CZ302620B6 - Zpusob sekvencne specifické rekombinace DNA v eukaryontní bunce - Google Patents
Zpusob sekvencne specifické rekombinace DNA v eukaryontní bunce Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302620B6 CZ302620B6 CZ20020756A CZ2002756A CZ302620B6 CZ 302620 B6 CZ302620 B6 CZ 302620B6 CZ 20020756 A CZ20020756 A CZ 20020756A CZ 2002756 A CZ2002756 A CZ 2002756A CZ 302620 B6 CZ302620 B6 CZ 302620B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- gene
- derivative
- seq
- Prior art date
Links
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims abstract description 118
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 116
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 114
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 101000607560 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102100039936 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 101150031239 xis gene Proteins 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 101150027964 ada gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 2
- 108010015268 Integration Host Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 101150062334 int gene Proteins 0.000 claims 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 47
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 101100109426 Rhodococcus fascians argJ gene Proteins 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 13
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 13
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 12
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- UOJMTSCORVQOHS-UHFFFAOYSA-N pachypodol Natural products COc1cc(ccc1O)C2=C(C)C(=O)c3c(O)cc(C)cc3O2 UOJMTSCORVQOHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 101150025323 SCLT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000001996 DNA Polymerase beta Human genes 0.000 description 1
- 108010001132 DNA Polymerase beta Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150108210 IX gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100055024 Mus musculus Aftph gene Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030476 POU domain class 2-associating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710114665 POU domain class 2-associating factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101710200251 Recombinase cre Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101710145752 Serine recombinase gin Proteins 0.000 description 1
- 108020005088 Superhelical DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 101150016395 atfB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002450 kidney nerve cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008212 organismal development Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 plasmids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 101150021083 recB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Podstatu rešení tvorí zpusob sekvencne specifické rekombinace DNA v eukaryontní bunce in vitro, zahrnující a) zavedení první sekvence DNA do bunky, která obsahuje sekvenci attB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, nebo sekvenci attP podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát, nebo sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát nebo sekvenci attR podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát, b) zavedení druhé sekvence DNA do bunky, jestliže první sekvence DNA obsahuje sekvenci attB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attP podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát a naopak, nebo jestliže uvedená první sekvence DNA obsahuje sekvenci attR podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát a naopak, c) provedení sekvencne specifické rekombinace integrázou Int bakteriofága lambda, kde pod pojmem "derivát" se rozumí sekvence attB, attP, attL a attR, obsahující jednu nebo více, nejvýše však šest substitucí ve srovnání s prírodne se vyskytujícími rekombinacními sekvencemi.
Description
Způsob sekvenčně specifické rekombinace DNA v eukaryontnf buňce
Oblast techniky
Vynález popisuje způsob sekvenčně specifické rekombinace DNA v eukaryontních buňkách, který zahrnuje zavedení první sekvence DNA do buňky, zavedení druhé sekvence DNA do buňky a provedení sekvenčně specifické rekombinace integrázou Int bakteríofága lamba. Výhodné provedení vynálezu popisuje způsob, který dále zahrnuje provedení sekvenčně specifické rekombi10 nace DNA pomocí Int a faktoru Xis. Vynález dále popisuje vektory a jejich použití jako léčebných prostředků.
Dosavadní stav techniky
Řízená manipulace eukaryontních genomů je důležitá metoda zkoumání funkce (funkcí) specifických genů v živých organizmech. Mimo to uvedená manipulace se používá při genových terapeutických metodách v medicíně. V této spojitosti je zvláště důležité vytvoření transgenních zvířat, změna genů nebo genových segmentů (tzv. „genové cílení“) a cílené začlenění cizorodé DNA do genomu vyšších eukaryont. V poslední době by se tyto technologie mohly zdokonalit způsoby charakterizace a aplikace sekvenčně specifických rekombinantních systémů.
Konzervativní sekvenčně specifické DNA rekombinázy se dělí do dvou rodin. Zástupci první rodiny se nazývají „integrázy“ a katalyzují Štěpení a opětné spojení řetězců DNA mezi dvěmi definovanými nukleotidovými sekvencemi, které se budou nazývat rekombinantní sekvence. Rekombinantní sekvence mohou být buď na dvou různých nebo na jedné stejné molekule DNA, což vede k intermolekulámí respektive intramolekulámí rekombinací. V druhém případě výsledek reakce závisí na vzájemné orientaci rekombinantních sekvencí. V případě inverzní, to znamená obrácené orientace rekombinantních sekvencí, se objeví inverze segmentů DNA ležících mezi rekombinantními sekvencemi. V případě přímých, to znamená tandemových repetic rekombinantních sekvencí, dochází k výskytu deleci v substrátu DNA. V případě intermolekulámí rekombinace, to znamená, jestliže obě rekombinantní sekvence se nachází na dvou různých molekulách DNA, dochází k fůzi dvou molekul DNA. Zatímco členové integrázové rodiny obvykle katalyzují intramolekulovou stejně jako intermolekulovou rekombinací, rekombinázy druhé rodi35 ny tzv. „invertázy/resolvázy“ jsou schopny katalyzovat pouze intramolekulámí rekombinaci.
Rekombinázy, které se používají hlavně při manipulaci eukaryontních genomů, patří do rodiny integráz. Uvedené rekombinázy jsou rekombináza Cer pocházející z bakteríofága Pl a rekombináza Flp pocházející z kvasinek (popisuje se v publikaci Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp.3). Rekombinantní sekvence, na které se rekombináza Cre váže, se nazývají loxP. Sekvence
LoxP je nukleotidová sekvence obsahující 34 bp, přičemž obsahuje dvě invertované nukleotidové sekvence o délce 13 bp, mezi nimiž leží mezemík obsahující 8 bp (popisuje se v publikaci Hoess, R. et al„ (1985), J. Mol Biol., 181, pp. 351). Vazebné sekvence pro Flp nazvané FRT se vytvořily podobným způsobem. Avšak liší se od loxP (popisuje se v publikaci Kilby, J. et al., (1993)
Trends Genet., 9, pp. 413). Rekombinantní sekvence se nemohou navzájem nahrazovat, to znamená, že Cre není schopná rekombinovat sekvence FRT a FLP není schopné rekombinovat sekvence loxP. Oba rekombinační systémy jsou aktivní po dlouhou vzdálenost, to znamená, že segment DNA, aby se opačně orientoval nebo deletoval a byl lemován dvěmi sekvencemi loxP nebo FRT, může obsahovat několik 100 000 párů bází.
S uvedenými dvěma systémy se dosáhlo například tkáňové specifické rekombinace v myším systému, chromozomální translokace v rostlinách a zvířatech a řízené indukce exprese genů (popisuje se v publikaci Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp.3). DNA polymeráza beta se deletovala v určitých tkáních myší tímto způsobem, (popisuje se v publikaci Gu, H. et al., (1994)
Science, 265, pp. 103). Dalším příkladem je specifická aktivace onkogenu nádorového viru SV40
-1 CZ 302620 B6 v čočkách myší vedoucí k vytvoření nádoru pouze v těchto tkáních. Strategie Cto-loxP se používá také ve spojení s indukovatelnými promotory. Například exprese rekombinázy se regulovala promotorem indukovatelným interferonem, což vede k deleci specifického genu v játrech ale nikoli vjiných tkáních a nebo v jiných tkáních ktéto situaci dochází pouze v malém rozsahu (popisuje se v publikaci Kubn, R. et al., (1995) Science, 269, pp. 142).
Dva zástupci rodiny invertáza/resolváza se použily při manipulaci eukaryontních genomu. Mutant invertázy Gin bakteriofága Mu může katalyzovat inverzi fragmentuje DNA v rostlinných protoplastech bez kofaktorů. Zjistilo se, že tento mutant je hyperrekombinantivní, to znamená, že katalyzuje štěpení řetězce DNA v jiné než přirozeně rekombinantních sekvencích. To vede k neúmyslné částečně letální rekombinací u genomů rostlinných protoplastů. β-rekombináza v myší buněčné kultuře mezi rekombinantními sekvencemi, jako řízené repetice vedoucí k excizi segmentu. Současně s deleci se také detekovala inverze, což poskytuje řízené použití systému při manipulaci nevhodných eukaryontních genomů.
Manipulace eukaryontních genomů s rekombinázou Cre a Flp vykazují podstatné nevýhody. V případě delece to znamená rekombinací dvou tandemových opakovaných rekombinantních sekvencí loxP nebo FRT v genomu, kde existuje nevratná ztráta segmentu DNA ležícího mezi tandemovými repeticemi. Gen lokalizovaný na tomto segmentu DNA bude v případě buňky a organizmu permanentně ztracen. Proto není možná rekonstrukce počátečního stavu při analýzách genové funkce například v pozdějším stádiu vývoje organizmu. Nezrušitelná ztráta segmentu DNA deleci může zabránit inverzi segmentu DNA. Gen se může deaktivovat inverzí, aniž se ztratí a může být aktivován v pozdějším stádiu vývoje nebo u dospělých zvířat způsobem časově regulované exprese rekombináz prostřednictvím zpětné rekombinaee. Použití obou rekombináz Cre a Flp u této modifikované metody nese jisté nevýhody. Inverze nemůže být regulována, protože rekombinantní sekvence se nebudou měnit jako výsledek rekombinantních jevů. Objevují se opakované rekombinantní jevy, které způsobují deaktivaci genu, což způsobuje inverzi segmentu DNA u některých cílových buněk, nej výhodněji u 50 % cílových buněk. Vyvíjí se úsilí řešit tento problém alespoň zčásti konstrukci mutovaných sekvencí loxP, které se nemohou použít při další reakcí po jednoduché rekombinací. Nevýhodou je jedinečnost reakce, to znamená, že nedochází k následné aktivaci zpětnou rekombinací po deaktivaci genu inverzí.
Další nevýhodou rekombináza Flp je její omezená tepelná stabilita při teplotě 37 °C limitující účinnost rekombinaění reakce u vyšších eukaryont, například u myší, které mají tělesnou teplotu přibližně 39 °C. Zkonstruovali se mutanti Flp, kteří vykazují vyšší teplotní stabilitu ve srovnání s rekombinázou divokého typu, avšak vykazují stále nižší účinnost rekombinaee ve srovnání s rekombinázou Cre.
Použití sekvenčně specifických rekombináz v oblasti medicíny, například při genové terapii, kde rekombinázy mohou integrovat segment DNA do genomu lidské cílové buňky stabilním a cílovým způsobem. Rekombinázy Cre a Flp mohou katalyzovat intermolekulámí rekombinací. Obě rekombinázy rekombinují plazmidovou DNA, která nese kopii své rekombinantní sekvence s odpovídající rekombinantní sekvencí, která se začlenila do eukaryontního genomu prostřednictvím homologní rekombinaee. Je však nutné, aby tato reakce byla proveditelná s „přirozeně“ se vyskytujícími rekombinantními sekvencemi v eukaryontním genomu. Sekvence loxP nebo FRT obsahují 34 a 54 nukleotidů. Výskyt této rekombinantní sekvence jako část genomu je statisticky vysoce nepravděpodobné. Dokonce jestliže rekombinantní sekvence je nevýhodná, vzhledem k tomu, že shora v textu popsaná zpětná reakce státe existuje, to znamená, že rekombináza Cre a Flp mohou vyjmout začleněný segment DNA po úspěšném začlenění intramolekulární rekombinací.
Jedním problémem podle vynálezu je poskytnou jednoduchý a řiditelný rekombinantní systém a požadované pracovní postupy. Dalším problémem vynálezu je vytvoření rekombinantního systému a požadovaných pracovních postupů, které se mohou provést stabilní a cílené začlenění požadované sekvence DNA.
-2CZ 302620 B6
Uvedené problémy řeší předmětná věc charakterizovaná v uvedených nárocích.
