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KR102762075B1 - Pd-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

Pd-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법 Download PDF

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KR102762075B1
KR102762075B1 KR1020187023163A KR20187023163A KR102762075B1 KR 102762075 B1 KR102762075 B1 KR 102762075B1 KR 1020187023163 A KR1020187023163 A KR 1020187023163A KR 20187023163 A KR20187023163 A KR 20187023163A KR 102762075 B1 KR102762075 B1 KR 102762075B1
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칼파나 샤아
더글라스 에이치. 스미스
모테-모스 로스 라
레슬리 에스. 존슨
폴 에이. 무어
에지오 본비니
스코트 쾨니그
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마크로제닉스, 인크.
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Abstract

본 발명은 두 가지, 시노몰구스 원숭이 PD-1 및 인간 PD-1: PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15항-PD-1 항체에 결합할 수 있는 선택된 항-PD-1 항체, 및 이러한 항체의 인간화된 및 키메라 버전에 관한 것이다. 발명은 추가적으로 이러한 항-PD-1 항체의 PD-1 결합 단편을 포함하는 PD-1-결합 분자, 면역컨쥬게이트, 및, 디아바디, BiTEs, 이중특이적 항체, 등을 포함하여 (i) 이러한 PD-1-결합 단편 및 (ii) 면역 세포의 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트를 조절하는데 관여하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 이중특이적 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역 반응을 자극하기 위해 PD-1에 결합하는 분자를 사용하는 방법, 뿐만 아니라 PD-1을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

PD-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법{PD-1-Binding Molecules and Methods of Use Thereof}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 출원 일련 번호 62/198,867 (2015년 7월 30일에 출원됨; 계류 중), 62/239,559 (2015년 10월 9일에 출원됨; 계류 중), 62/255,140 (2015년 11월 13일에 출원됨; 계류 중) 및 62/322,974 (2016년 4월 15일에 출원됨; 계류 중)의 우선권을 주장하며, 각 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 의해 하나 이상의 서열 목록을 포함하고, 이것들은 컴퓨터로 판독 가능한 매체로 개시되며(파일명: 1301_0122PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, 2016년 7월 1일 생성됨, 282,789 바이트의 크기를 가짐), 이 파일은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) PD-1 및 인간 PD-1 둘 다에 결합할 수 있는 선택된 항-PD-1 항체: PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 PD-1-결합 도메인을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 이러한 항체의 인간화된 또는 키메라 버전이거나, 또는 이러한 항-PD-1 항체의 PD-1 결합-단편 (특히 면역컨쥬게이트, 디아바디, BiTE, 이중특이적 항체, 등)을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 면역 세포의 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트(check point)를 조절하는데 관여하는 분자의 에피토프에 추가적으로 결합할 수 있는 이러한 PD-1-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PD-1을 검출하거나 또는 면역 반응을 자극하기 위해 이러한 PD-1 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 선택된 항-PD-1 항체의 하나 이상의 PD-1-결합 도메인(들)을 포함하는 PD-1-결합 분자가 면역 반응을 자극하는 데 효과적인 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 및/또는 특이적으로 암 항원에 결합하는 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 투여되는 조합 치료법에 관한 것이다.
I. 세포 매개 면역 반응
인간 및 다른 포유동물의 면역계는 감염 및 질환에 대한 보호를 제공할 책임을 가진다. 이러한 보호는 체액 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 둘 다에 의해 제공된다. 체액 반응은 외래 표적 (항원)을 인식하고 중화시킬 수 있는 항체 및 다른 생체분자의 생산을 초래한다. 반대로, 세포 매개 면역 반응은 T 세포에 의한 대식세포, 자연 살해 세포 (NK), 및 항원-특이적 세포독성 T-림프구의 활성화, 및 항원의 인식에 반응하여 다양한 사이토카인의 방출을 포함한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48).
항원에 대한 면역 반응을 최적으로 매개하는 T 세포의 능력은 두 가지 별개의 신호전달 상호작용을 필요로 한다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). 첫 번째로, 항원 제공 세포 (APC)의 표면 상에 배열된 항원이 항원-특이적 나이브(naive) CD4+ T 세포에 제공되어야 한다. 이러한 제공은 T 세포가 제공된 항원에 특이적인 면역 반응을 시작하도록 지시하는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 신호를 전달한다. 두 번째로, APC와 별개의 T 세포 표면 분자 간의 상호작용을 통해 매개되는 일련의 동시자극 및 억제 신호는 T 세포의 활성화 및 증식을 촉발하여 궁극적으로는 그것들의 억제를 촉발한다. 따라서, 제1 신호는 면역 반응에 대한 특이성을 부여하는 반면 제2 신호는 반응의 성질, 규모 및 기간을 결정하는 역할을 한다.
면역계는 동시자극 및 동시억제 리간드 및 수용체에 의해 엄격하게 제어된다. 이 분자들은 T 세포 활성화를 위해 제2 신호를 제공하고 양성 및 음성 신호의 균형 잡힌 네트워크를 제공하여 감염에 대한 면역 반응을 최대화하는 한편 스스로에 대한 면역력을 제한한다 (Wang, L. et al. (March 7, 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig SuperfamilyLigand That Negatively Regulates T-Cell Responses," J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators DuringParasitic Infections," Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). 항원 제공 세포의 B7.1 (CD80) 및 B7.2 (CD86) 리간드와 CD4+ T-림프구의 CD28 및 CTLA-4 수용체 간의 결합이 특히 중요하다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). CD28에 대한 B7.1 또는 B7.2의 결합은 T 세포 활성화를 자극하고; CTLA-4에 대한 B7.1 또는 B7.2의 결합은 이러한 활성화를 억제한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28은 구성적으로 T 세포의 표면 상에서 발현되는 반면 (Gross, J., et al. (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse," J. Immunol. 149:380-388), CTLA-4 발현은 T 세포 활성화 이후 빠르게 상향조절된다 (Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement," Immunity 4:535-543). CTLA-4가 더 높은 친화도의 수용체이기 때문에 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126), 결합은 T 세포 증식을 먼저 시작한 다음 (CD28을 통해) 그것을 억제하고 (CTLA-4의 초기 발현을 통해), 그로써 증식이 더 이상 필요하지 않을 때 효과를 약화시킨다.
CD28 수용체의 리간드에 대한 추가의 조사는 관련된 B7 분자의 세트 ("B7 슈퍼패밀리(Superfamily)")의 확인 및 특성화로 이어졌다 (Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T-Cell Costimulation," Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses," Microbes Infect. 6:759-766). 현재 패밀리의 여러 구성원들이 공지되어 있다: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), 유도성 동시자극자 리간드 (ICOS-L), 예정된 사멸-1 리간드 (PD-L1; B7-H1), 예정된 사멸-2 리간드 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 및 B7-H6 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).
II. 예정된 사멸-1 ("PD-1")
예정된 사멸-1 ("PD-1", 또한 "CD279"로도 알려짐)은 면역 반응을 광범위하게 부정적으로 조절하는 T 세포 조절자의 연장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 대략 31 kD의 제1형 막 단백질 구성원이다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; 미국 특허 번호 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; PCT 공개 번호 WO 01/14557).
PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 단핵세포상에서 발현되고 (Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The SurfaceOf Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545) 자연 살해 (NK) T 세포에서 저수준으로 발현된다 (Nishimura, H. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice," J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).
PD-1의 세포외 영역은 CTLA-4의 등가 도메인에 대해 23%의 동일성을 가지는 단일 면역글로불린 (Ig)V 도메인으로 구성된다 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-TumorImmunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 세포외 IgV 도메인에 이어 경막 영역 및 세포내 테일이 있다. 세포내 테일은 면역수용체 타이로신-기반 억제 모티프 및 면역수용체 타이로신-기반 스위치 모티프에 위치한 두 인산화 부위를 함유하고, 그것은 PD-1이 TCR 신호를 부정적으로 조절하는 것을 시사한다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (2006) "Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother. 56(5):739-745).
PD-1은 B7-H1 및 B7-DC에 결합함으로써 면역계의 억제를 매개한다 (Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in TumorImmunity," J. Immunother. 30(3):251-260; 미국 특허 번호 6,803,192; 7,794,710; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT 공개 번호 WO 01/39722; WO 02/086083).
B7-H1 및 B7-DC는 인간 및 쥐과의 조직, 예컨대 심장, 태반, 근육, 태아 간, 비장, 림프절 및 흉선뿐 아니라 쥐과의 간, 폐, 신장, 췌장의 도세포(islet cell) 및 소장의 표면에서 광범위하게 발현된다 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). 인간에서, B7-H1 단백질 발현은 인간 내피 세포에서 (Chen, Y. et al. (2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal TubularEpithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) "Renal TubularEpithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1" Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) "B7-H1 Is Expressed By HumanEndothelial Cells And SuppressesT-Cell Cytokine Synthesis," J. Immunol. 169:3581-3588), 심근에서 (Brown, J.A. et al. (2003) "Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production," J. Immunol. 170:1257-1266), 합포체영양세포에서 (Petroff, M.G. et al. (2002) "B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface," Placenta 23:S95-S101) 발견되었다. 분자들은 또한 일부 조직의 상주 대식세포들(resident macrophages)에 의해, 인터페론 (IFN)-γ 또는 종양 괴사 인자 (TNF)-α로 활성화된 대식세포들에 의해 (Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation," Nat. Immunol 2:261-268), 및 종양에서 (Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of TumorImmunity," J. Mol. Med. 81:281-287) 발현된다.
B7-H1과 PD-1 사이의 상호작용은 T와 B 세포에 대한 중대한 네거티브 동시자극 신호를 제공하는 것으로 밝혀졌고 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) 세포 사멸 유도자로서 기능한다 (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi,S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Molec. Med. 83:193-202). 보다 구체적으로, 저농도의 PD-1 수용체와 B7-H1 리간드 사이의 상호작용은 항원-특이적 CD8+ T-세포의 증식을 강력하게 억제하는 억제 신호의 전파를 초래하는 것으로 밝혀졌고; 고농도에서 PD-1과의 상호작용은 T-세포 증식을 억제하지는 않지만 다중 사이토카인의 생성을 현저하게 감소시킨다 (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 휴지기 및 전에 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 둘 다에 의한, 심지어 제대혈로부터의 나이브 T 세포에 의한 T-세포 증식 및 사이토카인 생성은 가용성 B7-H1-Fc 융합 단백질에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다 (Freeman, G.J. et al. (2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation," J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) "PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2," Eur.J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126).
T 세포 활성화 및 증식을 억제하는 데 있어 B7-H1 및 PD-1의 역할은 이 분자들이 염증 및 암의 치료를 위한 치료제로서 작용할 것임을 시사한다. 그로써, 감염 및 종양을 치료하고 적응성 면역 반응을 상향-조절하기 위한 항-PD-1 항체들의 사용이 제안되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401; 미국 특허 번호 7,521,051; 7,563,869; 7,595,048; PCT 공개 번호 WO 2004/056875; WO 2008/083174 참조). PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체들은 문헌에 보고되었다: Agata, T. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The SurfaceOf Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772; 및 Berger, R. et al. (2008) "Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A 인간화된Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies," Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (또한 미국 특허 번호 8,008,449 및 8,552,154; 미국 특허 공개 번호 2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 및 2014/0044738; 및 PCT 특허 공개 번호 WO 2003/099196; WO 2004/004771; WO 2004/056875; WO 2004/072286; WO 2006/121168; WO 2007/005874; WO 2008/083174; WO 2009/014708; WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549; 및 WO 2013/014668 참조).
그러나, 그러한 모든 선행 진보에도 불구하고, 암세포 또는 병원체-감염 세포를, 특히 낮은 치료적 농도에서 공격하기 위해 신체 면역계를 더욱 활발하게 지시할 수 있는 개선된 조성물에 대한 요구가 존재한다. 비록 적응성 면역계가 암 및 질환에 대한 강력한 방어 메커니즘일 수 있긴 하지만, 종종 종양 미세환경의 면역 억제 메커니즘, 예컨대 PD-1의 발현에 의해 방해를 받는다. 나아가, 종양 환경에서 종양 세포, 면역 세포 및 간질 세포(stromal cells)에 의해 발현된 동시억제 분자들은 암세포에 대한 T 세포 반응을 우세하게 약화시킬 수 있다. 그러므로, 강력한 PD-1-결합 분자가 여전히 필요하다. 특히, 바람직한 결합 동역학 프로파일을 가지고 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단함으로써 PD-1/PD-L1 축을 길항하고, 암 또는 다른 질환 및 상태로 고통받고 있는 환자들에게 개선된 치료 가치를 제공할 수 있을 강력한 PD-1 결합 분자에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은 이들 목표 및 다른 목표에 관한 것이다.
본 발명은 시노몰구스 원숭이 PD-1 및 인간 PD-1 둘 다에 결합할 수 있는 선택된 항-PD-1 항체: PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 PD-1-결합 도메인을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 이러한 항체의 인간화된 또는 키메라 버전이거나, 또는 이러한 항-PD-1 항체의 PD-1 결합-단편 (특히 면역컨쥬게이트, 디아바디, BiTE, 이중특이적 항체, 등)을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 면역 세포의 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트를 조절하는데 관여하는 분자의 에피토프에 추가적으로 결합할 수 있는 이러한 PD-1-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PD-1을 검출하거나 또는 면역 반응을 자극하기 위해 이러한 PD-1 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 선택된 항-PD-1 항체의 하나 이상의 PD-1-결합 도메인(들)을 포함하는 PD-1-결합 분자가 면역 반응을 자극하는 데 효과적인 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 및/또는 특이적으로 암 항원에 결합하는 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 투여되는 조합 치료법에 관한 것이다.
상세하게, 발명은 3개의 중쇄 CDR 도메인, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 3개의 경쇄 CDR 도메인, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 항-인간 PD-1 결합 분자를 제공하는데, 여기서
(A) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 1의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72 및 SEQ ID NO:73을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 1의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:78을 가지거나
또는
(B) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 2의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 및 SEQ ID NO:87을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 2의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91 및 SEQ ID NO:92를 가지거나
또는
(C) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 3의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100 및 SEQ ID NO:101을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 3의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 및 SEQ ID NO:106을 가지거나
또는
(D) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 4의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 및 SEQ ID NO:111을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 4의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115 및 SEQ ID NO:116을 가지거나
또는
(E) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 5의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 및 SEQ ID NO:121을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 5의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:125 및 SEQ ID NO:126을 가지거나
또는
(F) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 6의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130 및 SEQ ID NO:131을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 6의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:135 및 SEQ ID NO:136을 가지거나
또는
(G) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 7의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 7의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:146을 가지거나
또는
(H) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 8의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162 및 SEQ ID NO:163을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 8의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:167 및 SEQ ID NO:168을 가지거나
또는
(I) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 9의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:172 및 SEQ ID NO:173을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 9의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177 및 SEQ ID NO:178을 가지거나
또는
(J) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 10의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 및 SEQ ID NO:194를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 10의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198 및 SEQ ID NO:199를 가지거나
또는
(K) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 11의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203 및 SEQ ID NO:204를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 11의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208 및 SEQ ID NO:209를 가지거나
또는
(L) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 12의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213 및 SEQ ID NO:214를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 12의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218 및 SEQ ID NO:219를 가지거나
또는
(M) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 13의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223 및 SEQ ID NO:224를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 13의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228 및 SEQ ID NO:229를 가지거나
또는
(N) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 14의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233 및 SEQ ID NO:234를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 14의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238 및 SEQ ID NO:239를 가지거나
또는
(O) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 15의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243 및 SEQ ID NO:244를 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 15의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248 및 SEQ ID NO:249를 가지거나
또는
(P) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:146을 가지거나
또는
(Q) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.3)의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.3)의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158 및 SEQ ID NO:146을 가지거나
또는
(R) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 hPD-1 mAb 9(2.2)의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:172 및 SEQ ID NO:173을 가지며;
(2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 hPD-1 mAb 9(2.2)의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189 및 SEQ ID NO:178을 가진다.
발명은 또한 분자가 항체인, 특히 분자가 키메라 항체 또는 인간화된 항체인 그런 모든 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다.
발명은 또한 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181 또는 SEQ ID NO:250의 아미노산 서열을 가지는 그런 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다.
발명은 또한 경쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186 또는 SEQ ID NO:251의 아미노산 서열을 가지는 그런 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항-인간 PD-1-결합 분자가 인간 PD-1 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자인 구체예에 관한 것이며, 특히 제2 에피토프가 면역 세포의 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트를 조절하는데 관여하는 분자의 에피토프인 구체예에 관한 것이다 (특히 제2 에피토프는 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, 갈렉틴(Galectin)-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC 클래스 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 또는 VISTA의 에피토프이고, 가장 구체적으로 제2 에피토프는 CD137, CTLA-4, LAG-3, OX40, TIGIT 또는 TIM-3의 에피토프이다).
발명은 또한 항-인간 PD-1-결합 분자가 LAG-3 에피토프-결합 부위를 포함하는 이중특이적 분자인 구체예들에 관한 것이고, 여기서 LAG-3 에피토프-결합 부위는
(A) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44를 가지는 LAG-3 mAb 1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
(2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48을 가지는 LAG-3 mAb 1의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
또는
(B) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44를 가지는 hLAG-3 mAb 1 VH1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
(2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48을 가지는 hLAG-3 mAb 1 VL4의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
또는
(C) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:59를 가지는 LAG-3 mAb 6의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
(2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:63을 가지는 LAG-3 mAb 6의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
또는
(D) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:59를 가지는 hLAG-3 mAb 6 VH1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
(2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:63을 가지는 LAG-3 mAb 6의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을 포함한다.
발명은 또한 분자가 디아바디이고, 특히, 디아바디가 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 그러한 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다. 발명은 또한 분자가 3가 결합 분자이고, 특히 3가 결합 분자는 셋, 넷, 다섯 개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 그러한 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다. 발명은 추가적으로 분자가 Fc 영역을 포함하는 그러한 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예에 관한 것이다. 발명은 추가적으로 분자가 알부민-결합 도메인, 특히 탈면역화 알부민-결합 도메인을 포함하는 그러한 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예에 관한 것이다.
발명은 또한 분자가 Fc 영역을 포함하고, Fc 영역은 FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화도를 감소시키고 및/또는 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변종 Fc 영역이며, 더 구체적으로, 변형은 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 그러한 모든 항-인간 PD-1-결합 분자의 구체예들에 관한 것이다:
(1) L234A; L235A;
(2) L234A 및 L235A;
(3) M252Y; M252Y 및 S254T;
(4) M252Y 및 T256E;
(5) M252Y, S254T 및 T256E; 또는
(6) K288D 및 H435K;
여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이다.
발명은 또한 상기 기술된 PD-1-결합 분자 중 어느 것이 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는데 사용되는 구체예들에 관한 것이다. 발명은 추가적으로 상기 기술된 PD-1-결합 분자가 억제된 면역계와 관련된 질환 또는 상태, 특히 암 또는 감염의 치료에 사용되는 구체예들에 관한 것이다.
발명은 특히 암의 치료 또는 진단 또는 예후에서의 이러한 사용에 관한 것이며, 암은 다음의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암 세포의 존재를 특징으로 한다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 질환, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암 및 자궁암.
발명은 특히 암의 치료 또는 진단 또는 예후에서의 이러한 사용에 관한 것이며, 암은 대장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 (HCL), 출아형 형질세포양 수지상세포 신생물 (BPDCN), 맨틀 세포 백혈병 (MCL) 및 소림프구성 림프종 (SLL)을 포함한 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포종 또는 버킷 림프종이다.
발명은 또한 상기 기술된 PD-1-결합 분자 중 어느 것이 검출 가능하게 표지되어 PD-1의 검출에 사용되는 구체예들에 관한 것이다.
도 1은 각각 E-코일 또는 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가진 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디의 개략도를 제공한다. 시스테인 잔기는 도 3B에서 도시된 바와 같이 링커 및/또는 헤테로다이머-촉진 도메인에 존재할 수 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영(shading) 또는 채움(fill) 패턴을 사용하여 도시된다.
도 2는 회합된 사슬이 Fc 영역의 전부 또는 일부를 형성하도록, 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가진 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 3A 내지 3C는 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍 (즉, 총 네 개의 폴리펩타이드 사슬)으로 구성된 네 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 4가 디아바디를 도시하는 개략도를 제공한다. 각각의 쌍의 하나의 폴리펩타이드는, 회합된 사슬이 Fc 영역의 전부 또는 일부를 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다. 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍은 동일한 것일 수도 있다. VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서 (도 3A 내지 3C에서 도시된 바와 같음), 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 각각의 결합된 에피토프에 대하여 이중특이적이고 2가이다. VL 및 VH 도메인이 동일한 에피토프를 인식하는 (예를 들어, 동일한 VL 도메인 CDR 및 동일한 VH 도메인 CDR이 두 사슬에서 사용된다) 이러한 구체예에서, 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 단일 에피토프에 대하여 단일 특이적이고 4가이다. 대안으로, 폴리펩타이드의 두 개의 쌍은 다를 수도 있다. 폴리펩타이드 각각의 쌍의 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서 (도 3A 내지 3C에서 도시된 바와 같음), 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 각각의 결합된 에피토프에 대하여 사중특이적이고 1가이다. 도 3A는 시스테인 잔기을 포함하는 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 디아바디를 나타낸다. 도 3B는 시스테인 잔기 및 링커 (선택적으로 시스테인 잔기를 가짐)를 포함하는 E-코일 및 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 영역-함유 디아바디를 도시한다. 도 3C는 항체 CH1 및 CL 도메인을 함유하는 Fc 영역-함유 디아바디를 도시한다.
도 4A 및 4B는 세 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 폴리펩타이드 사슬 중 두 개는, 회합된 사슬이 Fc 영역의 전부 또는 일부를 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 헤테로다이머-촉진 도메인을 더 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 5는 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 네 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 폴리펩타이드 사슬 중 두 개는, 회합된 사슬이 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함한 Fc 영역을 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. 결합된 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 헤테로다이머-촉진 도메인을 더 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 6A 내지 6F는 세 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 Fc 영역-함유 3가 결합 분자의 개략도를 제공한다. 도 6A 및 6B는 각각 두 개의 디아바디-형 결합 도메인 및 디아바디-형 결합 도메인이 Fc 영역에 대하여 N-말단 또는 C-말단인 상이한 도메인 방향을 갖는 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6A 및 6B에서 분자는 네 개의 사슬을 포함한다. 도 6C 및 6D는 각각 Fc 영역에 대하여 N-말단인 두 개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 경쇄 및 중쇄가 폴리펩타이드 링커 스페이서, 또는 scFv-형 결합 도메인을 통해 결합되는 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6E 및 6F의 3가 결합 분자는 각각 Fc 영역에 대하여 C-말단인 두 개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 결합된 Fab-형 결합 도메인, 또는 디아바디-형 결합 도메인인 scFv-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6C 내지 6F의 3가 결합 분자는 세 개의 사슬을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 7A 내지 7D는 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15가 인간 PD-1에 결합하는 것을 도시한다. shPD-1-His에의 결합에 대한 결합 곡선은 도 7A에 (PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 4 및 PD-1 mAb 9), 도 7B에 (PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6 및 PD-1 mAb 7) 및 도 7C에 (PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 및 PD-1 mAb 15) 도시된다. shPD-1-인간 Fc에의 결합에 대한 결합 곡선은 도 7D에 (PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 및 PD-1 mAb 15) 도시된다.
도 8A 내지 8C는 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15가 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하는 것을 도시한다. scynoPD-1-hFc에의 결합에 대한 결합 곡선은 도 8A에 (PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7), 도 8B에 (PD-1 mAb 9) 및 도 8C에 (PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 및 PD-1 mAb 15) 도시된다.
도 9A 내지 9D는 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15가 인간 PD-L1의 인간 PD-1에의 결합을 차단하는 능력을 도시한다. 억제 곡선은 도 9A에 (PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 15 및 PD-1 mAb A), 도 9B에 (PD-1 mAb 4), 도 9C에 (PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7 및 PD-1 mAb A) 및 도 9D에 (PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14, PD-1 mAb 15 및 PD-1 mAb A) 도시된다.
도 10A 내지 10B는 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7의 조직 특이성을 도시한다. 도 10A는 정상 결장 (패널 i 및 vii), 간 (패널 ii 및 viii), 폐 (패널 iii 및 ix), 췌장 (패널 iv 및 x), 신장 (패널 v 및 xi) 및 심장 (패널 vi 및 xii) 조직의 조직학적 염색을 도시한다. 도 10A, 패널 i 내지 vi은 표지된 PD-1 mAb 7 (0.313 μg/mL)과 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 10A, 패널 vii 내지 xii는 표지된 동위원소 대조표준 mAb (0.314 ㎍/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 10B는 PD-1을 발현하는 피부 (패널 i 및 iv), 편도선 (패널 ii 및 v) 및 NSO 세포 (패널 iii 및 vi)의 조직학적 염색을 도시한다. 도 10B, 패널 i 내지 iii은 표지된 PD-1 mAb 7 (0.313 ㎍/mL)과 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다.
도 11은 IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P)를 가지는, 인간화된 항-인간 PD-1 항체 hPD-1 mAb 2, hPD-1 mAb 7(1.1), hPD-1 mAb 7(1.2), hPD-1 mAb 9(1.1), 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B의 세포 표면 PD-1에의 결합에 대한 결합 프로파일을 도시한다.
도 12A 내지 12B는 IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P)를 가지는, 인간화된 항-PD 항체 hPD-1 mAb 2, hPD-1 mAb 7(1.1), hPD-1 mAb 7(1.2), hPD-1 mAb 9(1.1), 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B가 세포 표면 인간 PD-1에 대한 가용성 인간 PD-L1 (도 12A) 및 가용성 인간 PD-L2 (도 12B)의 결합을 차단하는 능력을 도시한다.
도 13은 IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P)를 가지는, 인간화된 항-PD 항체 hPD-1 mAb 2, hPD-1 mAb 7(1.1), hPD-1 mAb 7(1.2), hPD-1 mAb 9(1.1), 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B가 Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1 루시페라제 리포터 분석에서 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하고 T-세포의 하향-조절을 방지함으로써 PD-1/PD-L1 축에 길항하는 능력을 도시한다.
도 14는 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15가 참조된 항-PD-1 항체 (PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B)와 비교할만한 또는 그것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있고 LAG-3 mAb 1과 조합된 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15로의 치료가 사이토카인 방출의 최대 증대를 제공하였음을 도시한다. 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체들로 단독으로 및 조합하여 처리된 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB)자극된 PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일.
도 15A 내지 15B는 IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P)를 가지는, 인간화된 항-PD 항체 hPD-1 mAb 2, hPD-1 mAb 7(1.2), hPD-1 mAb 9(1.1), 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B가 사이토카인 생성을 자극하는 능력을 도시한다. 항-PD-1 항체로 처리된 SEB-자극된 PBMC로부터의 IFNγ (도 15A) 및 TNFα (도 15B) 분비 프로파일.
도 16A 내지 16B는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART A, DART D, DART E, DART F, DART G 및 DART H가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)의 조합의 투여시 관찰된 것과 비교할만한 또는 그것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있고, PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART A, DART D, DART E, DART F 및 DART G가 사이토카인 방출의 최대 증대를 제공하였음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디로, 또는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체 단독으로 또는 조합하여 처리된 저농도의 SEB (0.2 ng/mL)로 자극된 PBMC의 IFNγ 분비 프로파일이 도표화된다. 두 대표적인 도너로부터의 PBMC를 사용한 결과가 도 16A 및 도 16B에 도시된다.
도 17A 내지 17B는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART A, DART B 및 DART C가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)의 조합의 투여시 관찰된 것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디로, 또는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체 단독으로 및 조합하여 처리된 고농도의 SEB (85 ng/mL)로 자극된, 두 대표적인 도너로부터의 PBMC의 IFNγ 분비 프로파일이 도표화된다. 두 대표적인 도너로부터의 PBMC를 사용한 결과가 도 17A 및 도 17B에 도시된다.
도 18A 내지 18B는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART A, DART B 및 DART C가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)의 조합의 투여시 관찰된 것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디로, 또는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체 단독으로 및 조합하여 처리된 중간 농도의 SEB (0.5 ng/mL)로 자극된, 두 대표적인 도너로부터의 PBMC의 IFNγ 분비 프로파일이 도표화된다. 두 대표적인 도너로부터의 PBMC를 사용한 결과가 도 18A 및 도 18B에 도시된다.
도 19는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART D 및 DART H가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)의 조합의 투여시 관찰된 것과 비교할만한 또는 그것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있고, DART D가 사이토카인 방출의 최대 증대를 제공하였음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디로, 또는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체 단독으로 및 조합하여 처리된 고농도의 SEB (85 ng/mL)로 자극된 대표적인 도너로부터의 PBMC의 IL-2 분비 프로파일이 도표화된다.
도 20은 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물 DART B 및 DART I가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A, hPD-1 mAb 7(1.2) + hLAG-3 mAb 1(1.4), hPD-1 mAb 7(1.2) + hLAG-3 mAb 6(1.1))의 조합의 투여시 관찰된 것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디로, 또는 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체 단독으로 및 조합하여 처리된 중간 농도의 SEB (0.5 ng/mL)로 자극된, 두 대표적인 도너로부터의 PBMC의 IFNγ 분비 프로파일이 도표화된다.
도 21A 내지 21D는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 DART I가 항-PD-1 mAb + 항-LAG-3 mAb (PD-1 mAb A + LAG-3 mAb A)의 조합의 투여시 관찰된 것보다 높은 수준으로 사이토카인 생성을 자극할 수 있음을 도시한다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디, 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체를 조합하여, 또는 동위원소 대조표준으로 처리된 파상풍 변독소 (5 μg/mL)로 자극된, 두 대표적인 도너로부터의 CD4 메모리 세포의 IFNγ (도 21A 및 21C) 및 IL-2 (도 21B 및 21D) 분비 프로파일이 도표화된다. 두 대표적 도너로부터의 CD4 메모리 T 세포를 사용한 7일째의 결과가 도 21A 내지 B 및 도 21C 내지 D에 도시된다.
도 22는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자, DART I의 약물동역학이 시노몰구스 원숭이에서 항-PD-1 항체, PD-1 mAb A IgG4 (P)의 그것과 비교할만한 것을 도시한다. 선은 DART I (실선) 및 PD-1 mAb A (점선)의 평균 혈청 농도를 도시한다. 수컷 (채워진) 및 암컷 (채워지지 않은) 원숭이에 대한 개별적인 값들이 DART I (삼각형) 및 PD-1 mAb A (원형)에 대해 도표화된다.
도 23A 내지 23C는 상이한 항-PD-1 항체로 처리한 후에 동물에서 시간의 경과에 따른 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 표면에 결합된 PD-1의 혈청 항체 농도 및 백분율을 도시한다. 항-PD 1 mAb 처리 후에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 표면에 결합된 PD-1의 백분율은 우측 y-축에 도표화된다; 기호는 각 개별적인 동물에 대한 T 세포상의 % 결합된 PD 1을 나타내고 점선은 평균값을 도시한다. 혈청 mAb 농도가 좌측 Y-축에 도표화된다; 기호는 각 개별적인 동물에 대한 혈청 수준을 나타내고 실선은 데이터의 비선형 피트를 도시한다. 각 패널은 1일에 IV 주입에 의해 10 mg/kg hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) (도 23A), PD-1 mAb A IgG4 (P) (도 23B) 또는 PD-1 mAb B IgG4 (P) (도 23B)가 투여된 각 동물 (n=1/성별/그룹)에 대한 데이터를 도시한다.
본 발명은 시노몰구스 원숭이 PD-1 및 인간 PD-1 둘 다에 결합할 수 있는 선택된 항-PD-1 항체: PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 PD-1-결합 도메인을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 이러한 항체의 인간화된 또는 키메라 버전이거나, 또는 이러한 항-PD-1 항체의 PD-1 결합-단편 (특히 면역컨쥬게이트, 디아바디 (이를테면, 한정하는 것은 아니지만 DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I 및 DART-J), BiTE, 이중특이적 항체, 등)을 포함하는 PD-1 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 면역 세포의 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트를 조절하는데 관여하는 분자의 에피토프에 추가적으로 결합할 수 있는 이러한 PD-1-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PD-1을 검출하거나 또는 면역 반응을 자극하기 위해 이러한 PD-1 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 선택된 항-PD-1 항체의 하나 이상의 PD-1-결합 도메인(들)을 포함하는 PD-1-결합 분자가 면역 반응을 자극하는 데 효과적인 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 및/또는 특이적으로 암 항원에 결합하는 하나 이상의 추가적인 분자와 조합하여 투여되는 조합 치료법에 관한 것이다.
I. 항체 및 그것들의 결합 도메인
본 발명의 항체는 면역글로불린 분자의 가변 도메인에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 등과 동일한 표적에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론성 항체, 카멜화(camelized) 항체, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화물-결합 이중특이적 Fv (sdFv), 인트라바디 및 상기의 것들 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 나타낸다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편들, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자들을 포함한다. 면역글로불린 분자들은 임의의 유형 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스의 것일 수 있다. 진단에서의 공지된 사용에 더불어, 항체들은 치료제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 항체들은 그런 분자 상의 특정 도메인 또는 모이어티 또는 형태 ("에피토프")의 존재로 인해 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 비-단백질 분자에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 에피토프-함유 분자는 면역원성 활성을 가질 수 있어서, 동물에서 항체 생성 반응을 유도할 수 있고; 그런 분자는 "항원"으로 언급된다. 지난 수십년은 항체의 치료 가능성에 다시 관심이 모아졌고, 항체들이 생명공학-유도된 약물의 선두 클래스의 일원이 되었다 (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). 200개가 넘는 항체-기반 약물이 사용할 수 있게 승인되었거나 개발 중이다.
용어 "단클론성 항체"는 단클론성 항체가 항원의 선택적 결합에 관여하는 아미노산들 (자연적으로 발생하는 및 자연적으로 발생하지 않는)로 구성되는 균일한 항체 집단을 나타낸다. 단클론성 항체는 단일 에피토프 (또는 항원성 부위)에 대해 지시되는, 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체들 및 전체 길이 단클론성 항체들뿐만 아니라 그것들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 단일-사슬 (scFv), 그것들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 항원에 대한 결합 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식 (예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합체 발현, 형질전환 동물 등에 의한)과 관련하여 제한되게 하려는 의도는 없다. 용어는 전체 면역글로불린뿐 아니라 "항체"의 정의 하에서 상기 기술된 단편 등을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 업계에 공지되어 있다. 이용될 수 있는 한 가지 방법은 Kohler, G. et al. (1975) "Continuous CulturesOf FusedCells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497의 방법 또는 그 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 개발된다. 항체는 원하는 에피토프를 함유한 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제의 면역원성 양으로 동물을 면역화시킴으로써 생산된다. 면역원은 1차 세포, 배양 세포주, 암성 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 조직일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 면역화에 사용된 세포는 면역원으로서 사용 전에 일정 기간 (예를 들어, 적어도 24시간) 동안 배양될 수 있다. 세포는 그 자체로 또는 비-변성 보조제, 예컨대 Ribi와 조합하여 면역원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125 참조). 일반적으로, 세포는 면역원으로서 사용될 때 온전하게 유지되어야 하고 바람직하게는 살아있어야 한다. 온전한 세포는 파열된 세포보다 면역화된 동물에 의해 항원이 더 잘 검출되게 할 수 있다. 변성 또는 거친 보조제, 예를 들어, 프로인트 보조제(Freud's adjuvant)의 사용은 세포를 파열시킬 수도 있으며 그러므로 권장되지 않는다. 면역원은 주기적인 간격으로, 예컨대 격주로, 또는 매주 여러 번 투여될 수도 있거나, 또는 동물에서 (예를 들어, 조직 재조합체에서) 생존력을 유지하는 방법으로 투여될 수도 있다. 대안으로, 기존의 단클론성 항체 및 원하는 병원성 에피토프에 대하여 면역특이적인 임의의 다른 동등한 항체가 서열분석되어 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체가 서열분석된 다음 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝된다. 관심있는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에서 유지될 수 있으며 그 다음에 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 확장되어 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체의 친화도, 또는 다른 특징을 개선하기 위해 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 및 사중특이적) 분자뿐 아니라 친화도 최적화된 키메라 항체, 인간화된 항체 및/또는 개화된 (caninized) 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 인간화하는 데 있어 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 한편, 항체의 비-인간 나머지를 인간 항체 서열로 바꿔치기하는 것을 포함한다.
천연 항체 (예컨대 IgG 항체)는 두 중쇄와 복합체를 형성한 두 경쇄로 구성된다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 함유한다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인 (VH), 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3), 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 함유한다. 천연 발생 면역글로불린 (예컨대 IgG)의 기본적인 구조 단위는 그러므로 두 경쇄 및 두 중쇄를 가진 테트라머이고, 보통 약 150,000 Da의 당단백질로서 표시된다. 각 사슬의 아미노-말단 ("N-말단") 부분은 주로 항원 인식에 기여하는 약 100 내지 110 또는 그 이사으이 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 ("C-말단") 부분은 불변 영역을 규정하는데, 경쇄는 하나의 단일 불변 도메인을 가지고 중쇄는 보통 3개의 불변 도메인 및 힌지 도메인을 가진다. 그러므로, IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고 IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다 (H는 힌지 도메인이고, n 및 c는 각각 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단을 나타낸다). IgG 분자의 가변 도메인은 에피토프와 접촉하는 잔기를 함유하는 상보성 결정 영역 (CDR), 및 그런 접촉을 허용하기 위해 일반적으로 CDR 루프의 구조를 유지하고 위치를 결정하는, 프레임워크 분절 (FR)로 언급되는 비-CDR 분절로 구성된다 (비록 특정 프레임워크 잔기가 또한 항원과 접촉할 수 있긴 하다). 그러므로, VL 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가진다. 항체 경쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDR L 1 도메인, CDR L 2 도메인 및 CDR L 3 도메인으로 표시된다. 유사하게, 항체 중쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDR H 1 도메인, CDR H 2 도메인 및 CDR H 3 도메인으로 표시된다. 그러므로, 용어 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, CDRL3 도메인, CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 단백질 안으로 통합될 때 단백질이 RMJS 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체이거나 디아바디이거나 또는 단일-사슬 결합 분자 (예컨대 scFv, BiTe, 등)거나, 또는 다른 유형의 단백질이거나에 관계없이 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 되는 것을 유발하는 폴리펩타이드에 향해 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "에피토프-결합 단편"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편을 의미하고, 용어 "에피토프-결합 부위"는 에피토프 결합에 기여하는 에피토프-결합 단편을 포함하는 분자의 그 부분을 나타낸다. 에피토프-결합 부위는 그런 항체의 CDR 도메인을 1, 2, 3, 4, 5 또는 전부 6개 함유할 수 있고, 그런 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있긴 하지만, 그런 항체와 상이한 그런 에피토프를 향한 면역특이성, 친화성 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 그러나, 바람직하게, 에피토프-결합 단편은 그런 항체의 6개의 모든 CDR 도메인을 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬 (예컨대 scFv)이거나, 각각 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가지는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다 (예컨대 디아바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 등).
발명은 특히 본 발명의 항-PD-1 항체들의 단일-사슬 가변 도메인 단편 ("scFv") 및 그것을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 포함한다. 단일-사슬 가변 도메인 단편은 짧은 연결 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인을 연결함으로써 만들어진다. Bird 등 (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426)은 한 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 가변 도메인의 아미노 말단 사이의 대략 3.5 nm를 연결하는 결합 펩타이드의 예를 기술한다. 다른 서열의 링커들이 디자인되고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커는 계속해서 추가적인 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 사슬 변종은 재조합으로 또는 합성으로 제조될 수 있다. scFv의 합성에 의한 제조를 위해서, 자동화 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합적 제조를 위해서는, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵세포, 예컨대 효모, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포, 또는 원핵세포, 예컨대 대장균(E. coli)으로 도입될 수 있다. 관심있는 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과로 생긴 scFv는 업계에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 분리될 수 있다.
발명은 또한 특히 발명의 항-PD-1 항체의 인간화된 변종 및 그것을 포함한 다중특이적 결합 분자를 포함한다. 용어 "인간화된" 항체는 일반적으로 재조합 기법을 사용하여 제조되는, 비-인간 종으로부터의 면역글로불린의 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가진 키메라 분자를 나타낸다. 본 발명의 항-인간 PD-1 항체는 항체 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 인간화된, 키메라 또는 개화된 변종을 포함한다. 그런 항체들의 가변 도메인의 폴리뉴클레오타이드 서열은 그런 유도체를 생성하고 그런 항체들의 친화성 또는 다른 특징을 개선하기 위하여 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 인간화하는데 있어서 일반적인 원칙은 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 한편, 항체의 비-인간 나머지를 인간 항체 서열과 바꾸는 것을 포함한다. 단클론성 항체를 인간화하는데에는 일반적으로 네 개의 단계가 있다. 이것들은 다음과 같다: (1) 시작 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예상된 아미노산 서열을 결정하는 단계 (2) 인간화된 항체 또는 개화된 항체를 디자인하는 단계, 즉, 인간화 또는 개화 공정 중에 어떤 항체 프레임워크 영역을 사용할지를 결정하는 단계 (3) 실제 인간화 또는 개화 방법론/기법 및 (4) 인간화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.
항원-결합 부위는 불변 도메인에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 적절한 프레임워크 영역에 이식된 그런 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 인간 개체에서 면역원으로서 불변 영역을 제거하지만 외래 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 남아있다 (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 다른 접근법은 인간-유래 불변 영역를 제공하는 것뿐만 아니라, 가능한 인간 형태에 가깝도록 가변 영역을 재형상화하기 위해 가변 도메인을 변형시키는 것에도 초점을 맞추고 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 주어진 종에서 상대적으로 보존되어 있고 추정상 CDR에 대한 스캐폴딩(scaffolding)을 제공하는 네 개의 프레임워크 영역 (FR)에 의해 플랭킹된, 문제의 항원에 반응하여 달라지고 결합 능력을 결정하는 세 개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한 것으로 알려져 있다. 비-인간 항체가 특정 항원에 대하여 제조될 때, 가변 도메인은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비-인간 항체로부터 유래된 CDR을 이식함으로써 "재형상화" 또는 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 적용은 문헌에서 보고되었다: Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping HumanAntibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping HumanAntibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "HumanizationOf A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped HumanAntibodies With HIV-Neutralizing Activity," HumanAntibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A HumanMonoclonal Antibody To Inhibit HumanRespiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "HumanizationOf An Anti-p185her2 Antibody For HumanCancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And HumanizedAntibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열 (예를 들어, 마우스 항체의 6개의 CDR 모두를 함유한 인간화된 마우스 항체)을 보존하고 있다. 다른 구체예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체와 비교하여 서열이 상이한 하나 이상의 CDR (하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개)을 갖는다.
설치류 또는 변형된 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인에 융합된 관련 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 많은 "인간화된" 항체 분자가 기술되어 있다 (예를 들어, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies," Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-AssociatedAntigen," J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) "Tumor-SpecificGenetically Engineered Murine/HumanChimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583 참조). 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간 지지 프레임워크 영역 (FR)으로 이식된 설치류 CDR을 기술한다 (예를 들어, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping HumanAntibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping HumanAntibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A HumanAntibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525 참조). 또 다른 참고문헌은 재조합으로 덧붙여진 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치류 CDR을 기술한다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 번호 519,596 참조. 이 "인간화된" 분자들은 인간 수령체에서 상기 모이어티의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한하는, 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 디자인된다. 이용될 수 있는 다른 항체 인간화 방법은 Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins," Nucl.Acids Res. 19:2471-2476 및 미국 특허 번호 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에서 개시된다.
II. Fcγ 수용체 (FcγR)
두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인은 그것에 한정되는 것은 아니지만, Fc 감마 수용체 (FcγR)를 포함하여, 세포의 Fc 수용체에 의해 인식된 도메인인 Fc 영역을 형성하기 위해 상호작용한다. 본원에서 사용되는, 용어 "Fc 영역"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 예시의 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:1)이다:
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
Kabat에 기재된 대로 EU 색인에 의해 넘버링되며, 여기에서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
예시의 인간 IgG2의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:2)이다:
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
Kabat에 기재된 대로 EU 색인에 의해 넘버링되며, 여기에서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
예시의 인간 IgG3의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:3)이다:
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPG X
Kabat에 기재된 대로 EU 색인에 의해 넘버링되며, 여기에서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
예시의 인간 IgG4의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:4)이다:
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLG X
Kabat에 기재된 대로 EU 색인에 의해 넘버링되며, 여기에서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
본 명세서 전반에 걸쳐, IgG 중쇄의 불변 영역에서 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, NH1, MD (1991)에 따르는 EU 색인의 것이며 ("Kabat"), 본원에 참조로 포함된다. 용어 "Kabat에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링을 말한다. 면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로부터의 아미노산은 사슬 내 아미노산의 위치에 의해 지정된다. Kabat은 항체에 대한 수많은 아미노산 서열을 기술하고, 각 하위그룹에 대한 아미노산 일치 서열을 확인하며, 잔기 번호를 각 아미노산에 배정하고, CDR은 Kabat에 의해 규정된 대로 확인된다 (Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) "Canonical structures for the hyper가변 regions of immunoglobulins,". J. Mol. Biol. 196:901-917)에 의해 규정된 CDRH1은 5개의 잔기만큼 먼저 시작되는 것이 인지될 것이다). Kabat 넘버링 전략은 보존된 아미노산을 참조하여 Kabat의 일치 서열 중 하나와 문제의 항체를 배열함으로써 Kabat의 목록에 포함되지 않은 항체로 확장 가능하다. 잔기 번호를 배정하기 위한 이 방법은 분야의 표준이 되었고 키메라 또는 인간화된 변종을 포함하여 상이한 항체들의 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 식별한다. 예를 들어, 인간 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산과 동등한 위치를 차지한다.
항체 불변 영역 내 많은 상이한 위치 (예를 들어, Kabat에 기재된 EU 색인에 의해 넘버링된 바와 같이, 제한되는 것은 아니지만, 위치 192, 193 및 214를 포함하는 CH1 위치; 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358를 포함하는 Fc 위치)에서 다형성이 관찰되었으며, 따라서 제공된 서열과 선행 기술의 서열 사이에는 약간의 차이가 존재할 수 있다. 인간 면역글로불린의 다형성 형태는 잘 특성화되어 있다. 현재는, 18개의 Gm 알로타입(allotype)이 공지되어 있다: G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., "The HumanIgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, FunctionAnd Regulation." Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum.Genet.: 50, 199-211). 구체적으로 본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 알로타입, 아이소알로타입, 또는 하플로타입(haplotype)을 포함할 수 있고, 본원에서 제공된 서열의 알로타입, 아이소알로타입 또는 하플로타입에 제한되는 것은 아닌 것으로 생각된다. 게다가, 일부 발현 시스템에서 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기 (상기 볼드체)는 번역 후에 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 발명의 PD-1-결합 분자에서 임의의 아미노산 잔기이다. 구체적으로 CH3 도메인의 C-말단 잔기가 없는 PD-1-결합 분자가 본 발명에 포함된다. 또한 CH3 도메인의 C-말단 리신 잔기를 포함하는 이러한 구성물이 본 발명에 구체적으로 포함된다.
