KR20020057953A - 진핵 세포에서의 서열 특이적 ｄｎａ 재조합 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제1 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계, 제2 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계 및 박테리오파아지 람다 인테그라제(integrase) Int의 작용을 이용하여 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 Int 및 Xis 인자의 작용을 이용한 DNA의 제2 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벡터 및 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 제1 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계, 제2 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계 및 박테리오파아지 람다 인테그라제(integrase) Int에 의한 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 Int 및 Xis 인자에 의한 DNA의 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벡터 및 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
진핵생물 게놈의 조절된 조작은 생유기체 내에서 특이적 유전자의 기능(들)을 연구 조사하는데 중요한 방법이다. 더우기, 이러한 조작은 의학 분야의 유전자 치료 방법에서 역할을 한다. 이러한 맥락에서, 형질전환 동물의 생성, 유전자 또는 유전자 절편의 변화(소위 "유전자 표적화") 및 외래 DNA의 고등 진핵생물의 게놈 내로의 표적화된 통합이 특히 중요하다. 최근에는 이러한 기술이 서열 특이적 재조합 시스템의 특성화와 적용을 통하여 개선될 수 있었다.
보존적 서열 특이적 DNA 레콤비나제(recombinase)는 2가지 계열로 분류되어 있다. 제1 계열 구성원인 소위 "인테그라제" 계열은 2개의 규정된 뉴클레오티드 서열(이는 다음에서 재조합 서열로 명명될 것이다)간의 DNA 쇄를 절단하고 재결합시키는 것을 촉매한다. 이러한 재조합 서열은 2개의 상이한 DNA 분자 상에 존재하거나, 특정의 DNA 분자 및 분자간 재조합과 분자내 재조합을 야기시킬 수 있는 동일한 DNA 분자에 각각 존재할 수 있다. 후자의 경우, 반응의 결과는 서로에 대한 재조합 서열의 각각의 배향에 좌우된다. 재조합 서열이 역배향, 즉 반대편 배향인 경우에는, 이러한 재조합 서열 사이에 놓여진 DNA 절편의 역위가 발생한다. DNA 기질 상의 상기 재조합 서열이 동향, 즉 직렬 반복체인 경우에는, 결실이 발생한다. 분자간 재조합의 경우, 즉 양 재조합 서열이 2개의 상이한 DNA 분자 상에 위치하는 경우에는, 이러한 2개의 DNA 분자간에 융합이 발생할 수 있다. 인테그라제 계열의 구성원이 통상적으로, 분자내 재조합 뿐만 아니라 분자간 재조합 모두를 촉매하긴 하지만, 소위 "인버타제(invertase)/레졸바제(resolvase)"로 불리우는 제2 계열의 레콤비나제는 분자내 재조합만을 촉매할 수 있다.
현재 진핵생물 게놈의 조작에 주로 사용되고 있는 레콤비나제는 인테그라제 계열에 속한다. 상기 레콤비나제는 박테리오파아지Pl의 Cre 레콤비나제 및 효모로부터의 Flp 레콤비나제이다[참조: Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3]. Cre 레콤비나제가 결합되는 재조합 서열은loxP로 명명된다.loxP는 2개의 13bp 길이의 역방향 뉴클레오티드 서열과 이러한 역방향 서열 사이에 놓여진 8bp 길이의 스페이서로 이루어진 34bp 길이의 뉴클레오티드 서열이다[참조: Hoess, R. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351]. Flp에 대한FRT지명된 결합 서열도 유사하게 구축된다. 그러나, 이들은loxP와는 상이하다[참조: Kilby, J. et al. (1993) Trends Genet., 9, pp. 413]. 따라서, 상기 재조합 서열은 서로 대체될 수 없는데, 즉 Cre는FRT서열을 재조합시킬 수 없고, FLP는loxP서열을 재조합시킬 수 없다. 양 재조합 시스템은 장거리에 걸쳐 활성인데, 즉 역위되거나 결실되고 2가지loxP또는FRT서열에 의해 플랭킹될 DNA 절편은 길이가 수만 염기쌍일 수 있다.
예를 들면, 마우스 계통에서의 조직 특이적 재조합, 식물과 동물에서의 염색체 전좌 및 유전자 발현의 조절된 유도는 상기 2가지 시스템을 이용하여 달성하였다[참조: Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3]. DNA 폴리머라제 β는 이러한 방식으로 마우스의 특정 조직에서 결실되었다[참조: Gu, H. et al. (1994) Science, 265, pp. 103]. 추가의 예는 마우스 렌즈에서 DNA 종양 바이러스 SV40 종양유전자를 특이적 활성화시켜, 이들 조직에서만 종양이 형성되도록 하는 것이다. Cre-loxP전략은 그밖에도, 이를 또한 유도성 프로모터와 결합하여 사용하였다. 예를 들면, 레콤비나제의 발현은 인터페론-유도성 프로모터로 조절하여, 간에서 특이적 유전자를 결실시키고, 다른 조직에서는 전혀 결실시키지 않거나 저수준으로만 특이적 유전자를 결실시켰다[참조: Kuhn, R. et al. (1995) Science, 269, pp. 1427].
지금까지는, 인버타제/레졸바제 계열의 2가지 구성원이 진핵생물 게놈의 조작에 사용되어 왔다. 박테리오파아지Mu인버타제 Gin의 돌연변이체가 조인자를 사용하지 않고서도 식물 원형질체에서 DNA 단편의 역위를 촉매할 수 있다. 그러나, 이러한 돌연변이체가 과재조합성이라는 사실이 밝혀졌는데, 즉 이는 또한 이의 천연 재조합 서열 이외의 서열에서의 DNA 쇄 절단을 촉매하는 것으로 밝혀졌다.이로써, 식물 원형질체 게놈에서 의도하지 않은 부분적으로 치명적인 재조합 이벤트가 발생된다. 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 β-레콤비나제는 마우스 세포 배양물에서 동향 반복체로서 두 재조합 서열간의 재조합을 촉매하여, 상기 절편의 절단을 유도한다. 그러나, 이러한 결실과 동시에, 진핵생물 게놈을 조작하기 위한 시스템의 조절된 사용이 부적합하도록 만드는 역위가 또한 검출되었다.
Cre 및 Flp 레콤비나제 각각을 이용하는 진핵생물 게놈의 조작은 상당한 단점을 나타낸다. 결실의 경우, 즉 게놈 내의 2개의 직렬로 반복된loxP또는FRT재조합 서열을 재조합하는 경우에는, 이러한 직렬 반복체 사이에 놓여진 DNA 절편이 비가역적으로 결손된다. 따라서, 이러한 DNA 절편 상에 위치한 유전자는 상기 세포와 유기체에 대해 영구적으로 결손될 것이다. 따라서, 예를 들면, 유기체의 후기 발생 단계에서, 유전자 기능의 새로운 분석을 위해 본래 상태를 재작제하는 것이 불가능하다. 결실에 의해 유발된 DNA 절편의 복귀 불가능한 결손은 각각의 DNA 절편을 역위시킴으로써 피할 수 있다. 유전자를 결손시키지 않고서도 이를 역위시킴으로써 불활성화시킬 수 있으며, 복귀 재조합을 통하여 적시에 조절된 레콤비나제 발현에 의해 성인 동물에서 또는 후기 발생 단계에서 상기 유전자를 다시 작동시킬 수 있다. 그러나, 이러한 변형된 방법에 Cre 레콤비나제와 Flp 레콤비나제 둘 다를 사용하는 것은, 상기 재조합 서열이 재조합 이벤트로 인해 변화될 수 없을 것이기 때문에, 역위가 조절될 수 없다는 단점을 지니고 있다. 따라서, 표적 세포의 일부에서만, 50% 이하에서만 각각의 DNA 절편의 역위로 인해 각각의 유전자를 불활성화시키는 반복된 재조합 이벤트가 발생된다. 단일 재조합 후의 추가의 반응에 사용될 수 없는 돌연변이된loxP서열을 작제함으로써 적어도 부분적으로 이러한 문제점을 해결하고자 노력하여 왔다. 그러나, 이러한 단점은 상기 반응의 독특한 현상이며, 즉 역위에 의한 유전자의 불활성화 후에 복귀 재조합에 의한 후속 활성화가 전혀 이루어지지 않는다.
Flp 레콤비나제의 추가의 단점은 이의 37℃에서의 열 안정성 저하인데, 이는 고등 진핵생물, 예를 들면, 체온이 약 39℃인 마우스에서 재조합 반응 효능을 상당히 제한한다. 따라서, 야생형 레콤비나제로서 열 안정성이 보다 높긴 하지만, 여전히 Cre 레콤비나제 보다는 낮은 재조합 효율을 나타내는 Flp 돌연변이체를 작제하였다.
서열 특이적 레콤비나제의 용도는 추가로, 의학 분야, 예를 들면, 상기 레콤비나제가 목적하는 DNA 절편을 안정하고도 표적화된 방식으로 각각의 사람 표적 세포의 게놈 내로 통합시키는 유전자 요법에 있다. Cre와 Flp는 둘 다 분자간 재조합을 촉매할 수 있다. 양 레콤비나제는 이의 각각의 재조합 서열 복사체를 보유하는 플라스미드 DNA를, 이전에 상동 재조합을 통하여 진핵생물 게놈 내로 삽입시킨 상응하는 재조합 서열과 재조합시킨다. 그러나, 이러한 반응이 상기 진핵생물 게놈 내의 "천연" 재조합 서열로 실행 가능하도록 하는 것이 요망된다.loxP와FRT는 길이가 각각 34개와 54개 뉴클레오티드이기 때문에, 상기 게놈의 일부로서의 이러한 재조합 서열의 생성은 통계적으로 거의 이루어지지 않는다. 재조합 서열이 존재하는 경우일지라도, 전술된 복귀 반응의 단점이 여전히 존재하는데, 즉 Cre 레콤비나제와 Flp 레콤비나제 둘 다가, 분자내 재조합에 의한 성공적인 통합 후 삽입된 DNA 절편을 절단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 가지 문제는 간단하고도 조절 가능한 재조합 시스템과 이에 요구되는 작업 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 문제는 목적하는 DNA 서열의 안정적이고도 표적화된 통합을 수행할 수 있는 재조합 시스템과 이에 요구되는 작업 수단을 제공하는 것이다.
