperfuziji.

Štaviše, davanje inhibitora IL-18 u mišjem modelu infarkta miokarda dovelo je do povećanog preživljavanja i značajnog poboljšanja ventrikularne funkcije.

Ova ispitivanja su pokazala da su inhibitori IL-18 pogodni za lečenje ili prevenciju disfunkcije miokarda.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju lekova za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja, pre svega ishemične bolesti srca i srčane insuficijencije.

Da bi se primenio genski terapijski pristup i inhibitor IL-18 doveo do obolelog tkiva ili ćelije, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje vektora za ekspresiju koji obuhvata i kodirajuću sekvencu inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja.

KRAĆI OPIS CRTEŽA

SI. 1 pokazuje dejstvo IL-18BP na ishemijski izazvanu disfunkciju kontraktilnosti miokrda..

(A) Kinetički odgovor na ishemijsko oštećenje. Po ekvilibraciji (eq), kontrolne (Ctrl) trabekule su perfundovane pod uslovima normalne oksigenacije tokom celog eksperimenta. Trabekule su podvrgnute ishemiji/reperfuziji u odsustvu ili prisustvu IL-18BP (5 p. g/ml). Vertikalna osa pokazuje procenat razvijene snage u poređenju sa vremenom početka eksperimenta (nulta tačka). Ovi podaci su izvedeni iz trabekula jednog bolesnika i reprezentativni su za metode koje se koriste za izračunavanje srednje promene razvijene snage u roku od 90 minuta.

(B) Post-ishemijsko razvijanje snage po neutralzaciji IL-18 sa 1 ili 5 µg/ml IL-18BP. Rezultati su izraženi kao srednji procenat promene u razvijenoj snazi u odnosu na kontrolu po završetku reperfuzije (90 minuta). Brojevi u zagradama pokazuju IL-18BP u (ig/ml. N=6. * p<0. 01 u poređenju sa l/R (ishemija/reperfuzija).

SI. 2: Prikazuje miokardijalni IL-18 proteinski sadržaj. Trabekule su homogenizovane posle 90 minuta suprafuzije u uslovima normalne oksigenacije (kontrola) ili 45 minuta po 30 minuta ishemije (l/R). Trabekule su uzimane od istih ispitanika. Nivoi IL-18 su izraženi na vertikalnoj osi u pg/ml. N=4. * p<0. 01.

SI. 3 Pokazuje stabilno stanje IL-18 i IL-18BP mRNK nivoe u kontrolnom i ishemičnom atrijalnom tkivu. Nivoi IL-18 i IL-18BP mRNK određeni su metodom RT-PCR. Prikazani su podaci jednog od dva ispitanika. A pokazuje etidijumbromidom obojeni agarosa gel, u kome su separirani proizvodi PCR, dok B pokazuje rezultate kvantifikacije količine PCT proizvoda kao umnožak promene u odnosu na kontrolu (GAPDH).

Fig 4: pokazuje dejstvo inhibicije ICE na post-ishemijski razvijenu snagu. Rezultati su izraženi kao srednji procenat promene u razvijenoj snazi u odnosu na kontrolu (Crti) posle ishemije/reperfuzije (l/R). Brojevi u zagradama pokazuju koncentraciju ICEi u (. tg/ml. N=7. * p<0. 01 u poređenju sa l/R.

SI. 5: pokazuje aktivnosti tkivne kreatin kinaze (CK) posle l/R. CK je izražena u jedinicama aktivnosti na miligram vlažne težine tkiva. Eksperimentalni uslovi su pokazani na horizontalnoj osi. Ctrl i l/R, N=6; IL-18BP (5 pig/ml), N=5; ICEi (10 i 20 pig/ml), N=5 svaki; * p<0. 05 u poređenju sa l/R.

SI. 6: pokazuje srednju promenu u razvijenoj snazi po periodu ekvilibracije, postavljenu na 100% (n=5), trabekula inkubiranih sa 10 |j. g/ml tokom 15 min, pre dodavanja TNFα (1 ng/ml). TNFα i IL-18BP su dodavani u svaku promenu kupatila.

SI._7L pokazuje temporalni odgovor humanih atrijalnih trabekula na IL-18 u uslovima

normalne oksigenacije. Zreli IL-18 (100 ng/ml) su dodavani u atrijalne trabekule tokom celog eksperimentalnog perioda od 90 min. Vertikalna osa pokazuje srednji procenat promene od bazalne linije razvijene snage Bazalna linija je određena na kraju perioda ekviiibracije (nije prikazana). (n=6). * P < 0. 05, ** P < 0. 001 u poređenju sa kontrolom u istom intervalu i za preostali deo eksperimentalnog perioda.

SI. 8: pokazuje očuvanje aktivnost mioćelijske tkivne kreatin kinaze po izlaganju l/R, TNFα (1 ng/ml) i TNFα (10 ng/ml) + IL-18BP. CK aktivnost je izražena u jedinicama CK aktivnosti na miligram težine vlažnog tkiva (n=6).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da inhibitori IL-18 imaju korisno dejstvo u slučajevima srčanih oboljenja, pre svega kod ishemične bolesti srca. Kako je pokazano u donjim primerima, dokazano je da nekoliko različitih inhibitora IL-18 pokazuje izuzetno blagotvorno dejstvo na postishemijski razvijenu snagu srčanog mišića.

Uz ovom, jedan inhibitor IL-18 je testiran na in vivo modelu infarkta miokarda što je dovelo do poboljšnog preživljavanja i značajnog poboljšanja ventrikularne funkcije.

Znači, ovaj pronalazak se odnosi na inhibitor IL-18 za proizvodnju i za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja.

U skladu sa ovim pronalaskom, izraz "srčano oboljenje” obuhvata bolesti, uključujući i srčanu disfunkciju. Ove bolesti se inače nazivaju kardiovaskularnim poremećajima.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, srčano oboljenje je ishemična bolest

srca.

Izraz “ishemična bolest srca”, kako se koristi ovde, uključuje sve različite tipove ishemične bolesti srca, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koje su detaljno objašnjene pod naslovom “Stanje tehnike”, kao i kardiovaskularne bolesti ili poremećaje koji se odnose na ishemičnu bolest srca.

Korišćenje u skladu sa ovim pronalaskom je dobro primereno dugoročnom tretmanu, i tako je posebno korisno za upotrebu vezanu za hronična srčana oboljenja. Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, ishemična bolest srca je hronična. Angina, ili angina pektoris je jedna od najkarakterističnijih kliničkih manifestacija kod pacijenata koji imaju dugu istoriju ishemične bolesti srca. Oslabljena funkcija leve komore, posle jedne ili više prethodnih epizoda infarkta miokarda, može da dovede do disfunkcije leve komore, a potom i do kongestivne srčane insuficijencije.

Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za lečenje i /ili prevenciju angine pektoris.

U dodatnom preporučenom obliku, ishemična bolest srca je akutna i po mogućstvu je to infarkt miokarda.

Akutna miokarda bolest srca ili infarkt miokarda obično uključuje nekrozu srčanog mišića, najčešće leve komore. Ovo je često posledica ateroma koronarnih arterija sa superimponovanim trombom ili hemoragijskim plakom. Nekrozu prati zapaljenska infiltracija i enzimi za fibrozni korekciju se oslobađaju iz nekrotičnog tkiva u krv, i nastaje leukocitoza koja je obično dijagnostički korisna. Komplikacije akutnog infarkta miokarda uključuju aritmije, prestanak srčanog rada, rupturu miokarda koja dovodi do hemoperikardijuma, muralnu trombozu koja vodi do embolije, i aneurizmu srca. U dodatne komplikacije spadaju iznenadna srčana smrt, aritmije, uporni bol, angina, srčana insuficijencija sa prestankom rada mitralna inkompetentnost, perikarditis, ruptura srca (ventrikularni bol, septum ili papilarni mišić), muralna tromboza, ventrikularna aneurizma, Dresslerov sindrom (bol u grudima, povišena temperatura, efuzije), plućna embolija. Lekovi u skladu sa ovim pronalaskom mogu da s koriste i za lečenje i/ili prevenciju ovih komplikacija infarkta miokarda.

