RU2469742C2

RU2469742C2 - Снижение уровней/активности аргиназы

Info

Publication number: RU2469742C2
Application number: RU2009106041/15A
Authority: RU
Inventors: Гарольд Х. ШМИТЦ; Кэтрин Л. КВИК-УРИБЕ; Хаген ШРЕТЕР
Original assignee: Марс, Инкорпорейтед; Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2012-12-20
Also published as: US20080021097A1; CN101516407A; CN101516407B; RU2009106041A; JP2010500973A; US20110257119A1; RU2012137517A; EP2438915A1; AU2007275561B2; IL196480A0; WO2008011173A3; AU2007275561A1; EP2068941A4; WO2008011173A2; CA2657915A1; US20120015053A1; EP2068941A2

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для снижения уровней и/или активности аргиназы у субъекта. Предложена композиция, включающая эффективное количество, по меньшей мере, одного соединения, выбранного из эпикатехина, катехина, их фармацевтически приемлемой соли и производного, причем производное не является производным галловой кислоты; и полимерного соединения, имеющего формулу A_n, его фармацевтически приемлемой соли. Также предложен способ снижения уровней и/или активности аргиназы. Группа изобретений обеспечивает снижение уровней и/или активности аргиназы у здоровых субъектов за счет снижения экспрессии гена аргиназы, используя продукт, содержащий какао. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 1 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим определенные полифенольные соединения, и способам лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающим введение нуждающемуся в этом субъекту определенных полифенольных соединений, описанных в данном документе.

Предшествующий уровень техники

Аргиназа представляет собой фермент, который катализирует гидролиз аргинина до орнитина и мочевины. Орнитин представляет собой биосинтетический предшественник аминокислоты пролина, который активизирует ремоделирование коллагена и тканей, и полиаминов, которые участвуют в клеточной пролиферации. Аргинин также является субстратом для синтазы оксида азота (NO-синтазы, NOS), которая катализирует синтез оксида азота (NO) и цитруллина из аргинина. Таким образом, аргиназа конкурирует с NO-синтазой за общий субстрат.

Известно, что существуют, по меньшей мере, два изофермента аргиназы млекопитающих (типы I и II). Аргиназа типа I локализуется в цитозоле и, главным образом, в печени, но также экспрессируется во многих других типах клеток, в то время как аргиназа типа II является митохондриальной и экспрессируется повсеместно в небольших количествах в экстрапеченочных тканях. Как аргиназа типа I, так и аргиназа типа II могут индуцироваться разнообразными цитокинами и другими агентами.

В последнее время было показано, что повышенные уровни/активность аргиназы связаны с некоторыми патологическими состояниями у человека. Следовательно, в данной области существует потребность в способах модуляции/снижения уровней/активности аргиназы.

К настоящему моменту заявителями обнаружено, что соединения, перечисленные в данном описании, являются эффективными для снижения экспрессии гена аргиназы (т.е. транкрипционного уровня) и/или для снижения активности аргиназы (т.е. пост-транскрипционного уровня). Следовательно, соединения, перечисленные в данном описании, являются полезными при лечении состояний, ассоциированных с повышенными уровнями/активностью аргиназы.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, продуктам и способам лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, определенных полифенольных соединений, описанных в данном документе.

В одном аспекте изобретение относится к композиции, такой как пища (включая пищу для домашних животных), пищевая добавка, диетическая добавка или фармацевтический продукт, включающей соединение по данному изобретению. Упакованные продукты, содержащие вышеописанные композиции и этикетку и/или инструкцию по применению, как описано в данном документе, например, для снижения уровней и/или активности аргиназы, входят в объем данного изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединений по данному изобретению.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу снижения уровней и/или активности аргиназы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединений по данному изобретению.

Краткое описание рисунков

На фигуре 1 представлены результаты анализа с помощью ПЦР в реальном времени, показывающие, что флаванолы снижают экспрессию мРНК аргиназы-2 в эндотелиальных клетках человека. Столбцы представляют среднее значение для трех отдельных экспериментов ± СО (стандартное отклонение). Каждый эксперимент был выполнен трижды независимо. *p<0,05 по сравнению с контрольным растворителем.

На фигуре 2 показано, что флаванольные метаболиты и (-)-эпикатехин снижают активность аргиназы-2 в эндотелиальных клетках человека. Добавление ингибитора аргиназы L-валина [10 мМ] или TNF-α + IL-1β (каждый в количестве 500 Ед/мл), которые снижают экспрессию аргиназы, применяли в качестве положительных контролей. Столбцы представляют среднее значение четырех отдельных экспериментов ± СО; *p<0,05 по сравнению с контрольным растворителем, **p<0,01 по сравнению с контрольным растворителем.

На фигуре 3 показано, что какао с высоким содержанием флаванола снижает активность аргиназы в эритроцитах у здоровых людей (n=10); представлены моменты времени до, через 2 и через 24 часа после приема 200 мл какао-напитка с высоким содержанием флаванолов или соответствующего контроля с низким содержанием флаванола. Черные линии представляют средние значения ± стандартная ошибка через 0 и 24 часа, серые квадраты представляют индивидуальные значения. *p<0,05.

Подробное описание

Все патенты, заявки на патент и ссылки, цитированные в этом описании, включены здесь путем ссылки. В случае какого-либо противоречия, настоящее раскрытие является определяющим.

Изобретение относится к композициям, продуктам и способам лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, определенных полифенольных соединений, описанных в данном документе. Соединения для применения в настоящем изобретении включают определенные флаванолы (флаван-3-олы), процианидины или их фармацевтически приемлемые соли или производные. Такие соединения, если они природного происхождения, могут быть включены в композицию в форме какао компонента, например, очищенных от шелухи зерен какао или их фрагментов, тертого какао, частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао, экстракта какао или его фракции.

Используемый в данном описании термин «флаванол» или «флаван-3-ол» относится к мономеру следующей формулы:

Термин «процианидин» относится к олигомерному соединению, составленному из мономерных единиц формулы, показанной выше.

Термин «какао компонент» относится к компоненту, полученному из какао-бобов, например, очищенным от шелухи зернам какао и их фрагментам, тертому какао, частично или полностью обезжиренному сухому веществу какао (например, жмых или порошок), экстракту какао, содержащему флаванол и/или процианидин, или его фракции.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к флаванолу (например, (-)-эпикатехину и (+)-катехину) и к композиции, содержащей эффективное количество флаванола (например, (-)-эпикатехина и (+)-катехина), или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные, причем (в некоторых вариантах осуществления) флаванольное производное не является производным галловой кислоты). Производные могут быть получены, как описано ниже.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению и композиции, содержащей эффективное количество соединения, имеющего следующую формулу A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n означает целое число от 2 до 18;

каждый из R и X имеет или α, или β стереохимию;

R означает OH или O-сахар;

заместители C-4, C-6 и C-8 представляют собой X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит в положении C-4, C-6 или C-8;

когда любой из C-4, C-6 или C-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z независимо представляют собой водород или сахар; и

сахар необязательно замещен фенольной группой в любом положении, например, посредством сложноэфирной связи.

