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KR20030005280A - 혈관의 건강을 개선하기 위한 조성물과 방법 - Google Patents

혈관의 건강을 개선하기 위한 조성물과 방법 Download PDF

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KR20030005280A
KR20030005280A KR1020027013750A KR20027013750A KR20030005280A KR 20030005280 A KR20030005280 A KR 20030005280A KR 1020027013750 A KR1020027013750 A KR 1020027013750A KR 20027013750 A KR20027013750 A KR 20027013750A KR 20030005280 A KR20030005280 A KR 20030005280A
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cocoa
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cholesterol
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해롤드 에이치. 슈미츠
카티 에이. 체복스
아미 돔브로스키
랄프 제롬
Original Assignee
마아즈, 인코오포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 예를 들면, 적어도 하나의 콜레스테롤 저감제와 조합된 프로시아니딘들과 같은 코코아 폴리페놀들을 포함하는 조성물들 및 아테롬성 동맥경화와 심혈관 질환의 치료와 예방을 포함하는 혈관계 건강의 개선을 위한 방법들에 관한 것이다.

Description

혈관의 건강을 개선하기 위한 조성물과 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING VASCULAR HEALTH}
심장 혈관 질병(CVD)의 일차 유형인 관상동맥 질병은 현재 미국에서 가장 큰 사망 원인이다. 뇌혈관 질병이 세 번째이다. 관상동맥 질병과 뇌혈관 질병의 병인학(etiology)은 아테롬성 동맥경화증에 기인한다. 이들의 임상적 징후들을 통하여 아테롬성 동맥경화증이 백만 건의 심장마비, 매년 약 40만 건의 발작 및 수많은 혈관 순환 문제의 가장 주된 원인이다. 많은 환자들이 고혈압으로 고통받고 있다.
실질적인 증거들이 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)과 조발성 아테롬성 동맥경화증간에, 혈장 콜레스테롤 수치가 높아질수록 뒤이은 심장 발작의 위험이 높아진다는 인과관계를 성립시켜왔다 (Steinberg, D., JAMA 264:3047(1990), 참고). 아테롬성 동맥경화증에 이르는 연속적인 경과들에 있어서, 처음은 경동맥,관상동맥, 대뇌 동맥 및 대동맥에서 "지방층"이 생성되는 것으로 시작한다고 여겨진다. 이러한 손상은 혈맥내막층(intimal layer)의 대식 세포와 평활근 세포(smooth muscle cell)에 있어 주로 발견되는 콜레스테롤과 콜레스테릴 에스테르의 지방성 축적을 포함한다. 혈관의 평활근 세포의 이동과 증식은 지질의 초기 축적에 따르는 아테롬성 동맥경화증의 발병에 중요한 역할을 한다.
부가적으로, 아테롬성 동맥경화증과 심혈관 질환의 발달은 LDL 산화, 고리-산화제(COX) 활성, 리폭시게나제(LOX) 활성, 산화질소(NO)의 생성 및 산화질소 합성제(NOS) 활성에 의해 조절되고, 그리고/또는 그것들과 관련되어 있다. 여기에 포함되는 다양한 경로(pathway)들과 과정(process)들간의 관계가 도 1에 나타나 있고, 세부적인 내용은 WO 97/36497로 발행된 국제출원번호 PCT/US97/05693에 설명되어 있고, 이것의 연관된 부분은 여기에 참고문헌으로 포함되어 있다. 간략하게, LDL 산화는 대식세포가 산화적으로 변형된 LDL을 섭취하여, 소위 말하는 "포말세포(foam cell)"로 변형될 때 발생하는 손상(아테롬(atheroma))이 시작되는 중요한 단계이다. COX와 LOX효소는 프로스타글란딘과 트롬복산 A2를 생산하는 아라키돈산 경로(arachidonic acid pathway)에 포함된다. 트롬복산 A2는 혈관 수축과 혈소판 응집을 유발하여 아테롬성 동맥경화증을 진행시킨다고 알려져 있다. 산화질소는, 아테롬성 동맥경화증을 진행시키는 것으로 여겨지고 있는 혈소판 응집, 단구 접착/화학주성 및 맥관성 평활근 세포의 증식을 방해한다. 코코아 폴리페놀은 LDL 산화를 억제하고, NO/NOS 활성을 강화하며, COX/LOX 활성을 억제하는 것에 의해 상기한 과정에 대한 유익한 효과를 나타내는 것으로 알려져 왔다. 이러한 효과들은예를 들어 WO97/36497로 발행된 국제출원 PCT/US97/05693과 이 출원에 기재된 실시예에 나타나 있다. 코코아 폴리페놀은 아스피린과 같은 비스테로이드성 항염증약물들(non-steroidal anti-inflammatory drugs)의 투여에 의하여 영향을 받는 것으로 알려져 있는 상태를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.
코코아 폴리페놀이 아테롬성 동맥경화증과 CHD의 유발(induction)과 진행에 관련된 많은 경로와 상태에 대해 가지고 있는 유익함에도 불구하고, 이러한 조성물들은 현저하게 콜레스테롤을 저감시키는 효과를 가지고 있지 않은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 적어도 하나의 콜레스테롤 저감제와 함께 폴리페놀을 함유하는 개선된 조성물을 조제하였다. 그 조성물은 이전에 알려져있는 폴리페놀이나 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물과 비교해 볼 때 포유류, 특히 인간의 혈관건강에 대한 향상된 효과를 가지고 있다.
본 발명은 예를 들어 적어도 하나의 콜레스테롤 저감제(lowering agent)와 함께 프로시아니딘과 같은 코코아 폴리페놀 등의 폴리페놀류를 포함하는 조성물과, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)과 심장 혈관 질병(cardiovascular disease)을 치료하고 예방하는 것을 포함하는 혈관 건강을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
도 1은 심장동맥성 심질환(coronary heart disease; CHD)의 진행에 중요한 기여를 하는 요소들을 나타내고, 코코아 폴리페놀이 어떻게 그 질병의 진행을 막는데 기여하는지 나타내는 차트이다.
도 2A-D는 BAECS에서 프로스테노이드와 엔도텔린(endothelin)의 기부내피세포의 합성에 대한 식물화학 물질들(phytochemicals)의 영향을 보여준다(*=p<0.05에서 대조군과 상당히 다름).
도 3A-B는 프로스타시클린과 엔도텔린의 EC방출에서 프로시아니딘에 의해 유도된 변형에 대한 세포 종의 영향을 보여준다.
도 4A-C는 약한 작용물질에 의한 자극이 있는 경우와 없는 경우의 활성화된 GPIIb-IIIa의 혈소판 표면 발현에 대한 코코아음료의 소비에 의한 영향을 나타낸다.
도 5A-C는 약한 작용물질에 의한 자극이 있는 경우와 없는 경우의 활성화된 P-셀렉틴의 혈소판 표면 발현에 대한 코코아 음료의 소비에 의한 영향을 나타낸다.
도 6은 시토스테롤, 코코아 프로시아니딘 및 이들의 조합물이 에피카데킨의 혈장으로의 흡수에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 시토스테롤, 코코아 프로시아니딘 및 이들의 조합물이 DNA에 대한 산화 손상에 미치는 영향을 나타낸다.
도 8은 시토스테롤, 코코아 프로시아니딘 및 이들의 조합물이 지질에 대한 산화 손상에 미치는 영향을 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은 포유류, 특히 인간 또는 수의 동물에 있어 혈관의 건강을 개선하는 조성물과 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 코코아 폴리페놀과 콜레스테롤 저감제를 포함하는 식품, 식품 첨가물, 다이어트 보충제 또는 약제와 같은 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 선택적으로 L-아르기닌을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 콜레스테롤을 감소시키는 과자류, 가장 바람직하게는 콜레스테롤을 감소시키는 초콜릿(예를 들어 흑초콜릿)과 콜레스테롤을 감소시키는 초콜릿을 함유한 과자류에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 또는 수의 동물들과 같은 포유류에 있어 코코아 폴리페놀과 콜레스테롤-저감 화합물, 그리고 선택적으로 L-아르기닌을 포함하는 조성물을 처방함으로써 아테롬성 동맥경화증과 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는 것을 포함하는 혈관건강을 개선하는 방법에 관한 것이다. 또한 코코아 폴리페놀과 동일한 특성을 가지고 있는, 다른 소스로부터 얻어진 폴리페놀들도 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 같은 콜레스테롤 저감제와 함께 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유류에게 피토스테롤 및/또는 피토스타놀과 함께 폴리페놀을 투여하는 것에 의해, 폴리페놀 예를 들어 플라바놀(flavanol) 또는 플라보놀(flavonol)의 흡수를 증대시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 사용되기 위해 제조된 조성물들과 생성물들이 또한 제공된다.
본 출원에 인용된 모든 발명, 특허출원 및 참고문헌들은 인용문헌으로 여기에 모두 포함되어 있다. 서로 일치하지 않는 경우에는 본 명세서의 기재 내용이 우세하다.
본 발명은 콜레스테롤 저감제, 예를 들면, 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 코코아 폴리페놀을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이 조성물은 포유류에 있어서 혈관의 건강을 개선하고 촉진하는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 부가적으로 L-아르기닌, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B 복합체중 어느 하나, 카로티노이드, 구아 검(guar gum) 또는 모노 혹은폴리 불포화 지방산(예를 들어, 오메가-3 지방산)을 포함할 수도 있다. 코코아 폴리페놀의 성질과 동일한 성질을 가지는, 다른 소스에서 얻어진 폴리페놀을 함유한 조성물들도 또한 본 발명의 범위내에서 콜레스테롤 저감제, 예를 들어 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다.
여기에서 사용되는 "코코아 폴리페놀(CP)"은 코코아 열매에 존재하거나 코코아 열매나 코코아 원료로부터 추출한 프로안토시아니딘(proanthocyanidin), 특히 프로시아니딘을 포함하는 폴리페놀류 물질을 의미한다. "프로시아니딘"이라는 용어는 카테킨(catechin)과 에피카테킨(epicatechin)의 모노머와 올리고머를 포함한다. 여기에서 코코아 폴리페놀에 대해 언급된 내용들은 코코아 프로시아니딘에 대하여도 적용된다는 것을 이해하여야만 한다. "코코아 원료"라는 용어는 초콜릿 액(liquor)과, 부분적으로 또는 완전히 탈지된 코코아 고형분들(예를 들어, 케이크나 파우더)과 같이 껍질이 제거된 코코아 열매로부터 유래된 코코아 고형분-함유물질을 의미한다. "콜레스테롤 저감제"라는 용어는 효과적인 양이 투여되었을 때 포유류의 콜레스테롤 수준을 낮추는 효과를 가지고 있는 자연적으로 발견되거나 또는 가공된 화합물, 화합물들의 조합물, 추출물 또는 식물성분을 의미한다. 이러한 콜레스테롤 저감제가 스테롤 또는 스타놀 타입(즉, 유도체와 이성질체 형태를 포함하는)의 화합물 또는 화합물들의 조합물이면, 콜레스테롤 저감제는 "스테놀 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제"로 언급된다. 예를 들어 상기 용어가 "콜레스테롤 저감 흑초콜릿"과 같은 조성물에 대하여 사용될 때, 이것은 그 조성물이 콜레스테롤을 저감시키는 특성을 갖고 있는 것을 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서의 당업자는 본 명세서에서 사용된 "혈관"이라는 단어는 심장까지 포함하는 전체의 혈관계 시스템을 의미하고, "혈관의 건강"은 심혈관 및/또는 관상동맥의 건강을 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. "혈관의 건강 증진"은 본 명세서에 기재된 유익한 건강의 효과를 획득하는 것을 의미한다.
코코아 폴리페놀은 자연적으로 코코아 열매로부터 얻거나 합성하여 제조될 수 있다. 당업자는 유용성과 가격의 측면을 고려하여 천연 또는 합성 코코아 폴리페놀을 선택할 수 있다. 코코아 폴리페놀, 예를 들어 초콜릿중의 초콜릿 원액과 같이 코코아 폴리페놀을 함유하는 코코아 원료로서 조성물에 포함될 수 있으며, 또는 코코아 원료와는 독립적으로 예를 들어 추출물, 추출물 분획, 모여진 추출물 분획들 또는 합성적으로 제조된 화합물로서 첨가될 수도 있다. 코코아 폴리페놀은 코코아 프로시아니딘을 포함하는데, 코코아 프로시아니딘은 에피카테킨과 카테킨의 모노머 및/또는 올리고머일 수 있다. 프로시아니딘 모노머들은 (+)-카테킨,(-)-에피카테킨 그리고 그것들 각각의 에피머(예를 들어, (-)-카테킨과 (+)-에피카테킨)를 포함하고, 다음의 구조를 갖는다:
프로시아니딘 올리고머는 2 내지 18의 모노머 유닛(unit), 바람직하게는 2내지 12, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개의 모노머 유닛을 갖는다. 예를 들어 올리고머는 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머 및 데카머일 수 있다. 올리고머에 있어서, 모노머들은 (4→6) 및/또는 (4→8)의 플라반간 결합(interflavan linkage)을 통하여 연결된다. (4→8)결합만을 갖는 올리고머들은 선형이고; 반면에 최소한 하나의 (4→6)결합이 있다면 분지형 올리고머가 된다.