상기 문제들은 본원의 청구의 범위에서 특징을 나타내는 주제들에 의해 해결된다.
본 발명은 다음 예시와 함께 보다 상세히 설명될 것이다.
도 1은 재조합 반응, 즉 인테그라제 Int에 의해 촉매된 통합과 절단 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 재조합 서열attP의 복사체를 보유하는 초나선형 플라스미드 DNA(상단)가 도시되어 있다.attP는 Int에 대한 5개의 소위 아암(arm) 결합 부위(P1, P2, P1', P2', P3'), 2개의 코어 Int 결합 부위(C 및 C'; 검은색 화살표로 표시됨), IHF에 대한 3개의 결합 부위(H1, H2, H'), Xis에 대한 2개의 결합 부위(X1, X2), 및 실제적인 DNA 쇄 교환이 이루어지는 소위 중복 영역(흰색 사각형)으로 이루어진다.attP에 대한 파트너 서열인attB가 선형 DNA 절편 아래에 도시되어 있고, 이는 Int에 대한 2개의 코어 결합 부위(B 및 B'; 흰색 화살표로 표시됨)와 중복 영역으로 이루어진다.attB와attP간의 재조합을 위해서는,attB를 보유하는 DNA 절편 내로 상기 플라스미드를 통합시키는 Int와 IHF가 필요하다. 이렇게 함으로써, 본 절단을 위한 표적 서열로서 작용하는, 2개의 새로운 하이브리드재조합 서열attL과attR이 형성된다. 이러한 반응에는 Int 및 IHF, 및 파아지 람다에 의해 암호화된 추가의 조인자 Xis가 요구된다.
도 2A는 인테그라제 발현 벡터를 도식적으로 나타낸 것이고, 도 2B는 웨스턴 분석을 도식적으로 나타낸 것이다. (A): 벡터 pKEXInt는 야생형 인테그라제 유전자를 포함하고, 벡터 pKEXInt-h는 돌연변이체 Int-h의 유전자를 포함하며, 벡터 pKEXInt-h/218은 돌연변이체 Int-h/218의 유전자를 포함한다. 대조군 벡터(pKEX)는 어떠한 Int 유전자도 포함하지 않는다. 야생형 인테그라제(Int)와 2개의 돌연변이체(Int-h 및 Int-h/218)에 대한 각각의 유전자가 회색 막대로서 도시되어 있다. 이러한 암호화 영역 다음에, 각각의 mRNA의 분자내 안정성 증가를 보장해주어야 하는 RNA 프로세싱용 시그널 서열(점무늬 사각형)이 존재하는데, 이는 SV40, t-Ag 스플라이스 및 폴리A 시그널로서 명명된다. 상기 인테그라제 유전자의 발현은 사람 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터를 통하여 발생한다. (B): 도시된 바와 같은 각각의 벡터를 리포터 세포주 B2 및 B3 내로 도입한 후, 세포 용해물을 제조하고, SDS PAGE에서 이들의 분자량에 근거하여 단백질을 분리시켰다. Int-h 단백질의 존재 여부는 야생형 Int에 대한 폴리클로날 마우스 항체를 통하여 가시화되었다(레인 2 및 4). 이러한 겔에서의 Int의 위치는 화살표로 표시한다.
도 3은 기질 벡터를 도식적으로 나타낸 것이다. (A): pGFPattB/attP. ApaLI로 선형화된 벡터가 도시되어 있다. 큰 검은색 화살표는 CMV 프로모터와 역배향으로 놓여지는 GFP(녹색 형광 단백질) 유전자를 플랭킹하는 2개의 재조합 서열attB 및attP의 위치와 배향을 표시한다. PA는 폴리A 시그널을 지칭한다. SV40프로모터에 의해 발현되고 안정한 리포터 세포주의 선택을 가능하게 하는 neo 내성 유전자가 부가적으로 상기 벡터 상에 놓여있다. 제한 효소 NcoI에 대한 인식 부위가 또한 표시되어 있다.attB와attP간의 통합성 재조합은 GFP 유전자의 역위가 유도되고, 이에 의해 이의 발현이 유도된다. 작은 흰색 화살표와 검은색 화살표는 단일 PCR 프라이머의 위치와 배향을 표시한 것이며, 이는 p1 내지 p7로서 명명된다. (B): pGFPattL/attR. 이 벡터는 pGFPattB/attP와 동일하지만,attB와attP 대신에attL과attR을 포함한다. GFP 유전자는 CMV 프로모터에 대해 3'-5' 배향으로 놓여져 있다. 해칭된 박스는 서던 분석에 사용된 프로브의 위치를 지정한다.
도 4A 내지 4D는 브롬화에티듐으로 염색함으로써 DNA를 가시적으로 만든 아가로즈 겔(1.2% w/v)에서 DNA 분자를 분리시킨 후, PCR를 통한 리포터 세포주에서의 통합성 재조합의 검출을 도식적으로 나타낸 것이다. (A): 역전사효소 PCR(RT-PCR). 벡터 pKEX와 pKEXInt-h(도 2A)를 전기천공에 의해 각각의 리포터 세포주 B1 내지 B3 내로 별도로 도입한다. 분리된 폴리A mRNA로부터 진행한 RT-PCR 분석은, 세포를 pKEXInt-h로 처리한 경우에만(레인 1, 3 및 5) 프라이머 쌍 p3/p4(도 3)를 갖는 예상 생성물을 나타낸다. 동일한 RNA 제제로부터의 β-액틴 유전자를 RNA 함량의 대조군으로서 증폭시켰다. 레인 M: DNA 래더(ladder); 레인 O: RNA 주형을 이용하지 않는 RT-PCR 대조군. (B,C): 게놈 PCR 분석. 각각의 세포주로부터, 전기천공시킨지 72시간 후에 게놈 DNA를 분리하고, 프라이머 쌍 p3/p4(도 3)와 p1/p2(도 3)를 사용하여 증폭시킨다. 레인의 넘버링과 명칭은 도 4A에 상응한다. (D): 결실 시험. 분리된 게놈 DNA를 프라이머 쌍 p5/p6(도 3)으로 증폭시킨다.역위 대신 결실 후에 예상되는 PCR 생성물(420bp)의 위치가 화살표로 표시되어 있다. 레인의 넘버링과 명칭은 도 4A에 상응한다.
도 5A 및 5B는 PCR에 의한 리포터 세포주에서의 역위 검출과, 아가로즈 겔(1.2% w/v)에서 해당 DNA 분자의 분리 후의 서던 하이브리드화에 의한 리포터 세포주의 역위 검출을 도식적으로 나타낸 것이다. (A): PCR 분석. 벡터 pKEX와 pKEXInt-h로 처리한 세포주 B1, B2, B3 및 BL60으로부터 분리된 게놈 DNA의 분획을 프라이머 쌍 p3/p4 및 p5/p7(도 3)로 증폭시킨다. 인테그라제에 의해 촉매된 GFP 유전자의 역위로 복귀된 PCR 생성물이 레인 1, 3 및 5에서 가시적이다. 레인 M: DNA 래더; 레인 O: 게놈 DNA를 이용하지 않은 PCR 대조군. (B) 서던 분석: 도 5A에 도시되어 있는 분석된 DNA의 나머지 분획을 이의 분자량에 근거하여 아가로즈 겔 전기영동에서 분리시킨 제한 효소 NcoI와 함께 항온 배양한 다음, 이를 후속적으로 니트로셀룰로즈 막 위에 옮긴다. GFP 보유 DNA 단편을 방사성 표지된 프로브(도 3B)에 의해 가시적으로 만들어 재조합을 검출하였다. 레인 9: 재조합되지 않은 pGFPattB/attP; 레인 10: 재조합된 pGFPattB/attP.
도 6A는attB와attH를 각각 포함하는 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 6B는attP와attP*의 부분 서열을 도시한 것이다. (A):attB와attH간의 서열 비교.attB에서 Int 코어 결합 부위 B 및 B'는 서열 상단에 대쉬로 표시한다.attH에서 Int 코어 결합 부위 H 및 H'는 서열 상단에 점괘선으로 표시한다. 중복 서열은 흰색 사각형으로 표시한다. 서열 차이는 수직 이중 대쉬로 표시한다. 코어 영역과 중복 영역 내의 잔기 넘버링은 O로 명명된 중복 영역의 중심에 관한 것이고, 이는문헌[참조: Landy and Ross (1977), Science, 197, pp. 1147]에 규정되어 있다. -9에서부터 +11까지의 서열은 각각attB 및attH 부위이다. (B):attB와attH에 각각 상응하는,attP와attP*의 부분 서열간의 서열 비교. 명칭은 도 6A에서와 같이 사용한다.
도 7은 아가로즈 겔 전기영동에서 분리한 후 이. 콜라이(E. coli) 중의 벡터 pACH 상에서attH와attP*간의 재조합의 검출을 도식적으로 나타낸 것이다. 기질 벡터 pACH를, Int, Int-h 또는 Int-h/218에 대한 각각의 원핵성 발현 벡터와 함께, 이. 콜라이 균주 CSH26 또는 CSH26 델타 IHF 내로 함께 형질전환시킨다. 선택한지 36시간 후에 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 HindIII 및 AvaI와 함께 항온 배양한 다음, 분리하고 아가로즈 겔 전기영동에 의해 가시적으로 만들었다. 역위에 의해 발생된 제한 단편의 위치는 "invers"로서 표시한다. 재조합되지 않은 DNA 위치는 pACH로서 표시한다. 레인 1 및 12: DNA 래더; 레인 2 및 3: 재조합되지 않은 pACH의 발현 벡터 및 DNA; 레인 4 내지 7: CSH26으로부터 분리된 DNA; 레인 8 내지 11: CSH 델타 IHF로부터 분리된 DNA.