U dodatnom preporučenom obliku, srčano oboljenje je prestanak srčanog rada ili teža srčana insuficijencija. Srčana insuficijencija je stanje bolesti u kome srce nije u stanju da pumpa krv brzinom koja je potrebna za normalni metabolizam. U skoro svim oblicima srčane insuficijencije smanjen je minutni volumen, što dovodi do stepena hipoperfuzije koja se zove nedovoljnim arterijskim punjenjem. Telo ovo kompenzuje. zadržavanjem povećane količine krvi. Srčana insuficijencija može biti akutna ili hronična. U ranim stadijumima, klinički znaci srčane insuficijencije mogu delovati jednostrano, ali zbog inteventrikularnoig septuma koji dele desna i leva komora, ako dođe do insuficijencije jedne komore, neizbežno dolazi i do insuficijencije druge. Srčana insuficijencija može da bude posledica drugih uzroka, kao što su sistemska hipertenzija, bolest srčanih valvula ili plućna bolest koja dovodi do kongestivne srčane insuficijencije.

Srčana insuficijencija može biti kongestivna srčana insuficijencija, što je simptomatska disfunkcija miokarda koja dovodi do karakterističnog modela hemodinamskih, bubrežnih i neurohormonskih odgovora. Kliničke manifestacije srčane insuficijencije mogu biti insuficijencija leve komore, ili insuficijencija desne komore. Srčana insuficijencija se manifestuje kao sistolna ili dijastolna disfunkcija, ili obe zajedno. Često dolazi do zajedničke pojave sistolnih i dijastolnih abnormalnosti.

U još jednom preporučenom obliku, srčana bolest je kardiomiopatija. Kardiomiopatija je svaka strukturna ili funkcionalna abnormalnost ventrikularnog miokarda.

Izraz “prevencija” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se ne samo na kompletnu prevenciju određenog efekta, već i na svaku delimičnu ili supstancijalnu prevenciju, ublažavanje, smanjenje, opadanje ili umanjenje efekta pre početka ili u ranoj fazi bolesti.

Izraz “tretman” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svako korisno dejstvo na progresiju bolesti, uključujući ublažavanje, smanjenje, opadanje ili umanjenje patološkog razvoja po početku bolesti.

Izraz “inhibitor IL-18” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svaku produkciju koji modulira molekule i/dejstvo IL-18 na takav način da produkcija i/ili dejstvo IL-18 budu umanjeni, oslabljeni ili delimično, supstancijalo ili potpuno sprečeni ili blokirani.

Inhibitor produkcije može biti svaki molekul koji negativno deluje na sintezu, procesiranje ili sazrevanje IL-18. Inhibitori o kojima je reč u ovom pronalasku mogu biti, a primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisens mRNK koje smanjuju ili sprečavaju transkripciju IL-18 mRNK ili dovode do degradacije mRNK, proteina koji slabe korektno preklapanje, ili delimično odnosno supstancijalno sprečavaju sekreciju IL-18, proteaze koje degradiraju IL-18, kada je jednom sintetizovan, inhibitore proteaza koji cepaju pro-IL-18 da se generiše zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1, i slični.

Inhibitor dejstva IL-18 može da bude, na primer, i antagonista IL-18. Antagonisti mogu ili da se vezuju ili da sekvestriraju same molekule IL-18 dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supstancijalno neutralizuju mesta vezivanja za IL-18 ili IL-18 koja su odgovorna za vezivanje IL-18 za svoje ligande (kao na pr. za svoje receptore). Antagonista može i da inhibira signanlni put IL-18, koji se aktivira u ćelijama povezivanju IL-18/receptor.

Inhibitori dejstva IL-18 mogu da budu rastvorljivi receptori ili molekuli IL-18 koji podražavaju receptore, ili agensi koji blokiraju IL-18 receptore, ili IL-18 antitela, kao što su poliklonska ili monoklonska antitela, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za svoje ciljeve, i na taj način sprečava ili smanjuje intra- ili ekstraćelijske reakcije posredovane IL-18.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se odabira iz inhibtora kaspaze-1 (ICE), antitela usmerenih protiv IL-18, antitela usmerenih protiv svih IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji se nadmeću sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujućih proteina, izoforma, muteina, fuziranih proteina, funkcionalnih derivata, tkivnih frakcija ili njihovih cirkularno permutovanih derivata koji inhibiraju biološku aktivnost IL-18.

Izraz “IL-18 vezujući proteini” ovde se koristi kao sinonim sa “IL-18 vezujući protein” ili “IL18BP”. On obuhvata IL-18 vezujućih proteina kako je to definisano u WO 99/09063 ili kod Novick et al., 1999, uključujući "splice" varijante i/ili izoforme IL-18 vezujućih proteina, kako je to definisano u Kim et al., 2000, koji se vezuju u IL-18. Pre svega, humani izoformi IL-18BP a i c su korisni u skladu sa ovim pronalaskom. Proteini koji su korisni u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti glikolizirani ili ne-glikoliziani, mogu biti dobijeni iz prirodnih izvora, kao što je urin, ili mogu, po mogućstvu, biti dobijeni tehnikama rekombinacije. Rekombinantna ekspresija može da se obavi u prokariotskim sistemima ekspresije E. coli, ili u eukariotskim, i po mogućstvu u ekspresionim sistemima sisara.

Kako se ovde koristi, izraz "muteini" se odnosi na analoge IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP, jedan ili više aminokiselinskih ostataka prirodnih IL-18BP ili virusnih IL-18BP bivaju zamenjeni različitim aminokiselinskim ostatcima ili se brišu, ili se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje prirodnoj sekvenci IL-18BP, ili virusnom IL-18BP, ne menjajući značajno aktivnost rezultujućeg proizvoda u poređenju sa divljim tipom IL-18BP ili virusnim 1L-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim na jedno mesto, ili ma kojom drugom pogodnom tehnikom za to.

Muteini u skladu sa ovim pronalaskom uključuju proteine enkodirane nukleinskom kiselinom, kao što je DNK ili RNK, koja hibridizuje za DNK ili RNK, što enkodira IL-18BP ili enkodira virusni IL-18BP, u skladu sa ovim pronalaskom, pod strogim uslovima. Izraz "strogim uslovima" odnosi se hibridizaciju i potonje uslove pranja, koje stručnjaci za ovu oblast konvencionalno nazivaju "strogim uslovima". Vidi Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Tekući protokoli u molekularnoj biologiji), supra, Interscience, N. Y., §§6. 3 and 6. 4 (1987, 1992), i Sambrook et al., supra. Bez ograničenja, primeri strogih uslova uključuju uslove pranja 12-20°C ispod izračunate Trn hibrida koji se ispituje u, na pr., 2 x SSC i 0. 5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0. 1% SDS tokom 15 minuta; 0. 1 x SSC i 0. 5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta, i onda, 0. 1 x SSC i 0. 5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Oni koji se bave ovim poslom razumeju da strogost uslova zavisi i od dužine sekvence DNK, oligonukleotidnih proba (kao što su 10-40 baza) ili mešanih oligonukleotidnih proba. Ako se koriste mešane probe, preporučuje se korišćenje tetrametil amonijum hlorida (TMAC) umesto SSC. Vidi Ausubel, supra.

Svaki takav mutein po mogućstvu ima aminokiselinsku sekvencu koja dovoljno podržava onu od IL-18BP, ili dovoljno podražava virusnu IL-18BP. tako da bi imala aktivnost sličnu IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP jeste sposobnost vezivanja IL-18. Sve dok mutein ima supstancijalnu aktivnost vezivanja za IL-18, može se koristiti za prečišćavanje IL-18, na primer uz pomoć afinitetne hromatografije, i tako može da se smatra da ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP. Znači, može da se odredi da li ma koji dati mutein ima supstancijalno istu aktivnost kao IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata koji. obuhvataju odvrgavanje takvog muteina, na pr. jednostavnom sendvič kompetitivnom eseju da se odredi hoće li se vezivati za odgovarajuće radioaktivno obeleženi IL-18, kao što je radioimunoesej ili ELISA esej.