코코아 폴리페놀은 코코아 열매, 껍질벗긴 코코아 열매, 또는 초콜릿 원액, 부분적으로 탈지된 코코아 고형분들 및/또는 완전히 탈지된 코코아 고형분들과 같은 코코아 원료들로부터의 추출에 의하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물은 완전히 또는 부분적으로 탈지된 코코아 파우더로부터 제조된다. 테오브로마(Theobroma), 헤라니아(Herrania)의 어떤 종 또는 그들의 종간, 종내 교잡종중의 어느 종으로부터의 열매들이 사용될 수 있다. 추출물은 발효되거나, 발효중이거나 또는 발효되지 않은 열매로부터 제조할 수 있는데, 발효된 열매가 코코아 폴리페놀의 양이 가장 적고, 발효되지 않은 열매가 코코아 폴리페놀의 양이 가장 많다. 열매에 대한 선택은 열매의 발효지수에 따라서 이루어질 수 있는데, 예를 들면 추출은 발효지수가 275이거나 그 이하인 열매로부터 이루어질 수 있다. 발효의 정도를 조절하므로써 코코아원료 및 그것의 추출물중의 폴리페놀의 양을 최적화하는 것은 WO98/09533으로 발행된 국제출원번호 PCT/US97/15893에 기술된 바에 따라 이루어질 수 있다. 상기 국제출원중 관련된 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
코코아 폴리페놀은 전통적인 코코아 가공 방법(이는 예로서 산업적인 초콜릿의 제조 및 이용, Beckett, S. T. 著, Blackie Acad. & Professional, 뉴욕, 1997, 의 1, 5 및 6장에 기재되어 있다.) 또는 전통적인 방법에 비하여 코코아 원료들 중에 폴리페놀을(그것들이 파괴되는 것을 방지하여) 보존하는 Kealey등의 미국 특허번호 제 6,015,913호에 기재된 향상된 가공 방법을 사용하여 가공된 코코아 원료들로부터 추출될 수 있다. 향상된 코코아 가공 방법은 전통적인 굽는 단계를 생략하고 있다. 따라서, 다음 단계들에 의하여 얻을 수 있는 코코아 원료들이 사용될 수 있다: (a)껍질벗긴 코코아 열매를 굽는 과정 없이, 코코아 껍질을 느슨하게 하는데 적합한 온도와 시간 동안 코코아 열매를 가열한다; (b)껍질이 벗겨진 코코아 열매를 코코아 껍질과 선별한다; (c)껍질이 벗겨진 코코아 열매를 스크류압축(screw pressing)한다; (d)코코아 버터와 보존된 양의 코코아 폴리페놀을 함유하고 있는 부분적으로 탈지된 코코아 고형분들을 회수한다. 상기 방법은 전통적인 방법에 비하여 고급 프로시아니딘 올리고머를 보다 많이 보유한다. 상기 방법에 의하여 생산되는 코코아 고형분들은 무지방 고형분의 그램당 20,000㎍ 이상, 바람직하게는 25,000㎍/g 이상, 더욱 바람직하게는 28,000㎍/g 이상, 가장 바람직하게는 30,000㎍/g이상의 총 프로시아니딘을 함유할 수 있다. 본 발명의 목적에 따라서 총 프로시아니딘의 양은 실시예 3에서 기재한 바에 따라 결정된다.
코코아 폴리페놀은 폴리페놀이 용해하는 용매를 사용하여 상기에서 언급한 소스로부터 추출될 수 있다. 적합한 용매는 물이나 메탄올, 에탄올, 아세톤, 이소프로필 알코올 및 에틸아세테이트와 같은 유기 용매를 포함한다. 용매의 혼합물들도 또한 사용될 수 있다. 물이 용매로 사용될 때, 이는 예를 들면 아세트산 같은 것으로 약하게 산성화된 것이 바람직하다. 바람직한 용매는 물과 유기용매의 혼합물로, 예를 들면 메탄올, 에탄올 또는 아세톤의 수용액이다. 유기용매 수용액은 예를 들어 약 50%에서 약 95%의 유기용매를 포함할 수 있다. 그래서 물 중의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 유기용매가 사용될 수 있다. 용매는 또한 예를 들어 약 0.5% 내지 1.0% 양의 아세트산과 같은 소량의 산을 포함할 수도 있다. 표현형(즉, 올리고머 프로필)과 프로시아니딘 올리고머의 양과 같은 추출물의 조성은 용매의 선택에 의존한다. 예를 들어, 물에 의한 추출물은 주로 모노머를 함유하고, 에틸아세테이트에 의한 추출물은 모노머와 주로 다이머와 트라이머인 저급 올리고머를 함유하며, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 수용액을 사용한 추출물은 모노머와 고급 범위의 올리고머를 포함한다. 모노머와 고급 프로시아니딘 올리고머를 추출하는데 바람직한 용매중 하나는 70% 아세톤이다. 그러나 폴리페놀을 함유하는 어느 추출물이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 코코아 폴리페놀의 추출 방법은 당분야에 잘 알려져있고, 예로서 Romanczyk 등의 미국특허번호 제 5,554,645호와 WO97/36497로 발행된 국제출원번호 PCT/US97/05693에 기재되어 있다. 한 구체예에서 코코아 추출물은 코코아 열매를 코코아 파우더로 분쇄하고, 파우더를 탈지하고, 코코아 폴리페놀을 추출하고, 추출물을 정제하여 제조된다. 코코아 파우더는 코코아 열매를 냉동건조하고, 냉동건조된 코코아 열매를 탈펄프(depulping)하고 탈피(dehulling)하고, 탈피된 열매를 분쇄하므로써 제조된다.
코코아 폴리페놀 추출물은 예를 들어 카페인 및/또는테오브로민(theobromine)을 제거하므로써 정제될 수 있고, 겔 투과 크로마토그래피 및/또는 고압력 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 더욱더 정제될 수 있다. 겔 투과 크로마토그래피(예를 들면, Sephadex LH-20)는 고급 프로시아니딘 올리고머의 추출물을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 모노머와 저급 올리고머를 함유한 용출물은 선택되는 올리고머가 컬럼에서 용출되기 시작할 때까지 수집하지 않을 수 있다. 이러한 추출의 예는 당분야에 공지되어 있고, WO97/36497로 발행된 국제출원번호 PCT/US97/05693의 실시예 5에 설명되어 있으며, 관련된 부분은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 예비적인 HPLC, 예를 들면 정상상(normal phase) HPLC를 이용하여 추출물이 분류된다. 예를 들어 최소한 50중량%의 모노머 또는 특정 올리고머(들)을 함유하는 모노머 분획과 올리고머 분획들로 분류된다. 분획들이 모노머와 저급 올리고머(테트라머를 포함하거나 그보다 저급의 올리고머)를 포함하는 경우, 그 분획들은 약 90 내지 95중량%의 특정 올리고머 분획을 포함한다. 분리 후에, 예를 들어 올리고머 3~10 또는 5~10을 함유하는 선택된 올리고머의 조합을 얻기 위하여 원하는 분획들을 모을 수 있다. 당업자는 본 명세서, 당분야의 일반적인 지식, 그리고 예를 들어 Romanczyk 등의 미국특허번호 제 5,554,645호와 WO97/36497로 발행된 국제출원번호 PCT/US97/05693의 기재 내용의 관점에서 원하는 프로시아니딘 프로필을 얻기 위하여 크로마토그래피의 조건들을 조작할 수 있다.
또한 코코아 폴리페놀은 본 발명에 따른 조성물 중에, 폴리페놀을 함유하는 코코아 원료들의 형태로 제공되거나 또는 밀크초콜릿, 달콤한 초콜릿 및 달지 않은 초콜릿, 바람직하게는 흑 초콜릿과 저지방 초콜릿과 같은 초콜릿을 포함시키므로써제공될 수 있다. 코코아 원료들은 전통적인 코코아 가공공정에 의하여 제조될 수 있는데, Kealey등의 미국특허번호 제 6,015,913호에 개시된 방법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 코코아 폴리페놀의 함량을 증가시키기 위하여, 275 이하의 발효지수를 갖는 코코아 열매로부터 제조된 초콜릿 원액과 코코아 고형분들이 사용될 수 있다. 이러한 원료들은 전통적인 코코아 가공 방법과 완전히 발효된 열매들을 사용하여 얻을 수 있는 것보다 높은 코코아 폴리페놀 함량을 가지고 있다. 초콜릿은 상기에서 기술한 원료들로부터 통상적인 기술들을 사용하거나 WO99/45788로 발행된 국제출원번호 PCT/US99/05414(관련된 부분은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다)에서 설명한 것처럼 초콜릿을 제조하는 동안 코코아 폴리페놀을 보존하기 위한 개선된 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 다음의 비전통적인 방법들 중 적어도 하나에 의하여 제조된 초콜릿은 여기에서 "보존량의 코코아 폴리페놀을 갖는 초콜릿"이라고 표시한다:(i)발효중이거나 발효되지 않은 코코아 열매로부터 코코아 원료들을 제조한다; (ii)코코아 원료 제조공정 동안에 코코아 폴리페놀을 보존한다; (iii) 초콜릿 제조공정 동안에 코코아 폴리페놀을 보존한다.
또한 합성 프로시아니딘도 사용될 수 있고, 이들은 당분야에 공지된 방법들과, WO99/19319로 발행된 국제출원번호 PCT/US98/21392(관련된 부분은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다)의 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의하여 제조될 수 있다. 코코아 폴리페놀 유도체들도 또한 유용하다. 이것들은 갈레이트화 모노머와 올리고머, 글리코실화 모노머와 올리고머, 그리고 이들의 혼합물; 설페이트화된 형태, 글루코로니데이트화된 형태, 및 메틸화된 형태와 같은 프로시아니딘 모노머와올리고머의 대사산물; 그리고 콜로니성 미생물총 대사 또는 포유동물의 내부 대사에 의하여 생성된 프로시아니딘의 효소분할산물들을 포함한다. 유도체들은 천연적인 근원으로부터 제조되거나 합성에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 콜레스테롤 저감제를 더 포함한다. 어떤 콜레스테롤 저감제라도 그 작용방식에 상관없이 사용될 수 있다. 적합한 제제는 포유류의 담즙에서 콜레스테롤의 흡수를 감소시키거나 콜레스테롤 합성을 감소시킴으로써 작용할 수 있다. 적합한 제제의 예는 피토스테롤, 피토스타놀 및 그 유도체들과 이성질체들; 콩 단백질; 가용성 섬유류, 예를 들어 귀리, 사일륨(psyllium), 견과류, 쌀겨유로부터 유래된 베타 글루칸 등이며; 이들은 특히 식품, 다이어트 보조제 및 식품 첨가 조성물에 사용하기에 적합한 것들이다. 알려져있는 콜레스테롤 저감 약품들이 또한 사용될 수 있지만, 식품과 식품 첨가 조성물에 사용하기에는 적합하지 않으며, 약제에는 사용될 수 있다. 당업자들에게 있어서, 콜레스테롤 저감제의 선택은 의도하는 전달 수단(예를 들어 식품, 보조제, 약제)과 투여방식에 따른다는 것은 자명한 것이다. 담즙에서 콜레스테롤의 흡수를 감소시키는 제제는 정맥내 투여용으로는 적합하지 않을 것이다. 유사하게, 전달 수단이 식품이라면, 바람직하지 않은 강한 약 맛이나 약 냄새를 가지고 있는 콜레스테롤 저감제는 적합하지 않다.
피토스테롤은 물에 녹지 않는 식물성 스테롤이고, 분자량과 구조가 콜레스테롤과 유사하다. 피토스테롤은 담즙에서 콜레스테롤의 흡수(내인성 콜레스테롤과 식사에 의한 콜레스테롤 모두 해당)를 감소시킬 뿐 아니라 혈청 콜레스테롤의 흡수없이 혈청 콜레스테롤의 농도(총농도 및 LDL)를 감소시킨다. 40개 이상의 식물성 스테롤들이 동정되어 왔지만 베타-시토스테롤, 켐페스테롤 및 스티그마스테롤이 가장 풍부하다. 다른 유용한 스테롤들의 예는 브라시케스테롤, 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤이 있다. 천연적인 소스에서 동정하였거나 합성한, 개별적인 스테롤이나 스테롤 혼합물, 그것들의 이성질체나 유도체들이 사용될 수 있다. 특히 유용한 것은 스타놀로 알려져 있는 스테롤의 포화유도체들로서, 이들은 고리에 있는 모든 탄소결합이 포화되어 있다. 적합한 스타놀은 28개 또는 29개의 탄소원자들을 가지고 있고, 베타-시토스타놀, 클리오나스타놀, 22,23-디하이드로브라시카스타놀과 켐페스타놀을 포함한다. 피토스테롤은 고체(예를 들어, 파우더나 입자)이거나 액체(예를 들어, 오일)의 형태일 수 있다.
