KR102835299B1 - 다중 동위원소체 반응 모니터링에 의한 샘플내 보정 곡선을 사용한 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 LC-MS/MS 분석에서 여러 방법을 제공한다: (1) 샘플의 분석물 농도를 결정하기 위한 LC-MS/MS 분석 기술의 방법으로서, 여기서 샘플내 보정 곡선 (ISCC)이 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM) 모드로 MS/MS를 통해 각 샘플에서 첨가된 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물의 다중 동위원소체 전이의 모니터링을 통한 외부 보정 곡선 대신에 사용되는 것인 방법; (2) 샘플의 분석물 농도를 결정하기 위한 LC-MS/MS 분석 방법으로서, 여기서 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 (OSMECC)이 다중샘플 외부 보정 곡선 대신에 사용되는 것인 방법; 및 (3) 검정의 ULOQ 초과의 분석물 농도를 갖는 샘플의 분석물 농도를 결정하기 위한 LC-MS/MS 분석 방법으로서, 여기서 동위원소 샘플 희석이 모니터링된 MIRM 채널의 동위원소 존재비의 계산에 기초하여 샘플 제조 동안에 샘플을 물리적으로 희석하는 것 대신에 사용되는 것인 방법.

Description

다중 동위원소체 반응 모니터링에 의한 샘플내 보정 곡선을 사용한 분석 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 12월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/775,318을 우선권 주장한다. 미국 가출원 번호 62/775,318의 전문은 본원에 참조로 포함된다.

EFS-WEB을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: "3338_148PC01_SL_ST25.txt"; 크기: 844 바이트; 및 생성일: 2019년 12월 3일)을 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

중개 의학 연구의 최근 급속한 발전과 함께, 전임상 및 임상 연구에서 바이오마커의 정량적 결정, 및 정량적 프로테오믹스는 분자 및 세포 생물학 연구, 약물 발견 및 개발에서, 예컨대 잠재적인 바이오마커를 확인 및 검증하고, 환자 계층화 및 용량 선택을 용이하게 하고, 대리 종점으로서 역할을 하고, 작용 부위에서 PK/PD 관계를 확립하는데 있어서 훨씬 더 중요한 역할을 하고 있다. 발생된 연구 샘플과 동일한 생물학적 매트릭스에서 제작된 외부 보정 곡선의 사용, 및 검정 내부 표준으로서 외부 보정 곡선 및 발생된 연구 샘플 둘 다에서 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물의 사용이 생물학적 매트릭스에서 소분자 약물 및 바이오치료제의 정량적 결정을 위한 정확하고 견고한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 검정의 개발에서 핵심인 것으로 널리 공지되어 있다.

그러나, 전임상 및 임상 연구에서 바이오마커 측정의 경우, 바이오마커의 내인성 성질로 인해, 정품 매트릭스에서 정품 참조 표준을 사용한 외부 보정 곡선의 사용은 많은 경우에 가능하지 않다. 정품 매트릭스에서 SIL 대리 분석물을 사용하는 외부 보정 곡선을 제작하는 것은 대안 중 하나이며, 정품 매트릭스에서 정품 분석물을 사용하는 검정과 동일한 검정 성능을 제공할 수 있는데, 이는 SIL 대리 분석물 및 정품 분석물이 샘플 추출, 크로마토그래피 분리, MS 이온화, 단편화 및 검출과 관련하여 "동일한" 물리화학적 특성을 갖기 때문이다. 그러나, 이 접근법은 검정 내부 표준으로서 또 다른 버전의 SIL 분석물이 필요하기 때문에 쉽게 이용가능하지 않고, 특히 단백질 분석의 경우에 두 가지 버전의 SIL 분석물에 대한 접근은 매우 많은 비용 및 시간이 소모된다. 따라서, 약물 개발의 전임상 또는 임상 단계에서 바이오마커, 약물 또는 이들의 대사산물의 정량적 LC-MS/MS 분석에 대한 다른 접근법을 개발할 필요가 있다.

본 개시내용은 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도를 정량화하기 위한 LC-MS/MS 기술에 관한 것이며, 방법은 하나 이상의 공지된 양(들)의 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물(들)을 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플에 첨가하여 각 첨가된 SIL 분석물(들)의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 하나 이상의 샘플내 보정 곡선(들) (ISCC)을 구축하는 것을 포함하며, 여기서 SIL 분석물의 MIRM은 SIL 분석물의 다중 동위원소 전이의 다중 반응 모니터링을 지칭하고; 여기서 각 분석물에 대한 ISCC는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 상응하는 MIRM 전이에서의 측정된 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS) 피크 면적 사이의 관계에 기초하여 샘플에서 구축되고; 여기서 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도는 확립된 ISCC 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 프로세스로부터의 분석물에 대한 측정된 피크 면적을 사용하여 정량화되고, 여기서 탠덤 질량 분광분석기는 다중 반응 모니터링 모드로 작동된다.

일부 측면에서, 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체는 질량 분광분석기에서 이온화되어 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 양성자화된 (또는 탈양성자화된) 모 이온을 생성한다. 일부 측면에서, 질량 분광분석기에서의 분석물의 모 이온, SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온은 동일한 절단 부위에서 단편화되어 중성 손실 및 딸 이온을 생성한다.

일부 측면에서, 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링되고, 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이에 대한 피크 면적이 측정된다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 다중 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링된다 ("다중 동위원소체 반응 모니터링" 또는 "MIRM").

일부 측면에서, 각 MIRM 전이의 피크 면적이 측정되며, 여기서 MIRM 전이는 SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 전이를 포함한다.

일부 측면에서, 샘플내 보정 곡선은 SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이에서의 측정된 피크 면적, 및 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량 사이의 관계에 기초하여 생성된다.

일부 측면에서, 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량은 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이의 이론적 동위원소 존재비로부터 계산되며, 여기서 이론적 동위원소 존재비는 문헌 [Analytical Chemistry, 2012, 84(11), 4844-4850]에 공개된 방법론을 사용하여 계산되며, 여기서 방법론은 SIL 분석물의 중성 손실 및 딸 이온의 동위원소 분포에 기초하여 계산된다. 다른 측면에서, 단위 해상도 삼중 사중극자 질량 분광분석기의 경우, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 (p+Z_p+α)/Z_p에서 (d+Z_d+β)/Z_d로의 각 MIRM 전이 (m/z)에 대한 이론적 동위원소 존재비는 식 (I)에 기초하여 계산된다:

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 MIRM 전이에서의 동위원소 존재비 =

[(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *

[n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포] (I)

여기서 m/z는 질량 대 전하 비이고,

p는 SIL 분석물의 모 분자의 단일동위원소 질량이고,

Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고,

d는 SIL 분석물의 딸 단편의 단일동위원소 질량이고,

Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수이고,

n은 SIL 분석물의 중성 손실의 단일동위원소 질량이고,

p = d+n이고,

α 및 β는 정수이며, 이들은 각각 모 이온 및 딸 이온 상의 추가 중성자의 수이고, α≥0, β≥0 및 α≥β이고,

Z_p 및 Z_d는 정수이다.

일부 측면에서, 동위원소 존재비 계산기는 worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html (2019년 11월 10일 접속)에 있다. 일부 측면에서, 최고 분석물 농도 당량 (ISCC의 "정량 상한" 또는 "ULOQ")은 식 (II)에 기초하여 계산된다:

(M/V)*(M_분석물/M_{SIL 분석물}) ng/mL (II)

여기서 M (ng)은 샘플에 첨가된 SIL 분석물의 총량이고;

V는 SIL 분석물이 첨가되기 전의 샘플 부피 (mL)이고;

M_분석물은 분석물의 분자량이고;

M_{SIL 분석물}은 SIL 분석물의 분자량이다.