Termín „transformace“ nebo „transformovat“ znamená libovolné zavedení sekvence nukleové kyseliny do buňky. Zavedení se může například provést transfekcí nebo lipofekcí nebo se může provést použitím vápníku, elektrošokem nebo injekcí do oocytů. Termín „transformace“ nebo „transformovat“ také znamená zavedení sekvence nukleové kyseliny viru obsahující například rekombinantní sekvenci(e) a terapeutický gen nebo genový fragment způsobem, který je pro virus přirozený. Sekvence nukleové kyseliny viru se nemusí vyskytovat jako holá sekvence io nukleové kyseliny, ale může být chráněna obalem virového proteinu. Termín se netýká pouze způsobu, který je obvykle známý pod pojmem „transformace“ nebo „transformovat“.
Termín „derivát“ obvykle popisuje sekvence attB a attP a sekvence attL a attP, které vykazují úpravy ve formě jedné nebo více, maximálně šesti, s výhodou dvou, tří, čtyř nebo pěti substitucí na rozdíl od přirozeně se vyskytujících rekombinantních sekvencí.
Termín „homologie“ nebo „homologní“ nebo „podobný“ s ohledem na rekombinantní sekvence vztahující se na sekvenci nukleové kyseliny je shodný ze 70 %, s výhodou z 80 %, výhodněji 85 %, ještě výhodněji z 90 %, ještě výhodněji z 95 % a nejvýhodněji z 99 % s přirozeně se vys20 kytujícími rekombinantnimi sekvencemi.
Termín „vektor“ se vztahuje k přirozeně se vyskytující nebo synteticky vytvořené konstrukci vhodné pro pohlcení, pomnožení, expresi nebo transmisi nukleových kyselin, jako jsou například plazmidy, fágemidy, kosmidy, umělé chromozomy, bakteriofágy, viry nebo retroviry.
Integráza (obvykle označená jako „Int“) bakteriofágu lambda patří podobně jako Cre a Flp k rodině integráz sekvenčně specifických konzervativních DNA rekombináz. Rekombináza Int katalyzuje integrační rekombinaci mezi dvěmi různými rekombinantnimi sekvencemi, jmenovitě attB a attP. Sekvence attB obsahuje 21 nukleotidů a původně se izolovala z genomu mikroorga30 nizmu E. coli (popisuje se v publikaci Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77 pp.322Q). Na druhou stranu sekvence attP obsahující 243 nukleotidů je daleko delší a objevuje se přirozeně v genomu bakteriofága lambda (popisuje se v publikaci Landy A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp,1147). Rekombináza Int obsahuje sedm vazebných míst, z nichž všechny se nacházejí v sekvenci attP a dvě v attB. Biologická funkce rekombinázy Int je sekvenčně specifické začlenění kruhového fágového genomu do lokusu attB v chromozomu mikroorganizmu E. coli. Rekombináza Int potřebuje proteinový ko-faktor, který se nazývá integrační hostitelský faktor (obvykle se označuje jako „IHF“) vhodný pro integrační rekombinaci (popisuje se v publikaci Ktkuchi, Z. and Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149). IHF je nutný pro vytvoření funkčního rekombinantního komplexu se sekvencí attP. Druhý ko-faktor vhodný pro integrační reakci je vytvoření negativního superhelikálního vinutí DNA sekvence attP. Nakonec rekombinace mezi sekvencemi attB a attP vede k vytvoření dvou nových rekombinantních sekvencí, jmenovitě attL a attR, které slouží jako substrátové a rozeznavací sekvence při další rekombinační reakci a sestřihu. Závěr týkající se začlenění bakteriofága lambda se popisuje v publikaci Landy, A, (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913.
Vystřižení genomu fága z bakteriálního genomu se katalyzuje také rekombinázou Int. Vedle rekombinázy Int a IHF je nutný další ko-faktor, který je kódován také bakteriofágem lambda. Tímto ko-faktorem je exciznáza (obvykle označována jako „XIS“), která má dvě vazebná místa v sekvenci attR (popisuje se v publikaci Gottesman, M. and Weisberg, R. (1971) The Bacterio50 phage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 113). Na rozdíl od integrační rekombinace DNA není nutné v případě excezivní rekombinace negativní superhelikální vinutí rekombinantních sekvencí. Negativní superhelikální vinutí DNA však zvyšuje účinnost rekombinační reakce. Další zlepšení účinnosti excize se může dosáhnout použitím druhého ko-faktoru, jmenovitě FIS (faktor pro inverzi stimulace), který působí ve spojení s Xis (popisuje se v publikaci Lany, A.
(1989) Annu. Rev. Biochem. 58, pp 913), Excize je geneticky zcela obrácená reakce integrace.
-3CZ 302620 B6 i
To znamená, že se opět vytvoří sekvence attP a attB. Závěr týkající se excize bakteriofága lambda se uvádí v publikaci Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913.
Podstata vynálezu
1. Podstatu vynálezu tvoří způsob sekvenčně specifické rekombinace DNA v eukaryontní buňce in vitro, zahrnující
a) zavedení první sekvence DNA do buňky, která obsahuje sekvenci podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, nebo sekvenci att? podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát, nebo sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát nebo sekvenci «ř/R podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát.
b) zavedení druhé sekvence DNA do buňky, jestliže první sekvence DNA obsahuje sekvenci tířZB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci att? podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát a naopak, nebo jestliže uvedená první sekvence DNA obsahuje sekvenci ař/R podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát a naopak,
c) provedení sekvenčně specifické rekombinace integrázou Int bakteriofága lambda, kde pod pojmem „derivát“ se rozumí sekvence attB, attP, attL a attR, obsahující jednu nebo více, nejvýše však šest substitucí ve srovnání s přírodně se vyskytujícími rekombinačními sekvencemi.
Vynález popisuje způsob, kde používané sekvence ttf/B a att? vykazují jednu nebo více substitucí v porovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí í/ZZB podle SEQ ID NO: 1 a sekvence att? podle SEQ ID NO: 2. Dále vynález popisuje způsob, kde používané sekvence aZzL a aZZR mají jednu nebo více substitucí v porovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí aZZL podle SEQ ID NO: 3 a sekvence tfZzR podle SEQ ID NO: 4. Výhodná je metoda, kde rekombinantní sekvence mají jeden, tři, čtyři nebo pět substitucí. Substituce se mohou vyskytovat ve dvou oblastech přesahu (popisuje se na obrázku č. 6A, prázdný obdélník) a v oblasti jádra (popisuje se na obrázku č. 6A, čárkovaně). Celá oblast přesahu, která obsahuje sedm nukleotidů, se může také substituovat. Více se preferuje metoda, kde jsou substituce zavedeny do sekvence σΖΖΒ a att?, buď v oblasti jádra nebo přesahu. Preferované je zavedení substituce do oblasti přesahu a současné zavedení jedné nebo více substitucí do oblasti jádra.
V případě metody podle vynálezu není nezbytné zavést odpovídající substituci do sekvence att?, jestliže je zavedena substituce do sekvence uZzB nebo zavést odpovídající substituci do sekvence attR, jestliže v sekvenci attL je zavedena substituce a opačně. Úprava ve formě substituce do rekombinantních sekvencí se vybrala tak, že rekombinace se může provést navzdory úpravám. Příklady takových substitucí jsou uvedeny například v publikaci Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149) a Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986) J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, pp 1134). Je možné provést další modifikace, například metodami mutageneze ajejich použití se může testovat testovací rekombinaci.
Vynález dále popisuje způsob, kde je možné použít sekvenci attB v porovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí attB podle SEQ ID NO: 1 nebo použití sekvence att? v porovnání s přirozeně se vyskytující sekvenci att? podle SEQ ID NO: 2 nebo užívanou sekvenci attL v porovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí attL podle SEQ ID NO: 3 nebo používanou sekvenci aZZR podle SEQ ID NO: 4, která má jednu nebo více substitucí. Proto jedna nebo více substitucí v jedné z rekombinantních sekvencí nezbytně nezahrnuje odpovídající substituci ve druhé rekombinační sekvenci.
V preferovaném provedení vynálezu sekvence óz/zB obsahuje 21 nukleotidů a odpovídá původně izolované sekvenci z genomu mikroorganizmu E. coli (popisuje se v publikaci Mizuuchi, M. and
-4CZ 302620 B6
Mizuuchi, K. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77, pp.3220) a sekvence attP obsahuje 243 nukleotidů a odpovídá původně izolované sekvenci z genomu bakteríofága lambda (popisuje se v publikaci Landy, A. and Ross, W, (1977) Science, 197, pp. 1147).
V dalším provedení vynálezu sekvence attL obsahuje 102 nukleotidů a sekvence αΖ/R obsahuje 162 nukleotidů. Obě sekvence odpovídají původně izolovaným sekvencím z genomu mikroorganizmu E. coli (popisuje se v publikaci Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913).
Za účelem uskutečnit způsob podle vynálezu může první sekvence DNA obsahovat vedle rekombinantní sekvence další sekvence DNA, které umožňují začlenění do požadovaného cílového lokusu v genomu eukaryontní buňky. Tato rekombinace se provádí prostřednictvím homologní rekombinace, která je zprostředkována mechanizmy vnitrní buněčné rekombinace. V případě uvedené rekombinace další sekvence DNA musí být homologní s DNA cílového lokusu nachází se stejně na 3' a 5'konci sekvencí a attL. Odborníci znají, jak vysoký musí být stupeň homologie a jak dlouhé musí být 3' a 5' sekvence, aby proběhla homologní rekombinace s dostatečnou pravděpodobností (popisuje se v publikaci Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288).
Druhá sekvence DNA s rekombinantními sekvencemi attP a αί/R může také obsahovat sekvence DNA, které jsou nezbytné v případě integrace do požadovaného cílového lokusu prostřednictvím homologní rekombinace. V případě metody podle vynálezu první a/nebo druhá sekvence DNA může obsahovat další sekvence DNA. Výhodný je způsob, kde obě sekvence DNA obsahují další sekvence DNA.
Zavedení první a druhé sekvence DNA s dalšími sekvencemi DNA nebo bez nich se může uskutečnit postupně a ve společné transformaci, kde sekvence DNA jsou přítomny na dvou různých molekulách DNA. Výhodná je metoda, kde je přítomna první a druhá sekvence DNA s dalšími sekvencemi nebo bez nich a zavedla se do eukaryontních buněk na jediné molekule DNA. Dále první sekvence DNA se může zavést do buňky a druhá sekvence DNA se může zavést do jiné buňky, ve které se buňky následně fuzují. Termín fúze znamená křížení organizmů stejně jako buněčná fuze v nejširším smyslu.
Způsob podle vynálezu se může použít k inverzi segmentu DNA, který leží mezi nepřímo orientovanými rekombinačními sekvencemi pri intramolekulámí rekombinaci. Dále způsob podle vynálezu se může použít při deleci segmentu DNA, který leží mezi přímo orientovanými rekombinačními sekvencemi při intramolekulámí rekombinaci. Jestliže rekombinantní sekvence jsou každá začleněna v orientaci 5-3' nebo 3 -5', jsou přítomny v přímé orientaci. Rekombinantní sekvence jsou v přímé orientaci, jestliže například sekvence atiB je začleněna v orientaci 5 -3 ' a sekvence attP je integrovaná v orientaci 3'-5'. Jestliže rekombinantní sekvence je každá začleněna prostřednictvím homologní rekombinace do intronových sekvencí v orientaci 5' a 3' exonu a rekombinace se uskuteční integrázou, exon se invertuje v případě nepřímých orientovaných rekombinačních sekvencí a de letuje v případě přímo orientovaných rekombinačních sekvencí. S tímto postupem polypeptid kódovaný genem může ztratit svou aktivitu nebo funkci nebo transkripce se může zastavit inverzí nebo deleci tak, že nedojde k vytvoření úplného transkriptu. Tímto způsobem se může například zkoumat biologická funkce kódovaného polypeptidu.