스테롤과 스타놀은 국제출원번호 PCT/EP96/02344의 실시예에서 설명한 것과 같은 여러 가지 식물 물질들에서 발견된다. 예를 들어 스테롤과 스타놀의 원료는 소나무 껍질, 대두유, 톨유, 대나무싹 추출물(WO98/57545로 발행된 국제출원번호 PCT/US98/12556에 설명되어 있다), 코코아 껍질들과 오일, 그리고 쌀겨유이다. 펄프와 종이산업의 부산물인 톨유는 스타놀 즉, 베타-스타놀의 좋은 공급원이다.
식물성 스테롤은 식물유, 식물유 슬러지, 식물유 증류액, 그리고 톨유와 같은 비교적 간단하고 저렴한 수단에 의해 얻어지는 다른 식물유 공급원과 같은 천연 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 용매로서 메탄올을 사용하여 식물유 슬러지로부터 스테롤을 제조하는 것이 Hamunen의 미국특허번호 제 4,420,427호에 설명되어 있다. 스타놀은 자연에서 적은 양만 발견되지만, 당업자에게 알려진 여러 방법들중 어떤 것을 사용하여 스테롤을 수소화 하므로써 스테롤로부터 쉽게 제조할수 있다. 스테롤 출발물질이 식물 물질로부터 제조되면, 이는 몇가지 다른 스테롤들의 혼합물을 함유할 것이고, 따라서 수소화 후, 결과 스타놀 또한 다양한 스타놀들의 혼합물이 될 것이다. 그 혼합물은 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 그러나, 순수한 특정 스테롤 제조물들이 이용 가능한 순수 스타놀을 생성하기 위해서 수소화될 수도 있다.
코코아 껍질로부터 추출한 코코아 오일은 피토스테롤의 좋은 공급원이다. 코코아 피토스테롤은 유리되거나 결합된 스테롤들의 혼합물인데, 존재하는 피토스테롤의 약 90%까지가 유리 스테롤에 해당한다. 피토스테롤은 켐페스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 시클로알테노일, 24-메틸렌 시클로알테노일 뿐 아니라 소량의 다른 피토스테롤을 포함한다. 결합된 피토스테롤은 지방산 에스테르나 피토스테롤의 페룰레이트(ferulate) 유도체들을 포함한다. 코코아 오일은 또한 토콜을 포함하는데, 이는 토코페롤(이는 항산화성질을 갖고 있다.)과 토코트리에놀(이는 콜레스테롤 저감 활성을 갖는다.)을 포함한다. 코코아 오일은 다음 단계들을 포함하는 공정에 의하여 제조된다. (i)코코아 껍질을 분쇄한다; (ii) 분쇄된 코코아 껍질을 피토스테롤에 대한 용매로 추출한다; (iii)용매를 제거한다; (iv)코코아 오일을 회수한다. 코코아 열매를 굽는 과정에서 생성되는 부산물인 코코아 껍질은 건조된 발효 코코아 열매, 미분화된 코코아 열매, 구운 코코아 열매 및 바람직하게는 가장 많은 총 스테롤 양을 갖는 건조된 미발효 열매로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 코코아 열매는 테오브로마 카카오(Theobroma cacao)이다. 바람직한 용매는 석유 에테르, 헥산, 펜탄 및 에틸에테르이다. 용매는 진공증류에 의하여 회수될 수 있다. 한구체예에서 냉동건조된 껍질은 Tekmar Mill(신시내티, 오하이오)에 의해 미세한 파우더로 분쇄되고, 분쇄물은 밤새도록 Soxtec장치로(Fisher Scientific, 스프링필드, 뉴저지)를 이용하여 재증류된 석유 에테르(b.p. 38~39.6℃)로 추출한다. 다음날 아침에 용매는 질소 스트림 하에서 천천히 증발시켜서 조심스럽게 제거하고, 결과로 생긴 추출물은 -40℃에서 저장된다. 그리고 나서 피토스테롤은 예비적인 HPLC나 칼럼 크로마토그래피로 정제될 수 있다.
스테롤과 스타놀의 에스테르화한 형태가 또한 사용될 수 있다. 에스테르화는 스테롤/스타놀이 지방이나 오일에 좀 더 가용성이 되도록 만드는데, 이것은 어떤 경우에서 이것들이 식품이나 다른 전달 수단에 쉽게 혼합될 수 있도록 한다. 예를 들면, 스테롤은 지방산 에스테르에 의하여 에스테르화될 수 있다. 이렇게 에스테르화된 스테롤의 예들은 시토스테롤아세테이트, 시토스테롤올레산염 및 스티그마스테롤올레산염을 포함한다. 스타놀에스테르는 당분야의 공지기술과, 예를 들어 van Amerongen 등의 미국특허번호 제 6,031,118호, Higgins의 미국특허번호 제 5,892,068호, Miettenent 등의 미국특허번호 제 5,502,045호 및 국제출원번호 PCT/CA99/00655(WO00/04887로 발행된)에 개시된 대로 제조할 수 있다. 한 구체예에서, 유용한 스타놀 에스테르는 Miettenen등의 미국특허번호 제 5,958,913호에 설명된 것과 같이 최소한 하나의 스테롤을 C2내지 C22의 지방산에스테르로 에스테르화하여 제조한다. 당분야에서 알려진 다른 방법들은 포유류에 투여되었을 때 스테롤/스타놀의 용해성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 하나의 방법은 Ostlund의 미국특허번호 제 5,932,562호에 설명되어 있는데, 여기에서는 수용성 파우더를 얻기 위해 스테롤/스타놀과 레시틴을 혼합한다.
스테롤/스타놀은 다른 재료들과 혼합되는 것에 의해 파우더 형태로 조성물에 첨가될 수 있다. 식품 조성물의 경우에, 스테놀/스타놀은 다른 콜레스테롤 저감제와 함께 혼합단계에서 편리하게 첨가된다. 콜레스테롤 저감 초콜릿을 제조하는 동안, 예를 들어 스테롤/스타놀은 설탕, 녹은 버터; 갈기 전의 껍질 벗긴 열매; 또는 덜 바람직하게는 녹은 초콜릿을 함유하는 건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 혼합을 촉진시키기 위해, 먼저 스테롤/스타놀을 지방, 식물유, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 토코페롤 및 이들의 혼합물과 같은 용해 조제에 용해시킬 수 있다. 스테롤/스타놀의 현탁액과 에멀젼을 만들기 위한 효과적인 운반체는 물, 알코올, 폴리올, 다른 식용 가능한 화합물들로서, 예를 들어 스테롤/스타놀이 적어도 부분적으로 용해되는 초콜릿 원액 및 이들의 혼합물이다.
콩단백질은 알려진 어떤 형태로 조성물에 첨가될 수 있는데, 예를 들면, 콩단백질 분리물, 콩단백질 농축물, 콩단백질로 만든 인조육 또는 콩분말, 콩플레이크 및 콩조분말(grits)형태일 수 있다. 이것들의 모든 입자나 단편들은 예를 들어 실시예 5에 기재된 대로 사용될 수 있다. 다양한 형태의 콩단백질이 당분야에 잘 알려져있고, 상업적으로 구입이 가능하다. 그것들의 특성들과 수득하는 방법들이 예를 들어 '콩 단백질과 인간의 영양, Wilcke 등 著, Acad. Press, 뉴욕, 1979'에 설명되어 있다. 콩단백질은 어떤 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 사용될 수 있다.
베타-글루칸같은 가용성 식물섬유는 혈장의 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 섬유는 어떤 베타-글루칸의 공급원, 바람직하게는 귀리 입자와 귀리겨 같은 공급원으로부터 얻을 수 있다. 섬유는 당분야에 알려진 방법에 따라서 제조되어, 조성물에 첨가될 수 있다. 이것들은 특히 식품과 다이어트 보조제와 같이 경구용의 조성물에 적합하다. 베타-글루칸과 다른 가용성 식물섬유는 스테롤/스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 L-아르기닌을 포함할 수 있는데, 이는 본 발명의 조성물에 여러 가지 형태, 예를 들어, 정제된 화합물, L-아르기닌을 함유하는 식물의 추출물 또는 씨/열매 재료의 형태, 예를 들어 열매분말이나 전체 씨/열매의 형태로 제공될 수 있다. 합성이건, 천연이건 어떤 L-아르기닌 공급원도 사용 가능하다. 바람직한 L-아르기닌 공급원은 콩과, 피넛, 월넛, 아몬드 및 헤즐넛과 같은 견과류의 알맹이이다. 탈지된 견과류 알맹이 및 부분적으로 탈지된 견과류 알맹이가 사용될 수 있다. 이것들은 분쇄될 수 있으며, 이 경우 열매분말이라고 칭해진다.
조성물은 또한 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체중의 어느것, 카로티노이드, 구아검 또는 당분야에 알려진 방법에 따라 얻어질 수 있는 모노 또는 폴리 포화지방산(예를 들어, 오메가-3지방산)을 포함할 수 있다. 이 모노 또는 폴리 불포화지방산은 올리브오일, 생선유 또는 견과열매의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 사용에 적합한 견과열매의 예는 피넛, 아몬드 및 월넛이다.
다음 성질중 적어도 하나를 갖는 폴리페놀과 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물도 본 발명의 범위에 속하는 것이다:혈관긴장저하의 유도, COX 활성의 억제,LOX 활성의 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성의 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 세포 증식의 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화성 스트레스의 조절. 예를 들어 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 같은 모든 종류의 콜레스테롤 저감제가 사용될 수 있다. 이런 조성물에서, 스테롤 및/또는 스테놀에 기초한 콜레스테롤 저감제는 폴리페놀의 생체이용율(bioavailability)을 증가시킨다. 이러한 폴리페놀의 예는 플라바놀(예를 들어 카테킨, 에피카테킨 및 이들의 갈레이트화 유도체), 플라보놀(예를 들어 케르세틴, 켐프세롤, 미리세틴 및 이들의 글리코실화 유도체) 및 프로시아니딘(예를 들어 코코아로부터 얻은 프로시아니딘 다이머)이다.
본 발명의 조성물은 식품, 식품 첨가물, 다이어트 보조제 또는 약제로서 유용하다. 본 발명의 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 의도된 용도에 따라서, 담체, 희석제 또는 부형제가 인간이나 수의동물에의 사용, 식품, 첨가물, 보조제 또는 약제적 사용에 적합하도록 선택될 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "식품"은 주로 단백질, 탄수화물 및/또는 지방으로 구성된 물질로, 몸의 장기들의 성장, 회복 및 생명과정을 유지하고, 에너지를 공급하는데 사용된다. 식품들은 또한 미네랄, 비타민 및 양념과 같은 보충적인 물질들을 포함할 수 있다. 메리암의 웹스터 대학생 사전, 10번째 판, 1993,을 보면, 식품이라는 용어는 인간과 동물의 소화에 적합한 음료수도 포함한다. 여기에서 사용되는 "식품 첨가물"은 21 C.F.R. 170.3(e)(1)에서 FDA에 의하여 정의되어 있으며, 직접적인 첨가물과 간접적인 첨가물을 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "약제"는 의료적인 약을 의미한다. 메리암의 웹스터 대학생 사전, 10번째 판, 1993 참고. 약제는 또한 의약이라고도 언급된다. 여기에서 사용되는 용어 "다이어트 보조제"는 다음의 다이어트 원료들을 하나 또는 그 이상 포함하는 다이어트 보조를 위한 생성물(담배는 제외)이다: 비타민, 미네랄, 허브 또는 다른 식물성 물질, 아미노산, 인간의 총 일일 섭취량을 증가시켜서 다이어트를 보조하도록 사용되는 다이어트 물질, 또는 농축물, 대사산물, 구성물, 추출물 또는 이들 원료의 조합.
코코아 폴리페놀 또는 이들의 유도체와 같은 폴리페놀과 함께, 그리고 선택적으로 L-아르기닌, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체중의 어느 것, 카로티노이드, 구아 검, 및/또는 모노 혹은 폴리 불포화지방산(예를 들어, 오메가-3)과 함께 콜레스테롤 저감제에 의해 개선된 음료를 포함한 모든 통상적인 식품은 본 발명의 범위에 포함된다.
코코아 폴리페놀에 있어서, (i)코코아 폴리페놀 또는 이들의 유도체를 코코아 폴리페놀을 함유하지 않은 식품에 첨가하거나, 또는 (ii)예를 들어, 초콜릿과 같이 원래 코코아 폴리페놀을 포함하는 식품의 경우에는, 전형적으로 제조된 식품에서 발견되는 것 보다 폴리페놀의 농도를 증가시키는 것에 의하여 개선이 이루어진다. 증진(enhancement)은 예를 들어 추출물의 형태인 부가적인 코코아 폴리페놀을 첨가하는 것; 코코아 폴리페놀을 다른 폴리페놀 함유 재료(예, 땅콩 껍질)와 함께 첨가하는 것; 상기에서 설명하였듯이 식품 생산 공정에 사용되는 코코아 원료들에 있어서 코코아 폴리페놀을 보존하도록 하기 위해 코코아 원료 가공과 코코아 열매의 선택을 조절하는 것; 또는 상기에서 설명한 초콜릿 제조공정을 조절하는 것에의하여 이루어진다. 그리하여, 이러한 식품(음료를 포함하여)은 통상적인 식품(음료수를 포함한다)과 비교하여 "증가된 폴리페놀"(코코아 프로시아니딘을 포함한다)을 함유한다. 초콜릿 제조자가 코코아 폴리페놀을 포함하는 코코아 추출물을 기존의 상업적으로 구입가능한 제품에 추가하면 증가된 폴리페놀을 갖는 초콜릿이 얻어지게 된다. 그러한 식품은 전형적인 대응 식품들에 비하여 높은 농도의 폴리페놀을 함유하는 식품으로서 "높은 코코아 폴리페놀 식품"으로도 언급될 수 있다.