일부 측면에서, MIRM 전이에서의 다른 분석물 농도 당량 중 하나 이상은 식 (III)에 기초하여 계산된다:

I_a*ULOQ (ng/mL) (III)

여기서 I_a는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비이다.

본 방법은 상응하는 SIL 분석물을 사용하여 단백질인 분석물을 검출 또는 정량화하는데 효과적이다. 일부 측면에서, 분석물은 단백질 또는 펩티드이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 안정한 동위원소 표지된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 측면에서, 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 모 이온은 적어도 약 3개의 아미노산, 적어도 약 4개의 아미노산, 적어도 약 5개의 아미노산, 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 7개의 아미노산, 적어도 약 8개의 아미노산, 적어도 약 9개의 아미노산, 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 11개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 13개의 아미노산, 적어도 약 14개의 아미노산, 적어도 약 15개의 아미노산, 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 17개의 아미노산, 적어도 약 18개의 아미노산, 적어도 약 19개의 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 모 이온은 4 내지 20개의 아미노산, 4 내지 15개의 아미노산, 5 내지 15개의 아미노산, 4 내지 14개의 아미노산, 5 내지 14개의 아미노산, 5 내지 13개의 아미노산, 5 내지 12개의 아미노산, 6 내지 15개의 아미노산, 6 내지 14개의 아미노산, 6 내지 13개의 아미노산, 6 내지 12개의 아미노산, 6 내지 11개의 아미노산, 6 내지 10개의 아미노산, 6 내지 9개의 아미노산, 6 내지 8개의 아미노산, 7 내지 15개의 아미노산, 7 내지 14개의 아미노산, 7 내지 13개의 아미노산, 7 내지 12개의 아미노산, 7 내지 11개의 아미노산, 7 내지 10개의 아미노산, 또는 7 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분석물은 항체이다. 다른 측면에서, 분석물은 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 분석물은 단백질 및 이종 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 측면에서, 분석물은 Fc 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1, PD-L1, CD73, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD73 항체 또는 이들의 임의의 조합이다.

본 방법은 또한 소분자인 분석물을 검출 또는 정량화하는데 효과적이다. 일부 측면에서, 분석물은 소분자이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 안정한 동위원소 표지된 소분자이다. 일부 측면에서, 소분자는 적어도 약 100 g/mol, 적어도 약 200 g/mol, 적어도 약 300 g/mol, 적어도 약 400 g/mol, 적어도 약 500 g/mol, 적어도 약 600 g/mol, 적어도 약 700 g/mol, 적어도 약 800 g/mol, 적어도 약 900 g/mol, 적어도 약 1000 g/mol, 적어도 약 1100 g/mol, 적어도 약 1200 g/mol, 적어도 약 1300 g/mol, 적어도 약 1400 g/mol, 적어도 약 1500 g/mol, 적어도 약 1600 g/mol, 적어도 약 1700 g/mol, 적어도 약 1800 g/mol, 적어도 약 1900 g/mol, 또는 적어도 약 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다.

본 방법은 동위원소로 표지된 SIL 분석물의 사용을 수반한다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 6개, 적어도 약 7개, 적어도 약 8개, 적어도 약 9개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 또는 적어도 약 20개의 안정한 동위원소 표지를 함유한다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 약 3 내지 약 20개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 19개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 15개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 10개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 8개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 7개의 동위원소 표지, 약 3 내지 약 6개의 동위원소 표지, 약 4 내지 약 15개의 동위원소 표지, 약 4 내지 약 10개의 동위원소 표지, 약 4 내지 약 8개의 동위원소 표지, 약 4 내지 약 7개의 동위원소 표지, 약 4 내지 약 6개의 동위원소 표지, 약 5 내지 약 8개의 동위원소 표지, 약 5 내지 약 7개의 동위원소 표지, 약 6 내지 약 10개의 동위원소 표지, 약 6 내지 약 8개의 동위원소 표지, 약 7 내지 약 16개의 동위원소 표지, 약 7 내지 약 16개의 동위원소 표지, 약 8 내지 약 16개의 동위원소 표지, 약 8 내지 약 15개의 동위원소 표지, 약 9 내지 약 15개의 동위원소 표지, 약 9 내지 약 14개의 동위원소 표지, 약 10 내지 약 14개의 동위원소 표지, 약 10 내지 약 13개의 동위원소 표지, 또는 약 11 내지 약 13개의 동위원소 표지를 함유한다.

측정을 위한 MIRM 전이의 선택은 견고하고 정확한 검정 성능을 보장하기 위한 본 방법의 중요한 요소이다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 각각은 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 15% 미만의 편차를 갖는다.

일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 중 적어도 하나는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만, 또는 0.0001% 미만의 편차를 갖는다.

일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 4 내지 15이다.

일부 측면에서, SIL 분석물의 최고 MIRM 전이 및 최저 MIRM 전이의 분석물 농도 당량은 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 또는 적어도 약 2000배 차이이다.

일부 측면에서, 2개의 선택된 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비는 적어도 0.01% 이격, 적어도 0.05% 이격, 적어도 0.1% 이격, 적어도 0.5% 이격, 적어도 1% 이격, 적어도 1.5% 이격, 적어도 2% 이격, 적어도 2.5% 이격, 적어도 3% 이격, 적어도 3.5% 이격, 적어도 4% 이격, 적어도 4.5% 이격, 적어도 5% 이격, 적어도 5.5% 이격, 적어도 6% 이격, 적어도 6.5% 이격, 적어도 7% 이격, 적어도 7.5% 이격, 적어도 8% 이격, 적어도 8.5% 이격, 적어도 9% 이격, 적어도 9.5% 이격, 적어도 10% 이격, 적어도 20% 이격, 적어도 30% 이격, 적어도 40% 이격 또는 적어도 약 50% 이격된다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 비-표지된 분석물을 함유한다.

일부 측면에서, 표지는 ²H, ¹³C, ¹⁵N, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ¹⁷O 또는 ¹⁸O이다.

본 방법은 분석물 (분자)을 이온화하기 위해 이온 공급원을 사용하는 질량 분광분석법을 수반한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 양성자화된 또는 탈양성자화된 분자(들)는 단일 하전, 이중 하전, 삼중 하전 또는 그 초과로 하전된다. 일부 측면에서, 질량 분광분석기는 Q1, Q2 및 Q3을 포함하는 삼중 사중극자 질량 분광분석기이다. 일부 측면에서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도는 단위 해상도이다. 다른 측면에서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도는 단위 해상도보다 더 높다. 다른 측면에서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도는 상이하다. 다른 측면에서, Q1에 사용되는 해상도는 Q3의 단위 해상도보다 더 높다.

일부 측면에서, 샘플내 보정 곡선 (ISCC) 조성물 (즉, 공지된 양의 SIL-분석물)은 샘플 제조 전에 또는 동안에 첨가된다.

본 방법은 특히 외부 보정 곡선이 기기에서 실행될 필요가 없는 경우에 고도로 효과적이고 총 필요한 기기 시간을 개선시킨다. 일부 측면에서, 방법은 총 기기 실행 시간을 감소시킨다. 일부 측면에서, 외부 보정 곡선은 사용되지 않는다. 일부 측면에서, 분석물은 바이오마커이다. 일부 측면에서, 분석물은 대사산물이다. 일부 측면에서, 분석물은 소분자 약물이다. 일부 측면에서, 분석물은 펩티드이다. 일부 측면에서, 분석물은 단백질이다.