U preporučenom obliku, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom bilo IL-18BP ili virusno enkodiranog IL-18BP homologa, kao što je to definisano u WO 99/09063. Još bolje, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, najbolje, najmanje 90% identičnosti ili homologije.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnog IL-18BPs, koji mogu da se koriste skladu sa ovim pronalaskom, ili kodiranje nukleinskih kiselina uključuje konačni skup supstancijalno odgovarajućih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukleotida koji mogu rutinski da se dobiju u skladu sa pravilima struke, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu uputstava i smernica koji su dati u opisu ovog pronalaska.

Preporučene promene muteina u skladu sa ovim pronalaskom su ono što se naziva "konzervativnim" supstitucijama. Konzervativne supstitucije amino kisleina IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnih IL-18BPs, mogu da uključe i sinonimne amino kiseline u grupi koja ima dovoljno slična fiziko-hemijska svojstva tako da zamena članova grupe čuva biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu da se naprave i u gore definisanim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno što ako insercije ili delecije uključuju samo nekoliko amino kiselina, na pr. manje od trideset, a po mogućstvu manje od deset, i ne uklanjaju niti dislociraju aminokiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, na pr. cisteinske ostatke. Proteini i muteini koji se proizvode takvim insercijama i/ili delecijama spadaju u okvire ovom pronalaska.

Po mogućstvu, grupe sinonimsnih amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli 1. Još je bolje ako su grupe sinonimsnih amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli 2, a najbolje je ako su grupe sinonimsnih amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli 3.

TABELA 1

Preporučene grupe sinonimsnih amino kiselina

TABELA 2

Više preporučene grupe sinonimsnih amino kiselina

TABELAA3

Najviše preporučene grupe sinonimsnih amino kiselina

Primeri produkcije supstitucije amino kiselina u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnih IL-18BP, za upotrebu u ovom pronalasku uključuju sve poznate faze metode, kao što su one predstavljene u sledećim američkim patentima: US patenti 4, 959, 314, 4, 588, 585 i 4, 737, 462, do Mark et al; 5, 116, 943 do Koths et al., 4, 965, 195 do Namen et al; 4, 879, 111 do Chong et al; i 5, 017, 691 do Lee et al; i pritene supstituisane lizinom predstavljene u US patentu No. 4, 904, 584 (Shaw et al).

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili jedan virusni IL-18BP, ili jedan mutein ili njegov fragment, fuziran sa drugim proteinom, koji, na pr. ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. IL-18BP ili virusni IL-18BP, mogu tako da se spajaju (fuziraju) sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično, na pr. sa nekim imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati” se ovde koriste da obuhvate derivate IL-18BP ili virusnog IL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji mogu da se pripreme iz funkcionalnih grupa koje nastaju kao bočni lanci na ostatcima ili na N- ili C-terminalnim grupama, uz pomoć metoda poznatih u struci, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dok su farmaceutski prihvatljivi, t. j. ne uništavaju aktivnost proteina koji je supstancijalno sličan aktivnosti IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, i nema toksična svojstva u sastavima u koje je uključen.

Ovi derivati mogu, na primer, da uključe bočne lance polietilen glikola, koji mogu da maskiraju antigena mesta i produže boravak IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. U ostale derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa aminokiselinskih ostataka oformljeni sa acilnim grupama (na pr. alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer serilni ili treonilni ostaci) formirani sa acilnim grupama.

Kao "aktivne frakcije" IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuziranih proteina, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnih lanaca proteinskih molekula samih ili zajedno sa pratećim molekulima ili povezanim ostatcima, na pr. šećer ili fosfatne ostatke ili agregate proteinskog molekula ili same šećerne ostatke, pod uslovom da ta frakcija ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP.

U dodatnom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je antitelo protiv IL-18 ili njegovih receptora, IL-18R. Antitela protiv ma koje od podjedinica IL-18R koje se nazivaju IL-18Ra i (3, mogu da se koriste u skladu sa ovim pronalaskom.

Antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu da budu poliklonska ili monoklonska, himerska, humanizovana ili potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihovi fragmenti odlikuju se visokim afinitetom vezivanja za IL-18 ili IL-18R in vivo i niskom toksičnošću. Antitela koja mogu da se koriste u ovom pronalasku odlikuju se sposobnošću da tretiraju pacijente tokom perioda dovoljnog da se postigne dobra ili odlična regresija ili ublaženje patogenog stanja ili ma kog simptoma ili grupe simptoma vezanih za patogeno stanje, i niskom toksičnošću.

Neutralizujuća antitela se lako razvijaju kod životinja kao što su zečevi, koza ili miš imunizacijom sa IL-18 ili IL-18Rαili β Imunizovani miševi su posebno pogodni za obezbeđivanje izvora B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se za uzvrat gaje da proizvedu velike količine anti-IL-18 monoklonskih antitela.

Himeriska antitela su imunoglobulinski molekuli koji se odlikuju sa dva ili više segmenata ili delova koji se izvode iz različitih životinjskih vrsta. Generalno, promenljivi region himerskog antitela dobija se iz antitela ne-humanog sisara kao. što je mišje monoklonsko antitelo, a imunoglobuilinski konstantni region se izvodi iz humanog imunoglobulinskog molekula. Po mogućstvu, oba regiona i njihove kombinacije imaju nisku imunogenost kako se to rutinski određuje (Elliott et al., 1994). Humanizovna antitela su imunoglobulinski molekuli koji su stvoreni tehnikom genetskog inženjeringa gde su konstantni mišji regioni zamenjeni humanim odgovarajućim delovima dok zadržavaju mišje regione koji se vezuju za antigene. Rezultujuće mišje-humano himersko antitelo po mogućstvu smanjuje imunogenost i poboljšava farmakokinetiku kod ljudi (Knight et al., 1993).

Prema tome, u dodatnom preporučenom obliku, IL-18 ili IL-18R antitelo su humanizovana antitela. Preporučeni primeri humanizovanih anti-IL-18 antitela su opisani, na primer, u Evropskoj patentnoj prijavi EP 0 974 600.

U još jednom preporučenom obliku, ovo antitelo je potpuno humano. Tehnologija za proizvodnju humanih antitela detaljno je opisana na primer u VVO00/76310, VVO99/53049, US 6, 162, 963 ili AU5336100.

Jedna metoda za pripremu potpuno humanih antitela sastoji se od “humanizacije" mišjeg humoralnog imunog sistema, t. j. produkciju mišjih sojeva koji su u stanju da proizvedu humani lg (Ksenomiš), uvođenjem humanog imunoglobulinskog (lg) lokusa u miša u kome su endogeni lg geni inaktivirani. Ig lokusi su složeni u smislu njihove fizičke strukture i genske preraspodele i procesa ekspresije koji je potreban da se na kraju proizvede široki imuni odgovor. Raznolikost antitela se prvenstveno generiše kombinatorijskom preraspodelom između različitih V, D, i J gena prisutnih u lokusima Ig. Ovi lokusi sadrže i međusobno raspoređene regulatorne elemente, koji kontrolišu ekspresiju antitela, isključivanje alela, prebacivanje klasa i sazrevanje afiniteta. Uvođenje rearanžiranih humanih Ig transgena u miševe pokazalo je da je mišja rekombinatorijska mašinerija kompatibilna sa humanim genima. Štaviše, hibridomi koji sekretuju antigen specifična hu-mAb različitih izotipova mogu da se dobiju imunizacijom ksenomiša antigenom.

Potpuno humana antitela i metode za njihovu produkciju već su poznati u struci (Mendez et al (1997); Buggemann et al (1991); Tomizuka et al., (2000) Patent WO 98/24893).

U visoko preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je IL-18BP, ili izoform, mutein, protein, funkcionanil derivat, aktivna frakcija ili cirkularlno permutovani derivat istog. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18, i po mogućstvu imaju najmanje aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, ovakvi proteini imaju pojačanu biološku aktivnost u poređenju sa neizmenjenim IL-18BP. Preporučene aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili koja ima druge prednosti, kao što je bolja stabilnost Sli manja toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvesti u većim količinama ili ih je lakše prečistiti.

