FI107015B - Kasvistanolirasvahappoestereiden seos ja sen käyttö sekä elintarvike - Google Patents

Description

10701b 5

Kasvistanolirasvahappoestereiden seos ja sen käyttö sekä elintarvike -Komposition av växtstanolfettsyraestrar och dess användning samt livs-medel Tämä keksintö koskee sitostanolirasvahappoesteriä sisältävää kasvistanolirasva-happoestereiden seosta, jota erityisesti käytetään seerumin kolesterolitasoa alentavana aineena. Tätä seosta voidaan edullisesti käyttää ravintorasvoissa ja -öljyissä ja rasvaa sisältävissä elintarvikkeissa. Keksintö koskee myös tällaisia 10 elintarvikkeita.

Kasvisterolit ovat kaikkien kasvien välttämättömiä rakennusaineita. Niiden tehtävät kasveissa muistuttavat kolesterolin tehtäviä nisäkkäissä. Kasvikunnan yleisimmät kasvisterolit ovat β-sitosteroli, kampesteroli ja stigmasteroli. Näiden kasvi-15 sterolien kemiallinen rakenne muistuttaa läheisesti kolesterolin rakennetta: rakenne-erot löytyvät molekyylin sivuketjusta. Kolesteroliin verrattuna esimerkiksi sito-sterolin sivuketjussa on lisäksi yksi etyyliryhmä ja kampesterolin sivuketjussa lisäksi yksi metyyliryhmä.

20 Jo 1950-luvulta lähtien kasvisterolien on tiedetty vähentävän tehokkaasti seerumin kolesterolitasoa. Suhteellisen pieninäkin, muutaman gramman päiväannoksina, ne vähentävät tehokkaasti sekä dietaarisen että binaarisen kolesterolin imeytymistä ja sitä kautta seerumin kokonais-ja LDL-kolesterolia (12, 28, ks. myös 27, 32). Mekanismia, joka saa aikaan kolesterolin imeytymisen vähentymisen, ei tun-25 neta tarkkaan. Otaksutaan, että kasvisterolit syrjäyttävät kolesterolin misellifaasis-ta ja estävät sitä kautta kolesterolin imeytymisen. Kasvisteroleista sitosteroli tai : sen hydrattu muoto sitostanoli on ollut kiinnostuksen kohteena käytännössä kai kissa aiemmissa tutkimuksissa. Tutkittujen valmisteiden sterolikoostumusta ei kuitenkaan ole läheskään aina selvästi dokumentoitu, ja useimmissa tutkimuksissa 30 käytetyt sterolivalmisteet ovat sisältäneet myös vaihtelevia määriä muita sterolei-ta.

*

Koska kasvisterolit ovat kasviöljyjen ja -rasvojen luontaisia aineosia, niitä on pidetty turvallisena keinona vähentää seerumin kolesterolitasoa. Lisäksi ne eivät 35 juurikaan imeydy terveiden ihmisten ruoansulatuskanavasta, ja vähäiset imeytyneet määrät erittyvät sappinesteen kautta pois elimistöstä. Kasvisterolien imey-tymistehokkuudessa on yksilöllisiä eroja eri henkilöillä ja eri kasvisterolien osalta, mutta normaalisti vähemmän kuin 5 % kasvisteroleista imeytyy terveen ihmisen ruoansulatuskanavasta (27). Kuitenkin on osoitettu, että jopa 10% dietaarisesta 40 kampesterolista imeytyy (20).

10701b 2

Eräissä harvinaisissa sairauksissa, kuten sitosterolemiassa, kasvisterolit imeytyvät poikkeuksellisen tehokkaasti, ja myös niiden poistuminen elimistöstä sapen kautta on häiriintynyt. Seerumin sitosteroli- ja kampesterolipitoisuudet sekä myös näiden kasvisterolien tyydyttyneiden muotojen sitostanolin ja kampestanolin pitoi-5 suudet ovat selvästi kohonneet. Tyydyttyneiden stanolien suurentuneet pitoisuudet johtuvat todennäköisesti niiden normaalia tehokkaammasta endogeenisesta synteesistä eivätkä tavallista tehokkaammasta imeytymisestä (10, 27). Hoitamattomana sitosterolemia johtaa jo nuorena ksantomatoosiin ja sepelvaltimotautiin. Ravinnosta normaalisti saatavaa kasvisterolimäärää suurempien kasvisterolimää-10 rien nauttiminen saattaa johtaa tätä sairautta potevilla ihmisillä vakaviin seurauksiin.

Lees ja Lees (25) tutkivat kolmen eri sitosterolivalmisteen vaikutuksia plasman lipidi- ja lipoproteiinipitoisuuksiin. Yksi tutkituista valmisteista oli kaupallinen Cytel-15 Iin (Eli Lilly Co., USA), joka sisälsi 60-65 % sitosterolia ja 35-40 % muita stero-leita, pääasiassa kampesterolia. Päiväannos (keskimäärin 18 g) nautittiin kolmena annoksena. Plasman kokonaiskolesteroliarvo putosi keskimäärin 10,5 % ja LDL-kolesteroliarvo putosi 15 %. Kun normaalisti plasmassa tavataan vain erittäin pieniä määriä kasvisteroleja kampesteroli mukaan lukien (10, 33), tutkimuksessa 20 plasman kampesterolipitoisuus vaihteli koehenkilöillä välillä 4-21 mg/dl (25). Tulosten tarkastelussa tutkijat totesivat painokkaasti, että koska kampesterolin mahdollista aterogeenisuutta ei tarkkaan tunneta, ei runsaasti kampesterolia sisältävän sitosterolivalmisteen, kuten kokeessa käytetyn Cytellin-valmisteen, käyttöä voi suositella.

; 25

Lisäksi Lees ym. (26) tutkivat soijaöljystä ja mäntyöljystä peräisin olevien kasvisterolien tehokkuutta veren kolesterolin vähentäjänä. Tutkimuksessa käytettiin kummankin kasvisterolin kahta eri olomuotoa eli suspensiota ja jauhetta. Soijasterolin koostumus oli 60-65 % sitosterolia ja 35 % kampesterolia. Keskimääräinen päivit-30 täinen steroliannos, 18 grammaa (päiväannoksen koon vaihteluväli 9-24 g), nau-·· tittiin kolmena yhtä suurena annoksena. Tutkimuksessa käytetty mäntyöljysteroli- valmiste sisälsi vain noin 5 % kampesterolia. Molempien mäntyöljysterolivalmis-teiden (suspensio ja jauhe) kolmen gramman päiväannoksen vaikutus tutkittiin, minkä lisäksi mäntyöljysterolisuspension vaikutus tutkittiin kuuden gramman päi-35 väännöksenä.

Soijasteroli molemmissa olomuodoissa ja jauhemuodossa oleva mäntyöljysteroli vähensivät plasman kolesterolipitoisuutta keskimäärin 12 % (26). Tässäkin tutki- 3 1070 Ib muksessa todettiin kuitenkin jo aikaisemmin havaittu kampesterolin suhteellisen tehokas imeytyminen. Viidellä tutkitulla koehenkilöllä plasman kampesterolipitoi-suudet vaihtelivat 5 ja 21 mg/dl välillä (keskiarvo 16 mg/dl). Siksi tutkijat eivät tämänkään tutkimuksen perusteella suositelleet soijasterolin käyttöä kolesterolia 5 alentavana aineena, vaikka sen kolesterolia vähentävä vaikutus todettiinkin tehokkaaksi. Päinvastoin he suosittelivat, että farmaseuttisen kasvisterolivalmisteen tulisi sisältää mahdollisimman vähän kampesterolia ja mahdollisimman paljon sitosterolia. Kahden yllä lainatun tutkimuksen perusteella voidaankin tehdä johtopäätös, jonka mukaan kasviöljypohjaisten sterolien, kuten soijasterolin käyttö ei 10 ole missään tapauksessa ollut suositeltavaa.