Мономерные единицы формулы A_n могут быть связаны посредством связей 4α→6; 4β→6; 4α→8; и/или 4β→8. Сахар предпочтительно представляет собой моносахарид или дисахарид. Сахар может быть выбран из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, рамнозы, ксилозы и арабинозы. Фенольный фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из кофеиновой, коричной, кумаровой, феруловой, галловой, гидроксибензойной и синаповой кислот. Производные процианидина могут включать сложные эфиры, такие как сложные эфиры галловой кислоты; соединения, модифицированные сахаридной группой, такой как моно- или дисахаридная группа (например, β-D-глюкоза), глюкуронидированные и метилированные производные и продукты окисления. В некоторых вариантах осуществления сложноэфирные производные не являются сложными эфирами галловой кислоты. Продукты окисления могут быть получены, как раскрыто в патенте США №5554645, релевантные части которого включены в данное описание путем ссылки. Сложные эфиры, например, сложные эфиры галловой кислоты, могут быть получены с использованием известных реакций этерификации, например, как описано в патенте США №6420572, раскрытие которого включено в данный документ путем ссылки. Метилированные производные, такие как 3'O-метил-, 4'O-метил- и 3'O, 4'O-диметил-производные могут быть получены, например, как описано в публикациях Cren-Olive et al., 2002, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 821-830, и Donovan et al, Journal of Chromatography B, 726 (1999) 277-283, раскрытие которых включено в данный документ путем ссылки. Глюкуронидированные продукты могут быть получены, как описано в публикации Yu et al, "A novel and effective procedure for the preparation of glucuronides," Organic Letters, 2(16) (2000) 2539-41, и как описано в публикации Spencer et al, "Contrasting influences of glucuronidation and O-methylation of epicatechin on hydrogen peroxide-induced cell death in neurons and fibroblasts," Free Radical Biology and Medicine 31(9) (2001) 1139-46, которые включены в данный документ путем ссылки. Глюкуронидирование может происходить в положениях 7, 5 и/или 3'. Примеры глюкуронидированных продуктов включают 4'-O-метил-эпикатехин-O-β-D-глюкуронид (например, 4'-О-метил-эпикатехин-7-O-β-D-глюкуронид), 3'-O-метил-эпикатехин-O-β-D-глюкуронид (например, 3'-O-метил-эпикатехин-5/7-O-β-D-глюкурониды) и эпикатехин-O-β-D-глюкуронид (например, эпикатехин-7-O-β-D-глюкуронид). Следует заметить, что это описание применяется ко всем формулам, перечисленным в данном документе.

В другом варианте осуществления изобретение относится к соединению и композиции, содержащей эффективное количество соединения, имеющего формулу A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные),

где

n означает целое число от 2 до 18;

R означает OH;

заместители C-4, C-6 и C-8 представляют собой X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит в положении C-4, C-6 и C-8; и

когда любой из C-4, C-6 или C-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z представляют собой водород.

Примеры соединений, пригодных для продуктов и способов по изобретению, включают соединения формулы A_n, описанные в данном документе, где целое число n имеет значения от 3 до 18; от 2 до 12; от 3 до 12; от 2 до 5; от 4 до 12; от 5 до 12; от 4 до 10; или от 5 до 10. В некоторых вариантах осуществления целое число n имеет значения от 2 до 4, например, 2 или 3. Это описание применяется в данном документе для любого соединения формулы A_n.

Способы применения

Изобретение относится к способам лечения состояния, ассоциированного с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы у субъекта, нуждающегося в этом.

Используемый в данном описании термин «лечение» или «воздействие» относится к получению желаемого фармакологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения состояния/заболевания/расстройства или их симптома, предотвращения возникновения заболевания или симптома заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано (например, включая заболевания, которые могут быть ассоциированы с или вызваны первичным заболеванием), и/или может быть терапевтическим с точки зрения замедления прогрессирования состояния/заболевания/расстройства (т.е. остановки его развития, вызывающей регрессию заболевания), увеличения выживаемости, снижения риска смерти, снижения риска неблагоприятных эффектов, свойственных заболеванию, и/или индуцирования измеряемого снижения смертности, ассоциированной с состоянием/заболеванием/расстройством.

Используемый в данном описании термин «лечение состояния, ассоциированного с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы» относится к лечению состояния/расстройства/заболевания, ассоциированного с повышением уровней и/или активности аргиназы у млекопитающего, в частности, у человека, или животного, являющегося объектом ветеринарии. Примерами таких состояний/заболеваний/расстройств являются: гемолитические заболевания (например, серповидно-клеточная анемия, талассемии, ассоциированная с гемолитической болезнью эндотелиальная дисфункция, ассоциированная с гемолитической болезнью легочная гипертензия); воспаление (например, замедленное заживление ран, послеоперационная рана, хроническая венозная язва на нижних конечностях, хроническая венозная недостаточность, периодонтит, артрит); иммунные нарушения/заболевания (например, гранулематоз Вегенера, артрит, послеоперационная иммунная дисфункция, например, у онкологических пациентов); респираторные/легочные заболевания (например, астма и гиперактивность дыхательных путей, ассоциированная с астмой/патологией дыхательной системы, муковисцидоз, утолщение стенок дыхательных путей и ремоделирование дыхательных путей); сосудистые/сердечно-сосудистые/сердечно-легочные заболевания (например, эссенциальная/первичная гипертензия, ассоциированная с повышенным уровнем аргиназы, легочная гипертензия, например, легочная артериальная гипертензия, эндотелиальная дисфункция, ассоциированная с повышенным уровнем аргиназы, стенокардия, старение сосудистой системы, включая связанную с возрастом дисфункцию миокарда и сердечную недостаточность); микроциркуляторные нарушения (например, повреждение, связанное с ишемией/реперфузией, например, в микрососудистом русле сердца, дисфункция коронарных артериол, сепсис); дисфункция в работе почек (например, гломерулонефрит, почечная недостаточность, например, у субъекта, склонного к повышенной сосудистой резистентности и/или повышенному кровяному давлению); состояния, ассоциированные с диабетом (например, нарушения микроциркуляции при диабете, например, при диабетической нейропатии, диабетической нефропатии/ренальной дисфункции, диабетическая язва стопы, включая каллюсообразование вокруг язвы, замедление заживления ран при диабете, микроциркуляторная недостаточность при болезни периферических сосудов при диабете, ассоциированная с диабетом сексуальная дисфункция); рак (например, груди, колоректальный, простаты); дерматологические заболевания (например, псориаз); неврологические заболевания (например, депрессия); сексуальная дисфункция (например, эректильная дисфункция, подобное болезни Пейрони заболевание пениса, женская сексуальная дисфункция).