SSkvence IL-18BP i njene "splice" varijantr/izoformi mogu da se uzmu od VV099/09063 ili iz Novick et al., 1999, kao i od Kim et al., 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu da se konjuguju sa polimerima da se poboljšaju osobine proteina, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, podnošenje od strane ljudskog organizma ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj, IL18-BP može da se povezuje sa na pr. polietilenglicol (PEG). PEGilacija se može obaviti poznatim metodama, opisanim na primer u WO 92/13095.

Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitori IL-18, pre svega IL-18BP se PEGiliraju.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 obuhvata jednu imunoglobulinsku fuziju, t. j. inhibitor IL-18 je jedan fuzirani protein koji obuhvata ceo ili delove IL-18 vezujućeg proteina, koji je spojen za sve ili za deo imunoglobulina. Metode za realizaciju imunoglobulinskih fuzionih proteina dobro su poznati u struci, kao što su, na primer, oni opisani kod WO 01/03737. Stručnjak za ovu oblast razume da rezultujuća fuzija proteina iz ovog pronalaska zadržava biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18. Ova fuzija može biti direktna ili ići preko kratkog veznaog peptida koji može biti veoma kratak, odnosno imati samo 1 do 3 amino kiselinska ostatka, ili može biti duži, na primer 13 do 20 amino kiselinskih ostataka. Ovaj veznik može biti jedan tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili 13-amino kiselinski veznik sekvence koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-ly-Gly-Gln-Phe-Met koji se uvodi između IL-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultujući fuzioni protein je poboljšao svojstva, kao što je produženo vreme boravka u telesnim tečnostima (polu-život), poboljšanje specifične aktivnosti, povećani nivo ekspresije, ili prečišćavanje fuzionog proteina se olakšava.

U preporučenom obliku, IL-18BP se spaja sa konstantnim regionom molekula lg. Po mogućstvu, spaja se za region teških lanaca, kao što su, na primer, domeni CH2 i CH3 humanog IgGI. Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji obuhvataju IL-18BP i deo imunoglobulina opisani su, između ostalog, i u primeru 11 WO 99/09063. Drugi izoformi lg molekula su takođe pogodni za generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi lgG2 ili lgG4, ili druge klase lg, kao što su, na primer, IgM ili lg A. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

U još jednom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u kombinaciji sa antagonistom TNF. Antagonisti TNF svoju aktivnost vrše na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju ili sekvestriraju sam molekul TNF sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću da se delimično ili supstancijalno neutralizuje TNF epitop ili epitopi odgovorni za vezivanje TNF za receptore (u daljem tekstu ovo se naziva “sekvestrirajući antagonisti"). Sekvestrirajući antagonista može, na primer, da bude antitelo protiv TNF.

Alternativno, TNF antagonisti mogu da inhibiraju TNF signalni put koji se aktivira receptorima na površini ćelija po vezivanju TNF (u daljem tekstu koristi se izraz "signalni antagonisti”). Obe grupe antagonista su korisne, bilo same ili zajedno, u kombinaciji sa inhibitorom IL-18, u terapiji ili prevenciji srčanih oboljenja.

Antagonisti TNF se lako identifikuju i procenjuju rutinskim skriningom kandidata za dejstvo na aktivnost nativnog TNF na osetljive ćelijske linije in vitro, na primer humane B ćelije, u kojima TNF uzrokuje proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Ovaj esej sadrži formulaciju TNF u različitim razblaženjima antagonista kandidata, na pr. od 0. 1 do 100 puta moiarna količina TNF koja se koristi u eseju, i kontrole bez TNF ili samo antagonist (Tucci et al., 1992).

Sekvestrirajući antagonisti su preporučeni antagonisti TNF koji će se koristiti u skladu sa ovim pronalskom. Među sekvestrirajućim antagonistima, prednost se daje onim polipeptidima koji vezuju TNF visokim afinitetom i imaju nisku imunogenost. Prednost se posebno daje rastvorljivim molekulima TNF receptora i neutralizujuća antitela na TNF. Na primer, rastvorljivi TNF-RI i TNF-RII su korisni u ovom pronalasku. Razgranate forme ovih receptora, koje obuhvataju vanćelijske domene receptora ili njihovih funkcionalnih delova su posebno preferirani antagonisti u skladu sa ovim pronalaskom. Razgranati rastvorljivi receptori TNF tip-l i tip-ll opisani su, na primer u EP914431.

Razgranate forme TNF receptora su rastvorljive i u urinu i u serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorni vezujući proteini, koji se zovu TBPI odnosno TBPII (Engelmann et al., 1990). U skladu sa ovim pronalaskom, prednost se daje istovremenoj, sekvencijalnoj ili odvojenoj upotrebi inhibitora IL-18 sa TNF antagonistom.

U još jednom preporučenom obliku, humani solubilni TNF-RI (TBPI) je TNF antagonista koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom. Prirodni i rekombinantni solubilni TNF receptorski molekuli i metode za njihovu produkciju opisani su u evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalno podsećaju na receptorske molekule koji mogu da se koriste i u ovom pronalasku. Ovakvi biološki aktivni ekvivalenti ili derivati receptorskog molekula odnose se na delo polipeptida, ili na sekvencu koja enkodira receptorski molekul, koji je dovoljne veličine i koji je u stanju da vezuje TNF takvim afinitetom da interakcija sa membranski vezanim TNF receptorom bude inhibirana ili blokirana.

IL-18 inhibitor može da se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa TNF inhibitorom.

U skladu sa ovim pronalaskom, lek može dalje da uključi poznate agense koji se koriste za iečenje srčanih oboljenja kao što su nitrati, na pr. nitroglicerin, diuretici, ACE inhibitori, digitalis, beta-Blokatori ili kalcijumski blokatori u kombinaciji sa inhibitorom IL-18. Aktivne komponente mogu da se koriste istovremeno, sekvencijalno ili posebno.

U još daljem preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini oko 0, 001 do 100 mg/kg ili oko 1 do 10 mg/kg ili 2 do 5 mg/kg.

IL-18 inhibitor u skladu sa ovim pronalaskom se po mogućstvu daje sistemski, i poželjno supkutano ili intramuskularno.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu ekspresionog vektora koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 u preparatu leka za prevenciju i/ili Iečenje srčanih oboljenja. Prema tome, pristup genskom terapijom treba uzeti u obzir kada IL-18 inhibitor treba dopremiti na mesto na kome je potreban. Da bi se lečile i/ili prevenirale srčane bolesti vektor genske terapije koji obuhvata sekvencu inhibitora IL-18 može da se, na primer, ubrizgava direktno u obolelo tkivo, izbegavajući na taj način probleme uključene u sistemsku primenu vektora genske terapije kao što su razblaživanje vektora, dostizanje do ili ciljanje ciljnih ćelija i tkiva, kao i neželjena dejstva.

Korišćenje vektora za izazivanje i/ili pojačavanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji koja je normalno nema na ekspresiju IL-18 inhibitora, ili koja eksprimira količine inhibitora koje nisu dovoljne, takođe se razmatraju u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj vektor može da obuhvati regulatorne sekvence funkcionalne u ćelijama za koje želimo da eksprimiraju inhibitor ili IL-18. Ovakve mogu biti, na primer, promoteri ili pojačivači. Regulatorne sekvence onda mogu da se uvedu u desni lokus genoma homolognom rekombinacijom i na taj način operativno povežu regulatornu sekvencu sa genom, čija ekspresija treba da se uvede ili pojača. Ova tehnologija se obično naziva "Endogena Genska Aktivacija” (EGA), i opisana je u, na primer, WO 91/09955.

Stručnjak za ovu oblast će lako razumeti da je moguće i da se direktno zatvori ekspresija IL-18 ne korišćenjem inhibitora IL-18, istom tehnikom. Da se to uradi, negativni regulacioni element, kao na primer, element za utišavanje, može da se uvede u genski lokus IL-18, i tako da dovede do nishodne regulacije ili prevencije ekspresije IL-18. Stručnjak za ovu oblast će lako razumeti da takva nishodna regulacija ili prevencija ekspresije IL-18 ima isto dejstvo kao i upotreba IL-18 inhibitora za prevenciju i/ili lečenje bolesti.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede inhibitor IL-18 u proizvoidnji leka za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja.