활성화 및 억제 신호는 세포의 Fc 감마 수용체 (FcγR)로의 Fc 영역의 결찰을 통해 변환된다. 정반대의 기능을 초래하는 이러한 결찰의 능력은 상이한 FcγR들 중에서도 구조적 차이로부터 발생한다. 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)라고 불리는, 수용체의 세포질 신호 전달 도메인 내 두 개의 별개의 도메인은 상이한 반응을 설명한다. 이 구성물들에 대한 상이한 세포질 효소의 충원은 FcγR-매개 세포 반응의 결과를 나타낸다. ITAM-함유 FcγR 복합체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA를 포함하는 반면에, ITIM-함유 복합체는 FcγRIIB만을 포함한다. 인간 호중구는 FcγRIIA 유전자를 발현한다. 면역 복합체 또는 특이적 항체 교차결합을 통한 FcγRIIA 군집화(clustering)는 ITAM 인산화를 용이하게 하는 수용체-관련 키나제와 함께 ITAM을 응집시키는 역할을 한다. ITAM 인산화는 Syk 키나제에 대한 도킹(docking) 부위로서 작용하며, 이것의 활성화는 하류 기질 (예컨대, PI3K)의 활성화를 초래한다. 세포 활성화는 전염증성 매개자의 방출로 이어진다. FcγRIIB 유전자는 B 림프구에서 발현되며; 그것의 세포외 도메인은 FcγRIIA와 96% 동일하고 구별 불가능한 방식으로 IgG 복합체에 결합한다. FcγRIIB의 세포질 도메인에서 ITIM의 존재는 FcγR의 이런 억제 하위클래스를 한정한다. 최근에 이 억제의 분자적 기초가 확립되었다. FcγR의 활성화와 함께 동시-결찰될 때, FcγRIIB의 ITIM은 인산화되어 이노시톨 폴리포스페이트 5'-포스파타제의 SH2 도메인 (SHIP)을 끌어들이며, 이것은 ITAM-함유 FcγR-매개 티로신 키나제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저(messenger)를 가수분해하여, 그 결과 세포 내 Ca++의 유입을 방지한다. 그로써 FcγRIIB의 교차-결합은 FcγR 결찰에 대한 활성화 반응을 약화시키고 세포 반응성을 억제한다. 그로써 B-세포 활성화, B-세포 증식 및 항체 분비가 무산된다.
III. 이중특이적 항체, 다중특이적 디아바디 및 DART® 디아바디
항체가 항원의 에피토프에 결합하는 능력은 항체의 VL 및 VH 도메인의 존재 및 아미노산 서열에 좌우된다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용 및, 특히 그것의 VL과 VH 도메인의 상호작용은 천연 항체의 두 에피토프-결합 부위들 중 하나를 형성한다. 천연 항체들은 단지 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉 그것들은 단일 특이적이지만), 그것들은 그 종의 다중 복사물에 결합할 수 있다 (즉 이가 또는 다가를 나타냄).
본 발명의 결합 도메인은 "면역특이적" 방식으로 에피토프에 결합한다. 본원에서 사용되는 바, 항체, 디아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는 만약 그것이 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 기간으로 및/또는 더 큰 친화성으로 대안 에피토프에 관하여 그 에피토프와 반응하거나 회합한다면 또 다른 분자 (즉 에피토프)의 영역에 "면역특이적으로" 결합한다고 말할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 그것이 다른 바이러스 에피토프 또는 비-바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합한 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 빠르게 및/또는 더 큰 기간 동안 이 바이러스 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한 이 정의를 판독함으로써, 예를 들어, 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 인지된다. 그로써, "면역특이적 결합"은 반드시 (비록 그것이 포함할 수 있긴 하지만) 독점적인 결합을 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 그러나 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 "특이적" 결합을 의미한다. 두 분자는 만약 그런 결합이 그것들의 각각의 리간드에 결합하는 수용체와의 특이성을 나타낸다면, 서로 "물성특이적" 방식으로 결합할 수 있다고 말할 수 있다.
항체의 기능성은 두 개의 분리된 별개의 항원 (또는 동일한 항원의 상이한 에피토프)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항체-기반 분자를 생성함으로써 및/또는 동일한 에피토프 및/또는 항원에 대하여 더 높은 원자가 (즉, 두 개 이상의 결합 부위)를 가진 항체-기반 분자를 생성함으로써 향상될 수 있다.
천연 항체보다 더 큰 능력을 가진 분자를 제공하기 위해서, 매우 다양한 재조합 이중특이적 항체 포맷이 개발되었으며 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), 이것들 대부분은 추가의 에피토프-결합 단편 (예컨대, scFv, VL, VH, 등)을 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)에, 또는 그 안에 융합시키거나 다수의 에피토프-결합 단편 (예컨대, 두 개의 Fab 단편 또는 scFv)을 융합시키기 위해 링커 펩타이드를 사용한다. 대안의 포맷은 에피토프-결합 단편 (예컨대, scFv, VL, VH, 등)을 다이머화 도메인, 예컨대 CH2-CH3 도메인 또는 대안의 폴리펩타이드에 융합시키기 위해 링커 펩타이드를 사용한다 (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). 전형적으로, 이러한 접근법은 타협 및 절충을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/136172는 링커의 사용이 치료 설정에서 문제를 유발할 수 있으며, CL 및 CH1 도메인이 각각의 천연 위치로부터 스위치되고 VL 및 VH 도메인이 다양화되어 (WO 2008/027236; WO 2010/108127) 그것들을 하나 이상의 항원에 결합시키는 삼중특이적 항체를 교시한다는 것을 개시한다. 그러므로, 이 문서들에서 개시된 분자는 결합 특이성을 추가적인 항원 종에 결합하는 능력으로 교환한다. PCT 공개 번호 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903은 결합 도메인을 포함한 융합 단백질 부가물을 함유하도록 CH2 도메인을 변형시키는 것을 개시한다. 문서는 CH2 도메인이 이펙터 기능을 매개하는데 있어서 최소한의 역할만을 할 가능성이 크다는 것에 주목하고 있다. PCT 공개 번호 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795는 3가 결합 분자를 형성하기 위해 Fc 영역이 추가적인 VL 및 VH 도메인으로 대체된 재조합 항체를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2003/025018 및 WO2003012069는 개별적인 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2013/006544는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성된 다음 헤테로다이머 구조를 얻기 위해 단백질 가수분해된 다가 Fab 분자를 개시한다. 그러므로, 이 문서들에서 개시된 분자는 이펙터 기능을 매개하는 능력의 전부 또는 일부를 추가적인 항원 종에 결합하는 능력으로 교환하였다. PCT 공개 번호 WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493은 추가적인 결합 도메인 또는 작용기를 항체 또는 항체 일부에 추가하는 것 (예를 들어, 디아바디를 항체의 경쇄에 추가하는 것, 또는 추가적인 VL 및 VH 도메인을 항체의 경쇄 및 중쇄에 추가하는것, 또는 이종기원 융합 단백질을 추가하거나 또는 다수의 Fab 도메인을 서로 연결하는 것)을 개시한다. 그러므로, 이 문서들에서 개시된 분자는 천연 항체 구조체를 추가적인 항원 종에 결합하는 능력으로 교환하다.
업계에서는 추가적으로 둘 이상의 상이한 에피토프 종에 결합할 수 있다는 점에서 (즉, 2가 또는 다가에 더하여 이중특이성 또는 다중특이성을 나타냄) 이러한 천연 항체와 상이한 디아바디를 생성하는 능력에 주목하였다 (예컨대 Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Viable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
디아바디의 디자인은 단일-사슬 가변 도메인 단편 (scFv)으로서 공지된 항체 유도체를 기반으로 한다. 이러한 분자는 짧은 결합 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인을 결합시킴으로써 제조된다. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426)는 한 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 가변 도메인의 아미노 말단 사이에서 대략 3.5 nm의 다리를 만드는 결합 펩타이드의 실례를 기술한다. 다른 서열의 링커들이 디자인되었고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커는 추가적인 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 차례로 변형될 수 있다. 단일 사슬 변종은 재조합으로 또는 합성으로 제조될 수 있다. scFv의 합성에 의한 제조를 위해서, 자동화 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해서는, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵세포, 예컨대 효모, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포, 또는 원핵세포, 예컨대 대장균으로 도입될 수 있다. 관심있는 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과로 생긴 scFv는 업계에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 분리될 수 있다.
비-단일특이적 디아바디의 제공은, 제한되는 것은 아니지만, 상이한 에피토프를 발현하는 세포를 동시-결찰 및 동시-국소화하는 능력을 포함하여, 항체들에 대하여 상당한 이점을 제공한다. 그러므로 이중특이적 디아바디는 치료법 및 면역진단을 포함한 광범위한 용도를 갖는다. 이중특이성은 다양한 용도에서 디아바디의 디자인 및 엔지니어링에 큰 유연성을 허용하여, 멀티머 항원에 대한 향상된 결합력, 상이한 항원의 교차-결합, 및 두 표적 항원의 존재에 따라 특이적 세포 유형에 대한 직접적 표적화를 제공한다. 증가된 원자가, 낮은 해리율 및 순환으로부터 빠른 클리어런스 (작은 크기, ~50 kDa 또는 그 이하의 디아바디에 대하여)로 인해, 업계에 공지된 디아바디 분자는 또한 종양 이미지화 분야에서 특별한 용도를 나타냈다 (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221).
디아바디의 이중특이성은 상이한 세포들의 공동-결찰, 예를 들어, 종양 세포에 대한 세포독성 T 세포의 교차-결합에서의 사용으로 이어졌다 (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). 대안으로, 또는 추가적으로, 이중특이적 디아바디는 상이한 세포들의 표면 상에서 또는 단일 세포에서 수용체를 공동-결찰하는데 사용될 수 있다. 다른 세포들 및/또는 수용체의 공동-결찰은 조절 이펙터 기능 및/또는 면역 세포 신호 전달에 유용하다. 에피토프-결합 부위를 포함하는 다중특이적 분자 (예컨대, 이중특이적 디아바디)는 임의의 면역 세포의 표면 결정요인, 예컨대 B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1BB), CD137L (4-1BBL), CD226, CTLA-4 (CD152), 갈렉틴-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), 킬러 활성화 수용체 (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258), MHC 클래스 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PD-L2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2) 및/또는 VISTA (PD-1H)에 대해 지시될 수 있으며, 이것들은 T 림프구, 자연 살해 (NK) 세포, 항원 제공 세포 또는 다른 단핵 세포 상에서 발현된다. 특히, 면역 체크포인트 (또는 그것의 리간드)를 조절하는데 관여하는 세포 표면 수용체에 대해 지시된 에피토프-결합 부위는 대상체에서 면역 체크포인트 분자의 억제 신호 전달에 반대로 작용하거나 이것을 차단함으로써 면역 반응을 자극하거나, 상향조절하거나 또는 향상시키는 이중특이적 또는 다중특이적 결합 분자의 생성에 유용하다. 면역 체크포인트를 조절하는데 관여하는 분자는 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, 갈렉틴-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC 클래스 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 및/또는 VISTA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
그러나, 상기 이점은 상당한 비용이 든다. 이러한 비-단일특이적 디아바디의 형성은 둘 이상의 별개의 상이한 폴리펩타이드의 성공적인 조립을 필요로 한다 (즉, 이러한 형성은 디아바디가 상이한 폴리펩타이드 사슬 종의 헤테로다이머화를 통해 형성되는 것을 필요로 한다). 이 사실은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모다이머화를 통해 형성되는 단일특이적 디아바디와는 대조적이다. 비-단일특이적 디아바디를 형성하기 위해서는 적어도 두 개의 같지 않은 폴리펩타이드 (즉, 두 개의 폴리펩타이드 종)가 제공되어야 하기 때문에, 그리고 이러한 폴리펩타이드의 호모다이머화가 비활성 분자로 이어지기 때문에 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 이러한 폴리펩타이드의 생성은 동일한 종의 폴리펩타이드 간의 공유 결합을 방지하기 위한 방식으로 (즉, 호모다이머화를 방지하기 위해) 달성되어야 한다 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 그러므로 업계에서는 이러한 폴리펩타이드의 비-공유 회합을 교시하였다 (예컨대 Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
그러나, 업계에서는 비-공유 회합된 폴리펩타이드로 구성된 이중특이적 디아바디가 불안정하고 비-기능적 모노머로 쉽게 회합된다는 것을 인식하였다 (예컨대, Lu,D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
이 도전에 직면하여, 업계에서는 DART® ( D ual A ffinity R e- T argeting Reagent; 이중친화성 재표적화 시약) 디아바디라고 불리는 안정하고, 공유 결합된 헤테로다이머 비-단일특이적 디아바디를 개발하는데 성공하였다; 예컨대, 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; 및 Sloan, D.D. et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells," PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) "Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform," Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates," Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449 참조). 이러한 디아바디는 공유 결합으로 복합체가 형성된 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하고, 이황화 결합이 형성되는 것을 허용하여 그로써 두 폴리펩타이드 사슬을 공유 결합시키는 사용된 폴리펩타이드 종의 각각으로 하나 이상의 시스테인 잔기를 엔지니어링하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 구성물의 C-말단에의 시스테인 잔기의 추가는 폴리펩타이드 사슬 간의 이황화 결합을 허용하여, 2가 분자의 결합 특징을 간섭하지 않으면서 결과로 생긴 헤테로다이머를 안정화시키는 것으로 나타났다.
가장 단순한 이중특이적 DART® 디아바디의 두 폴리펩타이드 각각은 세 개의 도메인을 포함한다. 제1 폴리펩타이드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인, (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인, 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 디아바디의 제2 폴리펩타이드와의 헤테로다이머화를 촉진하여 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드를 서로 공유 결합시키는 역할을 하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인, (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인, 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화를 촉진하기 위해 제1 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인과 복합체를 형성하는 상보적 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 함유한다. 제2 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬에 대한 제2 폴리펩타이드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 역할을 한다. 이러한 분자는 안정하고, 강력하며 둘 이상의 항원에 동시에 결합하는 능력을 갖는다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드의 제3 도메인은 각각 시스테인 잔기를 함유하며, 이것은 이황화 결합을 통해 폴리펩타이드에 함께 결합하는 역할을 한다. 도 1은 이러한 디아바디의 개략도를 제공하는데, 이것은 공유 결합을 위해 E-코일/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인 및 시스테인 함유 링커를 이용한다. 도 2 및 도 3A 내지 3C에서 제공된 바와 같이, 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다는 추가적으로 CH2-CH3 도메인의 서열을 가질 수 있어서, 두 개의 디아바디 폴리펩타이드 간의 복합체 형성은 세포 (예컨대 B 림프구, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합 가능한 Fc 영역을 형성한다. 하기 더 상세히 제공된 바와 같이, 이러한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없으며, 유리하게는 두 개의 폴리펩타이드 사슬 간의 복합체 형성을 촉진하도록 변형된다.
이러한 분자의 많은 변화가 기술되었다 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053 및 2009/0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 이 Fc 영역-함유 DART® 디아바디들은 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 제1 폴리펩타이드 사슬은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인, (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인, (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)를 함유하고 디아바디의 제2 폴리펩타이드와의 헤테로다이머화를 촉진하여 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드를 서로 공유 결합시키는 역할을 하는 제3 도메인, 및 (iv) CH2-CH3 도메인을 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로) (i) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL2)의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인, (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH1)의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인, 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화를 촉진하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 함유한다. 본원에서, 두 개의 제1 폴리펩타이드는 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 복합체를 형성한다. 도 3A 내지 3C는 상이한 헤테로다이머-촉진 도메인을 이용하는 이러한 디아바디의 세 가지 변화의 개략도를 제공한다.
다른 Fc-영역-함유 DART® 디아바디는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 DART® 디아바디의 제1 폴리펩타이드는 세 개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열 함유 도메인. 이러한 DART® 디아바디의 제2 폴리펩타이드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 DART® 디아바디의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 그러므로, 이러한 DART® 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 이러한 더 복잡한 DART® 분자는 또한 공유 결합된 복합체를 형성하는 기능을 하는 시스테인-함유 도메인을 가지고 있다. 그러므로, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 각각의 제3 도메인에서 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 이황화 결합을 통해 안정화되는 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 복합체를 형성한다. 도 4A 내지 4B는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이러한 디아바디의 개략도를 제공한다.
또 다른 Fc-영역-함유 DART® 디아바디는 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있으며, 이것들은 최대 세 개의 상이한 면역글로불린 (VL1/VH1, VL2/VH2 및 VL3/VH3으로 언급됨)의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인으로부터의 결합 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유할 수 있다. 이러한 디아바디의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL1-함유 도메인, 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유할 수 있다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인, (iv) VL2-함유 도메인, (v) VH3-함유 도메인 및 (vi) 제3 사슬과 제4 사슬의 다이머화를 촉진하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유할 수 있다. 이러한 디아바디의 제4 폴리펩타이드는 (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유할 수 있다. 본원에서, 제1 및 제3 폴리펩타이드는 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 복합체를 형성한다. 이러한 더 복잡한 DART® 분자는 또한 공유 결합된 복합체를 형성하는 기능을 하는 시스테인-함유 도메인을 가지고 있어서, 각각의 폴리펩타이드 사슬은 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 적어도 하나의 추가 폴리펩타이드 사슬에 결합된다. 바람직하게는, 이러한 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로 정렬된다. 도 5는 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이러한 디아바디의 개략도를 제공한다.
4가 분자가 바람직하지만 Fc는 필요하지 않은 대안의 구성물이 업계에 공지되어 있는데, "TandAb"로도 불리는 4가 탠덤(tandem) 항체를 포함하고, 이에 한정되는 것은 아니며 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667, 2013-0189263; 유럽 특허 공개 번호 EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 및 EP 1293514; PCT 공개 번호 WO 1999/057150, WO 2003/025018, 및 WO 2013/013700 참조), 이것들은 각각 VH1, VL2, VH2, 및 VL2 도메인을 가지고 있는 두 개의 동일한 사슬의 호모다이머화에 의해 형성된다.
최근에, 두 개의 디아바디-형 결합 도메인 및 하나의 비-디아바디-형 도메인 및 Fc 영역을 통합하는 3가 구조가 기술되었다 (예컨대 2015년 5월 29일에 출원된 "Tri-Specific Binding Molecules and Methods of Use Thereof"라는 제목의 PCT 출원 번호 PCT/US15/33076; 및 2015년 5월 29일에 출원된 "Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to MultipleCancer Antigens and Methods of Use Thereof"라는 제목의 PCT/US15/33081 참조). 이러한 3가 분자는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적 분자를 생성하는데 이용될 수도 있다. 도 6A 내지 6F는 3 또는 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이러한 3가 분자의 개략도를 제공한다.
IV. 본 발명의 항-인간 PD-1-결합 분자
본 발명의 바람직한 PD-1-결합 분자는 항체, 디아바디, BiTE, 등을 포함하고 인간 PD-1 (CD279)의 연속적 또는 불연속적 (예를 들어, 형태적) 부분 (에피토프)에 결합할 수 있다. 본 발명의 PD-1-결합 분자는 바람직하게는 하나 이상의 비-인간 종, 특히, 영장류 종 (특히 영장류 종, 예컨대 시노몰구스 원숭이)의 PD-1 분자에 결합하는 능력을 또한 나타낼 것이다. 대표적인 인간 PD-1 폴리펩타이드 (NCBI 서열 NP_005009.2; 20개의 아미노산 잔기 신호 서열 (밑줄로 표시됨) 및 268개의 아미노산 잔기 성숙 단백질 포함)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:68)을 갖는다:
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL.
특정 구체예에서 본 발명의 항-인간 PD-1-결합 분자는 다음 기준들 중 어느 것 (하나 이상)을 특징으로 한다:
(1) 자극된 인간 T-세포의 표면 상에서 내인성으로 발현된 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(2) 40 nM 이하의 평형 결합 상수 (KD)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(3) 0.5 nM 이하의 평형 결합 상수 (KD)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(4) 1.5 x 104 M-1min-1 이상의 온 속도(on rate)(ka)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(5) 90.0 x 104 M-1min-1 이상의 온 속도(ka)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(6) 7 x 10-4 min-1 이하의 오프 속도(off rate)(kd)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(7) 2 x 10-4 min-1 이하의 오프 속도(kd)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다;
(8) 비-인간 영장류 PD-1 (예컨대 시노몰구스 원숭이의 PD-1)에 특이적으로 결합한다;
(9) PD-1 리간드 (PD-L1/PD-L2)의 PD-1에 대한 결합/억제 활성을 억제한다 (즉 차단하거나 간섭한다);
(10) 면역 반응을 자극한다; 및/또는
(11) 항-인간 LAG-3 항체와 상승작용을 하여 항원 특이적 T-세포 반응을 자극한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항원 특이적 T-세포 반응"은 그것에 대해 T-세포가 특이적인 항원으로 T-세포를 자극함으로써 유발되는 T-세포에 의한 반응을 나타낸다. 항원 특이적 자극시 T-세포에 의한 반응의 비-제한적 예는 증식 및 사이토카인 생성 (예를 들어, TNF-α, IFN-γ 생성)을 포함한다. 항원 특이적 T-세포 반응을 자극하는 분자의 능력은, 예를 들어, 본원에서 기술된 스타필로코쿠스 아우레우스 장독소 B형 항원 ("SEB")-자극된 PBMC 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 항-인간 PD-1-결합 분자는 쥐 항-PD-1 단클론성 항체는 쥐과의항-인간 PD-1 단클론성 항체 "PD-1 mAb 1", "PD-1 mAb 2", "PD-1 mAb 3", "PD-1 mAb 4", "PD-1 mAb 5", "PD-1 mAb 6", "PD-1 mAb 7", "PD-1 mAb 8", "PD-1 mAb 9", "PD-1 mAb 10", "PD-1 mAb 11", "PD-1 mAb 12", "PD-1 mAb 13", "PD-1 mAb 14" 또는 "PD-1 mAb 15"의 VH 및/또는 VL 도메인을 가지고 보다 바람직하게는 이러한 항-인간 PD-1 단클론성 항체들의 VL 도메인의 CDRH 중 1, 2 또는 3개 모두 및/또는 VL 도메인의 CDRL 중 1, 2 또는 3개 모두를 가진다. 이러한 바람직한 항-인간 PD-1-결합 분자는 이중특이적 (또는 다중특이적) 항체, 키메라 또는 인간화된 항체, BiTe, 디아바디, 등, 및 변종 Fc 영역을 가진 이러한 결합 분자를 포함한다.
발명은 특히
(A) (1) PD-1 mAb 1의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 1의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 1의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 1의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(4) hPD-1 mAb 1 VH1의 VH 도메인;
(5) hPD-1 mAb 1 VL1의 VL 도메인;
(6) hPD-1 mAb 1 VL1의 VH 및 VL 도메인;
(B) (1) PD-1 mAb 2의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 2의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 2의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 2의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(4) hPD-1 mAb 2 VH1의 VH 도메인;
(5) hPD-1 mAb 2 VL1의 VL 도메인;
(6) hPD-1 mAb 2 VL1의 VH 및 VL 도메인;
(C) (1) PD-1 mAb 3의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 3의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 3의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 3의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(D) (1) PD-1 mAb 4의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 4의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 4의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 4의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(E) (1) PD-1 mAb 5의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 5의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 5의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 5의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(F) (1) PD-1 mAb 6의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 6의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 6의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 6의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(G) (1) PD-1 mAb 7의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 7의 VL 도메인, 또는 hPD-1 mAb 7 VL2, 또는 hPD-1 mAb 7 VL3의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 7의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1mAb 7의 VL 도메인, 또는 hPD-1 mAb 7 VL2, hPD-1 mAb 7 VL3의 세 개의 CDRLs;
(4) hPD-1 mAb 7 VH1, 또는 hPD-1 mAb 7 VH2의 VH 도메인;
(5) hPD-1 mAb 7 VL1, 또는 hPD-1 mAb 7 VL2, 또는 hPD-1 mAb 7 VL3의 VL 도메인;
(6) hPD-1 mAb 7(1.1), 또는 hPD-1 mAb 7(1.2), 또는 hPD-1 mAb 7(1.3), 또는 hPD-1 mAb 7(2.1), 또는 hPD-1 mAb 7(2.2), 또는 hPD-1 mAb 7(2.3)의 VH 및 VL 도메인;
(H) (1) PD-1 mAb 8의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 8의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 8의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 8의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(I) (1) PD-1 mAb 9의 VH 도메인, 또는 hPD-1 mAb 9 VH2의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 9의 VL 도메인, 또는 hPD-1 mAb 9 VL2의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 9의 VH 도메인, 또는 hPD-1 mAb 9 VH2의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 9의 VL 도메인, 또는 hPD-1 mAb 9 VL2의 세 개의 CDRLs;
(4) hPD-1 mAb 9 VH1 또는 hPD-1 mAb 9 VH2의 VH 도메인;
(5) hPD-1 mAb 9 VL1 또는 hPD-1 mAb 9 VL2의 VL 도메인;
(6) hPD-1 mAb 9(1.1), 또는 hPD-1 mAb 9(1.2), 또는 hPD-1 mAb 9(2.1), 또는 hPD-1 mAb 9(2.2)의 VH 및 VL 도메인;
(J) (1) PD-1 mAb 10의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 10의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 10의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 10의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(K) (1) PD-1 mAb 11의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 11의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 11의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 11의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(L) (1) PD-1 mAb 12의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 12의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 12의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 12의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(M) (1) PD-1 mAb 13의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 13의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 13의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 13의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(N) (1) PD-1 mAb 14의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 14의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 14의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 14의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(O) (1) PD-1 mAb 15의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs;
(2) PD-1 mAb 15의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(3) PD-1 mAb 15의 VH 도메인의 세 개의 CDRHs 및 PD-1 mAb 15의 VL 도메인의 세 개의 CDRLs;
(4) hPD-1 mAb 15 VH1의 VH 도메인;
(5) hPD-1 mAb 15 VL1의 VL 도메인;
(6) hPD-1 mAb 15의 VH 도메인 및 VL 도메인을 가지거나
또는
PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15와 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 이것들과의 결합에 대해 경쟁하는 PD-1 결합 도메인을 포함하는 PD-1-결합 분자에 관한 것이다.
A. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 1
1. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 1
PD-1 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:69)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWN WIRQ FPGNKLEWMG
HITYSGSTSY NPSLKS RISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCAR DY
GSGYPYTLDY WGQGTSVTVS S.
PD-1 mAb 1의 CDRH1 (SEQ ID NO:71): NDYAWN
PD-1 mAb 1의 CDRH2 (SEQ ID NO:72): HITYSGSTSYNPSLKS
PD-1 mAb 1의 CDRH3 (SEQ ID NO:73): DYGSGYPYTLDY
PD-1 mAb 1의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID N0:70이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc
tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaac tg
gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag
cactagctac aacccatctc tcaaa agtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa
ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc
aaga gattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt
caccgtctcc tcc.
PD-1 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:74)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTC SATSIVS YVY WYQQKPG SSPQPWIY LT
SNLAS GVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKLEIK.
PD-1 mAb 1의 CDRL1 (SEQ ID NO:76): SATSIVSYVY
PD-1 mAb 1의 CDRL2 (SEQ ID NO:77): LTSNLAS
PD-1 mAb 1의 CDRL3 (SEQ ID NO:78): QQWSDNPYT
PD-1 mAb 1의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID N0:75이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc
atgacctgc a gtgccacctc aattgtaagt tacgtttac t ggtaccagca gaagcctgga
tcctcccccc aaccctggat ttat ctcaca tccaacctgg cttct ggagt ccctgctcgc
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa
gatgctgcca cttattactg c cagcagtgg agtgataacc cgtacacg tt cggagggggg
accaagctgg aaataaaa.
2. "hPD-1 mAb 1"을 형성하기 위한 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 1의 인간화
상기 기술된 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 1은 인간 수령체에 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 PD-1 항체를 인간화할 수 있는 능력을 입증하기 위하여 항원성 에피토프들이 확인되었을 때 인간화되었고 추가로 탈면역되었다. 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 1 VH1"로 표시된 하나의 인간화된 VH 도메인 및 "hPD-1 mAb 1 VL1"로 표시된 하나의 인간화된 VL 도메인을 유발하였다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인을 포함하는 항체는 "hPD-1 mAb 1"로 언급된다.
hPD-1 mAb 1 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:79)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWN WIRQ PPGKGLEWIG HITYSGSTSY
NPSLKS RLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCAR DY GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS S.
hPD-1 mAb 1 VH1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:80이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg
acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaat tg gattaggcag
cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat
aatcccagtc tgaag agccg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt
ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcga gattat
ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc tcc.
hPD-1 mAb 1 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:81)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITC SATSIVS YVY WYQQKPG QAPQPLIY LT SNLAS GIPAR
FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SDNPYT FGGG TKVEIK.
hPD-1 mAb 1 VH1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:82이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga aaaggtcacc
attacttgc t ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtac t ggtatcagca gaagcccggt
caggctcccc agccattgat atat ctgacc agcaacctgg cttct ggtat cccagctcgt
ttttccggta gcgggtccgg gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa
gacgccgcca cctattattg t caacagtgg tcagacaatc catacact tt tggcggtggc
accaaagtcg aaataaag.
B. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 2
1. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 2
PD-1 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:83)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY
ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LS DYFDY WGQGT TLTVSS.
PD-1 mAb 2의 CDRH1 (SEQ ID NO:85): SFGMH
PD-1 mAb 2의 CDRH2 (SEQ ID NO:86): YISSGSMSISYADTVKG
PD-1 mAb 2의 CDRH3 (SEQ ID NO:87): LSDYFDY
PD-1 mAb 2의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:84이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcac tgggt tcgtcaggct
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgca tac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat
gcagacacag tgaagggc cg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atcc ctgagt
gactactttg actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc.
PD-1 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:88)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK.
PD-1 mAb 2의 CDRL1 (SEQ ID NO:90): RSSQSLVHSTGNTYLH
PD-1 mAb 2의 CDRL2 (SEQ ID NO:91): RVSNRFS
PD-1 mAb 2의 CDRL3 (SEQ ID NO:92): SQTTHVPWT
PD-1 mAb 2의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:89이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgc a gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttacat tgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac agggtttc taaccgattt
tc tggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agtagagtgg aggctgagga tctgggagtt tttttctgc t ctcaaactac acatgttccg
tggacg ttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa.
2. "hPD-1 mAb 2"를 형성하기 위한 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 2의 인간화
상기 기술된 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 2는 인간 수령체에 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 PD-1 항체를 인간화할 수 있는 능력을 입증하기 위하여 항원성 에피토프들이 확인되었을 때 인간화되었고 추가로 탈면역되었다. 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 2 VH1"로 표시된 하나의 인간화된 VH 도메인 및 "hPD-1 mAb 1 VL1"로 표시된 하나의 인간화된 VL 도메인을 유발하였다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인을 포함하는 임의의 항체는 "hPD-1 mAb 2"로 언급된다.
hPD-1 mAb 2 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:93)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSMSISY
ADTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCAS LS DYFDY WGQGT TVTVSS.
hPD-1 mAb 2 VH1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:94이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgcaat tggttgagag tggtggtggc ctggtgcagc caggtggaag tctgcggttg
tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga tgcat tgggt gcgccaggct
cccggcaagg gtctcgagtg ggtagca tac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat
gccgacacag tgaaaggc ag gtttactatc tcccgtgaca atgcaaaaaa cacactgtac
ctgcaaatga atagcctgcg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttcc ctgtct
gattacttcg actac tgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc.
hPD-1 mAb 2 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:95)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISC RSSQSLV HSTGNTYLH W YLQKPGQSPQ LLIY RVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC SQTTHVP WT FGQGTKLE IK.
hPD-1 mAb 2 VL1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:96이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt
atttcttgt c ggagttcaca gagtctggta cattccacag gaaatacata tctccat tgg
tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag ctgctgattt at agagtgtc taatcgattt
tct ggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac actgaaaatc
tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgt a gtcagaccac ccatgtaccc
tggact tttg gccaaggtac taagctggaa atcaag.
C. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 3
PD-1 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:97)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY
NQKFKG KAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTR EK ITTIVEGTYW YFDV WGTGTT VTVSS
PD-1 mAb 3의 CDRH1 (SEQ ID NO:99): DYVMH
PD-1 mAb 3의 CDRH2 (SEQ ID NO:100): TIDPETGGTAYNQKFKG
PD-1 mAb 3의 CDRH3 (SEQ ID NO:101): EKITTIVEGTYWYFDV
PD-1 mAb 3의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:98이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg
tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa tgcac tgggt gaagcagaca
cctgtgcatg gcctggaatg gattgga act attgatcctg aaactggtgg tactgcctac
aatcagaagt tcaagggc aa ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aaga gagaag
attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tc tggggcac agggaccacg
gtcaccgtct cctca.
PD-1 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:102)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGDTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHLP YT FGGGTKLE IK.
PD-1 mAb 3의 CDRL1 (SEQ ID NO:104): RSSQNIVHSNGDTYLE
PD-1 mAb 3의 CDRL2 (SEQ ID NO:105): KVSNRFS
PD-1 mAb 3의 CDRL3 (SEQ ID NO:106): FQGSHLPYT
PD-1 mAb 3의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:103이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgc a gatctagtca gaacattgta catagtaatg gagacaccta tttggaa tgg
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct at aaagtttc caaccgattt
tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgc t ttcaaggttc acatcttccg
tacacg ttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa.
D. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 4
PD-1 mAb 4의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:107)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMH WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSMSISY
ADTVKG RFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCAS LT DYFDY WGQGT TLTVSS.
PD-1 mAb 4의 CDRH1 (SEQ ID NO:109): SFGMH
PD-1 mAb 4의 CDRH2 (SEQ ID NO:110): YISSGSMSISYADTVKG
PD-1 mAb 4의 CDRH3 (SEQ ID NO:111): LTDYFDY
PD-1 mAb 4의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:108이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcac tgggt tcgtcaggct
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgca tat attagtagtg gcagtatgag tatttcctat
gcagacacag tgaagggc cg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atcc ctgact
gactactttg actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca.
PD-1 mAb 4의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSTGNTYFH W YLQKPGQSPK LLIY RVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQTTHVP WT FGGGTKLE IK.
PD-1 mAb 4의 CDRL1 (SEQ ID NO:114): RSSQSLVHSTGNTYFH
PD-1 mAb 4의 CDRL2 (SEQ ID NO:115): RVSNRFS
PD-1 mAb 4의 CDRL3 (SEQ ID NO:116): SQTTHVPWT
PD-1 mAb 4의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:113이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcctgc a gatctagtca gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttccat tgg
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac agggtttc taaccgattt
tct ggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaactac acatgttccg
tggacg ttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa.
E. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 5
PD-1 mAb 5의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:117)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMN WMKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL
NQKFKD KATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGSSPFAY WG QGTLVTVSA.
PD-1 mAb 5의 CDRH1 (SEQ ID NO:119): AYWMN
PD-1 mAb 5의 CDRH2 (SEQ ID NO:120): VIHPSDSETWLNQKFKD
PD-1 mAb 5의 CDRH3 (SEQ ID NO:121): EHYGSSPFAY
PD-1 mAb 5의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:118이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc gcctactgga tgaac tggat gaaacagagg
cctggacaag gccttgagtg gattggc gtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta
aatcagaagt tcaag gacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac
atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaga gagcac
tacggtagta gcccgtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca.
PD-1 mAb 5의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:122)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIY AASNQGS
GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K.
PD-1 mAb 5의 CDRL1 (SEQ ID NO:124): RANESVDNYGMSFMN
PD-1 mAb 5의 CDRL2 (SEQ ID NO:125): AASNQGS
PD-1 mAb 5의 CDRL3 (SEQ ID NO:126): QQSKEVPYT
PD-1 mAb 5의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:123이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc
atctcctgc a gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaac tggttc
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctat g ctgcatccaa ccaaggatcc
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtac
acg ttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa.
F.쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 6
PD-1 mAb 6의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:127)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSDTYY
PDSVKG RFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCAR QK ATTWFAY WGQ GTLVTVST.
PD-1 mAb 6의 CDRH1 (SEQ ID NO:129): SYGMS
PD-1 mAb 6의 CDRH1 (SEQ ID NO:130): TISGGGSDTYYPDSVKG
PD-1 mAb 6의 CDRH1 (SEQ ID NO:131): QKATTWFAY
PD-1 mAb 6의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:128이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact
ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccgcggatct
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat
act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa.
PD-1 mAb 6의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:132)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASESVD NYGISFMN WF QQKPGQPPKL LIY PASNQGS
GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPW T FGGGTKLEI K.
PD-1 mAb 6의 CDRL1 (SEQ ID NO:134): RASESVDNYGISFMN
PD-1 mAb 6의 CDRL2 (SEQ ID NO:135): PASNQGS
PD-1 mAb 6의 CDRL3 (SEQ ID NO:136): QQSKEVPWT
PD-1 mAb 6의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:133이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc
atctcctgc a gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaac tggttc
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctat c ctgcatccaa ccaaggatcc
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat
cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtgg
acg ttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa.
G. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7
1. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7
PD-1 mAb 7의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:137)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMN WVKQR PGQGLEWIG V IHPSDSETWL
DQKFKD KATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS.
PD-1 mAb 7의 CDRH1 (SEQ ID NO:139): SYWMN
PD-1 mAb 7의 CDRH2 (SEQ ID NO:140): VIHPSDSETWLDQKFKD
PD-1 mAb 7의 CDRH3 (SEQ ID NO:141): EHYGTSPFAY
PD-1 mAb 7의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:138이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg
tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaac tgggt gaagcagagg
cctggacaag gccttgagtg gattggc gtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta
gatcagaagt tcaaggac aa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac
atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagg gagcac
tacggtacta gcccgtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt gtcttcc.
PD-1 mAb 6의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:132)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS
GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FC QQSKEVPY T FGGGTKLEI K.
PD-1 mAb 7의 CDRL1 (SEQ ID NO:144): RANESVDNYGMSFMN
PD-1 mAb 7의 CDRL2 (SEQ ID NO:145): AASNQGS
PD-1 mAb 7의 CDRL3 (SEQ ID NO:146): QQSKEVPYT
PD-1 mAb 7의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:143이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc
atctcctgc a gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaac tggttc
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccat g ctgcatccaa ccaaggatcc
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat
cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgt cagc aaagtaagga ggttccgtac
acg ttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa.
2. "hPD-1 mAb 7"을 형성하기 위한 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7의 인간화
상기 기술된 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7은 인간 수령체에 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 PD-1 항체를 인간화할 수 있는 능력을 입증하기 위하여 항원성 에피토프들이 확인되었을 때 인간화되었고 추가로 탈면역되었다. 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 7 VH1" 및 "hPD-1 mAb 7 VH2"로 표시된 두 개의 인간화된 VH 도메인 및 "hPD-1 mAb 7 VL1", "hPD-1 mAb 7 VL2" 및 "hPD-1 mAb 7 VL3"으로 표시된 세 개의 인간화된 VL 도메인을 유발하였다. 인간화된 VL 도메인 중 어느 것이든지 인간화된 VH 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인을 포함하는 임의의 항체는 "hPD-1 mAb 7"로 언급되고, 인간화된 VH/VL 도메인의 특정 조합은 특이적 VH/VL 도메인을 참조로 언급되며, 예를 들면 hPD-1 mAb 7 VH1 및 hPD-1 mAb 1 VL2를 포함하는 인간화된 항체는 "hPD-1 mAb 7(1.2)"로서 특이적으로 언급된다.
hPD-1 mAb 7 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:147)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWIG V IHPSDSETWL
DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS.
PD-1 mAb 7의 VH1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:148이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg
tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaat tgggt gcgtcaagca
ccagggcagg gtctggaatg gattggg gtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg
gaccagaaat ttaaagat cg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac
atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc caga gagcac
tacggcacat caccttttgc atac tggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc.
hPD-1 mAb 7 VH2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:149)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMN WVRQA PGQGLEWAG V IHPSDSETWL
DQKFKD RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR EH YGTSPFAY WG QGTLVTVSS.
PD-1 mAb 7의 VH2를 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:150이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg
tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaat tgggt gcgtcaagca
ccagggcagg gtctggaatg ggctggg gtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg
gaccagaaat ttaaagat cg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac
atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc caga gagcac
tacggcacat caccttttgc atac tggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc.
hPD-1 mAb 7 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:151)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RANESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K.
PD-1 mAb 7의 VL1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:152이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact
ctcagctgc a gagcaaatga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccagggatct
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat
act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa.
hPD-1 mAb 7 VL2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:153)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K.
PD-1 mAb 7의 VL2를 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:154이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact
ctcagctgc a gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccagggatct
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat
act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa.
hPD-1 mAb 7 VL3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:155)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASESVD NYGMSFMN WF QQKPGQPPKL LIH AASNRGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FC QQSKEVPY T FGGGTKVEI K.
PD-1 mAb 7의 VL3을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:156이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact
ctcagctgc a gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaac tggttt
cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccac g ccgcctctaa ccgcggatct
ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc
tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgc cagc aatctaaaga ggtgccctat
act tttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa.
두 hPD-1 mAb 7 VL2 및 hPD-1 mAb 7 VL3의 VL 도메인의 CDRL1은 아스파라긴 대 세린 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: RA S ESVDNYGMSFMN ((SEQ ID NO:157), 치환된 세린은 밑줄로 표시됨)을 가진다. 유사한 치환이 상기 기술된 PD-1 mAb 7 CDRL1 도메인 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
또한, hPD-1 mAb 7 VL3의 VL 도메인의 CDRL2는 글루타민 대 아르기닌 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: AASNRGS ((SEQ ID NO:158), 치환된 아르기닌은 밑줄로 표시됨)를 가진다. 유사한 치환이 상기 기술된 PD-1 mAb 7 CDRL2 도메인 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
H. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 8
PD-1 mAb 8의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:159)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMN WVKQN HGKSLEWIG D INPKNGDTHY
NQKFKG EATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAS DF DY WGQGTTLT VSS.
PD-1 mAb 8의 CDRH1 (SEQ ID NO:161): DYYMN
PD-1 mAb 8의 CDRH2 (SEQ ID NO:162): DINPKNGDTHYNQKFKG
PD-1 mAb 8의 CDRH3 (SEQ ID NO:163): DFDY
PD-1 mAb 8의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:160이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaac tgggt gaagcagaac
catggaaaga gccttgagtg gattgga gat attaatccta aaaatggtga cactcactac
aaccagaagt tcaagggc ga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagc gatttt
gactac tggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc.
PD-1 mAb 8의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:164)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPLS LPVGLGDQAS ISC RSSQTLV YSNGNTYLN W FLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP FT FGSGTKLE IK.
PD-1 mAb 8의 CDRL1 (SEQ ID NO:166): RSSQTLVYSNGNTYLN
PD-1 mAb 8의 CDRL2 (SEQ ID NO:167): KVSNRFS
PD-1 mAb 8의 CDRL3 (SEQ ID NO:168): SQSTHVPFT
PD-1 mAb 8의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:165이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgc a gatctagtca gacccttgta tatagtaatg gaaacaccta tttaaat tgg
ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ac aaagtttc caaccgattt
tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgc t ctcaaagtac acatgttcca
ttcacg ttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa.
I. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 9
1. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 9
PD-1 mAb 9의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:169)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGGNTYY
SDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
PD-1 mAb 9의 CDRH1 (SEQ ID NO:171): SYLVS
PD-1 mAb 9의 CDRH2 (SEQ ID NO:172): TISGGGGNTYYSDSVKG
PD-1 mAb 9의 CDRH3 (SEQ ID NO:173): YGFDGAWFAY
PD-1 mAb 9의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:170이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg tgtct tgggt tcgccagact
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat
tcagacagtg tgaagggt cg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac
ctgcaaatca gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagg tatggt
ttcgacggcg cctggtttgc ttac tggggc caagggactc tggtcactgt ctcttcc.