Изобретение относится к лечению субъектов, страдающих от, или подверженных риску, возникновения состояний, перечисленных выше, с использованием соединений, описанных в данном документе.

Специалист в данной области выберет известные способы измерения уровней (т.е. экспрессии мРНК, уровней фермента (белка))/активности (т.е. ферментативной активности) аргиназы, например, способы, описанные в примере.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способ лечения состояния, ассоциированного с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающий введение млекопитающему (например, человеку) или животному - объекту ветеринарии, нуждающемуся в этом, эффективного количества флаванола, такого как эпикатехин или катехин (например, (-)-эпикатехин или (+)-катехин), или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные, в которых флаванольное производное не является производным галловой кислоты).

Термин «животное - объект ветеринарии» относится к любому животному, обслуживаемому или находящемуся под наблюдением ветеринара, и включает животных-компаньонов (домашних животных) и домашний скот, например, кошку, собаку и лошадь.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет способ лечения состояния, ассоциированного с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающий введение млекопитающему (например, человеку) или животному - объекту ветеринарии, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей эффективное количество соединения, имеющего следующую формулу A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n означает целое число от 2 до 18;

R означает OH или О-сахар;

Например, вышеописанный способ может включать применение соединения A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные), в котором R представляет собой OH и, когда любой из C-4, C-6 или C-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z представляют собой водород. Примеры подходящих сахаров являются такими же, как описано выше. Примеры фенольных групп являются такими же, как описано выше. Примеры производных являются такими же, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет способ лечения состояния, ассоциированного с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, включающий введение млекопитающему (например, человеку) или животному - объекту ветеринарии, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей эффективное количество соединения, имеющего формулу A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n означает целое число от 2 до 18;

R означает OH;

Примеры соединений, пригодных для продуктов и в способах по изобретению, включают соединения, описанные в данном документе, в которых целое число n имеет значения от 3 до 18; от 2 до 12; от 3 до 12; от 2 до 5; от 4 до 12; от 5 до 12; от 4 до 10; или от 5 до 10. В некоторых вариантах осуществления целое число n имеет значения от 2 до 4, например, 2 или 3. Это описание применяется в данном документе к любому соединению формулы A_n.

Примеры субъектов, нуждающихся в лечении состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, будут очевидны специалистам в данной области. Примерами таких субъектов являются субъекты, страдающие от или подверженные риску развития: гемолитических заболеваний (например, серповидно-клеточной анемии, талассемий, ассоциированной с гемолитической болезнью эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с гемолитической болезнью легочной гипертензии); воспаления (например, замедленного заживления ран, послеоперационной раны, хронической венозной язвы на нижних конечностях, хронической венозной недостаточности, периодонтита, артрита); иммунных нарушений/заболеваний (например, гранулематоза Вегенера, артрита, послеоперационной иммунной дисфункции, например, у онкологических пациентов); респираторных/легочных заболеваний (например, астмы и гиперактивности дыхательных путей, ассоциированной с астмой/патологией дыхательной системы, муковисцидоза, утолщения стенок дыхательных путей и ремоделирования дыхательных путей); сосудистых/сердечно-сосудистых/сердечно-легочных заболеваний (например, эссенциальной/первичной гипертензии, ассоциированной с повышенным уровнем аргиназы, легочной гипертензии, например, легочной артериальной гипертензии, эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с повышенным уровнем аргиназы, стенокардии, старения сосудистой системы, включая связанную с возрастом дисфункцию миокарда и сердечную недостаточность); микроциркуляторных нарушений (например, повреждения, связанного с ишемией/реперфузией, например, в микрососудистом русле сердца, дисфункции коронарных артериол, сепсиса); дисфункции в работе почек (например, гломерулонефрита, почечной недостаточности, например, у субъекта, склонного к повышенной сосудистой резистентности и/или повышенному кровяному давлению); состояний, ассоциированных с диабетом (например, нарушений микроциркуляции при диабете, например, при диабетической нейропатии, диабетической нефропатии/ренальной дисфункции, диабетической язвы стопы, включая каллюсообразование вокруг язвы, замедления заживления ран при диабете, микроциркуляторной недостаточности при болезни периферических сосудов при диабете, ассоциированной с диабетом сексуальной дисфункции); рака (например, груди, колоректального, простаты); дерматологических заболеваний (например, псориаза); неврологических заболеваний (например, депрессии); сексуальных дисфункций (например, эректильной дисфункции, подобного болезни Пейрони заболевания пениса, женских сексуальных дисфункций).

Настоящие соединения могут быть введены перорально в форме какао компонента, например, очищенных от шелухи зерен какао или их фрагментов, тертого какао, частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао (например, какао-порошка), экстракта какао или его фракции, или могут быть добавлены независимо от какао компонентов. Какао компонент может быть получен таким образом, чтобы сохранялось содержание полифенолов какао (CP, ПК) (флаванолов и/или процианидинов).

В некоторых вариантах осуществления настоящие соединения можно вводить в комбинации с другими ингибиторами аргиназы и/или повышать чувствительность к другим ингибиторам аргиназы. Примеры ингибиторов аргиназы включают: (S)-(2-борэтил)-L-цистеин (BEC), 2(S)-амино-6-боргексановую кислоту (ABH), N^G-гидрокси-L-аргинин (NOHA), L-2-амино-(4-(2'-гидроксигуанидино)масляную кислоту (nor-NOHA) и DL-альфа-дифторметилорнитин (DFMO) и их фармацевтические соли. Эти дополнительные ингибиторы аргиназы можно вводить местно или перорально.