První a/nebo druhá sekvence DNA může obsahovat další sekvence nukleové kyseliny kódující jeden nebo více polypeptidu. Strukturální protein, enzym nebo regulační protein se může zavést prostřednictvím rekombinačních sekvencí do genomu, který je dočasně exprimován po intramolekulámí rekombinaci. Zavedený polypeptid může být endogenní nebo exogenní. Dále se může zavést markerový protein. Mohou se najít příklady aplikací podle vynálezu provedené za použití rekombináz Cre a Flp, například v publikaci Kilby, N. et al., (1993), Trends Genet., 9, pp. 413.
Způsob podle vynálezu se může použít k deleci nebo inverzi segmentů DNA ve vektorech intramolekulámí rekombinaci v epizomálních substrátech. De léční reakce se může použít například
-5CZ 302620 B6 k deleci balících sekvencí z tzv. pomocných virů. Tato metoda má široké použití při průmyslové produkci virových vektorů při genové terapii (Hardy, S, et al., (1987), J. Viorl., 71, pp. 1842).
Intermolekulámí rekombinace vede k fúzi dvou molekul DNA, přičemž každá má kopii sekvencí č/Z/B a att? nebo attL a attR. Například sekvence attB se může zavést první prostřednictvím homologní rekombinace ve známém dobře charakterizovaném genomovém lokusu buňky. Následně vektor nesoucí att? se může začlenit do uvedené genomové sekvence attB prostřednictvím intermolekulámí rekombinace. V této metodě se preferuje exprese mutantního genu integrázy Int-h/218, který se nachází na druhém vektoru DNA, který je společně transfekován. Další sekvence se nacházejí na vektoru, který nese att?, například gen pro určitý markerový protein lemovaný sekvencemi loxP/FRT. Použitím tohoto přístupu je možné dosáhnout, že například v porovnávací expresívní analýze různých genů v buněčném typu nejsou ovlivněny pozitivními nebo negativními vlivy genomového integračního lokusu.
Aby se provedla metoda podle vynálezu integráza musí působit na rekombinantní sekvence. Integráza nebo gen integrázy a/nebo faktor Xis nebo gen faktoru Xis může být přítomen v eukaryontní buňce už před zavedením první a druhé sekvence DNA. Geny rekombináz se mohou také zavést mezi zavedením první a druhé sekvence DNA nebo po zavedení první a druhé sekvence DNA. Integráza používaná při sekvenčně specifické rekombinaci je přednostně exprimována v buňce, ve které se provádí reakce. Z tohoto důvodu třetí sekvence DNA obsahující integrázový gen se zavedla do buněk. Jestliže se provádí sekvenčně specifická rekombinace se sekvencemi attL/attR může se dále do buněk zavést gen faktoru Xis (čtvrtá sekvence DNA). Nejvíce preferovaný je způsob, kde třetí a/nebo čtvrtá sekvence DNA se začlenila do eukaryontního genomu buňky prostřednictvím homologní rekombinace nebo náhodně. Dále preferovaná je metoda, kde třetí a/nebo čtvrtá sekvence DNA obsahuje regulační sekvence, které umožňují prostorovou a/nebo dočasnou expresi integrázového genu a/nebo genu faktoru Xis.
V tomto případě prostorová exprese znamená, že rekombináza a faktor Xis se exprimuje pouze v určitém typu buňky, přičemž se použijí buněčné specifické promotory a katalyzují rekombinaci pouze v těchto buňkách, například v jaterních buňkách, ledvinových buňkách, v buňkách nervů nebo v buňkách imunitního systému. Při regulaci exprese integráza/faktor Xis se může dosáhnout dočasné exprese tím, že se aktivují promotory v určitém stádiu vývoje nebo u dospělého organizmu v určitém časovém okamžiku. Dále dočasné exprese je možné dosáhnout použitím indukovatelných promotorů, například promotory závislými na interferonu a tetracyklinu (popisuje se v publikaci Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3).
Integráza používaná způsobem podle vynálezu může být divokého typu a modifikovaná integráza bakteriofága lambda. Integráza divokého typu je pouze schopna uskutečnit rekombinační reakci s ko-faktorem, jmenovitě s IHF, přičemž se preferuje použití modifikované integrázy způsobem podle vynálezu. Jestliže se použije integráza divokého typu při způsobu podle vynálezu, je navíc nutná při průběhu rekombinační reakce IHF. Upravená integráza se modifikuje tak, že uvedená integráza může provést rekombinační reakci bez IHF. Vytvoření upravených polypeptidů a testování požadované aktivity je obsahem stavu techniky a může se jednoduše provést (popisuje se v publikaci Erlich, H. (1989) PCR Technology, Stockton Press. Dva mutanti Int jsou výhodné integrázy bakteriofágu lambda označené jako Int-h a Int-h/218 (popisuje se v publikaci Miller et al., (1980) Cell, 20, pp. 721, Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825. Int-h zahrnuje lyzinový zbytek místo glutamátového zbytku v poloze 174 ve srovnání s Int divokého typu. Rekombináza Int-h/218 zahrnuje další lyzinový zbytek místo glutamátového zbytku v poloze 218 a vytvořil se mutagenezí PCR genu Int-h. Uvedení mutanti mohou katalyzovat rekombinaci mezi sekvencemi atiBiatt? stejně jako mezi atiL/attR bez ko-faktoru IHF, Xis a negativní super-helix v mikroorganizmu E. coli a in vitro, to je s čištěnými substráty v reakční zkumavce. V eukaryontních buňkách mutanti potřebují pouze ko-faktor Xis pro rekombinaci mezi attL/attR. Další zlepšení účinnosti rekombinace mezi atfL/atfR se může dosáhnout dalším ko-faktorem, například FIS. Výhodný je mutantní Int-h/218, protože tento mutant může kataly-6CZ 302620 B6 zovat integrační reakci nezávislou na ko-faktoru se zvýšenou účinností (popisuje se v publikaci Christ, N. and Droge, P (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825).
Způsob podle vynálezu se může provést ve všech eukaryontních buňkách. Buňky mohou být pří5 tomny například v buněčné kultuře a obsahují všechny typy rostlinných a zvířecích buněk. Příkladem buněk mohou být oocyty, embryogenní kmenové buňky, hematopoietické kmenové buňky nebo libovolný typ diferenciovaných buněk. Preferuje se způsob, kde eukaryontní buňka je savčí buňka. Výhodnější je metoda, kde savčí buňka je lidská buňka, opičí buňka, myší buňka, krysí buňka, králičí buňka, buňka křečka, kozí buňka, bovinní buňka, ovčí nebo prasečí buňka.
Preferované provedení vynálezu popisuje způsob, kde se uskutečnila druhá sekvenčně specifická rekombinace DNA integrázou bakteriofága lambda a faktorem Xis. Druhá rekombinace potřebuje sekvence attL a atfR vytvořené první rekombinací sekvencí oz/B a att? nebo jeho deriváty. Proto druhá sekvenčně specifická rekombinace je omezena způsobem použitým při první sek15 venčně specifické rekombinací sekvencí attB a att? nebo jejích derivátů. Mutanti divokého typu a Int mohou také katalyzovat tzv. integrační rekombinací bez přidání dalších faktorů, to znamená, že rekombinují sekvence attB a att? a nikoli sekvence attL s attR, jestliže se stabilně integrují do genomu buněk. Integráza divokého typu nutná pro tzv. excizní rekombinací faktorů IHF, Xis a negativního super vinutí. Mutanti integrázy Int Int-h a Int-h/28 potřebují pro excizní rekombina20 ci pouze faktor Xis. Je možné provést dvě rekombinační reakce jednu po druhé řízeným způsobem, jestliže v buňce jsou přítomny další faktory pro druhou rekombinační reakci. Spolu s jinými už užívanými rekombinačními systémy se může vyvinout nová strategie pro řízenou manipulaci vyšších eukaryontních genomů. To je možné, protože různé rekombinační systémy používají pouze jejich vlastní rekombinantní sekvence.
Například systém Int se může použít při integraci sekvencí lox? a/nebo FRT cíleným způsobem do genomového lokusu eukaryontního genomu a do aktivního a neaktivního genu, kdy pak následuje řízená exprese Cre a/nebo Flp. Systém Int se může dále použít při deleci sekvencí loxP/FRT z genomu po použití, to je rekombinace pomocí rekombinázy.
Dále se preferuje způsob, kde je do buněk zavedena další sekvence DNA obsahující gen faktoru Xis. Nejvíce se preferuje způsob, kde další sekvence DNA dále obsahují regulační sekvenci DNA, které zvyšují prostorovou a/nebo dočasnou expresi genu faktoru Xis.
Po úspěšné integrační intramolekulámí rekombinací (inverzi) pomocí rekombinázy Int vedoucí k aktivaci/deaktivaci genu v určitém buněčném typu se může uvedený gen opět později deaktivovat nebo aktivovat pomocí vyvolané prostorové a/nebo dočasné exprese Xis se současnou expresí Int.
Dále se vynález týká použití sekvence attR podle SEQ ID NO: 1 nebo jejího derivátu a sekvence att? podle SEQ ID NO: 2 nebo jejího derivátu nebo sekvence attL podle SEQ ID NO: 3 nebo jejího derivátu a sekvence attR podle SEQ ID NO: 4 nebo jejího derivátu v sekvenčně specifické rekombinací DNA v eukaryontních buňkách. Eukaryontní buňka může být přítomna v buněčném agregátu organizmu, například savce, který ve své buňce neobsahuje žádnou integrázu nebo fak45 tor Xis. Uvedený organizmus se může použít pro šlechtění s jinými organizmy, které mají ve svých buňkách integrázu nebo faktor Xis tak, že se vytvoří potomstvo, kde sekvenčně specifická rekombinace se uskuteční v buňkách potomků. Vynález také popisuje použití integrázy nebo genu integrázy a faktoru Xis nebo genu faktoru Xis při sekvenčně specifické rekombinací v eukaryontních buňkách.
Dále se identifikovala sekvence v lidském genomu (zde označená jako attH), která vykazuje homologií 85 % se sekvencí attB. Sekvence attH se může použít jako rekombinantní sekvence v případě integrace cizorodé DNA do lidského genomu. Proto druhá rekombinační sekvence attP se může upravit tak, že integráza může provést rekombinační reakci s vysokou účinností. Je možné demonstrovat, že sekvence attH se muže rekombinovat s verzí sekvence att? upravenou
-7CZ 302620 B6 člověkem, která je zde označena jako sekvence J//P* aje znázorněna jako SEQ ID NO: 5 pomocí Int—h v mikroorganizmu E. coli. Experimenty s lidskými buňkami demonstrovaly, že zzZfH se rekombinuje se sekvencí attP* také jako část lidského genomu, jestliže se rekombináza Int-h dočasně syntetizuje uvedenými buňkami.
Tato skutečnost umožňuje, že cizorodá kruhová DNA, která má rekombinantní sekvenci může být stabilně začleněné do přirozeně se vyskytujícího lokusu a//H lidského genomu cíleným způsobem. Sekvence attH je pouze jedním příkladem rekombinantní sekvence, která se přirozeně vyskytuje v lidském genomu. Další sekvence se mohou identifikovat v projektu lidského genomu, které vykazují homologii se sekvencí atfB a mohou se použít při integrací cizorodé DNA do lidského genomu. Odpovídající rekombinantní sekvence attP v cizorodé kruhové DNA se vybrala v závislosti na přítomnosti uvedené sekvence v lidském genomu a její homologii se sekvencí
Výhodná je cizorodá kruhová DNA zahrnující sekvenci nukleové kyseliny přirozeně se vyskytující sekvence attP. Více se preferuje derivát přirozeně se vyskytující sekvence který obsahuje maximálně šest, s výhodou jednu až pět, zvláště tri substituce. Nej výhodnější je cizorodá cirkulámí DNA obsahující sekvenci nukleové kyseliny attP* podle SEQ ID NO: 5, která vykazuje přibližnou 95 % homologii se sekvencí attP.