Ovaj IL-18 inhibitor koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom može, po preporuci da se koristi u okviru jednog farmaceutskog sastava, opciono u kombinaciji sa terapisjki efikasnom količinom TNF inhibitora.

IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno permutovani derivati kako je to gore opisano predstavljaju preporučene aktivne sastojke ovog farmaceutkog sastava.

Definicija “farmaceutski prihvatljivog" treba da obuhvati svaki nosač, koji ne utiče na efikasnost biološke aktivnosti aktivne komponente koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu administraciju, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci u farmaaceutskom sastavu u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju na niz različitih načina. U načine davanja spadaju intradermalni, transdermalni (na pr. u formulacijama sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani, oralni, intrakranijalni, epidurani, topički i intranazalni put. Svi drugi terapijski efikasni načini davanja mogu da se koriste, na primer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili genskom terapijom gde se DNK molekul koji enkodira aktivni agens daje pacijentu (na pr. preko vectora), zbog čega se aktivni agens eksprimira i sekretuje in vivo. Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski aktivni surfaktanti, ekscipijenti, nosači, razblaživači i dopunske materije.

Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskularnu) administraciju, aktivni protein(i) mogu da se formulišu kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofiiizovani prah u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (na pr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (na pr.

manitol) ili hemijsku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Ova formulacija se sterilizuje uobičajenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih protein(a) u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša korišćenjem procesa konjugacije kojim se produžava poiu-život molekula u telu čoveka, na primer povezivanjem molekula sa polietilenglikolom. kako je opisano u prijavi PCT WO 92/13095.

Terapijski efikasne količine aktivnih proteina zavisiće od mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista, afinitet tog antagonista zar IL-18, svaku rezidualnu citotoksičnu aktivnost koju ispoljavaju ti antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući poželjnost održavanja netoksičnih nivoa endogene aktivnosti IL-18).

"Terapijski efikasna količina" je ona koja kada se daje, IL-18 inhibitor dovodi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza, u vidu pojedinačne ili većeg broja doza, svakom pojedincu zavisiće od čitavog niza faktora, uključujući i farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, način davanja, kliničko stanje pacijenta i njegove osobine (pol, godine, telesna težina, zdravlje, veličina), obim simptoma, prateću terapiju, učestalost terapije, kao i željeni efekat. Podešavanje i manipulacije utvrđenih raspona doza se nalaze u okvirima sposobnosti stručnjaka za ovu oblast, kao i in vivo i in vitro metode za određivanje inhibicije IL-18 kod pojedinca.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0, 001 do 100 mg/kg ili oko 0, 01 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0. 1 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 2 mg/kg telesne težine.

Način davanja kome se daje prednost u ovom pronalasku jeste supkutani način davanja. Dalje se preporučuje intramuskularna administracija u skladu sa ovim pronalaskom. Da bi se IL-18 inhibitor davao direktno na mesto delovanja, preporučuje se i da se daje topički.

U drugim preporučenim oblicima, inhibitor IL-18 daje se jednom dnevno ili svaki drugi dan.

Dnevna doza se obično daje u podeljenim dozama ili u obliku sa kontrolisanim oslobađanjem da bi se dobili željeni rezultati. Drugo ili naredno davanje se može obaviti u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja se daje pacijentu. Drugo ili naredno davanje se može obaviti tokom ili pre početka bolesti..

U skladu s ovim pronalaskom IL-18 inhibitor se može davati profilaktički, ili terapijski licima pre, istovremeno sa ili sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili agensima (na pr. terapijski režim sa više lekova), u terapijski efikasnim količinama, posebno sa TNF inhibitorom i/ili durgim kardioprotektivnim agensom. Aktivni agensi koji se daju istovremeno s drugim terapijskim agensima mogu se davati u istom sastavu ili drugačijem.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za primenu farmaceutskog sastava koji obuhvata mešavinu efikasne količine IL-18 inhibitora i/ili TNF antagonista sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Ovaj proizvod se dalje odnosi na metodu lečenja srčanih oboljenja, uključujući i davanje farmaceutski efikasnih IL-18 inhibitora, po želji u kombinaciji sa farmaceutski efikasnom količinom TNF antagonista, pacijentima kojima je to potrebno.

Pošto smo sada detaljno opisali ovaj pronalazak, oni koji su stručni za ovu oblast shvatiće da on može da se primenjuje u čitavom spektru različitih parametara ekvivalencije, koncentracija, i uslova a da se ne odstupa od duha i obima ovog pronalaska i bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Dok je ovaj pronalazak opisan u vezi sa specifičnim oblicima istog, jasno je da mogu postojati i druge modifikacije. Ova primena ima za cilj da obuhvati sve varijacije, primene ili adaptacije ovog pronalaska koje generalno prate principe samog pronalaska i takva odstupanja od ovog prikazivanja pronalaska do kojih se dolazi poznatom ili uobičajenom praksom u struci na koju se pronalazak odnosi, i kako može da se primeni na osnovne osobine koje su ovde navedene i koje su obuhvaćene zahtevima koji slede.

Sve ovde citirane reference, uključujući članke iz časopisa ili apstrakte, objavljene ili neobjavljene američke ili inostrane patentne prijave, izdate američke ili inostrane patente ili sve druge reference ovde su potpuno uključene samim njihovim citiranjem, uključujući sve podatke, tabele, cifre i tekst prikazan u citiranim referencama. Uz to, celokupni sadržaj citiranih referenci je takođe obuhvaćen ovde samim njihovim citiranjem.

Pozivanje na fazu poznate metode, konvencionalne metode ni na koji način ne znači da se priznaje da je ma koji aspekt, opis ili oblik ovog pronalaska otkriven, preporučen ili naveden u toj metodi.

Opisi specifičnih oblika ovog pronalaska koji slede će potpuno da otkriju opštu prirodu pronalaska da drugi mogu, primenjujući znanje iz struke (uključujući sadržaj citiranih referenci) da lako modifikuju i/ili prilagode različitim primenama te različite oblike, bez nepotrebnog eksperimentisanja, i ne odstupajući od opšteg koncepta ovog pronalaska. Prema tome, i takve adaptacije i modifikacije su obuhvaćene rasponu ekvivalenata opisanih oblika, na osnovu uputstava i znanja otkrivenih ovde. Podrazumeva se da frazeologija i terminolgija koji se ovde koriste služi za svrhe opisa, a ne za oganičavanje, tako da frazeologiju i terminolgiju dole iznetih specifikacija treba da tumači stručnjak za ovu oblast u svetlu znanja i uputstava koji su izneti, u kombinaciji sa znanjem koje je već poznato u ovoj oblasti.

PRIMERI

Primer 1: Inhibicija 1L-18 smanjuje disfunkciju ishemičnog miokarda in

vitro

Materijal i metode

Reagensi IL-18BPa izoform je eksprimiran N-terminalnim (His)s tagom u jajnim ćelijama kineskog hrčka i purifikovan do homogenosti. Sposobnost IL-18BPa-(His)6 da neutralizuje IL-18 već je opisana (Kim et al., 2000). ICE inhibitor (ICEi) Ac-Try-Val-Ala~ Asp-hlorometilketon (YVAD) je kupljen od Alexis Biochemicals (San Diego) i rastvoren u DMSO u koncentraciji od 10 mg/ml. ICEi je razblažen u rastvoru Tyrode pre korišćenja. Na humanim perifernim krvnim mononuklearnim ćelijama, ICEi smanjuje endotoksinom izazvanu sekreciju zrelih IL-1β za 92%, kako je izmereno pomoću ELISA (Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ).