도 8은 벡터 pEL13을 게놈 유전자좌attH 내로 통합시키는 전략과 검출 방법의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. 통합 벡터 pEL13은 내성 유전자("hygr"로 표시된 화살표), CMV 프로모터의 조절하에 Int-h에 대한 유전자("int h"로 표시된 화살표) 및attP*의 복사체("attP*/P*OP*'"로 표시된 흰색 사각형)를 보유한다. Int-h는 상기 벡터를 전기천공에 의해 BL60 세포 내로 도입한 후에 발현된다(도2B). 후속적으로, 레콤비나제는attP*와 염색체성attH간의 분자간 재조합("attH/HOH'"로 표시된 해칭된 사각형)을 촉매하여, 벡터 pEL13을 BL60 세포의 게놈 내로 통합시킨다. 상기 벡터를 안정하게 혼입시킨 세포를 선택하고, 프라이머 쌍attX1/B2("attX1" 및 "B2"로 표시된 화살표)를 사용하여 PCR에 의해 동정할 수 있다. EcoRV 및 SphI는 각각의 제한 효소의 제한 효소 인식 부위를 지정한다.
도 9는 BL60 세포에서attP*(pEL13)와attH간의 분자간 재조합의 검출을 도식적으로 나타낸 것이다. 게놈 DNA를 분리하고, pEL13을 전기천공시킨 다음, 수주에 걸쳐 선택을 수행한 후에 31개의 상이한 세포 집단으로부터 프라이머 쌍attX1/B2(도 8)를 이용하여 증폭시킨다. PCR 생성물을 분리시키고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 가시적으로 만들었다. 예상 생성물(295bp)의 위치는 겔에서 화살표로 표시한다. 후속적으로, 상기 생성물을 DNA 서열화에 의해 추가로 분석하였다. 우측 가장자리에는 DNA 래더가 위치한다.
본원에 사용된 바와 같은 "형질전환" 또는 "형질전환시키는"이란 용어는 세포 내로의 모든 핵산 서열 도입을 의미한다. 이러한 도입은, 예를 들면, 형질감염 또는 리포펙션(lipofection)일 수 있거나, 또는 칼슘 방법, 전기쇽 방법 또는 난모세포 주사를 통하여 수행할 수 있다. "형질전환" 또는 "형질전환시키는"이란 용어는 또한, 예를 들어, 재조합 서열(들)과 치료학적 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는 바이러스 핵산 서열을, 각각의 바이러스에 대해 천연 상태 방식으로 도입하는것을 의미한다. 이러한 바이러스 핵산 서열이 나출형 핵산 서열로서 존재할 필요는 없으나, 바이러스 단백질 외피에 팩키징될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 또한 "형질전환" 또는 "형질전환시키는"이란 용어하에 통상적으로 공지된 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 천연 재조합 서열에 비해 1개 이상, 6개 이하, 바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환물 형태의 변형을 갖는attB와attP 서열, 및attL과attR 서열에 관한 것이다.
재조합 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동체", "상동성" 또는 "유사한"은 천연 재조합 서열과 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 한층 더 바람직하게는 약 90%, 더 더욱 바람직하게는 약 95%, 가장 바람직하게는 약 99%가 동일한 핵산 서열에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 핵산의 흡수, 증식, 발현 또는 전달을 위해 합성적으로 생성시키거나 또는 천연 작제물에 관한 것이며, 예를 들면, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, 인공 염색체, 박테리오파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스이다.
박테리오파아지 람다의 인테그라제(본원에서 통상적으로 "Int"로 명명됨)는 Cre 및 Flp와 같이, 서열 특이적 보존적 DNA 레콤비나제의 인테그라제 계열에 속한다. Int는 2개의 상이한 재조합 서열, 즉attB와attP간의 통합성 재조합을 촉매한다.attB는 21개 뉴클레오티드를 포함하고, 본래 이. 콜라이 게놈으로부터 분리하였다[참조: Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, pp. 3220]. 또 다른 한편, 243개 뉴클레오티드를 갖는attP는 훨씬 더 길고, 박테리오파아지 람다의 게놈에서 천연적으로 발생된다[참조: Landy, A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147]. Int 레콤비나제는attP 중의 전체 7개의 결합 부위와attB에서의 2개의 결합 부위로 이루어진다. Int의 생물학적 기능은 환상 파아지 게놈을 이. 콜라이 염색체 상의 유전자좌attB 내로 서열 특이적 통합시키는 것이다. Int는 이러한 통합성 재조합을 위한 단백질 조인자, 소위 통합 숙주 인자(본원에서 통상적으로 "IHF"로 명명됨)를 필요로 한다[참조: Kikuchi, Y. and Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149]. IHF는attP와의 기능적 재조합 복합체의 어셈블리에 필요하다. 통합 반응에 대한 제2 조인자는attP의 DNA 음성 초나선화이다. 최종적으로,attB와attP간의 재조합으로 인해, 2개의 새로운 재조합 서열, 즉attL과attR이 형성되는데, 이는 추가의 재조합 반응인 절단 반응에 대한 기질 및 인식 서열로서 작용한다. 박테리오파아지 람다 통합에 관한 포괄적인 요약이 문헌[참조예: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 제공되어 있다.
세균 게놈으로부터의 파아지 게놈의 절단은 또한 Int 레콤비나제에 의해 촉매된다. 이를 위해, 박테리오파아지 람다로부터 암호화되기도 하는, Int 및 IHF 이외의 추가의 조인자가 필요하다. 이는attR에서 2개의 결합 부위를 갖는 엑시지오나제(excisionase)(본원에서 통상적으로 "XIS"로서 명명됨)이다[참조: Gottesman, M. and Weisberg, R. (1971) The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 113]. 통합성 재조합과는 대조적으로, 재조합 서열의 DNA음성 초나선화가 절단성 재조합에는 필수적인 것은 아니다. 그러나, DNA 음성 초나선화는 재조합 반응의 효율을 증대시킨다. 절단 반응의 효율을 추가로 개선시키는 것은 Xis와 연계하여 작용하는 제2 조인자, 즉 FIS(역위 자극을 위한 인자)를 사용하여 달성할 수 있다[참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]. 이러한 절단은 유전적으로 통합의 정확한 역반응인데, 즉attB 및attP가 다시 생성된다. 박테리오파아지 람다 절단에 관한 포괄적인 요약이 문헌[참조예: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 제공되어 있다.
본 발명의 한 국면은 a) 제1 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계, b) 제2 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계 및 c) 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이다. 제1 DNA 서열이 서열 1에 따르는attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하고, 제2 DNA 서열이 서열 2에 따르는attP 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법이 바람직하다. 제1 DNA 서열이 서열 3에 따르는attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하고, 제2 DNA 서열이 서열 4에 따르는attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하며, 단계 c)에서 서열 특이적 재조합이 Int와 Xis 인자에 의해 수행되는 방법이 추가로 바람직하다.
본 발명의 방법은 천연attB 및/또는attP 서열 또는attL 및/또는attR 서열을 사용하여 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 변형된, 예를 들면, 치환된attB 및/또는attP 서열 또는attL 및/또는attR 서열을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면,attB에서 다음 위치에 다음 치환물 중의 1개 또는 이들의 배합물[G, T(위치-9); A, C, G(-8); C, A, T(-7), T, G, A(-6); C, A(-5); A(-4); G, A(-3); A, C, G(-2); A, C, G(-1); A, C, G(0); T, C, G(+1); A, C, G(+2); T, G, C(+3); A, G, T(+4); A, C, G(+5); G, T(+6); G, T(+7); G, T, A(+8); C, G, A(+9); C, G, A(+10); T, A, C(+11)(참조: Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143; Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986) J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, pp. 1134)] 및/또는attP에서 다음 위치에 다음 치환물 중의 1개 또는 이들의 배합물[T(위치 +1); C(+2); 및 A(+4)(참조: Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143)]을 갖는,attP와attB 상동 서열(야생형 서열의 돌연변이체)간의 박테리오파아지 람다 및 이. 콜라이의 통합성 재조합이 관찰되었다.
따라서, 본 발명은 사용된attB 및attP 서열이 서열 1에 따르는 천연attB 서열 및 서열 2에 따르는attP 서열과 각각 비교하여 1개 이상의 치환물을 갖는 방법에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 사용된attL 및attR 서열이 서열 3에 따르는 천연attL 서열 및 서열 4에 따르는attR 서열과 각각 비교하여 1개 이상의 치환물을 갖는 방법에 관한 것이다. 재조합 서열이 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환물을 갖는 방법이 바람직하다. 이러한 치환은 중복 영역(도 6A, 흰색 사각형 참조)과 코어 영역(도 6A, 대쉬 참조) 모두에서 발생할 수 있다. 7개의 뉴클레오티드를 포함하는 완전한 중복 영역이 치환될 수도 있다. 코어 영역 또는 중복 영역 내에서의 치환물을attB 및attP 서열 내로 도입하는 방법이 보다 바람직하다. 중복 영역 내에서의 치환물을 도입하고, 이와 동시에 코어 영역 내에서의 1개 또는 2개의 치환물을 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법의 경우,attB에 치환물을 도입하는 경우에는attP에 상응하는 치환물을 도입할 필요가 없거나, 또는attL에 치환물을 도입하는 경우에는attR에 상응하는 치환물을 도입할 필요가 없으며, 이와 반대로 수행할 수 있다. 재조합 서열 내로의 치환물 형태의 변형은, 재조합이 이러한 변형(들)에도 불구하고 수행될 수 있도록 선택해야만 한다. 이러한 치환물의 예가 문헌[참조예: Nash, H. (1981), supra; 및 Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986), supra]에 열거되어 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 변형을, 예를 들면, 돌연변이 유발 방법에 의해 용이하게 도입할 수 있고, 시험 재조합에 의해 이들의 용도를 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로, 서열 1에 따르는 천연attB 서열과 비교하여 사용된attB 서열 또는 서열 2에 따르는 천연attP 서열과 비교하여 사용된attP 서열, 또는 서열 3에 따르는 천연attL 서열과 비교하여 사용된attL 서열 또는 서열 4에 따르는 천연attR 서열과 비교하여 사용된attR 서열이 하나 이상의 치환물을 갖는 방법에 관한 것이다. 따라서, 상기 재조합 서열 중의 한 서열에서의 하나 이상의 치환물이 다른 재조합 서열에서의 상응하는 치환물을 필연적으로 보유하지는 않는다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 양태에서는,attB 서열이 21개 뉴클레오티드를 포함하고, 이. 콜라이 게놈으로부터 최초로 분리된 서열에 상응하며[참조: Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220],attP 서열은 243개 뉴클레오티드를 포함하고 박테리오파아지 람다 게놈으로부터 최초로 분리된 서열에 상응한다[참조: Landy, A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147].