PD-1 mAb 9의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:174)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITC RASENIY SYLA WYQQKQ EKSPQLLVY N AKTLAA GVPS
RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYC QH HYAVPWT FGG GTRLEIT
PD-1 mAb 9의 CDRL1 (SEQ ID NO:176): RASENIYSYLA
PD-1 mAb 9의 CDRL2 (SEQ ID NO:177): NAKTLAA
PD-1 mAb 9의 CDRL3 (SEQ ID NO:178): QHHYAVPWT
PD-1 mAb 9의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:175이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga tattgtcacc
atcacatgt c gagcaagtga gaatatttac agttatttag ca tggtatca gcagaaacag
gaaaaatctc ctcagctcct ggtctat aat gcaaaaacct tggcagca gg tgtgccatca
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct
gaagattttg ggaattatta ctgt cagcat cattatgctg ttccgtggac g ttcggtgga
ggcaccagac tggaaatcac a
2. "hPD-1 mAb 9"를 형성하기 위한 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 9의 인간화
상기 기술된 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 9는 인간 수령체에 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 PD-1 항체를 인간화할 수 있는 능력을 입증하기 위하여 항원성 에피토프들이 확인되었을 때 인간화되었고 추가로 탈면역되었다. 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 9 VH1" 및 "hPD-1 mAb 9 VH2"로 표시된 두 개의 인간화된 VH 도메인 및 "hPD-1 mAb 9 VL1" 및 "hPD-1 mAb 9 VL2"로 표시된 두 개의 인간화된 VL 도메인을 유발하였다. 인간화된 VL 도메인 중 어느 것이든지 인간화된 VH 도메인 중 어느 하나와 쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인을 포함하는 임의의 항체는 "hPD-1 mAb 9"로 언급되고, 인간화된 VH/VL 도메인의 특정 조합은 특이적 VH/VL 도메인을 참조로 언급되며, 예를 들면 hPD-1 mAb 9 VH1 및 hPD-1 mAb 9 VL2를 포함하는 인간화된 항체는 "hPD-1 mAb 9(1.2)"로서 특이적으로 언급된다.
hPD-1 mAb 9 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:179)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVS WVRQA PGKGLEWVA T ISGGGGNTYY
SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 9 VH1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:180이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag tctgaaactg
tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgtct tgggt aagacaagca
cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat
agcgacagtg tcaaggga ag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac
ctccagatga actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgc tatgga
tttgacggcg catggtttgc ctac tgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
hPD-1 mAb 9 VH2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVG WVRQA PGKGLEWTA T ISGGGGNTYY
SDSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCAR YG FDGAWFAY WG QGTLVTVSS
hPD-1 mAb 9 VH2를 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:182이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag tctgaaactg
tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgggc tgggt aagacaagca
cccggaaaag gcttggaatg gacggcc act atctccggtg gaggtggcaa cacctactat
agcgacagtg tcaaggga ag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac
ctccagatga actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgc tatgga
tttgacggcg catggtttgc ctac tgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
hPD-1 mAb 9 VH2의 VH 도메인의 CDRH1은 세린 대 글리신 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: SYLV G ((SEQ ID NO:183), 치환된 글리신은 밑줄로 표시됨)를 가진다. 유사한 치환이 상기 기술된 PD-1 mAb 9 CDRH1 도메인 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
hPD-1 mAb 9 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:184)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY SYLA WYQQKP GKAPKLLIY N AKTLAA GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
hPD-1 mAb 9 VL1을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:185이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc
atcacctgc c gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg cc tggtatca acagaaacct
ggtaaagccc caaaattgct catttac aac gccaagaccc tcgcagct gg cgtgccaagt
aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc
gaggattttg ccacttacta ctgc cagcat cattacgcag tgccctggac c ttcggacaa
ggcactaagc tcgagatcaa a
hPD-1 mAb 9 VL2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASENIY NYLA WYQQKP GKAPKLLIY D AKTLAA GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYAVPWT FGQ GTKLEIK
hPD-1 mAb 9 VL2를 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:187이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc
atcacctgc c gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg cc tggtatca acagaaacct
ggtaaagccc caaaattgct catttac gac gccaagaccc tcgcagct gg cgtgccaagt
aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc
gaggattttg ccacttacta ctgc cagcat cattacgcag tgccctggac c ttcggacaa
ggcactaagc tcgagatcaa a
hPD-1 mAb 9 VL2의 VL 도메인의 CDRL1은 세린 대 아스파라긴 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: RASENIY N YLA (SEQ ID NO:188), 치환된 아스파라긴은 밑줄로 표시됨)를 가진다. 유사한 치환이 상기 기술된 PD-1 mAb 9 CDRL1 도메인 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
hPD-1 mAb 9 VL2의 VL 도메인의 CDRL2는 아스파라긴 대 아스파테이트 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: D AKTLAA ((SEQ ID NO:189), 치환된 아스파테이트는 밑줄로 표시됨)를 가진다. 유사한 치환이 상기 기술된 PD-1 mAb 7 CDRL2 도메인 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
J. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 10
PD-1 mAb 10의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:190)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMS WVRQT PEKRLEWVA S ISGGGSNIYY
PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCAR QE LAFDY WGQGT TLTVSS
PD-1 mAb 10의 CDRH1 (SEQ ID NO:192): NYLMS
PD-1 mAb 10의 CDRH2 (SEQ ID NO:193): SISGGGSNIYYPDSVKG
PD-1 mAb 10의 CDRH3 (SEQ ID NO:194): QELAFDY
PD-1 mAb 10의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:191이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca tgtct tgggt tcgccagact
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgca agt attagtggtg gtggtagtaa tatctactat
ccagacagtg tgaagggt cg attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac
ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaga caagaa
ctggcttttg actac tgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
PD-1 mAb 10의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:195)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RTSQDIS NFLN WYQQKP DGTIKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GSTLPWT FGG GTKLEII
PD-1 mAb 10의 CDRL1 (SEQ ID NO:197): RTSQDISNFLN
PD-1 mAb 10의 CDRL2 (SEQ ID NO:198): YTSRLHS
PD-1 mAb 10의 CDRL3 (SEQ ID NO:199): QQGSTLPWT
PD-1 mAb 10의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:196이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc
atcagttgc a ggacaagtca ggacattagc aattttttaa ac tggtatca gcagaaacca
gatggaacta ttaaactcct gatctac tac acatcaagat tacactca gg agtcccatca
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa
gaagatattg ccacttactt ttgc caacag ggtagtacgc ttccgtggac g ttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcat a
K. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 11
PD-1 mAb 11의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:200)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMH WVKQR PGQGLKWMG A IYPGNSDTHY
NQKFKG KAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTT GT YSYFDV WGTG TTVTVSS
PD-1 mAb 11의 CDRH1 (SEQ ID NO:202): GYWMH
PD-1 mAb 11의 CDRH2 (SEQ ID NO:203): AIYPGNSDTHYNQKFKG
PD-1 mAb 11의 CDRH3 (SEQ ID NO:204): GTYSYFDV
PD-1 mAb 11의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:201이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg
tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga tgcac tgggt aaaacagagg
cctggacagg gtctgaaatg gatgggg gct atttatcctg gaaatagtga tactcactac
aaccagaagt tcaagggc aa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac
atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tact gggacc
tactcgtact tcgatgtc tg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc a
PD-1 mAb 11의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:205)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TSIH WYQHRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS
RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ SNSWLT FGAG TKLELK
PD-1 mAb 11의 CDRL1 (SEQ ID NO:207): RASQSIGTSIH
PD-1 mAb 11의 CDRL2 (SEQ ID NO:208): YASESIS
PD-1 mAb 11의 CDRL3 (SEQ ID NO:209): QQSNSWLT
PD-1 mAb 11의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:206이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt
ttctcctgc a gggccagtca gagcattggc acaagcatac ac tggtatca gcacagaaca
aatggttctc caaggcttct cataaag tat gcttctgagt ctatctct gg gatcccttcc
aggtttagtg gcagtggatc agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct
gaagatattg cagattatta ctgt caacaa agtaatagct ggctcacg tt cggtgctggg
accaagctgg agctgaaa
L. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 12
PD-1 mAb 12의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:210)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMH WVKQT PVHGLEWIG T IDPETGGTAY
NQKFKG KAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSR ER ITTVVEGAYW YFDV WGTGTT VTVSS
PD-1 mAb 12의 CDRH1 (SEQ ID NO:212): DYEMH
PD-1 mAb 12의 CDRH2 (SEQ ID NO:213): TIDPETGGTAYNQKFKG
PD-1 mAb 12의 CDRH3 (SEQ ID NO:214): ERITTVVEGAYWYFDV
PD-1 mAb 12의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:211이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg
tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga tgcac tgggt gaaacagaca
cctgtgcatg gcctggaatg gattggg act attgatcctg aaactggtgg tactgcctac
aatcagaagt tcaagggc aa ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aaga gagagg
attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tc tggggcac agggaccacg
gtcaccgtct cctca
PD-1 mAb 4의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:215)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQNIV HSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIC KVSTRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP YT FGGGTKLE IK
PD-1 mAb 12의 CDRL1 (SEQ ID NO:217): RSSQNIVHSNGNTYLE
PD-1 mAb 12의 CDRL2 (SEQ ID NO:218): KVSTRFS
PD-1 mAb 12의 CDRL3 (SEQ ID NO:219): FQGSHVPYT
PD-1 mAb 12의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:216이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc
atctcttgc a gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaa tgg
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct gc aaagtttc cacccgattt
tct ggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattattgc t ttcaaggttc acatgttccg
tacacg ttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
M. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 13
PD-1 mAb 13의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:220)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMS WVRQT PEKRLEWVA T ISGGGSNIYY
PDSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCAR QA YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS S
PD-1 mAb 13의 CDRH1 (SEQ ID NO:222): SHTMS
PD-1 mAb 13의 CDRH2 (SEQ ID NO:223): TISGGGSNIYYPDSVKG
PD-1 mAb 13의 CDRH3 (SEQ ID NO:224): QAYYGNYWYFDV
PD-1 mAb 13의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:221이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca tgtct tgggt tcgccagact
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgca acc attagtggtg gtggttctaa tatctactat
ccagacagtg tgaagggtcg a ttcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aaga caagct
tactacggta attactggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc
tcc
PD-1 mAb 13의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:225)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS
RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYC QQ LDSIPWT FGG GTKLEIK
PD-1 mAb 13의 CDRL1 (SEQ ID NO:227): LASQTIGTWLA
PD-1 mAb 13의 CDRL2 (SEQ ID NO:228): AATSLAD
PD-1 mAb 13의 CDRL3 (SEQ ID NO:229): QQLDSIPWT
PD-1 mAb 13의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:226이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc
atcacgtgc c tggcaagtca gaccattggt acatggttag ca tggtatca gcagaaacca
gggaaatctc ctcagctcct gatttat gct gcaaccagct tggcagat gg ggtcccatca
aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct
gaagattttg taagttatta ctgt caacaa cttgacagta ttccgtggac g ttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa a
N. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 14
PD-1 mAb 14의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:230)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWIT WVKQR PGQGLQWIG N IYPGTDGTTY
NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCAT GL HWYFDV WGTG TTVTVSS
PD-1 mAb 14의 CDRH1 (SEQ ID NO:232): SYWIT
PD-1 mAb 14의 CDRH2 (SEQ ID NO:233): NIYPGTDGTTYNEKFKS
PD-1 mAb 14의 CDRH3 (SEQ ID NO:234): GLHWYFDV
PD-1 mAb 14의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:231이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg
tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga taacc tgggt gaaacagagg
cctggacaag gccttcagtg gattgga aat atttatcctg gtactgatgg tactacctac
aatgagaagt tcaagagc aa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac
atgcacctca gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aact gggcta
cactggtact tcgatgtc tg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc c
PD-1 mAb 14의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:235)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTC KASQSVG TNVA WYQQKP GQSPKALIY S ASSRFS GVPD
RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFC QQ YNSYPYT FGG GTKLEIK
PD-1 mAb 14의 CDRL1 (SEQ ID NO:237): KASQSVGTNVA
PD-1 mAb 14의 CDRL2 (SEQ ID NO:238): SASSRFS
PD-1 mAb 14의 CDRL3 (SEQ ID NO:239): QQYNSYPYT
PD-1 mAb 14의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:236이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt
gtcacctgc a aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag cc tggtatca acagaagccc
ggtcaatctc ctaaagcact gatttac tcg gcatcctccc gattcagt gg cgtccctgat
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct
gaagacttgg cagagtattt ctgt cagcaa tataacagct atccgtacac g ttcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa a
O. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 15
1. 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 15
PD-1 mAb 15의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:240)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLIS WVRQT PEKRLEWVA A ISGGGADTYY
ADSVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTR RG TYAMDY WGQG TSVTVSS
PD-1 mAb 15의 CDRH1 (SEQ ID NO:242): SYLIS
PD-1 mAb 15의 CDRH2 (SEQ ID NO:243): AISGGGADTYYADSVKG
PD-1 mAb 15의 CDRH3 (SEQ ID NO:244): RGTYAMDY
PD-1 mAb 15의 VH 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:241이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc
tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctct tgggt tcgccagact
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgct gcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat
gccgacagtg tgaagggt cg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aaga cgaggg
acctatgcta tggactac tg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c
PD-1 mAb 15의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:245)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKSPQLLIY A ATSLAD GVPS
RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYC QQ LYSIPWT FGG GTKLEIK
PD-1 mAb 15의 CDRL1 (SEQ ID NO:247): LASQTIGTWLA
PD-1 mAb 15의 CDRL2 (SEQ ID NO:248): AATSLAD
PD-1 mAb 15의 CDRL3 (SEQ ID NO:249): QQLYSIPWT
PD-1 mAb 15의 VL 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:246이다 (CDRL 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc
atcacatgc c tggcaagtca gaccattggt acatggttag ca tggtatca gcagaaacca
gggaaatctc ctcagctcct gatttat gct gcaaccagct tggcagat gg ggtcccatca
aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct
gaagattttg taaattatta ctgt caacaa ctttacagta ttccgtggac g ttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa a
2. "hPD-1 mAb 15"를 형성하기 위한 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 15의 인간화
상기 기술된 쥐과의 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 15는 인간 수령체에 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위하여 항-인간 PD-1 항체를 인간화할 수 있는 능력을 입증하기 위하여 항원성 에피토프들이 확인되었을 때 인간화되었고 추가로 탈면역되었다. 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 2 VH1"로 표시된 한 인간화된 VH 도메인 및 "hPD-1 mAb 1 VL1"로 표시된 한 인간화된 VL 도메인을 유발하였다. 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인을 포함하는 항체는 "hPD-1 mAb 15"로 언급된다.
hPD-1 mAb 15의 VH1 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:250)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLIS WVRQA PGKGLEWVA A ISGGGADTYY
ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCAR RG TYAMDY WGQG TLVTVSS
hPD-1 mAb 15의 VH1 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:251이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg
tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctct tgggt gcgccaagcc
ccaggtaagg gccttgaatg ggtc gccgcc attagtgggg gtggtgccga tacatattat
gccgacagcg tcaaggga cg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac
ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccgg cgcggg
acttacgcta tggactat tg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c
hPD-1 mAb 15의 VL1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:252)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC LASQTIG TWLA WYQQKP GKAPKLLIY A ATSLAD GVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYC QQ LYSIPWT FGQ GTKLEIK
PD-1 mAb 15의 VL1 도메인을 암호화하는 예시의 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:253이다 (CDRH 잔기를 암호화하는 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시됨):
gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc
atcacctgt c tggccagtca gaccattgga acctggctcg cc tggtatca gcagaaacct
ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagat gg agtgccctcc
cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc
gaggatttcg ctacatacta ctgt caacag ctctactcca ttccatggac c tttggtcag
ggtactaaac tggagatcaa a
V. 항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 1-15 및 엔지니어링된 Fc 영역을 가지는 그것들의 유도체
전통적인 면역 기능에서, 면역계의 세포와 항체-항원 복합체의 상호작용은 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포독성, 비만 세포 탈과립화 및 식균작용(phagocytosis)에서 면역조절 신호, 예컨대 림프구 증식 및 항체 분비의 조절까지의 범위에 있는 다양한 반응을 초래한다. 이 상호작용들 모두는 조혈성 세포 상에서 특수(specialized) 세포 표면 수용체로의 항체 또는 면역 복합체의 Fc 영역의 결합을 통해 시작된다. 이 상호작용들은 모두 조혈성 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체에 대한 항체 또는 면역 복합체의 Fc 영역의 결합을 통해 시작된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발된 다양한 세포 반응은 세 개의 Fc 수용체, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)의 구조적 이질성으로부터 유발된다. FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) 및 FcγRIII (CD16)은 활성화 (즉, 면역계 향상) 수용체이고; FcγRIIB (CD32B)는 억제 (즉, 면역계 약화) 수용체이다. 이에 더하여, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와의 상호작용은 엔도솜으로부터 세포 표면으로의 IgG 분자의 재순환 및 혈액으로의 방출을 매개한다. 예시의 야생형 IgG1 (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:2), IgG3 (SEQ ID NO:3), 및 IgG4 (SEQ ID NO:4)의 아미노산 서열은 상기 제시된다.
Fc 영역의 변형은 정상적으로 변화된 표현형, 예를 들어 변화된 혈청 반감기, 변화된 안정성, 세포 효소에 대한 변화된 민감성 또는 변화된 이펙터 기능으로 이어진다. 예를 들어, 암 치료에서 이러한 분자의 유효성을 향상시키기 위해서, 본 발명의 항체 또는 다른 결합 분자를 이펙터 기능에 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는, 어떤 경우에, 예를 들어, 작용 메커니즘이 표적 항원을 함유한 세포의 차단 또는 길항작용을 포함하지만, 살해는 포함하지 않는 항체의 경우에 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 종양 및 외래 세포와 같이, FcγR이 낮은 수준으로 발현되는 바람직하지 않은 세포, 예를 들어, FcγRIIB의 수준이 낮은 종양-특이적 B 세포 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종)에 대해 지시될 때 바람직하다. 상기 구체예에서, 이펙터 기능 활성이 부여되거나 변화된 본 발명의 분자는 이펙터 기능 활성의 향상된 효능이 요구되는 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
특정 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 야생형 Fc 영역의 아미노산 서열 (예컨대, SEQ ID NO:1)에 대하여 하나 이상의 변형 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 가지고 있는 Fc 영역을 포함하며, 이것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역 및, 따라서 발명의 분자의 친화성 및 결합력을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 발명의 분자는 야생형 Fc 영역의 아미노산에 대한 하나 이상의 변형을 가지고 있는 Fc 영역을 포함하며, 이것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역 및, 따라서, 발명의 분자의 친화성 및 결합력을 증가시킨다. 다른 구체예에서, 분자는 Fc 영역을 포함하지 않거나 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성의 증가 및/또는 FcγRIIA에 대한 결합의 증가를 부여하거나 또는 매개하는 변종 Fc 영역을 포함한다. 대안의 구체예에서, 분자는 변종 Fc 영역을 포함하는데, 상기 변종은 Fc 영역을 포함하지 않거나 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 ADCC 활성 (또는 다른 이펙터 기능)의 감소 및/또는 FcγRIIB에 대한 결합의 증가를 부여하거나 또는 매개한다. 일부 구체예에서, 발명은 변종 Fc 영역을 포함하는 PD-1-결합 분자를 포함하며, 이 변종 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 비슷한 분자에 비해 임의의 FcγR에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 발명은 변종 Fc 영역을 포함하는 PD-1-결합 분자를 포함하며, 이 변종 Fc 영역은 단지 단일 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA, FcγRIIB, 또는 FcγRIIIA 중 하나에만 결합한다. 이러한 증가된 친화성 및/또는 결합력은 바람직하게는 시험관 내에서 모(parent) 분자의 결합 활성 (변형된 Fc 영역이 없음)이 세포에서 검출되지 않을 때 낮은 수준의 FcγR을 발현하는 세포에서, 또는 비-FcγR 수용체 표적 항원을 30,000 내지 20,000개 분자/세포의 밀도로, 20,000 내지 10,000개 분자/세포의 밀도로, 10,000 내지 5,000개 분자/세포의 밀도로, 5,000 내지 1,000개 분자/세포의 밀도로, 1,000 내지 200개 분자/세포의 밀도로 또는 200개 분자/세포 이하의 밀도로 (하지만 적어도 10, 50, 100 또는 150개 분자/세포) 발현하는 세포에서 FcγR에 대한 검출 가능한 결합의 정도 또는 FcγR-관련 활성을 측정하여 평가된다.
본 발명의 PD-1-결합 분자는 활성화 및/또는 억제 Fcγ 수용체에 대하여 변화된 친화성을 갖는 변종 Fc 영역을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, PD-1-결합 분자는 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대한 친화성이 증가되고 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 친화성이 감소된 변종 Fc 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 변종 Fc 영역을 포함하며, 이것은 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대하여 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대하여 증가된 친화성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대하여 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대하여 감소된 친화성을 갖는 변종 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 변종 Fc 영역을 포함하며, 이것은 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대하여 변화되지 않은 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대하여 감소된 (또는 증가된) 친화성을 갖는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 면역글로불린이 향상된 이펙터 기능을 갖도록 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대하여 변화된 친화성을 갖는 변종 Fc 영역을 포함한다. 이펙터 세포 기능의 비-제한적 예는 항체 의존성 세포 매개 세포독성, 항체 의존성 식균작용, 식균작용, 옵소닌화, 옵소닌 식균직용, 세포 결합, 로세팅, C1q 결합 및 보체 의존성 세포 매개 세포독성을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 친화성 또는 이펙터 기능의 변화는 야생형 Fc 영역을 포함하는 비슷한 분자에 비해 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배이다. 발명의 다른 구체예에서, 변종 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% 또는 250% 더 큰 친화성으로 하나 이상의 FcR에 면역특이적으로 결합한다. 이러한 측정은 생체 내 또는 시험관 내 분석에서 이루어질 수 있고, 바람직한 구체예에서는 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 분석과 같은 시험관 내 분석에서 이루어진다.
상이한 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성을 작동시키거나, 또는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성에 길항작용하는 변종 Fc 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 분자는 FcγRIIB의 하나 이상의 활성, 예를 들어, B-세포 수용체-매개 신호 전달, B-세포의 활성화, B-세포 증식, 항체 생성, B 세포의 세포 내 칼슘 유입, 세포 주기 진행, FcγRI 신호 전달의 FcγRIIB-매개 억제, FcγRIIB의 인산화, SHIP 충원, SHIP 인산화 및 Shc와의 회합, 또는 FcγRIIB 신호 변환 경로에서 하나 이상의 하류 분자 (예컨대, MAP 키나아제, JNK, p38, 또는 Akt)의 활성에 길항작용하는 변종을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 FcγRI의 하나 이상의 활성, 예를 들어, 비만 세포 활성화, 칼슘 이동, 탈과립화, 사이토카인 생성 또는 세로토닌 방출을 작동시키는 변종을 포함한다.
특정 구체예에서, 분자는 둘 이상의 IgG 아이소타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)으로부터의 영역들을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, Fc 영역은 특정 IgG 아이소타입의 아미노산 서열이 다른 IgG 아이소타입에 비해 상기 아이소타입에 대하여 가장 상동성인 경우 특정 IgG 아이소타입의 것이라고 한다. 다양한 IgG 아이소타입은, 예를 들어 Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 또는 Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361에 기술된 바와 같이, 힌지 및/또는 Fc 영역의 아미노산 서열의 차이로 인해 혈청 반감기, 보체 결합(complement fixation), FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성 (예컨대, ADCC, CDC, 등)을 포함한 상이한 물리적 및 기능성 성질을 나타낸다. 이 유형의 변종 Fc 영역은 단독으로, 또는 아미노산 변형과 함께 사용되어 Fc-매개 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 영향을 줄 수 있다. 조합될 때, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 발명의 분자에 비하여 유사한 기능성 (예컨대 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성)을 나타낼 수 있고 부가적으로 또는, 더 바람직하게는 발명의 분자에서 이펙터 기능성을 상승적으로 변형시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 영역은 Fc 영역을 포함하지 않거나 또는 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 영역을 포함하는 발명의 분자에 비하여 반대의 기능성 (예컨대 FcγRIIA에 대하여 각각 증가된 및 감소된 친화성)을 나타낼 수도 있고 발명의 분자에서 특이적 기능성을 선택적으로 경감하거나 또는 감소시키는 작용을 할 수도 있다.
바람직한 특이적 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 변종 Fc 영역을 포함하는데, 상기 변종 Fc 영역은 상기 분자가 FcR에 대하여 변화된 친화성을 갖도록 야생형 Fc 영역에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 단 상기 변종 Fc 영역은 Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73에 의해 개시된 것들과 같이 Fc-FcR 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석을 기반으로 FcγR과 직접적으로 접촉하게 되는 위치에서는 치환을 갖지 않는다. FcγR과 직접적으로 접촉하게 되는 Fc 영역 내 위치의 예는 아미노산 잔기 234 내지 239 (힌지 영역), 아미노산 잔기 265 내지 269 (B/C 루프), 아미노산 잔기 297 내지 299 (C'/E 루프) 및 아미노산 잔기 327 내지 332 (F/G 루프)이다. 일부 구체예에서, 발명의 분자는 구조적 및 결정학적 분석을 기반으로 FcγR과 직접적으로 접촉하지 않는, 예를 들어, Fc-FcγR 결합 부위 내에 있지 않은 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변종 Fc 영역을 포함한다.
변종 Fc 영역은 업계에 널리 공지되어 있으며, 임의의 공지된 변종 Fc 영역은 본 발명에서, 예를 들어, NK 의존적 또는 대식세포 의존적 분석에서 기능적으로 분석된 바와 같이, Fc 영역 (또는 그 일부)를 포함하는 발명의 분자에 의해 나타난 이펙터 기능을 부여하거나 변형시키는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 이펙터 기능이 변화된 것으로 확인된 Fc 영역 변종은 PCT 공개 번호 WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; 및 WO 2008/140603에서 개시되고, 그 문헌들에서 개시된 임의의 적합한 변종이 본 분자에서 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 하나 이상의 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 가진 변종 Fc 영역을 포함하며, 이 변형(들)은 (야생형 Fc 영역에 비하여) 억제 FcγR (예컨대 FcγRIIB)에 비하여 활성화 FcγR (예컨대 FcγRIIA 또는 FcγRIIIA)에 대한 변종 Fc 영역의 친화성의 비율을 변화시킨다:
변종 Fc 영역이 1보다 큰 친화성 비율을 갖는 변종 Fc 영역 (야생형 Fc 영역에 비하여)을 가지고 있는 본 발명의 PD-1-결합 분자가 특히 바람직하다. 이러한 분자는, FcγR에 의해 매개되는 이펙터 세포 기능 (예컨대 ADCC)의 향상된 효능이 요구되는 경우, 특히 질환, 장애, 또는 감염, 예컨대, 암 또는 감염성 질환의 치료적 또는 예방적 처치, 또는 그것들의 증상의 개선을 제공하는데 사용된다. 반대로, 1 미만의 친화성 비율을 갖는 변종 Fc 영역은 이펙터 세포 기능의 감소된 효능을 매개한다. 표 1에서는 친화성 비율이 1 초과 또는 1 미만인지에 따라 예시의 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 돌연변이가 나열된다.
친화도 비율에 의해 나열된 예시의 단일 및 다중 돌연변이
단일 이중 삼중 사중 오중
친화도 비율 > 1
F243L F243L & R292P F243L, P247L & N421K L234F, F243L, R292P & Y300L L235V, F243L, R292P, Y300L & P396L
D270E F243L & Y300L F243L, R292P & Y300L L235I, F243L, R292P & Y300L L235P, F243L, R292P, Y300L & P396L
R292G F243L & P396L F243L, R292P & V305I L235Q, F243L, R292P & Y300L F243L, R292P, V305I, Y300L & P396L
R292P D270E & P396L F243L, R292P & P396L F243L, P247L, D270E & N421K
R292P & Y300L F243L, Y300L & P396L F243L, R255L, D270E & P396L
R292P & V305I P247L, D270E & N421K F243L, D270E, G316D & R416G
R292P & P396L R255L, D270E & P396L F243L, D270E, K392T & P396L
Y300L & P396L D270E, G316D & R416G F243L, D270E, P396L & Q419H
P396L & Q419H D270E, K392T & P396L F243L, R292P, Y300L, & P396L
D270E, P396L & Q419H F243L, R292P, V305I & P396L
V284M, R292L & K370N P247L, D270E, Y300L & N421K
R292P, Y300L & P396L R255L, D270E, R292G & P396L
R255L, D270E, Y300L & P396L
D270E, G316D, P396L & R416G
친화도 비율 < 1
Y300L F243L & P396L F243L, R292P & V305I
P396L P247L & N421K
R255L & P396L
R292P & V305I
K392T & P396L
P396L & Q419H
특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역에서, 위치 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 또는 330 중 어느 것에서 및 바람직하게는 다음 잔기들 중 하나 이상: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328 또는 V330에서 임의의 아미노산 변형 (예컨대 치환). 상이한 특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역에서, 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 것에서 및 바람직하게는 다음 잔기들 중 하나 이상: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 또는 L300에서 임의의 아미노산 변형 (예컨대 치환).
바람직한 구체예에서, 변화된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변종 Fc 영역에서, 위치 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 것에서 임의의 아미노산 변형 (예컨대 치환). 바람직하게는, 변종 Fc 영역은 다음 잔기들 중 임의의 것을 갖는다: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 또는 A430.
상이한 구체예에서, 감소된 친화성으로 FcγR에 결합하는 (그것의 Fc 영역을 통해) 변종 Fc 영역에서, 위치 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 임의의 위치에서 임의의 아미노산 변형 (예컨대 치환).
상이한 구체예에서, 향상된 친화성으로 FcγR에 결합하는 (그것의 Fc 영역을 통해) 변종 Fc 영역에서, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 또는 430 중 임의의 위치에서 임의의 아미노산 변형 (예컨대 치환). 상이한 구체예에서, 향상된 친화성으로 FcγRIIA에 결합하는 변종 Fc 영역에서, 다음 잔기들 중 어느 것: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 또는 A430.
바람직한 변종은 위치 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 또는 332 중 어느 위치에서 하나 이상의 변형을 포함한다.
특히 바람직한 변종은 군 A 내지 AI로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
더 특별하게는 바람직한 변종은 군 1 내지 105로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
한 구체예에서, 발명의 PD-1 결합 분자는 Fc 영역에서 적어도 하나의 변형을 가진 변종 Fc 영역을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 변종 Fc 영역은 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다.
특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역은 다음을 포함한다:
(A) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
(B) 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 치환:
(1) F243L 및 P396L;
(2) F243L 및 R292P; 및
(3) R292P 및 V305I;
(C) 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 세 개의 치환:
(1) F243L, R292P 및 Y300L;
(2) F243L, R292P 및 V305I;
(3) F243L, R292P 및 P396L; 및
(4) R292P, V305I 및 P396L;
(D) 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 네 개의 치환:
(1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
(2) F243L, R292P, V305I 및 P396L; 또는
(E) 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 다섯 개의 치환:
(1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및
(2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L.
또 다른 특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역은 다음의 치환을 포함한다:
(A) F243L, R292P 및 Y300L;
(B) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 또는
(C) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L.
한 구체예에서, 발명의 PD-1-결합 분자는 (야생형 IgG1 Fc 영역 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 비하여) FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 결합 (또는 실질적으로 없음)을 나타내는 변종 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 발명의 PD-1-결합 분자는 FcγR (예컨대 FcγRIIIA)에 대한 감소된 (또는 실질적으로 없음) 결합 및 ADCC 이펙터 기능의 감소 (또는 실질적으로 없음)를 나타내는 변종 Fc 영역을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 변종 Fc 영역은 L234A, L235A, D265A, N297Q 및 N297G로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다. 특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역은 L234A; L235A; L234A 및 L235A; D265A; N297Q, 또는 N297G의 치환을 포함한다.
발명의 PD-1-결합 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG1 서열은 L234A/L235A 치환 (SEQ ID NO:5)을 가질 것이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X
여기서, X는 리신 (K)이거나 없다.
상이한 구체예에서, 발명의 PD-1-결합 분자는 (야생형 IgG1 Fc 영역 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합과 비교하여) 본질적으로 FcγRIIIA (CD16a)에 대한 감소된 (또는 실질적으로 없음) 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능을 나타내는 Fc 영역을 포함한다. 특이적 구체예에서, 발명의 PD-1-결합 분자는 IgG2 Fc 영역 (SEQ ID NO:2) 또는 IgG4 Fc 영역 (SEQ ID NO:4)을 포함한다. IgG4 Fc 영역이 이용될 때, 발명은 또한 가닥 교환의 발생을 감소시키기 위하여 안정화 돌연변이, 예컨대 IgG4 힌지 영역 S228P 치환의 도입을 포함한다 (예컨대 SEQ ID NO:13: ESKYGPPCP P CP, (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point MutationOn The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969 참조). 업계에 알려져 있는 다른 안정화 돌연변이가 IgG4 Fc 영역에 도입될 수 있다 (Peters, P et al., (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT 특허 공개 번호: WO 2008/145142).
다른 구체예에서, 발명은 업계에 공지된 임의의 변종 Fc 영역, 예컨대 Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; 미국 특허 번호 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공보 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에서 개시된 것들의 사용을 포함한다.
일부 구체예에서, 발명의 분자는 추가로 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하여서, 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 분자에 공유 결합에 의해 부착된다. 바람직하게는, 하나 이상의 글리코실화 부위 및/또는 Fc 영역에서 하나 이상의 변형을 가진 발명의 분자는 변형되지 않은 항체와 비교하여, 향상된 항체 매개 이펙터 기능, 예컨대, 향상된 ADCC 활성을 부여하거나 또는 가진다. 일부 구체예에서, 발명은 추가로, 제한되는 것은 아니지만, 위치 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 및 301에서 아미노산을 포함하는, Fc 영역의 탄수화물 모이어티와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 것으로 알려져 있는 아미노산의 하나 이상의 변형을 포함하는 분자를 포함한다. Fc 영역의 탄수화물 모이어티와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 아미노산은 업계에 공지되어 있으며, 예컨대, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44:111-7을 참조하고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다른 구체예에서, 발명은, 바람직하게는 분자의 기능성, 예컨대, 표적 항원 또는 FcRγ에 대한 결합 활성을 변화시키지 않으면서, 하나 이상의 글리코실화 부위를 하나 이상의 분자에 도입함으로써 변형된 분자를 포함한다. 글리코실화 부위는 발명의 분자의 가변 및/또는 불변 영역으로 도입될 수 있다. 본원에서 공지된 바와 같이, "글리코실화 부위"는 올리고당 (즉, 함께 결합된 둘 이상의 당을 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 및 공유 결합에 의해 부착될 항체의 임의의 특이적 아미노산 서열을 포함한다. 올리고당 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O- 결합을 통해 항체의 백본(backbone)에 결합된다. N-결합된 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 올리고당 모이어티의 부착을 말한다. O-결합된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌에 올리고당 모이어티의 부착을 말한다. 발명의 분자는 N-결합된 및 O-결합된 글리코실화 부위를 포함하여, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 업계에 공지된 N-결합된 또는 O-결합된 글리코실화를 위한 임의의 글리코실화 부위는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서 유용한 예시의 N-결합된 글리코실화 부위는 아미노산 서열: Asn-X-Thr/Ser이며, X는 임의의 아미노산일 수 있고 Thr/Ser은 트레오닌 또는 세린을 나타낸다. 이러한 부위 또는 부위들은 본 발명이 속한 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 발명의 분자로 도입될 수 있다 (예를 들어 In vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116 참조, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 발명의 분자로 글리코실화 부위를 도입하기 위한 예시의 방법은 원하는 Asn-X-Thr/Ser 서열이 얻어지도록 분자의 아미노산 서열을 변형시키거나 또는 돌연변이를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 글리코실화 부위를 추가하거나 결실시킴으로써 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체 (및 항체 도메인, 예컨대, Fc 영역을 포함하는 분자)의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 업계에 잘 알려져 있고 발명 내에 포함된다, 예컨대 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 특허출원 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511 (전문이 본원에 참조로 포함됨). 다른 구체예에서, 발명은 분자의 하나 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 결실시킴으로써 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 특이적 구체예에서, 발명은 297에 인접한 위치를 변형시킴으로써, 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 이동시키는 단계를 포함한다. 특이적 구체예에서, 발명은 위치 297이 아니라 위치 296이 글리코실화되도록 위치 296을 변형시키는 단계를 포함한다.
이펙터 기능은 또한 Fc 영역으로 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입하고, 그로써 이 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성이 일어나는 것을 허용하여, 내재화 능력이 개선되고 및/또는 보체-매개 세포 살해 및 ADCC가 증가될 수 있는 호모다이머 항체의 생성을 초래하는 것과 같은 기법에 의해 변형될 수 있다 (Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered 인간화된 Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered HumanIgG MutantWith Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922). 향상된 항종양 활성을 가진 호모다이머 항체는 또한 Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In NudeMice," Cancer Research 53:2560-2565에서 기술된 바와 같이 헤테로이기능성(heterobifunctional) 교차-링커를 사용하여 제조될 수 있다. 대안으로, 항체는 이중 Fc 영역을 갖도록 엔지니어링될 수 있고 그로써 보체 용해 및 ADCC 능력이 향상될 수 있다 (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With DualFc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).
Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 투여 이후 분자의 평균 생존 시간의 측정값인 약물동역학적 특성을 의미한다. 반감기는, 예를 들어, 혈청에서, 즉, 순환 반감기, 또는 다른 조직에서 측정된 바와 같이 대상체의 신체 (예컨대 인간 환자 또는 다른 포유동물) 또는 이것들의 특정 구획으로부터의 분자의 공지된 양의 50 퍼센트 (50%)를 제거하는데 필요한 시간으로 표시될 수 있다. 일반적으로, 반감기의 증가는 투여된 분자에 대하여 순환 중 평균 체류 시간 (MRT)의 증가를 초래한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 변종 Fc 영역을 포함하며, 상기 변종 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여서, 상기 분자는 (야생형 Fc 영역과 비교하여) 증가된 반감기를 가진다.
일부 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 변종 Fc 영역을 포함하고, 상기 변종 Fc 영역은 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 및 436으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 반감기-연장 아미노산 치환을 포함한다. Fc 영역-함유 분자의 반감기를 증가시킬 수 있는 많은 특이적 돌연변이가 업계에 공지되어 있고, 예를 들어 M252Y, S254T, T256E 및 이것들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375, 7,083,784; 7,217,797, 8,088,376; 미국 특허출원 공개 번호 2002/0147311; 2007/0148164; 및 국제 공개 번호 WO 98/23289 WO 2009/058492, 및 WO 2010/033279에서 기술된 돌연변이를 참고하고, 이것들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 향상된 반감기를 가진 Fc 영역-함유 분자는 또한 Fc 영역 잔기 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 및 436 중 둘 이상에서 치환을 가진 것들을 포함한다. 특히, T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K 및 Y436I로부터 선택된 둘 이상의 치환.
특이적 구체예에서, 변종 Fc 영역은 다음의 치환을 포함한다:
(A) M252Y, S254T 및 T256E;
(B) M252Y 및 S254T;
(C) M252Y 및 T256E;
(D) T250Q 및 M428L;
(E) T307Q 및 N434A;
(F) A378V 및 N434A;
(G) N434A 및 Y436I;
(H) V308P 및 N434A; 또는
(I) K288D 및 H435K.
본 발명은 다음을 포함하는 변종 Fc 영역을 더 포함한다:
(A) 이펙터 기능 및/또는 FcγR을 변화시키는 하나 이상의 돌연변이; 및
(B) 혈청 반감기를 연장시키는 하나 이상의 돌연변이.
VI. 이중특이적 항-인간 PD-1-결합 분자
본 발명의 한 구체예는 "제1 에피토프" 및 "제2 에피토프"에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이며, 제1 에피토프는 인간 PD-1의 에피토프이고 제2 에피토프는 PD-1의 동일하거나 상이한 에피토프이거나, 또는 면역 세포 (예컨대 T 림프구)의 표면 상에 존재하는 또 다른 분자의 에피토프이고 면역 체크포인트의 조절에 관여한다. 한 구체예에서, 제2 에피토프는 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, 갈렉틴-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC 클래스 I 또는 II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 또는 VISTA의 에피토프이다. 한 구체예에서, 제2 에피토프는 PD-1의 에피토프가 아니다. 특이적 구체예에서, 제2 에피토프는 CD137, PD-1, OX40, TIGIT 또는 TIM-3이다. 특정 구체예에서, 이중특이적 분자는 둘 이상의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 LAG-3의 둘 이상의 상이한 에피토프 및 LAG-3이 아닌 분자의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명은 PD-1 및 제2 에피토프 (예컨대 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, PD-1 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 PCT 공개 번호 WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 및 WO 2014/022540 (이것들은 각각 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 제조된다.
A. Fc 영역이 없는 이중특이적 디아바디
본 발명의 한 구체예는 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 가장 바람직하게는 이것들로 구성된 이중특이적 디아바디에 관한 것이며, 그것들의 서열은 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합되는 것을 허용하여, 서로 동일하지 않은 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는, 공유 결합에 의해 회합된 디아바디를 형성한다. 그러므로 이러한 이중특이적 디아바디는 제1 에피토프에 결합할 수 있는 "VL1" / "VH1" 도메인 및 제2 에피토프에 결합할 수 있는 "VL2" / "VH2" 도메인을 포함한다. 표기법 "VL1" 및 "VH1"은 각각 이러한 이중특이적 디아바디의 "제1" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 유사하게, 표기법 "VL2" 및 "VH2"는 각각 이러한 이중특이적 디아바디의 "제2" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 특정 에피토프가 제1 대비 제2 에피토프로서 표시되는가 하는 것은 상관이 없고; 이러한 표기법은 단지 본 발명의 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 도메인의 존재 및 방향과만 상관이 있다. 한 구체예에서, 이러한 에피토프 중 하나는 PD-1의 에피토프이고 이러한 에피토프들 중 다른 하나는 PD-1의 에피토프가 아니다 (예를 들어, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등의 에피토프).
제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 제1 항원 (즉, PD-1 또는 제2 에피토프를 함유하는 항원 중 어느 하나)에 특이적인 제1 기능성 항원-결합 부위를 형성한다. 유사하게, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 제2 항원 (즉, 제2 에피토프를 함유하는 항원 또는 PD-1 중 어느 하나)에 특이적인 제2 기능성 항원-결합 부위를 형성한다. 그러므로, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은, 디아바디의 두 폴리펩타이드 사슬이 PD-1의 에피토프 및 제2 에피토프 둘 다에 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인을 전체적으로 포함하도록 조정된다 (즉 그것들은 VLPD-1/VHPD-1 및 VL2/VH2를 포함하고, PD-1은 "제1 에피토프" 또는 VL1/VH1 및 VLPD-1/VHPD-1이고, PD-1은 "제2 에피토프"이다).
이러한 이중특이적 디아바디의 구체예의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나 (즉 VLPD-1 또는 VL에피토프 2 중 어느 하나)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL1 도메인, 제1 개재 스페이서 펩티드 (링커 1), 제2 에피토프 (이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VLPD-1을 함유하는 경우) 또는 제1 에피토프 (이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VL에피토프 2를 함유하는 경우) 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH2 도메인, 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1).
이중특이적 디아바디의 이 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, PD-1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나 (즉 VLPD-1 또는 VL에피토프 2 중 어느 하나이고, 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬에 포함되기 위해 선택되지 않는 VL 도메인임)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL2 도메인, 개재 링커 펩타이드 (링커 1), 제2 에피토프 (이러한 제2 폴리펩타이드 사슬이 VLPD-1을 함유하는 경우) 또는 PD-1 (이러한 제2 폴리펩타이드 사슬이 VL에피토프 2를 함유하는 경우) 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH1 도메인, 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1).
가장 바람직하게는, 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리하는 개재 링커 펩타이드 (예컨대, 링커 1)의 길이는 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 서로 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전히 방지하기 위해 선택된다. 그러므로 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 서로 실질적으로 또는 완전히 결합할 수 없다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 서로 실질적으로 또는 완전히 결합할 수 없다. 바람직한 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:14): GGGSGGGG를 갖는다.
제2 개재 링커 펩타이드 (링커 2)의 길이 및 조성은 헤테로다이머-촉진 도메인의 선택을 기반으로 선택된다. 전형적으로, 제2 개재 링커 펩타이드 (링커 2)는 3 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 특히, 헤테로다이머-촉진 도메인이 시스테인 잔기를 포함하지 않는 경우 시스테인-함유 제2 개재 링커 펩타이드 (링커 2)가 활용된다. 시스테인-함유 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2)는 1, 2, 3개 또는 3개 이상의 시스테인 잔기(들)를 함유할 것이다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 (링커 2)는 서열 SEQ ID NO:15: GGCGGG를 가진다. 대안으로, 링커 2는 시스테인 (예컨대 GGG, GGGS (SEQ ID NO:29), LGGGSG (SEQ ID NO:261), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:262), ASTKG (SEQ ID NO:30), LEPKSS (SEQ ID NO:33), APSSS (SEQ ID NO:34), 등)을 포함하지 않고 하기 기술된 바와 같이 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 사용된다. 선택적으로, 시스테인-함유 링커 2 및 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 둘 다 사용된다.
헤테로다이머-촉진 도메인은 한 폴리펩타이드 사슬 상에서는 GVEPKSC (SEQ ID NO:16) 또는 VEPKSC (SEQ ID NO:17) 또는 AEPKSC (SEQ ID NO:18)이고 다른 폴리펩타이드 사슬 상에서는 GFNRGEC (SEQ ID NO:19) 또는 FNRGEC (SEQ ID NO:20)일 수도 있다 (US2007/0004909).
그러나, 더 바람직하게는, 이러한 디아바디의 헤테로다이머-촉진 도메인은 헤테로다이머-촉진 도메인이 순전하(net charge)를 갖도록 적어도 여섯 개, 적어도 일곱 개 또는 적어도 여덟 개의 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 대항 전하의 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 나란히(tandemly) 반복되는 코일 도메인으로부터 형성된다 (Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domain of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) "Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils," Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) "Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag," Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity," J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'--d--d′' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance," J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367).
이러한 반복된 코일 도메인은 정확한 반복부이거나 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인의 코일 도메인은 이러한 헤테로다이머-촉진 도메인에게 음전하를 부여하도록 선택된 여덟 개의 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있고, 제2 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인의 코일 도메인은 이러한 헤테로다이머-촉진 도메인에게 양전하를 부여하도록 선택된 여덟 개의 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수도 있다. 어떤 코일이 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬에 제공되는지는 중요하지 않으며, 단 반대 전하의 코일이 다른 폴리펩타이드 사슬에 사용된다. 양전하를 띈 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘, 등일 수 있고 및/또는 음전하를 띈 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산, 등일 수 있다. 양전하를 띈 아미노산은 바람직하게는 리신이고 및/또는 음전하를 띈 아미노산은 바람직하게는 글루탐산이다. 단지 단일 헤테로다이머-촉진 도메인만이 사용될 수 있지만 (이러한 도메인이 호모다이머화를 억제할 것이고 그로써 헤테로다이머화를 촉진하기 때문에), 본 발명의 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬 둘 다가 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인들 중 하나는 네 개의 탠덤 "E-코일" 나선형 도메인 (SEQ ID NO:21: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)을 포함할 것이며, 이것의 글루타메이트 잔기는 pH 7에서 음전하를 형성할 것인 한편, 헤테로다이머-촉진 도메인들 중 다른 것은 네 개의 탠덤 "K-코일" 나선형 도메인 (SEQ ID NO:22: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)을 포함할 것이며, 이것의 리신 잔기는 pH 7에서 양전하를 형성할 것이다. 이러한 전하를 띈 도메인의 존재는 제1 및 제2 폴리펩타이드 사이의 회합을 촉진하고, 그로써 헤테로다이머 형성을 촉진한다. SEQ ID NO:21의 네 개의 탠덤 "E-코일" 나선형 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인이 특히 바람직하다: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:23). 마찬가지로, SEQ ID NO:22의 네 개의 탠덤 "K-코일" 나선형 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인이 특히 바람직하다: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:24).
WO 2012/018687에서 개시된 바와 같이, 디아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 개선하기 위해서, 디아바디는 디아바디의 말단 중 하나 이상에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩타이드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게는, 혈청-결합 단백질의 이러한 폴리펩타이드 부분은 디아바디의 C-말단에 설치될 것이다. 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 인간에서 19일의 반감기를 갖는다. 알부민은 그것이 다른 단백질에 비-공유 결합되는 것을 허용함으로써 혈청 반감기를 연장시키는 여러 소분자 결합 부위를 가지고 있다. 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 안정한 세 개의 나선 다발을 형성하는 46개의 아미노산 잔기로 구성되고 광범위한 알부민-결합 특이성을 갖는다 (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 그러므로, 디아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 개선하기 위해, 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩타이드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G의 알부민-결합 도메인 (ABD)이고, 더 바람직하게는, 스트렙토코쿠스 디스갈락티애 (Streptococcus dysgalactiae) 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)이다 (SEQ ID NO:25): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.