íntegráze se může zavést do buněk buď jako polypeptid nebo prostřednictvím expresivního vektoru. Gen integrázy může být dále přítomen jako exprimovatelná sekvence nukleové kyseliny na molekule DNA, která obsahuje upravenou nebo přirozenou sekvenci attP nebo sekvenci attP*.
Cizorodá kruhová DNA zahrnující přirozenou sekvenci attP nebo její derivát nebo homolog, zvláště sekvenci attP* podle SEQ ID NO: 5 obsahuje také terapeutický gen nebo genový fragment, který se zavede do genomu. Terapeutické geny mohou být například gen CFTR, gen ADA, gen receptorů LDL, gen β-globinu, gen faktoru VIII nebo IX, gen alfa-1-antitrypsinu nebo gen dystropinu. Cizorodou kruhovou DNA může být například virový vektor, který se už použil v somatické genové terapii. Vektor může být také buněčně specifický tak, že pouze transfekuje tyto buňky, které jsou nutné pro genovou terapii, například buňky plicního epitelu, kmenové buňky kostní dřeně, T lymfocyty, B lymfocyty, buňky jater, buňky ledvin, nervové buňky, buňky kosterních svalů, hematopoietické kmenové buňky nebo fibroblasty. Odborníkovi je zřejmé, že tento výčet je pouze výběr terapeutických genů a cílových buněk a jiné geny a cílové buňky se mohou také použít při genové terapii. Genové fragmenty obsahují například delece terapeutických genů, jednotlivé exony, antisense sekvence nukleové kyseliny nebo ribozymy. Genové fragmenty mohou obsahovat segmenty genu, který zahrnuje trinukleotidové repetice genu, například gen syndromu lámavosti X.
IHF musí být přítomen, jestliže se pri rekombinaci používá integráza divokého typu. Preferuje se použití upravené integrázy, kde může dojít k rekombinaci bez přítomnosti IHF. Zvláště se preferuje použití rekombinázy Int-h nebo Int-h/218. Vynález dále popisuje přirozeně se vyskytující sekvenci attP nebo její derivát nebo homolog. Vynález zvláště popisuje sekvenci attP* nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 5. Dále vynález popisuje vektor obsahující přirozeně se vyskytující sekvenci z/Z/P nebo její derivát, zvláště sekvenci nukleové kyseliny attP* podle sekvence SEQ ID NO: 5 a dále sekvenci nukleové kyseliny obsahující terapeutický gen nebo fragment genu. Výhodný je vektor, kde terapeutický gen obsahuje gen CFTR, ADA, gen receptorů LDL, gen alfa-globinu nebo beta-globinu, gen alfa-1-antitrypsinu, faktor VIII nebo faktor IX nebo jeho fragment. Vektor může obsahovat regulační elementy DNA, které regulují expresi terapeutického genu nebo genového fragmentu.
Dále vynález popisuje použití vektoru jako léčebného prostředku v lidské nebo veterinární medicíně. Dále vynález popisuje použití vektoru pro výrobu léčivého prostředku pro somatickou genovou terapii.
Vektory podle vynálezu mohou být aplikovány například intravenózní nebo intramuskulární injekcí. Vektory se mohou také aplikovat aerosoly. Další aplikace je odborníkovi zřejmá.
-8CZ 302620 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek Č. 1 zobrazuje schéma rekombinantních reakcí, jmenovitě integraci a excizi katalyzovanou integrázou Int, Je zobrazena superhelikální plazmidová DNA nesoucí kopii rekombinantní sekvence attP. Sekvence attP obsahuje pět tzv. vazebných míst pro ramena rekombinázy Int (Pl, P2, Pl', P2', P3 ), dvě vazební místa pro jádro rekombinázy Int (C a C', označeno černou šipkou), tři vazebná místa pro IHF (Hl, H2, H), dvě vazebná místa pro Xis (XI, X2) a tzv. oblasti přesahu (vyznačeno prázdnými obdélníky), kde dochází k výměně současného řetězce DNA, Partnerská sekvence v případě attP, attB je zobrazena na lineárním segmentu DNA io a obsahuje dvě vazebná místa pro jádro rekombinázy Int (B a B', označeno otevřenou šipkou) a oblast přesahu. V případě rekombinace mezi attB a attP jsou nezbytné rekombinázy Int a IHF, což vede k začlenění plazmidu do segmentu DNA, kteiý nese attB. Vytvořily se dvě nové hybridní rekombinantní sekvence at/L a atfR a slouží jako cílové sekvence při excizi. Tato reakce vyžaduje rekombinázu Int a IHF a dále kofaktor Xis kódovaný fágem lambda.
Obrázek č. 2A zobrazuje schéma integrázového expresívního vektoru a obrázek č. 2B zobrazuje schéma westernový analýzy. (A) Vektor pKEXInt zahrnuje gen integrázy divokého typu, vektor pKEXInt-h zahrnuje gen mutantu Int-h a vektor pKEXInt-h/218 zahrnuje gen mutantu Int-h/218. Kontrolní vektor (pKEX) nezahrnuje gen Int. Geny integrázy divokého typu (Int) a dva mutanti (Int-h a Int-h/218) jsou zobrazeny jako šedé obdélníky. Dále jsou přítomny signální sekvence kódujících oblastí určené pro zpracování RNA, které by měly garantovat zvýšenou vnitrobuněčnou stabilitu mRNA (znázorněno tečkovanými obdélníky) a jsou označeny jako SV40, t-Ag sestřih a signály polyA. Exprese integrázových genů se děje pomocí promotoru cytomegaloviru (CMV). (B) Po zavedení vektoru, jakje zobrazeno, do reportních buněčných linií
B2 a B3, se připravily buněčné lyzáty a separovaly se proteiny podle jejich molekulární hmotnosti na SDS page. Přítomnost proteinu Int-h se zviditelnila polyklonálními myšími protilátkami proti rekombináze divokého typu Int (dráhy 2 a 4). Poloha rekombinázy Int na gelu je označena šipkou.
Obrázek č. 3 zobrazuje schéma substrátových vektorů. (A) Vektor pGFPa/Z/aZřP. Znázorněný je vektor linearizovaný restrikěním enzymem ApaLÍ. Velká černá šipka označuje polohu a orientaci dvou rekombinantních sekvencí attB a attP, které lemují gen GFP (zelený fluorescenční protein), jenž je umístěn v opačné orientaci vzhledem k promotoru CMV. PA označuje signál polyA. Do vektoru se dále zavedl gen neo nesoucí rezistenci, který se exprimuje pomocí promotoru viru
SV40 a umožňuje selekci stabilních reportních buněčných linií. Také jsou označena místa, která rozeznává restrikční enzym Ncol. Integrační rekombinace mezi sekvencemi attB a attP vede k inverzi genu GFP a tak kjeho expresi. Malá prázdná a vyplněná šípka označuje polohu a orientaci jednotlivých primerů PCR a jsou označeny jako pl až p7. (B) vektor pGFPaZZL/aZzR. Vektor je shodný s pGFPaZZB/aZZP, zahrnuje však aZZL a at/R místo attB a attP. Gen GFP vyka40 zuje orientaci 3 -5' vztaženo na promotor CMV. Šrafovaný rámeček označuje polohu sondy, která se použila při Southemově analýze.
Obrázek č. 4 A až D znázorňuje schéma detekce integrační rekombinace v reportních buněčných linií způsobem PCR po separaci molekul DNA v agarózových gelech (1,2 % hmotnost/objem), kde se DNA zviditelnila barvením v ethidiumbromidu. (A) Reverzní transkriptáza PCR (RT-PCR). Vektory pKEX a pKEXInt-h (obrázek č. 2A) se odděleně zavedly do reportní buněčné linie Bl až B3 elektroporaci. Průběh RT-PCR analýzy z izolované mRNA polyA vykazuje očekávaný produkt s párem primerů p3/p4 (obrázek č. 3), pouze v případě, kdy se buňky ošetřily pKEXInt-h (dráha 1, 3 a 5). Gen β-aktinu ze stejné RNA se amplifikoval jako kontrola obsahu
RNA. Dráha M: markér DNA, dráha O: kontrola RT-PCR bez templátu RNA, (B, C) Genomová PCR analýza. Z buněčných linií se 72 hodin po elektroporaci izolovala genomová DNA a amplifikovala se páry primerů p3/p4 (obrázek č. 3) a p l/p2 (obrázek č. 3). Číslování a označení linií odpovídající obrázku č. 4A. (D) Deleční test. Izolovaná genomová DNA se amplifikovala použitím páru primerů p5/p6 (obrázek č. 3). Poloha produktu PCR (o velikosti 420 bp), která se očeká55 vala po delecí místo inverze je označena šipkou. Číslování a označení drah odpovídá obrázku 4A.
-9CZ 302620 B6
Obrázek č. 5A a B zobrazují schéma detekce inverze v reportních buněčných liniích pomocí PCR a Southemovy hybridizace po separaci molekul DNA v agarózovém gelu (1,2 % hmotnost/objem). (A) Analýza PCR. Frakce genomové DNA, která se izolovala z buněčných linií Bl, B2, B3 a BL60, které se ošetřily vektory pKEX a pKEXInt-h, se amplifikovaly pomocí párů primerů p3/p4 a p5/p7 (obrázek č. 3). Produkty PCR jdoucí zpět k inverzi genu GFP katalyzovaného integrázou se zviditelnily v drahách 1, 3 a 5. V dráze M se nachází markér velikosti DNA fragmentů, v dráze Oje kontrola reakce PCR bez genomové DNA. (B) Southemova analýza: Zbytek frakce analyzované DNA zobrazený na obrázku č. 5A se inkuboval s restrikčním enzymem Ncol, který se separoval elektroforézou na agarózovém gelu na základě jeho molekulové hmotnosti a postupně se přenesl na nitrocelulózovou membránu. GFP nesoucí fragmenty DNA se zviditelnily použitím radioaktivně značené sondy (obrázek č. 3B), aby se detekovala rekombinace. V dráze 9 se nachází nerekombinovaný pGFPaZ/BMz/P, v dráze 10 se nachází pGF/c/ZZB/aZZP.
Na obrázku č. 6 jsou zobrazeny sekvence nukleové kyseliny obsahující aZZB a azzH. Obrázek č. 6B zobrazuje částečné sekvence attP a aZZP*. (A) Porovnání sekvencí aZZB a aZZH. Vazebná místa jádra rekombinázy Int BaB'v sekvenci attB jsou značeny čárkou nad sekvencí. Vazebná místa jádra rekombinázy Int H a H ' v sekvenci α/zH jsou značeny nad sekvencí čárkou. Přesahující sekvence jsou charakterizovány prázdnými obdélníky. Rozdíly v sekvencích jsou značeny dvojitými svislými čárami. Číslování zbytků v jádru a oblastí přesahu se vztahují k centru přesahu označeného O a definovaného v publikaci Landy and Ross (1977), Science, 197, pp. 1147). Sekvence od polohy -9 do +11 je čj/ζΒ a zíZzH. (B) Porovnání sekvencí mezi částečnými sekvencemi aZZP a aZZP*, což odpovídá sekvencím attB a aZíH. Značky jsou používány jako na obrázku 6A.