Таким образом, следующие виды применения входят в объем изобретения. Флаванол или его фармацевтически приемлемую соль или производное (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные, где (в некоторых вариантах осуществления) флаванольное производное не является производным галловой кислоты), как определено выше, применяют для получения лекарственного средства, пищевого продукта, нутрицевтика или диетической добавки для лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы, или субъектов, перечисленных выше. Соединение формулы A_n или его фармацевтически приемлемую соль или производное (включая продукты окисления, сложные эфиры, метилированные производные и глюкуронидированные производные), как определено в данном документе, применяют для получения лекарственного средства, пищевого продукта, нутрицевтика или диетической добавки для лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы.

Эффективное количество может быть определено специалистом в данной области с использованием рекомендаций, представленных в данном описании, и общих знаний в данной области, например, принимая во внимание такие факторы, как вводимая доза, основа, частота приема, путь введения и т.д. Например, эффективное количество может быть таким, чтобы добиться физиологически релевантной концентрации в организме млекопитающего. Такая физиологически релевантная концентрация может составлять, по меньшей мере, 20 наномоль (нМ), предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 100 нМ и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 500 нМ. В одном из вариантов осуществления достигается концентрация, по меньшей мере, приблизительно один микромоль в крови млекопитающего, такого как человек. Соединения могут быть определены в крови субъекта с использованием способов, описанных, например, в публикации Schroeter H. et al, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:1024-1029 (см. примеры ниже). Соединения, определенные в данном описании, могут быть введены в дозе от приблизительно 35 мг/день, 40 мг/день или 50 мг/день (например, до приблизительно 1000 мг/день) или от приблизительно 75 мг/день (например, до приблизительно 1000 мг/день), или от приблизительно 100-150 мг/день (например, до приблизительно 900 мг/день), или от приблизительно 300 мг/день (например, до приблизительно 500 мг/день). Однако могут быть использованы количества более высокие, чем приведенные в примере выше, поскольку верхняя граница количественного диапазона не является ограничивающим фактором. Количества могут быть определены, как описано в публикации Adamson, G.E. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47 (10) 4184-4188.

Введение может быть продолжено по схеме, т.е. в течение эффективного периода времени, например, ежедневно, ежемесячно, два раза в месяц, дважды в год, ежегодно или по какой-либо другой схеме, как определено врачом-специалистом, в течение такого периода времени, как это необходимо. Введение может быть продолжено, по меньшей мере, в течение периода времени, необходимого для снижения уровней и/или активности аргиназы и/или достижения улучшения состояний у субъектов, перечисленных выше. Композицию можно вводить ежедневно, предпочтительно два или три раза в день, например, утром и вечером, для поддержания уровней эффективных соединений в организме млекопитающего. Для получения наиболее полезных результатов композицию можно вводить в течение, по меньшей мере, 7 дней или, по меньшей мере, 14 дней, или, по меньшей мере, 30 дней, или, по меньшей мере, 45 дней, или, по меньшей мере, 60 дней, или, по меньшей мере, 90 дней. Эти схемы введения можно при необходимости периодически повторять. Композиция может также быть полезной при однократном введении, причем эффекты наблюдаются в течение часов или дней, например, при пероральном введении, или более быстро при внутривенном введении.

Композиции и готовые формы

Соединения по изобретению могут быть введены в виде пищи (включая пищу для домашних животных), пищевой добавки или диетической добавки или фармацевтического препарата.

Используемый в данном описании термин «пища» означает продукт, содержащий белки, углеводы и/или жиры, которые используются в организме для поддержания роста, восстановления и жизненных процессов и для снабжения энергией. Пища может также содержать добавочные вещества, например, минералы, витамины и приправы. См. Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10th Edition, 1993. Термин пища включает напиток, приспособленный для потребления человеком или животным. Используемый в данном описании термин «пищевая добавка» определен FDA (Управлением по контролю за продуктами и лекарствами) в 21 C.F.R. 170.3(e)(1) и включает прямые и косвенные добавки. Используемый в данном описании термин «диетическая добавка» означает продукт (не являющийся табачным изделием), предназначенный для дополнения диеты, который производит или содержит один или несколько из следующих диетических ингредиентов: витамины, минералы, травы или другие растительные компоненты, аминокислоты, диетические вещества, используемые человеком для дополнения рациона путем повышения общего дневного потребления, или концентраты, метаболиты, составляющие, экстракты или комбинации этих ингредиентов. Используемый в данном описании термин «фармацевтический препарат» означает лекарственное средство. См. Merriam-Webster's Collegiate Dictionary 10th Edition, 1993. Фармацевтический препарат может также называться лекарством. Вышеописанные композиции могут быть получены, как это известно в данной области.

Композиции могут содержать носитель, разбавитель или эксципиент. В зависимости от цели предназначения, носитель, разбавитель или эксципиент могут быть выбраны таким образом, чтобы они были подходящими для использования человеком или животным, для пищи, добавок, диетических добавок или фармацевтического применения. Композиция может, необязательно, содержать дополнительный ингибитор аргиназы. Также, в зависимости от применения, специалист в данной области может выбрать степень чистоты соединения по данному изобретению. Например, при использовании для получения фармацевтических лекарственных форм, соединение должно быть настолько чистым, насколько это возможно с коммерческой точки зрения, тогда как в процессе приготовления пищи, добавки или диетической добавки можно использовать менее чистые соединения или смеси соединений (например, растительные экстракты).

Соединение по данному изобретению может быть «выделенным и очищенным», т.е. оно может быть отделено от соединений, с которыми оно встречается в природе (например, когда соединение имеет природное происхождение), или оно может быть получено синтетическим путем, так что, в любом случае, уровень загрязняющих соединений и/или примесей существенно не влияет или не уменьшает эффективность соединения. Например, «выделенный и очищенный димер В2» отделен от димера В5, с которым он может встречаться в природе (например, в какао-бобах), до такой степени, которая достигается за счет коммерчески доступных, практически осуществимых методов очистки и отделения. Такие соединения являются особенно подходящими для фармацевтических областей применения.

Соединение может также быть менее чистым, т.е. «по существу чистым», т.е. оно может иметь самую высокую степень однородности, достижимую посредством доступных технологий очистки, выделения и/или синтеза, но не должно быть отделено от похожих соединений. Используемый в данном описании термин «похожие соединения» означает соединения, имеющие одинаковую степень полимеризации. Например, «по существу чистый димер» относится к смеси димеров (например, В2 и В5, как это происходило бы во фракции экстракта какао). Несмотря на то что они менее пригодны для фармацевтического применения, такие «по существу чистые» соединения могут быть полезными для пищевых продуктов, пищевых добавок и диетических добавок.

В некоторых вариантах осуществления соединение по данному изобретению является чистым, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99%. Такие соединения являются особенно подходящими для фармацевтического применения.