WO 2012/162068 (본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 바와 같이, SEQ ID NO:25의 "탈면역화" 변종은 MHC 클래스 II 결합을 약화시키거나 제거하는 능력을 갖는다. 조합 돌연변이 결과를 기반으로, 다음 치환의 조합들이 이러한 탈면역화 ABD를 형성하는데 바람직한 치환인 것으로 간주된다: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변종 ABD는 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진다. 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66NAK S 70 A 71EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:26),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:27),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70 VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:28)을 가지는 변종 탈면역화 ABD가 이러한 탈면역화 ABD가 실질적으로 야생형 결합을 나타내는 한편 약화된 MHC 클래스 II 결합을 제공하기 때문에 특히 바람직하다. 그러므로, ABD를 가진 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 바람직하게는 E-코일 (또는 K-코일) 도메인과 ABD (바람직하게는 탈면역화 ABD) 사이를 개재하기 위해서 이러한 폴리펩타이드 사슬의 E-코일 (또는 K-코일) 도메인에 대하여 C-말단에 위치한 펩타이드 링커를 함유한다. 이러한 펩타이드 링커에 대하여 바람직한 서열은 SEQ ID NO:29:GGGS이다.
B. Fc 영역을 함유하는 이중특이적 디아바디
본 발명의 한 구체예는 PD-1 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 Fc 영역을 포함하는 이중특이적 디아바디 (예컨대 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 관한 것이다. 디아바디 사슬의 복합체 형성이 Fc 영역의 형성을 초래하도록, 디아바디 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다에 IgG CH2-CH3 도메인의 추가는 디아바디의 생물학적 반감기를 증가시키고 및/또는 원자가를 변화시킨다. 디아바디 폴리펩타이드 둘 다로의 IgG CH2-CH3 도메인의 포함은 2-사슬 이중특이적 Fc-영역-함유 디아바디가 형성되는 것을 허용할 것이다 (도 2).
대안으로, 디아바디 폴리펩타이드 중 단 하나로의 IgG CH2-CH3 도메인의 포함은 더 복잡한 4-사슬 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디가 형성되는 것을 허용할 것이다 (도 3A 내지 3C). 도 3C는 불변 경쇄 (CL) 도메인 및 불변 중쇄 CH1 도메인을 가지고 있는 대표적인 4-사슬 디아바디를 도시하지만, 이러한 도메인의 단편, 뿐만 아니라 다른 폴리펩타이드가 대안으로 이용될 수도 있다 (예컨대 도 3A 및 3B, 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 그러므로, 예를 들어, CH1 도메인 대신에, 인간 IgG의 힌지 도메인으로부터 유도된 아미노산 서열 GVEPKSC (SEQ ID NO:16), VEPKSC (SEQ ID NO:17) 또는 AEPKSC (SEQ ID NO:18)를 가진 펩타이드를 사용할 수 있고, CL 도메인 대신에, 인간 카파 경쇄의 C-말단 6개의 아미노산, GFNRGEC (SEQ ID NO:19) 또는 FNRGEC (SEQ ID NO:20)를 사용할 수 있다. 4-사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 펩타이드가 도 3A에서 도시된다. 대안으로, 또는 이에 더하여, "E-코일" 나선형 도메인 (SEQ ID NO:21: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K 또는 SEQ ID NO:23: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K); 및 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:22: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E 또는 SEQ ID NO:24: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)과 같이 반대 전하의 탠덤 코일 도메인을 포함한 펩타이드를 사용할 수 있다. 4-사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 코일 도메인은 도 3B에서 도시된다.
본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디 분자는 일반적으로 추가적인 개재 링커 펩타이드 (링커)를 포함한다. 전형적으로, 추가적인 링커는 3-20개의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디 분자에서 이용될 수 있는 추가적인 또는 대안의 링커는 GGGS (SEQ ID NO:29), LGGGSG (SEQ ID NO:261), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:262), ASTKG (SEQ ID NO:30), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:31), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:32), LEPKSS (SEQ ID NO:33), APSSS (SEQ ID NO:34), 및 APSSSPME (SEQ ID NO:35), LEPKSADKTHTCPPC SEQ ID NO:36), GGC, 및 GGG를 포함한다. 클로닝을 쉽게 하기 위해 GGG 또는 GGC 대신 SEQ ID NO:33이 사용될 수 있다. 추가적으로, 아미노산 GGG 또는 SEQ ID NO:33이 SEQ ID NO:31 바로 다음에 사용되어 대안 링커: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:263); 및 LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:37)가 형성될 수 있다. 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디 분자는 링커에 더불어 또는 링커 대신 IgG 힌지 영역을 통합할 수 있다. 예시의 힌지 영역은 IgG1으로부터의 EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:32), IgG2로부터의 ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:11), IgG4로부터의 ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:12) 및 가닥 교환을 감소시키기 위해 안정화 치환체를 포함하는 IGG4 힌지 변종인 ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO:13)를 포함한다.
도 3A 내지 3C에서 제공된 바와 같이, 본 발명의 디아바디는 네 개의 상이한 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 세 개의 도메인 (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하며, 헤테로다이머-촉진 도메인은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬과 제2/제4 폴리펩타이드 사슬의 다이머화를 촉진한다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용하기 위해 동일하거나 상이할 수 있다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용하기 위해 동일하거나 상이할 수 있다. 표기법 "VL3" 및 "VH3"은 각각 이러한 디아바디의 "제3" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 유사하게, 표기법 "VL4" 및 "VH4"는 각각 이러한 디아바디의 "제4" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 발명의 대표적인 4-사슬 Fc 영역-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조는 표 2에서 제공된다:
이중특이적 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
사중특이적 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH
제4 사슬 NH2-VL4-VH3-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특이적 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 이중특이적이고, 4가이며 (즉, 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있음), 총 네 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 Fc-함유 디아바디이다 (도 3A 내지 3C). 본 발명의 이중특이적이고, 4가인 Fc-함유 디아바디는 PD-1에 대하여 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 (PD-1의 동일한 에피토프 또는 PD-1의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음), 제2 에피토프에 대하여 특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 (예를 들어, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)를 포함한다.
추가의 구체예에서, 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드는 세 개의 도메인 (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제2 폴리펩타이드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 그러므로, 이러한 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 각각의 제3 도메인에서 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 이황화 결합을 통해 안정화되는 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 복합체를 형성한다. 이러한 디아바디는 향상된 효능을 갖는다. 도 4A 및 4B는 이러한 디아바디의 구조를 나타낸다. 이러한 Fc-영역-함유 이중특이적 디아바디는 두 방향 중 하나를 가질 수 있다 (표 3):
제1 방향 제3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제2 방향 제3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특이적 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 이중특이적이고, 2가이며 (즉, 두 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있음), 총 세 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 Fc-함유 디아바디이다 (도 4A 내지 4B). 본 발명의 이중특이적이고, 2가인 Fc-함유 디아바디는 PD-1에 대하여 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위, 및 제2 에피토프 (예를 들어, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 대하여 특이적인 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다.
추가의 구체예에서, 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 총 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬 중 두 개는 동일한 아미노산 서열을 가진다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 서열을 함유한다. 제1 폴리펩타이드 사슬은 VH1 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체의 중쇄일 수 있다. 이러한 디아바디의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL1-함유 도메인 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬의 VH1에 대하여 상보적인 VL1을 함유하는 항체의 경쇄일 수 있다. 제1, 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 자연 발생 항체로부터 분리될 수도 있다. 대안으로, 그것들은 재조합에 의해 구성될 수 있다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인, (iv) VL2-함유 도메인, (v) VH3-함유 도메인 및 (vi) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하며, 헤테로다이머-촉진 도메인은 제3 사슬과 제4 사슬의 다이머화를 촉진한다. 이러한 디아바디의 제4 폴리펩타이드는 (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다.
그러므로, 이러한 디아바디의 제1 및 제2, 및 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 두 개의 VL1/VH1 결합 부위를 형성한다. 이러한 디아바디의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위, 뿐만 아니라 제3 에피토프에 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성한다. 제1 및 제3 폴리펩타이드는 각각의 불변 영역에서 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 복합체를 형성한다. 이러한 디아바디는 향상된 효능을 갖는다. 도 5는 이러한 디아바디의 구조를 나타낸다. VL1/VH1, VL2/VH2 및 VL3/VH3 도메인이 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용하기 위해 동일하거나 또는 상이할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 본원에서 제공된 바와 같이, 이 도메인들은 바람직하게는 PD-1 및 제2 에피토프 (또는 제2 및 제3 에피토프 (예컨대, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 결합하도록 선택된다.
폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 원하는 에피토프에 특이적인 VL/VH 결합 부위를 형성하기 위해 선택된다. 폴리펩타이드 사슬의 회합에 의해 형성된 VL/VH 결합 부위는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용하기 위해 동일하거나 상이할 수 있다. 특히, VL 및 VH 도메인은 이중특이적 디아바디가 제1 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 세 개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위, 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 제3 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 포함할 수 있도록 선택될 수도 있다 (도 5에서 도시됨). 발명의 대표적인 5-사슬 Fc 영역-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조가 표 4에서 제공된다:
이중특이적 (2x2) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL2-VH2-HPD-COOH
이중특이적 (3x1) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
삼중특이적 (2x1x1) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL3-VH2-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특이적 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 이중특이적이고, 4가이며 (즉, 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있음), 제1 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위를 갖는 총 5개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 Fc-함유 디아바디이다. 한 구체예에서, 발명의 이중특이적이고, 4가인, Fc-함유 디아바디는 PD-1에 대하여 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위 (이것은 PD-1의 동일한 에피토프 또는 PD-1의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다), 및 제2 에피토프 (예컨대, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 대하여 면역특이적인 두 개의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 발명의 이중특이적이고, 4가인, Fc-함유 디아바디는 PD-1에 대하여 면역특이적인 세 개의 에피토프-결합 부위 (이것은 PD-1의 동일한 에피토프 또는 PD-1의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다), 및 제2 에피토프 (예컨대, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, PD-1 MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 대하여 특이적인 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 발명의 이중특이적이고, 4가인, Fc-함유 디아바디는 PD-1에 대하여 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위 및 제2 에피토프 (예컨대, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, PD-1 MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 대하여 특이적인 세 개의 에피토프-결합 부위를 포함한다.
C. Fc 영역을 함유하는 이중특이적 3가 결합 분자
본 발명의 추가의 구체예는 Fc 영역을 포함하고, 제1 에피토프, 제2 에피토프 및 제3 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 3가 결합 분자에 관한 것이며, 이러한 에피토프 중 적어도 하나는 다른 것에 대해 동일하지 않다. 그러므로 이러한 이중특이적 디아바디는 제1 에피토프에 결합할 수 있는 "VL1" / "VH1" 도메인, 제2 에피토프에 결합할 수 있는 "VL2" / "VH2" 도메인 및 제3 에피토프에 결합할 수 있는 "VL3" / "VH3" 도메인를 포함한다. 한 구체예에서, 이러한 에피토프 중 하나 또는 두 개는 PD-1의 에피토프이고 이러한 에피토프 중 다른 것 (또는 다른 하나)는 PD-1의 에피토프가 아니다 (예컨대, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, 등의 에피토프). 이러한 이중특이적 3가 결합 분자는 세 개의 에피토프-결합 부위를 포함하는데, 그 중 두 개는 결합 부위 A 및 결합 부위 B를 제공하는 디아바디-형 결합 도메인이고, 그 중 하나는 결합 부위 C를 제공하는 비-디아바디-형 결합 도메인이다 (예컨대, 도 6A 내지 6F, 및 PCT 출원 번호 PCT/US15/33081; 및 PCT/US15/33076 참조).
전형적으로, 본 발명의 3가 결합 분자는 네 개의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 포함하겠지만 (도 6A 내지 6B 참조), 분자는, 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드 사슬을 서로 융합시킴으로써 (예컨대, 펩타이드 결합을 통해) 또는 이러한 폴리펩타이드 사슬을 분할하여(divide) 추가적인 폴리펩타이드 사슬을 형성함으로써, 또는 소수의 또는 추가적인 폴리펩타이드 사슬을 이황화 결합을 통해 회합시킴으로써 더 적거나 더 많은 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 도 6B 내지 6F는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 이러한 분자를 개략적으로 도시함으로써 본 발명의 이 측면을 예시한다. 도 6A 내지 6F에서 제공된 바와 같이, 본 발명의 3가 결합 분자는 디아바디-형 결합 도메인이 Fc 영역에 대하여 N-말단 (도 6A, 6C 및 6D)이거나 또는 C-말단 (도 6B, 6E 및 6F)인 대안의 방향을 가질 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 이러한 3가 결합 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. VL1 및 VL2 도메인은 표 5에서 제공된 바와 같이 CH2-CH3-함유 도메인에 대하여 N-말단 또는 C-말단에 위치한다 (도 6A 및 6B). 이러한 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유한다. 이러한 구체예의 제3 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH3-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제3 폴리펩타이드 사슬은 VH3 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체의 중쇄일 수 있다. 이러한 구체예의 제4 폴리펩타이드는 (i) VL3-함유 도메인 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 제4 폴리펩타이드 사슬은 제3 폴리펩타이드 사슬의 VH3에 대하여 상보적인 VL3을 함유하는 항체의 경쇄일 수도 있다. 제3 또는 제4 폴리펩타이드 사슬은 자연 발생 항체로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 그것들은 재조합에 의해, 합성으로 또는 다른 수단에 의해 구성될 수 있다.
제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 가변 경쇄 도메인은 그것들의 VL1/VH2 (또는 그것들의 VL2/VH1) 도메인이 함께 회합되어 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성하는 것을 허용하기에는 너무 짧은 길이를 가진 개재 스페이서 링커에 의해 이러한 폴리펩타이드 사슬의 가변 중쇄 도메인으로부터 분리된다. 이 목적을 위해 바람직한 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:14): GGGSGGGG를 가진다. 3가 결합 분자의 다른 도메인은 선택적으로 시스테인 잔기를 포함하는 하나 이상의 개재 스페이서 펩타이드에 의해 분리될 수 있다. 3가 결합 분자의 제조에 유용한 예시의 링커는 본원에서 제공되고 PCT 출원 번호 PCT/US15/33081; 및 PCT/US15/33076에서도 제공된다. 그러므로, 이러한 3가 결합 분자의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 이러한 3가 결합 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제3 에피토프에 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성한다. VL1/VH1, VL2/VH2 및 VL3/VH3 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용하기 위하여 동일하거나 상이할 수 있다는 것이 인지될 것이다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 3가 결합 분자는 세 개의 폴리펩타이드를 포함할 수도 있다. 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 3가 결합 분자는 제3 폴리펩타이드의 VH3-함유 도메인에 대하여 N-말단에서 제4 폴리펩타이드의 도메인을 결합시킴으로써 얻어질 수 있다. 대안으로, 세 개의 도메인, (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH3-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유하는 발명의 3가 결합 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬이 활용되는데, VL3 및 VH3은 이 도메인들의 회합이 에피토프-결합 부위를 형성하는 것을 허용하기 위해 충분히 긴 (적어도 9개 이상의 아미노산 잔기) 개재 스페이서 펩타이드만큼 서로 이격되어 있다.
VL1/VH1, VL2/VH2, 및 VL3/VH3 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용하기 위해 동일하거나 또는 상이할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 본원에서 제공된 바와 같이, 이 도메인들은 바람직하게는 PD-1 및 제2 에피토프 (또는 제2 및 제3 에피토프) (바람직하게는, 이러한 에피토프는 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등의 에피토프이다)에 결합하도록 선택된다.
특히, VL 및 VH 도메인은 3가 결합 분자가 제1 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 두 개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 제3 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 포함하도록 선택될 수 있다. 발명의 대표적인 3가 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조는 도 6A 내지 6F 및 표 5에서 제공된다:
4개의 사슬
제1 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
제4 사슬 NH2-VL3-CL-COOH
4개의 사슬
제2 방항		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2 -CH2-CH3--VL1-VH2-HPD COOH
제3 사슬 NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
제4 사슬 NH2-VL3-CL-COOH
3개의 사슬
제1 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
3개의 사슬
제2 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2 -CH2-CH3-VL1-VH2-HPD COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
본 발명의 한 구체예는 PD-1에 대한 두 개의 에피토프-결합 부위 및 PD-1 이외의 분자에 존재하는 제2 에피토프 (예컨대 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 대한 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는 이중특이적 3가 결합 분자에 관한 것이다. PD-1에 대한 두 개의 에피토프-결합 부위는 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 PD-1에 대한 하나의 에피토프-결합 부위 및 PD-1 이외의 분자에 존재하는 제2 항원 (예컨대 B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC 클래스 I 또는 II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, 등)에 결합하는 두 개의 에피토프-결합 부위를 포함하는 이중특이적 3가 결합 분자에 관한 것이다. 제2 항원에 대한 두 개의 에피토프-결합 부위는 항원의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프 (예컨대, LAG-3의 동일하거나 상이한 에피토프)에 결합할 수 있다. 상기 제공된 바와 같이, 이러한 이중특이적 3가 결합 분자는 세 개 또는 네 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다.
VII. 불변 도메인 및 Fc 영역
발명의 PD-1-결합 분자 (예컨대, 항체, 디아바디, 3가 결합 분자, 등)의 생성에 유용한 항체 불변 도메인이 본원에서 제공된다.
바람직한 CL 도메인은 인간 IgG CL 카파 도메인이다. 예시의 인간 CL 카파 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:8)이다:
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC.
대안으로, 예시의 CL 도메인은 인간 IgG CL 람다 도메인이다. 예시의 인간 CL 카파 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:9)이다:
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS
NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS.
본원에서 제공된 바와 같이, 발명의 PD-1-결합 분자는 Fc 영역을 포함할 수도 있다. 발명의 이러한 분자의 Fc 영역은 임의의 아이소타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)일 수 있다. 발명의 PD-1-결합 분자는 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 존재할 때, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역은 임의의 아이소타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)일 수 있고, 바람직하게는 원하는 Fc 영역과 동일한 아이소타입이다.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG1 CH 도메인이다. 예시의 인간 IgG1 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:10)이다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG2 CH 도메인이다. 예시의 인간 IgG2 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:257)이다:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG4 CH 도메인이다. 예시의 인간 IgG4 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:254)이다:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV.
한 예시의 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 예시의 인간 IgG1 힌지 영역의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:32)이다: EPKSCDKTHTCPPCP.
다른 예시의 힌지 영역은 인간 IgG2 힌지 영역이다. 예시의 인간 IgG2 힌지 영역의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:11)이다: ERKCCVECPPCP.
또 다른 예시의 힌지 영역은 인간 IgG4 힌지 영역이다. 예시의 인간 IgG4 힌지 영역의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:12)이다: ESKYGPPCPSCP. 본원에서 기술된 바와 같이, IgG4 힌지 영역은 S228P 치환과 같은 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시의 안정화된 IgG4 힌지 영역의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:13)이다: ESKYGPPCP P CP.
본 발명의 Fc 영역-함유 분자 (예컨대, 항체, 디아바디, 및 3가 분자)의 Fc 영역은 완전한 Fc 영역 (예컨대, 완전한 IgG Fc 영역)이거나 또는 Fc 영역의 단지 단편일 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 Fc 영역은 C-말단 리신 아미노산 잔기가 없다. 특히, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 Fc 영역은 엔지니어링된 변종 Fc 영역일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 Fc 영역-함유 분자의 Fc 영역은 하나 이상의 Fc 수용체 (예컨대, FcγR(들))에 결합하는 능력을 가질 수 있지만, 더 바람직하게는 이러한 변종 Fc 영역은 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대하여 변화된 결합을 갖거나 (야생형 Fc 영역에 의해 나타난 결합과 비교하여) 또는 억제 수용체(들)에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되거나 또는 없을 것이다. 그러므로, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 Fc 영역은 완전한 Fc 영역의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있거나, 또는 변종 CH2 및/또는 변종 CH3 서열 (예를 들어, 완전한 Fc 영역의 CH2 또는 CH3 도메인에 관련하여 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 Fc 영역은 비-Fc 폴리펩타이드 부분을 포함할 수 있거나, 비-자연적으로 완전한 Fc 영역의 일부를 포함할 수 있거나, 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연 발생 방향 (예컨대, 예를 들어, 두 개의 CH2 도메인 또는 두 개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 도메인에 결합된 CH3 도메인, 등)을 을 포함할 수 있다.
활성화 수용체에 대한 결합을 증가시키는 변형 (예컨대, FcγRIIA (CD16A)) 및 억제 수용체에 대한 결합을 감소시키는 변형 (예컨대, FcγRIIB (CD32B))을 포함하여, 이펙터 기능을 변화시키는 것으로 확인된 Fc 영역 변형은 업계에 공지되어 있다 (예컨대 Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls TumorExpansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890 참조). CD32B에 대한 결합이 감소되고 및/또는 CD16A에 대한 결합이 증가된 인간 IgG1 Fc 영역의 예시의 변종은 F243L, R292P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이 아미노산 치환들은 임의의 조합으로 또는 부분조합(subcombination)으로 인간 IgG1 Fc 영역에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 영역 변종은 F243L, R292P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 영역 변종은 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다.
특히, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 폴리펩타이드 사슬의 Fc 영역이 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 (또는 실질적으로 없음) 결합을 나타내는 것이 바람직하다 (야생형 IgG1 Fc 영역 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 비하여). 이러한 변화된 결합을 매개할 수 있는 변종 Fc 영역 및 돌연변이 형태는 상기 기술되어 있다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자는 감소된 ADCC 이펙터 기능을 나타내는 IgG Fc 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서 이러한 Fc 영역-함유 분자의 제1 및/또는 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 다음 치환 중 임의로 1, 2 또는 3개를 포함한다: L234A, L235A, N297Q, 및 N297G. 다른 구체예에서, 인간 IgG Fc 영역 변종은 N297Q 치환, N297G 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하며, 이 돌연변이들은 FcR 결합을 없앤다. 대안으로, 고유하게 FcγRIIIA (CD16a)에 대한 감소된 (또는 실질적으로 없음) 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능 (야생형 IgG1 Fc 영역 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 비하여)를 나타내는 Fc 영역의 CH2-CH3 도메인이 활용된다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자는 IgG2 Fc 영역 (SEQ ID NO:2) 또는 IgG4 Fc 영역 (SEQ ID NO:4)을 포함한다. IgG4 Fc 영역이 활용될 때, 본 발명은 또한 상기 기술된 힌지 영역 S228P 치환 (예컨대, SEQ ID NO:13 참조)과 같은 안정화 돌연변이의 도입을 포함한다. 297G, N297Q, L234A, L235A 및 D265A 치환이 이펙터 기능을 없애기 때문에, 이펙터 기능이 필요한 상황에서는, 이 치환들은 바람직하게는 사용되지 않을 것이다.
특히, 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 폴리펩타이드 사슬의 Fc 영역이 증가된 혈청 반감기를 나타내는 것이 바람직하다 (상응하는 야생형 Fc에 의해 나타난 반감기에 비하여). 연장된 혈청 반감기를 나타내는 변종 Fc 영역 및 돌연변이 형태는 상기 기술되어 있다. 바람직한 구체예에서 이러한 Fc 영역-함유 분자의 제1 및/또는 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 다음 치환 중 임의의 1, 2 또는 3개를 포함한다: M252Y, S254T 및 T256E. 발명은 또한 다음을 포함하는 변종 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 Fc 영역-함유 분자를 포함한다:
(A) 이펙터 기능 및/또는 FcγR을 변화시키는 하나 이상의 돌연변이; 및
(B) 혈청 반감기를 연장시키는 하나 이상의 돌연변이.
본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대하여 바람직한 IgG1 서열은 치환 L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E를 포함할 것이다 (SEQ ID NO:258):
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대하여 바람직한 IgG4 서열은 M252Y/S254T/T256E 치환을 포함할 것이다 (SEQ ID NO:259):
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X ,
여기서, X는 리신 (K)이거나 또는 없다.
제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 동일하지 않은 디아바디 및 3가 결합 분자에 대하여, 두 개의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 또는 두 개의 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 호모다이머화가 일어나는 것을 감소시키거나 방지하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요가 없고, 유리하게는 두 개의 폴리펩타이드 사슬 사이에서의 복합체 형성을 촉진하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게는 "놉(knob)"을 형성하는 부피가 큰 측면기를 포함하는 아미노산, 예컨대, 트립토판으로의 치환)은 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하게 되고 돌연변이된 도메인이 상보적, 또는 부응하는(accommodating) 돌연변이가 엔지니어링되는 도메인, 즉, "홀(hole)" (예컨대, 글리신으로의 치환)과 쌍을 형성하도록 CH2 또는 CH3 도메인으로 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이의 세트는 Fc 영역을 형성하는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 쌍으로 엔지니어링될 수 있다. 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하도록 단백질을 엔지니어링하는 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 조작과 관련하여, 업계에 널리 공지되어 있고, 본원에 포함된다 (예컨대, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And TumorCell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 이 문헌들은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 바람직하게는 "놉"은 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 엔지니어링되고 "홀"은 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 엔지니어링된다. 그러므로, "놉"은 제1 폴리펩타이드 사슬이 그것의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 통해 호모다이머화하는 것을 방지하도록 도울 것이다. 제3 폴리펩타이드 사슬은 바람직하게는 "홀" 치환을 함유하기 때문에, 그것은 제1 폴리펩타이드 사슬과 헤테로다이머화될 뿐만 아니라 자체로 호모다이머화될 것이다. 이 전략은 "놉"이 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 엔지니어링되고 "홀"이 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 엔지니어링되는 경우, 상기 기술된 바와 같이, 3, 4 또는 5개의 사슬을 포함하는 디아바디 및 3가 결합 분자에 활용될 수 있다.
바람직한 놉은 변형 T366W를 함유하도록 IgG Fc 영역을 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 홀은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 IgG Fc 영역을 변형시킴으로써 생성된다. 최종 이중특이적 헤테로다이머 Fc 영역-함유 분자로부터 홀-함유 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머를 정제하는 것을 돕기 위해서, 제3 폴리펩타이드 사슬의 홀-함유 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게는 위치 435에서의 아미노산 치환 (H435R)에 의해 돌연변이된다. 그러므로, 홀-함유 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머는 단백질 A에 결합하지 않는 반면, 이중특이적 헤테로다이머는 제1 폴리펩타이드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 대안의 구체예에서, 홀-함유 제3 폴리펩타이드 사슬은 위치 434 및 435에서의 아미노산 치환 (N434A/N435K)을 통합할 수 있다.
본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대하여 바람직한 IgG1 아미노산 서열은 "놉-함유" 서열 (SEQ ID NO:6)을 가질 것이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X는 리신 (K)이거나 없다.
두 개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬 (또는 3, 4, 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 Fc 영역-함유 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬)의 CH2 및 CH3 도메인에 대하여 바람직한 IgG1 아미노산 서열은 "홀-함유" 서열 (SEQ ID NO:7)을 가질 것이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X ,
여기서 X는 리신 (K)이거나 없다.
언급되는 바와 같이, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로 및 위치 235에서 알라닌으로의 치환을 포함하며, 따라서 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대한 감소된 (또는 실질적으로는 없음) 결합을 나타내는 Fc 영역을 형성한다 (야생형 Fc 영역 (SEQ ID NO:1)에 의해 나타난 결합에 비하여). 본 발명은 또한 이러한 CH2-CH3 도메인을 포함하는데, 이것은 위치 Fc 영역의 이펙터 기능 및/또는 FγR 결합 활성을 변형시키는 대안의 및/또는 추가적인 치환을 포함한다. 발명은 또한 이러한 CH2-CH3 도메인을 포함하는데, 이것은 하나 이상의 반감기 연장 아미노산 치환을 더 포함한다. 특히, 발명은 M252Y/S254T/T256E를 더 포함하는 이러한 홀-함유 및 이러한 놉-함유 CH2-CH3 도메인을 포함한다.
제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:6의 것과 같은, "놉-함유" CH2-CH3 서열을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 인식되는 바와 같이, "홀-함유" CH2-CH3 도메인 (예컨대, SEQ ID NO:7)은 제1 폴리펩타이드 사슬에서 사용될 수 있으며, 이 경우에, "놉-함유" CH2-CH3 도메인 (예컨대, SEQ ID NO:6)은 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 영역-함유 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬 (또는 3, 4, 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 Fc 영역-함유 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬)에서 사용될 것이다.
상기 상세히 설명된 바와 같이 발명은 야생형 CH2 및 CH3 도메인, 또는 상기 기술된 치환의 조합을 포함하는 CH2 및 CH3 도메인을 가진 Fc 영역-함유 분자 (예컨대, 항체 및 Fc 영역-함유 디아바디)를 포함한다. 이러한 변화를 포함하는 IgG1 CH2-CH3 도메인의 예시의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:260)이다:
APEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLX6CX7VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLX8SKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHX9X10YTQKS LSLSPGX11
여기서:
(a) X1 및 X2는 둘 다 L (야생형)이거나, 또는 둘 다 A (감소된 FcγR 결합)이고;
(b) X3, X4 및 X5는 각각 M, S 및 T (야생형)이거나, 또는 Y, T 및 E (연장된 반감기)이고,
(c) X6, X7 및 X8은 각각 T, L 및 Y (야생형)이거나, 또는 W, L 및 Y (놉), 또는 S, A 및 V (홀)이고;
(d) X9 및 X10은 각각 N 및 H (야생형)이거나, 또는 N 및 R (단백질 A 결합 없음), 또는 A 및 K (단백질 A 결합 없음)이고;
(e) X11은 K이거나 또는 없다.
다른 구체예에서, 발명은 PCT 공개 번호 WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867 (이것들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들과 같이, 업계에 공지된 돌연변이를 사용하여 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하도록 엔지니어링된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 PD-1-결합 분자를 포함한다.
VIII. PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자
본 발명은 특히 항-PD-1 항체, 바람직하게는 본원에 제공된 신규한 항-PD-1 항체들 중 하나의 에피토프-결합 단편, 및 항-인간 LAG-3 항체, 바람직하게는 본원에 제공된 신규한 항-인간 LAG-3 항체들 중 하나의 에피토프-결합 단편을 포함하는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 등)에 관련된다. 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자는 이러한 분자들의 억제 활성을 약화시키기 위하여, 두 개의 상이한 에피토프: PD-1의 에피토프 및 LAG-3의 에피토프에 배위 결합할 수 있는 것을 가능하게 하는 항체들의 에피토프-결합 단편을 가진다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 약화는 검출 가능한 PD-1 및/또는 LAG-3 억제 활성의 적어도 20%의 감소, 적어도 50%의 감소, 적어도 80%의 감소 또는 적어도 90%의 감소, 또는 검출 가능한 PD-1 및/또는 LAG-3 억제 활성의 완전한 제거를 말한다. 항-인간 PD-1 항체 및 항-LAG-3 항체의 에피토프-결합 단편 (예컨대, VL 및 VH 도메인)의 선택은 이러한 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자를 구성하는 폴리펩타이드 사슬들이 조립되어 제1 항원 (즉 PD-1 또는 LAG-3 중 어느 하나)에 특이적인 적어도 하나의 기능성 항원 결합 부위 및 제2 항원 (즉 제1 항원의 정체성에 따라 PD-1 또는 LAG-3 중 어느 하나)에 특이적인 적어도 하나의 기능성 항원 결합 부위를 형성하도록 조정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자는 본원에서 기술된 바와 같이 바람직하게 2, 3, 4 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이중특이적 디아바디이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자는 본원에서 기술된 바와 같이 바람직하게 2, 3 또는 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이중특이적 항체이다 (또한 예컨대 WO 2007/024715; WO2007/110205; WO 2009/080251; WO 2009/080254; WO 2009/089004; WO 2011/069104; WO 2011/117329; WO 2011/131746; WO 2011/133886; WO 2011/143545; WO 2012/023053; WO 2013/060867 참조, 이것들은 모두 전문이 본원에 참조로 포함됨).
A. 항-인간 LAG-3 항체
인간 LAG-3에 대하여 면역특이적인 예시의 항체들이 하기에 제공된다. 추가의 원하는 항체들은 LAG-3 또는 그것의 펩타이드 단편을 사용하여 유도된 항체-분비 하이브리도마를 분리함으로써, 또는 LAG-3 또는 그것의 펩타이드 단편에 대한 결합에 대해 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 인간 LAG-3 (28개의 아미노산 잔기 신호 서열 (하기에 밑줄로 표시됨) 및 497개의 아미노산 잔기 성숙 단백질을 포함함)은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:38)을 가진다:
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAE VP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL
QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT
VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA
VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV
HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN
VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP
PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI
ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA
QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL
LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE
ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL.
1. LAG-3 mAb A
본원에서 "LAG-3 mAb A"로 표시된 항-인간 LAG-3 항체 BMS-986016 (25F7; Medarex/BMS) 및 그것의 변종들이 기술되었다 (예컨대 WO 2014/008218 참조). LAG-3 mAb A의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:39)을 가진다 (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWN WIRQP PGKGLEWIG E
INHNGNTNSN PSLKS RVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAF GYS
DYEYNWFDP W GQGTLVTVSS.
LAG-3 mAb A의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:40)을 가진다 (CDR은 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSIS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D
ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPLT FGQ
GTNLEIK.
특유의 결합 특징을 가진 추가적인 쥐과의 항-인간 LAG-3 항체들이 최근에 확인되었다 (미국 특허 출원 번호 62/172,277 참조). 본 발명의 바람직한 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자는 항-인간 LAG-3 항체 LAG-3 mAb 1 또는 LAG-3 mAb 6 항체를 포함하는데, 그것들은 신규한 에피토프에 결합하고 LAG-3 결합에 대해 BMS-986016과 경쟁하지 않는다. LAG-3 mAb 1 또는 LAG-3 mAb 6의 인간화된 VH 및/또는 VL 도메인을 가지는 본 발명의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 결합 분자가 특히 바람직하다.
2. LAG-1 mAb 1
LAG-3 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:41)이 하기 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨).
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMN WVKQA PGKVLKWMG W
INTYTGESTY ADDFEG RFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCAR ES
LYDYYSMDY W GQGTSVTVSS
LAG-3 mAb 1의 CDRH1 (SEQ ID NO:42): RNYGMN
LAG-3 mAb 1의 CDRH2 (SEQ ID NO:43): WINTYTGESTYADDFEG
LAG-3 mAb 1의 CDRH3 (SEQ ID NO:44): ESLYDYYSMDY
LAG-3 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:45)이 하기 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVVTQTPLT LSVTIGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQRPGQSPE
RLIY LVSELD S GVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC WQGTHFP
YT FGGGTKLE IK
LAG-3 mAb 1의 CDRL1 (SEQ ID NO:46): KSSQSLLHSDGKTYLN
LAG-3 mAb 1의 CDRL2 (SEQ ID NO:47): LVSELDS
LAG-3 mAb 1의 CDRL3 (SEQ ID NO:48): WQGTHFPYT
본원에서 "hLAG-3 mAb 1 VH1" 및 "hLAG-3 mAb 1 VH2"로 표시된 LAG-3 mAb 1의 두 개의 예시의 인간화된 VH 도메인 및 LAG-3 mAb 1의 4개의 예시의 인간화된 VL 도메인, "hLAG-3 mAb 1 VL1", "hLAG-3 mAb 1 VL2", "hLAG-3 mAb 1 VL3" 및 "hLAG-3 mAb 1 VL4"가 하기에 제공된다. 인간화된 VL 도메인 중 어느 것이든지 인간화된 VH 도메인 중 어느 것과 쌍을 이루어 LAG-3 결합 도메인이 생성될 수 있다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인 중 하나를 포함하는 임의의 항체는 일반적으로 "hLAG-3 mAb 1"로 언급되고, 인간화된 VH/VL 도메인의 특정 조합은 특이적 VH/VL 도메인을 참조로 언급되며, 예를 들면 hLAG-3 mAb 1 VH1 및 hLAG-3 mAb 1 VL2를 포함하는 인간화된 항체는 "hLAG-3 mAb 1(1.2)"로 특이적으로 언급된다.
LAG-3 mAb 1 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:49)이 하기 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W
INTYTGESTY ADDFEG RFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCAR ES
LYDYYSMDY W GQGTTVTVSS.
LAG-3 mAb 1 VH2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:50)이 하기 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W
INTYTGESTY ADDFEG RFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCAR ES
LYDYYSMDY W GQGTTVTVSS.
LAG-3 mAb 1 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:51)이 하기 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQKPGQSPE
RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCW QGTHFP
YT FGGGTKVE IK.
LAG-3 mAb 1 VL2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:52)이 하기 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQRPGQSPE
RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP
YT FGGGTKVE IK.
LAG-3 mAb 1 VL3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:53)이 하기 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDGKTYLN W LLQKPGQPPE
RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP
YT FGGGTKVE IK.
LAG-3 mAb 1 VL4의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:54)이 하기 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISC KSSQSLL HSDAKTYLN W LLQKPGQPPE
RLIY LVSELD S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC WQGTHFP
YT FGGGTKVE IK.
hLAG-3 mAb 1 VL4의 VL 도메인의 CDRL1은 글리신 대 알라닌 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: KSSQSLLHSD A KTYLN (SEQ ID NO:55)을 가진다 (치환된 알라닌은 밑줄로 표시됨). 유사한 치환이 상기 기술된 LAG-3 mAb 1 CDRL1 도메인들 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
3. LAG-3 mAb 6
LAG-3 mAb 6의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:56)이 하기 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMD WVKQS HGESLEWIG D
INPDNGVTIY NQKFEG KATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAR EA
DYFYFDY WGQ GTTLTVSS
LAG-3 mAb 6의 CDRH1 (SEQ ID NO:57): DYNMD
LAG-3 mAb 6의 CDRH2 (SEQ ID NO:58): DINPDNGVTIYNQKFEG
LAG-3 mAb 6의 CDRH3 (SEQ ID NO:59): EADYFYFDY
LAG-3 mAb 6의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:60)이 하기 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITC KASQDVS SVVA WYQQKP GQSPKLLIF S
ASYRYT GVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWT FGG
GTKLEIK
LAG-3 mAb 6의 CDRL1 (SEQ ID NO:61): KASQDVSSVVA
LAG-3 mAb 6의 CDRL2 (SEQ ID NO:62): SASYRYT
LAG-3 mAb 6의 CDRL3 (SEQ ID NO:63): HYSTPWT
본원에서 "hLAG-3 mAb 6 VH1" 및 "hLAG-3 mAb 6 VH2"로 표시된 LAG-3 mAb 6의 두 개의 예시의 인간화된 VH 도메인 및 LAG-3 mAb 6의 2개의 예시의 인간화된 VL 도메인, "hLAG-3 mAb 1 VL1" 및 "hLAG-3 mAb 1 VL2"가 하기에 제공된다. 인간화된 VL 도메인 중 어느 것이든지 인간화된 VH 도메인 중 어느 것과 쌍을 이루어 LAG-3 결합 도메인이 생성될 수 있다. 따라서, 인간화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 인간화된 VL 도메인 중 하나를 포함하는 임의의 항체는 일반적으로 "hLAG-3 mAb 6"으로 언급되고, 인간화된 VH/VL 도메인의 특정 조합은 특이적 VH/VL 도메인을 참조로 언급되며, 예를 들면 hLAG-3 mAb 6 VH1 및 hLAG-3 mAb 6 VL2를 포함하는 인간화된 항체는 "hLAG-3 mAb 6(1.2)"로 특이적으로 언급된다.
hLAG-3 mAb 6 VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:294)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMD WVRQA PGQGLEWMG D INPDNGVTIY
NQKFEG RVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS.
hLAG-3 mAb 6 VH2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:295)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMD WVRQA PGKGLEWVS D INPDNGVTIY
NQKFEG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR EA DYFYFDY WGQ GTTLTVSS.
hLAG-3 mAb 6 VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:296)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWT FGG GTKLEIK.
hLAG-3 mAb 6 VL2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:297)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS SVVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPD
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWT FGG GTKLEIK.
hLAG-3 mAb 6 VL1 및 VL2의 VL 도메인의 CDRL1은 리신 대 아르기닌 아미노산 치환을 포함하고 아미노산 서열: R ASQDVSSVVA (SEQ ID NO:298)을 가진다 (치환된 아르기닌은 밑줄로 표시됨). 유사한 치환이 상기 기술된 LAG-3 mAb 6 CDRL1 도메인들 중 임의의 것에 통합될 수 있는 것으로 여겨진다.
B. E/K 코일을 가지는 예시의 4 사슬 Fc 영역-함유 디아바디
E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 4개의 예시적인 PD-1 X LAG-3 이중특이적, 4 사슬 Fc 영역-함유 디아바디 ("DART A", "DART B", "DART C" 및 "DART I"로 표시됨)가 생성되었다. 이 Fc 영역-함유 디아바디들의 구조는 하기에 상세하게 설명된다. 이 예시적인 PD-1 x LAG-3 디아바디들은 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.
1. DART A
DART A는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 IgG4 Fc 영역 및 시스테인-함유 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지는, 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART A의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단, LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:23)); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 변종 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART A의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:267의 변종이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDX1KTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP
KPKDTLX2IX3R X4PEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL
TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G,
여기서 X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 선택되고, X1은 A 또는 G이며; X2는 Y 또는 M이고; X3은 T 또는 S이며; X4는 E 또는 T이다.
DART A의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:267이고, 이때 X1은 A이며; X2는 Y이고; X3은 T이며; X4는 E이다.
DART A의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단, PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (K-코일) 도메인 (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:24)); 및 C-말단을 포함한다.
DART A의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:268)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA
DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG
GCGGGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
2. DART B
DART B는 DART A와 동일하되, DART B의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 CDRL1에 아미노산 치환을 포함하는, hLAG-3 mAb 1 VL3의 VL 도메인 (SEQ ID NO:53)을 포함한다. 그러므로, DART B의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL3) (SEQ ID NO:53); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:23)); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 변종 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART B의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:267이고, 이때 X1은 G이며; X2는 Y이고; X3은 T이며; X4는 E이다.
DART B의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:268이다.
3. DART C
DART C는 DART B와 동일하되, DART B의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 C-말단 잔기가 없는 야생형 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:4)을 포함한다. 그러므로, DART C의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL3) (SEQ ID NO:53); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:23)); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); C-말단 잔기가 없는 야생형 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:4); 및 C-말단을 포함한다.
DART C의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:267이고, 이때 X1은 G이며; X2는 M이고; X3은 S이며; X4는 T이다.
DART C의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:268이다.
4. DART I
DART I는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 IgG4 Fc 영역 및 시스테인-함유 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지는, 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART I의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL1) (SEQ ID NO:296); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:23)); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 변종 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART I의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:290)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK
DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG
EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH
QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLG.
DART I의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단, PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 6 VH1) (SEQ ID NO:294); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 (K-코일) 도메인 (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:24)); 및 C-말단을 포함한다.
DART I의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 (SEQ ID NO:291)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN
QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC
GGGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
C. CL/CH1 도메인을 가지는 예시의 4 사슬 Fc 영역-함유 디아바디
"DART D", "DART E", "DART J" 및 "DART 1"로 표시된, CL/CH1 도메인을 포함하는 4개의 예시적인 PD-1 X LAG-3 이중특이적, 4 사슬 Fc 영역-함유 디아바디가 생성되었다. 이 Fc 영역-함유 디아바디들의 구조는 하기에 상세하게 설명된다. 이 예시적인 PD-1 x LAG-3 디아바디들은 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.
1. DART D
DART D는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인 및 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 IgG4 Fc 영역을 가지는, 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART D의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); IgG4 CH1 도메인 (SEQ ID NO:254); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 IgG4 CH2-CH3 도메인의 변종 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART D의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:269)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA
DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL
GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL
GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ
EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS
RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G.
DART D의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 ((VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8); 및 C-말단을 포함한다.
DART D의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:270)이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL
GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES
VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC.
2. DART E
DART E는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인 및 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 IgG4 Fc 영역을 가지는, 또 다른 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART E의 PD-1 및 LAG-3 결합 부위들의 위치는 DART D에 비교하여 반전되었다.
DART E의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); IgG4 CH1 도메인 (SEQ ID NO:254); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 IgG4 CH2-CH3 도메인의 변종 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART E의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:271)이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL
GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL
GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ
EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS
RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G.
DART E의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8); 및 C-말단을 포함한다.
DART E의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:272)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA
DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL
GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES
VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC.
3. DART J
DART J는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인 및 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 IgG4 Fc 영역을 가지는, 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART J의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 6 VL1) (SEQ ID NO:296); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); IgG4 CH1 도메인 (SEQ ID NO:254); 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13); 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 IgG4 CH2-CH3 도메인의 변종 (SEQ ID NO:259); 및 C-말단을 포함한다.
DART J의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:292)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK
DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSLGGGSG
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV
FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG.
DART J의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 6 VH1) (SEQ ID NO:294); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8); 및 C-말단을 포함한다.
DART J의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:293)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN
QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSLGG
GSGRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT
EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC.
4. DART 1
DART 1은 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인 및 감소된 FcγR 결합을 위해 엔지니어링된 변종 IgG1 Fc 영역을 가지는, 이중특이적, 4 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART 1의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 PD-1 mAb A VL) (SEQ ID NO:65); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHLAG-3 LAG-3 mAb A VH1) (SEQ ID NO:39); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32); 치환 L234A/L235A를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 IgG1 CH2-CH3 도메인의 변종 (SEQ ID NO:5); 및 C-말단을 포함한다.
DART 1의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:284)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV
ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK
GRFTISRDNS KNTLFLQMNS LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSLG GGSGASTKGP
SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS
SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLYI TREPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG.
DART 1의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 LAG-3 mAb A VL) (SEQ ID NO:40); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHPD-1 PD-1 mAb A VH) (SEQ ID NO:64); 개재 링커 펩타이드 (링커 2: LGGGSG (SEQ ID NO:261)); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8); 및 C-말단을 포함한다.
DART 1의 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:285)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA
RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ
QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS
RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSLGGGS
GRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
D. 예시의 5 사슬 Fc 영역-함유 디아바디
"DART F" 및 "DART G"로 표시된, CL/CH1 도메인 및 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 두 개의 예시적인 PD-1 X LAG-3 이중특이적, 5 사슬 Fc 영역-함유 디아바디가 생성되었다. 이 Fc 영역-함유 디아바디들의 구조는 하기에 상세하게 설명된다. 이 예시적인 PD-1 x LAG-3 디아바디들은 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.
1. DART F
DART F는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인, 감소된 FcγR 결합 및 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 놉/홀-함유 IgG1 Fc 영역 및 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지는, 이중특이적, 5 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART F의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32); 치환 L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 홀-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:260, 여기서 X1은 A이고, X2는 A이며; X3은 Y이고, X4는 T이며, X5는 E이고, X6은 S이며, X7은 A이고, X8은 V이며, X9는 A이고, X10은 K이며, X11은 없음); 및 C-말단을 포함한다.
DART F의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:273)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHAKYTQ KSLSLSPG.
DART F의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8); 및 C-말단을 포함한다.