코코아 폴리페놀과 적어도 하나의 콜레스테롤 저감제(예로서 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제), 그리고 선택적으로 L-아르기닌, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체중의 어느 것, 카로티노이드, 구아 검, 또는 모노 혹은 폴리 불포화지방산(예로서 오메가-3)을 포함하는 식품은 인간 또는 애완동물의 먹이 용도도 포함하여 수의동물의 사용에 적합할 수 있다. 식품은 과자류 이외의 식품일 수 있지만, 바람직한 콜레스테롤 저감 식품은, 밀크초콜릿, 흑초콜릿을 포함하여 단 초콜릿과 지나치게 달지 않은 초콜릿, 저지방 초콜릿 및 초콜릿으로 피복된 캔디 등의 캔디와 같은 동일성 기준(SOI) 또는 비동일성 기준의 초콜릿 같은 과자류일 수 있다. 다른 실시예들은 구운 식품들(예로서, 브라우니, 구운 스낵, 쿠키, 비스킷), 양념, 그라놀라 바(granola bar), 토피 츄(toffee chew), 식사 대용 바, 잼, 시럽, 음료 파우더 믹스, 코코아 또는 초콜릿향 음료, 푸딩, 쌀 케이크, 쌀 믹스, 세이버리 소스(savory sauce)등을 포함한다. 만약 원한다면, 그 식품들은 초콜릿 향 또는 코코아 향이 날 수 있다. 코코아 폴리페놀과 콜레스테롤 저감제와 더불어 L-아르기닌을 함유하는 식품은 바람직하게는, 예를 들어피넛, 월넛, 아몬드 및 헤즐넛등의 견과류열매를 함유하는 초콜릿과 그라놀라 바와 같은 캔디바이다. 여기에서 설명한 것처럼 껍질이 있는 견과류 열매를 식품에 첨가하면, 예로서 땅콩 껍질에는 약 17%, 아몬드 껍질에는 약 30%의 프로시아니딘이 함유되어 있기 때문에 총 폴리페놀 함량이 증가할 수 있다. 한 구체예에서는 견과류 열매 껍질을 콜레스테롤 저감제를 포함하는 초콜릿 캔디의 누가(nougat)에 부가한다.
바람직한 구체예에 있어서, 콜레스테롤 저감제를 포함하는 비-초콜릿계(non-chocolate) 식품은 코코아 프로시아니딘을 적어도 약 5㎍/g에서 약 10㎎/g, 예를 들어 적어도 5㎍/g, 바람직하게는 적어도 10㎍/g, 더욱 바람직하게는 적어도 100㎍/g을 포함한다. 원한다면 비-초콜릿계 식품들은 아래에 기술한 초콜릿 식품들에서 발견되는 것 보다 더 높은 수준의 코코아 프로시아니딘을 함유할 수 있다.
특히 바람직한 식품은 콜레스테롤을 저감시키는 초콜릿 과자류이고, 가장 바람직한 것은 흑초콜릿이다. 어떤 구체예에서, 초콜릿은 제품중의 무지방 코코아 고형분의 전체 양을 기준으로, 초콜릿 단위 그램당 적어도 3,600㎍, 바람직하게는 적어도 4,000㎍, 바람직하게는 적어도 4,500㎍, 더욱 바람직하게는 적어도 5,000㎍, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 5,500㎍의 코코아 프로시아니딘을 포함한다. 다른 구체예에서, 초콜릿은 제품중의 무지방 코코아 고형분의 전체 양을 기준으로, 단위 그램당 적어도 6,000㎍, 바람직하게는 적어도 6,500㎍, 더욱 바람직하게는 적어도 7,000㎍, 가장 바람직하게는 적어도 8,000㎍, 그리고 더욱 바람직하게는 10,000㎍의 코코아 프로시아니딘을 함유한다.
콜레스테롤 저감 밀크초콜릿 과자류는 밀크초콜릿중의 무지방 코코아 고형분의 총량을 기준으로, 단위 그램당 프로시아니딘을 적어도 1,000㎍, 바람직하게는 적어도 1,250㎍, 보다 바람직하게는 적어도 1,500㎍, 가장 바람직하게는 적어도 2,000㎍을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 밀크초콜릿은 밀크초콜릿중의 무지방 코코아 고형분의 총량을 기준으로, 단위 그램당 적어도 2,500㎍, 바람직하게는 적어도 3,000㎍, 더욱 바람직하게는 적어도 4,000㎍, 가장 바람직하게는 적어도 5,000㎍의 코코아 프로시아니딘을 함유한다.
식품에서 L-아르기닌의 양은 다양할 수 있다. 전형적으로 코코아는 부분적으로 탈지된 코코아 고형분의 100g당 1~1.1g의 L-아르기닌을 함유한다. 코코아 100g당 0.8~1.5g까지의 범위일 수 있다. 본 발명의 초콜릿 식품은 코코아 원료에서 천연적으로 얻을 수 있는 것보다 많은 양의 L-아르기닌을 함유한다. 본 발명의 식품에 사용된 코코아 원료와 L-아르기닌의 양을 알기 위해, 당업자는 최종제품에서의 L-아르기닌의 총량을 쉽게 측정할 수 있다. 본 발명의 식품은 일반적으로 적어도 5㎍/g, 바람직하게는 적어도 30㎍/g, 또는 적어도 60㎍/g, 더욱 바람직하게는 적어도 200㎍/g의 L-아르기닌을 포함한다.
본 발명의 식품에서 콜레스테롤 저감제의 양은 사용되는 제제의 타입에 의존하며, 당업자는 본 명세서의 지침, 특히 아래에 제공된 일일 투여량 및 당분야의 지식에 따라 그 양을 결정할 수 있다. 식품 조성물은 예를 들어 한번에 45g을 먹을 때 약 0.5~10g, 바람직하게는 45g을 먹을 때 약 1.5~5g, 가장 바람직하게는 45g을 먹을 때 약 2~4.5g의 스테롤/스타놀을 포함할 수 있다. 콩 단백질과 귀리로부터의가용성 섬유에 관하여, FDA는 건강을 위한 요구량을 만족시킬 수 있도록 하는 식품 1회 공급분(food serving)당 최소량을 제공하고 있다. FDA에 따르면, 베타-글루칸을 포함하는 식품 1회 공급분은 최소한 0.75g을 포함하여야 하고, 콩 단백질을 포함하는 식품 1회 공급분은 최소한 6.25g의 콩 단백질을 포함하여야 한다. 이러한 값들은 식품에 있어서 콜레스테롤 저감제의 양을 결정하는 기준으로서 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 콜레스테롤 저감제와 코코아 폴리페놀의 일일 유효량이 1회 공급으로 제공된다. 따라서, 콜레스테롤 저감 과자(예, 초콜릿)는 1회 공급당 스테롤/스타놀을 적어도 1.5g(예, 1.5~4.5g), 코코아 프로시아니딘을 1회 공급당 적어도 약 100mg(예, 150~200mg, 200~400mg)을 함유한다.
여기에서 언급한 특성들을 갖는 폴리페놀(예, 코코아 폴리페놀들 또는 이들의 유도체)과 콜레스테롤 저감제와 선택적으로 L-아르기닌을 함께 함유하는 약제는 경구투여, 구강투여, 경비투여, 직장투여, 정맥투여, 비경구투여 및 국소투여 등의 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자는 투여 방식에 따라 적합한 콜레스테롤 저감제를 결정할 수 있다. 따라서, 각 투여방식의 유형에 적합한 투약의 형태는 본 발명의 범위 내이고, 정제, 캡슐, 젤라틴 캡슐(젤캡), 입자 또는 파우더의 팽창약 또는 단위투여제, 에멀젼, 현탁액, 연고, 크림, 젤, 거품 또는 젤리와 같은 고체, 액체 또는 반고체의 투약 형태를 포함한다. 서방성(Sustained-release) 투약 형태 또한 본 발명의 범위 내이고, 이는 관련 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국특허번호 제 5,024,843호; 제 5,091,190호; 제 5,082,668호; 제4,612,008호 및 제 4,327,725호에 기술된 대로 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 적절한 담체, 희석제 및 부형제들은 일반적으로 당 분야에 알려져있고, 당업자는 쉽게 이를 결정할 수 있다. 예를 들어 정제는 효과적인 양의 코코아 폴리페놀 함유 조성물과, 선택적으로 소르비톨, 락토오스, 셀룰로오스 또는 이칼슘인산염과 같은 담체를 포함할 수 있다. 코코아 폴리페놀, 적어도 하나의 콜레스테롤 저감제 및 선택적으로 L-아르기닌을 함유하는 다이어트 보조제는 당 분야에 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 이칼슘인산염, 마그네슘스테아레이트, 칼슘니트레이트, 비타민 및 미네랄과 같은 영양물질을 포함할 수 있다.
또한, 식품, 다이어트 보조제 또는 약제 및 (i)폴리페놀들 및/또는 이들의 유도체의 존재 또는 증가된 함량과 (ii) 콜레스테롤 저감제의 존재를 표시하는 라벨을 포함하는 포장물품도 본 발명의 범위에 속한다. 선택적으로 라벨은 L-아르기닌의 함유량, 조합된 폴리페놀(들), 콜레스테롤 저감제(들) 및 선택적으로 L-아르기닌의 유용한 특성 및 사용방법을 표시할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 유용한 특성들은 혈장 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및 LDL콜레스테롤을 저감시키는 것, COX 활성을 억제하는 것(COX1 활성을 포함한다), LOX 활성을 억제하는 것, 산화질소의 생성을 증가시키는 것, 죽종형성성(atherogenic)인자(즉, 아이코사노이드와 엔도텔린(endothelin) 생성물)에 대한 죽종증식방지성(atherostatic)인자의 비를 증가시키는 것 및 LDL의 산화를 억제하는 것을 포함하는데, 이것들은 차례대로, 개별적으로 또는 조합하여서, 혈관수축과 혈소판 응집을 감소시키고, 단구 접착을 억제하며, 맥관성 평활근의 과도한 증식을 억제하고, 혈전증을 감소시키며, 혈압을낮추는 것을 도와서 아테롬성 동맥경화증과 심혈관 질병과 같은 혈관과 심혈관계 질병과 관련된 위험을 감소시킨다.
또한 본 발명의 범위 내에는, (i) 다음과 같은 특성들 중에서 적어도 하나를 갖는 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 같은 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물: 혈관긴장저하 유도, COX 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성의 증가, NO의 수준의 증가, 혈소판응집 억제, 단구 접착 억제, 맥관성 평활근의 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소, 산화적 스트레스 완화; 그리고 (ii) 혈관 건강(심혈관건강이란 용어도 사용된다)의 증진 및/또는 심장 질환의 위험을 감소시키기 위한 조성물에 사용되기 위한 라벨 및/또는 지시서들을 포함하는 포장물품도 포함된다. 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제가 사용될 때, 라벨이나 지시서는 그 조성물이 폴리페놀의 흡수를 증가 또는 촉진시키는 것을 언급할 수 있다. 라벨 및/또는 지시서는 또한 상기에서 언급한 유용한 특성들을 나타낼 수 있다. 이런 특성들은 혈장 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤을 감소시키고, COX 활성을 억제하며, LOX 활성을 억제하고, 산화질소 생성을 증가시키며 죽종 형성성인자(즉, 아이코사노이드와 엔도텔린(endothelin) 생성물)에 대한 죽종증식 방지성 인자의 비를 증가시키는 것 및 LDL의 산화를 억제하는 것을 포함하는데, 이것들은 차례대로, 개별적으로 또는 조합하여서, 혈관수축과 혈소판응집을 감소시키고, 단구 접착을 억제하고, 맥관성 평활근의 과도한 증식을 억제하며, 혈전증을 감소시키고, 혈압을 낮추는 것을 도와서 아테롬성 동맥경화증과 심혈관의 질병과 같은 혈관과 심혈관계 질병과 관련된위험을 감소시키게 된다.