Tyydyttyneitä kasvisteroleja, kuten sitostanolia ja kampestanolia, on useimmissa kasviöljyissä vain hyvin pieniä määriä. Mäntyöljyn steroleista kuitenkin 10-15 % on sitostanolia, sitosterolin tyydyttynyttä muotoa. Sitostanolia voidaan myös val-15 mistaa hydraamalla sitosterolin kaksoissidos. Viimeisimmissä sekä koe-eläimillä että ihmisillä tehdyissä kokeissa sitostanoli on todettu sitosterolia tehokkaammaksi kolesterolin vähentäjäksi (8, 16, 17, 18, 19, 36).

Sitostanolin eräs lisäetu on se, ettei se käytännöllisesti katsoen imeydy lainkaan. 20 Useissa tutkimuksissa (esim. 9, 16, 17, 21) on osoitettu, että sitostanoli on käytännössä imeytymätön, kun pieni määrä (< 5 %) sitosterolia, sitostanolin tyydytty-mätöntä muotoa, voi imeytyä (33). Vastaavasti kolestanolin, kolesterolin tyydyttyneen muodon, on in vitro -kokeessa (6) - Amstrong ja Carey - osoitettu olevan hydrofobisempi ja huonommin imeytyvä kuin kolesteroli.

: : 25 • · ·

Kun sitostanolia valmistetaan hydraamalla yleisimmistä kasvisterolien lähteistä, muodostuu samalla myös toista tyydyttynyttä kasvisterolia eli kampestanolia kam-pesterolista. Tämän stanolin imeytyvyydestä ja mahdollisesta kolesterolin imeytymistä vähentävästä vaikutuksesta on viime aikoihin asti tiedetty vähän. Koska 30 edellä esitettyjen tietojen mukaan tyydyttyneet sterolit imeytyvät tyydyttymättömiä muotoja heikommin, voitaisiin olettaa, ettei kampestanoli imeydy käytännöllisesti katsoen lainkaan.

Eri kasvisterolien imeytyvyyden tutkimiseksi Heinemann ym. (20) vertasivat kole-35 sterolin imeytyvyyttä ihmisen ruoansulatuskanavasta eri kasvisterolien imeytyvyy-teen intestinal perfusion -tekniikalla. Tutkittavat kasvisterolit olivat kampesteroli, sitosteroli, stigmasteroli sekä myös sitostanoli ja kampestanoli pieninä määrinä. Tulokset osoittivat eri kasvisterolien imeytymistehokkuuden erilaiseksi. Keskimää- 10701ο 4 rin 4,2 % sitosterolista, 4,8 % stigmasterolista, 9,6 % kampesterolista ja 12,5 % kampestanolista imeytyi. Imeytymistehokkuudessa havaittiin myös suuria eroja 10 mieskoehenkilön välillä.

5 Näin ollen Heinemannin ym. (20) tutkimuksen mukaan kampestanoli imeytyi sen tyydyttymätöntä muotoa kampesterolia tehokkaammin, mikä on ristiriidassa aiempien tutkimusten perusteella tehdyn olettamuksen kanssa. Tyydyttyneiden steroli-enhan (sitostanoli, kolestanoli) on aiemmin todettu imeytyvän tyydyttymättömiä (sitosteroli, kolesteroli) heikommin. Syy ristiriitaiseen tulokseen ei ole selvä. Hei-10 nemann ym. (20) otaksuivat, että syy ristiriitaiseen tulokseen voisi olla siinä, että Amstrongin ja Careyn (6) tutkimuksissa käytettiin in vitro -olosuhteita ja että teoria, jonka mukaan hydrofobisuudella on suuri vaikutus misellaariseen sitoutumiseen ja/tai imeytyvyyteen, ei kenties pätisikään in vivo -olosuhteissa. Tämä selitys on kuitenkin ristiriidassa sen tosiasian kanssa, että useat tutkimukset, jotka ovat 15 osoittaneet sitostanolin sitosterolia heikomman imeytymisen, on tehty in vivo -olosuhteissa. Siten Heinemannin ym. (20) tulokset, jotka ovat ristiriidassa aikaisempien tulosten kanssa, jäävät ilman pitävää selitystä.

Sugano ym. (34) tutkivat maissisterolien (koostumus: 31 % kampesterolia, 4 % 20 stigmasterolia ja 65 % sitosterolia) ja maissiöljysteroliseosta hydraamalla saatujen maissistanolien (koostumus: 31 % kampestanolia ja 69 % sitostanolia) kolesterolia vähentävää vaikutusta rotilla kahdessa eri kokeessa. Sekä steroli että stanoii vähensivät plasman kolesterolia, kun niitä syötettiin 0,5-1 % pitoisuuksina ruokavaliossa ja kun ruokavalio sisälsi 1 % kolesterolia. Ensimmäisessä kokeessa ei 25 kasvisterolien ja kasvistanolien kolesterolia vähentävissä vaikutuksissa ollut merkittäviä eroja. Toisessa kokeessa käyttäen samoja ravintomääriä kasvistanolien plasman kolesterolia vähentävä vaikutus oli kuitenkin huomattavasti suurempi (statistisesti merkityksellinen p < 0,02) kuin kasvisterolien vaikutus. Lisäksi 1,0 % stanoleita ruokavaliossaan nauttineilla rotilla plasman kolesteroliarvot olivat mer-30 kitsevästi alhaisemmat (p < 0,02) kuin rotilla, jotka nauttivat kolesterolitonta ruokavaliota. Samaa vaikutusta ei havaittu rotilla, jotka saivat ruoassaan 1,0 % stero-lia,

Sugano ym. (34) eivät verranneet paljon sitostanolia ja vähän kampestanolia si-35 sältävän stanoliseoksen (mäntyöljypohjainen steroli) ja stanoliseoksen, jonka kampestanolipitoisuus on suhteellisesti suurempi (kasviöljypohjainen steroli) välisiä tehokkuuseroja kolesterolin vähentäjänä. He vertasivat tyydyttymättömän ste-' roliseoksen ja vastaavan tyydyttyneen stanoliseoksen välistä tehokkuuseroa ko- 10701 d 5 lesterolin vähentäjänä. Myöhemmät tämän tutkimusryhmän tutkimukset ovat kohdentuneet erityisesti sitostanolin kolesterolia vähentävään vaikutukseen tai sito-stanolin ja sitosterolin tehokkuuserojen vertailuun (21, 22, 23, 35). Itse asiassa eräässä myöhemmässä julkaisussa (23) tutkijat viittaavat edellä referoituun kasvi-5 stanolitutkimukseen (34) mainiten vain β-sitostanolin ja sitosterolin väliset tehokkuuserot kolesterolin vähentäjänä mainitsematta tyydyttyneiden sterolien (mukaan lukien kampestanoli) ja tyydyttymättömien sterolien välisiä tehokkuuseroja kolesterolin vähentäjänä. Edellä mainituissa myöhemmissä tutkimuksissa on käytetty hydrattujen mäntyöljysterolien koostumuksen omaavia steroliseoksia, joissa on 10 suuri sitostanolipitoisuus (> 90 %).