DART F의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:274)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
DART F의 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32); 치환 L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 놉-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:260, 여기서 X1은 A이고, X2는 A이며; X3은 Y이고, X4는 T이며, X5는 E이고, X6은 W이며, X7은 L이고, X8은 Y이며, X9는 N이고, X10은 H이며, X11은 없음); 개재 링커 펩타이드 (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:262)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:21)); 및 C-말단을 포함한다.
DART F의 제3 폴라펩타이드 사슬의 아미노산 사슬은 (SEQ ID NO:275)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IVMTQTPLSL SVTPGQPASI
SCKSSQSLLH SDAKTYLNWL LQKPGQPPER LIYLVSELDS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS
RVEAEDVGVY YCWQGTHFPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS
CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV
AALEKEVAAL EK.
DART F의 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (K-코일) 도메인 (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:22)); 및 C-말단을 포함한다.
DART F의 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:276)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA
DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG
GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
2. DART G
DART G는 PD-1에 특이적인 두 개의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 두 개의 결합 부위, CL/CH1 도메인, 감소된 FcγR 결합 및 연장된 반감기를 위해 엔지니어링된 변종 놉/홀-함유 IgG1 Fc 영역 및 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지는, 이중특이적, 5 사슬, Fc 영역-함유 디아바디이다. DART G의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32); 치환 L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 홀-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:260, 여기서 X1은 A이고, X2는 A이며; X3은 Y이고, X4는 T이며, X5는 E이고, X6은 S이며, X7은 A이고, X8은 V이며, X9는 A이고, X10은 K이며, X11은 없음); 및 C-말단을 포함한다.
DART G의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:277)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY
ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHAKYT QKSLSLSPG.
DART G의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8) 및 C-말단을 포함한다.
DART G의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:278)이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV
FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC.
DART G의 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32); 치환 L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 놉-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:260, 여기서 X1은 A이고, X2는 A이며; X3은 Y이고, X4는 T이며, X5는 E이고, X6은 W이며, X7은 L이고, X8은 Y이며, X9는 N이고, X10은 H이며, X11은 없음); 개재 링커 펩타이드 (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:262)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:21)); 및 C-말단을 포함한다.
DART G의 제3 폴라펩타이드 사슬의 아미노산 사슬은 (SEQ ID NO:279)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY
ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGG GGSGGGSGGG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT
LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS
SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS
CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV
AALEKEVAAL EK.
DART G의 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (K-코일) 도메인 (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:22)); 및 C-말단을 포함한다.
DART G의 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:280)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD
QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG
CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
E. E/K-코일을 가지는 예시의 3 사슬 Fc 영역-함유 디아바디
본 발명은 추가적으로 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는, PD-1 X LAG-3 이중특이적, 3 사슬 Fc 영역-함유 디아바디를 제공한다. "DART H"로 표시된, E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는, 예시의 PD-1 X LAG-3 이중특이적, 3 사슬 Fc 영역-함유 디아바디가 생성되었다. 이 Fc 영역-함유 디아바디들의 구조는 하기에 상세하게 설명된다. 이 예시적인 PD-1 x LAG-3 디아바디들은 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.
DART H는 PD-1에 특이적인 하나의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 하나의 결합 부위, 감소된 FcγR 결합을 위해 엔지니어링된 변종 놉/홀-함유 IgG1 Fc 영역 및 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 Fc 영역-함유 디아바디이다.
DART H의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (E-코일) 도메인 (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:21)); 개재 링커 (스페이서-링커 3: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:263)); 치환 L234A/L235A를 포함하고 C-말단 리신 잔기가 없는 놉-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:6): 및 C-말단을 포함한다.
DART H의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:281)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ
VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA
DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG
GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
DART H의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 ((VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 개재 링커 펩타이드 (링커 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO:14)); PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); 시스테인-함유 개재 링커 펩타이드 (링커 2: GGCGGG (SEQ ID NO:15)); 헤테로다이머-촉진 (K-코일) 도메인 (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:22)); 및 C-말단을 포함한다.
DART H의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:282)이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG
GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
DART G의 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; 힌지 영역 (DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:31); 치환 L234A/L235A를 포함하고 C-말단 리신 잔기가 없는 홀-함유 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:7); 및 C-말단을 포함한다.
DART G의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:283)이다:
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK.
F. 예시의 이중특이적 항체
"BSAB A"로 표시된 예시의 PD-1 X LAG-3 4 사슬 이중특이적 항체가 생성되었다. 이 이중특이적 항체의 구조는 하기에 상세하게 설명된다. 이 예시의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 항체는 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 의도된다.
BSAB A는 PD-1에 특이적인 하나의 결합 부위, LAG-3에 특이적인 하나의 결합 부위, FcγR 결합을 감소시키고 두 개의 상이한 중쇄 폴리펩타이드 사이의 복합체 형성을 촉진하기 위해 엔지니어링된 변종 IgG1 Fc 영역을 가지는 이중특이적 항체이다 (예컨대 WO 2011/143545 참조).
BSAB A의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHPD-1 hPD-1 mAb 7 VH1) (SEQ ID NO:147); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); 치환 D221E/P228E (Kabat에서와 같이 EU 색인에 의해 넘버링되고 하기 SEQ ID NO:286에 밑줄로 표시됨)를 포함하는 변종 IgG1 힌지 영역; 치환 L234A/L235A/L368E (하기 SEQ ID NO:286에 밑줄로 표시됨)를 포함하고 C-말단 잔기가 없는 변종 IgG1 CH2-CH3 도메인; 및 C-말단을 포함한다.
BSAB A의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:286)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA
STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SC E KTHTCP E CPAPE AA GGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLTC E VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG.
BSAB A의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; PD-1에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLPD-1 hPD-1 mAb 7 VL2) (SEQ ID NO:153); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8) 및 C-말단을 포함한다.
BSAB A의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:287)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
BSAB A의 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 ((VHLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VH1) (SEQ ID NO:49); IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10); 치환 D221R/P228R (하기 SEQ ID NO:288에 밑줄로 표시됨)을 포함하는 변종 IgG1 힌지 영역; 치환 L234A/L235A/L409R (하기 SEQ ID NO:288에 밑줄로 표시됨)을 포함하고 C-말단 잔기가 없는 변종 IgG1 CH2-CH3 도메인; 및 C-말단을 포함한다.
BSAB A의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산은 (SEQ ID NO:288)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY
ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSC R KTHTCP R CPAPE AA GG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY S R LTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.
BSAB A의 제4 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로: N-말단; LAG-3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLLAG-3 hLAG-3 mAb 1 VL4) (SEQ ID NO:54); 카파 CL 도메인 (SEQ ID NO:8) 및 C-말단을 포함한다.
BSAB A의 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산은 (SEQ ID NO:289)이다:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV
FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC.
IX. 참조 항체
A. 참조 항-인간 PD-1 항체
본 발명의 신규한 항-인간 PD-1-결합 분자를 평가하고 특성화하기 위하여, 다음의 참조 항체들이 사용되었다: 니볼루맙 (5C4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106으로도 알려져 있고, Bristol-Myers Squibb에 의해 OPDIVO®로 시판됨), 본원에서 "PD-1 mAb A"로 표시된 인간 IgG4 항체; 및 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙으로 알려지고, 또한 MK-3475, SCH-900475로서 알려지며, Merck에 의해 KEYTRUDA®로 시판됨).
1. 니볼루맙 ("PD-1 mAb A")
PD-1 mAb A의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 사열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:64)을 가진다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMH WVRQA PGKGLEWVA V
IWYDGSKRYY ADSVKG RFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCAT ND
DY WGQGTLVT VSS
PD-1 mAb A의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 사열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:65)을 가진다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D
ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ SSNWPRT FGQ
GTKVEIK
2. 펨브롤리주맙 ("PD-1 mAb B")
PD-1 mAb B의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 사열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:66)을 가진다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMY WVRQA PGQGLEWMG G
INPSNGGTNF NEKFKN RVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCAR RD
YRFDMGFDY W GQGTTVTVSS
PD-1 mAb B의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 사열은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:67)을 가진다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASKGVS TSGYSYLH WY QQKPGQAPRL
LIY LASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YC QHSRDLPL
T FGGGTKVEIK
X. 제조 방법
항-PD-1 폴리펩타이드, 및 다른 PD-1 작용물질 (agonist), 길항제 및 조절제는 업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 합성으로 또는 재조합에 의해 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 서열로부터 생성될 수 있다. 이러한 펩타이드 작용물질, 길항제 및 조절제를 생산하는 한 방법은 폴리펩타이드의 화학적 합성과, 이어서 올바른 이황화 결합인 고유한 형태를 얻기에 적절한 산화 조건 하에서의 처리를 포함한다. 이것은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법론을 사용하여 이루어질 수 있다 (예컨대, Kelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; 또한 미국 특허 번호 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925 참조).
발명의 폴리펩타이드는 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
또 다른 대안으로, 인간 PD-1 또는 그것의 가용성 형태에 대한 결합을 위해, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 하나 이상의 CDR을 가지거나, 또는 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15와 경쟁하는 전체 인간 항체들이 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하기 위해 엔지니어링되어 있는 상업적으로 입수 가능한 마우스의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 더 바람직한 (예컨대, 전체 인간 항체) 또는 더 왕성한 면역 반응을 생성하기 위해 디자인된 형질전환 동물들 또한 인간화된 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 XenomouseTM (Abgenix, Inc., Fremont, CA) 및 HuMAb-Mouse® 및 TC MouseTM (both from Medarex, Inc., Princeton, NJ)이다.
대안으로, 항체는 재조합으로 제조되고 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 항체는 먼저 숙주 동물로부터 제조된 항체를 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)에서 재조합으로 항체를 발현시킴으로써 재조합으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 식물 (예컨대, 담배(tobacco)) 또는 형질전환 유즙에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 유즙에서 재조합으로 항체를 발현시키기에 적합한 방법이 개시되었다 (예를 들어, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "HumanAntibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157). 항체의 유도체, 예를 들어, 인간화된, 단일 사슬, 등을 제조하는데 적합한 방법은 업계에 공지되어 있다. 다른 대안으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
관심있는 항체 또는 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있는 에드먼 분해(Edman degradation)에 의해 서열분석이 수행될 수 있다. 질량 분석법 또는 에드먼 분해로부터 생성된 펩타이드 정보는 관심있는 단백질을 클로닝하는데 사용되는 프로브 또는 프라이머를 디자인하는데 사용될 수 있다.
관심있는 단백질을 클로닝하는 대안의 방법은 인간 PD-1에 대한 결합을 위하여, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 하나 이상의 CDR을 가지는 관심있는 항체 또는 단백질, 또는 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15와 경쟁하는 항체를 발현하는 세포에 대해 정제된 PD-1 또는 그 일부를 사용하여 "패닝(panning)"하는 것이다. "패닝" 과정은 PD-1을 발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 얻고, 제2 세포 유형에서 cDNA를 과발현시키고, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 존재 또는 부재하에 PD-1에 대한 특이적 결합에 대하여 제2 세포 유형의 트랜스펙션된 세포를 스크리닝함으로써 실행될 수 있다. "패닝"에 의해 세포 표면 단백질을 암호화하는 포유류 유전자를 클로닝하는데 사용된 방법의 상세한 설명은 업계에서 찾아볼 수 있다 (예를 들어, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 및 Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell SurfaceProteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854 참조).
관심있는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 벡터는 전기천공법, 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용한 트랜스펙션; 미세사출법(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염 (예컨대, 벡터가 우두 바이러스(vaccinia virus)와 같은 감염원인 경우)을 포함한 많은 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라질 것이다.
이종성 DNA를 과발현시킬 수 있는 임의의 숙주 세포는 관심있는 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리할 목적으로 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주 세포는, 숙주 세포에서, 존재하는 경우, 관심있는 상응하는 내인성 항체 또는 단백질보다 약 5배 더 높은 수준, 더 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. PD-1에 대한 특이적 결합에 대하여 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역분석 또는 FACS에 의해 영향을 받는다. 관심있는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 식별될 수 있다.
발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 업계에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 항체의 단백질 가수분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기술된 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 약 50개 아미노산까지의 더 짧은 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 화학적 합성 방법은 업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 항-PD-1 폴리펩타이드는 고체상 방법을 이용하는 자동화 폴리펩타이드 합성기에 의해 제조될 수 있다.
발명은 PD-1에 결합하는 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15 항체의 변종 및, 기능적으로 동등한 항체 및 이러한 분자의 특성에 유의미하게 영향을 미치지 않는 융합 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 활성이 향상되거나 감소된 변종을 포함하는, 그것들의 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 폴리펩타이드의 변형은 업계에서는 일상적인 관행이므로 본원에서 상세히 기술될 필요는 없다. 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의미하게 유해하게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 추가, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩타이드를 포함한다. 서로 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는 글리신/알라닌; 세린/트레오닌; 발린/아이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 폴리펩타이드들은 또한 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 폴리펩타이드, 뿐만 아니라, 예를 들어, 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화와 같이 다른 번역-후 변형을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 보존적일 것이며, 즉, 치환된 아미노산은 원래의 아미노산과 유사한 화학적 특성을 가지고 있을 것이다. 이러한 보존적 치환은 업계에 공지되어 있으며, 그 예들은 상기 제공되어 있다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서부터 가변 도메인과 같은, 영역의 완전한 재디자인까지의 범위에 있을 수 있다. 가변 도메인의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변화시킬 수 있다. 다른 변형 방법은 업계에 공지된 커플링(coupling) 기법의 사용을 포함하며, 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형은, 예를 들어, 면역분석을 위한 라벨의 부착, 예컨대 방사성 면역분석을 위한 방사성 모이어티의 부착에 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 업계에서 확립된 과정을 사용하여 제조되며 업계에 공지된 표준 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15 항체 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 공개적으로 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해서, 항체 융합 단백질은 PD-1에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 및 고유한 분자에서 부착되지 않은 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 이종성 서열 또는 다른 영역으로부터의 상동성 서열을 함유한다.
XI. 본 발명의 PD-1-결합 분자의 사용
본 발명은 본 발명의 PD-1-결합 분자 (예컨대, 항-PD-1 항체, 항-PD-1 이중특이적 디아바디, 등), 이러한 분자로부터 유도된 폴리펩타이드, 이러한 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 본원에서 기술된 다른 제제들을 포함하는, 약학적 조성물을 포함한 조성물을 포함한다.
A. 치료적 사용
상기 논의된 바와 같이, PD-1은 T-세포 증식, 기능 및 항상성을 음성적으로 조절하는데 중요한 역할을 한다. 본 발명의 특정 PD-1-결합 분자는 PD-1 기능을 억제하는 능력을 가지며, 따라서 PD-1-매개 면역계 억제를 반전시킨다. 이와 같이, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14, 및 PD-1 mAb 15, 그것들의 인간화된 유도체 및 그것들의 PD-1-결힙 단편을 포함하는 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디 (한정하는 것은 아니지만, DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I 및 DART-J를 포함함) 등) 또는 이러한 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 분자는 PD-1-매개 면역계 억제를 차단하여, 면역계의 활성화를 촉진하는데 사용될 수 있다.
PD-1 및 세포 표면 상에 존재하는 면역 체크포인트의 조절에 관여된 또 다른 분자 (예컨대, LAG-3)에 결합하는 본 발명의 이러한 이중특이적 PD-1-결합 분자는 PD-1 및 이러한 면역 체크포인트 분자에 의해 매개된 면역계 억제를 차단함으로써 면역계를 증대시킨다. 그러므로, 발명의 PD-1-결합 분자는 대상체의 면역 반응 (예컨대, T-세포 매개 면역 반응)을 증대시키는데 유용하다. 특히, 발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 암 및 병원체 (예컨대, 박테리아, 균류, 바이러스 또는 원생동물 감염)의 존재와 관련된 질환을 포함하는, 바람직하지 않게 억제된 면역계와 관련된 임의의 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 PD-1-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 암은 다음의 세포로 구성된 군으로부터 선택된 암 세포의 존재를 특징으로 하는 암을 포함한다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 질환, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암.
특히, 본 발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 대장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 PD-1-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 병원체-관련 질환은 만성 바이러스, 박테리아, 균류 및 기생충 감염을 포함한다. 본 발명의 PD-1-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 만성 감염은 엡스타인 바 바이러스, A형 간염 바이러스 (HAV); B형 간염 바이러스 (HBV); C형 간염 바이러스 (HCV); 헤르페스 바이러스 (예컨대 HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 바실루스(Bacilli), 시트로박터(Citrobacter), 콜레라(Cholera), 디프테리아(Diphtheria), 엔테로박터(Enterobacter), 임균(Gonococci), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 클레브시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 수막염균(Meningococci), 미코박테리아(mycobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas), 뉴모노코쿠스(Pneumonococci), 리케차 박테리아(rickettsia bacteria), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 포도상구균(Staphylococci), 연쇄상구균(Streptococci), 파상풍(Tetanus), 아스페르질루스(Aspergillus) (푸미가투스(fumigatus), 니게르(niger), 등), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다(Candida)　(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis), 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 털곰팡이속(Genus Mucorales)(무코르(mucor), 아브시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenkii), 파라콕시디오이데스 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis),　히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 렙토스피라증(Leptospirosis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 장내 기생충(helminth parasite) (십이지장충(hookworm), 조충류(tapeworms), 디스토마류(flukes), 편형동물류(flatworms) (예컨대, 주혈흡충병(Schistosomia)), 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 트리키넬라(trichinella), 이핵아메바(Dientamoeba Fragilis), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 및 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani)를 포함한다.
발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 다른 항암제, 특히, 암 항원에 특이적으로 결합하는 분자들 (예컨대, antibodies, 디아바디)과 조합될 수 있다. 발명의 PD-1-결합 분자와 조합될 수 있는 항암 치료법은 다음을 포함하는 하나 이상의 암 항원에 특이적으로 결합하는 분자들을 포함한다: 결장암, 위암 뮤신에서 발견되는 19.9; 4.2; A33 (대장 암종 항원; Almqvist, Y. 2006, NuclMed Biol. Nov;33(8):991-998); ADAM-9 (미국 특허 공개 번호 2006/0172350; PCT 공개 번호 WO 06/084075); 위암에서 발견되는 AH6; ALCAM (PCT 공개 번호 WO 03/093443); APO-1 (악성 인간 림프구 항원) (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated TumorRegression By Induction Of Apoptosis," Science 245:301-304); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); B7-H3 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Sun,M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); 베타-카테닌 (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); 결장 선암종에서 발견되는 혈액군 ALe b /Le y ; 결장 선암종에서 발견되는 버킷 림프종 항원-38.13, C14; CA125 (난소 암종 항원)(Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl3:274-81　; Yuet al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2):468-475); 카르복시펩티다제 M (미국 특허 공개 번호 2006/0166291); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19 (Ghetie et al. (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of HumanB-Cell TumorLines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest," Blood 83:1329-1336; Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse HumanMonoclonal Antibody To CD20," Blood 83:435-445; Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 CurrTop Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia," J. Nucl.Med. 34:422-430); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 CurrOncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD46 (미국 특허 공개 번호 7,148,038; PCT 공개 번호 WO 03/032814); CD52 (Eketorp, S.S. et al. (2014) "Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients," Ann Hematol. 93(10):1725-1733; Suresh,T. et al. (2014) "New Antibody Approaches To Lymphoma Therapy," J. Hematol. Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) "Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemia," Curr.Opin. Oncol. 25(6):701-706); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD317 (Kawai, S. et al. (2008) "Interferon-γ Enhances CD317 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell Carcinoma Xenograft Models," Cancer Science 99(12):2461-2466; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody," Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. et al. (2009) "Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer," 63(1):23-31; Sayeed, A. et al. (2013) "Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells," PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (암배아 항원; Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine," J. Clin. Invest. 96(1):334-42); Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CEACAM9/CEACAM6 (Zheng, C. et al. (2011) "A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity," PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11); CO17-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced," Int. J. Cancer 53:751-758); 선암종에서 발견되는 CO-43 (혈액군 Leb); CO-514 (혈액군 Lea); CTA-1; CTLA-4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); 사이토케라틴 8 (PCT 공개 번호 WO 03/024191); D1.1; D 1 56-22; DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res. 35(3):249-262); 췌장암에서 발견되는 E 1 시리즈 (혈액군 B); EGFR (상피 성장 인자 수용체; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); 에프린 수용체 (및 특히 EphA2 (미국 특허 번호 7,569,672; PCT 공개 번호 WO 06/084226); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-1338); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-128); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-1025); 강글리오시드 GD2 (GD2; Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen," J.Immunol., 151, 3390-3398); 강글리오시드 GD3 (GD3; Shitara et al. (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities," Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380); 강글리오시드 GM2 (GM2; Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside," J. Clin. Oncol. 12:1036-1044); 강글리오시드 GM3 (GM3; Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers," Cancer Res. 53:5244-5250); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma," J. Clin. Immunol. 2:135-140); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); Gp37 (인간 백혈병 T 세포 항원; Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)," J. Immunol. 141:1398-1403); gp75 (흑색종 항원; Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product," J. Exp. Med. 171(4):1375-1380); gpA33 (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium," Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia," J. Clin. Pathol. 59(3):260-263); HER2 항원 (HER2/neu, p185HER2; Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); HMFG (인간 유지방 소구체 항원; WO1995015171); 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; HMW-MAA (고분자량 흑색종 항원; Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance," Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies," J. Clin. Invest. 86:2136-2144); I 항원 (분화 항원; Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens," Nature 314:53-57); IL13Rα2 (PCT 공개 번호 WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) "Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis," PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) "High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis," Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) "IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2," J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) "Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas," Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) "A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis," Cancer Res. 69(22):8678-8685); 인테그린 β6 (PCT 공개 번호 WO 03/087340); JAM-3 (PCT 공개 번호 WO 06/084078); KID3 (PCT 공개 번호 WO 05/028498); KID31 (PCT 공개 번호 WO 06/076584); KS 1/4 pan-암종 항원 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker," J. Immunol. 142:3662-3667; Moller et al. (1991) "Bi-specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); L6 및 L20 (인간 폐암종 항원; Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res. 46:3917-3923); LEA; LUCA-2 (미국 특허 공개 번호 2006/0172349; PCT 공개 번호 WO 06/083852); M1:22:25:8; M18; M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; 메조텔린 (Chang K, and Pastan I. 1996 "Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers," Proc Natl Acad Sci USA 93:136-40), MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Myl; N-아세틸글루코사미닐트란스페라제 (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); 네오당단백질; 선암종에서 발견되는 NS-10; OFA-1; OFA-2; 온코스타틴 M (온코스타틴 수용체 베타; 미국 특허 번호 7,572,896; PCT 공개 번호 WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); p97 (흑색종-관련 항원; Estin et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97," J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454); PEM (다형성 상피 뮤신; Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property," Trends in Biochem. Sci. 17:359-363); PEMA (다형성 상피 뮤신 항원); PIPA (미국 특허 번호 7,405,061; PCT 공개 번호 WO 04/043239); PSA (전립선-특이적 항원; Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Res. 53:227-230; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (전립선-특이적 막 항원; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180); 전립선산 포스페이트 (Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone," Nucl. Acids Res. 18(16):4928); 흑색종에서 발견된 R 24 ; ROR1 (미국 특허 번호 5,843,749); 스핑고지질; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); 피부 T 세포 림프종으로부터의 T 세포 수용체 유도 펩타이드 (Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy," Cancer J Sci Am. 4:62-71 참조); 골수 세포에서 발견된 T 5 A 7 ; TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms," Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (혈액군 A); TNF-수용체 (TNF-α 수용체, TNF-β 수용체; TNF-γ 수용체 (van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (혈액군 H); 트란스페린 수용체 (미국 특허 번호 7,572,895; PCT 공개 번호 WO 05/121179); 5T4 (TPBG, 영양세포 당단백질; Boghaert, E.R. et al. (2008) "The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin," Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) "Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin," Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6); TSTA (종양-특이적 이식 항원), 예컨대 바이러스-유도된 종양 항원, 이를테면 T-항원 DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원, 태아종양 항원-알파-태아단백질, 예컨대 결장의 CEA, 방광 종양 태아종양 항원 (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res. 45:2210-2188); VEGF (Pietrantonio, F. et al. (2015) "Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272-281; Grabowski, J.P. (2015) "Current Management Of Ovarian Cancer," Minerva Med. 106(3):151-156; Field, K.M. (2015) "Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies," Cancer 121(7):997-1007; Suh, D.H. et al. (2015) "Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014," J. Gynecol. Oncol. 26(2):156-167; Liu, K.J. et al. (2015) "Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer," Tumour Biol. 36(3):1323-1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) "Bevacizumab treatment in the elderly patient with metastatic colorectal cancer," Clin. Interv. Aging 10:127-133); VEGF 수용체 (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998); VEP8; VEP9; VIM-D5; 및 배아 암종 세포에서 발견되는 Y 합텐, Le y .
특정 구체예에서, 발명의 이러한 항-PD-1-결합 분자는 5T4, B7H3, CD19, CD20, CD51, CD123, DR5, EGFR, EpCam, GD2, gpA33, HER2, ROR-1, TAG-72, VEGF-A 항체 및/또는 VEGFR2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 분자와 조합하여 사용된다.
발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 면역원성 제제, 예컨대 종양 백신과 조합될 수 있다. 이러한 백신은 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자 포함), 자가조직 또는 동종이계 종양 세포를 포함할 수 있다. 많은 종양 백신 전략이 기술되었다 (예를 들어, Palena, C., et al., (2006) "Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies," Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I., et al. (2011) "Cancer immunotherapy comes of age," Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) "The anti-tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derived peptides," Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L.　et al.　(2002) "Generation of T-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines," J. Clin. Oncol.　20,　2624-2632; Vermeij, R. et al. (2012) "Potentiation of a p53-SLP vaccine by cyclophosphamide in ovarian cancer: a single-arm phase II study." Int. J. Cancer 131, E670-E680 참조). 발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 화학치료 처방과 조합될 수 있다. 이 경우에, 투여되는 화학치료제의 용량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).
발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 다른 면역자극성 분자, 예컨대 T-세포 활성화의 증가된 수준을 제공하도록 숙주 면역 반응성을 활성화시키는 항체와 조합될 수 있다. 특히, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체는 면역계를 활성화시킨다는 것이 입증되었다 (예컨대 del Rio, M-L. et al. (2005) "Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation," Eur.J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) "Restoring functionin exhausted CD8 T cells duringchronic viral infection," Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) "Involvement Of PD-L1 On TumorCells In The Escape From Host Immune System And TumorImmunotherapy By PD-L1 Blockade," Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al., (1996) "Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade," Science 271, 1734-1736). 발명의 PD-1-결합 분자와 조합될 수 있는 추가적인 면역자극성 분자는 수지상세포 (DC) 기능 및 항원 제공을 활성화시키는, 수지상세포의 표면 상의 분자에 대한 항체, T 세포 헬퍼 활성을 대체할 수 있는 항-CD40 항체, 및 T 세포 동시자극 분자, 예컨대 PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB 및 ICOS에 대한 활성화 항체 (예를 들어, Ito et al. (2000) "Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By SubcutaneousAdministration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies,"Immunobiology 201:527-40; U.S. Pat. No. 5,811,097; Weinberg et al. (2000) "Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity," Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) "Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors," Nature Medicine 3: 682-685; Hutloffet al. (1999) "ICOS Is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And FunctionallyRelated To CD28," Nature 397: 263-266; 및 Moran, A.E. et al. (2013) "The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy," CurrOpin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004) 및/또는 항원 결합시 T-세포를 자극하는 역할을 하는 다양한 동시자극 단백질 수용체 (예컨대, CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, 등)로부터의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인에 융합된 질환 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 자극성 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다 (예를 들어, Tettamanti, S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor," Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) "Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells," Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) "T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia," Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo," Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).
발명의 이러한 PD-1-결합 분자는 표적 면역치료 반응을 전환시키기 위해 억제 키메라 항원 수용체 (iCAR)와 조합될 수 있다. iCAR은 항원 결합시 T 세포 반응을 제한하는 역할을 하는 다양한 억제 단백질 수용체 (예컨대, CTLA-4, PD-1, 등)의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인에 융합된 질환 항원에 대해 지시된 항원 결합 도메인을 포함한다 (예를 들어 Fedorov V.D. (2013) "PD-1- and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses," Sci. Tranl. Med. 5:215ra172 doi:10.1126/ scitranslmed.3006597 참조).
특히, 발명의 이러한 항-PD-1 결합 분자는 항-CD137 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-OX40 항체, 항-LAG-3 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체 및/또는 암 백신과 조합하여 사용된다.
B. 진단 및 치료진단 유용성
본 발명의 특정 PD-1-결합 분자는 PD-1과 PD-L1 리간드 사이의 결합을 차단하는 능력이 거의 없는 것을 나타낸다. 이와 같이, 항체 PD-1 mAb 2 및 PD-1 mAb 4, 그것들의 인간화된 유도체, 및 그것들의 PD-1-결합 단편 (예컨대, 이중특이적 디아바디, 등)을 포함하거나 또는 이러한 항체들과의 결합에 대해 경쟁하는 분자들은 검출 가능하게 표지될 수 있고 (예컨대, 방사성, 효소적, 형광, 화학발광, 상자성, 반자성 또는 다른 표지화 모이어티로) 샘플 중의 PD-1의 검출에 또는 세포상의 PD-1의 영상화에 사용될 수 있다. 이러한 분자는 PD-1의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않기 때문에, 그것들은 특히 대상체에서 PD-1 발현의 정도, 위치 및 변화를 측정하는 방법에 유용하다 (예컨대 대상체는 PD-1의 발현 또는 표적화와 관련된 암에 대해 치료된다).
XII. 제약학적 조성물
발명의 조성물은 제약학적 조성물의 제조에 유용한 대량의 약물 조성물 (예컨대, 불순하거나 또는 비-멸균 조성물) 및 단위 투약 형태의 제조에 사용될 수 있는 제약학적 조성물 (즉, 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 본 발명의 PD-1-결합 분자, 또는 이러한 제제의 조합의 예방적 또는 치료적 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게는, 발명의 조성물은 본 발명의 PD-1-결합 분자의 예방적 또는 치료적 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 발명은 특히 PD-1-결합 분자가 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15; a 인간화된 PD-1 mAb 1; PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15; 임의의 이러한 항체의 PD-1-결합 단편; 또는 PD-1-결합 분자가 이중특이적 PD-1 디아바디 (예컨대, PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디)인 이러한 제약학적 조성물을 포함한다. 특히 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15 항체; 인간화된 PD-1 mAb 1; PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 3개의 CDRLs 및 3개의 CDRHs를 포함하는 이러한 분자들이 포함된다.
발명은 또한 추가적으로 특정 암 항원에 특이적인 제2 치료 항체 (예컨대 종양-특이적 단클론성 항체), 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 그런 제약학적 조성물을 포함한다.
특이적 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용되는"은 미국 연방정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 및 더 특별하게는 인간에서의 사용에 대하여 일반적으로 인정되는 다른 약전에 나열되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대, 프로인트 보조제 (완전 및 불완전), 부형제 또는 비히클을 말한다. 이러한 제약학적 담체는 멸균된 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 물은 제약학적 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한, 특히, 주사 용액에 대하여, 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 제약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이 조성물들은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지효성 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 발명의 조성물의 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 봉지(sachette)와 같은 용봉된(hermetically sealed) 용기 내 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서, 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균된 제약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 멸균된 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화 제2 철, 아이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
발명은 또한 본 발명의 PD-1-결합 분자 (및 더 바람직하게는, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15; 인간화된 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15 항체; 임의의 이러한 항체의 PD-1-결합 단편; 또는 PD-1-결합 분자가 이중특이적 PD-1 디아바디 (예컨대, PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아비디)인 것)가 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩(pack) 또는 키트를 제공한다. 특히 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 또는 PD-1 mAb 15의 3개의 CDRL 및 3개의 CDRH를, 단독으로 또는 이러한 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 그런 분자가 포함된다. 추가적으로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 제약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 발명은 또한 발명의 제약학적 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지가 이러한 용기(들)와 선택적으로 연관될 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 PD-1-결합 분자 중 어느 것도 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 PD-1-결합 분자 중 어느 것도 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기에, 암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 및/또는 치료제를 더 포함할 수 있고; 및/또는 키트는 암과 관련된 하나 이상의 암 항원에 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학치료제이다. 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.
XIII. 투여 방법
발명의 융합 단백질 또는 컨쥬게이션된 분자, 또는 발명의 융합 단백질 또는 컨쥬게이션된 분자를 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및 개선을 위한 본 발명의 조성물이 제공될 수 있다. 바람직한 측면으로, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 효과를 제한하거나 원치않는 부작용을 유발하는 물질이 실질적으로 없다). 특이적 구체예에서, 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예컨대, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류 (예컨대, 시노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 인간, 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
다양한 전달 시스템, 예컨대, 리포솜에의 캡슐화, 미립자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포 내 섭취(endocytosis) (예컨대, Wuet al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성, 등이 공지되어 있으며 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 분자를 투여하는 방법은 비경구 투여 (예컨대, 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외, 및 점막 (예컨대, 비강 내 및 경구 경로)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특이적 구체예에서, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 근육 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝(lining) (예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 연무제(aerosolizing agent)가 들어있는 제형의 사용에 의한 폐 투여가 또한 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참조하고, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명은 또한 본 발명의 PD-1-결합 분자가 분자의 양을 표시하는 용봉된 용기, 예컨대 앰플 또는 봉지에 포장된다는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 분자는 용봉된 용기 내에서 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 예를 들어, 대상체에게 투여하기에 적절한 농도로 물 또는 식염수로 복원될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 PD-1-결합 분자는 용봉된 용기 내 건조한 멸균 동결건조 분말로서 공급된다.
본 발명의 동결건조된 PD-1-결합 분자는 원래의 용기에서 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야 하고 분자는 복원된 후 12시간 내, 바람직하게는 6시간 내, 5시간 내, 3시간 내, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안의 구체예에서, 이러한 분자는 분자, 융합 단백질, 또는 컨쥬게이션된 분자의 양 및 농도를 표시하는 용봉된 용기 내 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 이러한 PD-1-결합 분자는 액체 형태로 제공될 때 용봉된 용기로 공급된다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 개선에 효과적일 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기법으로 결정될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각도에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 제약학적 조성물의 "유효량"은, 한 구체예에서는, 제한 없이, 질환으로부터 유발되는 증상의 감소, 감염의 증상 (예컨대, 바이러스량, 열, 통증, 패혈증, 등) 또는 암의 증상 (예컨대, 암세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이, 등)을 약화시켜서, 질환으로 고통받고 있는 것들의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물의 용량 감소, 표적화 및/또는 내재화를 통해 또 다른 약물의 효과 향상, 질환의 진행의 지연 및/또는 개체의 생존 연장과 같은 임상 결과를 포함하는, 이로운 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은, 직접적으로 또는 간접적으로, 바이러스 존재의 증식 (또는 효과)를 감소시키고 바이러스 질환의 발달을 감소시키고 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성되지 않을 수 있다. 그러므로, "유효량"은 하나 이상의 화학치료제의 투여의 맥락에서 고려될 수 있으며, 하나 이상의 다른 제제와 함께, 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된 경우, 단일 제제는 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다. 개개의 요구는 각기 다르지만, 각 구성성분의 유효량의 최적의 범위의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
발명에 포함된 PD-1-결합 분자에 대하여, 환자에게 투여되는 투약량은 바람직하게는 수령체 대상체의 체중 (kg)을 기준으로 결정된다. 발명에 포함된 PD-1-결합 분자에 대하여, 환자에게 투여되는 투약량은 전형적으로 대상체의 체중의 적어도 약 0.01 ㎍/kg, 적어도 약 0.05 ㎍/kg, 적어도 약 0.1 ㎍/kg, 적어도 약 0.2 ㎍/kg, 적어도 약 0.5 ㎍/kg, 적어도 약 1 ㎍/kg, 적어도 약 2 ㎍/kg, 적어도 약 5 ㎍/kg, 적어도 약 10 ㎍/kg, 적어도 약 20 ㎍/kg, 적어도 약 50 ㎍/kg, 적어도 약 0.1 mg/kg, 적어도 약 1 mg/kg, 적어도 약 3 mg/kg, 적어도 약 5 mg/kg, 또는 적어도 약 10 mg/kg, 적어도 약 30 mg/kg, 적어도 약 50 mg/kg, 적어도 약 75 mg/kg, 적어도 약 100 mg/kg, 적어도 약 125 mg/kg, 적어도 약 150 mg/kg 체중 이상이다.
본 발명의 PD-1-결합 분자의 투약량 및 투여 빈도는 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 분자의 흡수 및 조직 침투를 향상시킴으로써 감소되거나 변화될 수 있다.
환자에게 투여되는 발명의 PD-1-결합 분자의 투약량은 단일 제제 치료법으로서의 사용에 대하여 계산될 수 있다. 대안으로, 분자는 다른 치료적 조성물과 조합하여 사용될 수 있으며 환자에게 투여되는 투약량은 상기 분자가 단일 제제 치료법으로서 사용될 때보다 더 적다.
발명의 제약학적 조성물은 치료가 필요한 지역에 국소적으로 투여될 수 있다; 이것은, 예를 들면, 그리고 제한이 아니라, 국소적 주입, 주사, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 실라스틱 막, 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴 재료이다. 바람직하게는, 발명의 분자를 투여할 때, 분자를 흡수하지 않는 재료를 사용하기 위해 주의를 기울여야 한다.
발명의 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조).
발명의 조성물은 방출-제어 또는 지효성 시스템으로 전달될 수 있다. 발명의 PD-1-결합 분자(들) 중 하나 이상을 포함하는 지효성 제형을 제조하기 위해서 당업자에게 공지된 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938; PCT 공보 WO 91/05548; PCT 공보 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조 (이것들은 각각 전문이 본원에 참조로 포함됨). 한 구체예에서, 방출-제어 시스템에서 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 또 다른 구체예에서, 폴리머 재료가 분자의 방출-제어를 달성하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지효성 제형에 사용된 폴리머의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오쏘에스터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 방출-제어 시스템은 치료 표적 (예컨대, 폐)의 근처에 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 단지 일부만을 필요로 한다 (예컨대 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 방출-제어 이식물로서 유용한 폴리머 조성물이 Dunnet al.에 따라 사용될 수 있다 (U.S. 5,945,155 참조). 이 특정한 방법은 폴리머 시스템으로부터 생체활성 재료의 제자리(in situ) 방출-제어의 치료적 효과를 기반으로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 처치가 필요한 환자의 신체 내 어느 곳에서든 일어날 수 있다. 비-폴리머 지속성 전달 시스템이 사용될 수 있으며, 이에 의해 대상체의 신체에서 비-폴리머 이식물은 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에서 이식할 때, 이식물의 유기 용매는 조성물로부터 주위의 조직액으로 소멸되거나, 분산되거나 또는 침출될 것이며, 비-폴리머 재료는 서서히 응고되거나 침전되어 고체의 미소다공성 매트릭스를 형성한다 (U.S. 5,888,533 참조).
방출-제어 시스템은 Langer에 의한 리뷰 (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533)에서 논의된다. 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지효성 제형을 제조하기 위해서 당업자에게 공지된 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938; 국제 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들은 각각 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 조성물이 본 발명의 PD-1-결합 분자를 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 핵산이 세포 내에 있도록 핵산을 투여함으로써, 예컨대, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주사에 의해, 또는 미립자 충격 (예컨대, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 사용, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 트랜스펙션제로의 코팅에 의해, 또는 핵산을 핵에 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩타이드와 결합시켜 투여함으로써 (예컨대, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조), 등에 의해 생체 내에 투여되어 암호화된 PD-1-결합 분자의 발현을 촉진할 수 있다. 대안으로, 핵산은 세포 내로 도입되고 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내에 통합된다.
본 발명의 PD-1-결합 분자의 치료적 또는 예방적 유효량으로 대상체의 처리는 1회 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는, 일련의 처리를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 더 바람직하게는 약 3 내지 7주 동안, 및 더 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안 주 1회 이러한 디아바디로 처리된다. 발명의 제약학적 조성물은 하루에 1회, 하루에 2회, 또는 하루에 3회 투여될 수 있다. 대안으로, 제약학적 조성물은 주 1회, 주 2회, 격주 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 매 2개월에 1회, 연 2회 또는 연 1회 투여될 수 있다. 치료에 사용된 분자의 유효량은 특정 치료의 과정 동안에 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
실시예
다음의 실시예는 발명의 진단 또는 치료 방법 중의 조성물에 대한 다양한 방법을 예시한다. 실시예들은 발명의 범주를, 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니라, 예시하기 위해 의도된다.
실시예 1
항-인간 PD-1 단클론성 항체의 특성화
15개의 쥐과의 단클론성 항체를 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로서 분리하고, 표시 "PD-1 mAb 1", "PD-1 mAb 2", "PD-1 mAb 3", "PD-1 mAb 4", "PD-1 mAb 5", "PD-1 mAb 6", "PD-1 mAb 7", "PD-1 mAb 8", "PD-1 mAb 9", "PD-1 mAb 10", "PD-1 mAb 11", "PD-1 mAb 12", "PD-1 mAb 13", "PD-1 mAb 14" 및 "PD-1 mAb 15"를 부여하였다. 이 항체들의 CDR은 상이한 것으로 나타났고 상기에서 제공된다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1의 세포외 도메인에 대한 결합을 다음과 같이 평가하였는데, 평평한 바닥 맥시솝(maxisorb) 96-웰 플레이트를 가용성 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 (His 태그에 융합된 인간 PD-1 (shPD-1 His) 또는 인간 Fc 영역에 융합된 인간 PD-1 (shPD-1 hFc)의 세포외 도메인), 또는 인간 Fc 영역에 융합된 시노몰구스 원숭이 PD-1 (scyno-PD1 Fc)의 세포외 도메인)으로 각각 0.5 또는 1 ㎍/mL로 코팅하고, 플레이트를 세척 후 분리된 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15 중 하나와 인큐베이션하였다. 이 연구를 위해 항-PD-1 항체를 3, 1.0, 0.3333, 0.1111, 0.0370, 0.0123 또는 0.0041 ㎍/mL (3배 연속 희석)로 활용하였다. 고정된 PD-1 (인간 또는 시노몰구스 원숭이에 결합하는 항체의 양을 염소 항-마우스 IgG-HRP 이차 항체를 사용하여 산정하였다. 모든 샘플을 플레이트 판독기 (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers) 상에서 분석하였다. 가용성 인간 및 가용성 시노몰구스 PD-1에 대한 대표적인 결합 곡선을 도 7A 내지 7D 및 도 8A 내지 8C에 각각 도시한다.
이 결합 분석들의 결과 (도 7A 내지 7D 및 도 8A 내지 8C)는 모든 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15가 가용성 인간 및 가용성 시노몰구스 원숭이 PD-1 둘 다에 결합하는 것을 보여준다.
쥐과의 항-PD-1 항체를 한층 더 특성화하기 위하여 가용성 인간 PD-L1의 가용성 인간 PD-1에 대한 결합을 차단하는 능력을 두 상이한 분석에서 평가하였다. 한 분석에서 표면상에 고정된 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 항체가 차단하는 능력을 조사하였다. 이 분석을 위해 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15의 각각, 또는 참조 항-PD-1 항체 (PD-1 mAb A)를 shPD-1 His 융합 단백질과 (2.5 μg/mL에서) 혼합하고, 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트상에 고정된 1 ㎍/mL의 비오틴 표지된 가용성 인간 PD-L1 (인간 Fc (sPD-L1)에 융합된 PD-L1의 세포외 도메인)과 함께 별도로 인큐베이션하였다. 이 연구들에 대해 항-PD-1 항체를 10, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 또는 0.1563 ㎍/mL (2배 연속 희석)로 이용하였다. 고정된 sPD-L1에 대한 shPD-1 His 결합의 양을 항-His-Tag-HRP 이차 항체를 사용하여 His-태그를 통해 산정하였다. 모든 샘플을 플레이트 분석기 (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers)상에서 분석하였다. 이 실험의 결과를 도 9A 내지 9D에 도시한다.
이 억제 분석들의 결과 (도 9A-9D)는 항-PD-항체 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 및 PD-1 mAb 15가 가용성 인간 PD-1에 대한 가용성 인간 PD-L1의 결합을 달라지는 정도로 차단할 수 있었던 한편, PD-1 mAb 2 및 PD-1 mAb 4는 이 분석 포맷에서 차단 활성의 거의 내지는 전혀 나타내지 않았다.
제2 분석에서 NSO 세포 표면에 발현된 PD-1에 대한 PD-1리간드 (즉 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2)의 결합을 차단하는 쥐과의 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15의 능력을 조사하였다. 이 분석을 위해 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15의 각각, 또는 참조 항-PD-1 항체 (PD-1 mAb A 또는 PD-1 mAb B)를 각각 0.1 ㎍/테스트의 비오티닐화된-가용성 인간 PD-L1 (shPD-L1 융합 단백질) 또는 비오티닐화된-가용성 인간 PD-L2-muIgFc 융합 단백질 (shPD-L2; Ancell Cat# 573-030)과 별도로 혼합하고, 인간 PD-1을 발현하는 NSO 세포와 함께 (~250,000 세포/웰) 차단 완충액 (FACS + 10% 인간 혈청 알부민)에서 인큐베이션하였다. 이 연구들에 대해 항-PD-1 항체를 4.0, 1.0, 2.5 x10-1, 6.25 x 10-2, 1.56 x 10-2, 3.90 x 10-3, 9.76 x 10-4, 2.4 x 10-4, 0.6 x 10-4 ㎍/테스트 (4배 연속 희석)로 이용하였다. NSO 세포 표면에 대한 shPD-L1 (또는 shPD-L2) 결합의 양을 FACS 분석에 의해 PE-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 이차 항체를 사용하여 측정하였다. PD-1/PD-L1 결합의 억제에 대한 IC50 값을 측정하고 적어도 두 실험의 샘플 평균 (□)을 하기 표 6에 제시한다 (표시된 경우를 제외함).
항-PD-1 항체 IC50 (μg/테스트) 항-PD-1 항체 IC50 (μg/테스트)
PD-1 mAb A 0.0044 PD-1 mAb 8 0.6611 ‡
PD-1 mAb B 0.0064 PD-1 mAb 9 0.0154
PD-1 mAb 1 0.0048 PD-1 mAb 10 0.0057
PD-1 mAb 2 0.0110 PD-1 mAb 11 0.0259 ‡
PD-1 mAb 3 0.0361 ‡ PD-1 mAb 12 0.0238 ‡
PD-1 mAb 4 0.0156 ‡ PD-1 mAb 13 0.0117
PD-1 mAb 5 0.0039 PD-1 mAb 14 0.0149 ‡
PD-1 mAb 6 0.0051 PD-1 mAb 15 0.0060
PD-1 mAb 7 0.0024
‡ 단일 실험으로부터의 결과.
shPD-L1 억제 분석의 결과 (표 6)는 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 11, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14 및 PD-1 mAb 15가 NSO 세포 표면에 발현된 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합을 차단할 수 있었음을 보여준다. 특히, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 10 및 PD-1 mAb 15는 shPD-L1 결합 역시 차단하였고 참조 PD-1 항체 (PD-1 mAb A, PD-1 mAb B)보다 더 낫게 차단한 한편, PD-1 mAb 8은 본질적으로 이 분석 포맷에서 차단하지 않았다. PD-1 mAb 2 및 PD-1 mAb 4는 둘 다 이 분석 포맷에서 PD-1/PD-L1 결합을 차단할 수 있었다.