Na obrázku č. 7 je schématicky znázorněna rekombinace mezi sekvencemi aZZH a aZZP* na vektoru pACH v mikroorganizmu E. coli po separaci elektroforézou na agarózovém gelu. Substrátový vektor pACH se společně transformoval prokaryontními expresívními vektoiy vhodnými pro Int, Int-h nebo Int-h/218 do mikroorganizmu E. coli kmen CSH26 nebo CSH26 delta IHF. Plazmidová DNA se izolovala 36 hodin po selekci, inkubovala se s restrikčními enzymy HindlII a Aval, separovala se a zviditelnila elektroforézou na agarózovém gelu. Poloha restrikčních fragmentů vytvořená inverzí se označila jako „invers“. Poloha DNA, která nemusí rekombinovat, se označila jako pACH. V drahách 1 a 12 jsou markéry velikosti DNA, v drahách 2 a 3 je expresívní vektor a DNA nerekombinovaného pACH. V drahách 4 az 7 je DNA izolovaná z CSH26. V dráze 8 až 11 je DNA izolovaná z CSH delta IHF.
Na obrázku č. 8 je znázorněno schéma strategie integrace vektoru pEL13 do genomového lokusu attH a princip detekční metody. Integrační vektor pEL13 nese gen rezistence (označený šipkou s „hygr“), gen pro Int-h (označený šipkou s „int h“) řízeného promotorem CMV a kopii sekvence attP* (prázdné čtverce s ,,attP*/P*OP*'“). Int-h se exprimuje po zavedení do vektoru do buněk BL60 elektroporací (obrázek č. 2B). Následně rekombinace katalyzuje intermo leku lárn í rekombinaci mezi sekvencí attP* a chromozomální attP (šrafovaný obdélník označený s aZZ“H/OH“) vedoucí k začlenění vektoru pEL13 do genomu buněk BL60. Buňky, které se stabilně začlenily do vektoru se mohou vybrat a identifikovat pomocí PCR s párem primerů Č/ZZX1/B2 (šipky označené „aZZXl“ a „B2“). EcoRV a Sphl označují místa, která rozeznávají příslušné restrikční enzymy.
Obrázek č. 9 znázorňuje schéma detekce intermo leku lamí rekombinace mezi attP* (pEL13) a attH v buňkách BL60. Genomová DNA se izolovala a amplifikovala pomocí páru primerů attXl/B2 (obrázek č. 8) z 31 různých buněčných populací po elektroporací pEL13 a následné selekci trvající několik týdnů. Produkty PCR se separovaly a zviditelnily se elektroforézou na agarózovém gelu. Poloha očekávaného produktu (295 bp) je označena v gelech Šipkou. Následně se produkty analyzovaly sekvenováním DNA. Na pravé straně se nachází markér velikosti DNA.
- 10CZ 302620 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Produkce expresívních a substrátových vektorů
Expresívní vektory
Eukaryontní expresívní vektory vhodné pro integrázu Int divokého typu (pKEXInt), Int-h (pKEXInt-h), Int-h/218 (pKEXInt-h/218) a pEL13 jsou deriváty pKEX-2-XR (popisuje se v publikaci Rittner et al., (1991), Methods Mol. Cell. Biol., 2, pp. 176). Uvedený vektor zahrnuje lidský cytomegalovirový promotor/zesilovací element (CMV) a RNA sestřih a elementy polyadenylačního signálu opičího viru 40 (SV40) Geny integrázy Int se klonovaly PCR s následujícími primery (3343) 5'- GCTCTAGACCACCATGGGAAGAAGGCGAAGTCA-3' lokalizovaným na 5'konci genu integrázy Int a (3289) 5'-AAGGAAAGCGGCCGCTCATTATTTGATrrCAATTTTGTCC- 3' lokalizovaném na 3' konci. Amplifikace se provedla po první denaturaci při teplotě 95 °C po dobu 4 minut v 30 cyklech denaturace (teplota 95 °C, po dobu 45 vteřin), navázání primerů proběhlo při teplotě 55 °C po dobu 45 vteřin, syntéza DNA proběhla při teplotě 72 °C po dobu 2 minut a konečný krok syntézy trval 4 minuty při teplotě 72 °C. Výsledný fragment PCR se klonoval do vektoru pKEX-2-XR pomocí Xbal a Notl. Mutant Int-h se vytvořil z vektoru pHN16, jako templát (popisuje se v publikaci Lange-Gustafson, B. and Nash, H. (1989), J. Biol. Chem., 259, pp 12724). lntegráza Int divokého typu a Int-h/218 se vytvořila zpTrcInt a pTrcInt-h/218 jako templát (popisuje se v publikaci Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825). pEL13 nese navíc vedle genu Int-h kopii sekvence attP*.
Pomocí PCR mutageneze se ze sekvence attP zkonstruovala sekvence tfZZP*. Použily se následující oligonukleotidy:
(03) 5 '-GTTCAGCTTTTTGATACTAAGTTG-3 (04) 5 '-CAACTTAGTATCAAAAAGCTGAAC-3 (PC) 5 '-TTGATAGCTCTTCCGCTTTCTGTTAC AGGTCACTAATACC-3' (PD) 5'-ACGGTTGCTCTTCCAGCCAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3'.
Amplifikace se provedla po prvním stupni denaturace při teplotě 95 °C po dobu 4 minut s 30 cykly denaturace (teplota 95 °C, po dobu 45 vteřin), navázání primerů proběhlo při teplotě 57 °C po dobu 1 minuty a 30 vteřin, syntéza DNA proběhla pri teplotě 72 °C po dobu 1 minuty a 30 vteřin a konečná syntéza proběhla pri teplotě 72 °C po dobu 4 minut. Produkt PCR se inkuboval s restrikčním enzymem Sapl a ligoval se do pKEXInt-h, který se štěpil restrikčním enzymem Sapl. Kontrolní plazmid pKEX nenese žádný gen integrázy Int.
2. Substrátové vektory
Substrátové vektory jdou deriváty pEGFP (Clontech). Rekombinantní kazety jsou řízeny promotorem CMV, což garantuje silnou konstitutivní expresi. pGFPaZZB/aZZP se zkonstruoval vystřižením genu GFP (zelený fluorescenční protein) z pEGFP pomocí restrikčního enzymu Agel a BamHI. Sekvence tzZZB divokého typu se začlenila jako dvouřetězcový oligonukleotid do vektoru štěpeného restrikčním enzymem Agel za použití následujících oligonukleotidu:
- 11 CZ 302620 B6
ÍB1OB) 5'-CCGGTTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGAACGC-3 (BOBl)5'-AATTGCGTTCGCTCAAGTTAGTATA,AAAAAGCAGGCTTCAA-3'.
Sekvence atťP divokého typu se amplifikovala pomocí PCR z vektoru pAB3 (Droge, P. and Cozzarelli, N. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci., 86, pp. 6062) použitím následujících primerů:
(p7) 5'-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGACAAAATTGA-3' (p6) 5'-GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3'.
Amplifikace se provedla po prvním kroku denaturace při teplotě 95 °C po dobu 4 minuty s 30 cykly denaturace (teplota 95 °C, 45 vteřin), navázání primerů probíhá při teplotě 54 °C po dobu 30 vteřin), syntéza DNA probíhá pri teplotě 72 °C po dobu 32 vteřin) a konečný krok syntézy trvá po dobu 4 minut při teplotě 72 °C. Fragment PCR nesoucí sekvenci att? se štěpil restrikčním enzymem Xmal a BamHI a ligoval se s restrikčním fragmentem, který nese gen GFP. Uvedený restrikční fragment GFP se generoval z pEGFP restrikčními enzymy Agel a EcoRI. Ligační produkt se klonoval do vektoru, který nese sekvenci «ZZB, štěpeného Mfel/BamHI. Výsledný substrátový vektor nese gen GFP v opačné orientaci s ohledem na promotor CMV, jeho funkčnost při integrační rekombinaci se testovala Int divokého typu v mikroorganizmu E. coli.
S výjimkou rekombinantních sekvencí pGFPaftL/atfR je shodný s pGFPč/ZZB/uZZP. Vektor se konstruoval tak, že se nejdříve rekombinuje pGFPaZ/B/aíZP v mikroorganizmu E. coli, což vede k vytvoření sekvence aitL, a uZzR. Následně s ohledem na promotor CMV se vystřihl správně orientovaný gen GFP s částečnou restrikční reakcí s enzymy BsiEI a HindlII. Gen GFP se nejdříve celý amplifikoval PCR použitím následujících primerů, aby se začlenil v opačné orientaci s ohledem na promotor CMV.
(p2) 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3' (p3) 5 - AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3' (obrázek č. 3).
Amplifikace se provedla po prvním denaturaČním kroku při teplotě 95 °C (po dobu 4 minuty) s 30 cykly denaturace (teplota 95 °C, po dobu 45 vteřin), navázání primerů proběhlo při teplotě 56 °C po dobu 45 vteřin a syntéza DNA se provedla při teplotě 72 °C po dobu 1 minuty a konečný krok syntézy se provedl při teplotě 72 °C po dobu 4 minuty. Fragment PCR se štěpil restrikčním enzymem HindlII a následně BsiEI a integroval se do částečně štěpeného vektoru, který zahrnuje sekvenci attL a tzZzR v opačné orientaci. Tak pGFPaZzL/tfí/R ukazuje stejnou globální strukturu jako pGFPa/zB/aZíP s výjimkou přítomnosti attUatfiA místo aZ/B/aZZP.
Lidský homolog <jzzB uzzH se amplifikoval z čištěné lidské DNA použitím PCR s následujícími primery:
(B3) 5'-GCTCTAGATTAGCAGAAATTCTTTTTG-3' (B2) 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3
Amplifikace se provedla pro prvním kroku denaturace pri teplotě 95 °C po dobu 5 minut ve 30 cyklech denaturace, která probíhá pri teplotě 95 °C po dobu 45 vteřin, navázání primerů probíhá při teplotě 42 °C po dobu 1,45 minut, syntéza DNA probíhá při teplotě 72 po dobu 1,45 minuty a konečná syntéza probíhá po dobu 10 minut při teplotě 72 °C. Primerové sekvence vhodné pro přípravu sekvence attH se vybraly z EST (přístupové číslo N31218, EMBL-databáze). Neúplná sekvence aZZH přítomná v databázi se ověřila a doplnila sekvenací izolovaného produktu PCR (192 bp). Následně se fragment štěpil retrykčním enzymem Xbal a Pstl a začlenil se do stejným způsobem upraveného vektoru pACYC187 (získaného z instituce New England Biolabs). Sekvence AttP* se vytvořila cílenou mutagenezí, jak se popisuje v publikaci Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp 825) a začlenila se do vektoru, který nese sekvenci
- 12CZ 302620 B6 aftH v opačné orientaci ve srovnání s attH. Na základě této konstrukce vzniká testovací vektor pACH.
Z mikroorganizmu E. coli kmene DH5ot se izolovala plazmidová DNA (popisuje se v publikaci
Hanahen, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, pp. 557) afinitní chromatografií (Qiagen, Německo). Expresívní a substrátové vektory stejně jako konstrukce vytvořené PCR se kontrolovaly na základě fluorescence pomocí 373A DNA-sekvenační systém (Applied Biosystems). Reakce PCR se provedly pomocí sady „Master Mix Kit“ a výsledné produkty se analyzovaly elektroforézou na agarózovém gelu (0,8 % (hmotnost/objem) v pufru TBE.
Příklad 2: Buněčná kultura a konstrukce reportních buněčných linií
Dočasná exprese a rekombinantní analýzy se provedly s lidskou buněčnou linií Burkitova lym15 fomu (BL60, popisuje se v publikaci Wolf, J. et al., (1990) Cancer Res., 50, pp. 3095)). Buňky BL60 se kultivovaly v kultivačním médiu RPMI 1640 (od firmy Life Technologies, lne.) obohacené 10% fetálním telecím sérem a zahrnují 2 mM L-giutamin, streptomycin (0,1 mg/ml) a penicilín (100 jednotek/ml).