본 방법은 생물학적 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터의 분석물을 검출 또는 정량화하는데 효과적이다. 일부 측면에서, 샘플은 혈청, 조직, 생검 조직, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE), 혈장, 타액, 뇌척수액, 누액, 소변, 윤활액, 건조 혈반 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 측면에서, 분석물은 CD73 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 LAAFPED[Arg(¹³C₆, ¹⁵N₄)] (서열식별번호: 2)이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-L1 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3)이다. 일부 측면에서, 분석물은 다클라타스비르이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르이다.

본 방법은 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 포함하는 조성물을 개시하며, 여기서 ISCC는 안정한 동위원소 표지된 분석물의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 구축된다.

본 방법은 또한 연구 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도를 정량화하는 방법을 개시하며, 방법은 하나 이상의 공지된 양(들)의 하나 이상의 분석물(들)을 블랭크 매트릭스 샘플에 첨가하여 각 첨가된 분석물(들)의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 하나 이상의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선(들) (OSMECC)을 구축하는 것을 포함하며, 여기서 분석물의 MIRM은 분석물의 다중 동위원소 전이의 다중 반응 모니터링을 지칭하고; 여기서 각 분석물에 대한 OSMECC는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 상응하는 MIRM 전이에서의 측정된 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS) 피크 면적 (또는 내부 표준이 검정에 사용되는 경우의 피크 면적 비) 사이의 관계에 기초하여 블랭크 매트릭스 샘플에서 구축되고; 여기서 연구 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도는 확립된 OSMECC 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 프로세스로부터의 분석물에 대한 측정된 피크 면적 (또는 내부 표준이 검정에 사용되는 경우의 피크 면적 비)을 사용하여 정량화되고; 여기서 분석물에 대한 피크 면적 비는 분석물의 피크 면적을 내부 표준의 피크 면적으로 나눈 값이고, 여기서 탠덤 질량 분광분석기는 다중 반응 모니터링 모드로 작동된다.

일부 측면에서, 분석물의 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량은 분석물 또는 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이의 이론적 동위원소 존재비로부터 계산되며, 여기서 이론적 동위원소 존재비는 문헌 [Analytical Chemistry, 2012, 84(11), 4844-4850]에 공개된 방법론을 사용하여 계산되며, 여기서 방법론은 분석물의 중성 손실 및 딸 이온의 동위원소 분포에 기초하여 계산된다.

일부 측면에서, 단위 해상도 삼중 사중극자 질량 분광분석기의 경우, 분석물 및 분석물의 자연 발생 동위원소체의 (p+Z_p+α)/Z_p에서 (d+Z_d+β)/Z_d로의 각 MIRM 전이 (m/z)에 대한 이론적 동위원소 존재비는 식 (I)에 기초하여 계산된다:

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 MIRM 전이에서의 동위원소 존재비 =

[(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *

[n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포] (I)

여기서 m/z는 질량 대 전하 비이고,

p는 분석물의 모 분자의 단일동위원소 질량이고,

Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고,

d는 분석물의 딸 단편의 단일동위원소 질량이고,

Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수이고,

n은 분석물의 중성 손실의 단일동위원소 질량이고,

p = d+n이고,

α 및 β는 정수이며, α≥0, β≥0 및 α≥β이고,

Z_p 및 Z_d는 정수이다.

일부 측면에서, 동위원소 분포 계산기는 worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html (2019년 11월 10일 접속)에 있다. 일부 측면에서, 최고 분석물 농도 당량 (ISCC의 "정량 상한" 또는 "ULOQ")은 식 (II)에 기초하여 계산된다:

(M/V)* ng/mL (IV)

여기서 M (ng)은 샘플에 첨가된 분석물의 총량이고;

V는 분석물이 첨가되기 전의 샘플 부피 (mL)이다.

일부 측면에서, MIRM 전이에서의 다른 분석물 농도 당량 중 하나 이상은 식 (III)에 기초하여 계산된다:

I_a*ULOQ (ng/mL) (III)

여기서 I_a는 분석물 또는 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비이다.

일부 측면에서, 분석물은 단백질 또는 펩티드이다. 일부 측면에서, 분석물의 모 이온은 적어도 약 3개의 아미노산, 적어도 약 4개의 아미노산, 적어도 약 5개의 아미노산, 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 7개의 아미노산, 적어도 약 8개의 아미노산, 적어도 약 9개의 아미노산, 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 11개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 13개의 아미노산, 적어도 약 14개의 아미노산, 적어도 약 15개의 아미노산, 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 17개의 아미노산, 적어도 약 18개의 아미노산, 적어도 약 19개의 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 분석물의 모 이온은 4 내지 20개의 아미노산, 4 내지 15개의 아미노산, 5 내지 15개의 아미노산, 4 내지 14개의 아미노산, 5 내지 14개의 아미노산, 5 내지 13개의 아미노산, 5 내지 12개의 아미노산, 6 내지 15개의 아미노산, 6 내지 14개의 아미노산, 6 내지 13개의 아미노산, 6 내지 12개의 아미노산, 6 내지 11개의 아미노산, 6 내지 10개의 아미노산, 6 내지 9개의 아미노산, 6 내지 8개의 아미노산, 7 내지 15개의 아미노산, 7 내지 14개의 아미노산, 7 내지 13개의 아미노산, 7 내지 12개의 아미노산, 7 내지 11개의 아미노산, 7 내지 10개의 아미노산, 또는 7 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분석물은 항체이다. 일부 측면에서, 분석물은 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1, PD-L1, CD73, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD73 항체 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 분석물은 소분자이다.

일부 측면에서, 소분자는 적어도 약 100 g/mol, 적어도 약 200 g/mol, 적어도 약 300 g/mol, 적어도 약 400 g/mol, 적어도 약 500 g/mol, 적어도 약 600 g/mol, 적어도 약 700 g/mol, 적어도 약 800 g/mol, 적어도 약 900 g/mol, 적어도 약 1000 g/mol, 적어도 약 1100 g/mol, 적어도 약 1200 g/mol, 적어도 약 1300 g/mol, 적어도 약 1400 g/mol, 적어도 약 1500 g/mol, 적어도 약 1600 g/mol, 적어도 약 1700 g/mol, 적어도 약 1800 g/mol, 적어도 약 1900 g/mol, 또는 적어도 약 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 2 내지 20이다. 일부 측면에서, 최고 MIRM 및 최저 MIRM의 분석물 농도 당량은 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 또는 적어도 약 2000배 차이이다. 일부 측면에서, 2개의 선택된 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비는 적어도 0.01% 이격, 적어도 0.05% 이격, 적어도 0.1% 이격, 적어도 0.5% 이격, 적어도 1% 이격, 적어도 1.5% 이격, 적어도 2% 이격, 적어도 2.5% 이격, 적어도 3% 이격, 적어도 3.5% 이격, 적어도 4% 이격, 적어도 4.5% 이격, 적어도 5% 이격, 적어도 5.5% 이격, 적어도 6% 이격, 적어도 6.5% 이격, 적어도 7% 이격, 적어도 7.5% 이격, 적어도 8% 이격, 적어도 8.5% 이격, 적어도 9% 이격, 적어도 9.5% 이격, 적어도 10% 이격, 적어도 20% 이격, 적어도 30% 이격, 적어도 40% 이격 또는 적어도 약 50% 이격된다.