유사하게, 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2 및 PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 10, PD-1 mAb 12, PD-1 mAb 13, PD-1 mAb 14는 NSO 세포 표면에 발현된 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L2의 결합을 차단할 수 있었던 한편, 이 분석 포맷에서 PD-1 mAb 8은 본질적으로 차단하지 않았다. 특히, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7 및 PD-1 mAb 10은 shPD-L2 결합 역시 차단하였고, 또는 참조 PD-1 항체 (PD-1 mAb A, PD-1 mAb B)보다 더 낫게 차단하였다. PD-1 항체 PD-1 mAb 11 및 PD-1 mAb 15는 이 분석에서 테스트하지 않았다. hPD-1 mAb 15를 포함하여 여러 인간화된 항-PD-1 항체에 대한 결과를 하기에 제공한다.
실시예 2
인간화 및 추가의 특성화
항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15의 가변 도메인을 인간화하였는데, 항원성 에피토프들을 확인하였고 항체들을 추가로 탈면역시켜서 최종 인간화된 가변 도메인을 생성하였다. PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2 및 PD-1 mAb 15의 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 1 VH1" 및 "hPD-1 mAb 1 VL1"; "hPD-1 mAb 2 VH1" 및 "hPD-1 mAb 2 VL1"; 및 "hPD-1 mAb 15 VH1" 및 "hPD-1 mAb 15 VL1"로 표시된 각 항체에 대한 하나의 인간화된 VH 도메인 및 하나의 인간화된 VL 도메인을 산출하였다. PD-1 mAb 7의 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 7 VH1" 및 "hPD-1 mAb 7 VH2"로 표시된 두 인간화된 VH 도메인 및 본원에서 "hPD-1 mAb 1 VL1" "hPD-1 mAb 7 VL2" 및 "hPD-1 mAb 7 VL3"으로 표시된 3개의 인간화된 VL 도메인을 산출하였다. PD-1 mAb 9의 인간화는 본원에서 "hPD-1 mAb 9 VH1" 및 "hPD-1 mAb 9 VH2"로 표시된 두 개의 인간화된 VH 도메인 및 본원에서 "hPD-1 mAb 9 VL1" 및 "hPD-1 mAb 1 VL2"로 표시된 두 개의 인간화된 VL 도메인을 산출하였다. 다중 인간화된 가변 도메인이 생성된 경우에 특정 항-PD-1 항체 (예컨대, PD-1 mAb 7)의 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 임의의 조합으로 사용될 수 있고 인간화된 사슬들의 특정 조합은 특이적 VH/VL 도메인을 참조로 언급되는데, 예를 들면 hPD-1 mAb 7 VH1 및 hPD-1 mAb 7 VL2를 포함하는 인간화된 항체는 "hPD-1 mAb 7(1.2)"로 특이적으로 언급된다. 전체 길이 인간화된 항체는 L234A/L235A 치환을 포함하는 인간 IgG1 불변 영역 (IgG1 (AA)) 또는 S228P 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역 (IgG4 (P)) 중 어느 하나로 생성되었다.
전체 길이 IgG1 인간화된 항체 중쇄를 다음과 같이 구성하였다: 인간화된 VH 도메인의 C-말단을 변종 CH2-CH3 도메인을 가지고 C-말단 리신 잔기가 없는 인간 IgG1 불변 영역의 N-말단에 융합시켰다 (SEQ ID NO:255):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPE AA GG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG.
SEQ ID NO:255에서, 아미노산 잔기 1 내지 98은 IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:10)에 상응하였고, 아미노산 잔기 99 내지 113은 IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO:32)에 상응하였으며 아미노산 잔기 114 내지 329는 L234A/L235A 치환 (밑줄)을 포함하는 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:5)에 상응하지만 C-말단 리신 잔기가 없다.
L234A/L235A 돌연변이를 포함하고 C-말단 리신 잔기가 없는 IgG1 중쇄 불변 영역을 가지는 예시의 인간화된 항체 ((hPD-1 mAb 7(1.2))의 중쇄의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:265)이다:
Figure 112018079289569-pat00005
SEQ ID NO: 265에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 hPD-1 mAb 7 VH1의 VH 도메인 (SEQ ID NO: 147)에 상응하였고, 아미노산 잔기 120 내지 217은 IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO: 10)에 상응하였으며, 잔기 218 내지 232는 IgG1 힌지 영역 (SEQ ID NO: 32)에 상응하였고 잔기 233 내지 448은 L234A/L235A 치환을 포함하는 IgG1 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:5)에 상응하지만 C-말단 리신 잔기가 없다.
전체 길이 IgG4 인간화된 항체 중쇄를 다음과 같이 구성하였다: 인간화된 VH 도메인의 C-말단을 안정화된 힌지 영역 (S228P 치환을 포함함)을 가지고 C-말단 리신 잔기가 없는 인간 IgG4 불변 영역의 N-말단에 융합시켰다 (SEQ ID NO:256):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEFLGGPSV
FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK
NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG.
SEQ ID NO:256에서, 아미노산 잔기 1 내지 98은 IgG4 CH1 도메인 (SEQ ID NO:254)에 상응하였고, 아미노산 잔기 99 내지 110은 S228P 치환 (밑줄)을 포함하는 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13)에 상응하였으며 아미노산 잔기 111 내지 326은 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:4)에 상응하지만 C-말단 리신 잔기가 없는다.
S228P 돌연변이를 가지는 안정화된 힌지 영역을 포함하고 C-말단 리신 잔기가 없는 IgG4 중쇄 불변 영역을 가지는 예시의 인간화된 항체 ((hPD-1 mAb 7(1.2))의 중쇄의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:266)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL
DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA
STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG
LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCP P CPA PEFLGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN
QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG.
SEQ ID NO:266에서, 아미노산 잔기 1 내지 119는 hPD-1 mAb 7 VH1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:147)에 상응하였고, 아미노산 잔기 120 내지 217은 IgG4 CH1 도메인 (SEQ ID NO:254)에 상응하였으며, 아미노산 잔기 218 내지 229는 S228P 치환 (밑줄)을 포함하는 안정화된 IgG4 힌지 영역 (SEQ ID NO:13)에 상응하였고, 아미노산 잔기 230 내지 445는 IgG4 CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:4)에 상응하지만 C-말단 리신 잔기가 없다.
전체 길이 인간화된 항체 경쇄는 다음과 같이 구성하였다: 인간화된 VL 도메인의 C-말단을 인간 경쇄 카파 영역 (SEQ ID NO:8)의 N-말단에 융합시켰다. 동일한 경쇄는 IgG1 (AA) 및 IgG4 (P) 중쇄와 쌍을 이룬다.
카파 불변 영역을 가지는 예시의 인간화된 PD-1 항체 (hPD-1 mAb 7(1.2))의 경쇄의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:264)이다:
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS
GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC.
SEQ ID NO:264에서, 아미노산 잔기 1 내지 111은 hPD-1 mAb 7 VL2 (SEQ ID NO:153)의 VL 도메인에 상응하였고, 아미노산 잔기 112 내지 218은 경쇄 카파 불변 영역 (SEQ ID NO: 8)에 상응하였다.
대안 불변 영역, 예를 들면 엔지니어링된 Fc 영역을 가지는 항-PD-1 항체는 상이한 불변 영역을 통합시킴으로써 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환, 추가 또는 결실을 도입함으로써 쉽게 생성된다. 예를 들어, 이중특이적 항체가 바람직한 경우에 헤테로다이머화를 용이하게 하기 위해 놉-함유 및 홀-함유 CH2-CH3 도메인이 사용된다. 쥐과의 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항-PD-1 항체는 상기 기술된 바와 같이 생성된다.
인간화된 항체 (IgG1 (AA) 및/또는 IgG4 (P))를 상기에서 기술한 바와 같이 결합 및 차단 활성에 대하여 테스트하였다. 인간 PD-1 (shPD-1 His 및 shPD-1 hFc) 및 시노몰구스 원숭이 PD-1 (shPD-L1 hFc)에 대한 인간화된 항체의 결합은 상응하는 쥐과의 항체의 그것과 비슷하였다. 이에 더불어, 인간화된 항체는 ELISA 분석에서 인간 PD-L1의 인간 PD-1에 대한 결합을 차단하는 능력을 보유하였다.
쥐과의 항체 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9, PD-1 mAb 15, 인간화된 항체 hPD-1 mAb 2, hPD-1 mAb 7(1.2), hPD-1 mAb 9(1.1), hPD-1 mAb 15 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B의 결합 동역학을 Biacore 분석을 사용하여 조사하였다. 항-PD-1 항체들을 고정된 단백질 A 상에 포획하였고 Fc 부분을 제거하기 위하여 절단된 His-태그된 가용성 인간 PD-1 (shPD-1-His) 또는 가용성 인간 시노몰구스 원숭이 PD-1 Fc 융합물 (scyno PD-1 hFc)과 인큐베이션하고, 결합의 동역학을 Biacore 분석을 통하여 측정하였다. 추가적인 연구에서 항-PD-1 항체 hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P), PD-1 mAb A IgG1 (AA), PD-1 mAb A IgG4 (P), PD-1 mAb B IgG1 (AA) 및 PD-1 mAb B IgG4 (P)를 고정된 F(ab)2 염소 항-인간 Fc 상에 포획하였고 결합 동역학을 상기 기술한 바와 같이 Biacore 분석에 의해 측정하였다. 이 연구들로부터 계산된 ka, kd 및 KD를 하기 표 7에 제시한다.
단백질 A 포획
항-PD-1 항체 인간 a 시노몰구스 원숭이 b
k a (x104) k d (x10-4) KD (nM) k a (x104) k d (x10-4) KD (nM)
PD-1 mAb A 60 18 3 14 9.6 6.9
PD-1 mAb B 140 35 2.5 37 12 3.2
PD-1 mAb 7 21 2.8 1.3 17 6 3.5
hPD-1 mAb 7(1.2) 110 4.3 0.39 37 6.4 1.7
PD-1 mAb 9 4.3 4.2 9.8 2.2 16 72.7
hPD-1 mAb 9(1.1) 1.8 6.5 36.1 1.5 11 73.3
PD-1 mAb 15 4.5 1.3 2.9 2.7 11 40.7
hPD-1 mAb 15 2.4 3.2 13.3 2.3 18 78.3
PD-1 mAb 2 5.5 5.6 10.2 4.2 6.0 14.3
hPD-1 mAb 2 3.2 1.6 5.0 2.3 3.9 17
F(ab) 2 염소 항-인간 Fc 포획
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 13 8.4 6.5 8.1 4.5 5.6
PD-1 mAb A IgG4 (P) 13 7.9 6.1 8.4 5.0 6.0
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 25 28 11.2 20 6.4 3.2
PD-1 mAb B IgG4 (P) 26 25 9.6 20 7.9 4.0
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 25 3.8 1.5 16 7.8 4.9
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 27 4.1 1.5 17 7.8 4.6
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 5.6 6.1 10.9 5.6 5.2 9.3
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 6.1 5.8 9.5 4.9 7.4 15.1
a His 태그된 가용성 인간 PD-1 (shPD-1 His)
b 절단된 가용성 시노몰구스 원숭이 PD-1 (scyno PD-1 hFc)
결과는 PD-1 mAb 7 및 인간화된 hPD-1 mAb 7(1.2)이 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B에 비하여 더 나은 결합 동역학을 나타내는 것을 증명한다. PD-1 mAb 2 및 hPD-1 mAb 2는 참조 항-PD-1 항체의 약 2배 내에서 결합 동역학을 나타낸 한편, PD-1 mAb 9, hPD-1 mAb 9(1.1), PD-1 mAb 15 및 hPD-1 mAb 15는 참조 항-PD-1 항체의 약 2 내지 6배 내에서 결합 동역학을 나타낸다.
항-인간 PD-1 항체 PD-1 mAb 7의 조직 특이성을 조사하였다. 정상 조직을 PD-1 mAb 7 또는 아이소타입 대조표준 (0.313 ㎍/mL)과 접촉시키고 염색 정도를 가시화하였다. 블록살(Bloxall)을 결장 조직에서 비-특이적인 뮤신 염색을 감소시키기 위한 내인성 효소 차단에 사용하였다. 도 10A, 패널 i 내지 xii에서 도시된 바와 같이, PD-1 mAb 7 또는 아이소타입 대조표준은 둘 다 정상 결장, 간, 폐, 췌장, 신장 및 심장 조직의 세포를 표지하지 못하였다. 이에 더불어, PD-1 mAb 7 또는 아이소타입 대조표준은 정상 피부를 염색하지 못하였다 (도 10B, 패널 i 내지 ii). 대조적으로, PD-1 mAb 7은 정상 편도선 조직 및 PD-1을 발현하는 PDCD1 트랜스펙션된 NSO 세포에 존재하는 림프구를 강하게 표지하는 것으로 발견된 한편 (도 10B, 패널 iii 및 v), 아이소타입 대조표준은 어느 것도 표지하지 못하였다 (도 10B, 패널 iv 및 vi). 그러므로 도 10A 내지 10B에 제시된 결과는 PD-1 mAb 7이 림프구 및 PD-1 발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있었음을 나타낸다.
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1, (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P), hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B의 결합 포화 프로파일을 조사하였다. 간단히 설명하면, 항-PD-1 항체, PD-1 mAb 1 내지 15의 각각 또는 참조 항-PD-1 항체 (PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B)를 인간 PD-1을 발현하는 NSO 세포와 (~250,000 세포/웰) 차단 완충액 (FACS + 10% 인간 혈청 알부민)에서 혼합하였다. 이 연구들을 위해 항-PD-1 항체를 50, 12.5, 3.13, 2.0 x10-1, 4.9 x 10-2, 1.2 x 10-2, 3.0 x 10-3, 1.9 x 10-4, 7.6 x 10-4, 4.75 x 10-5 또는 1.19 x 10-5 μg/테스트 (4배 연속 희석)로 이용하였다. NSO 세포의 표면에 결합하는 항체의 양을 염소 항-인간-APC 이차 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 측정하였다. 대표적인 포화 곡선을 도 11에 나타낸다. EC50 및 EC90 값을 측정하고 별도의 4개의 실험으로부터의 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 하기 표 8에 제시한다.
포화 결합
EC50 (μg/테스트) EC90 (μg/테스트)
항-PD-1 항체 SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.1991 0.1309 1.4528 0.8040
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.1581 0.1161 1.5464 1.7690
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.1347 0.0681 1.3917 0.9573
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.1398 0.0951 1.1619 1.2681
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.4431 0.1997 2.4374 1.2637
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.1069 0.0500 0.9102 0.5476
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.1872 0.1553 0.6810 0.3226
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.1376 0.0926 0.6609 0.3437
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 0.3123 0.2291 1.6486 0.9117
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.5128 0.2228 3.0563 0.9437
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.2927 0.1333 2.0640 0.6096
결합 포화 연구들은 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15의 인간화된 버전이 세포 표면 PD-1에 대한 결합에 대해 선호하는 프로파일을 가진 것을 입증한다. 특히, IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P) Fc 영역 중 어느 하나를 가지는 인간화된 PD-1 mAb 7 (hPD-1 mAb 7(1.1) 및 hPD-1 mAb 7(1.2)는 조사된 모든 항체 중에서 가장 낮은 EC90 값을 가진다.
인간화된 항-PD-1 항체 hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1, (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 및 hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA)를 한층 더 특성화하기 위하여, NSO 세포의 표면에서 발현된 PD-1에 대한 인간 PD-L1 (shPD-L1) 및 인간 PD-L2 (shPD-L2)의 결합을 차단하는 능력을 조사하였다. 이 분석들은 본질적으로 상기에서 기술된 바와 같이 수행하였다. NSO 세포에서 발현된 PD-1에 대한 shPD-L1 및 shPD-L2 결합의 억제에 대한 대표적인 곡선을 각각 도 12A 및 12B에 도시한다. EC50 및 IC90 값을 측정하고 별도의 3개의 실험으로부터의 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 하기 표 9에 제시한다.
sPD-L1 sPD-L2
IC50 (μg/테스트) IC90 (μg/테스트) IC50 (μg/테스트) IC90 (μg/테스트)
항-PD-1 항체 SM SD σ SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.0203 0.0089 0.2985 0.3279 0.0414 0.0124 0.1601 0.066
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.0156 0.0096 0.0776 0.0208 0.0280 0.0070 0.1594 0.1153
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.0148 0.0008 0.1034 0.0100 0.0280 0.0059 0.1190 0.060
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.0143 0.0013 0.0798 0.0239 0.0280 0.0055 0.0924 0.0065
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.0578 0.0124 0.2480 0.050 0.1294 0.0143 0.3813 0.0656
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.0166 0.0032 0.0674 0.0041 0.0283 0.0147 0.0886 0.0166
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.0118 0.0027 0.0678 0.0031 0.0212 0.0031 0.0672 0.0043
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.0103 0.0023 0.0520 0.0033 0.0213 0.0019 0.0616 0.0063
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 0.0593 0.0036 0.3238 0.0508 0.4002 0.5000 0.4573 0.1805
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.0460 0.0118 0.2461 0.0513 0.1105 0.0146 0.2914 0.0526
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.0440 0.0092 0.2068 0.035 0.0945 0.0022 0.3093 0.0588
리간드 결합 억제 연구는 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15의 인간화된 버전이 세포 표면의 PD-1에 대한 sPD-L1 및 sPD-L2의 결합을 억제할 수 있음을 입증한다. 특히, 인간화된 PD-1 mAb 7 (hPD-1 mAb 7(1.1) 및 hPD-1 mAb 7(1.2))은 조사된 모든 항체의 가장 낮은 IC90 값을 가진다.
실시예 3
인간화된 항-인간 PD-1 항체에 의한 PD-1/PD-L1 체크포인트의 차단
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1, (AA), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA), hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P), hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 및 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B가 PD-1/PD-L1 축을 길항하는 (즉 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하고 T-세포 반응의 하향-조절을 방지하는) 능력을 Jurkat-luc-NFAT/ CHO-PD-L1 루시페라제 리포터 분석으로 조사하였다. 간단히 설명하면, PD-L1 (CHO/PD-L1)을 발현하는 CHO 세포를 100 μL의 배양 배지 (RPMI + 10% FBS + 100 ㎍/mL 하이그로마이신 B + 100 ㎍/mL G418)에 40,000/웰로 플레이팅하고 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 배지를 제거하고 MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat 세포 (Promega)를 50,000 세포/웰로 40 μL의 분석 완충액 (RPMI + 2% FBS)에 넣고 항-PD-1 항체 PD-1 mAb 1 내지 15 또는 참조 항-PD-1 항체 (PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B) (0 내지 25 ㎍/mL; 분석 완충액에 8회의 2.5배 연속 희석)를 각 웰에 추가하고 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 5 내지 10분 동안 주변 온도에서 인큐베이션하였다. 다음에 80 μL의 BioGlo 기질 (Promega)을 각 웰에 추가하고 플레이트를 추가의 5 내지 10분 동안 주변 온도에서 인큐베이션한 후, 발광을 Victor 플레이트 판독기에서 측정하였다. 대표적인 포화 곡선을 도 13에 도시한다. EC50 및 EC90 값을 측정하고 별도의 4개의 실험으로부터의 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 하기 표 10에 제시한다.
항-PD-1 항체 리포터 신호전달
EC50 (μg/테스트) EC90 (μg/테스트)
SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.2549 0.0480 2.4474 1.2228
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.2049 0.0719 2.5535 1.2139
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 0.2119 0.1781 2.2036 2.0118
PD-1 mAb B IgG4 (P) 0.1142 0.0323 0.9418 0.2863
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.3539 0.0983 3.8975 2.0054
hPD-1 mAb 7(1.1) IgG1 (AA) 0.1080 0.0386 1.1992 0.5103
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.0944 0.0153 0.6452 0.2615
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.0965 0.0169 0.6885 .01858
hPD-1 mAb 9 IgG1 (AA) 0.2835 0.0530 2.9968 0.8866
hPD-1 mAb 9 IgG4 (P) 0.3154 0.0872 5.0940 4.0496
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 0.2585 0.0592 3.3138 1.0532
리포터 신호전달 연구는 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15의 인간화된 버전이 PD-1/PD-L1 축을 차단하고 T-세포 반응의 하양-조절을 방지할 것임을 입증한다. 특히, IgG1 (AA) 또는 IgG4 (P) Fc 영약 중 어느 하나를 가지는 인간화된 PD-1 mAb 7 (hPD-1 mAb 7(1.1) 및 hPD-1 mAb 7(1.2)가 가장 낮은 EC50/EC90 값을 가진다.
실시예 4
항-인간 PD-1 항체의 기능적 활성
스타필로코쿠스 아우레우스 장독소 B형 (SEB)은 SEB-반응성 도너에서 T-세포의 큰 집단 (5 내지 30%)을 활성화할 수 있는 미생물의 수퍼항원이다. SEB는 펩타이드 결합 그로브 밖에서 MHC II에 결합하고, 그러므로 MHC II 의존적이지만, 제한받지 않으며 TCR 매개된다. T-세포의 SEB-자극은 올리고클론성 T-세포 증식 및 사이토카인 생성을 초래한다 (비록 도너의 가변성이 관찰되고 일부 도너는 반응하지 않을 것이지만). SEB-자극 후 48시간 이내에 PMBC는 PD-1과 LAG-3을 상향 조절하고 이때 96-웰 플레이트에서 SEB-자극으로 이차 배양 후 5일 째에 추가의 향상이 보인다. PBMC의 SEB-자극 후 면역 체크 포인트 단백질 PD-1 및 LAG-3의 상향조절은 재자극시 사이토카인 방출을 제한한다. 항-PD-1 항체 단독 및 항-LAG-3 항체와 조합되었을 때의 체크포인트 억제를 통한 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을 조사하였다.
간단히 설명하면, PBMC를 Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) 밀도 구배 원심분리 방법을 사용하여 제조자의 설명서를 따라 건강한 도너 (Biological Specialty Corporation)로부터의 서면 동의하에 얻어진 전혈로부터 정제한 다음 T 세포를 Dynabeads® Untouched T 세포 키트 (Life Technologies)를 사용하여 제조자의 설명서를 따라 정제하였다. 정제된 PBMC를 T-25 벌크 플라스크 중의 RPMI-배지 + 10% 열 비활성화 FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 2 내지 3일 동안 단독으로 또는 0.1 ng/mL의 SEB (Sigma-Aldrich)와 함께 (일차 자극) 배양하였다. 제1 라운드의 SEB-자극이 끝났을 때 PBMC를 PBS로 2회 세척하고 즉시 96-웰 조직 배양 플레이트에 1 내지 5 x 105 세포/웰의 농도로 배지 단독에, 대조표준 또는 항-PD-1 항체가 들어있는 배지에, 0.1 ng/mL의 SEB (이차 자극)이 있으며 항체가 없는 배지에, 또는 SEB와 대조 IgG 또는 항-PD-1 항체 +/- an 항-LAG-3 mAb가 들어있는 배지에 플레이팅한 후, 추가의 2 내지 3일 동안 배양하였다. 이차 자극이 끝났을 때, 상층액을 수득하여 IFNγ, TNFα, IL-10 및 IL-4 (R&D Systems)에 대한 인간 DuoSet ELISA 키트를 사용하여 제조자의 지시를 따라 사이토카인 분비를 측정하였다.
PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15가 단독으로, 또는 특유한 항-LAG-3 항체 LAG-3 mAb 1과 함께 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을 조사하였다. 이 연구들은 또한 다음 참조 항-PD-1 항체 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함하였다: PD-1 mAb A; PD-1 mAb B; 및 LAG-3 mAb A. 도 14는 다음으로 처리된, 대표적으로 반응하는 도너 (D:38941)로부터의 SEB-자극된 (0.1 ng/mL) PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일을 나타낸다: 항체 없음; 아이소타입 대조표준 항체; PD-1 mAb 7 및/또는 LAG-3 mAb 7; PD-1 mAb 9 및/또는 LAG-3 mAb 1; PD-1 mAb 15 및/또는 LAG-3 mAb 1; PD-1 mAb 2 및/또는 LAG-3 mAb 1; 또는 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb B 및/또는 LAG-3 mAb A (항체들은 10 ㎍/mL로 사용하였다).
추가의 연구에서 인간화된 버전의 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15 (인간 IgG1 (AA) 또는 인간 IgG4 (P) Fc 영역을 포함함)와, 뿐만 아니라 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B의 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을 조사하였다. 이 연구들에 대해 항체를 0.625, 2.5, 및 10 ㎍/mL로 이용하였다. 도 15A 내지 15B는 항체로 처리되지 않았거나 다음 항체들 중 하나로 처리된, 대표적인 반응 도너 (D:57709)로부터의 SEB-자극된 (0.2 ng/mL) PBMC로부터의 IFNγ (도 15A) 및 TNFα (도 15B) 분비 프로파일을 나타낸다: 아이소타입 대조표준; hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA); hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA); hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P); hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA); hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P); hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA); 또는 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A IgG1 (AA), PD-1 mAb A IgG4 (P), PD-1 mAb B IgG1 (AA), PD-1 mAb B IgG4 (P). SEB+Ab로 처리된 샘플의 IFNγ의 총 pg/mg을 0.625, 2.5 및 10 ㎍/mL의 항-PD-1 항체로 처리한 샘플에 대해 측정하였고, 3개의 상이한 반응 도너로부터의 샘플 평균 (SM) 및 표준 편자 (SD σ) (표시된 경우 제외함)를 표 11에 제시한다. 참조 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A 및 PD-1 mAb B (즉 인간화된 항-PD-1/PD-1 mAb A 및 인간화된 항-PD-1/PD-1 mAb B)를 능가하는, 인간화된 버전의 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15 (인간 IgG1 (AA) 또는 인간 IgG4 (P) Fc 영역을 포함함)로 처리된 샘플에서 분비된 IFNγ의 비율을 각각 표 12 및 표 13에 제시한다.
IFNγ 분비 (pg/mL)
μg/mL 항-PD1 항체 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
항-PD-1 항체 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 221.18 110.89 341.13 247.93 347.46 144.72
PD-1 mAb A IgG4 (P) 281.36 132.65 495.15 190.57 399.41 117.56
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 366.69 196.64 387.682 215.51 387.32 282.81
PD-1 mAb B IgG4 (P) 348.40 185.96 433.382 163.23 551.68 125.08
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 302.05 185.71 610.70 209.77 414.63 272.65
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 384.57‡ 323.79‡ 411.40 398.59 370.06 108.12
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 340.81 207.76 442.598 303.70 655.29 567.91
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 309.82 130.30 468.62 350.15 424.35 288.95
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 360.00 274.28 373.32 160.25 541.83 444.22
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 275.88 135.23 372.73 53.53 496.70 235.37
대조표준 IgG 137.14 76.61 100.65 48.67 138.10 120.81
항체 없음 120.05 73.90 120.05 73.90 109.46 85.18
‡ 반응하는 두 도너로부터의 결과
IFNγ 분비 비율 (새로운 항-PD-1/PD-1 mAb A)
μg/mL 항-PD1 항체 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
항-PD-1 항체 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00
PD-1 mAb A IgG4 (P) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 1.77 0.92 1.28 0.36 1.07 0.42
PD-1 mAb B IgG4 (P) 1.23 0.16 0.92 0.27 1.40 0.12
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 1.36 0.37 2.46 1.85 1.17 0.41
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 1.20‡ 0.35‡ 0.79 0.54 0.95 0.22
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 1.48 0.19 1.46 0.71 1.70 0.84
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 1.13 0.13 0.91 0.42 1.02 0.46
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 1.50 0.39 1.51 1.23 1.48 0.71
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 1.32 0.53 1.48 0.86 1.42 0.12
대조표준 IgG 0.63 0.2 0.33 0.08 0.39 0.24
항체 없음 0.54 0.12 0.39 0.14 0.31 0.17
‡ 반응하는 두 도너로부터의 결과
IFNγ 분비 비율 (새로운 항-PD-1/PD-1 mAb B)
μg/mL 항-PD1 항체 0.625 μg/mL 2.5 μg/mL 10 μg/mL
항-PD-1 항체 SM SD σ SM SD σ SM SD σ
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 0.37 0.37 0.82 0.20 1.06 0.48
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.82 0.12 1.16 0.38 0.72 0.07
PD-1 mAb B IgG1 (AA) 1.0 0.00 1.0 0.00 1.0 0.00
PD-1 mAb B IgG4 (P) 1.0 0.00 1.0 0.00 1.0 0.00
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 0.84 0.22 1.77 0.81 1.11 0.07
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.91‡ 0.26‡ 0.83 0.50 0.68 0.17
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA) 1.04 0.59 1.12 0.29 1.60 0.42
hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P) 0.92 0.09 0.99 0.36 0.75 0.39
hPD-1 mAb 15 IgG1 (AA) 1.01 0.48 1.07 0.57 1.34 0.15
hPD-1 mAb 2 IgG1 (AA) 0.78 0.12 1.10 0.38 1.46 0.53
대조표준 IgG 0.39 0.08 0.27 0.08 0.34 0.13
항체 없음 0.34 0.11 0.31 0.03 0.28 0.08
‡ 반응하는 두 도너로부터의 결과
이 연구들의 결과는 PD-1 항체 PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 및 PD-1 mAb 15가 재자극시 SEB-자극된 PBMC로부터 IFNγ (도 14 및 15A 및 표 11 내지 13) 및 TNFα (도 15B)를 극적으로 향상시켰음을 입증한다. 이에 더불어, 항-PD-1 항체와 항-LAG-3 항체의 조합은 재자극시 SEB-자극된 PBMC로부터의 사이토카인 방출의 추가의 향상을 초래하였다 (도 14). 특히, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 9 또는 PD-1 mAb 15와 특유한 항-LAG-3 항체 LAG-3 mAb 1과의 조합이 가장 큰 향상을 제공하였다.
실시예 5
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자 결합 연구
3, 4 및 5개의 사슬 및 이중특이적 항체를 포함하는 Fc 영역-함유 디아바디를 포함하여, 여러 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자를 생성하였다. 4개의 사슬을 가지며 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 4개의 디아바디를 생성하고 표시 "DART A" "DART B" "DART C 및 "DART I"를 부여하였다. 4개의 사슬을 가지며 CH1/CL 도메인을 포함하는 4개의 디아바디를 생성하였고 표시 "DART D" "DART E" "DART J" 및 "DART 1"을 부여하였다. 5개의 사슬을 가지며 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인 및 CH1/CL 도메인을 포함하는 2개의 디아바디를 생성하고 표시 "DART F" 및 "DART G"를 부여하였다. 3개의 사슬을 가지며 E/K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 한 디아바디를 생성하였고 표시 "DART H"를 부여하였다. 4개의 사슬을 가지는 하나의 이중특이적 항체를 생성하였고 표시 "BSAB A"를 부여하였다. 이 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들의 구조 및 아미노산 서열을 상기에서 제공하였고 하기 표 14에서 요약한다.
명칭 모 mAbs Fcγ 사슬 SEQ ID NO: 다른 성분
DART A hPD-1 mAb 7(1.2)
hLAG-3 mAb 1(1.4)		 IgG4 (YTE) 4 267 (X1=A; X2=Y; X3=T; X4=E) 및 268 E/K-코일; 도 3B 참조
DART B hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.3) IgG4 (YTE) 4 267 (X1=G; X2=Y; X3=T; X4=E) 및 268 E/K-코일; 도 3B 참조
DART C hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.3) IgG4 4 267 (X1=G; X2=M; X3=S; X4=T) 및 268 E/K-코일; 도 3B 참조
DART D hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (YTE) 4 269 및 270 CL/CH1; 도 3C 참조
DART E hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (YTE) 4 271 및 272 CL/CH1; 도 3C 참조
DART F hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA/ YTE) 5 273, 274, 275, 및 276 CL/CH1 및 E/K-코일; 도 5 참조
DART G hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA/ YTE) 5 277, 278, 279, 및 280 CL/CH1 및 E/K-코일; 도 5 참조
DART H hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 3 281, 282, 및 283 E/K 코일; 도 4A 참조
DART I hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (YTE) 4 290 및 291 E/K-코일; 도 3B 참조
DART J hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (YTE) 4 292 및 293 CL/CH1; 도 3C 참조
DART 1 PD-1 mAb ALAG-3 mAb A IgG1 (AA) 4 284 및 285 CL/CH1; 도 3C 참조
BSAB A hPD-1 mAb 7(1.2)hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1
(AA)		 4 286, 287, 288, 및 289 전하 엔지니어링된 Fc 영역을 가지는 mAb
‡ IgG4 Fc 영역을 통합시키는 분자들은 또한 안정화된 IgG4 힌지 영역을 통합시킨다.
대안 PD-1 및/또는 LAG-3 에피토프-결합 부위를 포함하는 추가의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들은 상이한 VH 및 VL 도메인을 통합시킴으로써 쉽게 생성될 수 있다. 유사하게, LAG-3 이외의 항원을 결합하는 분자들은 원하는 특이성을 가지는 VH 및 VL을 통합시킴으로써 생성될 수 있다.
PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I 및 DART 1; 항-PD-1 항체: hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA), PD-1 mAb A IgG1 (AA) 및 PD-1 mAb A IgG4 (P); 및 항-LAG-3 항체: hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P), LAG-3 mAb A IgG4 (P), hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 및 LAG-3 mAb A IgG1 (AA)의 결합 포화 프로파일을 본질적으로 상기에서 기술한 바와 같이 조사하였다. PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물을 PD-1 및 LAG-3 결합 둘 다에 대해 테스트하는 한편, 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체는 단지 그것들의 각각의 항원에 대한 결합에 대해서만 테스트하였다. 이 연구들에 대해 PD-1 또는 LAG-3을 발현하는 NSO 세포를 이용하였다. 디아바디 및 항체를 170.0 내지 0.013 μM 또는 85.0 내지 0.0021 μM (4배 연속 희석)로 이용하였다. EC50 및 EC90 값을 측정하고 하기 표 15 및 표 16에 제시한다. 둘 이상의 별도의 실험을 수행한 경우에 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 제시한다.
분자 포화 결합 PD-1
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 1.9297 0.4324 9.6027 0.4801
DART B 1.7640§ 12.2700§
DART D 2.2267 0.4140 10.9313 2.6351
DART E 3.2180 0.5742 23.840 3.2385
DART F 1.4320§ 14.5800§
DART G 1.1488 0.6227 3.4220 2.4600
DART H 4.5310§ 22.6600§
DART I 1.3232 0.4890 7.8135 4.0821
DART 1 2.1329 1.4850 13.8113 9.0256
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 1.2083 0.8112 3.9340 1.8746
PD-1 mAb A IgG4 (P) 2.3470 1.2362 22.7770 15.0690
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA) 1.0879 0.3958 7.4153 3.0794
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.6733 0.5464 9.9543 6.6569
§ 단일 실험으로부터의 결과
분자 포화 결합 LAG-3
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 0.8402 0.2231 4.4448 2.4770
DART B 1.0750§ 9.8580§
DART D 0.8985 0.5326 5.7967 4.7329
DART E 0.9250 0.8075 5.6450 5.6809
DART F 5.0090 0.5770 19.3350 4.7447
DART G 0.9396 0.3045 8.5507 4.7448
DART H 2.3840§ 9.7810 4.2412
DART I 0.5321 0.0547 4.198 3.2188
DART 1 20.0233 2.1454 115.97 15.2425
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P) 1.0057 0.1969 5.1360 4.7904
LAG-3 mAb A IgG4 (P) 0.5968 0.1376 2.0833 0.3244
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 0.6069 0.3430 3.6373 2.4762
LAG-3 mAb A IgG1 (AA) 0.4523 0.1660 2.0187 0.7035
§ 단일 실험으로부터의 결과
결합 포화 연구는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물이 PD-1에 대한 결합을 보유하고 모 항-PD-1 항체의 결합 프로파일에 유사한 결합 프로파일을 가지는 것을 입증한다. 유사하게, PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물은 LAG-에 대한 결합을 보유하며, 이때 DART 1은 예외이고, 모 항-LAG-3 항체의 결합 프로파일에 유사한 결합 프로파일을 가진다.
실시예 6
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자 억제 연구
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 및 BSAB A; 및 항-PD-1 항체: hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA), PD-1 mAb A IgG1 (AA) 및 PD-1 mAb A IgG4 (P)가 NSO 세포 표면에 발현된 PD-1에 대한 인간 PD-L1 (shPD-L1) 및 인간 PD-L2 (shPD-L2)의 결합을 차단하는 능력을 본질적으로 상기에서 기술한 바와 같이 조사하였다. 디아바디 및 항체를 33.75 내지 0.002 μM 또는 107.5 내지 0.0001 μM (4배 연속 희석)로 이용하였다.
IC50 및 IC90 값을 측정하고 하기 표 17에 제시한다. 둘 이상의 별도의 실험을 수행한 경우에 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 제시한다.
분자 차단 sPD-L1/PD-1 결합 차단 sPD-L2/PD-1 결합
IC50 (μM) IC90 (μM) IC50 (μM) IC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ SM SD σ SM SD σ
DART A 0.9645 0.1485 5.6312 1.5247 1.6273 0.4285 6.9335 3.9849
DART B 1.1515 0.0007 4.8615 0.2199 2.1150 0.3154 7.9550 0.0933
DART D 1.5548 0.1692 7.8950 2.5135 3.1255 0.5869 9.2973 5.5426
DART E 1.6533 0.3307 7.8470 1.1642 2.9460 0.7736 6.6135 0.0177
DART F 0.5697 0.1729 2.0360 0.1174 0.8389 0.0846 1.7995 0.2171
DART G 1.6013 0.3581 8.1953 1.5708 2.5540 0.7891 7.4810 0.2333
DART H 3.3950 0.1018 18.640 9.5742 6.2065 3.6847 29.395 3.8679
DART I 0.8363 0.1302 5.3115 0.3125 1.286 0.3125 6.2485 1.3951
DART 1 1.7467 0.3097 5.4533 1.0214 2.8355 1.8250 7.2735 3.9831
BSAB A 2.1590 0.3097 11.075 0.8132 4.8775 0.5438 15.580 1.3294
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.5186 0.1668 3.8050 1.2227 1.0425 0.2563 3.4880 0.5459
PD-1 mAb A IgG4 (P) 0.9209 0.3256 4.3023 0.7069 1.3859 0.3882 5.1675 0.2943
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1(AA) 0.7320 0.2337 3.2048 1.1479 0.9769 0.2893 2.8437 1.4801
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.0765 0.2393 5.2775 0.9933 1.9510 0.8814 5.0880 1.3831
리간드 결합 억제 연구는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물이 세포 표면에서 PD-1에 대한 sPD-L1 및 sPD-L2의 결합을 억제하는 능력을 보유한 것을 입증한다.
이에 더불어, PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 및 BSAB A; 및 항-LAG-3 항체: hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P), LAG-3 mAb A IgG4 (P), hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 및 LAG-3 mAb A IgG1 (AA)가 Daudi 세포 표면 상에서 천연 MHC 클래스 II에 대한 인간 LAG-3의 결합을 차단하는 능력을 조사하였다. 간단히 설명하면, PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자 및 대조표준 항-LAG-3 항체를 각각 비오티닐화된-가용성 인간 LAG-3-Fc 융합 단백질 (shLAG-3), (0.5 ㎍/ml에서)과 혼합하고, 별도로 MHC II-포지티브 Daudi 세포 (2.5 x 106 세포)와 함께 인큐베이션하였다. Daudi 세포의 표면에 대한 LAG-3 결합의 양을 PE-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 이차 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 측정하였다. 디아바디 및 항체를 27.5 내지 0.026 μM (2배 연속 희석) 또는 107.5 내지 0.0001 μM (4배 연속 희석) 또는 35 내지 0.002 μM (4배 연속 희석)로 이용하였다.
IC50 및 IC90 값을 측정하고 하기 표 18에 제시한다. 둘 이상의 별도의 실험을 수행한 경우에 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 제시한다.
분자 차단 shLAG-3/MHC 클래스 II 결합
EC50 (μM) EC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 1.3835 1.6465 8.396102 8.3962
DART B 0.4081 0.1104 3.0645 0.3924
DART D 1.1843 1.1398 8.0041 7.3317
DART E 3.2706 2.9177 28.9683 24.1694
DART F 1.5347 1.2674 10.3920 11.2555
DART G 2.0618 3.3552 11.4422 12.4964
DART H 2.8967 4.9817 17.2533 21.1420
DART I 0.4864 0.1549 2.339 1.1780
DART 1 15.9610 14.0883 87.1486 109.533
BSAB A 0.7101 0.0571 7.2470 1.0706
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4 (P) 0.4815 0.2176 3.4837 1.7564
LAG-3 mAb A IgG4 (P) 0.7011 0.1900 2.4232 0.3481
hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG1 (AA) 0.3637 0.1409 9.4422 7.9319
LAG-3 mAb A IgG1 (AA) 0.5923 0.3407 2.1451 1.1139
리간드 결합 억제 연구는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물이 세포 표면에서 MHC 클래스 II에 대한 shLAG-3-Fc 융합 단백질의 결합을 억제하는 능력을 보유한 것을 입증한다. DART 1의 예외로, PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자가 모 항-LAG-3 항체와 유사한 억제 프로파일을 가진다.
실시예 7
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자에 의한 PD-1/PD-L1 체크포인트의 차단
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 및 BSAB A; 및 항-PD-1 항체: hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA), PD-1 mAb A IgG1 (AA) 및 PD-1 mAb A IgG4 (P)가 PD-1/PD-L1 축을 길항하는 (즉 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하고 T-세포 반응의 하향-조절을 방지하는) 능력을 본질적으로 상기에서 기술된 바와 같이 Jurkat-luc2-NFAT/CHO-PD-L1 루시페라제 리포터 분석으로 (CHO/PD-L1 세포 및 MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat 세포를 사용하여) 조사하였다. 디아바디 및 항체를 100 내지 0.0065 μM (4배 연속 희석) 또는 100 내지 0.0013 μM (5배 연속 희석)로 이용하였다.
IC50 및 IC90 값을 측정하고 하기 표 19에 제시한다. 둘 이상의 별도의 실험을 수행한 경우에 샘플 평균 (SM) 및 표준 편차 (SD σ)를 제시한다.
분자 리포터 신호전달
IC50 (μM) IC90 (μM)
SM SD σ SM SD σ
DART A 0.8804 0.1949 7.9115 1.3232
DART B 1.079 0.1535 7.5413 3.1483
DART D 1.4044 0.2584 12.0786 3.6616
DART E 1.4060 0.1222 13.7867 1.4981
DART F 0.3404 0.0103 1.8710 0.481
DART G 0.6914 0.0206 4.2090 0.7331
DART H 36.6167 20.8078 968.300 811.8471
DART I 1.3335 0.3641 12.146 6.8787
DART 1 11.8807 3.4905 1048.2000 1508.9992
BSAB A 9.7825 1.0288 113.3350 22.2951
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) 0.6460 0.3035 6.0736 2.5513
PD-1 mAb A IgG4 (P) 1.328 0.7439 16.5138 9.7149
hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1(AA) 0.5214 0.1541 4.7592 2.1044
PD-1 mAb A IgG1 (AA) 1.4514 1.0049 35.7382 40.9858
리포터 신호전달 연구는 대부분의 PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물이 세포 표면에서 PD-1에 대한 sPD-L1의 결합을 억제하는 능력을 보유한 것을 입증한다. 사가(tetravalent) PD-1 x LAG-3 이중특이적 디아바디 구성물, DART A, DART B, DART D, DART-E, DART F, DART G 및 DART I는 이 분석에서 가장 강력한 억제제였다. PD-L2 리포터 분석으로 조사한 이 이중특이적 구성물 중 여럿에 대해 유사한 결과를 얻었다.
실시예 8
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들의 기능적 활성
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들이 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을, 표기된 것을 제외하고 본질적으로 상기에서 기술된 바와 같이 재자극시 SEB-자극된 PBMC에서 조사하였다.
초기 연구에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART A, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H; 및 항-PD-1 및 항-LAG 항체: PD-1 mAb A IgG4 (P) 및 LAG-3 mAb A IgG4 (P)가 단독으로 또는 조합하여, 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을 조사하였다. 이 분석에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들 및 항체를 3.125, 12.5 또는 50 nM의 총 농도로 사용하였고 PBMC를 0.2 ng/mL의 SEB (이전 연구에서는 0.1 ng/mL로 사용함)로 자극하였다. 이 연구들에 대해, 항체 조합을 사용한 경우에 각 항체는 총 농도의 절반으로 제공하였다 (즉 1.563, 6.25 또는 25 nM). 도 16A 및 16B는 두 대표적인 반응하는 도너, D: 35644 및 D: 59697로부터의 각각의 SEB-자극된 PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일을 나타낸다.
주지한 바와 같이, 모든 도너가 0.1 또는 0.2 ng/mL에서 SEB에 반응하지는 않았다. 더 많은 수의 도너로부터의 PBMC의 SEB 자극을 향상시키기 위하여 SEB를 추가의 연구에서는 85 ng/mL의 고농도 또는 0.5 ng/mL의 중간 농도에서 사용하였다. 이 농도들에서 도너 대 도너 가변성이 여전히 나타날 수 있지만, SEB 자극은 더 많은 도너에 걸쳐 더 왕성하다.
한 연구에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART A, DART B; 항-PD-1 항체: hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P); 항-LAG-3 항체: LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P); 및 PD-1 mAb A IgG4 (P)와 LAG-3 mAb A IgG4 (P)의 조합이 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키는 능력을 조사하였다. 이 분석들에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들 및 항체를 0.019, 0.078, 0.3125, 1.25, 5 또는 20 nM의 총 농도로 사용하였고 PBMC를 85 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이 분석을 위해 항체의 조합을 사용하는 경우 각 항체를 표시된 농도로 제공하였고 그로써 총 항체 농도는 각 항체에 대해 사용된 농도의 2배이다 (즉 0.038, 0.156, 0.625, 2.5, 10 또는 40 nM). 도 17A 및 17B는 두 대표적인 도너, D: 55515 및 D: 54024로부터의 SEB 자극된 PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일을 나타낸다.