본 발명에 따르는 방법의 추가의 바람직한 양태에서는,attL 서열은 102개 뉴클레오티드를 포함하고,attR 서열은 162개 뉴클레오티드를 포함하는데, 양 서열은 이. 콜라이 게놈으로부터 최초로 분리된 서열에 상응한다[참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913].
재조합 서열 이외에도 본 발명의 방법을 수행하기 위해서는, 제1 DNA 서열이 진핵 세포의 게놈 내의 목적하는 표적 유전자좌 내로 통합할 수 있도록 하는 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 재조합은 내부 세포의 재조합 기전에 의해 매개되는 상동 재조합을 통하여 이루어진다. 상기 재조합의 경우, 추가의 DNA 서열은 표적 유전자좌의 DNA와 상동성이어야 하고, 또한attB 및attL 서열의 3'와 5'에 각각 위치해야 한다. 당해 분야의 숙련가에게는, 상동 재조합이 충분한 확률로 일어나도록 각각의 3' 및 5' 서열이 어느 정도 길이여야 하고, 상동성이 얼마만큼 높아야 하는지가 공지되어 있다[참조: Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288].
attP 및attR 재조합 서열을 각각 갖는 제2 DNA 서열은 또한 상동 재조합을 통하여 목적하는 표적 유전자좌 내로 통합시키는데 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 경우에, 마찬가지로 제1 DNA 서열 및/또는 제2 DNA 서열은 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 양 DNA 서열이 추가의 DNA 서열을 포함하는 방법이 바람직하다.
추가의 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않으며, 2개의 상이한 DNA 분자 상에 존재하는 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열의 도입은 연속적으로 및 공형질전환으로 수행할 수 있다. 추가의 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않는 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열이 존재하고, 이를 단일 DNA 분자 상에서 진핵 세포 내로 도입하는 방법이 바람직하다. 더우기, 제1 DNA 서열을 세포 내로 도입하고 제2 DNA 서열을 또 다른 세포 내로 도입할 수 있는데, 여기서, 후속적으로 이들 세포를 융합시킨다. 융합이란 용어는 유기체의 교배 뿐만 아니라, 광범위한 의미의 세포 융합을 의미한다.
본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들면, 분자내 재조합에서 우회 배향된 재조합 서열 사이에 놓여진 DNA 절편을 역위시킬 수 있다. 더우기, 본 발명의 방법을 사용하여, 분자내 재조합에서 정배향된 재조합 서열 사이에 놓여진 DNA 절편을 결실시킬 수 있다. 이러한 재조합 서열이 각각 5'-3' 또는 3'-5' 배향으로 혼입되는 경우, 이들은 정배향으로 존재한다. 예를 들어,attB 서열이 5'-3' 배향으로 통합되고attP 서열이 3'-5' 배향으로 통합되는 경우에는, 상기 재조합 서열은 우회 배향으로 존재한다. 재조합 서열이 엑손의 인트론 서열 5' 및 3'에서 상동 재조합을 통하여 각각 혼입되고 재조합이 인테그라제에 의해 수행된다면, 이러한 엑손은, 우회 배향된 재조합 서열의 경우에는 역위될 수도 있고, 정배향된 재조합 서열의 경우에는 결실될 수도 있다. 이러한 과정을 이용하여, 각각의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 이의 활성이나 기능을 상실할 수 있거나, 또는 상기 역위 또는 결실에 의해 전사가 중단되어 전사체가 전혀(완전히) 생성되지 못할 수 있다.이러한 방식으로, 예를 들면, 상기와 같이 암호화된 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 연구 조사할 수 있다.
그러나, 제1 및/또는 제2 DNA 서열은 관심있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 구조 단백질, 효소 또는 조절 단백질을 상기 재조합 서열을 통하여, 분자내 재조합 후에 일시적으로 발현되는 게놈 내로 도입할 수 있다. 이와 같이 도입된 폴리펩타이드는 내인성이거나 외인성 폴리펩타이드일 수 있다. 추가로, 마커 단백질을 도입할 수도 있다. 당해 분야의 숙련가는 이와 같이 열거하는 본 발명에 따르는 방법의 적용 예가 단지 예시적이며, 이에 제한되지 않는다는 것을 인지한다. 지금까지 사용된 Cre 및 Flp 레콤비나제를 이용하여 수행된 본 발명에 따르는 적용 예는 문헌[참조예: Kilby, N. et al., (1993), Trends Genet., 9, pp. 413]에서 발견할 수 있다.
더우기, 본 발명의 방법을 사용하여, 에피좀성 기질 상에서의 분자내 재조합에 의해 벡터 상의 DNA 절편을 결실시키거나 역위시킬 수 있다. 결실 반응을 이용하여, 예를 들면, 소위 헬퍼 바이러스로부터 팩키징 서열을 결실시킬 수 있다. 이러한 방법은 유전자 요법 적용을 위한 바이러스 벡터의 산업적 생산에 광범위하게 적용된다[참조: Hardy, S. et al., (1997), J. Virol., 71, pp. 1842].
분자간 재조합으로 인해, 각각attB와attP의 복사체 또는attL과attR의 복사체를 갖는 2개의 DNA 분자가 융합된다. 예를 들면,attB는 먼저 상동 재조합을 통하여, 널리 특성화되고 공지된 세포의 게놈 유전자좌에 도입할 수 있다. 후속적으로,attP 보유 벡터를 분자간 재조합을 통하여 상기 게놈attB 서열 내로 통합시킬 수 있다. 이러한 방법에서는, 이의 유전자가 공형질감염되는 제2 DNA 벡터 상에 위치하는 돌연변이체 인테그라제 Int-h/218를 발현시키는 것이 바람직하다. 추가의 서열이attP 보유 벡터, 예를 들면,loxP/FRT서열에 의해 플랭킹된 특정한 마커 단백질에 대한 유전자 상에 위치할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여, 예를 들면, 특정 세포 유형의 상이한 유전자의 비교 발현 분석에서, 상기 유전자가 각각의 게놈 통합 유전자좌에 의해 긍정적이거나 부정적인 영향을 받지 않도록 할 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해서는, 인테그라제가 상기 재조합 서열 상에서 작용해야만 한다. 인테그라제 또는 인테그라제 유전자 및/또는 Xis 인자 또는 Xis 인자 유전자는 당해 제1 및 제2 DNA 서열을 도입하기 이전에 이미 진핵 세포 내에 존재할 수 있다. 이들은 또한 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열을 도입하는 사이에 도입할 수 있거나, 제1 DNA 서열과 제2 DNA 서열을 도입한 후에 도입할 수 있다. 서열 특이적 재조합에 사용된 인테그라제는 바람직하게는, 당해 반응이 수행되는 세포에서 발현된다. 이를 위하여, 인테그라제 유전자를 포함하는 제3 DNA 서열을 세포 내로 도입한다.attL/attR을 이용하여 서열 특이적 재조합을 수행하는 경우에는, Xis 인자 유전자(제4 DNA 서열)를 또한 상기 세포 내로 도입할 수 있다. 상기 제3 및/또는 제4 DNA 서열을 상동 재조합에 의해 또는 무작위로 세포의 진핵생물 게놈 내로 통합시키는 방법이 가장 바람직하다. 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 인테그라제 유전자 및/또는 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는 시간적 발현을 실행시키는 조절 서열을 포함하는 방법이 추가로 바람직하다.
이러한 경우, 공간적 발현은 레콤비나제와 Xis 인자 각각이 세포 유형 특이적 프로모터의 사용에 의해 특정한 세포 유형에서만 발현되고 단지 이들 세포, 예를 들면, 간 세포, 신장 세포, 신경 세포 또는 면역계 세포에서만 재조합을 촉매한다는 것을 의미한다. 인테그라제/Xis 인자 발현의 조절에서는, 시간적 발현이 활성 형태인 프로모터들에 의해 달성되거나, 특정한 발생 단계 또는 성인 유기체에서의 특정 시점에서 달성될 수 있다. 더우기, 시간적 발현은 유도성 프로모터, 예를 들면, 인터페론 또는 테트라사이클린 의존된 프로모터를 사용함으로써 달성할 수 있다[참조: Muller, U. (1999), Mech. Develop., 82, pp. 3].
본 발명의 방법에 사용된 인테그라제는 박테리오파아지 람다의 야생형 및 변형된 인테그라제 둘 다일 수 있다. 야생형 인테그라제는 조인자, 즉 IHF를 사용한 재조합 반응만을 수행할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법에 변형된 인테그라제를 사용하는 것이 바람직하다. 야생형 인테그라제가 본 발명의 방법에 사용된 경우에는, 재조합 반응을 위해 IHF가 또한 필요하다. 변형된 인테그라제는, 이러한 인테그라제가 IHF를 사용하지 않고서도 재조합 반응을 수행할 수 있도록 변형된 것이다. 변형된 폴리펩타이드의 생성과 목적하는 활성에 대한 스크리닝은 현 기술 수준이며, 이는 용이하게 수행할 수 있다[참조: Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press]. Int-h 및 Int-h/218로서 명명된 2개의 Int 돌연변이체가 바람직한 박테리오파아지 람다 인테그라제이다[참조: Miller et al. (1980) Cell, 20, pp. 721; Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825]. Int-h는 야생형 Int-h와 비교해서 174번 위치에 글루타메이트 잔기 대신에 리신 잔기를포함한다. Int-h/218은 218번 위치에 글루타메이트 잔기 대신에 추가의 리신 잔기를 포함하고, 이는 Int-h 유전자의 PCR 돌연변이 유발에 의해 생성된다. 상기 돌연변이체는 이. 콜라이 및 시험관내에서 조인자 IHF, Xis 및 음성 초나선화를 이용하지 않고서도, 즉 반응 튜브 내의 정제된 기질을 이용하여attB/attP간의 재조합 뿐만 아니라,attL/attR간의 재조합을 촉매할 수 있다. 진핵 세포에서는, 상기 돌연변이체가attL/attR간의 재조합을 위한 조인자 Xis만을 필요로 한다.attL/attR간의 재조합 효율을 추가로 개선시키는 것은 추가의 조인자, 예를 들면, FIS를 사용하여 달성할 수 있다. 돌연변이체 Int-h/218이 바람직한데, 이는 이러한 돌연변이체가 조인자-독립적 통합 반응을 증대된 효율로 촉매할 수 있기 때문이다[참조: Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825].