도 1은 PD-L1에 대한 대리 펩티드를 예로서 사용한 MIRM-ISCC-MS/MS 방법론에 대한 개략도를 제시한다. SIL 분석물의 양은 적절한 보정 곡선을 생성하기 위해 분석물의 예상된 농도에 기초하여 첨가된다. 라인 1은 SIL 분석물 MIRM 채널 1 (m/z: 464.2→686.4), 동위원소 존재비 100%: 100 ng/mL의 SIL 분석물 농도 (99.4 ng/mL의 분석물 농도 당량)를 제시하고; 라인 2는 SIL 분석물 MIRM 채널 2 (m/z: 464.7→687.4), 동위원소 존재비 30.0%: 30.0 ng/mL의 SIL 분석물 농도 (29.8 ng/mL의 분석물 농도 당량)를 제시하고; 라인 3은 SIL 분석물 MIRM 채널 3 (m/z: 465.2→688.4), 동위원소 존재비 6.63%: 6.63 ng/mL의 SIL 분석물 농도 (6.59 ng/mL의 분석물 농도 당량)를 제시하고; 라인 4는 분석물 선택된 반응 모니터링 (SRM) 채널 (m/z: 461.2→680.4), 측정된 농도: 56.8 ng/mL를 제시한다.
도 2a 및 2b는 SIL CD73 펩티드의 10개의 MIRM 채널, 및 CD73 펩티드에 대한 하나의 선택된 반응 모니터링 (SRM) 채널에 대한 대표적인 크로마토그램을 제시한다. 이들 10개의 MIRM 채널은 CD73의 정량적 분석을 위한 ISCC를 구축하는데 사용된다. 도 2a는 줌 아웃 그래프이고; 도 2b는 줌 인 그래프이다.
도 3은 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 (OSMECC) 및 동위원소 샘플 희석에 대한 LC-MS/MS 생분석 워크플로우를 제시한다.
도 4a 및 4b. 도 4a는 다클라타스비르의 측정을 위한 다중샘플 외부 보정 곡선, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 (OSMECC), 샘플내 보정 곡선 (ISCC) 및 동위원소 샘플 희석에 대해 모니터링된 MRM 및 MIRM 전이의 요약을 제시한다. 도 4b는 사용된 2개의 다중샘플 외부 보정 곡선 및 2개의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선, 뿐만 아니라 2개의 ISCC에 대한 보정 곡선 성능을 제시한다.
도 5a 및 5b. 도 5a는 다중샘플 외부 보정 곡선, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선, 및 ISCC를 사용하여 정량화된 QC 샘플에 대한 정확도 및 정밀도 데이터를 제시한다. 보정 곡선 범위 내의 농도 (1, 3, 40, 500 및 800 ng/mL)를 갖는 QC 샘플 및 보정 곡선 범위 초과의 농도 (5000 및 20000 ng/mL)를 갖는 QC 샘플 둘 다를 시험하였다. 그러나, 5000 및 20000 ng/mL의 QC 샘플은 샘플 제조 동안에 보정 곡선 범위로 물리적으로 희석되었다 (각각 100 및 200배). 도 5b는 동위원소 샘플 희석을 사용하여 정량화된 QC 샘플에 대한 정확도 및 정밀도 데이터를 제시한다. 보정 곡선 범위 초과의 농도 (5000, 20000 및 50000 ng/mL)를 갖는 QC 샘플만을 시험하였다.

본 개시내용은 LC-MS/MS를 통해 분석물의 농도를 정량화하기 위한 고도로 효과적인 접근법을 제공한다. 구체적으로, 접근법은 안정적으로 표지된 동위원소 (SIL) 분석물을 사용한 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 사용하여 샘플 내 분석물의 농도를 측정한다. 본 개시내용의 특징은 외부 보정 곡선 대신에 ISCC를 사용하여, 이에 의해 LC-MS/MS 총 기기 실행 시간을 감소시킬 수 있다는 것이다. 또한, ISCC가 샘플 자체 내부에 존재하기 때문에, 본 방법은 외부 보정 곡선을 제작하기 위해 정품 생물학적 매트릭스를 사용할 필요를 제거하고 정량적 LC-MS/MS 생분석 프로세스를 단순화한다.

작업 예에 제시된 바와 같이, 접근법은 농도 곡선을 생성하기 위해 동위원소 전이의 MIRM 모니터링을 통해 분석물 농도를 정량화하는데 효과적이다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 분석물을 함유하는 샘플에 SIL 분석물을 첨가하는 방법을 제공하며, 여기서 분석물은 SIL 분석물의 "다중 동위원소체 반응 모니터링" 또는 "MIRM"으로부터 생성된 ISCC를 통해 정량화될 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 안정한 동위원소 표지된 단백질 또는 단백질 단편을 사용하여 단백질 분석물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 항체의 농도를 정량화하는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 소분자의 안정한 동위원소 표지된 변이체를 사용하여 소분자를 분석하는 방법을 제공한다.

I. 용어

본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 다른 하나를 포함하거나 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 그러므로, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

본원에서 "포함하는"이라는 언어로 측면이 기재되는 경우마다 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 면에서 기재된 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용된 많은 일반 용어 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는 이들의 국제단위계 (SI) 승인 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 명세서 전체를 참조하여 가질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 그 전문이 명세서를 참조하여 더 완전히 정의된다.

대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "하나"는 임의의 언급 또는 열거된 "하나 이상"의 성분을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "약" 또는 "본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 실행당 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 구성된"은 최대 10%의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성이 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 구성된"의 의미는 특정 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.

본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "바이오마커"는 사실상 임의의 검출가능한 화합물, 예컨대 단백질, 펩티드, 프로테오글리칸, 당단백질, 지단백질, 탄수화물, 지질, 핵산 (예를 들어, DNA, 예컨대 cDNA 또는 증폭된 DNA, 또는 RNA, 예컨대 mRNA), 유기 또는 무기 화학물질, 천연 또는 합성 중합체, 소분자 (예를 들어, 대사산물), 또는 임의의 전술한 것들의 식별 분자 또는 식별 단편, 즉 생물학적 샘플에 존재하거나 이로부터 유래된 것, 또는 정상적인 생물학적 프로세스, 병원성 프로세스, 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응, 또는 그의 적응증의 지표로서 객관적으로 측정 및 평가되는 임의의 다른 특징이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "대사산물"은 대사의 임의의 중간체 및 생성물을 지칭한다. 약물 대사산물의 존재는 사람이 해당 대사산물의 "모" 약물을 사용했다는 신뢰가능한 지표이다. 대사산물은 바이오마커일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "대사 프로파일"은 또 다른 샘플 또는 샘플 그룹으로부터 유래된 참조 값 또는 프로파일과의 비교를 위해 사용될 수 있는 대사산물에 대한 정량적 결과의 임의의 정의된 값 세트를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동위원소체"는 적어도 하나의 원자가 상이한 수의 중성자를 갖는다는 점에서 그의 모 조성물과 상이한 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분석물"은 분석 또는 정량화가 요구되는 혼합물에 존재하는 임의의 분자 또는 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 이러한 분석물은 제한 없이 소분자, 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 펩티드, 면역글로불린 (예를 들어, 항체), 및/또는 임의의 융합 단백질을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동위원소" 및 "동위원소체"는 상호교환적으로 사용되며, 모 분자와 비교하여 상이한 동위원소 조성을 갖는 분자를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분석물 당량" 또는 "분석물 농도 당량"은 SIL 분석물 및 분석물 사이의 질량 차이를 조정한 후 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 구축하기 위해 사용되는 SIL 분석물의 계산된 농도를 지칭한다. ISCC 보정 곡선은 SIL 분석물의 MIRM을 병렬로 측정하여 각 MIRM의 피크 면적을 결정하는 것에 기초하여 구축된다. SIL 분석물 및 비표지된 분석물 사이의 질량 차이로 인해, 계산된 농도 곡선은 이들 사소한 질량 차이를 고려하여 조정되어야 하며, 또한 동위원소 존재비에 대해 조정되어야 한다. 대표적인 ISCC 농도 곡선은 도 1에서 볼 수 있으며, 여기서 SIL 분석물 농도는 질량 차이 및 동위원소 존재비를 설명하기 위해 조정된다. 농도 곡선의 최고 농도 (정량 상한 "ULOQ")에 대한 분석물 당량을 계산하기 위한 샘플 조정은 도 1에서 포인트 1로 표시되고, 식 (II)에 기초하여 계산된다:

(M/V)*(M_분석물/M_{SIL 분석물}) ng/mL (II)

여기서 M (ng)은 샘플에 첨가된 SIL 분석물의 총량이고;

V는 SIL 분석물이 첨가되기 전의 샘플 부피 (mL)이고;

M_분석물은 분석물의 분자량이고;

M_{SIL 분석물}은 SIL 분석물의 분자량이다.

예를 들어, SIL 분석물이 100 ng/mL의 공지된 농도로 첨가되고 MIRM이 100%의 동위원소 존재비를 갖는 경우, 분석물 농도 당량은 99.4 ng/mL일 것이고 (데이터 포인트 1로서 도 1에 표시됨), 또한 ULOQ이다. 농도 곡선의 나머지 분석물 당량 농도에 대한 샘플 조정은 도 1에서 포인트 2 및 3으로 표시되고, 식 (III)에 기초하여 계산된다:

I_a*ULOQ (ng/mL) (III)

여기서 I_a는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모 이온" 또는 "전구체 이온"은 해리되어 단편을 형성할 수 있는 전기적으로 하전된 분자 모이어티 (이들 중 하나 이상은 전기적으로 하전될 수 있음) 및 하나 이상의 중성 종을 지칭한다. 모 이온은 분자 이온 또는 분자 이온의 전기적으로 하전된 단편일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "딸 이온"은 특정 모 (전구체) 이온의 반응의 전기적으로 하전된 생성물을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 이온은 특정 전구체 이온과 직접적인 관계를 갖고, 전구체 이온의 고유한 상태와 관련될 수 있다. 반응은 단편화를 수반할 필요는 없지만, 예를 들어 운반되는 전하의 수의 변화를 수반할 수 있다. 그러므로 단편 이온은 딸 이온이지만, 모든 딸 이온이 단편 이온은 아니다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "중성 손실"은 질량 분광분석기의 작동 동안 특정 모 (전구체) 이온의 반응 동안 손실되는 중성 전하의 질량을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비-펩티드 분자"는 가장 넓은 의미로 의도되고, 소분자 및 소분자 약물을 포함할 수 있다. "소분자" 또는 "소분자 약물"은 전형적으로 약 1000-2000 g/mol 미만의 분자량을 갖는 유기, 무기 또는 유기금속 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 광범위하게 사용되지만, 이 특징화는 본 발명의 목적을 위해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. "소분자"는 또한 실험실에서 합성되거나 자연에서 발견되는 비-펩티드성, 비-올리고머성 유기 화합물을 지칭할 수 있다. "소분자"의 예는 탁솔, 클로피도그렐 및 아픽사반을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 소분자의 다른 예는 다파글리플로진, 삭사글립틴, 템사비르, 레디파스비르, 소포스부비르 및 로수바스타틴을 포함한다.

용어 "크로마토그래피"는 혼합물에 존재하는 다른 분자 (예를 들어, 오염물질)로부터 분자 (예를 들어, 항체)를 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다. 일반적으로, 분자는 이동상의 영향 하에 있거나 결합 및 용출 프로세스에서 혼합물의 개별 분자가 고정 매질을 통해 이동하는 속도의 차이로 인해 다른 분자 (예를 들어, 오염물질)로부터 분리된다. 용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 분리 프로세스에서 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 분자를 분리하는 임의의 종류의 흡착제, 수지 또는 고체상을 지칭한다. 비제한적인 예는 칼럼 또는 카트리지에 넣을 수 있는 막 뿐만 아니라 미립자, 모놀리식 또는 섬유성 수지를 포함한다. 매트릭스를 형성하기 위한 물질의 예는 다당류 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스); 및 다른 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어 제어된 공극 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 이들의 임의의 유도체를 포함한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 전형적인 매트릭스 유형의 예는 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지 또는 혼합 모드 수지이다. "리간드"는 크로마토그래피 매트릭스에 부착되고 매트릭스의 결합 특성을 결정하는 관능기이다. "리간드"의 예는 이온 교환 기, 소수성 상호작용 기, 친수성 상호작용 기, 친황성 상호작용 기, 금속 친화성 기, 친화성 기, 생체친화성 기, 및 혼합 모드 기 (상기 언급된 것들의 조합)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는 강한 양이온 교환 기, 예컨대 술포프로필, 술폰산; 강한 음이온 교환 기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환 기, 예컨대 카르복실산; 약한 음이온 교환 기, 예컨대 N5N 디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용 기, 예컨대 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성 기, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용을 보다 쉽게 이해할 수 있게 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어 각각은 하기 제시된 의미를 가질 수 있다. 추가 정의는 본 출원 전체에 걸쳐 제시되어 있다.

용어 "친화성 크로마토그래피"는 분자 (예를 들어, 분자 또는 항체를 함유하는 Fc 영역)가 분자에 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기술을 지칭한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생체특이적 리간드로 지칭된다. 일부 측면에서, 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체)는 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유결합으로 부착되고, 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉할 때 용액에서 분자에 접근가능하다. 분자는 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드에 대한 특이적 결합 친화성을 유지하는 반면, 혼합물 내의 다른 용질 및/또는 단백질은 리간드에 현저하게 또는 특이적으로 결합하지 않는다. 고정된 리간드에 대한 분자의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과할 수 있게 하는 반면, 분자는 고체상 물질 상의 고정된 리간드에 특이적으로 결합된 상태로 유지된다. 그 후, 특이적으로 결합된 분자는 적합한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등) 하에서 고정된 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 이전에 칼럼을 통해 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 없는 용출 완충액을 사용하여 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과한다. 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 임의의 성분이 사용될 수 있다. 그러나, 본 개시내용에 따른 다양한 방법에서, 단백질 A는 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역에 대한 리간드로서 사용된다. 표적 단백질 (예를 들어, 단백질을 함유하는 Fc 영역)의 생체특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A)로부터의 용출 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그의 기능적 변이체는 생체특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 생체특이적 리간드, 예컨대 단백질 A는 단백질을 함유하는 Fc 영역에 결합하고 생체특이적 리간드/표적 단백질 접합체를 세척 또는 재평형화하기 위해 5-9의 pH 범위에서 사용된 후, 적어도 하나의 염을 함유하는 약 4 이하의 pH를 갖는 완충액으로 용출된다.