Фармацевтические препараты, содержащие соединения по данному изобретению, необязательно в сочетании с другим ингибитором аргиназы, можно вводить перорально. Используемый в данном описании термин «пероральное введение» включает введение через рот и включает подъязычное и трансбуккальное введение. Специалист в данной области сможет определить подходящий способ введения для максимального улучшения доставки соединения по данному изобретению. Таким образом, лекарственные формы, приспособленные для каждого типа введения через рот, входят в объем изобретения и включают твердые, жидкие и полутвердые лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы, желатиновые капсулы (гель-капсулы), нерасфасованные или в виде стандартных доз порошки или гранулы, эмульсии, суспензии, пасты или желе. Лекарственные формы с замедленным высвобождением также входят в объем изобретения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители или эксципиенты, как правило, известны в данной области и могут быть быстро определены специалистом в данной области. Таблетка, например, может содержать эффективное количество соединения по данному изобретению и необязательно носитель, такой как сорбит, лактоза, целлюлоза или дикальция фосфат.

Пищевые продукты, содержащие соединения, описанные в данном документе, и необязательно другой ингибитор аргиназы, могут быть приспособлены для применения человеком или животным - объектом ветеринарии и включают корма для домашних животных. Пищевые продукты могут быть отличными от кондитерских изделий, например, напитками (например, напиток со вкусом какао). Кондитерское изделие, такое как стандартизованный по идентичности (SOI) и нестандартизованный (не SOI) шоколад, такой как молочный, сладкий или полусладкий шоколад, включая темный шоколад, шоколад с низким содержанием жира и леденец, который может представлять собой леденец, покрытый шоколадом, также входят в объем изобретения. Другие примеры включают выпечку (например, шоколадное пирожное, выпеченный снэк, печенье, бисквит), приправу, батончик мюсли, жевательные ириски, заменитель пищи, пасту, сироп, порошковую смесь для напитка, напиток со вкусом шоколада или какао, пудинг, рисовый кекс, рисовую смесь, пряный соус и тому подобное. При необходимости пищевые продукты могут иметь вкус шоколада или какао. Пищевые продукты могут представлять собой шоколадные и леденцовые батончики, такие как батончики мюсли, содержащие орехи, например, арахис, грецкий орех, миндаль и лесной орех. Пища предназначена для доставки эффективного количества соединений, описанных в данном документе.

Соединения для применения в настоящем изобретении могут быть природного происхождения, например, полученными из какао-бобов или другого природного источника, известного специалистам в данной области, или получены синтетическим путем. Специалист в данной области может выбрать натуральный или синтетический полифенол, основываясь на применении и/или доступности или стоимости.

Соединения могут быть включены в композицию в форме какао компонента. Например, соединение(я) может быть включено в композицию в форме какао ингредиента, например, тертое какао входит в состав шоколада, или может быть добавлено независимо от какао ингредиентов, например, в виде экстракта, фракции экстракта, выделенного или очищенного индивидуального соединения, объединенных фракций экстракта или синтетически полученного соединения. Термин «какао ингредиент» относится к веществу, содержащему какао в твердом виде, полученному из очищенных от шелухи зерен какао, такому как тертое какао и частично или полностью обезжиренное твердое какао (например, брикет или порошок). Экстракция и очистка может быть проведена, как описано в патентах США №№5554645 и 6670390, Romanczyk et al., и патенте США №6627232, Hammerstone et al., каждый из которых включен в данное описание путем ссылки.

Флаванолы и/или процианидины какао могут быть представлены в композиции по изобретению какао ингредиентами, содержащими эти соединения, или путем включения шоколада, который может быть молочным, сладким или полусладким и предпочтительно является темным шоколадом, и шоколадом с низким содержанием жиров. Какао ингредиенты могут быть получены с использованием традиционных методик переработки какао, но предпочтительно с использованием способа, описанного в патенте США №6015913, Kealey et al. Альтернативно, для повышения уровня полифенолов какао можно использовать тертое какао и какао в твердом виде, полученные из очищенных от шелухи зерен какао, имеющих фактор ферментации 275 или менее. Эти ингредиенты имеют содержание полифенола какао, которое выше, чем может быть получено с использованием традиционных способов переработки какао (например, путем обжаривания) и полностью ферментированных зерен. Шоколад может быть получен с использованием традиционных методик из ингредиентов, описанных выше, или с использованием улучшенного способа сохранения полифенолов какао в процессе получения шоколада, как описано в международной заявке на патент №PCT/US99/05414, опубликованной как WO 99/45788 и ее эквивалент в США, патенте США №6194020, релевантные части которых включены в данное описание путем ссылки. Шоколад, полученный при помощи, по меньшей мере, одного из следующих нетрадиционных способов, называется в данном описании «шоколад, имеющий сохраненное количество полифенолов какао»: (i) получение какао ингредиентов из недостаточно ферментированных или неферментированных зерен какао; (ii) сохранение полифенола какао в течение процесса получения какао ингредиента и (iii) сохранение полифенола какао в течение процесса получения шоколада. Такие нетрадиционные способы могут быть использованы для получения других, содержащих какао компонент продуктов (пищевых продуктов, например, напитков, диетических добавок), предназначенных содержать повышенные уровни флаванолов и/или процианидинов.

Синтетические процианидины также могут быть использованы и получены способами, известными в данной области, и как описано, например, в патентах США №№6420572; 6156912; и 6864377, релевантные части каждого из которых включены в данное описание путем ссылки.

Дневное эффективное количество соединения по изобретению может быть представлено в виде единой порции в случае пищи, или в виде единой дозы в случае фармацевтического препарата или диетической добавки. Например, кондитерское изделие (например, шоколад) может содержать, по меньшей мере, приблизительно 100 мг/порция (например, 150-200, 200-400 мг/порция).

Диетическая добавка, содержащая соединения по данному изобретению и необязательно другой ингибитор аргиназы, может быть получена с использованием способов, известных в данной области, и может содержать, например, нутриент, такой как дикальция фосфат, магния стеарат, кальция нитрат, витамины и минералы.

Дополнительно в объем изобретения входит готовое изделие, такое как упакованный продукт, содержащий композицию по изобретению (например, пищевой продукт, диетическую добавку, фармацевтический препарат) и этикетку, указывающую наличие или повышенное содержание соединений по данному изобретению, или руководство по применению композиции для лечения состояний, ассоциированных с повышенными уровнями и/или активностью аргиназы. Упакованный продукт может содержать композицию и инструкции по применению для снижения уровней и/или активности аргиназы. Этикетка и/или инструкции по применению могут относиться к любому способу применения, описанному в данной заявке.