lizolovani atriialni trabekuii Pacijenti koji se podvrgavaju elektivnoj operaciji premošćavanja koronarnih arterija sa oksigenatorskom pumpom iziskuju da im se umetne kanila u desnu pretkomoru. U tom trenutku, mali segment apendiksa desnog atrijuma se iseca rutinski i odbacuje. Trabekule su dobijene iz tog odbačenog tkiva. Humano atrijalno tkivo je stavljeno u oksigenisani modifikovani puferovani Tirodov rastvor na 4°C. Modifikovani Tirodeov rastvor je pripreman svakodnevno s dejonizovanom destilovanom vodom i sadržao D-glukoze u količini od 5. 0 mmol/litar, CaCI2 2. 0 mmol/litar, NaCI 118. 0 mmol/litar, KCI 4. 0 mmol/litar, MgS04-7H20 1. 2 mmol/litar, NaHC03 25. 0 mmol/litar, i NaH2P04 1. 2 mmol/litar. Tyrodov rastvor bez supstrata sadržao je holin hlorid u količini od 7 mmol/liter da se održi osmolarnost. Osim ako nije drugačije navedeno, hemikalije i reagensi su kupljeni kod firme Sigma. Dve od četiri trabekule (4-7 mm duge i prečnika <1. 0 mm) spojene su za fors transdjuser i uronjene u zagrejano (37°C) 30-ml kupatilo od modifikovanog Tirodovog rastvora; 92. 5% 02/7, 5% C02mešavine je ubacivano tokom stanja normooksemije. Ova gasna mešavina je obezbedila parcijalni pritisak 02 od >350 mmHg (1 mmHg = 133 Pa), parcijalni pritisak C02 od 36-40 mmHg, i pH od 7. 35-7. 45. Svaki parametar je rutinski proveravan automatskim analizatorom gasova u krvi. Temperatura kupatila u kome je organ održavana je na 37°C tokom celog eksperimenta. Tokom simulirane ishemije, gasna mešavina je promenjena na 92.5% N2/7.5% C02. Ova mešavina je dala parcijalni pritisak

02 od <50 mmHg. Puferski rastvor je menja na svakih 20 min osim tokom perioda od 30-min kada je simulirana ishemija.

Eksperimentalni dizajn Trabekule u ekvilibrirane tokom 90 min da se poveća osnovna snaga istezanja na 1.000 mg i da se omogući stabilizacija razvijene snage. Trabekule koje nisu uspele da generišu više od 250 mg razvijene snage su isključene iz ispitivanja. Tokom perioda od 90 min ekvilibracije, piatinskim elektrodama je uspostavljen ritam (Radnoti Glass, Monrovia, CA) za stimulaciju polja. Ove elektrode su stavljene na obe strane trabekula, stimulisane (Grass SD9 stimulator, Warwick, Rl) pulsno na 6-ms pri naponu od 20% iznad praga, sa ritmom od 1 Hz tokom normooksije i

3 Hz tokom ishemije. Kontrakcije su praćene transdjuseruima snage (Grass FT03) i beležene kompjuterizovanim preamplifajerom i digitajzerom (MacLab Quad Bridge, MacLab/8e, AD Instruments, Milford, MA) i kontinuirano praćene jednim Macintosh kompjuterom.

Po ekvilibraciji, trabekule od jednog pacijenta su proučavane u tri vrste eksperimentalnih uslova: kontrolnim uslovima koji su se sastojali od 90 min normoksične suprafuzije; l/R koja se sastojala od 30 min simulirane ishemije praćene sa 45 min reperfuzije; dok se treći uslov sastojao od intevencije anticitokinima. U ovom drugom slučaju, anticitokin je dodavan u kupatilo za suprafuziju neposredno pre početka ishemije i bio je prisutan tokom svih 45 min reperfuzije.

Očuvana Trabekularna CK Aktivnost Na kraju tkivne reperfuzije (90 min) CK aktivnost je određivana kako je opisano (Kaplan et al., 1993). Tkiva su homogenizovana u 100 vol ledeno hladnog izotonog ekstrakcionog pufera (Cleveland et al., 1997, Kaplan et al., 1993). Ovaj esej je obavljen kompletom za CK (Sigma) korišćenjem automatskog spektrofotometra. Rezultati su prikazani kao jedinice CK aktivnosti na mg (vlažna težina tkiva).

Izolacija RNK i PCR kuoliran reverznom transkripcijom Sveže trabekule su homogenizovane u Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati), a ukupna RNK je izolovana hloroformskom ekstrakcijom i izopropanolskom precipitacijom. RNK je rastvorena u vodi tretiranoj dietil-pirokarbonatom, tretiranoj DNasom, i kvantifikovanoj korišćenjem GeneOuant (Amersham Pharmacia Biotech). cDNK metode su već opisane (Reznikov et al., 2000). Za svaki PCR, korišćen je sledeći redosled: prethodno zagrevanje na 95°C tokom 15 min, zatim ciklusi na94°C tokom 40 s, 55°C tokom 45 s, i 72°C tokom 1 min, sa završnom ekstenzionom fazom na 72°C tokom 10 min. Optimalni broj ciklusa je utvrđen na 35. Prajmeri za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) i humani IL-18 (Reznikov et al., 2000) i za humani IL-18BPa (Kim et al., 2000) su već objavljeni. Ovi PCR proizvodi su separirani na 1.5% agaroza gelu sa sadržajem 0.5x TBE (50 mM Tris/45 mM borne kiselihe/0.5 mM EDTA, pH 8.3) sa etidijum bromidom na 0.5 mg/ml, vizualizovano UV osvetljenjem i fotografisano. Denzitometrija je obavljena na negativu (IMAGEOUANT softvvare, Molecular Dynamics), a relativna apsorbanca IL-18 i IL-18BP PCR proizvoda je korigovana u odnosu na apsorbancu dobijenu za GAPDH.

Određivanja IL-18 Sveže trabekule su homogenizovane kako je gore opisano za merenja CK. IL-18 je analiziran tečnom fazom elektrohemiluminescencije (ECL, Igen, Gaithersburg, MD). Mišja anti-humana IL-18 mAb (R &D Systems) obeležena su rutenijumom (Igen). Uz to, afinitentno prečišćeno kozje anti-humano IL-18 antitelo (R & D) obeleženo je biotinom (Igen). Ovo biotinilirano antitelo razblaženo je do finalne koncentracije odi pg/rnl u PBS (pH 7.4) sa sadržajem 0.25% BSA, 0.5% Tween-20, i0.01% azida (ECL pufer). Epruvete za esej, 25 pl biotiniliranog antitela prethodno su inkubirane na sobnoj temperaturi sa 25 pl streptavidinom obloženih paramagnetskih perli (Dynal, Great Neck, NY) na 1 pg/pl tokom 30 min snažno mućkajući. Uzorci koji će se testirati (25 pl) ili standardi dodavani su u epruvete posle čega je dodavano 25 pl ruteniliranog antitela (finalna koncentracija, 1 pg/pl, razblaženo u ECL puferu). Ove epruvete su onda mućkane naredna 24 h. Reakcija je gašena odavanjem PBS u koncentraciji od 200 pl po epruveti a količina hemiluminescencije određivana je Origen Analizatoromr (Igen). Granica detekcije za IL-18 je 16 pg/ml.

Confocal Microscopy Humano atrijalno tkivo koje je dobijeno tokom insercije kanile oksigenatorske pumpe stavljeno je u plastični držač od 1 cm (Meldrum et al., 1998), ukalupljeno i zamrznuto u medijumu za zamrzavanje tkiva (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) na izopentanu hlađeno suvim ledom. Zamrznuti odsečci (5 pm) su sečeni kriostatom Leica CM 1850 (Leica, Deerfield, IL). Slajdovi su fiksirani 10 min u 4% paraformaldehidu, sušeni na vazduhu, i inkubirani 20 min u PBS u koji je dodato 10% normalnog kozjeg seruma. Odsečci su inkubirani u razblaženju 1:100 zečjeg anti-humanog IL-18 antitela (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ili ne-imunom zečjem IgG u koncentraciji od 1 pg/mi kao negativna kontrola. Antitela su razblažena u PBS sa sadržajem 1% BSA. Posle inkubacije preko noći na 4°C, odsečci su oprani tri puta sa 0.5% BSA u PBS. Odsečci su onda inkubirani sa sekundarnim kozjim anti-zečjim antitelom konjugovanim do Alexa488 (Molecular Probes) tokom 60 min na sobnoj temperaturi u mraku. Jedra su bojena plavo bisbenzimidom (Sigma) u koncentraciji od 1 pg/100 ml. Po prebojavanju, isprani i ispitani uz pomoć Leica DM RXA (Leica) konfokal laser sistemom za skeniranje i analizirani SLIDEBOOK softvvare koji je rađen za Macintosh (Intelligent imaging Innovations, Denver).