본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "정제하는", "분리하는", 또는 "단리하는"은 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분자의 순도 정도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 분자의 순도 정도는 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.

본원에서 사용된 바와 같은 크로마토그래피와 관련된 용어 "크로마토그래피 칼럼" 또는 "칼럼"은 종종 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지로 충진된 실린더 또는 중공 기둥 형태의 컨테이너를 지칭한다. 크로마토그래피 매트릭스 또는 수지는 정제에 사용되는 물리적 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질이다.

용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 이온화가능한 관심 용질 (예를 들어, 혼합물 내의 분자)이 pH 및 전도도의 적절한 조건하에 고체상 이온 교환 물질에 연결된 반대로 하전된 리간드와 (예를 들어, 공유결합 부착에 의해) 상호작용하여, 관심 용질이 혼합물 내의 용질 불순물 또는 오염물질보다 더 많거나 적은 하전된 화합물과 비-특이적으로 상호작용하도록 하는 크로마토그래피 프로세스를 지칭한다. 혼합물 내의 오염 용질은 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 세척될 수 있거나, 관심 용질보다 빠르거나 느리게 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다. "이온 교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환 (CEX), 음이온 교환 (AEX) 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.

"양이온 교환 수지" 또는 "양이온 교환 막"은 음으로 하전되고 고체상 위로 또는 고체상을 통해 통과된 수용액에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체상을 지칭한다. 양이온 교환 수지를 형성하기에 적합한 고체상에 부착된 임의의 음으로 하전된 리간드, 예를 들어, 카르복실레이트, 술포네이트 및 하기 기재된 바와 같은 다른 것들이 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 양이온 교환 수지는 예를 들어, 술포네이트 기반 기를 갖는 것들 (예를 들어, 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터의 모노S, 미니S, 소스 15S 및 30S, SP 세파로스(SP SEPHAROSE)® 패스트 플로우, SP 세파로스® 고성능, 토소(Tosoh)로부터의 토요펄(TOYOPEARL)® SP-650S 및 SP-650M, 바이오래드(BioRad)로부터의 마크로-프렙(MACRO-PREP)® 하이 S, 폴 테크놀로지스(Pall Technologies)로부터의 세라믹 하이퍼D S, 트리스아크릴(TRISACRYL)® M 및 LS SP 및 스페로덱스 LS SP); 술포에틸 기반 기 (예를 들어, EMD로부터의 프락토겔(FRACTOGEL)® SE, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터의 포로스(POROS)® S-10 및 S-20); 술포프로필 기반 기 (예를 들어, 토소로부터의 TSK 겔 SP 5PW 및 SP-5PW-HR, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터의 포로스® HS-20, HS 50, 및 포로스® XS); 술포이소부틸 기반 기 (예를 들어, EMD로부터의 프락토겔® EMD SO₃ ^-); 술폭시에틸 기반 기 (예를 들어, 와트만(Whatman)으로부터의 SE52, SE53 및 익스프레스-이온 S), 카르복시메틸 기반 기 (예를 들어, 지이 헬스케어로부터의 CM 세파로스(CM SEPHAROSE)® 패스트 플로우, 바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)로부터의 히드로셀 CM, 바이오래드로부터의 마크로-프렙® CM, 폴 테크놀로지스로부터의 세라믹 하이퍼D CM, 트리스아크릴® M CM, 트리스아크릴® LS CM, 밀리포어(Millipore)로부터의 매트렉스 셀루파인(Matrex CELLUFINE)® C500 및 C200, 와트만으로부터의 CM52, CM32, CM23 및 익스프레스-이온 C, 토소로부터의 토요펄® CM-650S, CM-650M 및 CM-650C); 술폰산 및 카르복실산 기반 기 (예를 들어, 제이. 티. 베이커(J. T. Baker)로부터의 베이커본드(BAKERBOND)® 카르복시-술폰); 카르복실산 기반 기 (예를 들어, 제이. 티. 베이커로부터의 WP CBX, 다우 리퀴드 세퍼레이션스(Dow Liquid Separations)로부터의 다우엑스(DOWEX)®. MAC-3, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 앰버라이트(AMBERLITE)® 약한 양이온 교환기, 다우엑스® 약한 양이온 교환기, 및 다이아이온(DIAION)® 약한 양이온 교환기 및 EMD로부터의 프락토겔® EMD COO--); 술폰산 기반 기 (예를 들어, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 SP, 다우 리퀴드 세퍼레이션스로부터의 다우엑스® 파인 메쉬 강산 양이온 수지, 제이. 티. 베이커로부터의 우노스피어 S, WP 술포닉, 사토리우스(Sartorius)로부터의 사토바인드(SARTOBIND)® S 막, 시그마-알드리치로부터의 앰버라이트® 강한 양이온 교환기, 다우엑스® 강한 양이온 및 다이아이온® 강한 양이온 교환기); 또는 오르토포스페이트 기반 기 (예를 들어, 와트만으로부터의 P11)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

다른 양이온 교환 수지는 포로스 HS, 포로스 XS, 카르복시-메틸-셀룰로스, 베이커본드 ABXTM, 아가로스 상에 고정된 술포프로필 및 아가로스 상에 고정된 술포닐, 모노S, 미니S, 소스 15S, 30S, SP 세파로스™, CM 세파로스™, 베이커본드 카르복시-술폰, WP CBX, WP 술포닉, 히드로셀 CM, 히드로셀 SP, 우노스피어 S, 마크로-프렙 하이 S, 마크로-프렙 CM, 세라믹 하이퍼D S, 세라믹 하이퍼D CM, 세라믹 하이퍼D Z, 트리스아크릴 M CM, 트리스아크릴 LS CM, 트리스아크릴 M SP, 트리스아크릴 LS SP, 스페로덱스 LS SP, 다우엑스 파인 메쉬 강산 양이온 수지, 다우엑스 MAC-3, 매트렉스 셀루파인 C500, 매트렉스 셀루파인 C200, 프락토겔 EMD SO3-, 프락토겔 EMD SE, 프락토겔 EMD COO-, 앰버라이트 약한 및 강한 양이온 교환기, 다이아이온 약한 및 강한 양이온 교환기, TSK 겔 SP-5PW-HR, TSK 겔 SP-5PW, 토요펄 CM (650S, 650M, 650C), 토요펄 SP (650S, 650M, 650C), CM (23, 32, 52), SE(52, 53), P11, 익스프레스-이온 C 또는 익스프레스-이온 S를 포함한다.