Изобретение также относится к способу получения готового изделия, содержащего любую из композиций, описанных в данном документе, упаковке композиции для получения готового изделия и инструктированию, указанию или продвижению применения композиции/готового изделия для любой области применения, описанной в данном документе. Такое инструктирование, указание или продвижение включает рекламирование.

Изобретение дополнительно описано в следующих неограничивающих примерах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Флаванолы какао снижают активность аргиназы и уровни аргиназы in vivo и in vitro.

Материалы и способы

Материалы: Химические реактивы приобретали от Sigma (Deisenhofen, Germany), за тем исключением, когда указано иное. Смесь метаболитов содержит сумму всех флаванолов 2,6 мкмоль/л, состоящую из (-)-эпикатехина (0,1 мкмоль/л) и катехина (0,4 мкмоль/л), так же, как и флаванольных метаболитов эпикатехин-7-β-D-глюкуронида (0,25 мкмоль/л), 4'-O-метил-эпикатехина (0,2 мкмоль/л), 4'-O-метил-эпикатехин-β-D-глюкуронида (1,7 мкмоль/л). Концентрация каждого флаванола эквивалентна концентрации в плазме через два часа после приема напитка какао с высоким содержанием флаванола (917 мг), как описано в публикации Schroeter H. et al, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:1024-1029, включенной в данное описание путем ссылки.

Протокол исследования: Эффект напитка какао с высоким или низким содержанием флаванола (включающего олигомеры, композиция показана ниже в таблице а) определяли в группе из 10 здоровых добровольцев. Критерием исключения были курение, гипертензия, сахарный диабет и терминальная почечная недостаточность. В течение двух дней измеряли активность аргиназы в эритроцитах, до, через 2 и 24 часа после приема напитка либо с высоким содержанием флаванола (902,1 мг), либо с низким содержанием флаванола (36,4 мг) в качестве контроля. Напиток с высоким содержанием флаванола содержал флаванолы и процианидины в виде от мономеров до декамеров, как показано в таблице b ниже. Индивидуумов исследовали утром после 12-часового периода отдыха. Во избежание эффектов кумуляции, исследования разделяли во времени фазой вымывания более чем 6 дней.

Таблица a
Композиция напитка какао
	Продукт с высоким содержанием CP	Контрольный продукт
Размер пакета, г	62	62
мг CP	902,1	36,4
Калории	237,4	234,4
Общее содержание жира, г	2,8	3,0
Насыщенные жиры, г	1,5	1,7
Холестерин, мг	8,8	9,7
Натрий, мг	210,2	310,0
Общее содержание углеводов, г	34,3	33,0
Пищевые волокна, г	6,0	7,8
Сахара, г	18,8	18,5
Белок, г	18,8	18,8
Кофеин, мг	36,5	42,4
Теобромин, мг	673,0	654,8

Минералы
	Продукт с высоким содержанием CP	Контрольный продукт
	мг/г	мг/г
Натрий, мг	210,2	310,0
Калий, мг	1060,2	1289,6
Кальций, мг	487,3	482,4
Железо, мг	3,9	5,9
Фосфор, мг	560,5	530,7
Магний, мг	171,7	156,9
Цинк, мг	3,1	3,3
Медь, мг	0,7	0,8
Марганец, мг	1,2	1,1

Таблица b
Композиции CP
	Высокое содержание CP	Контроль
	%	%
Мономеры	24,8	27
Эпикатехин	18,6	10,1
Катехин	6,2	16,9
Димеры	18,3	22,2
Триммеры	14,2	7,9
Тетрамеры	12,7	5,3
Пентамеры	9,8	3,9
Гексамеры	8,3	5,7
Гептамеры	3,8	4,7
Октамеры	3	5
Нонамеры	4,3	11,9
Декамеры	0,8	6,4
Всего	100	100

Культура клеток: Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) приобретали от Promo Cell, (Heidelberg, Germany) и культивировали до 2 пассажей.

Количественный анализ экспрессии генов: ОТ-ПЦР (RT-PCR) в реальном времени на LightCycler® (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) выполняли в общем объеме 20 мкл, содержащем 2 мкл кДНК, 2 мкл реакционной смеси с быстрым стартом SYBR Green I, 1,6 мкл 25 мМ MgCl₂, по 2 мкл каждого праймера 5 пикомоль/мкл и 10,4 мкл Н₂О. Клетки HepG2, линию клеток печени человека, использовали в качестве положительного контроля. Для отрицательного контроля использовали такие же препараты РНК, пропуская стадию обратной транскрипции. После завершения циклического процесса образцы подвергали воздействию изменяющейся температуры при постоянном контроле флуоресценции для анализа кривой плавления. Для каждого продукта ПЦР, независимо от праймеров-димеров, получали единственный узкий пик путем анализа кривых плавления при определенной температуре плавления, и только единственная полоса ожидаемого размера наблюдалась при электрофорезе в агарозном геле, показывая специфическую амплификацию без значительного количества побочных продуктов. Образцы количественно определяли соответствующим образом (LightCycler analysis software, version 3.5) с использованием гена «домашнего хозяйства» GAPDH в качестве стандарта.

Активность аргиназы: Эритроциты из венозной крови отделяли дифференциальным центрифугированием и активность аргиназы определяли сразу же после выделения соответствующим образом (Corraliza I. M. et al, 1994, J. Immunol. Methods 174:231-235). Клетки HUVEC лизировали и инкубировали с 10 мМ MnCl₂ при температуре 55°C в течение 10 минут. Затем добавляли равный объем 0,5 М L-аргинина и инкубацию проводили в течение 60 минут при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 800 мкл кислой смеси (H₂SO₄:H₃PO₄:H₂O=1:3:7) и количество мочевины определяли колориметрическим способом при 540 нм после добавления 50 мкл 9% α-изонитрозопропионфенона (ISPF) и нагревания при 96°C в течение 45 минут. Количество полученной мочевины после нормализации по белку применяли в качестве индекса для активности аргиназы. Для определения концентрации белка в эритроците лизаты разбавляли в соотношении 1:100. Активность аргиназы определяли в гомогенатах почки, полученных из замороженных участков ткани в соответствии с модифицированным способом (Ensunsa J. L. et al, 2004, Exp. Biol. Med. (Maywood) 229:1143-1153) Брауна и Коэна (Brown G. W., Jr., and Cohen, P. P., 1959, J. Biol. Chem. 224:1769-1774).