Miettinen ja Vanhanen (30) ovat osoittaneet, että sitostanolin rasvahappoesteri on tehokkaampi seerumin kolesterolitasojen vähentäjä kuin vapaa sitostanoli. Myöhemmät tutkimukset ovat myös osoittaneet, että päivittäisen ravinnon osana nau-15 tittu sitostanolin esteri on tehokas seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolin vähentäjä (13, 14, 15, 31, 37, 38). Stanoliestereiden käytön etu vapaaseen stano-liin verrattuna on myös se, että stanoliesterit ovat rasvaliukoisia ja siten helposti sisällytettävissä moniin erilaisiin elintarvikkeisiin ilman, että lopputuotteiden maku tai käyttöominaisuudet muuttuisivat. Sitostanolin rasvahappoestereiden valmistus-20 menetelmä sekä rasvaliukoisten stanoliestereiden käyttö elintarvikkeissa on esitetty US-patentissa 5 502 045 (2), joka on sisällytetty tähän viitteenä.

Straub (3) ehdottaa tyydyttyneiden etanolien (sitostanoli, klionastanoli, 22,23-di-hydrobrassicastanoii, kampestanoli ja näiden seokset) käyttöä elintarvikkeen li-25 säaineseoksen valmistusmenetelmässä, jossa stanolit sekoitetaan syötäväksi kel-paavaan liukoiseen aineeseen, tehokkaaseen määrään sopivaa antioksidanttia ja tehokkaaseen määrään sopivaa dispergoivaa ainetta. Tällaiset elintarvikelisäaineet on tarkoitettu käytettäväksi kolesterolia sisältävissä ruoissa ja juomissa, esim. lihassa, kananmunissa ja maitotuotteissa vähentämässä kolesterolin imey-30 tyrnistä näistä elintarvikkeista. Patentissa ei kuitenkaan esitetä minkäänlaista da-- taa, joka kuvaisi kliinisiä vaikutuksia tai vaikutuksia dietaaristen sterolien imeyty miseen.

Eugster ym. (1) käsittelevät pienten sterolimäärien, niiden rasvahappoestereiden 35 ja glukosidien käyttöä kasvainten hoidossa. Eugsterin ym. esittämissä valmistusmenetelmissä käytetään vaarallisia kemiallisia reagensseja, kuten N.N'-karbo-nyyli-di-imidatsolia, tionyylikloridia, ja liuottimia, kuten tetrahydrofuraania, bent-seeniä, kloroformia tai dimetyyliformamidia. Eugster ym. kommentoivat näiden 6 107016 aineiden mahdollista käyttöä elintarvikkeina ja elintarvikkeiden lisäaineina, mutta eivät esittäneet mitään tuloksia aineiden kolesterolia vähentävästä vaikutuksesta tai mitään sellaista käyttöä koskevia patenttivaatimuksia. Eugsterin ym. patentista on vaikea saada selvää kuvaa siitä, miten lopputuote puhdistetaan, jotta saadaan 5 riittävän suuri määrä riittävän puhdasta steroliesteriä elintarvikkeiden aineosana käytettäväksi. Ainoat puhdistusprosessit, joihin viitataan, ovat ohutlevykromato-grafia (TLC) ja nestekromatografia (HPLC). Tästä syystä Eugsterin ym. patentissa mainittu valmistusmenetelmä rajautuu vain hyvin pieniin valmistusmääriin.

10 US-patentti 3 751 569 (4) käsittelee kasvisterolien rasvahappoestereiden lisäämistä ruokaöljyyn tavoitteena vähentää seerumin kolesterolitasoa ihmisellä. Mainittu patentti esittää vapaiden sterolien esteröintiin menetelmää, joka ei missään tapauksessa täytä ravinnossa käytettävän tuotteen valmistusvaatimuksia. Patentin mukaan esteröinti tehdään vapaan sterolin ja rasvahapon anhydridin välillä per-15 kloorihappoa katalyyttinä käyttäen. Katalyyttiä ja reagenssia ei voida hyväksyä elintarvikeprosesseissa käytettäviksi. Lisäksi mainittu patentti kattaa vain luontaisten kasvisterolien rasvahappoesterit. Saksalaisessa patentissa DE-22 48 921 (5) esitetty rasvoissa ja öljyissä esiintyvien sterolien esteröintimenetelmä käyttäen kemiallista vaihtoesteröintitekniikkaa täyttää elintarvikeprosesseille asetettavat 20 vaatimukset. Mainitussa patentissa vapaa steroli ja ylimäärä rasvahappoestereitä lisätään rasva- tai öljyseokseen, minkä jälkeen koko rasvaseos vaihtoesteröidään yleisesti tunnetulla vaihtoesteröintitekniikalla. Lopputuloksena syntyvässä rasva-seoksessa käytännössä kaikki vapaat sterolit ovat muuntuneet rasvahappoeste-reiksi. Tarkoituksena on suojata vapaita steroleja kasvi- ja eläinöljyissä niiden - 25 prosessoinnissa mahdollisesti tapahtuvilta muutoksilta.

Kampesterolin, joka on yksi yleisimmistä kasvisteroleista, on aikaisemmin osoitettu imeytyvän suhteellisen tehokkaasti. Siksi on suositeltu käytettävän vain sellaisia kasvisteroliseoksia, joiden kampesterolipitoisuudet ovat mahdollisimman 30 pienet. Käytännössä tämä on johtanut runsaasti sitosterolia sisältävien sterolise-osten, kuten mäntyöljypohjaisen sterolin, käyttöön.

• 4

Suurin osa etanoleilla tehdyistä tutkimuksista on keskittynyt vain sitostanoliin. Heinemannin ym. (20) tutkimus, joka osoitti kampesterolin tyydyttyneen muodon 35 kampestanolin imeytyvän tehokkaammin kuin kampesteroli tai sitosteroli (12,5 %, 9,6 % ja vastaavasti 4,2 %), on johtanut "konsensukseen", jonka mukaan "kohonneita" määriä kampestanolia sisältävät tyydyttyneet steroliseokset eivät ole turvallisia kampestanolin imeytymisen vuoksi. Selvä osoitus tästä on, että kaikki 7 10701b kliiniset stanoleilla (sitostanolilla) tehdyt tutkimukset on tehty stanoliseoksilla, joissa on korkea sitostanolipitoisuus ja matala kampestanolipitoisuus.

Useissa tutkimuksissa on osoitettu, että sitosterolin tyydyttynyt muoto sitostanoli 5 vähentää veren kolesterolitasoa tehokkaammin kuin vastaava tyydyttymätön sito-steroli (esim. 8, 17, 18, 19, 23, 36). Lisäksi tyydyttyneet sterolit imeytyvät hyvin rajoitetusti, mikä tekee niiden käytöstä turvallisen keinon vähentää veren kolesterolia väestötasolla. Tyydyttymättömistä steroleista nimenomaan kampesteroli imeytyy niin tehokkaasti, että on vahvasti perusteltua kehottaa välttämään steroliseok-10 siä (kuten kasviöljypohjaisia steroliseoksia), joiden kampesterolipitoisuus on kohonnut (25, 26).

Näin ollen on esiintynyt vahvaa ennakkoluuloisuutta kohtuullisten kampestanoli-määrien käyttöä kohtaan elintarvikkeisiin lisättävänä aineena. Tämä on selkeästi 15 rajoittanut kasvisteroleita sisältävien raaka-aineiden käyttöä sellaisiin raaka-aineisiin, jotka sisältävät suhteellisen pieniä määriä kampesterolia ja sen tyydyttynyttä muotoa, kampestanolia.

Tämä keksintö koskee kasvistanolirasvahappoestereiden seoksia, joissa sitosta-20 nolirasvahappoesteri on pääkomponentti, mutta jotka sisältävät myös huomattavan määrän kampestanolirasvahappoesteriä veren seerumin kolesterolitason alentamiseksi.

Keksintö koskee lisäksi pääkomponenttinaan sitostanolirasvahappoesteriä sisäl-. 25 tävien, mutta myös huomattavan määrän kampestanolirasvahappoesteriä sisältä vien stanoliseosten rasvahappoestereiden käyttöä elintarvikkeissa ravinnon osana tarkoituksena vähentää veren seerumin kolesterolia.