또 다른 연구에서 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키기 위하여 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART A, DART B, DART C; 항-PD-1 항체: hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P); 항-LAG-3 항체: LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P); PD-1 mAb A IgG4 (P)와 LAG-3 mAb A IgG4 (P)의 조합을 조사하였다. 이 분석들에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들 및 항체들은 0.048, 0.195, 0.78, 3.125, 12.5 또는 50 nM의 총 농도로 사용하였고 PBMC를 0.5 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이 연구들을 위해, 항체 조합이 사용되는 경우에 각 항체는 총 농도의 절반으로 제공된다 (즉 0.024, 0.098, 0.39, 1.563, 6.25 또는 25 nM). 도 18A 및 18B는 두 대표적인 도너, D: 20990 및 D: 54947로부터의 SEB-자극된 PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일을 나타낸다.
추가의 연구로, 사이토카인 IL-2의 방출을 조사하였다. 구체적으로, 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키기 위하여 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART D, DART H; 항-PD-1 항체: PD-1 mAb A IgG4 (P), hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P); 항-LAG-3 항체: LAG-3 mAb A IgG4 (P) 및 LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P); 및 PD-1 mAb A IgG4 (P) 및 LAG-3 mAb A IgG4 (P), 그리고 hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P) 및 LAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)의 조합을 조사하였다. 이 분석들에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들 및 항체들은 3.125, 12.5 또는 50 nM의 총 농도로 사용하였고 PBMC를 85 ng/mL의 고농도의 SEB로 자극하였다. 이 연구들을 위해, 항체 조합이 사용되는 경우에 각 항체는 총 농도의 절반으로 제공된다 (즉 1.563, 6.25 또는 25 nM). 도 19는 대표적인 도너 (D: 54024)로부터의 SEB-자극된 PBMC로부터의 IL-2 분비 프로파일을 나타낸다.
추가의 연구에서 체크포인트 억제를 통해 사이토카인 방출을 향상시키기 위하여 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들: DART B 및 DART I; 항-PD-1 항체: PD-1 mAb A IgG4 (P) 및 hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P); 항-LAG-3 항체: LAG-3 mAb A IgG4 (P), hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P) 및 hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (P); 및 thPD-1 mAb A IgG4 (P)와 LAG-3 mAb A IgG4 (P)의 조합, hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)와 hLAG-3 mAb 1(1.4) IgG4(P)의 조합 및 hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4(P)와 hLAG-3 mAb 6(1.1) IgG4 (P)의 조합을 조사하였다. 이 분석들에서 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들 및 항체들을 0.0061, 0.024, 0.09, 0.39, 1.56, 6.25 또는 25 nM의 농도로 사용하였고 PBMC를 0.5 ng/mL의 SEB로 자극하였다. 이 연구들을 위해, 항체 조합이 사용되는 경우에 각 항체는 표시된 농도로 제공하고 그로써 총 항체 농도는 각 항체에 대해 사용된 농도의 2배이다 (즉 0.0122, 0.048, 0.18, 0.78, 3.12, 12.5 또는 50 nM). 도 20은 대표적인 도너 D: 56041로부터의 SEB-자극된 PBMC로부터의 IFNγ 분비 프로파일을 나타낸다.
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자 DART I; 항-PD-1 항체 PD-1 mAb A IgG4와 항-LAG-3 항체 LAG-3 mAb A IgG4 (P)의 조합; 및 네거티브 대조표준 항체가 항원-특이적 T 세포 반응을 향상시키는 능력을 파상풍-변독소 리콜 분석을 사용하여 조사하였다. 특히, 사이토카인의 항원-특이적 향상된 분비의 반응을 리콜 항원으로서 공동배양 분석 시스템에서 파상풍 변독소를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, CD4 메모리 T 세포 (0.5 내지 1.0 X105 세포/웰)를 네거티브 선택 분리 키트 (Miltenyi Biotec, San Diego, CA 및 Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 인간 말초혈로부터 분리하고 동일한 도너로부터의 방사선 조사된 단핵세포 (0.01 내지 0.05X105 세포/웰, 3500 rads)와 함께 5 ㎍/mL의 리콜 항원 파상풍 변독소 (TTd) 및 희석된 (25 nM에서 시작함) DART I, PD-1 mAb A IgG4 + LAG-3 mAb A IgG4(P) 또는 아이소타입 대조표준의 존재 또는 부재하에 5 내지 7일 동안 배양하였다. 병렬 플레이트에서, 삼중수소화된 티미딘의 통합을 통해 증식을 측정하고 IL-2 및 IFNγ를 ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 5 내지 7일에 측정하였다. 도 21A 내지 21D는 두 대표적인 도너 (D50702 및 D54267)로부터의, 7일째의 IFNγ (도 21A, 21C) 및 IL-2 (도 21B, 21D) 분비 프로파일을 나타낸다.
이 연구들의 결과는 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들이 재자극시 SEB-자극된 PBMC로부터의 IFNγ (도 16A 내지 16B, 17A 내지 17B, 18A 내지 18B, 20) 및 IL-2 (도 19) 생성을 극적으로 향상시켰음을 증명한다. 이에 더불어, PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들은 파상풍 변독소로 자극된 CD4 메모리 T 세포로부터 IFNγ 생성을 극적으로 향상시켰다 (도 21A 및 21C). 특히, 사가 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들은 항-PD-1 항체와 항-LAG-3 항체의 조합보다 큰 향상을 제공하였다.
실시예 9
PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들의 약물동역학
대표적인 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자, DART I 및 대표적인 항-PD-1 항체, PD-1 mAb A의 약물동역학을 시노몰구스 원숭이에서 조사하였다. 간단하게 설명하면, 두 시노몰구스 원숭이 (수컷 한 마리와 암컷 한 마리)를 단일 용량의 DART I (5 mg/kg) 또는 PD-1 mAb A (10 mg/kg) 및 혈청 농도의 분자들을 시간 경과에 따라 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 모니터링하였다. 간단하게 설명하면, 맥시소브 96-웰 분석 플레이트를 가용성 인간 PD-1 (shPD-1)로 코팅하고, 소 혈청 알부민으로 차단한 후, 세척하고 교정 표준, 품질 대조표준 및 희석된 혈청 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 포획된 DART I 및 PD-1 mAb A의 양을 염소 항-인간 IgG Fc-비오틴 이차 및 스트렙트아비딘-양고추냉이 과산화효소 (SA-HRP)의 연속적인 추가에 의해 산정하였다. HRP 활성을 TMB 기질을 사용하여 검출하였다. 모든 샘플을 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax M2e, Molecular Device, Sunnyvale,CA)를 사용하여 분석하고 표준 캘리브레이터에 의해 생성된 OD 신호를 SoftMax Pro 소프트웨어 (버전 5.4, Molecular Devices)를 사용하는 4-매개변수 로지스틱 모델에 사용하였다. PD-1 mAb A 또는 DART I의 농도를 표준 곡선을 설명하는 방정식으로 샘플의 OD 신호 데이터의 내삽으로부터 측정하였다. 이 분석에 대한 정량의 하한 (LLOQ)을 9.775　ng/mL로 추정하였다.
도 22는 시간 경과에 따른 혈청 농도를 나타내고, 선은 DART I (실선, 삼각형) 또는 PD-1 mAb A (점선, 원형)로 주입된 두 수컷 (검은색 기호) 및 암컷 (흰색 기호) 원숭이의 평균을 나타낸다. 이 데이터들은 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자의 약물동역학이 시노몰구스 원숭이에서 항-PD-1 항체의 그것과 비교할만한 것을 입증한다.
실시예 10
PD-1 항체 및 PD-1 x LAG-3 이중특이적 분자들의 독물학 연구
대표적인 항-PD1 항체, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 및 대표적인 PD1 x LAG3 이중특이적 분자, DART I의 안전성 프로파일을 시노몰구스 원숭이에서 비-GLP (Good Laboratory Practice)에서 평가하였다.
이 연구에서 항-PD-1 항체 (hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))의 잠재적 독성 및 독성동태학을, 다중 정맥 내 주입에 의해 투여될 때 평가하였다. 이에 더불어, PD-1 x LAG-3 DART 분자 (DART I)의 잠재적 독성 및 독성동태학을, 단일 정맥 내 주입에 의해 투여될 때 평가하였다. 연구 디자인을 하기 표 20에 제시한다.
그룹
번호		 테스트 물질 용량 수준 (mg/kg) 투약일 투약
부피		 용량 (mg/mL) 동물의 수
수컷 암컷
1 대조표준 0 1, 8, 15 5 0 1a 1a
2A hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 1 1, 8, 15 5 0.2 1a 1a
2B hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 1 1, 8, 15 5 0.2 1b 1b
3A hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 100 1, 8, 15 5 20 1a 1a
3B hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 100 1, 8, 15 5 20 1b 1b
4 DART I 5 1 5 1 1c 1c
a 그룹 1, 2A 및 3A에 1일에 투약을 시작하였고 18일에 마지막 (제3) 용량 후 72시간 후에 부검하였다.
b 그룹 2B 및 3B에 1일에 투약을 시작하였고 22일에 마지막 (제3) 용량 후 7일 후에 부검하였다.
c 그룹 4에 1일에 투약을 시작하였고 단일 용량 투여 후 28일 동안 계속하였다 (29일까지); 다음에 동물들을 군집으로 복귀시켰다.
다음의 매개변수 및 종점을 이 연구에서 평가하였다: 임상 신호, 체중, 식품 소비, 체온, 임상적 병리학 매개변수들 (혈액학, 응고 및 임상 화학), 생체 분석 및 독성 역학 매개변수들, 항-약물 항체 분석, 유동 세포 분석, 사이토카인, 총 부검 결과, 기관 중량 및 조직병리학적 조사(examination).
모든 동물은 18일 또는 22일에 안락사 스케줄이 있을 때까지 또는 29일에 연구로부터 방출될 때까지 생존하였다. hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)에 대해 임상 신호, 식품 소비, 체중, 체온, 혈액학, 응고 또는 임상 화학 매개변수들, 또는 총 부검 결과에 테스트 물품-관련 변화는 없었다. 18일 및 22일에, 1 또는 100 mg/kg의 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)를 받은 동물에서 비장 무게 및 적색 비수 (red pulp)의 용량-의존성 경미에서 중간까지의 림프조직구 침윤물의 증가가 분명하였다. 주변의 림프구와 비교하여, 림프조직구성 세포는 창백한 세포질 및 불규칙적인 핵을 가졌다. 드문 유사분열상(Rare mitotic figure)이 분명하였다. 침윤물은 현미경으로 볼 때 증가된 비장 중량에 상관이 있었다.
hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)를 제공한 동물에 대한 혈청 농도-시간 프로파일은 이 종에서, 소수의 예외는 있지만, 항체에 대해 예상된 프로파일을 보인다. 제3 용량 우 곡선의 기울기는 1 mg/kg 용량 그룹에서 두 동물 및 100 mg/kg 용량 그룹에서 두 동물에 대한 제1 용량 후보다 더 날카롭게 떨어졌고, 그것은 후기 사이클에서 항-약물 항체 (ADA)의 가능한 출현을 가리킨다. 분석은 1 mg/kg 그룹에서 4마리중 2마리 동물이 ADA를 발생시켰고 100 mg/kg 그룹에서 4마리 중 1마리 동물이 ADA를 발생시켰다.
결론적으로, 3주 동안 (1, 8 및 15일) 주 1회 정맥 내 주입에 의한 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 투여는 시노몰구스 원숭이에서 1 및 100 mg/kg의 수준에서 잘 용인되었다. 비장의 적색 비수의 용량-의존성 경미에서 중간까지의 림프조직구성 세포 침윤물은 1 및 100 mg/kg의 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)에서 존재하였다.
DART I에 대해, 임상 신호, 식품 소비, 체중, 체온, 혈액학 또는 응고 매개변수에서 테스트 물품-관련 변화는 없었다. 임상 화학 매개변수들의 DART I-관련 변화는 2일에 아스파테이트 아미노트란스페라제 (AST) 및 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)의 비-역기능적, 일시적 상승을 포함하였다. 평균 AST 변화는 3.2x 비히클-처리된 대조표준 동물 및 7.8x 사전연구 수준이었고, 이때 수준은 대조표준 참조 범위2보다 위였다. 평균 LDH 변화는 2.5x 비히클-처리된 대조표준 동물 및 7.8x 사전연구 수준이었다. 두 매개변수는 8일에 거의 기준선 수준으로 복귀하였다. 결론적으로, 정맥 내 주입에 의한 DART-I의 단일 투여는 5 mg/kg의 수준에서 시노몰구스 원숭이에서 잘 용인되었다.
실시예 11
항-PD-1 항체를 사용한 단일 용량 PK
선택된 독물학적 종점을 사용한 단일-용량 PK 연구를 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 이 연구에서, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)를 두 개의 다른 항-PD1 IgG4 (P), κ mAbs: PD-1 mAb A IgG4 (P) 및 PD-1 mAb B IgG4 (P)와 비교하였다. 각 항체를 10 mg/kg으로 1-시간 정맥 내 주입에 의해 2마리 원숭이 (1마리 수컷, 1마리 암컷)에게 투여하고 동물들을 65일 동안 모니터링하였다.
hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 또는 PD-1 mAb A IgG4 (P)의 투여와 관련된 테스트 물품-관련 임상 신호, 체중, 식품 소비, 사이토카인 또는 면역표현형의 변화는 없었다. 데이터는 PD-1 mAb B IgG4 (P)에 대해 유사하였는데, 예외는 PD-1 mAb B IgG4 (P) 투여 후에 IL-5의 상승이 관찰된 것이었다.
T 세포의 표면에서 PD-1에 결합하는 항-PD-1 항체를, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P), PD-1 mAb A IgG4 (P) 또는 PD-1 mAb B IgG4 (P)로 처리된 시노몰구스 원숭이로부터 수집한 혈액 샘플의 전시간 과정에 대해 과잉 경쟁자 (미표지 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))의 부재 (PBS 대조표준) 또는 존재하에 T 세포에 결합하는 형광 표지된 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 평균 형광 세기 (MFI)가 있는 경쟁 방법을 사용하여 유동 세포분석에 의해 측정하였다. 도 23A-23C에 도시된 바와 같이, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 및 PD-1 mAb B IgG4 (P)는 PD-1 mAb A IgG4 (P)에 비교하여 (PD-1 결합은 21일 이하의 날 동안 ≥ 80%에서 유지됨)(도 23B) CD4+ 및 CD8+ T 세포 표면에서 PD-에 대한 연장된 결합 (PD-1 결합은 28일 또는 그 이상의 날 동안 ≥ 80%에서 유지됨)(각각 도 23A 및 23C)을 입증하였다. 각각의 항-PD-1 항체에 대하여, T-세포 PD-1 결합 데이터는 그것들의 혈청 농도와 상관이 있었다.
실시예 12
반복 용량 독물학 연구
본 발명의 치료 분자들의 안전성, 독성 역학 및 약물동역학 프로파일을 평가하기 위하여, 예시의 분자 (hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P))를 시노몰구스 원숭이에 투여하고 GLP (Good Laboratory Practice) 투약 연구를 수행하였다. 이 연구에서, 4 그룹의 동물 (그룹당 10마리, 5마리 수컷 및 5마리 암컷)을 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 또는 대조표준 물품으로, 3가지 용량 수준에서의 주입에 의해 주 1회 처치하였다. 동물을 4-주의 약물 투약 기간 중에 임의의 잠재적인 독성에 대해 평가하고 이어서 추가의 10-주의 약물이 없는 기간 중에 모니터링하였다. 이 연구의 실험 디자인을 하기 표 21에 제시한다. 동물들에게 연구일 1, 8, 15 및 22일에, 주 1회 1-시간 정맥 내 주입을 통해 눈금이 표시된 주입 펌프를 사용하여 투약하였다. 각 그룹으로부터 1마리 수컷 및 1마리 암컷을 25일에 희생시키고, 나머지 동물들을 연구일 95일에 희생시켰다. T-림프구 상의 PD-1 수용체의 선점(occupancy)을 포함하여, 순환 중의 백혈구 하위집단에 미치는 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 투여의 효과를 평가하였다. 이에 더불어, 항-약물 항체 (ADA) 프로파일을 측정하였다.
a 대조표준 및 hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P)를 주마다 정맥 내 주입에 의해 투여하였다.
b 그룹당 6마리의 원숭이 (수컷 3마리/암컷 3마리)를 25일에 부검한 한편, 나머지 회복 그룹 원숭이 (수컷 2마리/암컷 2마리)는 95일에 부검하였다.
시노몰구스 원숭이에서 0, 10, 40 및 150 mg/kg에서 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 주마다 1회 정맥 내 (IV) 주입은 잘 용인되었고 모든 동물은 그것들의 안락사 스케줄이 있는 25일 또는 95일까지 생존하였다. 임상 신호, 식품 소비, 체중, 신체적, 안과적 및 신경학적 검사, 심전도, 체온, 호흡률, 혈압 및 심박수, 응고, 임상 화학 및 소변 검사 매개변수들, 장기 무게 또는 총 해부 결과에서 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-관련 변화는 없었다.
혈액학적 매개변수들의 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-관련 변화들은 림프구 역가의 일시적인 감소를 포함하였다. 림프구 역가는 2일 (주입 후 23시간 후)에 ≥ 10 mg/kg에서, 대조표준에 비교하여 10 및 40 mg/kg에서 수컷에 대해 및 40 및 150 mg/kg에서 암컷에 대해 통계학적으로 유의미한, 수컷 및 암컷에서 사전-연구 (1일 사전용량)에 비교하여 적당히 감소하였다. 림프구 역가는 8일 사전용량시 거의 사전연구 수준으로 복귀하였지만 9일 (주입 후 23시간)에 모든 용량 수준에서 일부 개별적인 수컷 및 암컷에 대해 약하게 감소하였다 (0.47x 내지 0.68x 사전연구). 림프구 역가는 15일 및 22일에 투약 전에 증가하였지만, 16일 및 23일 (주입 후 23시간)에 일부 개별적인 수컷 및 암컷에 대해 감소하였다.
총 백혈구, T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함하여, 순환하는 면역 세포 집단에서 용량-의존성, 일시적인 감쇠가 대조표준 그룹과 비교하여 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-처리된 동물에서 주입 종점 후 23시간 후에 관찰되었다. 변화의 가장 큰 크기는 1일에 제1 용량 투여 후에 관찰되었다; 더 작은 크기의 변화는 8, 15 또는 22일에 후속적인 용량 후에 일시적으로 관찰되었다. 면역 세포 집단은 일반적으로 EOI-후 27시간 후에 및 회복 단계 내내 기준선 값으로 또는 거의 기준선 값으로 회복되었다. 대조표준 그룹과 비교하여 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-처리된 동물에서 순환하는 단핵세포의 변화는 관찰되지 않았다.
PD-1+/CD4+ 및 PD-1+/CD8+ 세포에 결합하는 최대 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)를 시험된 모든 용량 (10, 40 또는 150 mg/kg)에서 연구의 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 단계 동안 관찰하였다. 항-약물 항체 (ADA) 반응을 발달시키지 않았던 회복되는 동물에서, 혈청 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 농도는 29 ㎍/mL 이상으로 유지되었고 PD-1+/CD4+ 및 PD-1+/CD8+ 세포에 결합하는 최대 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)는 전체 1-주 회복 기간 동안 유지되었다. 이 동물들에서, T 세포 상의 PD-1 조절의 증거는 없었다. ADA 반응을 발달시킨 회복되는 동물에서, MGD012-결합된 PD-1+ T 세포의 빈도는 기준선 수준으로 감쇠하였다. ADA-포지티브 동물의 PD-1+/CD4+ 및 PD-1+/CD8+ 세포에 대한 최대 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 결합으로부터의 감쇠는 일반적으로 외관상의 혈청 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 농도가 대략 25 ㎍/mL 아래로 떨어질 때 발생하였다. 그러나, ADA-포지티브 동물에서의 ADA의 존재가 PD-1에 대한 PD-1 항체의 결합을 차단하기 위해 기여할 수 있기 때문에, 이런 외관상의 한계값 관계가 ADA-네거티브 동물에도 적용되는지는 알 수 없다.
hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 약물동역학적 반응에는 최소한의 성-관련 차이가 있었고, 그것은 평가된 용량 범위 (10 내지 150 mg/kg)에 걸쳐 선형이었다. 10, 40 및 150 mg/kg에서 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)에 대해, 성 조합된 평균 Cmax는 각각 240 ㎍/mL (0.240　mg/mL), 1078 ㎍/mL (1.08　mg/mL) 및 3938 ㎍/mL (3.94　mg/mL)이었고, AUC는 각각 47310 h·㎍/mL (47.3 h·mg/mL), 205723 h·㎍/mL (206 h·mg/mL) 및 745681 h·㎍/mL (746　h·mg/mL)이었다. ADA가 출현하기 전 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 제1 사이클의 비-구획성 분석 (NCA)에 의한 평균 클리어런스는 0.21 mL/h/kg으로, 큰 분자량 단백질에 대해 예상되는 바와 같이, 시노몰구스 원숭이의 사구체 여과율보다 실질적으로 더 낮았다. hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 제1 사이클의 NCA에 의한 분포의 평균 정상 상태 부피는 68 mL/kg으로, 혈청 부피의 대략 1.5배지만, 세포외 물 공간보다는 적다. 이것은 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)가 맥관 구획으로부터 조직 세포외 공간으로 흘러나오는 것을 시사하지만, 언제나 모든 세포외 공간이 이 분자에 접근할 수 있지 않다는 것을 시사한다. hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 제1 사이클의 NCA에 의한 평균 체류 시간 (MRT)의 평균 값은 335시간 또는 대략 14일이었다. ADA의 출현은 사이클 2 내지 4에서 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 농도를 감소시켰다. hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 반복된 용량 후에 감소된 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 혈청 농도의 증거는 10, 40 및 150 mg/kg 용량 그룹에서 각각 10마리 중 7마리, 10마리 중 4마리 및 10마리 중 3마리 동물에서 관찰되었다. hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)에 대한 ADA의 존재는 10, 40 및 150 mg/kg 용량 그룹에서 각각 이들 동물 중 4, 2 및 1마리에서 확인되었고; ADA가 확인되지 않은 모든 동물은 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) 혈청 농도가 ADA를 검출하는 능력으로 간섭되는 말기 해부 그룹에 있었다. 따라서, 후속되는 TK 분석에서, 트로프 농도 (trough concentration)가 기존의 트로프 농도보다 낮을 때 이 시간 전으로부터의 데이터는 검열될 수 있다. 3개의 용량 그룹에 대한 모든 사이클 전체에서 데이터의 2-구획 모델링으로부터 ADA에 의해 영향을 받은 지점들을 배제하는 것은 2-구획 모델에 대한 일차 TK 매개변수들에 대한 평균 값이 클리어런스에 대해 0.22 mL/h/kg이었고, 분포의 초기 부피 (V1)에 대해서는 38.5　mL/kg이었으며 V2에 대해서는 33.8 mL/kg이었음을 의미하고, 72.3　mL/kg의 분포의 평균 정상-상태 부피 (Vss) 및 329 시간의 MRT를 유발하였다. 이 값들은 제1 용량의 NCA로부터 얻어진 매개변수들과 일치하였다. ADA의 부재시에, 시뮬레이션으로, 약하게 투약함으로써, 시노몰구스 원숭이에서 정상 상태는 제5 용량 후에 이루어질 수 있을 것이고 축적 지수는 2.4일 것임을 예측할 수 있다.
25일에, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-관련된 최소 다초점 혈관주위 단핵 세포 침윤물은 수컷에서 ≥ 40 mg/kg로 및 암컷에서 ≥　10　mg/kg로 IV 주사한 부위의 가장 바깥쪽의 진피에 존재하였고, 외래 단백질 (단클론성 항체)의 반복된 주입에 대해 예상된 반응이었다. 95일에, hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)-관련된 미시적 변화는 주지되지 않았고, 그것은 25일에 존재한 테스트 물품-관련 변화의 회복을 나타낸다.
요약하면, 이 연구의 결과는 주 1회 (1, 8, 15 및 22일에) 정맥 내 주입을 통한 hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P)의 투여가 10, 40 또는 150 mg/kg의 수준에서 시노몰구스 원숭이에서 임상적으로 잘 용인되었음을 나타낸다. 관찰된 효과는 순환하는 림프구 및 외래 단백질의 주입에 관련된 최소 주사-부위 변화의 일시적인 감소에 국한되었다. 이 결과들을 기반으로, 비관측 역효과 수준 (NOAEL)이 150　mg/kg인 것 (3.94 mg/mL의 성 조합된 평균 Cmax 및 746 h·mg/mL의 AUC)으로 여겨졌다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별적인 공보 또는 특허 출원이 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명이 그것의 특정 구체예들과 관련하여 기술되었지만, 추가로 변형될 수 있고 일반적으로, 발명의 원리를 따르는 본 출원이 임의의 변화, 사용 또는 적응을 다 포함하고 본 개시로부터의 그런 일탈을 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지된 또는 관례적인 실시에 포함되는 것으로서 및 지금까지 설명된 필수 특징에 적용될 수 있는 것으로서 포함하는 것으로 의도된 것이 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenic, Inc. Shah, Kalpana Smith, Douglas La Motte-Mohs, Ross Johnson, Leslie Moore, Paul Bonvini, Ezio Koenig, Scott <120> PD-1-Binding Molecules and Methods of Use Thereof <130> 1301.0122PCT <150> US 62/198,867 <151> 2015-07-30 <150> US 62/239,559 <151> 2015-10-09 <150> US 62/255,140 <151> 2015-11-13 <150> US 62/322,974 <151> 2016-04-15 <160> 298 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> Human IgG1 CH2-CH3 Domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 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<223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 3 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg 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Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa 210 215 <210> 5 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 CH2-CH3 Domain Having L234A/L235A Substitutions <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 5 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 210 215 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Knob-Bearing" Human IgG1 CH2-CH3 Domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 6 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 210 215 <210> 7 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Hole-Bearing" Human IgG1 CH2-CH3 Domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 7 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 210 215 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Human IgG CL Kappa Domain <400> 8 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 9 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(104) <223> Human IgG CL Lambda Domain <400> 9 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 10 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> Human IgG1 CH1 Domain <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Human IgG2 Hinge Region <400> 11 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Human IgG4 Hinge Region <400> 12 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stabilized IgG4 Hinge Region <400> 13 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 14 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-containing Linker 2 <400> 15 Gly Gly Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 16 Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 17 Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 18 Ala Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 19 Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 20 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting (E-coil) Domain <400> 21 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting "K-coil" Domain <400> 22 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Heterodimer-Promoting "E-coil" Domain <400> 23 Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Heterodimer-Promoting "K-coil" Domain <400> 24 Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 <210> 25 <211> 46 <212> PRT <213> Streptococcus dysgalactiae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(46) <223> Albumin-Binding Domain 3 of Protein G of Streptococcus Strain G148 <400> 25 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 26 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant deimmunized Albumin Binding Domain <400> 26 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 27 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Deimmunized Albumin Binding Domain <400> 27 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 28 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant deimmunized Albumin Binding Domain <400> 28 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 29 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 30 Ala Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 31 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 32 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 33 Leu Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 34 Ala Pro Ser Ser Ser 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 35 Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu 1 5 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 36 Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 37 Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 38 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(525) <223> Human LAG-3 (Signaling Sequence and Mature Protein) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(28) <223> Signaling Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(525) <223> Mature Protein <400> 38 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala 130 135 140 Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser 180 185 190 Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln 195 200 205 Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser 210 215 220 Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly 225 230 235 240 Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala 260 265 270 Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val 275 280 285 Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu 305 310 315 320 Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His 325 330 335 Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr 340 345 350 Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu 355 360 365 Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser 370 375 380 Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala 385 390 395 400 Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln 405 410 415 Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser 420 425 430 Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly 435 440 445 His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln 485 490 495 Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 500 505 510 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu 515 520 525 <210> 39 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(120) <223> Heavy Chain Variable Domain of LAG-3 mAb A <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Light Chain Variable Domain of LAG-3 mAb A <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Heavy Chain Variable Domain of LAG-3 mAb 1 <400> 41 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ile Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> CDRH1 of LAG-3 mAb 1 <400> 42 Arg Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> CDRH2 of LAG-3 mAb 1 <400> 43 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> CDRH3 of LAG-3 mAb 1 <400> 44 Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> VL Domain of LAG-3 mAb 1 <400> 45 Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> CDRL1 of LAG-3 mAb 1 <400> 46 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL2 of LAG-3 mAb 1 <400> 47 Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDRL3 of LAG-3 mAb 1 <400> 48 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hLAG-3 mAb 1 VH1 <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hLAG-3 mAb 1 VH2 <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hLAG-3 mAb 1 VL1 <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hLAG-3 mAb 1 VL2 <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hLAG-3 mAb 1 VL3 <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hLAG-3 mAb 1 VL4 <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of the VL Domain of hLAG-3 mAb 1 VL4 <400> 55 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(118) <223> VH Domain of LAG-3 mAb 6 <400> 56 Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of LAG-3 mAb 6 <400> 57 Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> CDRH2 of LAG-3 mAb 6 <400> 58 Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDRH3 of LAG-3 mAb 6 <400> 59 Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> VL Domain of LAG-3 mAb 6 <400> 60 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Ala Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> CDRL1 of LAG-3 mAb 6 <400> 61 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val Val Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL2 of LAG-3 mAb 6 <400> 62 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL3 of LAG-3 mAb 6 <400> 63 His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 64 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(113) <223> Heavy Chain Variable Domain of PD-1 mAb A <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Light Chain Variable Domain of PD-1 mAb A <400> 65 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(120) <223> Heavy Chain Variable Domain of PD-1 mAb B <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(111) <223> Light Chain Variable Domain of PD-1 mAb B <400> 67 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 68 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(288) <223> Human PD-1 Polypeptide (NCI Sequence NP 005009.2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Human PD-1 Signal Sequence <400> 68 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 69 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(121) <223> VH Domain of PD-1 mAb 1 <400> 69 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Arg Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 373 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(373) <223> Polynucleotide Encoding VH Domain of PD-1 mAb 1 <400> 70 cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc 60 tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaactg 120 gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag 180 cactagctac aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa 240 ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc 300 aagagattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt 360 caccgtctcc tcc 373 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <400> 71 Asn Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> CDRH2 of PD-1 mAb 1 <400> 72 His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> CDRH3 of PD-1 mAb 1 <400> 73 Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(106) <223> VL Domain of PD-1 mAb 1 <400> 74 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Gln Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(318) <223> Polynucleotide Encoding VL Domain of PD-1 mAb 1 <400> 75 caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacgtttact ggtaccagca gaagcctgga 120 tcctcccccc aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtgataacc cgtacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> CDRL1 of PD-1 mAb 1 <400> 76 Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL2 of PD-1 mAb 1 <400> 77 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDRL3 of PD-1 mAb 1 <400> 78 Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Tyr Thr 1 5 <210> 79 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hPD-1 mAb 1 VH1 <400> 79 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly His Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Val 65 70 75 80 Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding hPD-1 mAb 1 VH1 <400> 80 gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg 60 acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaattg gattaggcag 120 cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat 180 aatcccagtc tgaagagccg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt 240 ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcgagattat 300 ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc 360 tcc 363 <210> 81 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hPD-1 mAb 1 VL1 <400> 81 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(348) <223> Polynucleotide Encoding the VH Domain of PD-1 mAb 2 <400> 84 gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgagt 300 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc 348 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of PD-1 mAb 2 <400> 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gtctcgagtg ggtagcatac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat 180 gccgacacag tgaaaggcag gtttactatc tcccgtgaca atgcaaaaaa cacactgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttccctgtct 300 gattacttcg actactgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc 348 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hPD-1 mAb 2 VL1 <400> 95 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 96 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding hPD-1 mAb 2 VL1 <400> 96 gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt 60 atttcttgtc ggagttcaca gagtctggta cattccacag gaaatacata tctccattgg 120 tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag ctgctgattt atagagtgtc taatcgattt 180 tctggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac actgaaaatc 240 tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgta gtcagaccac ccatgtaccc 300 tggacttttg gccaaggtac taagctggaa atcaag 336 <210> 97 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> VH Domain of PD-1 mAb 3 <400> 97 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe 85 90 95 Thr Arg Glu Lys Ile Thr Thr Ile Val 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tatttcctat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgact 300 gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 109 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of PD-1 mAb 4 <400> 109 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> CDRH2 of PD-1 mAb 4 <400> 110 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Met Ser Ile Ser Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRH3 of PD-1 mAb 4 <400> 111 Leu Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 112 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> VL Domain of PD-1 mAb 4 <400> 112 Asp Val Val Met Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Thr 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PD-1 mAb 5 <400> 123 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat 240 cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> CDRL1 of PD-1 mAb 5 <400> 124 Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Met Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL2 of PD-1 mAb 5 <400> 125 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDRL3 of PD-1 mAb 5 <400> 126 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 127 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE 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attaatccta aaaatggtga cactcactac 180 aaccagaagt tcaagggcga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagcgatttt 300 gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc 339 <210> 161 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of PD-1 mAb 8 <400> 161 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 162 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> CDRH2 of PD-1 mAb 8 <400> 162 Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Asp Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 163 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> CDRH3 of PD-1 mAb 8 <400> 163 Asp Phe Asp Tyr 1 <210> 164 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(112) <223> VL Domain of PD-1 mAb 8 <400> 164 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Gly Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly 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<212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(351) <223> Polynucleotide Encoding the VH Domain of PD-1 mAb 15 <400> 241 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgctgcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat 180 gccgacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aagacgaggg 300 acctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c 351 <210> 242 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of PD-1 mAb 15 <400> 242 Ser Tyr Leu Ile Ser 1 5 <210> 243 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> CDRH2 of PD-1 mAb 15 <400> 243 Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 244 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> CDRH3 of PD-1 mAb 15 <400> 244 Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 245 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> VL Domain of PD-1 mAb 15 <400> 245 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 246 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> Polynucleotide Encoding the VL Domain of PD-1 mAb 15 <400> 246 gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc 60 atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct 240 gaagattttg taaattatta ctgtcaacaa ctttacagta ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 247 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> CDRL1 of PD-1 mAb 15 <400> 247 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 248 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> CDRL2 of PD-1 mAb 15 <400> 248 Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 249 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> CDRL3 of PD-1 mAb 15 <400> 249 Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 250 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hPD-1 mAb 15 VH1 <400> 250 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 251 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding hPD-1 mAb 15 VH1 <400> 251 gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg 60 tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctcttgggt gcgccaagcc 120 ccaggtaagg gccttgaatg ggtcgccgcc attagtgggg gtggtgccga tacatattat 180 gccgacagcg tcaagggacg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac 240 ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccggcgcggg 300 acttacgcta tggactattg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c 351 <210> 252 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hPD-1 mAb 15 VL1 <400> 252 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 253 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding hPD-1 mAb 15 VL1 <400> 253 gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc 60 atcacctgtc tggccagtca gaccattgga acctggctcg cctggtatca gcagaaacct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagatgg agtgccctcc 180 cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc 240 gaggatttcg ctacatacta ctgtcaacag ctctactcca ttccatggac ctttggtcag 300 ggtactaaac tggagatcaa a 321 <210> 254 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> Human IgG4 CH1 Domain <400> 254 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 255 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Humanized Antibody Heavy Chain <400> 255 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 256 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Humanized Antibody Heavy Chain with Stabilized Hinge Region <400> 256 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 257 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> Human IgG2 CH1 Domain <400> 257 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 258 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Sequence for the CH2 and CH3 Domains <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa is a lysine (K) or is absent <400> 258 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 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Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa 210 215 <210> 260 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild-type and Variant Human IgG1 CH2 and CH3 Domains <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa4 and Xaa5 are both L (wild type), or are both A (decreased FcgammaR binding) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(26) <223> Xaa22, Xaa24 and Xaa26 respectively are M, S and T (wild type), or are Y, T and E (extended half-life) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (136)..(177) <223> Xaa136, Xaa138, and Xaa177 respectively are: T, L and Y (wild type), or are W, L and Y (knob), or S, A and V (hole) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(205) <223> Xaa204 and Xaa205 respectively are N and H (wild type), or are N and R (no protein A binding), or A and K (no protein A binding) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217) <223> Xaa217 is K or is absent <400> 260 Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Xaa Ile Xaa Arg Xaa Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Xaa Xaa Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 210 215 <210> 261 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 261 Leu Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 262 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 262 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 263 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 263 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 264 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of a Humanized PD-1 Antibody (hPD-1 mAb 7(1.2)) <400> 264 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 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Gly Ala Leu Thr Ser 275 280 285 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 290 295 300 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 305 310 315 320 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 325 330 335 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 340 345 350 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 355 360 365 Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 370 375 380 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 385 390 395 400 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 405 410 415 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 420 425 430 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 435 440 445 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 450 455 460 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 465 470 475 480 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 485 490 495 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 500 505 510 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 515 520 525 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 530 535 540 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 545 550 555 560 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 565 <210> 293 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second and Fourth Polypeptide Chains of DART J <400> 293 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 115 120 125 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 130 135 140 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro 145 150 155 160 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val 165 170 175 Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp 180 185 190 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp 195 200 205 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe 210 215 220 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 245 250 255 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 260 265 270 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 275 280 285 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 290 295 300 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 305 310 315 320 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 325 330 335 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 <210> 294 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hLAG-3 mAb 6 VH1 <400> 294 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 295 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH Domain of hLAG-3 mAb 6 VH2 <400> 295 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 296 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hLAG-3 mAb 6 VL1 <400> 296 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 297 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Domain of hLAG-3 mAb 6 VL2 <400> 297 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 298 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of the VL Domain of hLAG-3 mAb 6 VL1 and VL2 <400> 298 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Val Val Ala 1 5 10

Claims (34)

  1. 인간 PD-1 및 LAG-3에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자로서,
    이중특이적 결합 분자는 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 PD-1-결합 도메인을 포함하고,
    상기 가변 중쇄 도메인은 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하고, 상기 가변 경쇄 도메인은 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을 포함하며,
    (A) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 PD-1 mAb 7의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 포함하며;
    (2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 PD-1 mAb 7의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:146을 포함하거나;
    또는
    (B) (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 포함하며;
    (2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:146을 포함하는,
    이중특이적 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 중쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140 및 SEQ ID NO:141을 포함하며;
    (2) CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인은 hPD-1 mAb 7(1.2)의 경쇄 CDR이고, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:145 및 SEQ ID NO:146을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) SEQ ID NO:147, 또는 SEQ ID NO:149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
    (B) SEQ ID NO:151, 또는 SEQ ID NO:153의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) SEQ ID NO:147의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및/또는
    (B) SEQ ID NO:153의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  5. 제1항에 있어서, LAG-3 에피토프-결합 부위를 포함하고, 상기 LAG-3 에피토프-결합 부위는:
    (A) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44를 포함하는 LAG-3 mAb 1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
    (2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48을 포함하는 LAG-3 mAb 1의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
    또는
    (B) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 및 SEQ ID NO:44를 포함하는 hLAG-3 mAb 1 VH1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
    (2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:48을 포함하는 LAG-3 mAb 1 VL4의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
    또는
    (C) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:59를 포함하는 LAG-3 mAb 6의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
    (2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:63을 포함하는 LAG-3 mAb 6의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인;
    또는
    (D) (1) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:59를 포함하는 hLAG-3 mAb 6 VH1의 가변 중쇄의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인; 및
    (2) 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:63을 포함하는 LAG-3 mAb 6의 가변 경쇄의 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을
    포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 LAG-3 에피토프-결합 부위는:
    (1) hLAG-3 mAb 6 VH1 (SEQ ID NO:294)의 가변 중쇄 및
    (2) hLAG-3 mAb 6 VL1 (SEQ ID NO:296)의 가변 경쇄
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) 4개 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 디아바디; 또는
    (B) 이중특이적 항체
    인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  8. 제5항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) 4개 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 디아바디; 또는
    (B) 이중특이적 항체
    인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) 4개 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 디아바디; 또는
    (B) 이중특이적 항체
    인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  10. 제7항에 있어서, 상기 분자는 디아바디이고 알부민-결합 도메인 (ABD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 분자는 Fc 영역을 포함하고,
    (a) 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입의 것이며;
    (b) 상기 분자는 힌지 도메인을 추가적으로 포함하고;
    (c) 상기 Fc 영역은 IgG4 Fc 도메인이며 상기 항체는 안정화 돌연변이를 포함하는 IgG4 힌지 도메인을 추가적으로 포함하며;
    (d) 상기 Fc 영역은 FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고; 및/또는
    (e) 상기 Fc 영역은 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    (A) FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이며; 및
    (B) 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 상기 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  13. 제7항에 있어서, 상기 분자 또는 상기 항체는 Fc 영역을 포함하고,
    (a) 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입의 것이며;
    (b) 상기 분자는 힌지 도메인을 추가적으로 포함하고;
    (c) 상기 Fc 영역은 IgG4 Fc 도메인이며 상기 항체는 안정화 돌연변이를 포함하는 IgG4 힌지 도메인을 추가적으로 포함하며;
    (d) 상기 Fc 영역은 FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고; 및/또는
    (e) 상기 Fc 영역은 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    (A) FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이며; 및
    (B) 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 상기 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  15. 제8항에 있어서, 상기 분자 또는 상기 항체는 Fc 영역을 포함하고,
    (a) 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입의 것이며;
    (b) 상기 분자는 힌지 도메인을 추가적으로 포함하고;
    (c) 상기 Fc 영역은 IgG4 Fc 도메인이며 상기 항체는 안정화 돌연변이를 포함하는 IgG4 힌지 도메인을 추가적으로 포함하며;
    (d) 상기 Fc 영역은 FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고; 및/또는
    (e) 상기 Fc 영역은 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서,
    (A) FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이며; 및
    (B) 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 상기 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  17. 제9항에 있어서, 상기 분자 또는 상기 항체는 Fc 영역을 포함하고,
    (a) 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입의 것이며;
    (b) 상기 분자는 힌지 도메인을 추가적으로 포함하고;
    (c) 상기 Fc 영역은 IgG4 Fc 도메인이며 상기 항체는 안정화 돌연변이를 포함하는 IgG4 힌지 도메인을 추가적으로 포함하며;
    (d) 상기 Fc 영역은 FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하고; 및/또는
    (e) 상기 Fc 영역은 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    (A) FcγR에 대한 변종 Fc 영역의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이며; 및
    (B) 변종 Fc 영역의 혈청 반감기를 향상시키는 상기 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링인
    것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  19. 제7항에 있어서, 상기 분자는:
    (a) SEQ ID NO:267 (X1은 Ala이고; X2는 Tyr이며; X3은 Thr이고; X4는 Glu임) 및 SEQ ID NO:268; 또는
    (b) SEQ ID NO:267 (X1은 Gly이고; X2는 Tyr이며; X3은 Thr이고; X4는 Glu임) 및 SEQ ID NO:268; 또는
    (c) SEQ ID NO:267 (X1은 Gly이고; X2는 Met이며; X3은 Ser이고; X4는 Thr임) 및 SEQ ID NO:268; 또는
    (d) SEQ ID NO:269 및 270; 또는
    (e) SEQ ID NO:271 및 272; 또는
    (f) SEQ ID NO:273, 274, 275 및 276; 또는
    (g) SEQ ID NO:277, 278, 279 및 280; 또는
    (h) SEQ ID NO:281, 282 및 283; 또는
    (i) SEQ ID NO:290 및 291; 또는
    (j) SEQ ID NO:292 및 293을 포함하는 디아바디인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분자는 SEQ ID NO:290 및 291을 포함하는 디아바디인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  21. (A) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자; 및
    (B) 제약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 암 또는 감염의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는:
    (A) 그것을 필요로 하는 대상체의 T-세포 매개 면역 반응을 자극하기 위해; 또는
    (B) 억제된 면역계와 관련된 질환 또는 상태의 치료에
    사용되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 질환 또는 상태는 암 또는 감염인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 질환, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암의 세포로 구성된 군으로부터 선택된 암 세포의 존재가 특징인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암은 대장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 (HCL), 출아형 형질세포양 수지상세포 신생물 (BPDCN), 맨틀 세포 백혈병 (MCL) 및 소림프구성 림프종 (SLL)을 포함하는 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증, 또는 버킷 림프종인 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  26. 제21항에 있어서, 조성물은 그것을 필요로 하는 대상체의 T-세포 매개 면역 반응을 자극하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아 암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 희귀성 혈액 질환, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암, 및 자궁암의 세포로 구성된 군으로부터 선택된 암 세포의 존재가 특징인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암은 대장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경아세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 (HCL), 출아형 형질세포양 수지상세포 신생물 (BPDCN), 맨틀 세포 백혈병 (MCL) 및 소림프구성 림프종 (SLL)을 포함하는 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증, 또는 버킷 림프종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는 검출 가능하게 표지되어 PD-1의 검출에 사용되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 인간 PD-1에 결합하기 위한 이중특이적 결합 분자를 암호화하는 핵산 발현 벡터.
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Families Citing this family (338)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CN101212967A (zh) 2005-05-10 2008-07-02 因塞特公司 吲哚胺2,3-双加氧酶调节剂及其用法
CN104042611B (zh) 2008-07-08 2019-05-14 因塞特控股公司 作为吲哚胺2，3-双加氧酶的抑制剂的1，2，5-噁二唑
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
EP3495367B1 (en) 2012-06-13 2020-09-30 Incyte Holdings Corporation Substituted tricyclic compounds as fgfr inhibitors
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
HRP20191865T1 (hr) 2013-01-14 2020-01-10 Xencor, Inc. Novi heterodimerni proteini
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
DK2986610T5 (en) 2013-04-19 2018-12-10 Incyte Holdings Corp BICYCLIC HETEROCYCLES AS FGFR INHIBITORS
SG11201607983YA (en) 2014-03-28 2016-10-28 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
RU2718692C2 (ru) * 2014-05-29 2020-04-13 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы, которые специфически связывают антигены множества злокачественных опухолей, и способы их применения
TWI693232B (zh) * 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
RS62332B1 (sr) 2014-11-26 2021-10-29 Xencor Inc Heterodimerna antitela koja vezuju cd3 i cd20
CN107406512A (zh) 2014-11-26 2017-11-28 Xencor公司 结合cd3和cd38的异二聚体抗体
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
CR20170390A (es) 2015-02-20 2017-10-23 Incyte Holdings Corp Heterociclos biciclicos como inhibidores de fgfr
EP3283508B1 (en) 2015-04-17 2021-03-17 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TWI870335B (zh) * 2015-06-12 2025-01-21 美商宏觀基因股份有限公司 變異的嵌合4d5抗體及其與抗pd-1抗體聯合用於治療癌症的應用
WO2017011580A2 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
ES2898958T3 (es) * 2015-07-30 2022-03-09 Macrogenics Inc Moléculas de unión a PD-1 y LAG-3 y métodos de uso de las mismas
HK1257840A1 (zh) 2015-09-01 2019-11-01 Agenus Inc. 抗-pd-1抗体及其使用方法
CN108289953B (zh) 2015-09-29 2022-03-11 细胞基因公司 Pd-1结合蛋白及其使用方法
MX2018005517A (es) 2015-11-02 2018-11-09 Five Prime Therapeutics Inc Polipeptidos del dominio extracelular de cd80 y su uso en el tratamiento del cancer.