Активность GAPDH: Замороженные кусочки почки гомогенизировали в 10 объемах ледяного буфера (10 мМ Tris, pH 7,4, 0,25 M сахарозы, 0,5 мМ ЭДТА) и центрифугировали при 10000 × g в течение 30 минут при температуре 4°C. Активность GAPDH измеряли в полученных супернатантах в соответствии с Bergmeyer (Bergmeyer H. U., 1972, Methods of enzymatic analysis 2^nd edition, Weinheim: Verlag Chemie 1; 466-467).

Исследования на животных: Десять самцов крысят-отъемышей линии Sprague-Dawley получали от Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA). Крыс содержали по отдельности в подвесных клетках из нержавеющей стали при температуре (23°C) и световом периоде (цикл день-ночь 14-10 часов) в помещении с контролируемой окружающей средой. Их разделяли на 2 группы (n=5 в каждой группе) после 6-дневного периода адаптации и приема основного рациона в течение 2 дней, по желанию, с последующим контрольным рационом в течение 4 дней, с соблюдением времени кормления (5 часов в день). Животных затем произвольно включали в одну из двух диетических групп и обеспечивали ограниченный доступ (5 часов в день в течение темного цикла: с 0 до 5 утра) к рациону на основе очищенного яичного белка, содержащему 59,5% фруктозы с или 0%, или 4% порошка какао, в течение 28 дней. Обе группы имели свободный доступ к воде, доставляемой посредством поилки из нержавеющей стали. Подробная композиция рационов показана в таблице 1. Какао, используемое в этом исследовании, имело чрезвычайно высокое содержание флаванолов и процианидинов и содержало 11,0 мг/г эпикатехина, 2,8 мг/г катехина и 43,0 мг/г процианидинов. В конце 28-дневного периода крыс умерщвляли после 2-часового голодания. Животных анестезировали диоксидом углерода, почки быстро вырезали, взвешивали и хранили при -80°C до начала исследования. Протоколы экспериментов были одобрены до введения в действие Комитетом по использованию и защите животных Университета Калифорнии в Дейвисе и контролировались Университетским ветеринарным департаментом.

Статистический анализ: Величины представлены как средние ± СО (стандартное отклонение). Статистический анализ осуществляли с использованием непарного t-теста Стьюдента и p<0,05 рассматривали как достоверный.

Результаты

Обработка флаванольными метаболитами снижает экспрессию мРНК аргиназы-2 в клетках HUVEC

Уровни экспрессии мРНК аргиназы-2 исследовали в эндотелиальных клетках человека с использованием ПЦР в реальном времени. Композиция и концентрация флаванольных метаболитов, используемых для этого исследования in vitro, были равны концентрациям, обнаруженным в плазме человека через два часа после приема какао с высоким содержанием флаванола, как описано в разделе способов, с общим количеством флаванолов 2,6 мкмоль/л, с 4'-O-метил-эпикатехин-β-D-глюкуронидом в качестве главного компонента (Schroeter H. et al, 2006, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 103:1024-1029, включенный в данное описание путем ссылки).

Обработка флаванольными метаболитами приводила к сниженной экспрессии мРНК аргиназы-2 после 24 часов инкубации, и, кроме того, ранний ответ наблюдали с концентрацией флаванолов 2,6 и 7,8 мкмоль/л через 2 часа (фиг.1). В соответствии с результатами, полученными для флаванольных метаболитов, обработка (-)-эпикатехином также приводила к сниженной экспрессии мРНК аргиназы-2 после 24 часов инкубации, тогда как кратковременного эффекта через 30 минут или через 2 часа не наблюдали.

(-)-Эпикатехин и флаванольные метаболиты снижают активность аргиназы в клетках HUVEC

Клетки культивировали в присутствии эпикатехина или смеси флаванольных метаболитов и активность аргиназы-2 исследовали, как описано в разделе способов. Как показано на фигуре 2, обработка (-)-эпикатехином снижала активность аргиназы-2 через 48 часов. Активность аргиназы в клетках контроля составляла 6,9±0,4 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1, в то время как в клетках, обработанных (-)-эпикатехином, отмечалось дозозависимое снижение до 3,3±0,2 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1 при 30 мкмоль (-)-эпикатехина, сравнимое с ответом в клетках, обработанных TNF-α и IL-1β (3,7±0,6 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1), для которых известно, что обработка ими вызывает снижения экспрессии аргиназы (Suchek CV. et al., 2004, Curr. Mol. Med., 4:763-775). Обработка смесью флаванольных метаболитов также снижает активность аргиназы зависимым от концентрации образом.

Рацион на основе какао с высоким содержанием флаванолов снижает активность аргиназы in vivo

Дополнительное доказательство эффектов, опосредованных флаванолом, на активность аргиназы, было представлено в эксперименте на животных. Крысы получали рацион, содержащий 59,5% (мас.) фруктозы в качестве источника углеводов с наличием или без 4% (мас.) богатого флаванолами какао (таблица 1), содержащего (-)-эпикатехин и его олигомеры. Это воздействие посредством рациона с высоким содержанием флаванола привело к снижению активности почечной аргиназы, тогда как активность GAPDH в качестве контроля не изменилась (таблица 2).

Таблица 1
Композиция рациона (г/кг рациона)
Ингредиент	Контроль	4% Какао
Яичный белок¹	210	210
Картофельный крахмал²	0	0
Фруктоза³	595	595
Кукурузное масло	80	80
Минеральная смесь⁴	60	60
Alphacel⁵	40	40
Смесь витаминов с высоким содержанием биотина⁶	15	15
Порошок какао⁷	0	40
¹ Высушенный распылением яичный белок получали от Dyets Inc., (Bethlehem, PA, USA). ² Кукурузный крахмал получали от National Starch and Chemical Co., (Bridgewater, NJ, USA). ³ Фруктозу получали от ICN Biomedicals Inc., (Aurora, OH, USA). ⁴ Минеральная смесь содержала следующие вещества (г/кг смеси): CaCO₃, 139,7; CaHPO₄, 166,6; K₂HPO₄, 133,6; NaCl, 21,2; MgSO₄, 49,5; FeSO₄ ·7H₂O 6,2; ZnCO₃, 0,8; MnSO₄ ·H₂O, 0,61; CuSO₄ ·5H₂O, 0,66; KI, 0,0033; CrK(SO₄)₂ ·12H₂O, 0,048; Na₂SeO₃, 0,015; Na₂MoO₄ ·2H₂O 0,0063, Церелоза 481,06. ⁵ Alphacel, наполнитель, не обладающий пищевыми качествами, получали от INC Biomedicals Inc. (Aurora, OH, USA). ⁶ Витаминная смесь содержала следующие ингредиенты (г/кг смеси): инозит, 25,0; аскорбиновая кислота, 5,0; кальция пантотенат, 0,67; тиамина гидрохлорид, 0,27; пиридоксина гидрохлорид, 0,53; никотиновая кислота, 1,0; менадион (витамин К), 0,25; рибофлавин, 0,27; п-аминобензойная кислота, 0,50; фолиевая кислота, 0,067; биотин, 0,26; неразделенная смесь рацематов α-токоферола, 1,20; ретинол, 0,047; холекальциферол, 0,0017; витамин B12 + маннит, 3,33; холинхлорид (70% раствор мл/кг), 71,50; церелоза, 887,52. ⁷ Порошок какао получали от Mars Inc. (Hackettstown, NJ, USA). Он содержал 13,8 мг/г мономера, включающего 11,0 мг/г эпикатехина и 2,8 мг/г катехина, 10,5 мг/г димера, 7,7 мг/г тримера, 6,7 мг/г тетрамера, 5,1 мг/г пентамера, 4,2 мг/г гексамера, 2,3 мг/г гептамера, 2,1 мг/г октамера, 3,2 мг/г нонамера и 1,2 мг/г декамера.