Tämän keksinnön tarkoitus on laajentaa kasvipohjaisten raaka-aineiden valikoi-30 maa valmistettaessa elintarvikkeisiin, erityisesti ruokaöljyihin ja -rasvoihin sekä ' .· rasvaa sisältäviin elintarvikkeisiin käytettävää veren seerumin kolesterolin vähen tämiseen tähtäävää ainetta. Keksintö mahdollistaa sen, että raaka-aineena näihin tarkoituksiin käytetään kasviöljyjä ja -rasvoja, jotka sisältävät sitosterolin lisäksi myös huomattavan määrän kampesterolia.

Sopivia raaka-aineita, joita voidaan käyttää keksinnön tarkoittamien seosten valmistamiseen, ovat esimerkiksi maissi, soija ja rypsi, mutta myös muita kasveja, joiden kasvisteroleista suuri osa on kampesterolia, voidaan käyttää.

35 10701ο 8 Tämän keksinnön käsittämää uutta aineseosta, joka on esteröidyssä muodossa, voidaan sisällyttää elintarvikkeisiin, kuten ruokaöljyihin, margariineihin, voihin, majoneesiin, salaatinkastikkeisiin, shorteningeihin, juustoihin (mukaan lukien tuorejuustot ja kypsät juustot) ja muihin rasvaa sisältäviin elintarvikkeisiin.

5 Tämän keksinnön mukaista aineseosta voidaan myös nauttia sellaisenaan.

Tämän keksinnön mukaan kasvistanolirasvahappoestereiden seos sisältää pää-komponenttinsa sitostanolirasvahappoesterin lisäksi myös huomattavan määrän, 10 vähintään 20 %, kampestanolirasvahappoesteriä.

Tämän seoksen suositeltava kampestanolirasvahappoesteripitoisuus on 20-40 % ja parhaimmillaan 25-35 %, esimerkiksi noin 30 % kampestanolirasvahappoesteriä.

15

Keksinnön mukainen seos sisältää edullisesti 50-80 % sitostanolirasvahappoes-teriä.

Keksinnön mukaisesti on myös aikaansaatu elintarvike, joka sisältää sitostanoli-20 rasvahappoesteriä käsittävän kasvistanolirasvahappoestereiden seoksen ja joka tehokkaasti alentaa seerumin kolesterolitasoja, joka seos lisäksi sisältää huomattavan määrän kampestanoli rasvahappoesteriä, jolloin kampestanolirasvahappo-esterin ja sitostanolirasvahappoesterin välinen painosuhde on 2:8 - 4:6. Mainittu painosuhde on edullisesti 2:8 - 3,5:6,5.

25

Selityksessä ja patenttivaatimuksissa kaikki prosentit ovat painoprosentteja, ellei erikseen toisin mainita. Tässä selityksessä suluissa olevat numerot viittaavat oheisessa lähdeluettelossa lueteltuihin julkaisuihin.

30 Saadut tutkimustulokset osoittavat yllättäen ja vastoin vallitsevaa käsitystä, että .· kasvistanolirasvahappoestereiden seos, jonka pääkomponentti on sitostanoliras- vahappoesteri, mutta joka sisältää myös huomattavan määrän kampestanolirasvahappoesteriä, on vähintään yhtä tehokas kuin stanolirasvahappoesteriseos, joka sisältää yli 90 % sitostanolirasvahappoesteriä ja vähäisen määrän kampesta-35 nolirasvahappoesteriä. Tämä osoittaa, että kampestanoli on vähintään yhtä tehokas kolesterolin imeytymisen rajoittaja kuin sitostanoli. Lisäksi veren seerumin ste-rolianalyysit osoittavat, että kampestanolin pitoisuus veren seerumissa on noin 40 % pienempi kuin sitostanolin pitoisuus, joten kampestanoli on käytännöllisesti 10701ο 9 katsoen imeytymätön. Siten stanolirasvahappoesteriseosta, jonka pääkomponentti on sitostanolirasvahappoesteri, mutta joka sisältää huomattavan määrän kampe-1 stanolirasvahappoesteriä, on pidettävä vähintään yhtä turvallisena kuin tavan omaista mäntysterolipohjaista stanolirasvahappoesteriseosta. Nämä tutkimustu-5 lokset ovat voimakkaasti ristiriidassa nykyisen kampestanolia huomattavia määriä sisältävien stanoliseosten turvallisuutta ja tehokkuutta koskevan mielipiteen kanssa (katso 20, 27, 34).

US-patentti 5 502 045 (2) osoitti, että sitostanolin rasvahappoesteri on tehok-10 kaampi veren kolesterolin vähentäjä kuin vapaa sitostanoli. Myöhemmät tutkimukset ovat selkeästi osoittaneet rasvaliukoista sitostanolin rasvahapoesteriä sisältävän margariinin kolesterolia vähentävän tehon (esim. 31).

Stanolin rasvahappoestereiden käyttö vapaan stanolin sijaan on ratkaisevaa aja-15 telien niiden laajaa käyttöä erilaisissa rasvaa sisältävissä elintarvikkeissa. Vain stanolien rasvahappoesterit liukenevat ravinnon rasvoihin ja öljyihin tarpeeksi suurina määrinä, jotta voidaan saavuttaa sekä dietaarisen että binaarisen kolesterolin imeytymistä ruoansulatuskanavasta tehokkaasti rajoittava määrä.

20 Stanoliestereiden liukoisuus ravinnon rasvoihin ja öljyihin on jopa 35-40 %, kun vapaiden sterolien liukoisuus ravinnon rasvoihin ja öljyihin on enintään vain 2 pai-no-% 21 °C:n lämpötilassa (24). Erilaisia liuottavia, dispergoivia tai pinta-aktiivisia aineita käyttämällä voidaan saada suurempi määrä vapaita steroleita liukenemaan ravinnon rasvoihin ja öljyihin, mutta näidenkään aineiden käyttö ei takaa rasvaliu-25 koisuutta. Edellä mainittujen aineiden käyttöä on tavallisesti rajoitettu tai käyttö on jopa estetty lainsäädännöllä. Lisäksi 1 % vapaata sterolia muuttaa rasvan tai öljyn fysikaalisia ominaisuuksia ja aiheuttaa muutoksia tuotteen rakenteeseen ja fysikaalisiin ominaisuuksiin. Näin ei käy kun käytetään stanolien rasvahappoesterei-tä, sillä rasvaseoksen fysikaalisia ominaisuuksia voidaan helposti muuttaa muun-30 tamalla seoksen rasvahappokoostumusta.

* ·

On selvää, että stanolien rasvahappoestereitä voidaan helposti käyttää muidenkin elintarvikkeiden kuin tässä keksinnössä kuvattujen margariinien ja levitteiden valmistukseen. US-patentissa 5 502 045 on annettu esimerkkejä mahdollisista muis-35 ta käyttökohteista. Asiantuntijoille on kuitenkin selvää, että stanolien rasvahappoestereitä voidaan lisätä hyvinkin erilaisiin elintarvikkeisiin, erityisesti rasvaa sisältäviin elintarvikkeisiin.

10701s 10

Sterolien rasvahappoestereiden valmistukseen on esitetty useita valmistusmenetelmiä. Lähes kaikkien näiden menetelmien haittapuolena on se, että niissä käytetään reagensseja, joiden käyttöä elintarvikkeen makroravinteen valmistuksessa käytettävän aineen valmistusprosessissa ei voida hyväksyä. Myrkyllisten reagens-5 sien, kuten tionyylikloridin tai rasvahappojen anhydridijohdannaisten käyttö on yleistä.