본 발명의 방법은 모든 진핵 세포에서 수행할 수 있다. 이 세포는, 예를 들면, 세포 배양물에 존재할 수 있고, 모든 유형의 식물 세포와 동물 세포를 포함한다. 예를 들면, 상기 세포는 난모 세포, 배아 간세포, 조혈 간세포 또는 어떠한 유형의 분화된 세포일 수 있다. 진핵 세포가 포유류 세포인 방법이 바람직하다. 이러한 포유류 세포가 사람, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 염소, 소, 양 또는 돼지 세포인 방법이 보다 바람직하다.
더우기, 본 발명의 바람직한 양태는, 임의로 DNA의 제2 서열 특이적 재조합을 박테리오파아지 람다 인테그라제와 Xis 인자에 의해 수행하는 방법에 관한 것이다. 이러한 제2 재조합은attB와attP서열 또는 이의 유도체의 제1 재조합에 의해 발생된attL과attR 서열을 필요로 한다. 따라서, 제2 서열 특이적 재조합은제1 서열 특이적 재조합에서attB 및attP서열 또는 이의 유도체를 사용하는 방법으로 제한된다. 야생형과 Int 돌연변이체 둘 다는 추가의 인자를 부가하지 않고서도 소위 통합성 재조합만을 촉매할 수 있는데, 즉 이들은 세포 게놈 내로 안정적으로 통합되는 경우에attB를attP와 재조합시키지만,attL을attR과 재조합시키지는 않는다. 야생형 인테그라제는 소위 절단성 재조합을 위해, 인자 IHF, Xis 및 음성 초나선화를 필요로 한다. Int 돌연변이체인 Int-h 및 Int-h/218은 절단성 재조합을 위해, Xis 인자만을 필요로 한다. 따라서, 제2 재조합 반응, 즉 절단 반응에 대한 추가의 인자가 세포 내에 존재한다면, 조절된 방식으로 하나의 재조합 반응물을 방출시킨 다음, 다른 재조합 반응물을 방출시킴으로써 두 재조합 반응물을 방출시키는 것이 가능하다. 고등 진핵생물의 게놈의 조작을 조절하기 위해, 기존에 사용된 기타 재조합 시스템과 함께, 새로운 전략을 개발할 수 있다. 이것은, 상이한 재조합 시스템이 단지 이들 자신의 재조합 서열만을 이용하기 때문에 가능한 일이다.
예를 들면, Int 시스템을 사용하여,loxP및/또는FRT서열을 표적화 방식으로 진핵생물 게놈의 게놈 유전자좌 내로 통합시킬 수 있고, 이어서 Cre 및/또는 Flp를 조절하여 발현시킴으로써 유전자를 각각 활성화 및 불활성화시킬 수 있다. 이러한 Int 시스템을 사용하여, 사용 후, 즉 각각의 레콤비나제로 재조합한 후에 게놈으로부터loxP/FRT서열을 추가로 결실시킬 수 있다.
더우기, Xis 인자 유전자를 포함하는 추가의 DNA 서열을 상기 세포 내로 도입하는 방법이 바람직하다. 추가의 DNA 서열이 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는시간적 발현을 실행시키는 조절 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법이 가장 바람직하다.
예를 들면, 특정한 세포 유형에서 유전자의 활성화/불활성화를 야기시키는, Int를 통해 분자내 통합성 재조합(역위)을 성공적으로 수행한 후, Int를 동시에 발현시키면서 Xis의 공간적 및/또는 시간적 발현을 유도함으로써 이후 시점에서 상기 유전자를 다시 불활성화시키거나 활성화시킬 수 있다.
더우기, 본 발명은 진핵 세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는데 있어서의, 서열 1에 따르는attB 서열 또는 이의 유도체 및 서열 2에 따르는attP 서열 또는 이의 유도체, 또는 서열 3에 따르는attL 서열 또는 이의 유도체 및 서열 4에 따르는attR 서열 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다. 이러한 진핵 세포는 이의 세포 내에 인테그라제 또는 Xis 인자를 전혀 갖지 않는 유기체, 예를 들면, 포유류의 세포 응집체로 존재할 수 있다. 상기 유기체는 이의 세포 내에 인테그라제 또는 Xis 인자를 갖는 기타 유기체와 함께 육종하는데 사용될 수 있어 자손이 생겨나는데, 이때 서열 특이적 재조합이 이러한 자손 세포에서 수행된다. 따라서, 본 발명은 또한 진핵 세포에서의 서열 특이적 재조합에 있어서의, 인테그라제 또는 인테그라제 유전자, 및 Xis 인자 또는 Xis 인자 유전자의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은attB와 약 85%의 상동성을 나타내는 서열(본원에서attH로서 명명됨)을 사람 게놈에서 동정하였다.attH는 외래 DNA를 사람 게놈 내로 통합시키기 위한 재조합 서열로서 사용될 수 있다. 따라서, 제2 재조합 서열attP가 이에 따라 변형될 수 있어, 상기 인테그라제가 재조합 반응을 고효율로 수행할 수 있게 된다. 본 발명자들은attH가 본 발명자들에 의해 변형된attP의 버젼(이는 본원에서attP*로 명명되고 이. 콜라이에서 Int-h에 의해 서열 5로서 제시됨)과 재조합될 수 있다는 사실을 입증할 수 있었다. 사람 세포를 이용한 실험 결과, Int-h가 상기 세포에 의해 일시적으로 합성되는 경우에는attH가 또한 사람 게놈의 일부로서attP*와 재조합된다는 사실이 입증되었다.
attP 재조합 서열을 갖는 외래 환상 DNA를 표적화 방식으로 사람 게놈의 천연attH 유전자좌 내로 안정하게 통합시킬 수 있다는 가능성에 관심이 집중된다.attH는 사람 게놈 내에 천연 상태로 발생하는 재조합 서열에 대한 한 예일 뿐이다.attB와의 상동성을 나타내는 휴먼 게놈 프로젝트(Human Genome Project) 내에서 추가의 서열을 동정할 수 있고, 이는 또한 외래 DNA를 사람 게놈 내로 통합시키는데 사용할 수 있다. 사람 게놈에 존재하고attB와 상동성인 상기 서열에 의존하여, 외래 환상 DNA 내의 상응하는attP 재조합 서열을 선택한다. 천연attP 서열의 핵산 서열을 포함한 외래 환상 DNA가 바람직하다. 6개 이하, 바람직하게는 1개 내지 5개, 특히 3개의 치환물을 갖는 천연attP 서열의 유도체가 보다 바람직하다.attP와의 상동성이 약 95%인 서열 5에 따르는attP*핵산 서열을 포함하는 외래 환상 DNA가 가장 바람직하다.
인테그라제는 폴리펩타이드로서 또는 발현 벡터를 통하여 세포 내로 전달할 수 있다. 인테그라제 유전자는, 변형되거나 천연attP 서열 또는attP*서열을 포함하는 DNA 분자 상에 발현 가능한 핵산 서열로서 추가로 존재할 수 있다. 천연attP 서열, 또는 이의 유도체 또는 상동체, 특히 서열 5에 따르는attP*서열을 포함한 외래 환상 DNA는 게놈 내로 도입될 치료학적 유전자 또는 유전자 단편을 포함하기도 한다. 치료학적 유전자는, 예를 들면, CFTR 유전자, ADA 유전자, LDL 수용체 유전자, β-글로빈 유전자, 인자 VIII 또는 인자 IX 유전자, 알파-1-안티트립신 유전자 또는 디스트로핀 유전자일 수 있다. 외래 환상 DNA는, 예를 들면, 기존에 체세포 유전자 요법에 사용되어 온 바이러스 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 또한 세포 특이적일 수 있어, 이것이 유전자 요법에 요망되는 세포, 예를 들면, 상피 폐 세포, 골수 간세포, T 림프구, B 림프구, 간 세포, 신장 세포, 신경 세포, 골격근 세포, 조혈 간세포 또는 섬유아세포만을 형질감염시킨다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 열거가 단지 치료학적 유전자 및 표적 유전자의 선택일 뿐이고, 기타 유전자와 표적 세포가 유전자 요법에 또한 사용될 수 있다는 것을 인지한다. 유전자 단편은, 예를 들면, 치료학적 유전자의 결실물, 단일 엑손, 안티센스 핵산 서열 또는 리보자임을 포함한다. 더우기, 유전자 단편은 특정 유전자, 예를 들면, 취약-X-증후군 유전자의 트리뉴클레오티드 반복 서열을 포함한 유전자의 절편을 포함할 수 있다.
야생형 인테그라제가 재조합에 사용되는 경우에는 IHF가 존재해야만 한다. IHF를 사용하지 않고서 재조합을 수행할 수 있는 변형된 인테그라제를 사용하는 것이 바람직하다. Int-h 또는 Int-h/218을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 천연attP 서열, 또는 이의 유도체 또는 상동체에 관한것이다. 특히, 본 발명은 서열 5에 따르는attP*핵산 서열에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 천연attP 서열 또는 이의 유도체, 특히 서열 5에 따르는attP*핵산 서열, 및 치료학적 유전자 또는 이의 유전자 단편을 포함하는 추가의 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 치료학적 유전자가 CFTR 유전자, ADA 유전자, LDL 수용체 유전자, 알파 또는 베타 글로빈 유전자, 알파-1-안티트립신 유전자, 인자 VIII 또는 인자 IX 유전자, 또는 이의 단편을 포함하는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는 치료학적 유전자 또는 이의 유전자 단편의 발현을 역시 조절하는 조절 DNA 요소를 포함할 수 있다.