Таблица 2
Рацион, содержащий порошок какао, снижает активность аргиназы в почке крысы
Ферментативная активность [Ед/мг белка]	Контроль	4% Какао
Аргиназа	0,18±0,02	0,013±0,02*
GAPDH	1,30±0,10	1,25±0,11
Крысы получали в течение 28 дней рацион на основе казеина, содержащий 59,9% (мас.) фруктозы в качестве источника углеводов с наличием или без 4% (мас.) какао (см. таблицу 1). Данные представлены в виде среднего ± СО. *p<0,05.

Потребление какао с высоким содержанием флаванолов снижает активность аргиназы в эритроцитах человека

В исследовании in vivo у здоровых людей (n=10), с использованием напитка какао с высоким содержанием флаванолов и соответствующего контрольного напитка с низким содержанием флаванолов, активность аргиназы оценивали в эритроцитах до и через 2 и 24 часа после приема 200 мл напитка какао. Потребление напитка какао с высоким содержанием флаванолов приводило к незначительному снижению активности аргиназы через 2 часа (среднее значение: 3,4 ± 0,4 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1; p<0,05) по сравнению с контролем (3,9 ± 0,4 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1). Однако явное снижение активности аргиназы наблюдали через 24 часа (3,0 ± 0,3 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1; p<0,05). Потребление напитка какао с низким содержанием какао приводило к небольшому снижению ферментативной активности через 2 часа (3,3 ± 0,4 против 3,7 ± 0,4 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1; p<0,05), тогда как на активность аргиназы через 24 часа это существенно не влияло (3,5 ± 0,5 мкмоль мочевины × мг белка^-1 × ч^-1; p недостоверное) по сравнению с контролями (фигура 3).

Claims

1. Композиция для снижения уровней и/или активности аргиназы у субъекта, включающая эффективное количество по меньшей мере одного соединения, выбранного из эпикатехина, катехина, их фармацевтически приемлемой соли и производного, причем производное не является производным галловой кислоты; и полимерного соединения, имеющего формулу A_n, его фармацевтически приемлемой соли и его производного:

где n означает целое число от 2 до 18;
каждый из R и Х имеет или α, или β стереохимию;
R означает ОН, O-сахар или O-галлат;
заместители С-4, С-6 и С-8 представляют собой X, Z и Y соответственно, и связывание мономерных единиц происходит в положении С-4, С-6 или С-8;
когда любой из С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z представляют собой водород или сахар;
и
сахар необязательно замещен фенольной группой.

2. Композиция по п.1, в которой соединение представляет собой эпикатехин или его фармацевтически приемлемую соль.

3. Композиция по п.1, в которой производное представляет собой метилированное производное или глюкуронидированное производное.

4. Композиция по п.3, в которой метилированное производное выбрано из 3'-O-метил-(+)-катехина, 3'-O-метил-(-)-эпикатехина, 4'-O-метил-(+)-катехина, 4'-O-метил-(-)-эпикатехина, 3'-O-, 4'-O-диметил-(+)-катехина и 3'-O-, 4'-O-диметил-(-)-эпикатехина.

5. Композиция по п.3, в которой производное выбрано из группы, состоящей из 4'-O-метил-эпикатехин-O-β-D-глюкуронида, 3'-O-метил-эпикатехин-O-β-O-глюкуронида и эпикатехин-О-β-D-глюкуронида.

6. Композиция по п.5, в которой производное выбрано из 4'-O-метил-эпикатехин-7-O-β-D-глюкуронида, 3'-O-метил-эпикатехин-5/7-O-β-D-глюкуронидов и эпикатехин-7-O-β-D-глюкуронида.

7. Композиция по п.1, в которой соединение представляет собой полимерное соединение формулы A_n, в которой R представляет собой ОН, и X, Y и Z выбраны из группы, состоящей из мономерной единицы А и водорода, или его фармацевтически приемлемую соль.

8. Композиция по п.7, в которой n представляет собой число от 2 до 10.

9. Композиция по п.8, в которой смежные мономерные единицы связываются в положениях (4β→6) и/или (4β→8).

10. Композиция по п.1, которая представляет собой фармацевтическую композицию, пищевой продукт, корм для домашних животных, напиток, диетическую добавку, кондитерское изделие или шоколад.

11. Композиция по п.1, в которой соединение представлено в виде экстракта какао, фракции экстракта какао или твердого вещества какао.

12. Композиция по п.11, в которой твердое вещество какао содержит сохраненный уровень эпикатехина.

13. Композиция по п.11, в которой твердое вещество какао представляет собой порошок какао.

14. Композиция по п.11, в которой твердое вещество какао представляет собой необработанное щелочью твердое вещество какао.

15. Способ снижения уровней и/или активности аргиназы, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного соединения, выбранного из эпикатехина, катехина, их фармацевтически приемлемой соли и производного, причем производное не является производным галловой кислоты; и полимерного соединения, имеющего формулу A_n, его фармацевтически приемлемой соли и его производного:

где n означает целое число от 2 до 18;
каждый из R и Х имеет или α, или β стереохимию;
R означает ОН, O-сахар или O-галлат;
заместители С-4, С-6 и С-8 представляют собой X, Z и Y соответственно, и связывание мономерных единиц происходит в положении С-4, С-6 или С-8;
когда любой из С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z представляют собой водород или сахар; и
сахар необязательно замещен фенольной группой в любом положении.