Parempi menetelmä stanolirasvahappoestereiden valmistukseen on kuvattu US-patentissa 5 502 045 (2, joka on sisällytetty tähän viitteenä). Tämä menetelmä peto rustuu ravintorasva- ja -öljyteollisuudessa yleisesti käytettyyn vaihtoesteröintime-netelmään. Tämä esteröintimenetelmä poikkeaa edukseen aikaisemmista menetelmistä siinä, ettei muita aineita kuin vapaata stanolia, rasvahappoesteriä tai ras-vahappoesteriseosta ja vaihtoesteröintikatalyyttiä, kuten natriumetylaattia, tarvita. Menetelmän tärkeä piirre on se, että rasvahappoesteriä käytetään ylimäärin, ja se 15 toimii liuottimena liuottaen stanolin käytetyissä olosuhteissa (vakuumi 5-15 mmHg). Reaktion tuloksena syntyy rasvahappoestereitä ja stanolirasvahappo-estereitä. Stanolirasvahappoesterit voidaan helposti konsentroida lähes puhtaaksi stanolirasvahappoesteriksi vakuumitislauksella, jolloin ylimäärä rasvahappoestereitä poistuu. Vaihtoehtoisesti seos voidaan lisätä sellaisenaan lopulliseen rasva-20 seokseen ennen hajunpoistovaiheen suorittamista.

Luonnossa stanoleita esiintyy pieniä määriä esimerkiksi vehnässä, rukiissa, maississa ja ruisvehnässä, joten päivittäinen ravintomme sisältää pieniä määriä stanoleita (11, 14). Stanoleita voidaan helposti valmistaa hydraamalla luonnollisia 25 steroliseoksia. Alkuvuonna 1996 markkinoilla oli saatavana elintarvikekäyttöön » sellaisenaan soveltuvia riittävän puhtaita steroliseoksia (sterolipitoisuus > 98 %) vain mäntyöljypohjaisena. Suhteellisen suuria määriä kampesterolia sisältäviä kasvisteroleja, kuten kasviöljypohjaisia steroliseoksia, on esimerkiksi saatavana kasviöljytislettä raaka-aineena käyttävän tokoferolituotannon sivutuotteena. Pro-30 sessin tuloksena saatavat kasvisterolit voidaan muuntaa stanoleiksi aikaisemmin ’ tunnetuilla hydraustekniikoilla kuten Pd/C-katalyytin ja orgaanisen liuottimen käyt töön perustuvalla tekniikalla (7, joka on sisällytetty tähän viitteenä). Asiantuntijalle on selvää, että hydrauksessa voidaan käyttää useita erilaisia Pd-katalyyttejä ja liuottimia. Optimiolosuhteissa tehtynä hydrauksessa vain pieni osa tyydyttymättö-35 mistä steroleista jää tyydyttymättä samalla kun tyypillisten dehydroksyloituneiden sivutuotteiden staanien ja eteenien muodostuminen jää vähäiseksi (< 1,5 %).

10701ο 11 Tämä keksintö vertaa asiantuntijoiden keskuudessa yleisesti turvallisimpana ja kolesterolin imeytymisen estäjistä tehokkaimpana ja siten seerumin kolesterolipitoisuutta tehokkaimmin vähentävänä pidettyä suuren sitostanolirasvahappoeste-ripitoisuuden sisältävää stanolirasvahappoesteriseosta toiseen stanolirasvahap-5 poesteriseokseen, joka sisältää huomattavan määrän kampestanolirasvahappo-esteriä. Tässä selityksessä on ensimmäistä kertaa raportoitu kasviöljypohjaisten stanolien seerumin kolesterolitasoa vähentävä vaikutus ihmisellä. Tämä keksintö osoittaa ensimmäisenä, että stanolirasvahappoesteriseos, joka sisältää huomattavan määrän kampestanolirasvahappoesteriä (yli 20 % ja parhaimmillaan noin 10 30 %), on vähintään yhtä tehokas kuin stanolirasvahappoesteriseokset, joissa si- tostanolirasvahappoesterin pitoisuus on korkea. Lisäksi tämän tutkimuksen tulokset osoittavat selvästi, että päinvastoin kuin Heinemann ym. (20) ovat raportoineet, kampestanoli on käytännöllisesti katsoen imeytymätön.

15 Kliiniset tutkimukset

Kasviöljystanoliesteri- ja mäntyöljystanoliesterimargariinien veren kolesterolia vähentävän vaikutuksen tutkimiseksi järjestettiin 5 viikon kaksoissokko (cross over) -tutkimus käyttäen 2 viikon pituista ns. wash-out-jaksoa. Tutkimuksen koejärjestely 20 on esitetty seuraavassa.

Interventiotutkimuksen koejärjestely:

Numerot 1-6 osoittavat kotiruokavaliolla (1, 2), ensimmäisen interventiojakson jäl-25 keen (3, 4) ja toisen interventiojakson jälkeen (5, 6) otettuja verinäytteitä. VS = kasviöljypohjainen stanoliesterimargariini, TS = mäntyöljypohjainen stanoliesteri-margariini.

« ♦ « 10701d 12

Ryhmä 1 (n=12) ----1—2------------------3—4n ,------------------------5--6

VS VS

5 n /

Ryhmä 2 (n=12) κ s

/ N

-----1—2----------------3—4' N------------------------5--6

TS TS

10

Koti- 5 viikon 2 viikon 5 viikon ruokavalio interventio- wash-out- interventio- 15 jakso jakso jakso

Kaksikymmentäneljä vapaaehtoista tervettä naista, joilla oli kohtuullisesti koholla oleva veren kolesteroliarvo (keskiarvo 6,12 ± 0,16 mol/l), nautti päivittäin satun-naisjärjestyksessä ruokavalionsa osana noin 25 grammaa (250 g rasia/10 päivää) 20 koemargariinia. Seerumin lipidit (kokonaiskolesteroli, LDL-kolesteroli, HDL-kole-steroli ja triglyseridit) sekä seerumin sterolipitoisuudet mitattiin kotiruokavalion aikana ja kunkin koejakson lopussa. Verinäytteet otettiin kahdesti noin viikon välein normaalisti noudatetun kotiruokavalion aikana sekä molempien koemargariinijak-sojen lopussa. Seerumin lipidiarvot on esitetty alla taulukossa 1.

25

Taulukko 1. Seerumin lipidiarvot (mmol/l, keskiarvo±SE) kotiruokavalion aikana ja viiden viikon käsittelyn jälkeen käyttäen kasviöljystanoliesterimargariinia (VS) ja mäntyöljystanoliesterimargariinia (TS), (n=24).

30 _

Kotiruokavalio VS TS

« w 35 Kokonaiskolesteroli 6,12 ±0,16 5,77 + 0,18* 5,95 ±0,23 LDL-kolesteroli 4,03 ±0,15 3,60 ±0,17* 3,76 ±0,19* HDL-kolesteroli 1,54 ±0,09 1,62 ±0,09* 1,63 ±0,10*

Triglyseridit 1,22 ±0,13 1,20 ±0,11 1,26 ±0,15 40 * p<0,05 tai vähemmän 10701s 13

Kumpaakin koemargariinia käyttämällä saatiin aikaan myönteiset muutokset seerumin lipidiarvoissa. Seerumin LDL-kolesteroliarvot pienenivät ja HDL-kolesteroli-arvot kohosivat tilastollisesti merkitsevästi (p<0,05 tai vähemmän). Lisäksi kasvi-öljypohjainen stanoliesteri johti myös kokonaiskolesterolin tilastollisesti merkitse-5 vään vähenemiseen. Kokonais- ja LDL-kolesteroliarvot pienenivät enemmän kas-viöljypohjaisella stanoliesterillä täydennettyä margariinia käytettäessä verrattuna mäntyöljypohjaisella stanoliesterillä täydennettyyn margariiniin. Triglyseriditasois-sa ei tapahtunut muutoksia. Saadut seerumin lipiditulokset osoittavat, että kasvi-ö Ijy stanol i esteri 11 ä täydennetty margariini, jonka stanoleista huomattava osa on 10 kampestanolia, voi olla jopa tehokkaampi kuin mäntyöljystanoliesterillä täydennetty margariini. Mäntyöljystanoliesterillä täydennetyn margariinin on aikaisemmissa tutkimuksissa osoitettu vähentävän seerumin kolesteroliarvoja tehokkaasti (14, 15, 31). Siten tämän tutkimuksen pohjalta kasviöljypohjaisten stanolien voidaan todeta olevan vähintään yhtä tehokkaita seerumin kolesterolin määrän vä-15 hentäjiä kuin mäntypohjaisten stanolienkin.