또한 본 발명의 범위 내에는, COX 활성, LOX 활성, NO 생성, NOS 활성, LDL의 산화 및 혈장 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 증가와 관련되거나 또는 이것들에 의하여 조절되는 질병 및/또는 상태들을 치료하거나 예방하는 방법들이 포함된다. 여기에서 사용된 것처럼, "치료"는 질병이나 그에 관련된 징후의 병리에 영향을 미쳐서, 예를 들어 고혈압 또는 아테롬성 동맥경화증과 같은 존재하는 의료적 상태를 개선하는 것을 의미한다. "예방"이라는 용어의 의미는 질병의 발생을 감소시키는 것을 포함하여 질병의 진행과 관련된 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예방 또는 예방법은 질병의 진행 위험이 높은 것으로 알려진 개인들 또는 예를 들어 혈관건강을 유지하는 것과 같은 건강 유지를 위해 일반 대중에게 사용될 수 있다. 이 방법들은 인간 또는 개, 고양이, 말과 같은 수의 동물들에 사용될 수 있다.
COX 활성, LOX 활성, NO 생산성, NOS 활성, LDL의 산화 및/또는 높은 콜레스테롤들과 관련되어 있거나 이것들에 의하여 조절되는 질병 및/또는 상태들은 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 관상동맥성심질환(CHD), 뇌혈관질환, 심장발작, 협심증, 말초혈관질환 및 신장 질환을 포함한다. 또한 고콜레스테롤혈증(경콜레스테롤혈증을 포함한다)의 치료 또는 예방, 혈관긴장저하 유도, COX(COX1을 포함)와 LOX의 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS의 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 억제, 맥관성 평활근의 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 완화를 위한 방법들이 포함된다.
본 발명의 방법은 포유류, 바람직하게는 인간 또는 수의 동물에게, 코코아 폴리페놀, 콜레스테롤 저감제 및 선택적으로 L-아르기닌을 포함하는 조성물을 치료, 예방 또는 콜레스테롤 저하뿐 아니라 상기의 유용한 효과들중 적어도 하나를 얻기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 혈장의 콜레스테롤 수준을 측정하는 것과 같은 방법에 의해 치료의 효과를 측정하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 건강한 포유류에게 예방 목적으로 투여하거나 또는 치료가 필요하거나 관련된 위험 요소들중 적어도 하나를 가지고 있는 포유류에게 투여될 수 있다. 혈관건강에 관련된 위험 요소들중 적어도 하나를 가지고 있는 개인들도 여기에 기술된 조성물을 투여받아야 하는 대상이 된다. 콜레스테롤 수치가 높은 가족력(familial history)을 가진 개인들, 폐경전·후의 여성들, 심근허혈 손상을 가진 폐경후의 여성들, 수술이나 화학적으로 에스트로겐이 부족해진 여성들, 노인들, 고혈당증, 당뇨병, 고혈압, 당뇨병이 있는 사람들 및 담배를 피는 사람들은 병에 걸리기 쉬운 사람들로, 여기에 기술한 치료가 필요한 사람들이다. 혈관건강의 문제가 진행되기 쉬운 다른 포유류 개체군들은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법은 혈관재협착(restenosis)을 치료하거나 예방하는데 특히 유용하다. 매년 미국에서 330,000의 환자들이 관상 및/또는 말초혈관성형술을 받는데, 이는 예를 들어 아테롬성 동맥경화성 플라크들로 막힌 관상동맥을 정상적인 혈류속도로 회복시키기 위해 혈관을 벌리도록 고안되어 있는 과정이다. 그러나 거의 33%의 환자들이 혈관재협착이 된다. 즉, 치료받은 혈관이 곧바로 다시 막혀 버린다. 이러한 환자들은 개선되지 않으며, 때때로 혈관성형술을 받기 전보다 더 악화된다. 혈관벽에서의 평활근 세포들(SMCs)의 과도한 증식이 혈관재협착을 유발한다. 따라서 코코아 폴리페놀 및 콜레스테롤 저감제(그리고 선택적으로 L-아르기닌)를 포함하는 본 발명의 조성물이 혈관성형술 전이나 직후에 숙련된 의사의 결정으로 투여될 수 있다.
개, 고양이 및 말과 같은 수의동물에게 상기에 설명한 조성물을 심부전, 판상변성(valvular degeneration) 및 만성신부전(chronic renal failure)을 치료하거나 예방하기 위하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 개에게 다음의 상태들을 억제하기 위해 투여될 수 있다: 만성 판질환(심방심실판막의 내심증(endocardiosis) 또는 점액종양 변성(myxomatous degeneration)), 확장된 심근병증, 심막질병, 심내막염, 일차성 부정맥 및 심장사상충.
인간이나 수의동물(예로서 애완동물)의 혈액으로 폴리페놀이 흡수되는 것을 증가시키는 방법도 제공된다. 그 방법은 본질적으로 인간 또는 동물의 건강에 유익한 폴리페놀의 생체이용율을 증가시키는 것으로, 다음을 조합하여 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함한다: (i) 다음중 적어도 하나의 특성을 가지고 있는 폴리페놀; 혈관긴장저하 유도, COX 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 억제 및 산화적 스트레스 조절, 그리고 (ii) 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제. 폴리페놀은 예를 들어 플라바놀 또는 플라보놀일 수 있고, 그 예는 상기에서 제시되었다. 본 발명의 방법은 폴리페놀과 스테롤/스타놀을 같은 조성물의 성분으로서 투여하거나 또는 개별적으로 투여하는 것에 의하여 실행될 수 있다.
효과적인 양은 당업계의 상식이나 여기에 제시된 지시에 따라 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어 스테롤/스타놀을 사용하여 콜레스테롤 저감 효과를 얻기 위해서는, 채식주의자가 아닌 사람의 평균적인 식사에서 발견되는 일반적인 것보다 많이 투여하여야 한다. 전형적인 북아메리카 식사를 하는 사람은 하루에 약 200~400mg을 소비한다. 따라서, 시토스테롤과 같은 피토스테롤이 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위하여 사용된다면, 적어도 하루에 약 1g, 바람직하게는 적어도 약 3g 투여하여야 한다. 바람직하게는 적어도 하루에 약 1g, 바람직하게는 적어도 하루에 약 4.5g에서 부터 하루에 약 20g까지 사용된다. 그러나 양은 피토스테롤의 콜레스테롤 저감 능력에 따라 다르므로, 만약 더 강력한 시토스타놀이 사용된다면 유효량은 하루에 약 1~3g만큼 낮아질 것이다. 이런 양은 Roger 등, J. Amer. Oil Chem. Soc.70(30), 1993과 Carpenter등, J. Amer. Oil Chem. Soc.71(8), 1994에 기술된 분석적 방법을 통하여 결정될 수 있다. 콩 단백질은 예를 들면 하루에 적어도 약 25g이 투여될 수 있다. 다른 지시사항은 Recommended Daily Allowances, 9번째 판, National Res. Council/National Acad. Sci., Washington, D.C.에서 찾을 수 있다. 가용성 섬유는 예를 들면 하루에 적어도 약 3g이 투여될 수 있다. 코코아 폴리페놀은 하루에 약 50mg 내지 1000mg, 바람직하게는 약 100~150mg 내지 약 900mg, 그리고 가장 바람직하게는 하루에 약 300mg 내지 500mg이 투여될 수 있다. 그러나 자연적으로 식품에 존재하고 독성이 없는 폴리페놀이 사용된다면, 위에서언급한 것보다 많은 양이 사용될 수 있다. L-아르기닌은 하루에 약 2g 내지 50g, 바람직하게는 하루에 약 3g 내지 10g, 그리고 가장 적합하게는 하루에 약 6g 내지 8g이 투여될 수 있다. 여기에 또한 자연적으로 식품에 존재하는 L-아르기닌이 사용된다면, 위에서 언급한 것 보다 더 많은 양이 사용될 수 있다. 폴리페놀은 일반적으로 당분야에 알려진 양만큼 투여될 수 있다. 유효량을 결정할 때는, 또한 스테롤/스타놀의 존재하에서 흡수가 촉진된다는 점을 고려할 수 있다.
치료와 예방적 투여는 섭생요법(regimen), 예를 들면 매일, 매달, 2달마다, 2년마다, 매년마다 또는 숙련된 의사에 의하여 결정된 필요한 기간에 따른 다른 섭생요법에 의해 계속될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은, 예로서 포유류의 신체 내에서 유효 화합물의 수준을 유지시키기 위하여, 매일 투여되고, 가장 바람직하게는 하루에 2회 또는 3회 아침과 저녁에 투여된다. 가장 유익한 결과를 얻기 위하여, 본 발명의 조성물은 적어도 약 30일에서 약 60일 동안 투여될 수 있다. 이러한 섭생요법은 주기적으로 계속될 수 있다.
실시예 1 : 리폭시게나제 활성에 대한 코코아 프로시아니딘들의 효과
페놀 분획들(모노머∼헥사머)과 추출물들(조아세톤과 펜타머가 보강됨)이 Romanczyk 등의 미국특허 제 5,554,645호의 실시예 1∼5와, WO97/36497로서 발행된 국제출원 PCT/US97/05693의 실시예 5에 개시된 것과 같은 방법으로 제조되었다. 콩으로부터 얻은 리폭시게나제 I-B형태, 리놀린산(약 99%), 트윈(Tween) 20(폴리옥시에틸렌-소르비탄 모노라우레이트), 및 대조 페놀들(노르디히드로구아이아레틴산(NDGA), (+)-카테킨 및 (-)-에피카테킨)을 Sigma Chemical사로부터 구입했다.
리놀린산을 Grossman & Zakut(Method Biochem. Anal. 25:303-329, 1979)에 따라 유화제 트윈 20을 사용하여 용해시켰다. 리폭시게나제를 5000U/mL로, pH 8.6의 PBS에 용해시켰다. 코코아 페놀들을 순수한 물에 용해시키고, 모액으로부터 희석시켰다. 모노머∼헥사머를 1mg/mL로, 1mM 추출물에 용해시켰다(1g의 조아세톤 추출물/L∼3.0mM 모노머, 1g 펜타머 보강 추출물/L∼3.4mM)
저해도(inhibition)는 각각의 6개의 반응큐벳들(한개의 대조군은 물, 5개의 실험군은 물중의 페놀이 포함)의 샘플에 대해 다음식에 따라 계산되었다: %저해도=(△ abs. 대조군 - △ abs. 실험군)/△abs. 대조군)×100. 반응혼합물들은 pH 7.4의 PBS내 용해된 리놀린산(100μM )±물중의 테스트 페놀을 포함했다. 반응은 최종농도 100U/mL로 리폭시게나제를 첨가하므로써 시작되었다. 리놀린산의 과산화수소 형성에 대한 공액 디엔 측정은 Beckman DU-600 UV 스펙트로미터기(37℃, 흡광도 234nm에서)로 5분 또는 10분에 걸쳐 키네틱 스캔(kinetic scans)을 기록하므로써 측정되었다.
코코아 성분들의 높은 UV 흡광도로 인해 실제 농도들에서 IC50의 측정을 할 수 없었다. 이러한 이유로, IC50값은 테스트물질에 의해 리폭시게나제 활성의 50% 저해가 이루어진 농도에 대한 로그회귀곡선(페놀농도의 로그값에 대한 % 저해도)을외삽하므로써 계산되었다. 외삽된 IC50값들은 코코아 폴리페놀 추출물들의 리폭시게나제 저해 활성의 대략적인 근사값을 제공한다.
NDGA는 콩과 여러가지 포유동물의 리폭시게나제들의 확인된 저해물질이다(Kemal 등, Biochemistry 26:7064-7072, 1987). 이것은 지방들과 오일들에 있어서 산화방지제로서 상업적으로 사용된다. 다른 테스트 페놀들에 의해서는 2×10-6M의 IC50값에 이르지 못하기 때문에, NDGA는 양성 대조군으로서 역할을 한다. (+)-카테킨 및 (-)-에피카테킨은 코코아 폴리페놀 모노머와 구조적으로 유사하다고 추정된다.
페놀들은 몰기준으로 비교되었다. (+)-카테킨에 의한 리폭시게나제 저해도(3×10-3M)는 (-)-에피카테킨에 의한 리폭시게나제 저해도(3×10-1M)보다도 두 승수 강했고, 코코아 모노머(5×10-3M), 다이머(2×10-3M) 및 트리머(2×10-3M)를 더한 경우의 저해도와 매우 유사했다. 고급 올리고머들에 의한 리폭시게나제 저해도는 몰농도의 로그값과는 상관관계가 적었다. 0.3∼25μM의 최종농도들에서, 테트라머, 펜타머 및 헥사머는 5∼30%의 리폭시게나제 활성을 저해했다. 그러나, 페놀농도와 저해도는 주요한 상관관계는 없었다. 조아세톤 추출물은 리폭시게나제 저해도에 따라서(IC50= 5μM, 모노머 기준과 비교) 모노머∼트리머 분획들의 저해도보다 약 3승수 약한 농도를 보여주었다. 펜타머 보강 추출물(IC50=59M)은 리폭시게나제 활성을 의미있는 수준으로 저해하지는 않았다.