"음이온 교환 수지" 또는 "음이온 교환 막"은 양으로 하전되어 여기에 부착된 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고체상을 지칭한다. 음이온성 교환 수지를 형성하기에 적합한 고체상에 부착된 임의의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4차 아미노 기가 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 음이온 교환 수지는 어플라이드 바이오시스템스로부터의 DEAE 셀룰로스, 포로스® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50, 사토리우스로부터의 사토바인드® Q, 모노Q, 미니Q, 소스 15Q 및 30Q, Q, DEAE 및 ANX 세파로스® 패스트 플로우, Q 세파로스® 고성능, QAE 세파덱스® 및 FAST Q 세파로스® (지이 헬스케어), 제이. 티. 베이커로부터의 WP PEI, WP DEAM, WP QUAT, 바이오크롬 랩스 인크.로부터의 히드로셀 DEAE 및 히드로셀 QA, 바이오래드로부터의 우노스피어 Q, 마크로-프렙®. DEAE 및 마크로-프렙® 하이 Q, 폴 테크놀로지스로부터의 세라믹 하이퍼D Q, 세라믹 하이퍼D DEAE, 트리스아크릴® M 및 LS DEAE, 스페로덱스 LS DEAE, QMA 스페로실(QMA SPHEROSIL)® LS, QMA 스페로실®. M 및 머스탱(MUSTANG)® Q, 다우 리퀴드 세퍼레이션스로부터의 다우엑스® 파인 메쉬 강한 염기 유형 I 및 유형 II 음이온 수지 및 다우엑스® 모노스피어 77, 약한 염기 음이온, 밀리포어로부터의 인터셉트(INTERCEPT)® Q 막, 매트렉스 셀루파인® A200, A500, Q500, 및 Q800, EMD로부터의 프락토겔® EMD TMAE, 프락토겔® EMD DEAE 및 프락토겔® EMD DMAE, 시그마-알드리치로부터의 앰버라이트® 약한 강한 음이온 교환기 유형 I 및 II, 다우엑스® 약한 및 강한 음이온 교환기 유형 I 및 II, 다이아이온® 약한 및 강한 음이온 교환기 유형 I 및 II, 듀오라이트(DUOLITE)®, 토소로부터의 TSK 겔 Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, 토요펄® 슈퍼Q-650S, 650M 및 650C, QAE-550C 및 650S, DEAE-650M 및 650C, 와트만으로부터의 QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, 익스프레스-이온 D 또는 익스프레스-이온 Q, 및 사토바인드® Q (사토리우스 코포레이션, 미국 뉴욕주)를 포함한다.

다른 음이온 교환 수지는 포로스 HQ, Q 세파로스(Q Sepharose)™ 패스트 플로우, DEAE 세파로스(DEAE Sepharose)™ 패스트 플로우, 사토바인드® Q, ANX 세파로스(ANX Sepharose)™ 4 패스트 플로우 (high sub), Q 세파로스™ XL, Q 세파로스™ 빅 비드, DEAE 세파덱스 A-25, DEAE 세파덱스 A-50, QAE 세파덱스 A-25, QAE 세파덱스 A-50, Q 세파로스™ 고성능, Q 세파로스™ XL, 소스 15Q, 소스 30Q, 리소스 Q, 캅토 Q, 캅토 DEAE, 모노 Q, 토요펄 슈퍼 Q, 토요펄 DEAE, 토요펄 QAE, 토요펄 Q, 토요펄 기가캡 Q, TS 겔 슈퍼Q, TS 겔 DEAE, 프락토겔 EMD TMAE, 프락토겔 EMD TMAE 하이캡, 프락토겔 EMD DEAE, 프락토겔 EMD DMAE, 마크로프렙 하이 Q, 마크로-프렙-DEAE, 우노스피어 Q, 누비아 Q, PORGS PI, DEAE 세라믹 하이퍼D, 또는 Q 세라믹 하이퍼D를 포함한다.

"질량 분광분석법" ("MS" 또는 "질량-스펙")은 질량-대-전하 비 이온을 측정하는데 사용되는 분석 기술이다. 이는 샘플을 이온화하고 상이한 질량의 이온을 분리하고 이온 플럭스의 강도를 측정하여 이들의 상대 존재비를 기록함으로써 달성된다. 전형적인 질량 분광분석기는 세 부분을 포함한다: 이온 공급원, 질량 분석기 및 검출기 시스템. 이온 공급원은 분석 중인 물질 (분석물)을 이온화하는 질량 분광분석기의 일부이다. 그 후, 이온은 자기장 또는 전기장에 의해 이들의 질량-대-전하 비 (m/z)에 따라 이온을 분리하는 질량 분석기로 수송된다. 많은 질량 분광분석기는 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS)을 위해 2개 이상의 질량 분석기를 사용한다. 검출기는 이온이 표면을 통과하거나 표면에 부딪힐 때 유도된 전하 또는 생성된 전류를 기록한다. 질량 스펙트럼은 질량 분석기로 m/z 이온을 스캔할 때 검출기에서 생성된 신호를 측정한 결과이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "샘플내 보정 곡선 (ISCC)"은 예를 들어, LC-MS/MS 분석을 수행하기 위해 전통적으로 사용되는 외부 보정 곡선이 아니라 샘플 매트릭스 자체에 존재하는 보정 곡선을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "SIL 분석물" 또는 "안정한 동위원소 표지된 분석물"은 하나 이상의 위치에서 동위원소를 함유하도록 변형된 분석물 또는 그의 단편인 화합물을 지칭한다. 가장 일반적인 표지화 기술은 ¹³C 또는 ¹⁵N을 안정한 동위원소로 사용하고, 화합물은 하나 이상의 위치에서 표지될 수 있다. 다른 적합한 안정한 동위원소는 ²H, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ¹⁷O 또는 ¹⁸O를 포함한다.

용어 "다중 동위원소체 반응 모니터링" 또는 MIRM은 모 이온 및 그의 동위원소체 이온 (상이한 중성자를 갖는 모 이온)으로부터 동일한 절단 부위를 갖는 이들의 생성물 이온으로의 특정 다중 반응 모니터링 (MRM) 전이 (또한 "MIRM 채널" 또는 "MIRM 전이"로 지칭됨)를 모니터링하기 위해 질량 분광분석기가 조정되는 프로세스를 지칭한다. 보다 일반적으로, 질량 분광분석기를 사용하여 단일 이온 단독을 측정하는 경우, 이 프로세스는 또한 선택된 반응 모니터링 (SRM)이라고 한다. 하나 이상의 전구체 이온으로부터 다중 생성물 이온이 생성되는 SRM을 통해 다중 반응을 측정하는 경우, 이 프로세스는 다중 반응 모니터링 (MRM)으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 삼중-사중극자 질량 분광분석기에 대한 SRM 실험에서, 제1 사중극자 (Q1)는 샘플에서 예상된 화학적 종의 특정된 m/z (전구체 이온)의 이온만 통과하도록 설정된다. 제2 사중극자 (즉, Q2 또는 충돌 셀)는 Q1을 통해 통과하는 이온을 단편화하는데 사용된다. 제3 사중극자 (Q3)는 예상된 화학적 종의 예상된 단편화 생성물에 상응하는 특정된 m/z (단편 이온)의 이온만 검출기로 통과하도록 설정된다. 수많은 SRM 실험이 실행되는 경우, 이 프로세스는 다중 반응 모니터링 ("MRM")이라고 한다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "MIRM 전이" 또는 대안적으로 모-딸 이온 전이 쌍 "PDITP"는 모니터링되는 m/z 값의 쌍을 지칭한다. 간략히, 딸 이온 D (d+1.00783*Z_d의 단일동위원소 질량, Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수임) 및 중성 손실 N (n의 단일동위원소 질량)을 갖는 모 이온 P (p+1.00783*Z_p의 단일동위원소 질량, Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고, 수소 단일동위원소 질량은 1.00783 Da임)의 경우, 가장 풍부한 (100%) MIRM 채널 (m/z)은 하기에 제시된다:

(p+1.00783* Z_p)/Z_p → (d+1.00783* Z_d)/Z_d

가장 일반적으로 사용되는 전하 상태 (단일-, 이중- 및 삼중- 하전된 이온)를 사용하는 단위 해상도 삼중 사중극자 질량 분광분석기의 경우, 이 MIRM 채널 (m/z)은 하기와 같이 단순화될 수 있다:

(p+Z_p)/Z_p → (d+Z_d)/Z_d

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 (m/z)는 하기와 같이 계산될 수 있다:

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 =

[(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *

[n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포]

여기서: (1) p = d+n이고,

(2) α 및 β는 정수이며, 이들은 각각 모 이온 및 딸 이온 상의 추가 중성자의 수이고, α≥0, β≥0 및 α≥β이다.