Seerumin sterolipitoisuudet määritettiin neste-kaasukromatografisesti aiemmin julkaistun menetelmän mukaan (29, joka sisällytetään tähän viitteenä). Kunkin jakson lopussa otettujen kahden verinäytteen tuloksista laskettiin keskiarvo. Tulokset koskien keskimääräisiä seerumin kasvisterolipitoisuuksia koti ruoka väli on 20 aikana ja kunkin koejakson jälkeen sekä keskimääräiset havaitut muutokset näissä pitoisuuksissa on esitetty seuraavissa taulukoissa 2 ja 3.

Taulukko 2. Seerumin kasvisterolipitoisuudet (pg/dl, keskiarvo±SE) kotiruokavali-on aikana ja jokaisen interventiojakson jälkeen (n=24). VS = kasviöljypohjainen 25 stanoliesterimargariini, TS = mäntyöljypohjainen stanoliesterimargariini.

Kotiruokavalio VS TS

30 _ - ·

Kampestanoli 47 ± 2 58 ± 3 47 ± 3

Sitostanoli 94 ± 3 92 ± 5 96 ± 5

Kampesteroli 472 ± 37 337 ± 25 350 ± 28 35 Sitosteroli 277 ±17 198 ±12 227 ±15 * p<0,05 tai alle 10701 is 14

Taulukko 3. Seerumin kasvisterolipitoisuuksien (pg/dl) keskimääräiset muutokset (± SE), (n=24). VS = kasviöljypohjainen stanoliesterimargariini, TS = mäntyöljy-pohjainen stanoliesterimargariini, HD = kotiruokavalio.

5 _ Δ (VS - HD) Δ (TS - HD) Δ (VS - TS) 10 Kampestanoli 11 ±2* 0±2 11 ±2*

Sitostanoli -2 ±3 2±4 -4±4

Kampesteroli -134 ±19* -122 ±21* -12 ±13

Sitosteroli -80 ± 11 * -51 ± 12* -29 ± 8* 15 * p<0,05 tai alle

Molemmat koemargariinit vähensivät selvästi seerumin kampesteroli- ja sitostero-lipitoisuuksia. Seerumin kampesterolipitoisuuden tiedetään kuvaavan kolesterolin imeytymistä ihmisen ohutsuolesta (29, 39). Mitä pienempi seerumin kampesteroli-20 pitoisuus sitä pienempi osuus ruoansulatuskanavassa olevasta kolesterolista imeytyy.

Seerumin kampesterolitasojen selvä pieneneminen (25-28 %) koejaksojen aikana osoittaa, että molemmat stanoliesterimargariinit vähensivät kolesterolin imeyty-25 mistä ruoansulatuskanavasta. Lisäksi seerumin sitostanolipitoisuuksissa ei havait-• · tu eroja. Kasviöljypohjaisella stanoliesterillä täydennettyä margariinia käytettäessä seerumin keskimääräinen kampestanolipitoisuus oli merkitsevästi korkeampi kuin kotiruokavaliota tai mäntypohjaisella stanoliesterillä täydennettyä margariinia nautittaessa. Kampestanolin absoluuttinen pitoisuus seerumissa oli kuitenkin vain 30 noin 63 % sitostanolin pitoisuudesta, ja tämän perusteella kampestanolia voidaan pitää olennaisesti imeytymättömänä. Tämä kampestanolin alhainen seerumin pi-:* toisuus osoittaa selvästi kampestanolin imeytyvän vain hyvin rajallisesti. Tulos on ristiriidassa Heinemannin ym. (20) esittämien tulosten kanssa. Koska runsaasti sitostanolia sisältävien stanoliseosten käyttöä pidetään ihmiselle turvallisena, 35 myös huomattavia määriä kampestanolia sisältävien stanoliseosten käyttöä on pidettävä samoin turvallisena sen perusteella, että kampestanoli on sitostanolin tapaan käytännöllisesti katsoen imeytymätön.

10701d 15

Keksinnön stanoliesteriseoksen ja kliinisessä tutkimuksessa käytettyjen margariinien valmistus on kuvattu yksityiskohtaisesti seuraavissa suoritusesimerkeissä.

Esimerkki 1. Steroliseosten hydraaminen 5

Kaupallinen kasviöljytisleestä saatu steroliseos (koostumus: brassicasteroli 2,7 %, kampesteroli 26,7 %, stigmasteroli 18,4 %, sitosteroli 49,1 % ja sitostanoli 2,9 %) hydrattiin pilot-mittakaavan reaktorissa (25 I). 26 g kuitumaista Pd katalyyttiä (Smop-20; Pd-pitoisuus 10 paino-%, Smoptech, Turku, Suomi), 26 g tislattua vettä 10 katalyytin aktivoimiseen sekä 11,7 kg propanolia syötettiin reaktoriin. Reaktori huuhdeltiin typellä ja katalyytin aktivointi toteutettiin vetykaasussa 1 baarin paineessa ja 65 °C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan. Aktivoinnin jälkeen seos jäähdytettiin 40 °C:n lämpötilaan, minkä jälkeen joukkoon lisättiin 1,3 kg steroliseosta.

15 Propanoli-steroliseos lämmitettiin typpiatmosfäärissä 65 °C:n lämpötilaan, minkä jälkeen typpi korvattiin vedyllä. Tämän jälkeen suoritettiin perusteellinen huuhtelu vedyllä, ja hydraus suoritetiin 1 baarin vetypaineessa. Normaali muuntumisaika on noin 120 minuuttia. Muuntumista voidaan helposti seurata ottamalla näyte, joka analysoidaan nestekromatografisesti (HPLC).

20

Vetypainetta pudotettiin, ja reaktori huuhdeltiin typellä. Kuitumainen katalyytti suodatettiin pois typpipaineella. Propanoli-stanoliseos jätettiin kiteytymään yli yön 10 °C:n lämpötilaan, minkä jälkeen stanolikiteet suodatettiin vakuumissa ja kiteet pestiin puolella kilolla (0,5 kg) kylmää propanolia. Syntynyt stanoliseos kuivattiin 25 60 °C:n lämpötilassa vakuumikuivauskaapissa. Saanto oli 75 % ja syntyneen sta- • < noliseoksen koostumus oli kapillaarikaasukromatografisen analyysin mukaan: kampesteroli 0,2 %, kampestanoli 28,9 %, stigmasteroli 0,1 %, sitosteroli 0,2 %, sitostanoli 70,1 %. On syytä mainita, että brassicasteroli muuttuu hydrattaesssa 24B-metyylikolestanoliksi, kampestanolin epimeeriksi. Mutta koska nämä yhdis-30 teet näkyvät samassa piikissä, kun pitoisuudet määritetään tavanomaisilla kapil-- .v laarikaasukromatogafisilla menetelmillä, jotka eivät pysty erottamaan niitä toisis taan kiraalisuuden perusteella, kyseinen yhdiste lasketaan tavallisesti kampe-stanoliin kuuluvaksi. Alkuperäisen steroliseoksen koostumuksen perusteella 24β-metyylikolestanolin pitoisuuden tulisi olla 2,7 %.