코코아 페놀 추출물들의 콩의 리폭시게나제 저해 활성도는 (+)-카테킨의 저해 활성도와 유사하다. 몰기준으로 비교하면, 모노머∼트리머의 활성도들 사이에 약간의 차이가 있는데, 이는 효소의 입체적 저해를 시사한다. 테트라머∼헥사머 물질들은 꽤 낮은 리폭시게나제 저해 활성도를 나타내고, 펜타머 보강 추출물은 모노머∼트리머 올리고머 분획들을 더 많이 포함하는 조추출물보다 저해도가 낮기 때문에, 저해도는 낮은 분자량 성분들(모노머∼트리머)에 대해 특이적일 수 있다. 따라서, 코코아 폴리페놀들은 보결 철이온을 킬레이트하므로써, 또는 산화반응에서 페놀성 히드록실기를 거쳐, 유리 라디칼 중간체들을 포함하는 유리 라디칼들을 제거하므로써 콩의 리폭시게나제를 저해한다. 거대 올리고머들(테트라머들∼헥사머들)은 입체적으로 장해를 받을 수 있고, 따라서 효소의 촉매부위를 인식할 수 없다.
실시예 2 : 프로스타노이드들과 총 엔도텔린(ET)의 기본 내피세포 방출에 대한 코코아 프로시아니딘 추출물들과 코코아 프로시아니딘 올리고머 분획들의 효과들
프로스타노이드 프로스타시클린, 프로스타글란딘(PGE2) 및 트롬복산의 방출에 대한 코코아 폴리페놀 추출물로부터의 정제된 프로시아니딘 모노머들과 펜타머들의 효과와, 배양물중의 소와 인간의 내피세포상의 총 엔도텔린이 연구되었다.
인도메타신은 Cayman사(Ann Arbor, MI USA)로부터 구입했다. 모노머 및 펜타머 프로시아니딘 분획들은 프로시아니딘-보강 코코아열매들(2000. 1. 18 등록된 미국특허 제 6,015,913호에 개시된 방법에 따라 가공됨)로부터, 1996. 9.10 등록된 미국특허 제 5,554,645호의 실시예 1∼5에 개시된 방법에 의해 정제되었다.
샘플들은 Hammerstone 등,(J. Agric. Food Chem., 47:2:490-469, 1999)의 방법에 의해 분석되었다. 분자량 순도의 확인은 질량 스펙트로미터에 의해 얻어졌다.
소의 대동맥 내피세포들(BAEC)과 인간의 대동맥 내피세포들(HAEC)은 Schramm 등,(J. Nutr. Biochem. 8:647-651, 1997; J. Agric. and Food. Chem. 46(5): 1900-1905, 1998)에 의해 이미 개시된 Eagle의 최소 필수 배지(EMEM)내에서 배양되었다.
ES들(통과값＜11)은 2mmol 글루타민/L, 10% 새끼소의 혈청, 페니실린 100유니트/L, 0.1mg 스트렙토마이신/L, 및 0.25pg 암포테리신/L을 포함하는 EMEM과 함께 24-웰 플레이트(well plate)에 뿌려졌다. 융합세포들은 적용가능한 처리화합물들을 포함하는 페놀 레드-프리 EMEM 250ml내에서 처리되었다. EC와 함께 항온처리된 배지는 프로시아니딘 분획들(10, 20 및 30pmol/L)을 적용하고, 0분 및 20분간 EC들과 함께 항온처리한 후 분석되었다. 배지는 하기에 개시된 대로 면역분석법에 의해 분석될 때까지 -70℃에서 보관되었다. EC 인테그러티(integrity)는 Bioadjieras 등, Methods in Lab. Invest. 50:239-246, 1984에 개시된 것과 같이 트리판 블루(Trypan Blue) 배제에 의해 모니터되었다.
면역분석법 과정들은 Westcott 등, Prostaglandins32:857-873, 1986; Yakota 등, Adv. Prostgl. Thrombox. Leukot. Res.15:33-34, 1985; Schramm 등, 1997; 1998; 1999에 개시된 것과 같이 행해졌다. 배지 총 ET(ET-1 + ET-2 + ET-3)가 캐이먼 면역분석법 #583151로 측정되었다. 프로스타시클린(PGI2) 대사산물 6-케토 프로스타글란딘 F1-알파는 캐이먼 효소 면역분석법 #515211로 측정되었고, 트롬복산(TXA2) 대사산물 TXB2는 캐이먼 효소 면역분석법 #519031로 측정되었으며, PGE2는 캐이먼 면역분석법 #514016으로 측정되었다.
설정된 분석조건들은, 3000 da.보다 작은 질량을 가진 와인(wine) 분획이 EC 프로스타노이드 합성에 대해 3000보다 큰 질량을 가진 와인 분획과는 다른 효과들을 유도함을 보여주기 위해 사용된 조건들(Schramm 등, J. Agric. and Food. Chem.46(5): 1900-1905, 1998)과 유사하다. 기초 세포기능에 대한 효과들이 검사되었다. 세포생존도와 세포형태 모두 코코아 프로시아니딘 처리들에 의해 영향을 받지 않았다. BAEC들과 함께 20분간 항온처리된 각 대조배지 밀리리터당 73.5=+/-0.044ng TXB2 및 294+/-6.3 pg PGE2가 포함되어 있었다.
도 2에 도시된 바와 같이, BAEC들과 함께 20분간 항온처리된 배지에의 모노머 또는 펜타머 코코아 프로시아니딘들의 첨가는 대조배지 단독과 비교시, 배지 프로스타노이드와 ET농도들을 변화시켰다. 모노머(A1) 또는 펜타머(A2) 프로시아니딘들을 포함하는 배지는 대조배지보다 6-케토-PGF1-알파를 더 포함하고 있었다. 배지 PGE2가 투입량 의존방식으로 모노머 분획(B1)과 30μM에서의 펜타머 분획(B2)에 의해 감소되었다. 배지 TXB(C1-2)에 대한 코코아 프로시아니딘 분획의 중요한 효과는 발견되지 않았다. 모노머 및 펜타머 코코아 프로시아니딘 분획들은 배지 6-케토-PGF1-알파 및 PGE2에 대해 유사한 효과들을 갖고 있었지만, 이들은 배지 ET에 대해 30μM에서 모노머 분획(D1)이 배양배지내 ET농도를 증가시키고, 펜타머 분획(D2)은 투입량 의존방식으로 배지 ET농도를 감소시키는 반대효과들을 가지고 있었다.
도 3A-B의 데이타는 모노머 및 펜타머 코코아 프로시아니딘들이 소(BAEC)와 인간(HAEC)으로부터의 대동맥 EC들에 영향을 주는 유사한 방식을 도시하고 있다.
상기 데이타는 코코아 프로시아니딘들이 혈관이완을 완화시키고, 프로스타시클린 유도 및 엔도텔린과 프로스타글란딘의 저해와 같은 혈소판 응집/혈전 형성을감소시키는 이코사노이드 및 엔토텔린 효과들을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 3 : 혈소판 활성에 대한 프로시아니딘-보강 코코아음료의 소비의 효과들
혈소판 활성화 및 1차 지혈의 조절에 대한 코코아음료의 소비의 효과들이 연구되었다.
심장질환 또는 지혈이상들의 전력이 없는 서른명의 건강한 비흡연 성인들을 세개의 처리그룹들로 나누었다: (a) 코코아음료를 소비한 10명의 검사대상자들(4명의 남성과 6명의 여성, 24∼49세) (b) 대조군으로서 카페인음료를 소비한 10명의 검사대상자들(4명의 남성과 6명의 여성, 26∼50세), 및 (c) 대조군으로서 물을 소비한 10명의 검사대상자들(4명의 남성, 6명의 여성, 24∼50세). 모든 여성들은 폐경전의 여성이었고, 에스트로겐을 복용하고 있지 않았다. 참가자들에게 적어도 4일간 무스테로이드성 염증치료 약제를, 적어도 이틀간 알콜음료들을, 또한 테스트전과 테스트일동안 적어도 24시간동안 카페인 또는 테오브로민함유 식품들을 삼가하도록 지시했다.
혈액은 오전 8∼10시 사이에 각 검사대상자들로부터 채취되었다. 샘플들은 3.2% 완충 구연산나트륨용액(Becton Dickinson, 프랭클린 레이크스, 뉴저지) 0.5ml를 함유하는 두개의 5ml 진공 튜브들에 채취되었다. 그 다음 검사대상자들은 18.75g의 프로시아니딘이 보강된 코코아분말(약 960mg의 총 프로시아니딘, 17mg 카페인 및 285mg 테오브로민을 제공함) 및 희석된 물과 혼합된 12.5g의 설탕(Adamson, G.E 등, J. Ag. Food. Chem.; 1999;47(10)4184-4188)을 함유한 음료 300ml를 마셨다. 대조 검사대상자들은 17mg 카페인 및 12.5g 설탕을 함유한 음료 또는 그냥 물을 마셨다. 추가 혈액샘플들은 음료 소비 2시간과 6시간 후에 채취되었다. 한 여성 검사대상자는 코코아 소비 6시간 후의 혈액채취에 참여하지 않았다.
프로시아니딘은 하기와 같이 하여 양을 측정했다: 복합물 표준을 상업적으로 구입가능한 (-)-에피카테킨을 사용하여 제조했고, 다이머들∼데카머들을 Hammerstone, J.F. 등, J. Ag. Food Chem ; 1999; 47(10)490-496, Lazarus, S. A.등, J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(9); 3693-3701 및 Adamson, G. E. 등, J. Ag. Food. Chem.; 1999; 47(10) 4184-4188에 개시된 방법에 의해 정제된 상태로 얻었다. 이러한 물질들을 사용한 표준 모액들은 상기 Adamson의 참고문헌에 개시된 정상상 HPLC법을 이용하여 분석되었고, 각각 276nm 및 316nm의 여기 및 방사 파장에서 형광검출되었다. 피크들은 그룹화되었고, 올리고머들의 어떤 한 부류에 속하는모든 이성체들로부터의 기여를 포함하도록 그들의 합계 총면적을 계산하고, 보정곡선들은 2차 핏(quadratic fit)을 이용하여 생성되었다. 모노머들과 소올리고머들은모노머-기준 및 다이머-기준 보정곡선들을 생성하기 위한 선형 회귀의 사전 사용과 일치하는 거의 선형의 플롯들을 가졌다.
이들 보정곡선들은 그 다음 하기와 같이 제조된 샘플들내의 프로시아니딘 수준들을 계산하는 데에 사용되었다: 우선, 코코아 또는 초콜릿 샘플(약 8g)을 세개의 헥산 추출물들(각각 45mL)을 사용하여 탈지시켰다. 다음으로, 탈지된 물질 1g을 5mL의 아세톤/물/아세트산 혼합물(70:29.5:0.5 v/v)로 추출하였다. 그 다음 탈지된 물질내의 프로시아니딘들의 양은 샘플들로부터의 HPLC 데이타를, 위에 개시한 대로 하여 얻어진 보정곡선들(정제된 올리고머들을 사용했던 것)과 비교하므로써 결정되었다. 샘플들(초콜릿 1g 샘플크기 또는 분액 1.5g 샘플크기를 사용)의 지방 퍼센트는 Association of Official Analytical Chemist에 의한 표준법(AOAC 공식법 920.177)을 사용하여 결정되었다. 그 다음 원래의 샘플(지방함유)내의 총 프로시아니딘 수준들의 양이 계산되었다. 각 샘플의 시험실행(run) 전에 칼럼-대-칼럼 변동들을 방지하기 위해 보정이 행해졌다.
혈액샘플들의 채취 10분 이내에, 전체 혈액은 펩티드 Arg-Gly-Asp-Ser(Sigma, 세인트루이스, 미조리)의 존재 또는 부재하에, 10㎕ HEPES 완충용액(pH 7.4, 비자극 대조군), 20 또는 100μM ADP 또는 20μM 에피네프린(BioData, 호르샴, 펜실베니아)과 함께 실온에서 5분간 폴리스티렌 튜브들 내에서 항온처리되었다. 5분후, 샘플들은 1mL HEPES 완충용액내에 현탁되었고, 100㎕의 샘플이 하기 형광라벨된 단일클론성 항체들을 각각 포화농도(20μL)로 함유하는 튜브들로 옮겨졌다: PAC1-형광 이소티오시아네이트(FITC), 안티-CD62P-피코에리트린(PE) 및 안티-CD42a-PerCP. PAC1은 피브리노겐-결합 수용체 GPⅡb-Ⅲa를 인지하고, 안티-CD62P는 활성화된 혈소판들의 표면상에 존재하는 P-셀렉틴을 인지한다. 안티-CD42a는 활성화된 혈소판들과 휴지 혈소판들의 양쪽 모두의 표면에 존재하는 GPⅠb-Ⅸ를 인지한다. 쥐의 IgG, FITC 및 쥐의 IgG, PE가 동기준표본(isotype) 대조군들로서 사용되었다. Arg-Gly-Asp-Ser-펩티드는 혈소판들에 대한 PAC1 항체의 결합을 방해해서, 흘림세포계측기상의 음성 대조 마커를 만들도록 하기 위해 사용되었다. 항체들과 동기준표본 대조군들은 켈리포니아주의 산호세 소재의 Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc.로부터 구입되었다.