Reportní buněčné linie BL60 s pGFPaZZB/aZZP nebo pGFPa/zL/a/zR stabilně integrované do genomu se zkonstruovaly následujícím způsobem: přibližně 20 gg každého vektoru se linearizovalo restrikčním enzymem ApaLI a čistil se extrakcí směsí fenol/chloroform, sráželo se ethanolem a zavedlo se do buněk v přibližném počtu 2 x 107 elektroporací při 260 V a 960 mF za použití zařízení „Bio-Rad Gene Pulser“. Stabilní buněčné linie se vybraly pomocí G418/Genetizin (300 gg/ml) a následně se charakterizovaly PCR, sekvencováním DNA a Southemovou analýzou.
Příklad 3: Rekombinaění analýza in vivo
Aby se provedla intramolekulární rekombinaee in vivo přibližně 2 x 107 buněk reportní buněčné linie BL 60 se transfekovalo 40 gg každého kruhového expresívního vektoru elektroporací, jak se popisuje v příkladu 2. Buňky se sklízely po 72 hodinách centrifugací a genomová DNA z polovičního množství buněk se izolovala afinitní chromatografií podle instrukcí výrobce (Qiaamp
Blood Kit, Qiagen, Německo). Z polovičního množství buněk se izolovala RNA (Rneisy kit, Qiagen, Německo) nebo se připravil buněčný lyzát western analýzou (příklad 4).
RekombinaČní analýza s vektorem pACH se provedla v mikroorganizmu E. coli, jak se popisuje shora v textu (popisuje se v publikaci Christ and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol. 288, pp. 825) použitím rekombináz Int, Int-h a Int—b/218. Očekávaná rekombinaee pACH vede k inverzi a prokázala se restrikční analýzou restrikčními enzymy HindlII a Aval.
Intermolekulámí rekombinaee při integraci pEL13 do genomu lokalizovaném na lokusu aZZH buněk BL60 se provedla následujícím způsobem: 2x107 buněk se transfekovalo 20 gg kruhového pEL13 pomocí elektroporace, jak se popisuje shora v textu. Buňky se nanesly na plotny v koncentraci lxlO6 buněk/ml v selekčním médiu (200 gg/ml hygromycinu B) po 48 hodinách a inkubace probíhala po dobu 6 až 8 týdnů. Z části buněčné populace, která přežila se po inkubaci podle instrukcí výrobce připravila genomová DNA (Qiaamp Blood Kit, Qiagen, Německo).
Aby se zlepšila intramolekulární, integrační a excizní rekombinaee 0,4 gg genomové DNA se amplifikovalo pomocí PCR za použití 20 až 50 pmol následujícího primerů:
- 13 CZ 302620 B6 (pl) 5'-GGCAAACCGGTTGAAGCCTGCTTTT-3';
(p2) 5'-AATCCGCGGTCGGAGCTCGAGATCTGAGTCC-3Y (p3) 5'-AATCCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGG-3';
(p4) 5'-AACCTCTACAAATGTGGTATGG- 3\ (p5)5'-TACCATGGTGATGCGGTTTTG-3';
(p6) 5 -GGGGATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC;
(p7) 5 '-TCCCCCCGGGAGGGAGTGGGAC AAAATTGA-3'.
Amplifikace se provedla po prvním kroku denaturace při teplotě 95 °C (po dobu 5 minut) při 30 cyklech denaturace (teplota 95 °C, po dobu 45 vteřin), proběhlo navázání primerů při teplotě 57 °C po dobu 45 vteřin a syntéza DNA při teplotě 72 °C po dobu 1,5 minuty a konečný krok syntézy proběhl při teplotě 72 °C po dobu 4 minuty, íntermolekulámí integrační rekombinace pEL13 se detekovala následujícím způsobem. Přibližně 400 ng genomové DNA izolované z přeživší buněčné populace se inkubovalo s následujícími oligonukleotidy, které se použily jako primery PCR:
(attxl) 5'-AGTAGGAATTCAGTTGATTCATAGTGACTGC-3' (B2) 5'-AACTGCAGTAAAAAGCATGCTCATCACCCC-3\
Amplifikace se provedla po prvním kroku denaturace při teplotě 95 °C (po dobu 4 minuty) při 30 cyklech denaturace (teplota 95 °C, po dobu 45 vteřin), pak proběhlo navázání primerů při teplotě 52 °C po dobu 45 vteřin a syntéza DNA při teplotě 72 °C po dobu 45 vteřin a konečný krok syntézy proběhl při teplotě 72 °C po dobu 4 minuty.
PCR s reverzní transkriptázou se provedla s izolovanou RNA v množství 4 μg. Nejdříve se syntetizovala cDNA použitím primerů oligo-dT podle instrukcí výrobce (použitím sady „First Strand Synthesis Kit“, Pharmacia). Pak se čtvrtina uvedené cDNA použila jako templát pro následnou reakci PCR za použití primerů p3 a p4. Aby se testovala delece místo inverze, izolovaná genomová DNA se amplifikovala pomocí primerů p5 a p6. Transkripty beta aktinu se analyzovaly použitím uvedené cDNA pomocí primerů (AS) 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3' (S) 5 '-TGGAATCCTGTGGC ATCC ATG AAAC-3'.
Podmínky PCR byly stejné jako v případě použití primerů pl až p7.
Southemova analýza se v podstatě provedla podle protokolu uvedeného v publikaci Sambrook, J. (1989) Molecular Cloning (2 nd Edt.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Přibližně 10pg genomové DNA se Štěpilo na fragmenty pomocí restrikční endonukleázy Ncol a jednotlivé fragmenty se separovaly na elektroforézou na agarózovém gelu (0,8 % hmotnostní/objem) v pufru TBE a přes noc se převedly na nylonovou membránu. Sonda GTP určená pro detekci rekombinace se vytvořila pomocí PCR použitím primerů p2 a p3. Radioaktivní značení se provedlo použitím dATP a dCTP značeným 2P podle instrukcí výrobce (Megaprime. Amersham).
Příklad 4: Western analýza
Buněčné lyzáty dočasně transfeko váných buněk se vytvořily po vařením buněk v pufru vhodném pro sondu (New England Biolabs) po dobu 5 minut. Proteiny se separovaly v 12,5 % SDS polyakrylamidovém gelu podle jejich molekulové hmotnosti a přes noc se přenesly na nitrocelulózo- 14CZ 302620 B6 vou membránu (Immobilon P, Millipore). Membrána se ošetřila 1 % blokačním roztokem BM Chemiluminiscence Western Blotting Kit, Boehringer Mannheim, Německo) a inkubovala se s myšími monoklonálními protilátkami řízenými proti Int divokého typu v ředění 1 : 50 000 (protilátky od A. Landy, USA). Aby se zviditelnilo poloha integrázy v gelu použily se sekundární protilátky spojené s peroxidázou (BM Chemiluminiscence Western Blotting Kit, Boehringer Mannheim, Německo). Jako kontrola se použily extrakty buněk mikroorganizmu E. coli obsahující Int.
io Příklad 5: Výsledky
1, Syntéza Int-h v buňkách BL60
Aby se testovalo, zda Int-h může katalyzovat rekombinaci v lidských buňkách, je nezbytné uká1 s zat, že v uvedených buňkách se syntetizuje rekombináza. Proto se začlenil eukaryontní expresívní vektor pKEXInt-h nesoucí gen Int—h řízený promotorem CMV. Po zavedení pKEXInt-h do dvou různých reportních buněčných linií jmenovitě B2 a B3 se analýzou RT-PCR detekovaly úplné a správně modifikované transkripty. Buněčné lyzáty se zkoumaly western analýzou 72 hodin po elektroporací vektoru pKEXInt-h. Detekce rekombinázy se provedla myšími polyklonálními protilátkami určenými proti Int. divokého typu. Jako kontrola se do buněk zavedl vektor pKEX.
Výsledky ukazují, že protein, který vykazuje očekávanou molekulovou hmotnost je přítomen v buňkách ošetřených elektroporací s pKEXInt-h. Uvedený protein se nemohl detekovat, jestliže se použil vektor pKEX.
2. Integrační intramolekulámí rekombinace v lidských buňkách katalyzovaná Int-h
Western analýza demonstrovala, že protein Int-h se syntetizoval ze dvou reportních buněčných linií, přičemž se vycházelo z vektoru pKEXInt-h. Uvedené buňky obsahují substrátový vektor pGFPattB/attP, jako cizorodou DNA začleněnou do jejich genomu. Dvě rekombinantní sekvence vhodné pro integrační rekombinaci, jmenovitě attB a attP se nacházejí ve vzájemně obrácené orientaci a lemují gen GFP. Samotná gen GFP se nachází v obrácené orientaci vůči promotoru CMV, který se nachází proti směru exprese sekvence attB. Rekombinace mezi sekvencemi attB a attP pomocí Int-h vede k inverzi genu GFP a tak kjeho expresi. Celkem se zkonstruovaly tri reportní buněčné linie (Bl až B3). Southemova analýza jejich genomové DNA ukázala, že několik kopií pGFPattB/attP jako přímé repetice se mohou začlenit do genomu Bl a B3, zatímco buněčná linie B2 obsahuje pouze jednu kopii. Začleněné sekvence se ověřily pomocí PCR a následnou sekvenací.
Za účelem testovat rekombinaci mezi sekvencemi attB a attP se do buněčných linií zavedly vektory pKEXInt-h a pKEX odděleně. Buňky se sklízely 72 hodin po elektroporací, RNA se izolovala z části uvedených buněk a zkoumala se exprese GFP pomocí RT-PCR za použití páru příměrů p3/p4. Uvedené primery se použily kamplifíkaci 0,99 kb dlouhého fragmentu DNA, jestliže se gen GFP obrátil došlo k rekombinaci. Výsledky demonstrovaly, že produkt se deteko45 val ve všech třech buněčných linií. Jestliže vektor pKEX se zavedl do buněk nedetekoval se žádný produkt. Analýzy sekvence DNA izolovaného produktu PCR potvrdila, že se přepisovala kódující oblast genu GFP a že se v transkriptu detekovala sekvence attR místo attP. Jako kontrola množství RNA ve všech šesti buněčných linií stejně jako se úspěšně analyzoval pomocí PCR první řetězec DNA transkriptu beta-aktinu syntetizovaný reverzní transkriptázou. Výsledky uká50 žaly, že transkript byl přítomen většinou ve stejném množství.
Rekombinace se detekovala také přímým PCR genomové DNA. Výsledky demonstrovaly, že očekávané produkty se mohly detekovat pouze páry primerů p3/p4 (0,99 kb) a pl/p2 (0,92 kb), jestliže vektor pKEXInt-h se zavedl do buněk. Analýza uvedených produktů sekvenováním DNA potvrdila, že attR a attL jsou přítomny v genomu a že gen GFP má po rekombinaci opačnou
- 15CZ 302620 B6 orientaci. Tyto experimenty se opakovaly třikrát, přičemž rekombinace mezi a attP se detekovaly ve všech třech buněčných liniích pomocí RT-PCR a/nebo PCR. Detekce delece genu GFP pomocí PCR byla negativní párem primerů p5/p6. Amplifikovat se mohl pouze očekávaný fragment o velikosti 1,3 kb, který je začleněný ve vektoru.
Nesilnější signál, který ukazuje inverzi mezi sekvencemi rtf/B a attP, se opakovaně získal pomocí PCR s buněčnou linií B3 v dalším experimentu. Jako výsledek se genomová DNA štěpila pomocí restrikčního enzymu Ncol a testovala se Southemovou analýzou, kdy se jako sonda použil gen GFP. Výsledky ukázaly, že restrikční fragment genomové DNA se detekoval v buněčné linii B3, která se očekávala jako výsledek inverze mezi a/zB a aZZP.