10701ο 16

Esimerkki 2. Stanolirasvahappoestereiden valmistus

Stanolirasvahappoesteriseos valmistettiin pilot-mittakaavassa. Kuusi kiloa stanole-ja, jotka saatiin yhdistämällä useiden esimerkissä 1 mainitulla tavalla hydrattujen 5 stanolivalmistuserien tuotos, kuivattiin yli yön 60 °C:n lämpötilassa, ja esteröitiin rypsiöljyn (LEAR) metyyliesteriseoksen (8,6 kg) kanssa. Käytettyjen stanoliseos-ten sterolikoostumus oli seurava: kampesteroli 0,4 %, kampestanoli (+24β-metyylikolestanoli) 29,7 %, stigmasteroli 0,1 %, sitosteroli 0,4 % ja sitostanoli 68,0 %. Seoksen stanolipitoisuus oli 98,2 %. Esteröinti suoritettiin seuraavasti: 10

Stanolien ja rypsiöljyn (LEAR) rasvahappometyyliestereiden seos kuumennettiin reaktoriastiassa 90-120 °C:n lämpötilassa 5-15 mmHg:n vakuumissa. Tunnin kuivaamisen jälkeen 21 g Na-etylaattia lisättiin ja reaktio jatkui noin 2 tunnin ajan. Katalyytti tuhottiin lisäämällä 30 paino-% vettä 90°C:n lämpötilassa. Faasien 15 erotuksen jälkeen vesifaasi poistettiin ja suoritettiin toinen pesu. Vesifaasin erotuksen jälkeen öljyfaasi kuivattiin vakuumissa 95 °C:n lämpötilassa sekoittamalla nopeudella 200 kierrosta/minuutti (rpm). Stanoli-rasvahapposeos valkaistiin kevyesti 20 minuutin ajan 30 mmHg:n paineessa 110°C:n lämpötilassa valkaisumaan (1,0 %, Tonsil Optimum FF, Sudchemie, Saksa) avulla sekoittamalla 200 rpm. 20 Valkaisumaa suodatettiin pois. Tämän jälkeen syntynyt rasvahappometyyliestereiden ja stanolirasvahappoestereiden seos voidaan lisätä sellaisenaan rasva-seoksiin ennen hajunpoistoa tai ylimäärä metyyliestereitä voidaan tislata pois vakuumissa. Lisäksi seokselle voidaan suorittaa hajunpoisto, jolloin saadaan mauton stanolirasvahapposeos, jota voidaan käyttää sellaisenaan erilaisissa elintar-25 vikkeiden valmistusprosesseissa.

Esteröintiprosessin muuntumisprosentti on normaalisti yli 99 nopealla nestekro-matografialla (HPLC) mitattuna, ja saanto on luokkaa 95 %.

Esimerkki 3. Margariinien valmistus kliiniseen tutkimukseen ·; 3o

Tutkimusta varten valmistettiin 80 % rasvaa sisältäviä mäntyöljypohjaista stanoli-rasvahappoesteriä ja kasviöljypohjaista stanolirasvahappoesteriä sisältäviä margariineja. Valmistuslaitteisto oli Gestenberg & Agger 3x57 pilot-mittakaavan per-fektori. Mäntyöljypohjainen stanolirasvahappoesteri saatiin Benecol®-margariinin 35 (Raision Margariini, Suomi) normaalista tuotannosta. Rasvaseoksena käytettiin normaalia transrasvahapoista vapaata rasvaseosta (koostumus: 70 % juoksevaa rypsiöljyä (LEAR), 30 % ei-kovetettua vaihtoesteröityä kasvirasvaa), johon stanoli- 10701s 17 rasvahappoesteriseos lisättiin. Lopputuotteen stanolikoostumuksen osalta tähdättiin pitoisuuteen 12 g / 100 g, mikä margariinin 25 gramman päivittäisellä käyttömäärällä toisi ruokavalioon 3 grammaa stanoleja/päivä. Tuotteet valmistettiin seu-raavan reseptin mukaan: 5

Rasvaseos, joka sisältää stanolirasvahappoesterit 80 %

Vesi 19 %

Suola 0,5 %

Emulgointiaine Dimodan BP

10 Happamuudensäätöaineet Na-bikarbonaatti ja sitruunahappo Väriaine β-karoteeni Aromit

Margariinit pakattiin 250 gramman polypropeenirasioihin, jotka tiivistettiin ilmatii-15 viiksi alumiinifoliolla. Margariinien makuja rakenne vastasivat kaupallisia margariineja.

Mäntyöljypohjaisen stanolimargariinin stanolipitoisuus oli 12,7 g /100 g ja kasvi-öljypohjaisen stanolimargariinin stanolipitoisuus 12,6 g / 100 g. Näiden kahden 20 tuotteen sterolikoostumukset olivat seuraavat: Mäntyöljypohjainen Kasviöljypohjainen stanolimargariini stanolimargariini Brassicasteroli 0,3 % 0,4 %

Kampesteroli 2,2 % 2,4 % 25 Kampestanoli 7,5 % 27,6 %

Sitosteroli 7,4 % 4,2 %

Sitostanoli 82,5 % 63,8 %

Muut 0,1% 1,6% «· · 1β 10701ο Lähdeluettelo US-patenttiiulkaisut

Viite no.

1 Eugster C, Eugster C, Haldemann W, Rivara G. Sterols, their fatty acid esters and glucosides; processes for their preparation; spontaneously dispersible agents containing these compounds, and their use for treatment of tumors. 1993. US Patent No 5,270,041.

2 Miettinen TA, Vanhanen H, Wester I. Use of stanol fatty acid ester for reducing serum cholesterol level. 1996. US Patent No 5,502,045.

3 Straub CD. Stanols to reduce cholesterol absorption from foods and methods of preparation and use thereof. 1993. US Patent No 5,244,887.

4 Clear cooking and salad oils having hypocholesterolemic properties. 1973. US Patent No 3,751,569.

Muut patenttiasiakiriat 5 Baltes J, Merkle R. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus pflanzlichen und tierischen Olen bzw. Fetten und Fettsäurestemestern. German patent DE 22 48 921.

Muut julkaisut 6 Amstrong MJ, Carey MC. Thermodynamic and molecular determinants of sterol solubilities in bile salt micelles. J Lipid Res 1987; 28: 1144-1155.

7 Augustine RL, Reardon Jr. EJ 1969. The palladium catalyzed hydrogenation of cholesterol. Org Prep and Proced 1969; 1: 107-109.

10701s 19 8 Becker M, Staab D, Von Bergmann K. Treatment of severe familial hypercholesterolemia in childhood with sitosterol and sitostanol. J pediatr 1993;122:292-296.

9 Czubayko F, Beumers B, Lammsfuss S, Liitjohann D, von Bergmann K. A simplified micro-method for quantification of fecal excretion of neutral and acidic sterols for outpatient studies in humans. J Lipid Res 1991; 32: 1861-1867.

10 Dayal B, Tnt GS, Batta AK, Speck J, Khachadurian AK, Shefer S, Salen G. Identification of 5-a stanols in patients with sitosterolemia and xanthomatosis: stereochemistry of the protonolysis of steroidal organobo-ranes. Steroids 1982; 40: 233-243.

11 Dutta PC, Appelqvist l_A. Saturated sterols (stanols) in unhydroge-nadted and hydrogenated edible vegetable oils and in cereal lipids. J Sci Food Agric 1996; 71: 383-391.

12 Grundy SM, Mok HYI. Effects of low dose phytosterols on cholesterol absorption in man. Teoksessa: Greten H (Toim.) Lipoprotein metabolism. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1976: 112-118.