작용물질 ADP 및 에피네프린의 존재 또는 부재하에, 전체 혈액샘플들은 실온, 암실에서 20분간 단일클론성 항체들 또는 동기준표본 대조군과 함께 항온처리되었다. 그 다음 샘플들은 여과된 1% 파라포름알데히드(pH 7.2)내에 고정되었고, 2∼8℃, 암실에서 보관되었다. 모든 샘플들은 LYSYSⅡ 소프트웨어를 사용하여 FACScan 흘림세포계측기상에서 48시간내에 분석되었다. 흘림세포계측기 실행은 1, 2 및 10㎛ 보정비드들(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., 산호세, 캘리포니아 및 Flow Cytometry Systems, Research Triangle Park, 노스캐롤라이나)을 사용하여 확인되었다. 2만건의 결과들(events)이, 모든 빛 산란과 형광 파라미터들이 로그모드로 표시된 리스트 모드에 수집되었다. 혈소판들은 빛 산란과 CD42a 발현에 근거하여 게이트(gate)되었다. 활성화된 혈소판들은 GPⅡb-Ⅲa 또는 P-셀렉틴의 활성화된 형태를 공동 발현하는 CD42a 양성 결과들의 퍼센트로서 규정되었다. 혈소판 미세입자들은 크기가 2㎛보다 작은 CD42a 양성 결과들의 퍼센트로서 규정되었다.
세개의 연구시점의 각각에서 취해진 하나의 혈액샘플은 제조자의 지시들에 따라 혈소판 기능분석기(PFA-100TM, Dade Behring International, 마이애미, 플로리다)를 사용하여 4시간내에 분석되었다. Mammen 등, Sem. Thromb. Hemostas.24:195-202, 1998, 및 Fressinaud 등, Blood91:1325-31, 1998 참조. 기능은 테스트 카트리지 막내에서 혈액이 개구를 폐쇄하기 위해 요구되는 시간으로 정의되는 초단위의 폐쇄시간으로서 측정되었다.
각 처리군 또는 대조군으로부터의 데이타는 등급에 따른 Friedman의 반복 치수들 ANOVA(SigmaStat for Windows, SPSS, 리치몬드, 캘리포니아)를 사용하여 차이들을 분석하였다. Student-Newman-Keuls 다비교법이 기준 및 소비 2시간과 6시간후 결과들 사이의 차이를 밝혀내기 위해 사용되었다. 0.05보다 작은 P값은 통계학적으로 중요한 것으로 간주되었다.
코코아 소비는 섭취 2시간과 6시간후에, 자극되지 않은(P = 0.035, 도 4A) 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현 및 생체외 에피네프린-유도된(P = 0.008, 도 4B) 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현을 억제했다. 자극없이 활성화된 GPⅡb-Ⅲa를 발현하는 혈소판들의 중간 퍼센트는 소비 0시간, 2시간 및 6시간후 시점에서 각각 0.9%, 0.5% 및 0.3%였고, 에피네프린에 반응한 경우에는 각각 9.6%, 6.8% 및 3.3%였다. 반대로, 카페인음료를 마신 대조군에서는 에피네프린-자극된 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현이 증가되었다(P = 0.048, 소비 0시간, 2시간 및 6시간후 시점에서의 중간값 = 5.3%,6.5% 및 7.5%). 물을 마신 대조군에서는 변화가 없었다.
코코아는 소비 2시간과 6시간후 혈소판상에서의 20μM ADP-유도된 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현을 감소시켰다(P＜0.001, 도 4C, 소비 0시간, 2시간 및 6시간후 시점에서 각각의 중간값 = 58.5%, 44.2% 및 38.8%). 이 경향은 활성화가 100pm ADP에 의해 유도되었을 때, 코코아 소비후 혈소판상에서의 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현이 감소되는 것을 시사했다(P = 0.067, 소비 0시간, 2시간 및 6시간후 시점에서 각각의 중간값 = 76.5%, 68.7% 및 57.6%). 카페인음료와 물 대조군들을 소비한 그룹에서는 ADP-유도된 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현에서의 변화가 없었다.
코코아 소비후, P-셀렉틴 발현이 감소되는 중요하지 않은 경향이 관찰되었다(P = 0.053, 도 5A). 코코아 소비는 소비 2시간 및 6시간후에 20μM ADP-유도된 P-셀렉틴 발현을 감소시켰고(P = 0.007, 도 5C), 100μM ADP-유도된 P-셀렉틴은 소비 0시간, 2시간 및 6시간후에 각각 56.1%, 54.7% 및 41.7%였다.
카페인함유 음료 또는 물을 소비한 대조군들내에서의 혈소판 자극 또는 저해의 증거는 없었다.
코코아음료의 소비후 흘림세포계측기에 의해 검출된 혈소판 미세입자들의 수는 2시간후에 기준보다 감소되었고, 6시간 후에 더욱 감소되었다(표 1 참조). 반대로, 혈소판 미세입자들의 수는 물의 소비 2시간 및 6시간 후, 그리고 카페인함유 음료의 소비 6시간 후에 증가되었다. 혈소판 미세입자들은 생리적 혈소판 활성화 동안에 형성된, 지혈 활성을 갖는, 인지질이 풍부한 미세소포들이다.
표 1
코코아음료의 소비 6시간 후, 콜라겐-에피네프린-유도된 폐쇄시간은 연장되었다(표 2 참조). 이것은 코코아 소비가 혈소판-관련 1차 지혈을 지연시킴을 나타낸다. 연장된 폐쇄시간에 대한 경향은 콜라겐-ADP-유도후에 관찰되었다(p=0.097); 폐쇄시간은 카페인 대조군에서는 변화되지 않았다.
표 2
결과들은 초콜릿음료의 소비가 인간들내에서의 혈소판기능을 변형시킴을 보여주었다. 첫째, 생체외의 약한 작용물질에 의한 혈소판 활성화 마커 발현에 의해측정된 혈소판 활성화는 코코아 소비후 감소되었다. 둘째, 혈소판 미세입자 형성이 코코아 소비후 감소되었다. 그리고 셋째, 혈소판-관련 1차 지혈에 의해 측정된 바로는, 코코아 소비가 혈소판 기능에 대해 아스피린과 유사한 효과를 초래했다. 카페인음료 대조군이 에피네프린-유도된 활성화 GPⅡb-Ⅲa 발현 및 미세입자 형성의 증가를 초래했다는 사실은 코코아음료내에 존재하는 코코아 프로시아니딘들이 혈소판의 활성화와 기능의 저해에 대한 원인이 된다는 것을 의미하는 것일 것이다.
실시예 4: 콜레스테롤에 의한 혈관내피 의존성 이완(EDR)의 저해에 대한 코코아 경구소비의 효과들
플라보노이드들을 포함하는 몇몇 식물추출물들이 생체외에서 토끼의 대동맥내에서의 EDR을 유도한다는 것이 알려져 있다. 우리들은 코코아의 만성적 경구투여에 의한 EDR에 대한 효과들과 콜레스테롤 투여시 일어나는 EDR의 손실에 대한 이의 보호작용을 연구했다. 뉴질랜드 흰토끼에게 7주동안 4종류의 식이를 먹였다.: (1) 차우(chow), (2) 차우 + 200mg 코코아/일, (3) 3주간 2% 콜레스테롤 공급후 4주간 차우를 먹임, (4) 3주간 2% 콜레스테롤 공급후 4주간 차우 + 200mg 코코아/일을 먹임. EDR은 기관 바스들(baths)(20ml)내에 현탁된 대동맥 고리들에 대해 측정되었다. 고리들은 노르에피네프린(NE)(10-5M)으로 사전에 수축되었다. 아세틸콜린(Ach)및 코코아 펜타머 추출물(10-7∼10-5M)에 대한 EDR은 NE에 대한 % 이완으로서 측정되었다.
실시예 5: 코코아 프로시아니딘들, 피토스테롤들 및 이들의 조합물의 경구소비의 효과
이 실험의 결과들은 피토스테롤들과 코코아 프로시아니딘들의 조합투여의 시너지효과뿐만 아니라, (1)산화적 스트레스와 손상의 지표 및 (2)콜레스테롤 수준들에 대한 톨(tall) 오일("피토스테롤") 및 약 70mg/g의 총 코코아 프로시아니딘들을 포함하는 코코아분말(CPd)로부터 얻을 수 있는 에스테르화되지 않은 피토스테롤들과 피토스타놀들의 조합투여의 효과를 보여준다.
피토스테롤들(2중량%) 및/또는 CPd(0, .5, 1, 2중량%)가 보충된 정제된 계란껍질 식이가, 2주 기간동안 수컷 쥐에게 먹이기 위해 사용되었다. 쥐들은 8개의 그룹들(한 그룹당 3마리 쥐)로 나뉘었고, 20∼25g/일의 대조군 식이와 하기와 같은 테스트 식이들을 먹였다:
식이+2% 피토스테롤(440mg/일) 식이-피토스테롤
그룹 1 0% CPd(0.0mg/일) 그룹 5 0% CPd(0.0mg/일)
그룹 2 0.5% CPd(110mg/일) 그룹 6 0.5% CPd(110mg/일)
그룹 3 1% CPd(220mg/일) 그룹 7 1% CPd(220mg/일)
그룹 4 2% CPd(440mg/일) 그룹 8 2% CPd(440mg/일)
물은 임의섭식하도록 했고, 소비량은 남긴 음식물/음식컵들 아래에서 수집된 흘린 음식물의 무게를 측정하므로써 결정되었다. 음식섭취량은 매일 측정되었고, 쥐의 체중은 이틀에 한번씩 측정되었다.
산화적 손상/스트레스 파라미터들, 콜레스테롤 수준들 및 혈액 플라스마내로의 에피카테킨 흡수도가 측정되었다.
플라스마 TBARS가 Yagi(Biochem Med 15:212-6, 1976)에 의해 개시된 방법의 변형을 사용하여 측정되었다. 100μL의 전혈이 1ml의 생리식염수에 첨가되었고, 1700g로 15분간 원심분리되었다. 상징액이 채취되었고, 분석될 때까지 -70℃에서 냉동되었다. 액체들은 포스포텅스틴산/황산 시스템으로 이들을 침전시키므로써 분리되었다. 그 다음 액체분획을 티오바비튜린산과 반응시켰고, 결과로 얻어진 첨가생성물들(adducts)은 표준물질로서 1,1',3,3'-테트라에톡시프로판을 사용하여 형광분석적으로 측정되었다. 결과물들은 밀리리터 플라스마당 MDA 나노몰로서, 그리고 플라스마 폴리불포화 지방산들의 농도에 대한 함수로서 표현되었다,
8-히드록시-2'-디옥시구아노신(8OH2'dG)이 하기와 같이 측정되었다. 핵 DNA를 Wako DNA Extractor WB kit(Wako Chemical USA, Inc., 리치몬드, 버지니아)를 사용하여 분리하였다. 조직(100∼250mg) 또는 세포들(106세포들)은 키트 용해 완충용액내에서 균질화되었고, 4℃에서 20초간, 10,000g로 원심분리되었다. 펠렛은 용해 완충용액으로 처리되었고, 결과 펠렛은 키트 효소반응용액에 용해되었다. RNase가 최종농도 20㎍/ml로 첨가되었고, 샘플은 50℃에서 10분간 항온처리되었다. 키트 단백질 분해효소용액이 첨가되고, 50℃ 항온처리가 한시간 더 계속되었다. 샘플들은 실온에서 5분간, 10,000g로 원심분리되었고, 상징액을 DNA를 정제하기 위해 키트 NaI용액과 이소프로판올로 처리하였다. 침전물을 실온에서 10분간, 10,000g로 수집하였고, 키트용액 A와 B로 세척하였다. 최종펠렛을 간단히 공기로 건조시켰고, pH 4.8의 200㎕의 0.1mM 데스페릴/20mM Na 아세테이트에 재현탁시켰다. DNA 분해와 분석이 Shigenaga 등(Method Enzymol 234:16-33, 1994)의 방법에 몇가지 변형을 가하여 실시되었다. 요약하면, DNA는 65℃에서 15분간, 최종농도 0.1mg/ml에서 핵산가수분해효소 P1과의 항온처리에 의해 뉴클레오티드 5'-모노포스페이트들로 분해되었다. pH가 1M Tris-HCl을 이용하여 pH 8.5로 조정되었고, 송아지의 장의 알칼린 포스페이트가 샘플을 뉴클레오타이드들로 더 분해하기 위하여 사용되었다(1시간, 37℃). 샘플의 pH가 pH 5.1의 3M 아세테이트 나트륨 완충용액으로 조정되었고, 0.1mM EDTA/0.1mM 데스페릴이 금속에 의한 산화를 방지하기 위해 첨가되었다. 샘플을 30,000MW 커트오프 스핀 필터(cutoff spin filter)를 통과하도록 놓고, HPLC 주입 바이알 안에 위치시켰다. 샘플들은 인공물 형성을 방지하기 위해 제조 48시간 이내에 분석되었다. 분석을 위해, 샘플들은 전자화학 검출기(ESA, Coulochem Ⅱ)를 갖춘 휴렛 패커드 1100 HPLC 상으로 주입되었다. Supelcosil LC-18-DB 칼럼(150×4.6mm, 3미크론 입자크기)과 5% 메탄올을 포함한 pH 5.2의 100mM Na 아세테이트 완충용액의 이동상을 이용하여 1.0ml/min의 유속에서 등용매원리에 따라분리가 행해졌다. OH8dG가 전기화학 검출기를 사용하여 450mV에서 검출되었고, 2'-데옥시구아노신(dG)이 UV검출기를 사용하여 248nm에서 검출되었다. OH8dG 수준들은 샘플들내의 dG의 양에 대해 표현되었다.