MA43186B1 (fr) 2015-11-03 2022-03-31 Janssen Biotech Inc Anticorps se liant spécifiquement à pd-1 et leurs utilisations
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
MA44082A (fr) 2015-12-14 2018-10-24 Macrogenics Inc Molécules bispécifiques présentant une immunoréactivité par rapport à pd-1 et à ctla-4 et leurs procédés d'utilisation
KR102744951B1 (ko) 2016-03-28 2024-12-23 인사이트 코포레이션 Tam 억제제로서 피롤로트리아진 화합물
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
KR20190006495A (ko) 2016-04-15 2019-01-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
IL263542B2 (en) 2016-06-14 2024-10-01 Xencor Inc Bispecific antibodies inhibit immunological checkpoint
RU2018142573A (ru) 2016-06-20 2020-07-21 Ф-Стар Бета Лимитед Партнеры по связыванию lag-3
CN116903741A (zh) 2016-06-20 2023-10-20 科马布有限公司 特异性结合于pd-l1的抗体或其抗原结合片段及其用途
CN116063545A (zh) 2016-06-28 2023-05-05 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10766958B2 (en) 2016-09-19 2020-09-08 Celgene Corporation Methods of treating vitiligo using PD-1 binding antibodies
BR112019004733A2 (pt) 2016-09-19 2019-05-28 Celgene Corp métodos de tratamento de distúrbios imunes usando proteínas de ligação a pd-1
MA46534A (fr) 2016-10-14 2019-08-21 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères il15/il15r
AU2017373945B2 (en) 2016-12-07 2025-01-23 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
HRP20230937T1 (hr) 2017-01-05 2023-11-24 Kahr Medical Ltd. Pd1-41bbl fuzijski protein i metode korištenja istog
IL267862B2 (en) 2017-01-05 2024-05-01 Kahr Medical Ltd A SIRPalpha-41BBL FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF
US11591398B2 (en) 2017-01-06 2023-02-28 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death protein 1 (PD-1)
EP3569616B1 (en) * 2017-01-13 2021-09-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics, Inc. Monoclonal antibody against pd-1 and applications thereof
WO2018133842A1 (zh) 2017-01-20 2018-07-26 大有华夏生物医药集团有限公司 人程序性死亡受体pd-1的单克隆抗体及其片段
CN108341871A (zh) * 2017-01-24 2018-07-31 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
JP6929951B2 (ja) * 2017-02-22 2021-09-01 アイ−エムエービー バイオファーマ （ハンジョウ） カンパニー リミテッド 抗ｌａｇ−３抗体およびその使用
CA3053803A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
BR112019017743A2 (pt) 2017-02-28 2020-04-07 Sanofi Sa rna terapêutico
EP3596115A1 (en) 2017-03-16 2020-01-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018170026A2 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018183928A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
BR112019021520A2 (pt) 2017-04-14 2020-08-04 Tollnine, Inc. oligonucleotídeo, composto, polinucleotídeo imunomodulador, composição, conjugado, método para modular um receptor, método de tratamento de um tumor, método de tratamento de câncer, método para tratar um tumor, método de prevenção de câncer, método para induzir uma resposta imune
JOP20190248A1 (ar) * 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3628070B1 (en) 2017-04-28 2021-09-08 Five Prime Therapeutics, Inc. Cd80 extracellular domain polypeptides for use in increasing central memory t cells
WO2018217944A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
CN110691795A (zh) 2017-05-30 2020-01-14 百时美施贵宝公司 包含抗-lag3抗体、pd-1途径抑制剂和免疫治疗剂组合的组合物
WO2018222722A2 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising an anti-lag-3 antibody or an anti-lag-3 antibody and an anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
IL322104A (en) 2017-05-30 2025-09-01 Bristol Myers Squibb Co Treatment of lag-3 positive tumors
CN110678483B (zh) 2017-06-01 2023-09-22 百时美施贵宝公司 用抗pd-1抗体治疗肿瘤的方法
MX2019014577A (es) 2017-06-05 2020-07-29 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a pd-1 y metodos de uso.
WO2019005635A2 (en) * 2017-06-25 2019-01-03 Systimmune, Inc. ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND METHODS OF PREPARATION AND USE
KR20200037250A (ko) * 2017-07-06 2020-04-08 메뤼스 엔.페. 세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 항체
CR20200099A (es) 2017-08-03 2020-07-24 Amgen Inc Muteínas de interleucina 21 y métodos de tratamiento
TWI870011B (zh) 2017-08-25 2025-01-11 美商戊瑞治療有限公司 Ｂ７－ｈ４抗體及其使用方法
AU2018342471B2 (en) 2017-09-27 2023-08-24 Incyte Corporation Salts of pyrrolotriazine derivatives useful as TAM inhibitors
KR102813968B1 (ko) 2017-10-10 2025-05-29 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
KR20200064132A (ko) 2017-10-15 2020-06-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
SG11202003078VA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Alpine Immune Sciences Inc Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
KR20200084880A (ko) 2017-11-06 2020-07-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
CN112272563A (zh) * 2017-11-08 2021-01-26 Xencor股份有限公司 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200083574A (ko) 2017-11-13 2020-07-08 크레센도 바이오로직스 리미티드 Cd137 및 psma에 결합하는 분자
CN109897111B (zh) * 2017-12-08 2021-02-23 杭州翰思生物医药有限公司 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
CN109971712B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
CN109971714B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
BR112020013236A2 (pt) * 2018-01-03 2020-12-01 Alpine Immune Sciences, Inc. proteínas imunomoduladoras de múltiplos domínios e métodos de seu uso
TW201930344A (zh) 2018-01-12 2019-08-01 美商安進公司 抗ｐｄ-１抗體及治療方法
AU2019210332A1 (en) 2018-01-22 2020-09-10 Pascal Biosciences Inc. Cannabinoids and derivatives for promoting immunogenicity of tumor and infected cells
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
WO2019148412A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
WO2019148410A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1 antibodies
GB201802573D0 (en) * 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
CN111741978A (zh) 2018-02-21 2020-10-02 戊瑞治疗有限公司 B7-h4抗体制剂
EP3755716A4 (en) * 2018-02-23 2021-08-04 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND THEIR USES
CA3092470A1 (en) 2018-02-27 2019-09-06 Incyte Corporation Imidazopyrimidines and triazolopyrimidines as a2a / a2b inhibitors
CA3091801A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibodies and methods of use thereof
WO2019179422A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/lag-3 antibody molecules
TWI841554B (zh) 2018-03-21 2024-05-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 以鉑為主之劑與抗組織因子抗體－藥物共軛物的組合治療癌症之方法
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
CN108546297B (zh) * 2018-03-29 2019-08-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 针对pd-1的单克隆抗体及其应用
US20210032344A1 (en) 2018-03-30 2021-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CN112584901A (zh) * 2018-04-04 2021-03-30 真和制药有限公司 用于阻断非糖基化的pd-1多肽之间的相互作用的方法和组合物
WO2019201169A1 (en) * 2018-04-15 2019-10-24 Salubris (Chengdu) Biotech Co., Ltd Antibodies binding pd-1 and uses thereof
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
KR20210010862A (ko) 2018-04-18 2021-01-28 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 PD-1 항원 결합 도메인을 함유하는 PD-1 표적화 이종이량체 융합 단백질 및 이의 용도
CN112074541A (zh) * 2018-05-03 2020-12-11 上海岸迈生物科技有限公司 Pd-1和lag-3的高亲和力抗体以及由其制备的双特异性结合蛋白
US11466004B2 (en) 2018-05-04 2022-10-11 Incyte Corporation Solid forms of an FGFR inhibitor and processes for preparing the same
CN112566912A (zh) 2018-05-04 2021-03-26 因赛特公司 Fgfr抑制剂的盐
JP7460608B2 (ja) 2018-05-07 2024-04-02 ジェンマブ エー／エス 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法
KR102882368B1 (ko) 2018-05-07 2025-11-07 젠맵 에이/에스 항-pd-1 항체와 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
WO2019222677A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Incyte Corporation Fused pyrimidine derivatives as a2a / a2b inhibitors
WO2019227490A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and methods for imaging
KR20210056288A (ko) 2018-06-01 2021-05-18 타유 후아시아 바이오테크 메디컬 그룹 컴퍼니 리미티드 질환 또는 병태를 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도
IL279455B1 (en) 2018-06-20 2025-09-01 Incyte Corp ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND THEIR USES
ES3031110T3 (en) 2018-06-29 2025-07-04 Incyte Corp Formulations of an axl/mer inhibitor
AU2019297361B2 (en) 2018-07-05 2024-06-27 Incyte Corporation Fused pyrazine derivatives as A2A / A2B inhibitors
CN110684113A (zh) * 2018-07-06 2020-01-14 复旦大学 一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体及其构建方法
BR112021000360A2 (pt) 2018-07-11 2021-04-13 Kahr Medical Ltd. Proteína de fusão variante sirpalpha-4-1bbl e métodos de uso da mesma
CA3104778A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Kahr Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
GB201811415D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-Mesothelin Anti bodies
MX2021000399A (es) 2018-07-12 2021-05-27 F Star Therapeutics Ltd Moleculas de anticuerpo que se unen a cd137 y ox40.
GB201811410D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd OX40 Binding molecules
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
GB201811403D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Antibody molecules
US12344672B2 (en) * 2018-07-12 2025-07-01 Invox Pharma Limited Antibody molecules that bind PD-L1 and CD137
GB201811450D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Delta Ltd Mesothelin and CD137 binding molecules
JP7519985B2 (ja) * 2018-07-19 2024-07-22 タユー ファシャ バイオテック メディカル グループ カンパニー， リミテッド 抗ｐｄ－１抗体、投薬量、およびその使用
JP2021532143A (ja) 2018-07-26 2021-11-25 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company 癌の処置のためのｌａｇ−３併用療法
CN119638835A (zh) 2018-09-17 2025-03-18 布里格姆妇女医院 抗klrg1抗体
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
PE20211491A1 (es) 2018-09-27 2021-08-11 Celgene Corp PROTEINAS DE FIJACION A SIRPa Y METODOS DE USO DE ESTAS
JP7612571B2 (ja) 2018-10-03 2025-01-14 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
US11066404B2 (en) 2018-10-11 2021-07-20 Incyte Corporation Dihydropyrido[2,3-d]pyrimidinone compounds as CDK2 inhibitors
EP3866850B1 (en) 2018-10-19 2024-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for melanoma
CN112912403A (zh) 2018-10-23 2021-06-04 百时美施贵宝公司 治疗肿瘤的方法
TWI844571B (zh) 2018-10-30 2024-06-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
CN119798453A (zh) * 2018-11-13 2025-04-11 Jn生物科学有限责任公司 激活免疫细胞的双特异性抗体
PE20211284A1 (es) 2018-11-16 2021-07-19 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-nkg2a y usos de los mismos
KR102835299B1 (ko) 2018-12-04 2025-07-18 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 다중 동위원소체 반응 모니터링에 의한 샘플내 보정 곡선을 사용한 분석 방법
EP3666905A1 (en) 2018-12-11 2020-06-17 Sanofi E. coli positive for pks island as marker of positive response to anti-pd1 therapy in colorectal cancer
US20230071889A1 (en) 2018-12-21 2023-03-09 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
EA202191763A1 (ru) 2018-12-21 2022-03-10 Озе Иммьюнотерапьютикс Бифункциональная молекула анти-pd-1/sirp
CN111349162A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 神州细胞工程有限公司 人源化抗pd-1抗体及其用途
CN111423510B (zh) * 2019-01-10 2024-02-06 迈威(上海)生物科技股份有限公司 重组抗人pd-1抗体及其应用
JP2022518236A (ja) 2019-01-21 2022-03-14 サノフイ 進行期固形腫瘍がんに対する治療用ｒｎａおよび抗ｐｄ１抗体
WO2020151572A1 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Anti-pd-l1 diabodies and the use thereof
TWI829857B (zh) 2019-01-29 2024-01-21 美商英塞特公司 作為a2a / a2b抑制劑之吡唑并吡啶及三唑并吡啶
US12428482B2 (en) 2019-02-03 2025-09-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-PD-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2020168197A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Incyte Corporation Pyrrolo[2,3-d]pyrimidinone compounds as cdk2 inhibitors
MA54947A (fr) 2019-02-15 2021-12-22 Incyte Corp Biomarqueurs de kinase 2 dépendant de la cycline et leurs utilisations
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
WO2020180959A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Incyte Corporation Pyrazolyl pyrimidinylamine compounds as cdk2 inhibitors
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
KR20210146348A (ko) 2019-03-28 2021-12-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
WO2020198676A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2020205560A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Incyte Corporation Sulfonylamide compounds as cdk2 inhibitors
US11447494B2 (en) 2019-05-01 2022-09-20 Incyte Corporation Tricyclic amine compounds as CDK2 inhibitors
US11440914B2 (en) 2019-05-01 2022-09-13 Incyte Corporation Tricyclic amine compounds as CDK2 inhibitors
JP2022534889A (ja) 2019-05-24 2022-08-04 ファイザー・インコーポレイテッド Ｃｄｋ阻害剤を使用した組合せ療法
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
CN112225809B (zh) * 2019-06-30 2023-09-05 福州创方医药科技有限公司 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
CN117447596A (zh) * 2019-06-30 2024-01-26 福州创方医药科技有限公司 一种靶向pd-1的单克隆抗体及其应用
TWI809286B (zh) 2019-07-05 2023-07-21 日商小野藥品工業股份有限公司 以pd-1/cd3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療
US11591329B2 (en) 2019-07-09 2023-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US20220289846A1 (en) * 2019-07-09 2022-09-15 Cadila Healthcare Limited Antibodies to human programmed death receptor pd-1
CN112239506B (zh) * 2019-07-16 2023-09-26 复旦大学 一种抗PD-1及c-Met抗原的小分子双特异性抗体Diabody
CN114502196A (zh) * 2019-08-01 2022-05-13 因赛特公司 Ido抑制剂的给药方案
JP7753186B2 (ja) * 2019-08-02 2025-10-14 シーティーティーキュー－アケソ（シャンハイ） バイオメド テク カンパニー リミテッド 抗ｐｄ－１抗体およびその医学的使用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
US20220332825A1 (en) 2019-08-08 2022-10-20 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific protein
PH12022550361A1 (en) 2019-08-14 2023-02-27 Incyte Corp Imidazolyl pyrimidinylamine compounds as cdk2 inhibitors
JP2022549273A (ja) 2019-09-22 2022-11-24 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｌａｇ－３アンタゴニスト治療のための定量的空間プロファイリング
JP7739269B2 (ja) 2019-09-25 2025-09-16 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー がん療法のための複合バイオマーカー
WO2021063201A1 (zh) * 2019-09-30 2021-04-08 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
US12122767B2 (en) 2019-10-01 2024-10-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
MX2022004390A (es) 2019-10-11 2022-08-08 Incyte Corp Aminas biciclicas como inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina 2 (cdk2).
GEAP202415945A (en) 2019-10-14 2024-04-25 Incyte Corp Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2021076728A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
JP2022553821A (ja) 2019-11-05 2022-12-26 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｍ－タンパク質アッセイおよびその使用
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
CN115942973A (zh) 2019-11-08 2023-04-07 百时美施贵宝公司 用于黑色素瘤的lag-3拮抗剂疗法
US20220395553A1 (en) 2019-11-14 2022-12-15 Cohbar, Inc. Cxcr4 antagonist peptides
WO2021097800A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 Abl Bio Inc. Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof
BR112022010664A2 (pt) 2019-12-04 2022-08-16 Incyte Corp Derivados de um inibidor de fgfr
EP4069696A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
TW202136287A (zh) 2019-12-17 2021-10-01 法商Ｏｓｅ免疫治療公司 包含il-7變體之雙官能分子
US20230089255A1 (en) 2019-12-19 2023-03-23 Bristol-Myers Squibb Company Combinations of dgk inhibitors and checkpoint antagonists
CN113004408B (zh) * 2019-12-20 2022-07-01 广东菲鹏制药股份有限公司 抗人程序死亡因子-1单克隆抗体
AU2020412595A1 (en) * 2019-12-23 2022-07-14 Macrogenics, Inc. Therapy for the treatment of cancer
EP4085060A1 (en) * 2020-01-03 2022-11-09 Incyte Corporation Combination therapy comprising a2a/a2b and pd-1/pd-l1 inhibitors
CA3161733A1 (en) 2020-01-07 2021-05-15 Everett Stone Improved human methylthioadenosine/adenosine depleting enzyme variants for cancer therapy
US12012409B2 (en) 2020-01-15 2024-06-18 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
CA3161513A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Irwin DAVIDSON Antisense oligonucleotide targeting linc00518 for treating melanoma
EP4097130A1 (en) 2020-01-30 2022-12-07 Ona Therapeutics S.L. Combination therapy for treatment of cancer and cancer metastasis
JP2023514152A (ja) 2020-02-06 2023-04-05 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－１０およびその使用
KR20220144821A (ko) 2020-02-21 2022-10-27 마크로제닉스, 인크. Cd137 결합 분자 및 그것의 용도
EP4112647A4 (en) * 2020-02-28 2024-03-27 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. ANTI-CD47/ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND ITS USES
MX2022010515A (es) 2020-02-28 2022-11-14 Tallac Therapeutics Inc Conjugacion mediada por transglutaminasa.
US20230089536A1 (en) 2020-03-06 2023-03-23 Celgene Quanticel Research, Inc. Combination of an lsd-1 inhibitor and nivolumab for use in treating sclc or sqnsclc
AU2021230385A1 (en) 2020-03-06 2022-09-22 Incyte Corporation Combination therapy comprising AXL/MER and PD-1/PD-L1 inhibitors
MX2022011050A (es) 2020-03-06 2022-12-15 Ona Therapeutics S L Anticuerpos anti-cd36 y su uso para tratar cancer.
EP4135844A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Incyte Corporation Fused tricyclic kras inhibitors
WO2021219048A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 迈威(上海)生物科技股份有限公司 一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用
CA3176497A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Fatima MECHTA-GRIGORIOU Antxr1 as a biomarker of immunosuppressive fibroblast populations and its use for predicting response to immunotherapy
US12202882B2 (en) 2020-05-08 2025-01-21 Alpine Immune Sciences, Inc. APRIL and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof
US11739102B2 (en) 2020-05-13 2023-08-29 Incyte Corporation Fused pyrimidine compounds as KRAS inhibitors
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
AU2021306613A1 (en) 2020-07-07 2023-02-02 BioNTech SE Therapeutic RNA for HPV-positive cancer
MX2023002045A (es) * 2020-08-19 2023-05-08 Pandion Operations Inc Anticuerpos anti-pd-1 multiparatopicos y usos de los mismos.
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
KR20230058442A (ko) 2020-08-28 2023-05-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 간세포성 암종에 대한 lag-3 길항제 요법
WO2022047093A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Incyte Corporation Vinyl imidazole compounds as inhibitors of kras
BR112023003553A2 (pt) 2020-08-31 2023-04-04 Bristol Myers Squibb Co Assinatura de localização celular e imunoterapia
US11767320B2 (en) 2020-10-02 2023-09-26 Incyte Corporation Bicyclic dione compounds as inhibitors of KRAS
US20230374064A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for concentrating proteins
WO2022076596A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
EP4226377A1 (en) 2020-10-09 2023-08-16 Worldwide Innovative Network Novel prediction method and gene signatures for the treatment of cancer
JP2023548051A (ja) 2020-10-23 2023-11-15 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 肺がんのためのｌａｇ－３アンタゴニスト療法
JP2023549678A (ja) 2020-10-28 2023-11-29 イケナ オンコロジー， インコーポレイテッド ＡＨＲ阻害剤のＰＤｘ阻害剤またはドキソルビシンとの組み合わせ
IL302836A (en) 2020-11-17 2023-07-01 Seagen Inc Methods of treating cancer with a combination of tucatinib and an anti-pd-1/anti-pd-l1 antibody
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022118197A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Pfizer Inc. Time to resolution of axitinib-related adverse events
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
CN116782937A (zh) * 2020-12-10 2023-09-19 优特力克斯有限公司 抗pd-1抗体及其用途
MX2023007301A (es) 2020-12-17 2023-07-04 Ose Immunotherapeutics Moleculas bifuncionales anti-pd1/il-7.
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
EP4566674A3 (en) 2020-12-28 2025-08-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
JP2024501029A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１抗体の皮下投与
AU2021411952A1 (en) 2020-12-29 2023-08-10 Incyte Corporation Combination therapy comprising a2a/a2b inhibitors, pd-1/pd-l1 inhibitors, and anti-cd73 antibodies
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
EP4274852A4 (en) * 2021-01-11 2025-02-26 Eutilex Co., Ltd. BISPECIFIC EPITOP-BINDING PROTEIN WITH ANTI-4-1BB ANTIBODY AND PD-1 PROTEIN OR FRAGMENTS THEREOF AND USE THEREOF
US20240384350A1 (en) 2021-01-29 2024-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating cancer with kinase inhibitors
CN113336848B (zh) * 2021-02-03 2022-08-19 上海莱馥医疗科技有限公司 一种抗pd-1抗体及其用途
KR20230156079A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 젠코어 인코포레이티드 Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
TW202304506A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
AU2022246593A1 (en) 2021-03-29 2023-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
AU2022253474A1 (en) 2021-04-08 2023-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds and methods for theranostic targeting of parp activity
JP2024515263A (ja) 2021-04-09 2024-04-08 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 改善された特性を有する二機能性分子のための新規足場構造
US20240182572A1 (en) 2021-04-09 2024-06-06 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctional molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
TW202304459A (zh) 2021-04-12 2023-02-01 美商英塞特公司 包含ｆｇｆｒ抑制劑及ｎｅｃｔｉｎ－４靶向劑之組合療法
WO2022240741A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lag3 and gal3 inhibitory agents, xbp1, cs1, and cd138 peptides, and methods of use thereof
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
JP2024522189A (ja) 2021-06-09 2024-06-11 インサイト・コーポレイション Ｆｇｆｒ阻害剤としての三環式ヘテロ環
WO2022261159A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US11981671B2 (en) 2021-06-21 2024-05-14 Incyte Corporation Bicyclic pyrazolyl amines as CDK2 inhibitors
US12441727B2 (en) 2021-07-07 2025-10-14 Incyte Corporation Tricyclic compounds as inhibitors of KRAS
KR20240035533A (ko) * 2021-07-09 2024-03-15 마크로제닉스, 인크. Pd-1 항체의 약학적 조성물 및 그것의 용도
JP2024525758A (ja) 2021-07-13 2024-07-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんのための併用療法におけるｃｄ４０およびｃｄ１３７に対する多重特異性結合剤
CA3224841A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Zhenwu Li Tricyclic compounds as inhibitors of kras
US20250206836A1 (en) 2021-07-30 2025-06-26 ONA Therapeutics S.L. Anti-cd36 antibodies and their use to treat cancer
CA3229855A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Incyte Corporation Naphthyridine compounds as inhibitors of kras
US12030883B2 (en) 2021-09-21 2024-07-09 Incyte Corporation Hetero-tricyclic compounds as inhibitors of KRAS
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
WO2023056421A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Incyte Corporation Pyrazoloquinoline kras inhibitors
TW202327595A (zh) 2021-10-05 2023-07-16 美商輝瑞大藥廠 用於治療癌症之氮雜內醯胺化合物的組合
EP4413040A1 (en) 2021-10-06 2024-08-14 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
PE20242113A1 (es) 2021-10-14 2024-10-28 Incyte Corp Compuestos de quinolina como inhibidores de kras
US20230272072A1 (en) * 2021-10-21 2023-08-31 Seismic Therapeutic, Inc. Dual targeted immune regulating compositions
KR20240099362A (ko) 2021-10-29 2024-06-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 혈액암에 대한 lag-3 길항제 요법
WO2023079428A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Pfizer Inc. Combination therapies using tlr7/8 agonist
WO2023083439A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment
WO2023091746A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Incyte Corporation Combination therapy comprising an fgfr inhibitor and a kras inhibitor
US11976073B2 (en) 2021-12-10 2024-05-07 Incyte Corporation Bicyclic amines as CDK2 inhibitors
WO2023122134A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Incyte Corporation Salts and solid forms of an fgfr inhibitor and processes of preparing thereof
JP2025503962A (ja) 2022-01-26 2025-02-06 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 肝細胞がんのための併用療法
US20250179174A1 (en) 2022-02-25 2025-06-05 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
AU2023230110A1 (en) 2022-03-08 2024-10-24 Alentis Therapeutics Ag Use of anti-claudin-1 antibodies to increase t cell availability
JP2025509749A (ja) 2022-03-18 2025-04-11 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー ポリペプチドの単離方法
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
WO2023196964A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Machine learning identification, classification, and quantification of tertiary lymphoid structures
CA3253038A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S LIAISON AGENTS CAPABLE OF BINDING TO CD27 IN POLYTHERAPY
US20250332252A1 (en) 2022-06-02 2025-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
CN119998295A (zh) 2022-06-08 2025-05-13 因赛特公司 作为dgk抑制剂的三环三唑并化合物
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
US20240101557A1 (en) 2022-07-11 2024-03-28 Incyte Corporation Fused tricyclic compounds as inhibitors of kras g12v mutants
EP4310197A1 (en) 2022-07-21 2024-01-24 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda Method for identifying lung cancer patients for a combination treatment of immuno- and chemotherapy
CN119923267A (zh) 2022-07-27 2025-05-02 阿斯利康(瑞典)有限公司 表达白介素-12的重组病毒与pd-1/pd-l1抑制剂的组合
CN119907811A (zh) 2022-08-02 2025-04-29 Ose免疫疗法公司 针对cd28的多功能分子
TW202421193A (zh) * 2022-09-28 2024-06-01 美商英塞特公司 抗ｐｄ－１／ｌａｇ－３雙特異性抗體及其用途
WO2024069009A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alentis Therapeutics Ag Treatment of drug-resistant hepatocellular carcinoma
AU2023367648A1 (en) * 2022-10-25 2025-05-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Klrb1 binding agents and methods of use thereof
AU2023367781A1 (en) 2022-10-25 2025-06-05 Seismic Therapeutic, Inc. VARIANT IgG FC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
WO2024097328A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 Incyte Corporation Combination therapies comprising an anti-gitr antibody for treating cancers
WO2024107731A2 (en) * 2022-11-14 2024-05-23 Ablexis, Llc Anti-pd-l1 antibodies
CN120202222A (zh) 2022-11-16 2025-06-24 勃林格殷格翰国际有限公司 抗SIRPa抗体的疗效预测性生物标志物
AR131099A1 (es) 2022-11-18 2025-02-19 Incyte Corp Fluoroalquenos heteroarílicos como inhibidores de dgk
WO2024115725A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
US20250340648A1 (en) 2022-12-01 2025-11-06 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
KR20250120305A (ko) 2022-12-14 2025-08-08 아스텔라스 파마 유럽 비.브이. Cldn18.2 및 cd3에 결합하는 2중 특이성 결합제와 면역 체크포인트 저해제를 수반한 조합 요법
KR20250123912A (ko) 2022-12-21 2025-08-18 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 폐암에 대한 병용 요법
CN117482246B (zh) * 2022-12-30 2024-10-15 英百瑞(杭州)生物医药有限公司 抗cd33/cll1双特异性抗体-自然杀伤细胞偶联物及其用途
KR20240112755A (ko) * 2023-01-11 2024-07-19 주식회사 녹십자 혈전성 질환의 예방 또는 치료를 위한 신규한 액상 제형물
WO2024150177A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Advesya Treatment methods for solid tumors
US20240270739A1 (en) 2023-01-12 2024-08-15 Incyte Corporation Heteroaryl Fluoroalkenes As DGK Inhibitors
EP4658310A1 (en) 2023-01-30 2025-12-10 Kymab Limited Antibodies
EP4669429A1 (en) 2023-02-23 2025-12-31 Imcheck Therapeutics COMBINATION OF BTN3A ACTIVATING ANTIBODIES AND IMMUNE CHECKPOINT INHIBITORS
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy
WO2024200823A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
WO2024200820A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
WO2024209072A1 (en) 2023-04-06 2024-10-10 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 for treating cancer
US20240390340A1 (en) 2023-04-18 2024-11-28 Incyte Corporation Pyrrolidine kras inhibitors
AU2024271605A1 (en) 2023-05-12 2025-11-13 BioNTech SE Antibodies capable of binding to ox40, variants thereof and uses thereof
WO2024236048A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Nh Theraguix Combination therapy for treating tumors with radiotherapy
WO2024261239A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Imcheck Therapeutics Bispecific antibodies targeting btn3a and the pd-1/pd-l1 inhibitory axis
WO2025038763A1 (en) 2023-08-15 2025-02-20 Bristol-Myers Squibb Company Ceramic hydroxyapatite chromatography flow through method
WO2025043151A2 (en) 2023-08-24 2025-02-27 Incyte Corporation Bicyclic dgk inhibitors
WO2025056180A1 (en) 2023-09-15 2025-03-20 BioNTech SE Methods of treatment using agents binding to epcam and cd137 in combination with pd-1 axis binding antagonists
WO2025068452A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025068461A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
US20250114346A1 (en) 2023-10-09 2025-04-10 Incyte Corporation Combination therapy using a kras g12d inhibitor and pd-1 inhibitor or pd-l1 inhibitor
US20250163079A1 (en) 2023-11-01 2025-05-22 Incyte Corporation Kras inhibitors
WO2025114541A1 (en) 2023-11-30 2025-06-05 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ox40 in combination therapy
WO2025122545A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Incyte Corporation Tricyclic triazolo compounds as dgk inhibitors
US20250186450A1 (en) 2023-12-06 2025-06-12 Incyte Corporation COMBINATION THERAPY COMPRISING DGK INHIBITORS and PD-1/PD-L1 INHIBITORS
WO2025121445A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
US20250195536A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 Incyte Corporation Bicyclooctane kras inhibitors
WO2025132831A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Universite D'aix-Marseille N-heteroaryl derivatives and uses thereof for treating cancer
WO2025133115A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticles comprising il-35
US20250215087A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg depleting agent
EP4658320A1 (en) 2024-02-27 2025-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibody drug conjugates
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer
WO2025245489A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of tumors in subjects having fgl-1 positive samples

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014194302A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
WO2015042246A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors

Family Cites Families (246)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (ko) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
ATE159982T1 (de) 1988-09-15 1997-11-15 Univ Columbia Antikörper mit modifiziertem kohlenhydratgehalt und verfahren zur herstellung und verwendung
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
FR2656800B1 (fr) 1990-01-08 1992-05-15 Roussy Inst Gustave Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
FR2664500B1 (fr) 1990-07-13 1994-10-28 Lille Ii Universite Droit Sant Procede de preparation d'une lipoproteine modifiee par incorporation d'une substance active lipophile, lipoproteine modifiee ainsi obtenue et composition pharmaceutique ou cosmetique la contenant.
US5972337A (en) 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
IL108501A (en) 1994-01-31 1998-10-30 Mor Research Applic Ltd Antibodies and pharmaceutical compositions containing them
KR100257466B1 (ko) 1994-05-06 2000-07-01 레지날드 쇼트버그 에스. 안토니우스-소도 Lag-3의 가용성 폴리펩타이드 절편 및 생산 방법 치료 조성물, 항-이디오타입 항체
JPH10511957A (ja) 1995-01-05 1998-11-17 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ ミシガン 表面改質ナノ微粒子並びにその製造及び使用方法
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5916597A (en) 1995-08-31 1999-06-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition and method using solid-phase particles for sustained in vivo release of a biologically active agent
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
JP2000506165A (ja) 1996-03-04 2000-05-23 ザ ペン ステイト リサーチ ファウンデーション 細胞インターナリゼーションを増強するための物質および方法
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
DE69735502T2 (de) 1996-11-28 2006-12-14 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Mutanten des lag-3 proteins, ihre expression und verwendung
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
ATE427966T1 (de) 1997-02-11 2009-04-15 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikírper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0900841A1 (en) 1997-06-18 1999-03-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) LAG-3 splice variants
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
WO1999066903A2 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
IL148021A0 (en) 1999-08-23 2002-09-12 Dana Farber Cancer Inst Inc Novel b7-4 molecules and uses therefor
EP1210428B1 (en) 1999-08-23 2015-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
US6803192B1 (en) 1999-11-30 2004-10-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
AU784634B2 (en) 1999-11-30 2006-05-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
HUP0204475A2 (en) 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
AU2002258941A1 (en) 2001-04-20 2002-11-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
EP1445264B1 (en) 2001-07-31 2011-09-14 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
DE60124912T2 (de) 2001-09-14 2007-06-14 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
US20030138425A1 (en) 2001-09-21 2003-07-24 Mather Jennie Powell Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
ATE524196T1 (de) 2001-10-16 2011-09-15 Macrogenics West Inc An das krebsassoziierte antigen cd46 bindende antikörper und verwendungsverfahren dafür
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
EP1456652A4 (en) 2001-11-13 2005-11-02 Dana Farber Cancer Inst Inc IMMUNOCELL ACTIVATION MODULATING SUBSTANCES AND USE METHOD THEREFOR
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
KR20040101502A (ko) 2002-04-16 2004-12-02 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물
JP2005524399A (ja) 2002-05-03 2005-08-18 レイヴェン バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ａｌｃａｍおよびａｌｃａｍ調節因子
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
ES2350687T3 (es) 2002-07-03 2011-01-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Composiciones de inmunopotenciación.
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP4757493B2 (ja) 2002-11-13 2011-08-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 抗原ｐｉｐａおよびそれに結合する抗体
ES2367430T3 (es) 2002-12-23 2011-11-03 Wyeth Llc Anticuerpos contra pd-1 y sus usos.
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
ES2897506T3 (es) 2003-01-09 2022-03-01 Macrogenics Inc Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de utilización de los mismos
KR20050107399A (ko) 2003-01-23 2005-11-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 인간 ｐｄ-1에 대하여 특이성을 갖는 물질
EP1897548B2 (en) 2003-02-28 2024-05-22 The Johns Hopkins University T cell regulation
PT1666604E (pt) 2003-07-07 2008-05-19 Scripps Research Inst Composições de pares ortogonais de lisil-arnt e aminoacil-arnt-sintetase e suas utilizações
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
NZ545968A (en) 2003-09-18 2010-01-29 Raven Biotechnologies Inc KID3 and KID3 antibodies that bind thereto
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
ES2364147T3 (es) 2004-01-16 2011-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polipéptidos de fusión capaces de activar receptores.
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
CA2569692C (en) 2004-06-07 2015-07-21 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
US20070166281A1 (en) 2004-08-21 2007-07-19 Kosak Kenneth M Chloroquine coupled antibodies and other proteins with methods for their synthesis
WO2006021955A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Mor Research Applications Ltd. Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
US8087074B2 (en) 2004-10-15 2011-12-27 Symantec Corporation One time password
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JP2008526256A (ja) 2005-01-12 2008-07-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド Ｋｉｄ３１およびｋｉｄ３１に結合する抗体
WO2006083852A2 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Luca2 and antibodies that bind thereto
JP5328155B2 (ja) 2005-02-02 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド Ａｄａｍ−９モジュレータ
WO2006084078A2 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Jam-3 and antibodies that bind thereto
AU2006210606B2 (en) 2005-02-03 2012-03-22 Macrogenics West, Inc. Antibodies to Oncostatin M receptor
MX2007009403A (es) 2005-02-04 2007-10-02 Raven Biotechnologies Inc Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
AU2006232920B2 (en) 2005-04-06 2011-09-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP1896582A4 (en) 2005-05-09 2009-04-08 Ono Pharmaceutical Co HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PROGRAMMED CELL DEATH 1 (PD-1) AND METHOD FOR CREATING TREATMENT WITH ANTI-PD-1 ANTIBODIES ALONE OR IN COMBINATION WITH OTHER IMMUNOTHERAPEUTICS
MX349137B (es) 2005-06-08 2017-07-13 Dana-Farber Cancer Inst Metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cancer por inhibicion de la ruta de muerte celular programada (pd-1).
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
ES2526811T3 (es) 2005-08-10 2015-01-15 Macrogenics, Inc. Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
JP5231231B2 (ja) 2005-10-19 2013-07-10 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 複雑性が増大した生理活性アセンブリーを生成するための方法および組成物ならびに使用
KR101410521B1 (ko) 2005-12-16 2014-06-20 아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들
EP1999470A4 (en) 2006-03-10 2009-08-19 Macrogenics Inc IDENTIFICATION AND GENETIC MODIFICATION OF ANTIBODIES WITH HEAVY CHAINS OF VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
CN105837690A (zh) 2006-06-12 2016-08-10 新兴产品开发西雅图有限公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8652466B2 (en) 2006-12-08 2014-02-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting
EP2133365B1 (en) 2006-12-27 2017-05-17 Emory University Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
AU2008255352B2 (en) 2007-05-31 2014-05-22 Genmab A/S Stable IgG4 antibodies
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
WO2008156712A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 N. V. Organon Antibodies to human programmed death receptor pd-1
AU2008265984B2 (en) 2007-06-21 2014-07-17 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
CA2694488A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US8062852B2 (en) 2007-10-01 2011-11-22 The Children's Hospital And Regional Medical Center Detection and treatment of autoimmune disorders
AR069747A1 (es) 2007-11-30 2010-02-17 Medarex Inc Conjugado anticuerpo monoclonal anti-b7h4- farmaco y metodos de utilizacion
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
BRPI0907718A2 (pt) 2008-02-11 2017-06-13 Curetech Ltd método para tratar um tumor, método para melhorar a tolerabilidade a pelo menos um agente quimiterápico, método para aumentar a sobrevida de um indivíduo que tem um tumor, método para reduzir ou prevenir recidiva tumoral, uso de um anticorpo monoclonal humanizado ou seu fragmento e anticorpo monoclonal humanizado ou seu fragmento
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
US7565048B1 (en) 2008-05-30 2009-07-21 Ofs Fitel Llc Undersea optical fiber transmission systems
US20110081347A1 (en) 2008-06-04 2011-04-07 Macrogenics, Inc. Antibodies with Altered Binding to FcRn and Methods of Using Same
US8460886B2 (en) 2008-07-04 2013-06-11 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Use of an efficacy marker for optimizing therapeutic efficacy of an anti-human PD-1 antibody on cancers
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
EP2350129B1 (en) 2008-08-25 2015-06-10 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
MX2011006416A (es) 2008-12-19 2011-07-12 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos.
WO2010089411A2 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Universite De La Mediterranee Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
NZ594665A (en) 2009-03-20 2013-08-30 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
BRPI1007602A2 (pt) 2009-05-27 2016-02-16 Hoffmann La Roche "anticorpo tri ou tetraespecífico, método para preparação de um anticorpo triespecífico ou tetraespecífico, célula hospedeira, composição, composição farmacêutica e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia"
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
BR112012007760A2 (pt) 2009-10-07 2015-08-25 Macrogenics Inc Método de atenuar fucosilação pós translacional de uma região fc de igc humana, anticorpo que se liga especificamente a um antigeno de câncer caracteristico de um cancêr polipeptideo
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
EP2507381A4 (en) 2009-12-04 2016-07-20 Hoffmann La Roche MULTISPECIFIC ANTIBODIES, ANTIBODY ANALOGS, COMPOSITIONS AND METHODS
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
PL2361936T3 (pl) 2010-02-25 2016-10-31 Cząsteczka wiążąca antygen i jej zastosowania
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
EP2982380B1 (en) * 2010-03-04 2021-09-01 MacroGenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
TW201134488A (en) * 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
WO2011110604A1 (en) 2010-03-11 2011-09-15 Ucb Pharma, S.A. Pd-1 antibody
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
CA2796181C (en) 2010-04-20 2023-01-03 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
US8876892B2 (en) 2010-04-21 2014-11-04 Medtronic, Inc. Prosthetic heart valve delivery system with spacing
RU2624027C2 (ru) 2010-04-23 2017-06-30 Дженентек, Инк. Получение гетеромультимерных белков
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
CA2802344C (en) 2010-06-18 2023-06-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20130115215A1 (en) 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
EP2601216B1 (en) 2010-08-02 2018-01-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
PL2606064T3 (pl) 2010-08-16 2015-07-31 Novimmune Sa Sposoby wytwarzania wieloswoistych i wielowartościowych przeciwciał
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
DK2691112T3 (en) 2011-03-31 2018-07-30 Merck Sharp & Dohme STABLE FORMULATIONS OF ANTIBODIES AGAINST HUMAN PD (PROGRAMMED DEATH) 1- RECEPTOR AND RELATED TREATMENTS
PT2699264T (pt) 2011-04-20 2018-05-23 Medimmune Llc Anticorpos e outras moléculas que ligam b7-h1 e pd-1
WO2012156430A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Trion Research Gmbh Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
CN107722124A (zh) 2011-05-21 2018-02-23 宏观基因有限公司 能够与人和非人cd3结合的cd3结合分子
ES2605784T3 (es) 2011-05-21 2017-03-16 Macrogenics, Inc. Dominios de enlazamiento a suero desinmunizados y su uso para extender la vida media en suero
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
US20150045540A1 (en) 2011-06-28 2015-02-12 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
PT3357511T (pt) 2011-06-30 2020-07-23 Genzyme Corp Inibidores da ativação de células t
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
WO2013006867A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 Massachussetts Institute Of Technology Methods and apparatus for ultrathin catalyst layer for photoelectrode
CN103687879B (zh) 2011-07-22 2016-05-04 阿菲姆德农业医药公司 多价抗原结合fv分子
AU2012288413B2 (en) 2011-07-24 2016-10-13 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
WO2013060867A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
CA2854806A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
EA037351B8 (ru) 2012-05-15 2021-04-29 Бристол-Майерс Сквибб Компани Способ лечения злокачественных опухолей с использованием комбинации антител против pd-1 и ctla-4
WO2013174873A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
UY34887A (es) * 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
EP2890715B1 (en) 2012-08-03 2020-12-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Single agent anti-pd-l1 and pd-l2 dual binding antibodies and methods of use
WO2014043708A1 (en) 2012-09-17 2014-03-20 Traber Peter G Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
EP2904011B1 (en) 2012-10-02 2017-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat cancer
CN104853776B (zh) 2012-10-12 2021-04-09 布里格姆及妇女医院股份有限公司 免疫应答的增强
EP2912063A1 (en) 2012-10-23 2015-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-kir and anti-ctla-4 antibodies to treat cancer
WO2014066834A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The University Of Chicago Synergistic combination of immunologic inhibitors for the treatment of cancer
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
IL240838B (en) 2013-03-15 2022-09-01 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Anti-3–lag binding proteins
ES2845609T3 (es) 2013-05-02 2021-07-27 Anaptysbio Inc Anticuerpos dirigidos contra muerte programada-1 (PD-1)
WO2014209804A1 (en) 2013-06-24 2014-12-31 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies
DK177790B1 (en) 2013-08-08 2014-07-07 Liqtech Internat A S A METHOD OF PRODUCING A CERAMIC FILTER MEMBRANE, A METHOD OF IMPROVING A CERAMIC FILTER MEMBRANE AND THE CERAMIC FILTER MEMBRANE OBTAINED BY THE METHOD
AR097306A1 (es) 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
EP2840091A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
US10077305B2 (en) 2013-09-10 2018-09-18 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses thereof
EA034666B1 (ru) * 2013-09-13 2020-03-04 Бейджин Свитзерланд Гмбх Антитело против pd-1 и его применение для лечения рака или вирусной инфекции и фрагмент антитела
EP3049442A4 (en) * 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
HUE046249T2 (hu) 2013-12-12 2020-02-28 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd PD-1 antitest, antigén-kötõ fragmense, és gyógyászati alkalmazása
KR102056963B1 (ko) 2013-12-30 2019-12-17 에피맙 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드 Fabs-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도
CA2936244A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Medimmune, Llc Compositions and methods for modulating and redirecting immune responses
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
RS62788B1 (sr) 2014-01-28 2022-02-28 Bristol Myers Squibb Co Anti-lag-3 antitela za lečenje hematoloških maligniteta
KR102442436B1 (ko) 2014-03-14 2022-09-15 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
US20150307620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
CA2949121A1 (en) 2014-05-15 2015-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of lung cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent
RU2718692C2 (ru) 2014-05-29 2020-04-13 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы, которые специфически связывают антигены множества злокачественных опухолей, и способы их применения
WO2015195163A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 R-Pharm Overseas, Inc. Pd-l1 antagonist fully human antibody
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
EP3160497A4 (en) 2014-06-27 2018-01-17 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Conjugates for immunotherapy
BR122020025583B1 (pt) 2014-07-22 2023-12-05 Cb Therapeutics, Inc Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo que liga a pd-1, uso deste, composição, polinucleotídeo isolado e vetor de expressão
CN105330740B (zh) 2014-07-30 2018-08-17 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗pd-1抗体及其应用
US10435470B2 (en) 2014-08-05 2019-10-08 Cb Therapeutics, Inc. Anti-PD-L1 antibodies
PL3177644T3 (pl) 2014-08-05 2021-06-14 MabQuest SA Immunologiczne reagenty wiążące do PD-1
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
GB201419084D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-PD-1 antibodies
US10822414B2 (en) 2014-11-11 2020-11-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-PD-1 antibodies, compositions comprising anti-PD-1 antibodies and methods of using anti-PD-1 antibodies
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
US10239942B2 (en) 2014-12-22 2019-03-26 Pd-1 Acquisition Group, Llc Anti-PD-1 antibodies
EP3253413A2 (en) 2015-02-06 2017-12-13 Kadmon Corporation, LLC Immunomodulatory agents
DK3283107T3 (da) 2015-04-17 2020-08-31 Bristol Myers Squibb Co Sammensætninger omfattende en kombination af ipilimumab og nivolumab
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TWI870335B (zh) * 2015-06-12 2025-01-21 美商宏觀基因股份有限公司 變異的嵌合4d5抗體及其與抗pd-1抗體聯合用於治療癌症的應用
ES2898958T3 (es) * 2015-07-30 2022-03-09 Macrogenics Inc Moléculas de unión a PD-1 y LAG-3 y métodos de uso de las mismas
EP3359192A4 (en) * 2015-10-08 2019-05-01 MacroGenics, Inc. COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT
MA43186B1 (fr) 2015-11-03 2022-03-31 Janssen Biotech Inc Anticorps se liant spécifiquement à pd-1 et leurs utilisations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014194302A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
WO2015042246A1 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors

Also Published As

Publication number Publication date
CO2018000867A2 (es) 2018-04-19
PE20181151A1 (es) 2018-07-17
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PH12018500232A1 (en) 2018-08-29
DK3981792T3 (da) 2024-09-02
EA201890296A1 (ru) 2018-08-31
CN108976300B (zh) 2023-04-14
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SI3456346T1 (sl) 2021-11-30
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