13 Gylling H, Miettinen TA, Serum cholesterol lowering by dietary sitostanol is associated with reduced absorption and synthesis of cholesterol : and decreased transport of LDL apoprotein B in men with type II diabe- tes. Teoksessa: Gotto Jr AM, Mancini M, Richter WO, Schwandt P (Toim.) Treatment of severe dyslipoproteinemia in the prevention of coronary heart disease. 4th Int Symp Munich 1992, Karger, Basel, 1993: 57-59.

14 Gylling H, Miettinen TA. Serum cholesterol and cholesterol and lipoprotein metabolism in hypercholesterolemic NIDDM patients before and during sitostanol ester-margarine treatment. Diabetologia 1994; 37: 773-780.

15 Gylling H, Siimes MA, Miettinen TA. Sitostanol ester margarine in dietary treatment of children with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res 1995; 36: 1807-1912.

10701b 20 16 Hassan AS, Rampone AJ. Intestinal absorption and lymphatic transport of cholesterol and β-sitostanol in the rat. J Lipid Res 1979; 20: 646-653.

17 Heinemann T, Leiss O, von Bergmann K. Effect of low-dose sitostanol on serum cholesterol in patients with hypercholesterolemia. Atherosclerosis 1986; 61: 219-223.

18 Heinemann T, Pietruck B, Kullack-Ublick G, von Bergmann K. Comparison of sitosterol and sitostanol on inhibition of intestinal cholesterol absorption. Agents Actions (Suppl) 1988; 26: 117-122.

19 Heinemann T, Kullak-Ublick G-A, Pietruck B, von Bergmann K. Mechanisms of action of plant sterols on inhibition of cholesterol absorption. Eur J Clin Pharmacol 1991; 40: 59-63.

20 Heinemann T, Axtmann G, von Bergmann K. Comparison of intestinal absorption of cholesterol with different plant sterols in man. Eur J Clin Invest 1993; 23: 827-831.

21 Ikeda I, Sugano M. Comparison of absorption and metabolism of β-si-tosterol and β-sitostanol in rats. Atherosclerosis 1978; 30: 227-237.

22 Ikeda I, Tanabe Y, Sugano M. Effects of sitosterol and sitostanol on micellar solubility of cholesterol. J Nutr Sei Vitaminoi 1989; 35: 361-369.

· % 23 Ikeda I, Kawasaki A, Samezima K, Sugano M. Antihypercholesterole-mic activity of β-sitostanol in rabbits. J Nutr Sei Vitaminoi 1981; 27: 243-251.

-. 24 Jandacek RJ, Webb MR, Mattson FH. Effect of an aqueous phase on the solubility of cholesterol in an oil phase. J Lipid Res 1977; 18: 203-210.

25 Lees RS, Lees AM. Effects of sitosterol therapy on plasma lipid and li poprotein concentrations. In: Greten H (Toim.) Lipoprotein metabolism. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1976: 119-124.

21 107015 26 Lees AM, Mok HYI, Lees RS, McCluskey MA, Grundy SM. Plant sterols as cholesterol-lowering agents: clinical trials in patients with hypercholesterolemia and studies of sterol balance. Atherosclerosis 1977; 28: 325-338.

27 Ling WH, Jones PJH. Minireview dietary phytosterols: A review of metabolism, benefits and side effects. Life Sciences 1995; 57: 195-206.

28 Mattson FH, Grundy SM, Crouse JR. Optimizing the effect of plant sterols on cholesterol absorption in man. Am J Clin Nutr 1982; 35: 697-700.

29 Miettinen TA, Koivisto P. Non-cholesterol sterols and bile acid production in hypercholesterolaemic patients with ileal bypass. Teoksessa: Paumgarter G, Stiehl A, Gerok W (Toim.). Bile acid and concentration in health and disease. MTP Press, Boston 1983: 183-187.

30 Miettinen TA, Vanhanen H. Dietary sitostanol related to absorption, synthesis and serum level of cholesterol in different apolipoprotein E phenotypes. Aterosclerosis 1994; 105: 217-226.

31 Miettinen TA, Puska P, Gylling H, Vanhanen H, Vartiainen E. Reduction of serum cholesterol with sitostanol-ester margarine in a mildly hy-percholesterolemic population. New Engl J Med 1995; 333:1308-1312.

32 Poliak OJ. Effect of plant sterols on serum lipids and atherosclerosis. Pharmac Ther 1985; 31: 177-208.

33 Salen G, Ahrens Jr. EH, Grundy SM. Metabolism of β-sitosterol in man. J Clin Invest 1970, 49: 952-967. J Nutr Sei Vitaminoi 1981; 27: 243-251.

* ~ * 34 Sugano M, Kamo F, Ikeda l, Morioka H. Lipid-lowering activity of phytostanols in rats. Atherosclerosis 1976; 24: 301-309.

35 Sugano M, Morioka H, Ikeda I. A comparison of hypocholesterolemic activity of β-sitosterol and β-sitostanol in rats. J Nutr 1977; 107: 2011-2019.

10701b 22 36 Vanhanen HT, Miettinen TA. Effects of unsaturated and saturated dietary plant sterols on their serum contents. Clin Chim Acta 1992; 205: 97-107.

37 Vanhanen HT, Blomqvist S, Enholm C, Hyvönen M, Jauhiainen M, Torsti la I, Miettinen TA. Serum cholesterol, cholesterol precursors, and plant sterols in hypercholesterolemic subjects with different apoE phenotypes during dietary sitostanol ester treatment. J Lipid Res 1993; 34: 1535-1544.

38 Vanhanen HT, Kajander J, Lehtovirta H, Miettinen TA. Serum levels, absorption efficiency, faecal elimination and synthesis of cholesterol during increasing doses of dietary sitostanol esters in hypercholestero-laemic subjects. Clin Sci 1994; 87: 61-67.

39 Tiivis RS, Miettinen TA. Serum plant sterols and their relation to cholesterol absorption. Am J Clin Nutr 1986; 43: 92-97.

j

Claims (8)

10701ο

1. Kasvistanolirasvahappoestereiden seos, joka sisältää sitostanolirasvahap-poesterin, käytettäväksi seerumin kolesterolitasoa alentavana aineena, tunnettu siitä, että seos lisäksi sisältää vähintään 20 % kampestanolirasvahappoesteriä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen seos, tunnettu siitä, että se sisältää 20- 40. kampestanolirasvahappoesteriä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen seos, tunnettu siitä, että se sisältää 25-35 %, esimerkiksi noin 30 %, kampestanolirasvahappoesteriä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen seos, tunnettu siitä, että se sisältö tää 50-80 % sitostanolirasvahappoesteriä.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen seoksen käyttö ruokavalion osana, esimerkiksi rasvaa sisältävissä elintarvikkeissa.

6. Elintarvike, joka sisältää sitostanolirasvahappoesteriä käsittävän kasvistano-lirasvahappoestereiden seoksen ja joka tehokkaasti alentaa seerumin kolesteroli- 15 tasoja, tunnettu siitä, että seos lisäksi sisältää huomattavan määrän kampestanolirasvahappoesteriä, jolloin kampestanolirasvahappoesterin ja sitostanolirasva-happoesterin välinen painosuhde on 2:8 - 4:6.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen elintarvike, tunnettu siitä, että mainittu painosuhde on 2:8 - 3,5:6,5.

8. Sellaisen kasvisteroliseoksen käyttö, joka sitosterolin lisäksi sisältää huo mattavan määrän kampesterolia, raaka-aineena valmistettaessa jonkin patenttivaatimuksista 1-4, 6 ja 7 mukainen seerumin kolesterolitasoa alentava seos tai elintarvike. · · 10701b