에피카테킨 흡수도는 Rein 등, J. of Nutr., 2000, 130(8S), 2109S-2114S에 개시된 바에 따라 측정되었다.
결과들
결과들은 피토스테롤들과 폴리페놀들의 조합된 투여에 의한 예기치 않은 이익들을 입증한다.
도 6을 참조하면, 흡수된 에피카테킨의 양이 투여량 의존방식으로 증가되었다. 놀랍게도, 피토스테롤들의 투여는 에피카테킨의 흡수도를 증가시켜, 예를 들면, 2중량% CPd 식이에서, 피토스테롤들이 포함되지 않은 비교식이에 비해 플라스마내의 에피카테킨 수준들이 약 30% 증가되었다. 따라서, 피토스테롤은 에피카테킨의 생체이용도를 증가시켰다.
도 7을 참조하면, CPd가 투여량 의존방식으로 DNA의 산화적 손상을 저해했다. 놀랍게도, CPd의 더 높은 투여량에서, DNA에 대한 산화적 손상을 방지하는 데 있어서, 피토스테롤들과 CPd의 시너지효과를 나타내는, DNA에 대한 산화적 손상에 있어서의 예기치 않은 감소가 관찰되었다.
도 8을 참조하면, 피토스테롤들을 포함하는 식이의 공급은 놀랍게도 산화적 스트레스를 악화시키는, 본 출원의 출원일전에 당분야에서 추천된, 피토스테롤과음식물의 동시 섭취(코코아 프로시아니딘들 없이)와 같은 대조 식이보다 더 높은 산화적 스트레스를 초래했다. 코코아 프로시아니딘들의 공급은 이러한 피토스테롤들의 음성적인 효과를 역전시키거나 둔감시켰다.
총 플라스마 콜레스테롤들도 측정되었고, 결과들을 표 3에 나타냈다.
표 3
표 3을 참조하면, 예상했던 대로, 피토스테롤들은 콜레스테롤 수준들을 감소시켰다. 그러나 놀랍게도, 피토스테롤들이 CPd와 함께 투입되었을 때, 콜레스테롤 수준들이 투입량 의존방식으로 더욱더 감소했다. 예를 들면, 피토스테롤함유 식이를 먹인 세마리 쥐들의 평균 총 콜레스테롤 수준은 84mg/dl이었다. 이 식이의 2중량% CPd를 보충했더니 총 콜레스테롤을 80mg/dl로, 추가적 감소를 초래했는데, 이는 두개의 물질들의 시너지효과를 나타낸다. 대조 식이를 먹인 쥐들은 88.3mg/dl의 평균 콜레스테롤 수준을 보여주었다.
실시예 6: 코코아 프로시아니딘을 포함하는 코코아 또는 초콜릿과 함께 콜레스테롤 저감제를 포함하는 식품 조성물들
콜레스테롤 저감제를 포함하는 흑 초콜릿, 토피츄(toffee chew) 및 그라놀라바(granola bar)들을 제조했다.
토피츄는 표 4에 도시된 원료들로부터 설탕과 코코아를 미리 섞어서 이를 캬라멜과 혼합하므로써 제조되었다. 유리 피토스테롤들(그대로 또는 분쇄된 것)이 설탕과 코코아 혼합물에 첨가되었다.
표 4
유리 스테롤을 함유한 흑 초콜릿은 상업적으로 구입가능한 흑 초콜릿(MARS Inc.로부터 구입가능한 DOVE Dark)을 사용하여 제조되었다. 녹은 초콜릿과의 혼합을 촉진하고, 초콜릿 텍스쳐(texture)에 대한 역효과를 피하기 위하여, 식물성 스테롤/스타놀의 분말형태들이 IKA에 의해 제조된 Universal Muche M20상에서 30∼60초동안 파쇄, 혼합되었고, 입자 크기가 초콜릿의 입자크기만해 질 때까지 30초간 더 파쇄되었다. 흑 초콜릿을 녹이고, 스테롤 입자들을 확실히 균일하게 분배하기 위해 스테롤을 천천히 혼합시키므로써 첨가하였다. 결과 조성물을 표 5에 나타냈다.
표 5
콜레스테롤 저감 귀리섬유를 함유하는 그라놀라 바들을 표 6과 7에 나타낸 원료들로부터 제조하였다. 시럽 결합제는 팜커널유를 45℃로 녹이므로써 제조되었고, 사용에 적합해 질 때까지 그 온도로 유지되었다. 옥수수시럽, 글리세린, 코코아분말, 흑설탕, 소금, 레시틴 및 프로필 갈레이트가 조합되고, 팜커널유가 첨가되었다. 혼합물을 따뜻하게 유지시켰다. 그라놀라를 제조하기 위해, 귀리 또는 콩퍼프들(테네시주 칼리지데일 소재의 Sovex Food사로부터 구입가능)을 초콜릿 조각들과 함께 혼합하고, 상기 개시된 대로 제조된 따뜻한 시럽 결합제를 혼합물에 섞었다. 그 다음 그라놀라 혼합물을 판으로 만들고, 10X 설탕(62%), 코코아분말(33%) 및 시나몬(5%)의 혼합물을 뿌리고, 조각들로 잘랐다. 혼합물에 사용된 코코아분말은 Kealey 등의 미국특허 제 6,015,913호의 방법에 따라 제조되었다.
표 6
표 7

Claims (50)

  1. 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머와 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제.
  2. 제 1항에 있어서, 콩 단백질, 가용성 섬유 및/또는 L-아르기닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제.
  3. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 하기 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제: 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체들중 어느 하나, 카로티노이드, 구아껌 또는 모노 또는 폴리 불포화 지방산.
  4. 제 1항에 있어서, 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머가 코코아 원료, 프로시아니딘 함유 코코아 추출물, 또는 적어도 하나의 프로시아니딘 모노머 또는 올리고머를 포함하는 코코아 추출물의 분획의 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제.
  5. 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머와 스테롤 및/또는 스타놀에기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 것을 특징으로 하는 과자류가 아닌 식품.
  6. 제 5항에 있어서, 콩 단백질, 가용성 섬유 및/또는 L-아르기닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
  7. 제 5항에 있어서, 적어도 하나의 하기 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식품: 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체들중 어느 하나, 카로티노이드, 구아껌 또는 모노 또는 폴리 불포화 지방산.
  8. 제 5항에 있어서, 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머가 코코아 원료, 프로시아니딘 함유 코코아 추출물 또는 적어도 하나의 프로시아니딘 모노머 또는 올리고머를 포함하는 코코아 추출물의 분획의 형태인 것을 특징으로 하는 식품.
  9. 제 5항에 있어서, 식품은 음료인 것을 특징으로 하는 식품.
  10. 제 5항에 있어서, 식품은 애완동물용 식품인 것을 특징으로 하는 식품.
  11. 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머와 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤을 저감시키는 과자류.
  12. 제 11항에 있어서, 콩 단백질, 가용성 섬유 및/또는 L-아르기닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과자류.
  13. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 하기 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 과자류: 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 B복합체들중 어느 하나, 카로티노이드, 구아껌 또는 모노 또는 폴리 불포화 지방산.
  14. 제 11항에 있어서, 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머가 코코아 원료, 프로시아니딘 함유 코코아 추출물 또는 적어도 하나의 프로시아니딘 모노머 또는 올리고머를 포함하는 코코아 추출물의 분획의 형태인 것을 특징으로 하는 과자류.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 과자류는 초콜릿, 초콜릿이 피복된 캔디, 구운 제품, 및 그라놀라 바인 것을 특징으로 하는 과자류.
  16. 제 11항에 있어서, 상기 과자류는 적어도 하나의 다음의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 과자류: 혈관긴장저하 유도, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 완화.
  17. 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머와 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 저감 초콜릿.
  18. 제 5항 내지 제 10항중 어느 한항의 식품 또는 제 11항 내지 제 17항중 어느 한항의 과자류 및 심혈관 건강의 증진 및/또는 심장질환 위험의 감소를 위한 식품 또는 과자류에 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포장물품.
  19. 제 5항 내지 제 10항중 어느 한항의 식품 또는 제 11항 내지 제 17항중 어느 한항의 과자류 및 혈관긴장저하 유도, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 효과의 방지를 위한 식품 또는 과자류에 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포장물품.
  20. 제 5항 내지 제 10항중 어느 한항의 식품 또는 제 11항 내지 제 17항중 어느 한항의 과자류 및 식품 또는 과자류가 코코아 프로시아니딘의 흡수를 증진 및/또는향상시키는 것을 표시하는 데에 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포장물품.
  21. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 포장물품: (ⅰ)적어도 하나의 다음의 성질을 갖는 폴리페놀과 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물: 혈관긴장저하 유도, COX 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 완화; 및 (ⅱ)심혈관 건강 증진, 심장질환의 위험 감소, 및/또는 폴리페놀의 흡수 증진 또는 향상을 위한 조성물에 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서들.
  22. 제 21항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  23. 제 21항에 있어서, 폴리페놀은 플라보놀인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  24. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 포장물품: (ⅰ)적어도 하나의 다음의 성질을 갖는 폴리페놀과 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물: 혈관긴장저하 유도, COX의 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소, 산화적 스트레스 완화; 및 (ⅱ)혈관 건강 증진, 심장질환의 위험 감소를위한 조성물에 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서들.
  25. 제 24항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  26. 제 25항에 있어서, 플라바놀은 코코아 플라바놀인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  27. 제 24항에 있어서, 폴리페놀은 플라보놀인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  28. 제 24항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀 관련 올리고머인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  29. 제 28항에 있어서, 플라바놀 관련 올리고머는 코코아 프로시아니딘 올리고머인 것을 특징으로 하는 포장물품.
  30. 적어도 하나의 다음의 성질을 갖는 폴리페놀 및 콜레스테롤 저감제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물: 혈관긴장저하 유도, COX 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 완화.
  31. 폴리페놀 및 콜레스테롤 저감제를 포함하는 조성물을 인간 또는 수의 동물에게 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 수의 동물의 심혈관 및/또는 혈관계 건강을 증진시키는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 폴리페놀은 코코아 프로시아니딘 모노머 및/또는 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 콜레스테롤 저감제는 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 콜레스테롤 저감제는 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 다음 물질의 조합물을 인간 또는 수의 동물에게 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 수의 동물의 혈액내로의 폴리페놀의 흡수를 증진시키는 방법: (ⅰ)적어도 하나의 다음의 성질을 갖는 폴리페놀: 혈관긴장저하 유도, COX 활성 억제, LOX 활성 억제, LDL의 산화 억제, NOS 활성 증진, NO의 수준 증가, 혈소판 응집 억제, 단구 접착 및 맥관성 평활근 증식 억제, 혈압 감소, 혈전증 감소 및 산화적 스트레스 완화; 및 (ⅱ)스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제.
  36. 제 35항에 있어서, 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제는 개별적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제는 같은 조성물에 포함되어 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 37항에 있어서, 폴리페놀은 플라바놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 인간 또는 수의 동물의 혈관계 건강을 증진시키기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 코코아 프로시아니딘 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제의 사용.
  42. 인간 또는 수의 동물의 혈관계 건강을 증진시키기 위해 코코아 프로시아니딘과 함께 사용하기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제의 사용.
  43. 인간 또는 수의 동물의 혈관계 건강을 증진시키기 위해 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 사용하기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 코코아 프로시아니딘의 사용.
  44. 인간 또는 수의 동물의 혈류내로의 폴리페놀의 흡수를 향상시키기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제의 사용.
  45. 인간 또는 수의 동물의 혈류내로의 폴리페놀의 흡수를 향상시키기 위해 폴리페놀과 함께 사용하기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제의 사용.
  46. 인간 또는 수의 동물의 혈류내로의 폴리페놀의 흡수를 향상시키기 위해 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제와 함께 사용하기 위한 약제, 식품, 다이어트 보충제 또는 식품 첨가제의 제조에 있어서의 폴리페놀의 사용.
  47. 제 44항 내지 제 46항중 어느 한항에 있어서, 폴리페놀이 플라바놀인 것을 특징으로 하는 사용.
  48. 제 47항에 있어서, 플라바놀이 코코아 플라바놀인 것을 특징으로 하는 사용.
  49. 혈관계 건강을 증진시키기 위한 개별적, 동시적 또는 연속적 사용을 위한, 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제를 포함하는 제품.
  50. 혈관계 건강을 증진시키기 위한 조합된 사용을 위한 폴리페놀 및 스테롤 및/또는 스타놀에 기초한 콜레스테롤 저감제.
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