Aby se testovalo zda Int divokého typu a mutant Int-h/218 mohl katalyzovat intramolekulámí integrační rekombinací, také vektory pKEXInt-h, pKEXInt-h/218 a jako kontrola pKEX se zavedly do rerpotní buněčné linie B3 elektroporaci v dalším experimentu, jak se popisuje v příkladu 2. Genomová DNA se izolovala po 72 hodinách a testovala se rekombinace prostřednictvím PCR s páry primerů p5/p7 a p3/p4, jak se popisuje v příkladu 3. Výsledky ukázaly, že oba mutanti Int by mohly katalyzovat rekombinací mezi aZZB a attP, avšak Int divokého typu není aktivní.
3. Excízní rekombinace mezi sekvencemi azzL a aZZR nebyly detekovatelné
Protože Int-h by mohly katalyzovat také excizní rekombinaci mezi attL a aZZR v nepřítomnosti kofaktorů IHF a Xis tří reportních buněčných linií BL60, které mají stabilně integrovaný vektor pGFPaZZL/aZZR do genomu. Uvedené buněčné linie zahrnují gen GFP obrácené orientaci s ohledem na promotor GMV sousedící se sekvencí attL a α/ZR místo aZZB a attP. Rekombinační analýzy se provedly pomocí pKEXInt-h, jako expresívního vektoru v případě rekombinázy, jak se popisuje v příkladu 3. Demonstrovaly však, že mezi sekvencí attL a attR se pomocí RT-PCR nebo PCR nedetekovaly ani inverze ani delece.
4. Identifikace a charakterizace přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvence v lidském genomu, která je podobná sekvenci a/zB
Mutanti rekombinázy Int katalyzují integrační intramolekulámí rekombinaci v lidských buňkách, jak se demonstrovalo v příkladu 3. Jedna ze dvou rekombinantních sekvencí, která se podílí na uvedené reakci, jmenovitě sekvence aZZB, je 21 bp dlouhá a tvoří přirozenou část genomu mikroorganizmu E. coli. Ukázalo se, že některé rozdíly v sekvenci, která se nazývá rozeznávaná oblast jádra sekvence attB jsou tolerovány rekombinázou Int-h v rekombinaci s attP (popisuje se v publikaci Nash (1981) Annu. Rev. Gent., 15, pp. 143). Ze statistického hlediska přítomnost funkčních sekvenčních homologů se sekvencí aZZB v lidském genomu. V databázi se může identifikovat stále neúplná sekvence, jako část exprimované sekvence tag (EST). Uvedená sekvence se pak izolovala pomocí PCR z lidské DNA a klonovala se. Analýza sekvence DNA doplnila sekvenci a dále Southemova analýza s genomovou DNA buněk BL60 demonstrovala, že uvedená sekvence je částí stále neznámého lidského genu v přítomnosti genomu jako genu s jednou kopií.
Uvedená sekvence označená jako attH se liší od sekvence attB divokého typu ve třech polohách. Dva z nukleotidů se nachází na levé straně rozeznávací oblasti jádra rekombinázy Int (B) a třetí je část, která se nazývá oblast přesahu. Protože shoda oblasti přesahu dvou rekombinantních sekvencí je nezbytná pro účinnou rekombinaci rekombinázou Int-h, respektive nukleotid v poloze 0 v přesahu sekvence attP se změnil zthymidinu na guanin, což vede k sekvenci attP*. Sekvence attB a attP* se začlenily jako sekvence s opačnou orientací do vektoru (pACH) a testovala se jejich schopnost rekombinace do mikroorganizmu E. coli. Výsledky ukázaly, že rekombináza Int-h a Int-h/218 katalyzovaly inverzi mezi sekvencí attH a attP* v nepřítomnosti IHF. Analýza sekvence DNA izolovaných rekombinantních produktů potvrdilo, že rekombinace mezi sekvencí attH/attP* se provádí očekávaným mechanizmem. Naopak rekombináza Int divokého typu může rekombinovat sekvence attHlattP* dokonce v přítomnosti IHF pouze velmi nedostatečně. Pak
- 16CZ 302620 B6 sekvence attH je potencionální integrační sekvence v případě rekombinázy ínt-h, která katalyzuje začlenění cizorodé DNA, jenž zahrnuje kopii sekvence attP*.
5. Integrační intermolekulámí rekombinace mezi sekvencemi attH a attP* v lidských buňkách.
Aby se ukázalo, že sekvence attH se jako přirozená část lidského genomu může rekombinovat se sekvencí atfP* v intermolekulámí reakci, zkonstruoval se vektor pEL13. Uvedený vektor zahrnuje kopii sekvence attP* vedle genu rekombinázy Int-h, který řídí promotor CM V a gen rezistence na hygromycin, jenž slouží jako selekční markér. Po zavedení vektoru pEL13 do buněk io BL60 může se syntetizovat Int-h a katalyzuje intermolekulámí rekombinaci mezi genomovou sekvencí α/íH a attP* jako částí vektoru pEL13.
Vektor pEL13 se zavedl do buněk BL60 elektroporací, jak se popisuje v příkladu 2. Uvedené buňky se po 72 hodinách vystavily selekčnímu tlaku a ředily se. U populace buněk, které přežily, is se po 6 až 8 týdnech testovaly PCR s páry primerů attxl/B2. Výsledky ukázaly, že u 13ti z 31 buněčných populací se detekovalo začlenění sekvence α/zH. Sekvenční analýza DNA produktů
PCR z různých přístupů potvrdila shodu rekombinačních produktů.
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1: ctgcxttttt atactaactt g (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 243 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Bakteriofág lambda (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
- 17CZ 302620 B6
| tctgttacag | gtcactaata | ccatctaagt | agttgaccca | tagtgactgc | atatgttgtg | 60 |
| ttttacagta | ttatgtagtc | tgttttttat | gcaaaaccta | atttaatata | ttgatattta | 120 |
| tatcatttta | cgtttctcgt | tcagcttttt | tatactaagt | tggcattata | aaaasgcatt | 180 |
| gcttatcaat | ttcttgcaac | gaacaggtca | ctatcagtca | aaataaaatc | attatttgat | 240 |
| ttc | 243 |
(2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 102 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg rgttgcaacg 60 aacaggrcan tatcagtcaa aataaaatca ttacizgatt tc 102 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: 20 (A) DÉLKA: 162 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
| tctgttacag | gtcactaata | ccatctaagt | agttgattca | tactgact gc | atatgttgtg 60 |
| ttttacagta | ttatgtagtc | tgttttttat | gcaaaatcta | atttaatata | ttgatattta 120 |
| tatca 111 ta | cgtttctcgt | tcagcttttt | tstattaacc | tg | O tí |
(2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: 35 (A) DÉLKA: 243 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
- 18CZ 302620 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(B) umělá sekvence (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace: specifikace umělé sekvence: oligonukleotid io (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
| tctgttacag | gtcactaata | ccatctaagt | agttgattca | tagtgactgc | atatgttgtg | 60 |
| ttttacagta | ttatgtagtc | tgttttttat | gcaaaatcta | atttaatata | ttgatattta | 120 |
| tatcatttta | cgtttctcgt | tcagcttttt | gatactaagt | tggcattaca | aaaaagcatt | 180 |
| gct^atcaat | ctgttgcaac | gaacaggtca | ctatcagtca | aaataaaatc | attatttgat | 240 |
| ttc | 243 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (27)
1. Způsob sekvenčně specifické rekombinace DNA v eukaryontní buňce in vitro, vyzná20 čující se tím, že zahrnuje
a) zavedení první sekvence DNA do buňky, která obsahuje sekvenci attB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, nebo sekvenci attP podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát, nebo sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát nebo sekvenci attP, podle SEQ ID NO: 4 nebo
25 její derivát,
b) zavedení druhé sekvence DNA do buňky, jestliže první sekvence DNA obsahuje sekvenci tíf/íB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attP podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát a naopak, nebo jestliže uvedená první sek30 vence DNÁ obsahuje sekvenci attP, podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát, uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát a naopak,
c) provedení sekvenčně specifické rekombinace integrázou Int bakteriofága lambda,
35 kde pod pojmem „derivát“ se rozumí sekvence attB, attP, attL a attR, obsahující jednu nebo více, nejvýše však šest substitucí ve srovnání s přírodně se vyskytujícími rekombinačními sekvencemi.
2. Způsob sekvenčně specifické rekombinace DNA v eukaryontní buňce obsahující ve svém genomu první sekvenci DNA, která se buď v eukaryontní buňce přirozeně vyskytuje nebo se do
40 ní dříve zavedla rekombinaci DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky b) a c) definované v nároku 1.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedená první sekvence DNA obsahuje sekvenci u//B podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát a uvedená druhá sekvence
45 DNA obsahuje sekvenci attP podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát ve významu, uvedeném v nároku 1.
4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedená první sekvence DNA obsahuje sekvenci attL podle SEQ ID NO: 3 nebo její derivát ve významu, uvedeném
- 19CZ 302620 B6 v nároku 1 a uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci attR podle SEQ ID NO: 4 nebo její derivát ve významu, uvedeném v nároku 1, kde v kroku c) je navíc přítomen faktor Xis.
5. Způsob podle libovolného nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že se do buňky navíc zavedla třetí nebo třetí a čtvrtá sekvence DNA obsahující gen Int nebo gen Int a gen faktoru Xis.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená třetí nebo uvedená třetí a/nebo Čtvrtá sekvence DNA dále obsahuje regulační sekvenci DNA ovlivňující prostorovou a/nebo dočasnou expresi genu Int a/nebo genu faktoru Xis.
7. Způsob podle libovolného z nároků laž6, vyznačující se tím, že uvedená Int je upravená integráza.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedená upravená Int je Int-h nebo Int-h/218.
9. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že v kroku c) je navíc zahrnut „integrační hostitelský faktor“ (IHF).
10. Způsob podle libovolného z nároků laž9, vyznačující se tím, že uvedená první a/nebo druhá sekvence DNA dále obsahují sekvence DNA, ovlivňující začlenění uvedené první a/nebo druhé sekvence DNA do genomu eukaryontních buněk homologní rekombinací.
11. Způsob podle libovolného z nároků lažlO, vyznačující se tím, že uvedená první a/nebo druhá sekvence DNA dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid.
12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že uvedený polypeptid je strukturální protein, endogenní nebo exogenní enzym, regulační protein nebo markerový protein.
13. Způsob podle libovolného z nároků 1 a 3 až 12, vyznačující se tím, že uvedená první a druhá sekvence DNA se zavedly do eukaryontní buňky na stejné molekule DNA.
14. Způsob podle libovolného z nároků lažl3, vyznačující se tím, že uvedená eukaryontní buňkaje savčí buňka.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedená savčí buňka je lidská, opičí, myší, krysí, králičí, křeččí, kozí, bovinní, ovčí nebo prasečí buňka.
16. Způsob podle libovolného z nároků Iaž3a5aží5, vyznačující se tím, že dále zahrnuje
a) provedení druhé sekvenčně specifické rekombinace DNA po první sekvenčně specifické rekombinací DNA po krocích a) až c) pomocí Int a faktoru Xis, kde uvedená první sekvence DNA obsahuje uvedenou sekvencí attB podle SEQ ID NO: 1 nebo její derivát ve významu uvedeném v nároku 1, a uvedená druhá sekvence DNA obsahuje sekvenci att? podle SEQ ID NO: 2 nebo její derivát ve významu uvedeném v nároku 1, nebo naopak.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že do uvedených buněk se dále zavádí další sekvence DNA, která obsahuje gen faktoru Xis.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedená další sekvence DNA obsahuje další regulační sekvenci DNA ovlivňující prostorovou a/nebo dočasnou expresi uvedeného genu faktoru Xis.