더우기, 본 발명은 인의학 또는 수의학용 약제로서의 상기 벡터의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 체세포 유전자 요법에 대한 약제를 제조하기 위한 상기 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는 예를 들어, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 당해 벡터는 에어로졸에 의해 복용할 수도 있다. 추가의 적용은 당해 분야의 숙련가에게 명백하다.
1. 발현 및 기질 벡터의 생산
1.1 발현 벡터
야생형 Int에 대한 진핵생물 발현 벡터(pKEXInt), Int-h에 대한 진핵생물 발현 벡터(pKEXInt-h), Int-h/218에 대한 진핵생물 발현 벡터(pKEXInt-h/218) 및 pEL13은 pKEX-2-XR의 유도체이다[참조: Rittner et al. (1991), Methods Mol. Cell. Biol., 2, pp. 176]. 상기 벡터는 사람 사이토메갈로 바이러스 프로모터/인핸서 요소(CMV)와, 소형 원숭이 바이러스 40(SV 40) 종양 항원의 RNA 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널 요소를 포함한다. Int 유전자를 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 클로닝시킨다: Int 유전자의 5' 말단에 위치한 (3343) 5'- GCTCTAGACCACCATGGGAAGAAGGCGAAGTCA-3' 및 3' 말단에 위치한 (3289) 5'-AAGGAAAGCGGCCGCTCATTATTTGATTTCAATTTTGTCC-3'. 변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(4분), 프라이머 결합(55℃, 45초), DNA 합성(72℃, 2분) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다. 이로써 생성된 PCR 단편을 XbaI 및 NotI을 사용하여 pKEX-2-XR 벡터 내로 클로닝시킨다. 주형으로서 벡터 pHN16으로부터 Int-h를 생성시켰다[참조: Lange-Gustafson, B. and Nash, H. (1989) J. Biol. Chem., 259, pp. 12724]. 주형으로서 pTrcInt 및 pTrcInt-h/218로부터 각각 야생형 Int 및 Int-h/218을 생성시켰다[참조: Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825]. pEL13은 Int-h 유전자 이외에도attP*의 복사체를 보유한다.
attP로부터 출발하여,attP*를 PCR 돌연변이 유발에 의해 작제하였다. 다음의 올리고뉴클레오티드가 사용되었다:
(O3) 5'-GTTCAGCTTTTTGATACTAAGTTG-3',
(O4) 5'-CAACTTAGTATCAAAAAGCTGAAC-3',
(PC) 5'-TTGATAGCTCTTCCGCTTTCTGTTACAGGTCACTAATACC-3' 및
(PD) 5'-ACGGTTGCTCTTCCAGCCAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3'.
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(4분), 프라이머 결합(57℃, 1분 30초), DNA 합성(72℃, 1분 30초) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다. 이로써 생성된 PCR 생성물을 제한 효소 SapI와 함께 항온 배양한 다음, SapI로 절단시킨 pKEXInt-h에 연결시킨다. 대조군 플라스미드 pKEX는 어떠한 Int 유전자도 보유하지 않는다.
1.2 기질 벡터
기질 벡터는 pEGFP의 유도체이다(구입처: Clontech). 재조합 카셋트는 CMV 프로모터의 조절하에 있으므로, 강력한 구성 발현을 보장해준다. 먼저 AgeI 및 BamHI에 의해 pEGFP로부터 GFP 유전자(녹색 형광 단백질)를 절단함으로써, pGFPattB/attP를 작제하였다. 야생형attB 서열을 이본쇄 올리고뉴크레오티드로서, 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 AgeI로 절단시킨 벡터 내로 삽입하였다:
(B1OB) 5'-CCGGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGAACGC-3' 및
(BOB1) 5'-AATTGCGTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAA-3'.
다음 프라이머를 사용하여, 야생형attP 서열을 벡터 pAB3[참조: Droge, P. and Cozzarelli, N. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 86, pp. 6062]으로부터 PCR에의해 증폭시켰다:
(p7) 5'-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3' 및
(p6) 5'-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3'.
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(4분), 프라이머 결합(54℃, 30초), DNA 합성(72℃, 30초) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다.attP를 보유하는 PCR 단편을 XmaI 및 BamHI로 분해하고, GFP 유전자를 보유하는 제한 단편에 연결시킨다. 상기 GFP 제한 단편은 AgeI 및 EcoRI을 사용하여 pEGFP로부터 생성시킨다. 이러한 연결 생생물을 MfeI/BamHI로 절단시킨attB 보유 벡터 내로 클로닝시킨다. 이로써 생성된 기질 벡터는 CMV 프로모터를 기준으로 하여 역배향으로 GFP 유전자를 보유하는데, 이의 통합성 재조합에서의 기능은 이. 콜라이에서 야생형 Int로 시험하였다.
재조합 서열을 예외로 하면, pGFPattL/attR은 pGFPattB/attP와 동일하다. 이러한 벡터는 먼저 이. 콜라이에서 pGFPattB/attP를 재조합하여attL과attR을 형성시킴으로써 작제하였다. 후속적으로, CMV 프로모터를 기준으로 하여 정배향된 GFP 유전자를 BsiEI 및 HindIII과의 부분 제한 반응으로 절단하였다. 상기 GFP 유전자를 무엇보다도 먼저, 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 이를 CMV 프로모터를 기준으로 하여 역배향으로 삽입시킨다:
(p2) 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3' 및
(p3) 5'-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3'(도 3).
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(4분), 프라이머 결합(56℃, 45초), DNA 합성(72℃, 1분) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다. 후속적으로, PCR 단편을 HindIII 및 BsiEI로 절단시키고,attL 및attR을 포함한 부분 절단된 벡터 내로 역배향으로 통합시킨다. 이로써, pGFPattL/attR은attB/attP 대신에attL/attR이 존재한다는 것을 제외하고는 pGFPattB/attP와 동일한 전체적인 구조를 나타낸다.
사람attB 상동체인attH를 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 정제된 사람 DNA로부터 증폭시켰다:
(B3) 5'-GCTCTAGATTAGCAGAAATTCTTTTTG-3' 및
(B2) 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3'.
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(5분), 프라이머 결합(42℃, 1.45분), DNA 합성(72℃, 1.45분) 및 72℃에서 10분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다.attH를 생성시키기 위한 프라이머 서열은 EST(수탁 번호: N31218; EMBL-데이터베이스)로부터 취하였다. 상기 데이터베이스에 존재하는 바와 같은 완전하지 못한attH 서열을 확인하고, 이를 상기 분리된 PCR 생성물(192bp)을 서열화함으로써 완전하게 만들었다. 후속적으로, 이러한 단편을 XbaI 및 PstI로 분해하고, 상응하게 처리된 벡터 pACYC187[구입처: New England Biolabs] 내로 삽입하였다.attP*를 문헌[참조: Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825]에 기재된 바와 같이 표적화 돌연변이 유발에 의해 생성시키고, 이를attH와 역배향으로attH 보유 벡터 내로 삽입하였다. 이러한 작제 결과, 시험용 벡터 pACH가 생성된다.
플라스미드 DNA를 친화성 크로마토그래피[구입처: Qiagen, Germany]에 의해 이. 콜라이 균주 DH5α[참조: Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, pp. 557]로부터 분리하였다. 발현 및 기질 벡터 뿐만 아니라 모든 PCR 발생된 작제물은 형광계 373A DNA-서열화 시스템[구입처: Applied Biosystems]을 통하여 조절하였다. PCR 반응을 "마스터 믹스 키트(Master Mix Kit)"[구입처: Qiagen, Germany]로 수행하고, 이로써 생성된 생성물을 TBE 완충액 중에서 아가로즈 겔 전기영동(0.8%w/v)에 의해 분석하였다.
2. 세포 배양 및 리포터 세포주의 작제
사람 버킷트(Burkitt) 림프종 세포주[BL 60; (Wolf, J. et al., (1990) Cancer Res., 50, pp. 3095)]를 사용하여 일시적인 발현 및 재조합 분석을 수행하였다. BL60 세포를, 10% 태아 송아지 혈청이 보강되고 2mM L-글루타민, 스트렙토마이신(0.1mg/ml) 및 페니실린(100단위/ml)을 포함하는 RPMI1640 배지[구입처: Life Technologies, Inc.]에서 배양하였다.
게놈 내로 안정적으로 통합된 pGFPattB/attP 또는 pGFPattL/attR을 갖는 BL60 리포터 세포주를 다음과 같이 작제한다: 각 벡터 약 20㎍을 페놀/클로로포름 추출로 정제된 ApaLI으로 선형화시키고, 에탄올로 침전시킨 다음, "바이오-래드 진 펄서(Bio-Rad Gene Pulser)"를 사용하여 260V 및 960mF에서 전기천공에 의해 약 2 x 107개 세포 내로 도입하였다. G418/Genetizin(300㎍/ml)을 사용하여 안정한 세포주를 선택하고, 이어서 PCR, DNA 서열화 및 서던 분석에 의해 이를 특성화하였다.
3. 생체내 재조합 분석
생체내에서 분자내 재조합을 수행하기 위하여, 각각의 BL60 리포터 세포주 약 2 x 107개 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 전기천공에 의해 각 환상 발현 벡터 40㎍으로 형질감염시킨다. 이 세포를 원심분리에 의해 72시간 후에 수거하고, 이러한 세포 절반의 게놈 DNA을 제조업자[Qiaamp Blood kit, Qiagen, Germany]의 지시에 따라서 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이러한 세포 절반으로부터, RNA를 분리하거나[Rneasy kit, Qiagen, Germany] 또는 웨스턴 분석을 위한 세포 용해물을 제조하였다(실시예 4 참조).
pACH로의 재조합 분석은 레콤비나제 Int, Int-h 및 Int-h/218을 사용하여 문헌[참조: Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825]에 기재된 바와 같이 이. 콜라에서 수행하였다. 예상된 pACH의 재조합은 역위를 유발시키는데, 이는 HindIII 및 AvaI로의 제한 분석에 의해 입증되었다.