Statistička analiza Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM. Prosečne promene u razvijenoj snazi su izračunavane u odnosu na kontrolnu vrednost posle 90 min za tkivo svakog pacijenta. Statistička značajnost razlika između grupa određivana je faktorijalnom ANOVA sa Bonferroni-Dunn post hoc analizom. Statistička analiza obavljena je sa STAT-VIEW 4.51 softvvare (Abacus Concepts, Calabasas, CA).

Rezultati

Deistvo neutralizacije endogenog IL-18 sa IL-18BP na postishemiiski razvijenu

snagu

SI. 1A pokazuje kinetički odgovor trabekula na oštećenje izazvano l/R. Pokazana je finalna 15 min ekvilibracija i normalizacija na 100% na početku eksperimentalnog perioda. Kontrolne trabekule su podvrgnute suprafuziji u normooksičnim uslovima tokom celog eksperimenta. Kao što je prikazano, postoji smanjenje (10%) u razvijenoj snazi u kontrolnim trabekulima. Trabekule podvrgnute ishemiji pokazuju brzi pad kontraktilne funkcije; kod reperfuzije, kontraktilna snaga se vraća na oko 25% razvijene snage kod kontrole. Za razliku od toga, trabekule izložene ishemiji ali u prisustvu IL-18BP vraćale su 55% razvijene snage kod kontrole. Za procenu odgovora na l/R tkiva srca dobijenog od nekoliko pacijenata, nivoi razvijene snage u kontrolnim trabekulima posle 90 min postavljeni su kao 100% vrednosti za uzorak svakog pacijenta, pa je izračunat procenat relativne promene razvijene snage za eksperimentalne grupe.

Kao što je prikazano na SI. 16, postishemijski razvijena snaga kod netretiranih trabekula (l/R) smanjena je na prosečno 35% od kontrolne. Međutim, u prisustvu IL-18BP, ovo smanjenje je ublaženo na prosečno 66.2% od kontrole u koncentraciji od 1 pg/ml i na 76% pri 5 pg/ml. Ovi rezultati govore da l/R dovodi do oslobađanja biološki aktivnog IL-18 po obradi endogenog prekursora IL-18 pomoću ICE. Prema tome, IL-18 je mereno u sveže dobijenom atrijalnom tkivu. Kao što je prikazano na SI. 2, bazalni IL-18 bio je prisutan u trabekulima dobijenim pre insercije kanile oksigenatorske pumpe u desnu pretkomoru. Posle 90 min ekvilibracije, 30 min ishemije, i 45 min reoksigenacije, trabekule su homogenizovane, pa su određivani nivoi IL-18. Zabeleženo je 4,5-struko povećanje IL-18 u tkivu posle l/R (SI. 2).

Nivoi IL-18 i IL-18BP u mRNK u stabilnom takođe su određivani u ovim tkivima. Zabeležili smo bazalnu gensku ekspresiju za IL-18 i IL-18BP u sveže dobijenim homogenatima preishemičnog atrijuma (SI. 3 A, B). Slično povećanju IL-18 proteina, l/R je dovela do dodatnog povećanja nivoa IL-18 u mRNK u stabilnom stanju (povećanje od 4,7- puta). IL-18BP genska ekspresija je zabeležena i u sveže dobijenom atrijalnom tkviu i samo umereno povećana (1,3-puta) posle l/R.

Lokacija IL-18 u Humanom Miokardiiumu Budući da su IL-18 protein, mereno pomoću ECL, i IL-18 mRNK prisutni u sveže dobijenim hiomogenatima miokada, histohemijsko bojenje se koristi za određivanje lokacije IL-18. Atrijalno tkivo je dobijeno neposredno pre insercije kanile oksigenatorske pumpe i odmah brzo zamrznuto (nije prikazano). IL-18 je primećen u rezidentnim miokardijalnim makrofagima i u vaskularnim endotelijalnim ćelijama. IL-18 u makrofagima i u endotelijalnim ćelijama prisutni su pre nego što ishemija vezana za operaciju nastane i prisutna je u odsustvu kontakta sa ma kojom stranom površinom. Lokalizacija IL-18 u rezidentnim makrofagima i u vaskularnim endotelijalnim ćelijama je konzistentna sa prethodnim ispitivanjima konstitutivnog prethodno formiranog IL-18 u sveže dobijenim humanim perifernim monocitima zdravih ispitanika (Puren et al., 1999). Prema tome, može se zaključiti da prethodno formirani prekursor IL-18 postoji u miokardu pacijenata kojima je zakazan koronarni arterijski bajpas zbog ishemičnog oboljenja srca.

Deistvo inhibiciie ICE na postishemijski razvijenu snagu

Pošto IL-18BP efikasno ublažava ishemijski izazvanu disfunkciju miokarda, mi smo pretpostavili da će inhibicija konvrerzije prethodni formiranog prekursora IL-18 u zreli IL-18 takođe ublažiti ishemijski izazvanu disfunkciju miokarda. Prema tome, specifični ICE inhibitor YVAD dodat je u kupatilo za suprafuziju pre početka ishemije. ICE inhibicija dodavanjem YVAD nastavljena je tokom celog perioda ishemije i tokom reperfuzije. YVAD-posredovana inhibicija ICE rezultirala je ublaženjem ishemijski izazvane disfunkcije miokarda, što je pokazano poboljšanjem kontraktilne funkcije sa 35% od kontrolne u l/R na 60% u koncentraciji od 10 pg/ml i 75.8% sa 20 pg/ml (SI. 4). Ovi rezultati potvrđuju da biološki aktivni IL-18 u humanom miokardijumu predstavlja rezultat cepanja prethodno formiranog prekursora IL-18 pomoću ICE. Uz to, ovi rezultati govore da ishemija miokarda može da aktivnira latentni ICE.

Očuvanje viiabilnosti ćelija

Intraćelijski nivoi CK korišćeni su da se proceni stepen ćelijske vijabilnosti posle l/R. U ovom eseju, što je veća vredbnost CK, veći je broj vijabilnih ćelija. Svaka od intervencija anticitokina dovodi do očuvanja ćelijske vijabilnosti. Kao što je pokazano na SI. 5, IL-18BP i ICE inhibicija (10 i 20 pig/ml), povećavali su nivoe CK posle l/R sa 1.399 do, 5.921,5.675, 6.624, i 4.662 jedinica aktivnosti CK na mg (vlažno tkivo). Ova opažanja govore da inhibicija l/R-indukovane aktivacije IL-18 čuva vijabilnost mišićnih ćelija u ovom ex vivo modelu.

Deistvo neuralizaciie TNFα indukovane miokardiialne funkcije

Kao što je prikazano na SI. 6, razvijena snaga (DF) trabekula smanjena je za 18% posle 90 minuta izlaganje egzogenom TNFα. Neuralizacija endogenog IL-18 na kontraktilnu funkciju u humanom miokardijumu izloženom egzogenom TNFα inkubacijom sa IL-18BP tokom deset minuta pre dodavanja TNFα smanjilo je veličinu pada razvijene snage (DF), vidi SI. 6. Posle 90 minuta, razvijena snaga u kontrolnoj grupi smanjena je za 18%, dok je u tabekulama izloženim TNFα-povećana za 58% u poređenju s kontrolom. Međutim, kod trabekula izloženih TNFα- sa IL-18BP, razvijena snaga je pala samo za 30% u poređenju s kontrolom. Ovi podaci govore da direktna dejstva TNFα na depresiju kontraktilnosti miokarda biva posredovana, ber delimično, biološki aktivnim endogenim IL-I8.

Deistvo egzogenog IL-18 na razvijenu snagu

Dalje, određivano je direktno dejstvo egzogenog IL-I8 na kontraktilnu funkciju miokarda. IL-I8 je dodavano u suprafuzirane trabekule posle 90 minuta ekvilibracije i sa svakom promenom kupatila. Kao što je pokazano na Slici 7, IL-I8 dovodi do sporog ali progresivnog opadanja razvijene snage tokom eksperimentalnog perioda. Posle 90 minuta kontinuiranog izlaganja dejstvu IL-18, razvijena snaga je opala za 42%. Ovi podaci pokazuju da egzogeni IL-18,. slično TNFα, deluje depresivno na funkciju miokarda.