-20CZ 302620 B6
19. Použití sekvence attB podle SEQ ID NO: 1 nebo jejího derivátu a sekvence att? podle SEQ ID NO: 2 nebo jejího derivátu nebo sekvence attL podle SEQ ID NO: 3 nebo jejího derivátu a sekvence attR podle SEQ ID NO: 4 nebo jejího derivátu, v sekvenčně specifické rekombinací
5 DNA v eukaryontních buňkách in vitro, kde pod pojmem „derivát“ se rozumí sekvence attB, attP, attL a attR, obsahující jednu nebo více, nejvýše však šest substitucí ve srovnání s přírodně se vyskytujícími rekombinačními sekvencemi.
20. Homolog sekvence nukleové kyseliny podle SEQ ID NO: 5 nebo její derivát, která zahrnuje io až šest substitucí s podmínkou, že derivát není sekvence att? divokého typu.
21. Vektor, který obsahuje uvedenou sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 20 a další sekvenci nukleové kyseliny kódující terapeutický gen nebo fragment genu.
15
22. Vektor podle nároku 21, kde uvedený terapeutický gen je gen CFTR, gen ADA, gen receptoru LDL, gen β-globinu, gen faktoru VIII nebo gen faktoru IX, gen alfa-l-antitrypsinu nebo gen dystropinu.
23. Vektor podle nároku 21 nebo 22, kde uvedená další sekvence nukleové kyseliny obsahuje
20 další expres ívní a/nebo transkripční elementy.
24. Vektor podle libovolného z nároků 21 až 23 pro použití jako léčebného prostředku v lidské nebo veterinární medicíně.
25 25. Použití vektoru podle libovolného z nároků 21 až 23 pro výrobu léčebného prostředku pro somatickou genovou terapii.
26. Eukaryontní buňka, která obsahuje první sekvenci DNA podle stupně a) nároku 1 a druhou sekvenci DNA podle stupně b) nároku 1, přičemž tato první a druhá sekvence byly zavedeny
30 způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19941186A DE19941186A1 (de) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | Sequenz-spezifische DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002756A3 CZ2002756A3 (cs) | 2002-06-12 |
| CZ302620B6 true CZ302620B6 (cs) | 2011-08-03 |
Family
ID=7920135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20020756A CZ302620B6 (cs) | 1999-08-30 | 2000-08-29 | Zpusob sekvencne specifické rekombinace DNA v eukaryontní bunce |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030027337A1 (cs) |
| EP (2) | EP1214440B1 (cs) |
| JP (1) | JP2003520028A (cs) |
| KR (1) | KR100490188B1 (cs) |
| CN (1) | CN1182247C (cs) |
| AT (2) | ATE331802T1 (cs) |
| AU (1) | AU776297B2 (cs) |
| CA (1) | CA2390526C (cs) |
| CY (2) | CY1105288T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ302620B6 (cs) |
| DE (3) | DE19941186A1 (cs) |
| DK (2) | DK1681355T3 (cs) |
| ES (2) | ES2267567T3 (cs) |
| HK (1) | HK1047129B (cs) |
| IL (2) | IL148152A0 (cs) |
| MX (1) | MX244498B (cs) |
| PT (2) | PT1214440E (cs) |
| SK (1) | SK286034B6 (cs) |
| WO (1) | WO2001016345A2 (cs) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6720140B1 (en) | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
| US6964861B1 (en) | 1998-11-13 | 2005-11-15 | Invitrogen Corporation | Enhanced in vitro recombinational cloning of using ribosomal proteins |
| US6143557A (en) | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Life Technologies, Inc. | Recombination cloning using engineered recombination sites |
| US7351578B2 (en) * | 1999-12-10 | 2008-04-01 | Invitrogen Corp. | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
| NZ504214A (en) * | 1997-10-24 | 2003-06-30 | Invitrogen Corp | Recombination cloning using nucleic acids having recombination sites |
| EP1173460B1 (en) | 1999-03-02 | 2009-09-16 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids |
| WO2001042509A1 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Invitrogen Corporation | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
| US7244560B2 (en) | 2000-05-21 | 2007-07-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| EP1390394A4 (en) * | 2001-04-19 | 2004-05-26 | Invitrogen Corp | COMPOSITIONS AND METHODS FOR RECOMBINANT CLONING OF NUCLEIC ACID MOLECULES |
| WO2002095055A2 (en) * | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules |
| NZ529597A (en) * | 2001-05-30 | 2005-12-23 | Chromos Molecular Systems Inc | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
| US20030119104A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-06-26 | Edward Perkins | Chromosome-based platforms |
| JP2005521400A (ja) | 2002-03-29 | 2005-07-21 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | 植物におけるラムダインテグラーゼ媒介型組換え |
| AU2003253992A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-02-09 | Robert P. Bennett | Viral vectors containing recombination sites |
| US7491539B2 (en) | 2002-12-05 | 2009-02-17 | Boehringer Ingelheim Pharma Kg | Sequence specific DNA recombination in eukaryotic cells |
| TW200502390A (en) | 2002-11-28 | 2005-01-16 | Peter Droege | Sequence specific DNA recombination in eukaryotic cells |
| WO2005028615A2 (en) * | 2003-06-26 | 2005-03-31 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for detecting promoter activity and expressing fusion proteins |
| EP2484687A3 (en) | 2003-08-08 | 2012-11-14 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for seamless cloning of nucleic acid molecules |
| US8304189B2 (en) * | 2003-12-01 | 2012-11-06 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| US7935862B2 (en) | 2003-12-02 | 2011-05-03 | Syngenta Participations Ag | Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination |
| MX2008015435A (es) | 2006-06-03 | 2008-12-12 | Syngenta Participations Ag | Evento de maiz mir 162. |
| WO2009068645A1 (en) * | 2007-11-30 | 2009-06-04 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Novel recombination sequences |
| CN102604936B (zh) * | 2011-01-21 | 2013-09-04 | 上海市儿童医院 | 羊基因组中被噬菌体*c31整合酶识别的dna及其应用 |
| WO2013018096A1 (en) | 2011-08-03 | 2013-02-07 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Use of integrase for targeted gene expression |
| CN102533741B (zh) * | 2011-12-09 | 2014-09-24 | 深圳华大基因研究院 | 猪假attp位点及其用途 |
| US11078493B2 (en) | 2016-06-21 | 2021-08-03 | Nanyang Technological University | Site-specific DNA recombination |
| CA3066047A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Technische Universitat Dresden | Methods and means for genetic alteration of genomes utilizing designer dna recombining enzymes |
| WO2023237453A1 (en) * | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement | Attp mv4-derived site-specific recombination and its use for integration of sequence of interest |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040722A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
| WO1997047758A1 (en) * | 1996-06-14 | 1997-12-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for transforming cells |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| US7118911B1 (en) * | 1990-03-05 | 2006-10-10 | Genzyme Corporation | DNA molecules stabilized for propagation in bacterial cells that encode cystic fibrosis transmembrane conductance regulator |
| US5227288A (en) * | 1990-10-01 | 1993-07-13 | Blattner Frederick R | DNA sequencing vector with reversible insert |
| US5733743A (en) * | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| FR2731014B1 (fr) * | 1995-02-23 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique |
| PT937098E (pt) * | 1995-06-07 | 2002-12-31 | Invitrogen Corp | Clonagem recombinatoria in vitro utilizando locais de recombinacao modificados |
| DE19530412A1 (de) * | 1995-08-18 | 1997-02-20 | Harald Von Prof Dr Melchner | Selbst deletierende retrovirale Vektoren für die Gentherapie |
| FR2741892B1 (fr) * | 1995-12-04 | 1998-02-13 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'une banque multicombinatoire de vecteurs d'expression de genes d'anticorps, banque et systemes d'expression d'anticorps "coliclonaux" obtenus |
| AU5603998A (en) * | 1996-12-18 | 1998-07-15 | Targeted Genetics Corporation | Recombinase-activatable AAV packaging cassettes for use in the production of AV vectors |
| US5851808A (en) * | 1997-02-28 | 1998-12-22 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
| NZ504214A (en) * | 1997-10-24 | 2003-06-30 | Invitrogen Corp | Recombination cloning using nucleic acids having recombination sites |
| WO2000011155A1 (en) * | 1998-08-19 | 2000-03-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for genomic modification |
-
1999
- 1999-08-30 DE DE19941186A patent/DE19941186A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-08-29 IL IL14815200A patent/IL148152A0/xx active IP Right Grant
- 2000-08-29 PT PT00965792T patent/PT1214440E/pt unknown
- 2000-08-29 DE DE50013093T patent/DE50013093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 AU AU76429/00A patent/AU776297B2/en not_active Expired
- 2000-08-29 PT PT06008807T patent/PT1681355E/pt unknown
- 2000-08-29 HK HK02108061.5A patent/HK1047129B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-08-29 EP EP00965792A patent/EP1214440B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 EP EP06008807A patent/EP1681355B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 JP JP2001520890A patent/JP2003520028A/ja active Pending
- 2000-08-29 MX MXPA02002036 patent/MX244498B/es active IP Right Grant
- 2000-08-29 CA CA2390526A patent/CA2390526C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 KR KR20027002817A patent/KR100490188B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 DE DE50015772T patent/DE50015772D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 DK DK06008807T patent/DK1681355T3/da active
- 2000-08-29 AT AT00965792T patent/ATE331802T1/de active
- 2000-08-29 SK SK304-2002A patent/SK286034B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-08-29 ES ES00965792T patent/ES2267567T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 CZ CZ20020756A patent/CZ302620B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-08-29 DK DK00965792T patent/DK1214440T3/da active
- 2000-08-29 ES ES06008807T patent/ES2334577T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 CN CNB008151040A patent/CN1182247C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-29 WO PCT/DE2000/002947 patent/WO2001016345A2/de not_active Ceased
- 2000-08-29 AT AT06008807T patent/ATE446373T1/de active
-
2002
- 2002-02-14 IL IL148152A patent/IL148152A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-02-25 US US10/082,772 patent/US20030027337A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-09-11 CY CY20061101290T patent/CY1105288T1/el unknown
-
2010
- 2010-01-21 CY CY20101100065T patent/CY1110590T1/el unknown
-
2012
- 2012-11-01 US US13/666,329 patent/US20130133092A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040722A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
| WO1997047758A1 (en) * | 1996-06-14 | 1997-12-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for transforming cells |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ302620B6 (cs) | Zpusob sekvencne specifické rekombinace DNA v eukaryontní bunce | |
| CN111885915B (zh) | 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制 | |
| CN111163633B (zh) | 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法 | |
| ES3033963T3 (en) | Method of testing the ability of a crispr/cas9 nuclease to modify a target genomic locus in vivo, by making use of a cas-transgenic mouse or rat which comprises a cas9 expression cassette in its genome | |
| AU2004204167B2 (en) | Targeted transgenesis using the Rosa26 locus | |
| JP2020533957A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒリポーター非ヒト動物およびその使用 | |
| CN113874510A (zh) | 包括具有β滑移突变的人源化TTR基因座的非人动物和使用方法 | |
| KR20220062079A (ko) | 지질 나노입자에 의해 전달되는 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절 | |
| EP1395612B1 (en) | Modified recombinase | |
| US7892823B2 (en) | Methods and systems for high homologous recombination (“HR”) targeting efficiency | |
| US8759089B2 (en) | Methods and systems for high homologous recombination (“HR”) targeting efficiency | |
| EP1205490A1 (en) | Fusion protein comprising integrase (phiC31) and a signal peptide (NLS) | |
| RU2784927C1 (ru) | Отличные от человека животные, включающие в себя гуманизированный ttr локус, и способы применения | |
| US20040231006A1 (en) | Self-extinguishing recombinases, nucleic acids encoding them and methods of using the same | |
| JPWO2006041096A1 (ja) | 黄色ブドウ球菌バクテリオファージφｍｒ１１由来インテグラーゼ、及びその認識配列を利用した部位特異的遺伝子組換え方法 | |
| HUP0202722A2 (hu) | Szekvencia-specifikus DNS-rekombináció eukarióta sejtekben |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150829 |