BL60 세포의 게놈성 국재된attH 유전자좌 내로 pEL13을 통합시키기 위한 분자간 재조합을 다음과 같이 수행하였다: 2 x 107개 세포를 상기 언급된 바와 같이 전기천공을 통하여, 20㎍의 환상화 pEL13으로 형질감염시킨다. 이 세포를 48시간 후에 1 x 106개 세포/ml 선택 배지(200㎍/ml 하이그로마이신 B)의 농도로 도말하고, 6 내지 8주 동안 항온 배양한다. 생존하는 각각의 세포 집단의 일정 부분으로부터, 제조업자[Qiaamp Blood kit, Qiagen, Germany]의 지시에 따라서 항온 배양한 후에 게놈 DNA를 제조하였다.
분자내 통합성 및 절단성 재조합을 입증하기 위하여, 0.4㎍의 게놈 DNA를 다음 프라이머 20 내지 50pmol을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
(p1) 5'-GGCAAACCGGTTGAAGCCTGCTTTT-3';
(p2) 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3';
(p3) 5'-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3';
(p4) 5'-AACCTCTACAAATGTGGTATGG-3';
(p5) 5'-TACCATGGTGATGCGGTTTTG-3';
(p6) 5'-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC 및
(p7) 5'-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3'.
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(5분), 프라이머 결합(57℃, 45초), DNA 합성(72℃, 1.5분) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다.
pEL13의 분자간 통합성 재조합을 다음과 같이 검출하였다: 생존하는 세포 집단의 게놈 DNA 약 400ng을 PCR 프라이머로서 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 항온 배양하였다:
(attx1) 5'-AGTAGGAATTCAGTTGATTCATAGTGACTGC-3' 및
(B2) 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3'.
변성(95℃, 45초)을 30주기 수행한 95℃에서의 제1 변성 단계(4분), 프라이머 결합(52℃, 45초), DNA 합성(72℃, 45초) 및 72℃에서 4분 동안의 최종 합성 단계 후에 증폭을 수행하였다.
분리된 RNA 4㎍을 이용하여 역전사효소 PCR(RT-PCR)을 수행하였다. 첫째, 제조업자[First Strand Synthesis Kit, Pharmacia]의 지시에 따라서 올리고-dT 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성한다. 둘째, 상기 cDNA의 1/4을, 프라이머 p3과 p4를 사용하여 후속 PCR을 위한 주형으로서 사용한다. 역위 대신에 결실을 시험하기 위해, 분리된 게놈 DNA을 프라이머 p5와 p6을 사용하여 증폭시킨다. 다음 프라이머를 사용하여 상기 cDNA로부터 출발하여, 베타 액틴 전사체를 분석한다:
(AS) 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3' 및
(S) 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'.
PCR 조건은 p1 내지 p7에 대해 기재된 바와 같다.
문헌[참조: Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning(2nd Edt.) Cold Spring Harbor Laboratory Press]의 프로토콜에 따라서 서던 분석을 필수적으로 수행하였다. 약 10㎍의 게놈 DNA를 NcoI로 단편화시키고, TBE 완충액 중에서 아가로즈 겔 전기영동(0.8% w/v)에 의해 분리시킨 다음, 밤새 나일론 막으로 옮긴다. 프라이머 p2와 p3을 사용하여 PCR에 의해, 재조합을 검출하기 위한 GFP 프로브를 생성시킨다. 제조업자[Megaprime, Amersham]의 지시에 따라서32P 표지된 dATP 및 dCTP를 사용하여, 방사성 표지화를 수행한다.
4. 웨스턴 분석
일시적으로 형질감염된 세포를 프로브 완충액[New England Biolabs]에서 5분 동안 비등시킴으로써, 상기 세포의 세포 용해물을 생성시켰다. 당해 단백질을 이들의 분자량에 따라서 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리시키고, 이를 밤새 니트로셀룰로즈 막[Immobilon P, Millipore] 상으로 옮긴다. 이러한 막을 1% 차단 용액[BM Chemiluminescence Western Blotting Kit, Boehringer Mannheim, Germany]으로 처리하고, 1:50.000의 희석률로 야생형 Int에 대해 지시된 마우스의 폴리클로날 항체[구입처: A. Landy, USA]와 함께 항온 배양한다. 퍼옥시다제에 커플링된 2차 항체를 사용하여, 겔에서의 인테그라제의 위치를 가시화하였다[BM Chemiluminescence Western Blotting Kit, Boehringer Mannheim, Deutschland]. 야생형 Int를 함유하는 이. 콜라이 세포 추출물을 대조군으로서 사용하였다.
5. 결과
5.1 BL60 세포에서의 Int-h의 합성
Int-h가 사람 세포에서 재조합을 촉매할 수 있는지를 시험하기 위해서는, 상기 레콤비나제가 상기 세포로부터 합성될 수 있는지를 결정하는 것이 필요하다. 따라서, CMV 프로모터의 조절하에 Int-h 유전자를 보유하는 진핵생물 발현 벡터 pKEXInt-h를 통합하였다. pKEXInt-h를 2개의 상이한 BL60 리포터 세포주, 즉 B2와 B3 내로 도입시킨 후, Int-h 유전자에 특이적인 완전하고도 정확하게 변형된 전사체를 RT-PCR 분석에 의해 검출할 수 있었다. pKEXInt-h로 전기천공시킨지 72시간 후에 세포 용해물을 웨스텐 분석으로 연구 조사하였다. 이러한 레콤비나제의 검출은 야생형 Int에 대해 지시된 마우스의 폴리클로날 항체를 사용하여 수행하였다. pKEX를 대조군으로서 상기 세포 내로 도입하였다.
그 결과, 예상 분자량을 갖는 단백질이 전기천공에서 pKEXInt-h로 처리된 세포에 존재한다는 것이 입증되었다. 상기 단백질은 대조군 벡터 pKEX가 사용된 경우에는 검출할 수 없었다.
5.2. Int-h는 사람 세포에서 통합성 분자내 재조합을 촉매하였다
웨스턴 분석 결과, Int-h 단백질이 벡터 pKEXInt-h로부터 출발하여 2개의 리포터 세포주로부터 합성된다는 것이 입증되었다. 상기 세포는 이들의 게놈 내로 안정적으로 통합된 외래 DNA로서, 기질 벡터 pGFPattB/attP를 함유한다. 이러한 통합성 재조합을 위한 2개의 재조합 서열, 즉attB와attP는 서로에 대해 역배향으로 위치하며, GFP에 대한 유전자를 플랭킹한다. 이러한 GFP 유전자 자체는attB의 상류에 위치한 CMV 프로모터에 대해 역배향으로 위치한다. Int-h에 의한attB와attP간의 재조합으로 인해, GFP 유전자가 역위되고, 이로써 이의 발현이 유도된다. 3개의 리포터 세포주(B1 내지 B3)를 전부 작제하였다. 이들의 게놈 DNA를 서던 분석한 결과, 직방향 반복 서열로서의 pGFPattB/attP의 몇몇 복사체가 B1과 B3의 게놈 내로 통합된 반면, 세포주 B2는 단지 1개의 복사체만을 함유하고 있다는 사실이 밝혀졌다. 이와 같이 통합된 서열을 PCR에 의해 확인하고, 후속적으로 서열화하였다.
attB와attP간의 재조합을 시험하기 위하여, pKEXInt-h 및 pKEX를 상기 세포주 내로 개별적으로 도입하였다. 이 세포를 전기천공시킨지 72시간 후에 수거하고, RNA를 상기 세포의 일정 부분으로부터 분리시킨 다음, 프라이머 쌍 p3/p4를 사용하여 RT-PCR에 의해 GFP 발현에 대해 연구 조사하였다. GFP 유전자가 재조합으로 인해 역위된다면, 상기 프라이머는 단지 0.99kb 길이의 DNA 단편만을 증폭시켰다. 이러한 결과는 생성물이 3가지 세포주 모두에서 검출 가능하였다는 것을 입증해준다. pKEX를 세포 내로 도입한 경우에는, 어떠한 생성물도 검출할 수 없었다. 분리된 PCR 생성물을 DNA 서열 분석한 결과, GFP 유전자의 암호화 영역이 전사되었고, 이러한 전사체에서attP 대신에attR이 검출될 수 있다는 사실이 확인되었다. 6개 세포 집단 모두에서 뿐만 아니라 역전사효소에 의한 성공적인 제1 쇄 DNA 합성에 대한 RNA 양의 대조군으로서, 내인성 β-액틴 전사체를 PCR로 분석하였다. 그 결과, 상기 전사체가 거의 동일한 양으로 존재하고 있다는 사실이 입증되었다.
게놈 DNA의 직접적인 PCR에 의해서도 재조합이 또한 검출되었다. 그 결과, pKEXInt-h을 세포 내로 도입한 경우에는, 예상 생성물을 프라이머 쌍 p3/p4(0.99kb) 및 p1/p2(0.92kb)를 사용해서만 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 상기 생성물을 DNA 서열화하여 분석한 결과,attR 및attL이 상기 게놈에 존재하고, GFP 유전자가 재조합에 의해 역위되었다는 사실을 확인하였다. 이들 실험을 3회 반복하였는데, 이때attB와attP간의 재조합이 RT-PCR 및/또는 PCR에 의해 3가지 세포주 모두에서 검출 가능하였다. PCR에 의한 GFP 유전자의 결실 검출은 프라이머 쌍 p5/p6을 사용한 경우에 음성이었다. 통합된 벡터로부터 비롯된 1.3kb의 예상 단편만이 증폭될 수 있었다.