Interesantno je da IL-18 nije tako snažan depresivni agens za miokardnu funkciju kao što je to TNFα.

Očuvanje viiabilnosti ćelija

Casases se često dovode u vezu sa apoptozom. Za procenu vijabilnosti ćelija u trabekulima izmoženim TNFα, merili smo tkivnu intraćelijsku kreatin kinazu (CK). U ovom eseju, visoki nivoi CK ukazuju na vijabilne ćelije. Kao što je prikazano na SI. 8, kontrolne trabekule koje su podvrgnute normoksičnoj suprafuziji u trajanju od 90 minuta sadržavale su 6801+276 jedinica CK aktivnosti na miligram težine vlažnog tkiva. Za razliku od njih, trabekule izložene 30/45 minutnom l/R oštećenju ili 90 minutnom izlaganju dejstvu TNFα pikazale su smanjene nivoe očuvane CK izraženo kao 1774+181 i 3246+217 jedinica/mg. Trabekule izložene TNFα u prisustvu IL-18BP sadržale su 5605+212 jedinica/mg tkiva. Zanimljivo da su trabekule tretirane sa TNFα imale više nivoe očuvanih CK u poređenju sa trabekulima izloženim l/R. Ovo je bio neočekivani nalaz jer je veličina razvijene snage na kraju eksperimentalnog perioda bila slična za l/R i TNFα.

Primer 3: IL-18BP štiti od infarkta miokarda IL-18BP in vivo

Metoda

In vivo intramuskularni elektrotransfer mišjeg IL-18BP ekspresionog plazmida C57BL/6 miševi su primali u trondeljnim intervalima 3 injekcije sa ekspresionim plazmidom sa sadržajem cDNK za IL-18BP (koji se naziva pcDNA3-IL18BP, opisan u WO 01/85201). Kontrolnim miševima je ubrizgvan kontrolni prazni plazmid. Mišji IL-18BP izoform d cDNA izolovan kako je opisano (prateći broj # 09Z0M9) (Kim et al., 2000) subkloniran je u EcoR1/Not1 lokacije ekspresionog vektora ćelija sisara pcDNA3 pod kontrolom promotora citomegalovirusa (Invitrogen). Kontrolni plazmid je bio slični konstrukt lišen terapijske cDNK. Kontrolna grupa je imala 31 miša, dok je eksperimentalna grupa koja je primala IL-18BP imala 27 miševa.

IL-18BP ili kontrolni ekspresioni plazmid (60 pig) ubrizgavan je u oba tibijalna kranijalna mišića anesteziranih miševa kao je prethodno opisano (Mallat et al., 1999). Ukratko, transkutani električni pulsevi (8 kvadratnih talasa električmih pulseva od po 200 V/cm, trajanja 20 msec na 2 Hz) davani su preko PS-15 elektropulsatora (Genetronics, France) korišćenjem dve pločaste elektrode od nerđajućeg čelika postavljenih u razmaku od 4. 2 do 5. 3 mm, sa svake strane noge.

Indukcija infarkta u levoi komori

Dvadeset četiri sata po administraciji IL-18BP plazmida ili praznog plazmida, miševi su anestezirani IP injeksijom ksilazina i ketamina, ventilirani i podvrgnuti torakotomiji. Glavna leva koronarna arterija je zatim trajno ligirana koriošćenjem prolenskog konca 8-0, da bi se izazvao infarkt miokarda, posle čega je zatvoren grudni koš a životinje ostavljene da se oporave od anestezije. Perioperativni mortalitet je bio manji od 20%. Postoperativni mortalitet je bio 48% u kontrolnoj grupi i 26% u eksperimentlanoj i skoro po pravilu nastajao je 4-5 dana po ligaciji.

Sedam dana po ligaciji, miševi su ponovo bili anestezirani i procenjene su dimenzije leve ventrikule (LV) uz pomoć ehokardiografije dok je grudni koš bio zatvoren, korišćenjem ATL HDI 5000 ehokardiografa. LV frakciono skraćivanje je izračunato iz mera prečnika na kraju dijastole i na kraju sistole. Na kraju elektrokardiografskog merenja, srce je izvađeno, fiksirano, i kasnije isečeno na preseke. Histološki preseci su obojeni sirijus crvenim za procenu veličine infarkta.

Rezultati

Dijastolni prečnik leve komore sedam dana po ligaciji kod preživelih miševa iznosio je:

0. 53+0. 01 mm (n=20) kod miševa tretiranih IL-18BP u poređenju sa 0. 59+0. 01 mm kod kontrolnih miševa (n=16), p < 0. 01.

Sistolni prečnik leve komopre sedam dana po ligaciji kod preživelih miševa iznosio je:

0. 45+0. 02) kod miševa tretiranih IL-18BP u poređenju sa 0. 52+0. 02 kod kontrolnih miševa, p < 0. 01

Frakciono skraćenje leve komore: 15+1% kod miševa tretiranih 1L-18BP u poređenju sa 11 + 1 % kod kontrolnih miševa p < 0. 01.

Zaključak: IL-18BP smanjuje mortalitet kod miševa posle infarkta miokarda indukovanog totalnom ligacijom koronarnih arterija u levoj komori za 50 %. Uz to,

funkcija leve komore signifikantno je poboljšana, što se pokazuje smanjenim prečnicima leve komore u sistoli i dijastoli.

Claims (25)

1.    Korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja.

2.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time da je srčano oboljenje zapravo ishemična bolest srca.

3.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je srčano oboljenje hronično.

4.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da je to srčano oboljenje angina pektoris.

5.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je srčano oboljenje hronično.

6.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 5, naznačeno time da je srčano oboljenje infarkt miokarda.

7.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da je srčano oboljenje srčana insuficijencija.

8.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da je srčano oboljenje kardiomiopatija.

9.    Korišćenje u skladu zahtevima 1 do 8, naznačeno time da je inhibitor IL-18 odabran od inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela protiv IL-18, antitela protiv svih IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujući proteini, ili izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkulatorno permutovani njihovi derivati koji inhibiraju biološku aktivnost IL-18.

10.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 9, naznačeno time da je inhibitor IL-18 antitelo protiv IL-18.

11.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 9, naznačeno time da je inhibitor IL-18 antitelo protiv IL-18 receptora α

12.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 9, naznačeno time da je inhibitor IL-18 antitelo protiv IL-18 receptora δ

13.    Korišćenje u skladu zahtevima 9 do 12, naznačeno time da je IL-18 antitelo humanizovano ili humano antitelo.

14.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 9, naznačeno time da je inhibitor IL-18 jedan IL-18 vezujući protein, ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkulatorno permutovan njihov derivat koji inhibira biološku aktivnost IL-18.

15.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time daje IL-18 inhibitor giikoziliran na jednom ili više mesta.

16.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 14, naznačeno time da fuzirani protein obuhvata fuziju imunoglobulina (lg).

17.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 9 ili 14, naznačeno time da funkcionalni derivat obuhvata najmanje jednu grupu pripojenu ua jednu ili više funkcionalnih grupa, koja nastaje najednom ili više bočnih lanaca aminokiselinskih ostataka.

18.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 17, naznačeno time da je ova grupa jedna polietilenska grupa.

19.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da ovaj lek još dodatno obuhvata i antagonistu faktora tumorske nekroze (TNF).

20.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 19, naznačeno time da se inhibitor IL-18 istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od TNF antagonista.

21.    Korišćenje u skladu sa zahtevom 19 ili 20, naznačeno time da je TNF antagonista TBPI i/ili TBPil.

22.    Korišćenje u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se inhibitor IL-18 u koncentracijama u rasponu od oko 0, 001 do 100 mg/kg ili oko 1 to 10 mg/kg ili 2 do 5 mg/kg.

23.    Korišćenje ekspresionog vektora koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 za pripremu leka za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja.

24.    Korišćenje ekspresionog vektora za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za pripremu leka za prevenciju i/ili lečenje srčanih bolesti.

25. Metoda za lečenje srčanih bolesti koja obuhvata davanje efikasne inhibirajuće količine inhibitora IL-18 domaćinu kome je to potrebno.