PCR에서attB와attP간의 역위를 나타내는 가장 강력한 시그널이, 추가의 실험에서 세포주 B3을 이용한 경우에 반복적으로 수득되었다. 그 결과, 게놈 DNA을NcoI에 의해 단편화하고, 프로브로서의 GFP 유전자를 통하여 서던 분석에 의해 조사하였다. 그 결과, 게놈 DNA의 제한 단편이 세포주 B3에서 검출될 수 있었는데, 이는attB와attP간의 역위 결과로서 예상된 것이다.
야생형 Int와 돌연변이체 Int-h/218이 분자내 통합성 재조합을 촉매할 수 있었는지를 시험하기 위하여, 또한 벡터 pKEXInt-h, pKEXInt-h/218, pKEXInt 및 대조군으로서의 pKEX를 다음의 실시예 2에 기재된 바와 같이 전기천공에 의해 추가의 실험에서 리포터 세포주 B3 내로 도입하였다. 72시간 후에 게놈 DNA를 분리하고, 이를 대상으로 하여, 다음의 실시예 3에 기재된 바와 같이 프라이머 쌍 p5/p7 및 p3/p4를 사용하여 PCR을 통한 재조합을 시험하였다. 그 결과, Int 돌연변이체 둘 다가attB와attP간의 재조합을 촉매할 수는 있지만, 야생형 Int는 불활성이었다는 사실이 밝혀졌다.
5.3attL과attR간의 절단성 재조합은 검출 가능하지 않았다
Int-h는 조인자 IHF와 Xis의 부재하에attL과attR간의 절단성 재조합을 또한 촉매할 수 있기 때문에, 벡터 pGFPattL/attR를 게놈 내로 안정적으로 통합시킨 3가지 BL60 리포터 세포주를 작제하였다. 다시, 상기 세포주는 CMV 프로모터를 기준으로 하여 역배향의 GFP 유전자를 포함하지만,attB와attP 대신에attL과attR에 의해 플랭킹되었다. 다음의 실시예 3에 기재된 바와 같이 상기 레콤비나제에 대한 발현 벡터로서 pKEXInt-h를 사용하여 재조합 분석을 수행하였지만, 이들 결과는 어떠한 역위나 결실도 RT-PCR 또는 PCR에 의해attL과attR간에 검출될 수 없었다는 사실을 입증해주었다.
5.4attB와 유사한 사람 게놈에서 천연 뉴클레오티드 서열의 동정 및 특성화
양 Int 레콤비나제 돌연변이체는 실시예 3에서 입증된 바와 같이 사람 세포에서 통합성 분자내 재조합을 촉매한다. 이러한 반응과 관련된 2개의 재조합 서열 중의 하나, 즉attB는 21bp 길이이고 이. 콜라이 게놈의 천연 부분이다.attB의 소위 코어 인식 영역 서열 상의 몇몇 차이가attP와의 재조합에서 Int-h에 의해 관용되는 것으로 입증되었다[참조: Nash (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143]. 통계학적 관점에서 보면, 사람 게놈 내에attB와 상동성인 기능적 서열이 존재하는 것은 가능한 일이다. 본 발명자들은 데이터베이스 조사에서 발현된 서열 태그(EST) 일부로서 여전히 불완전한 서열을 동정할 수 있었다. 이어서, 상기 서열을 사람 DNA로부터 PCR에 의해 분리한 다음, 클로닝하였다. DNA 서열 분석을 이러한 서열을 완성하였으며, BL60 세포의 게놈 DNA를 이용한 추가의 서던 분석은 상기 서열이 단일 복사 유전자로서 게놈 내에 존재하는 아직 공지되지 않은 사람 유전자의 일부라는 사실을 입증해주었다.
본원에서attH로서 명명된 상기 서열은 3개 위치에서 야생형attB 서열과 상이하다. 이러한 뉴클레오티드 중의 2개는 좌측(B) Int 코어 인식 영역 내에 위치하고, 제3 뉴클레오티드는 소위 중복 영역의 일부이다. 상기 2가지 재조합 서열의 중복 영역의 실체는 Int-h에 의한 효율적인 재조합에 선행 조건이기 때문에,attP의 중복 영역 내의 0 위치에서의 각각의 뉴클레오티드는 티미딘에서 구아닌으로 변하였고, 이로써attP*가 유도되었다.attH 및attP*는 벡터(pACH)에서 역 방향 서열로서 혼입되었고, 이를 대상으로 하여 이. 콜라에서 재조합을 시험하였다. 그 결과, Int-h 및 Int-h/218이 IHF의 부재하에서attH와attP*간의 역위를 촉매하였다는 사실이 입증되었다. 분리된 재조합 생성물에 대한 DNA 서열 분석 결과, 예상된 기전을 이용하여attH와attP*간의 재조합이 발생되었다는 사실을 확인하였다. 이와는 반대로, 야생형 Int는 IHF의 존재하에서도 단지 극히 비효율적으로attH/attP*를 재조합할 수 있다. 따라서,attH는attP*의 복사체를 포함한 외래 DNA의 Int-h 촉매된 통합에 대한 잠재적인 통합 서열이다.
5.5 사람 세포에서attH와attP*간의 통합성 분자간 재조합
사람 게놈의 천연 부분으로서의attH가attP*와 분자간 반응으로 재조합할 수 있는지를 밝혀내기 위해 pEL13을 작제하였다. 상기 벡터는 CMV 프로모터 및 선택 마커로서의 내성 유전자 하이그로마이신의 조절하에 Int-h 유전자 이외에도attP*복사체를 포함한다. pEL13을 BL60 세포 내로 도입한 후, Int-h를 합성할 수 있으며, pEL13의 일부로서 게놈attH와attP*간의 분자간 재조합을 촉매할 수 있다.
pEL13을 실시예 2에 기재된 바와 같이 전기천공을 통하여 BL60 세포 내로 도입하였다. 상기 세포를 선택 압력하에 놓아 두고, 72시간 후에 희석하였다. 생존하는 세포 집단을 대상으로 하여, 프라이머 쌍 attx1/B2를 사용한 PCR에 의해 6 내지 8주 후에 재조합 이벤트를 조사하였다. 그 결과, 생존하는 세포 집단 31개 중의 13개에서,attH에서의 통합이 검출 가능한 것으로 나타났다. 상이한 접근법으로부터의 PCR 생성물을 DNA 서열 분석한 결과, 이들의 실체가 재조합 생성물인 것으로 확인되었다.
Claims (28)
- a) 제1 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계;b) 제2 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계 및c) 박테리오파아지 람다 인테그라제(integrase) Int에 의한 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법.
- 제1항에 정의된 단계 b) 및 c)를 포함하는, 천연 상태이거나 또는 DNA 재조합에 의해 미리 도입시킨 제1 DNA 서열을 이의 게놈 내에 갖는 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 1에 따르는attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하고, 제2 DNA 서열이 서열 2에 따르는attP 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 3에 따르는attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하고, 제2 DNA 서열이 서열 4에 따르는attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하며, 단계 c)에서 부가적으로 Xis 인자가 존재하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 부가적으로 Int 유전자, 또는 Int 유전자 및 Xis 인자 유전자를 각각 포함하는 제3 DNA 서열, 또는 제3 및 제4 DNA 서열이 세포 내로 도입되는 방법.
- 제5항에 있어서, 제3 DNA 서열, 또는 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 Int 유전자 및/또는 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는 시간적 발현을 실행시키는 조절 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, Int가 변형된 인테그라제인 방법.
- 제7항에 있어서, 변형된 Int가 Int-h 또는 Int-h/218인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 부가적으로 "통합 숙주 인자(integration host factor)"(IHF)가 관련되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 DNA 서열이 제1 및/또는 제2 DNA 서열을 상동 재조합에 의해 진핵 세포의 게놈 내로 통합시키는 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 DNA 서열이 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 관심있는 폴리펩타이드가 구조 단백질, 내인성 또는 외인성 효소, 조절 단백질 또는 마커 단백질인 방법.
- 제1항 및 제3항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 DNA 서열이 동일한 DNA 분자 상에서 진핵 세포 내로 도입되는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포가 포유류 세포인 방법.
- 제14항에 있어서, 포유류 세포가 사람, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 염소, 소, 양 또는 돼지 세포인 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서,d) Xis 인자를 사용하지 않고서 단계 a) 내지 c) 또는 a) 및 b)에 따르는 DNA의 제1 서열 특이적 재조합 후에, Int 및 Xis 인자에 의한 DNA의 제2 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, Xis 인자 유전자를 포함하는 추가의 DNA 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 추가의 DNA 서열이 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는 시간적 발현을 실행시키는 조절 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합에 있어서, 서열 1에 따르는attB 서열 또는 이의 유도체 및 서열 2에 따르는attP 서열 또는 이의 유도체, 또는 서열 3에 따르는attL 서열 또는 이의 유도체 및 서열 4에 따르는attR 서열 또는 이의 유도체의 용도.
- 서열 5에 따르는 핵산 서열 또는 이의 유도체.
- 서열 5에 따르는 핵산 서열 또는 이의 유도체와, 치료학적 유전자를 암호화하는 추가의 핵산 서열 또는 이의 DNA 단편을 포함하는 벡터.
- 제21항에 있어서, 치료학적 유전자가 CFTR 유전자, ADA 유전자, LDL 수용체 유전자, β-글로빈 유전자, 인자 VIII 유전자 또는 인자 IX 유전자, 알파-1-안티트립신 유전자 또는 디스트로핀 유전자, 또는 이러한 유전자들 중의 어느 하나의 유전자 단편인 벡터.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 추가의 핵산 서열이 추가의 발현 및/또는 전사 요소를 포함하는 벡터.
- 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 인의학 또는 수의학용 약제로서 사용하기 위한 벡터.
- 체세포 유전자 요법용 약제를 제조하기 위한, 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터의 용도.
- 제1항 또는 제2항의 진핵 세포를 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 적용시킴으로써 수득 가능한 진핵 세포.
- 제26항에 따르는 하나 이상의 세포를 포함하는 형질전환 유기체.
- 제27항에 있어서, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터인 유기체.
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