(3) Z_p 및 Z_d는 정수이다.

(4) 분자의 동위원소 분포는 온라인 계산기를 사용하여 찾을 수 있다 (worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html, 2019년 11월 10일 접속)

(5) d (α=0) 및 n (α-β=0)의 질량에서 딸 이온 및 중성 손실의 상대 동위원소 분포는 각각 100%이다.

α 및 β의 상이한 조합을 사용함으로써, (p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 상이한 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 (m/z)는 정확하게 계산 및 측정될 수 있다.

본 개시내용의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 더 상세히 설명된다.

II. 정량화 방법

본 개시내용은 다중 동위원소체 반응 모니터링 - 샘플내 곡선 보정 - LC - MS/MS (MIRM-ISCC-LC-MS/MS) 방법론에 관한 것이며, 이는 외부 보정 곡선을 사용하지 않고 각 개별 샘플의 즉각적이고 정확한 측정을 허용하여, 정품 생물학적 매트릭스를 사용할 필요를 제거하고, 정량적 LC-MS/MS 생분석 프로세스를 단순화하고, 기기 시간을 크게 감소시킨다. MIRM-ISCC-LC-MS/MS 방법론은 약물 발견 및 개발에서 정기적인 약동학 (PK) 샘플 분석에 적용될 수 있지만, 이 방법론은 정품 매트릭스가 거의 이용가능하지 않은 경우, 예컨대 바이오마커 측정 및 정량적 프로테오믹스에 특히 유용하고, 여기서 낮은 처리량 및 긴 회송 시간은 LC-MS/MS 기술, 예컨대 임상 진단 실험실에서 임상 진단의 사용을 방지하는 주요 문제이고, 신선 동결 및 FFPE 조직 분석과 같이 보정 곡선 제작은 번거롭다. 추가로, ISCC는 또한 블랭크 매트릭스에 공지된 양의 비-표지된 분석물을 스파이킹함으로써 외부 보정 곡선으로서 사용될 수 있고, 따라서 외부 보정 곡선이 단 하나의 샘플에서 구축될 수 있으므로, 외부 보정 곡선을 위한 다중 샘플의 제조에 대한 필요를 제거한다.

일반적으로, 분석물의 가장 풍부한 MIRM 채널은 정량적 분석을 위해 LC-MS/MS 검정에서 모니터링된다. 원소의 자연 발생 동위원소로 인해, 그의 가장 풍부한 MIRM 채널에서 관찰되는 MS/MS 반응 외에도, 가장 풍부한 MIRM 채널에 인접한 동위원소 MIRM 채널의 동위원소 존재비는 LC-MS/MS에 의해 정확하게 계산 및 측정될 수 있다. 간략히, 딸 이온 D (d+1.00783*Z_d의 단일동위원소 질량, Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수임) 및 중성 손실 N (n의 단일동위원소 질량)을 갖는 모 이온 P (p+1.00783*Z_p의 단일동위원소 질량, Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고, 수소 단일동위원소 질량은 1.00783 Da임)의 경우, 가장 풍부한 (100%) MIRM 채널 (m/z)은 하기에 제시된다:

(p+1.00783* Z_p)/Z_p → (d+1.00783* Z_d)/Z_d

가장 일반적으로 사용되는 전하 상태 (단일-, 이중- 및 삼중- 하전된 이온)를 사용하는 단위 해상도 삼중 사중극자 질량 분광분석기의 경우, 이 MIRM 채널 (m/z)은 하기와 같이 단순화될 수 있다:

(p+Z_p)/Z_p → (d+Z_d)/Z_d

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 (m/z)는 하기와 같이 계산될 수 있다:

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 =

[(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *

[n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포]

여기서: (1) p = d+n이고,

(2) α 및 β는 정수이며, 이들은 각각 모 이온 및 딸 이온 상의 추가 중성자의 수이고, α≥0, β≥0 및 α≥β이다.

(3) Z_p 및 Z_d는 정수이다.

(4) 분자의 동위원소 분포는 온라인 계산기를 사용하여 찾을 수 있다 (worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html, 2019년 11월 10일 접속)

(5) d (α=0) 및 n (α-β=0)의 질량에서 딸 이온 및 중성 손실의 상대 동위원소 분포는 각각 100%이다.

α 및 β의 상이한 조합을 사용함으로써, (p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 상이한 인접 MIRM 채널의 동위원소 존재비 (m/z)는 정확하게 계산 및 측정될 수 있다. 가장 풍부한 MIRM 채널 (α=0 및 β=0)에서 가장 낮은 풍부한 MIRM 채널까지의 동위원소 존재비는 5 내지 6 자릿수만큼 높은 값에 도달할 수 있다. 이론적으로, 이들 동위원소 존재비는 딸 이온 및 중성 손실의 상이한 동위원소의 조합에서 비롯되고 "동일한" 물리화학적 특성을 갖기 때문에, 전체 범위에 걸쳐 모든 인접 MIRM 채널에서 MS/MS 반응 (피크 면적) 및 계산된 이론적 동위원소 존재비 사이에 선형 관계가 존재해야 한다. 그러나, 이 선형 관계는 질량 분광분석기의 검출 한계 뿐만 아니라 대부분의 질량 분광분석기의 선형 범위에 의해 제한된다. 이 선형 관계를 유지하기 위해, SIL 분석물에 사용되는 모든 MIRM 채널 및 분석물에 사용되는 SRM 채널에 대해 동일한 질량 분광분석기 파라미터, 예컨대 체류 시간, 충돌 에너지 (CE) 및 디클러스터링 전위 (DP) 등을 설정하는 것이 필요하다.

본 방법은 정량적 LC-MS/MS 생분석을 위한 모든 연구 샘플에서 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 구축하기 위해 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM) 채널의 동위원소 존재비를 사용하는 완전히 새로운 방법론을 입증한다. MIRM-ISCC-LC-MS/MS 방법론의 수많은 잠재적인 적용, 예컨대 소분자, 펩티드, 단백질, 바이오마커의 정량적 분석, 정량적 프로테오믹스, 임상 진단 실험실 및 다른 영역에서 사용된다.

동위원소 희석 원리를 사용한 LC-MS 프로테오믹스에서의 절대 정량화는 공지된 양의 SIL 펩티드 (AQUA 접근법) 또는 단백질 (PSAQ 접근법)을 각 연구 샘플에 스파이킹함으로써 달성되었다. 연구 샘플의 펩티드 (또는 단백질) 농도는 비-표지된 펩티드 (또는 단백질)의 피크 면적 및 표지된 펩티드 (또는 단백질)의 피크 면적 사이의 비을 사용하여 계산될 수 있다. 그러나, 이 정량화 접근법은 원점을 통해 통과하는 선형 관계가 MS 반응 (또는 반응 비) 및 상응하는 농도 사이에 존재한다는 가정하에 단 하나의 보정 포인트에 기초한다.

최근에, 이 문제를 해결하기 위해, 문헌 [Chiva et al. (66th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 3-7, 2018, San Diego, CA, p ThP 481)]은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플에서 표적화된 펩티드의 절대 정량화를 위해 각 연구 샘플에 보정 곡선을 스파이킹함으로써 정확하고 견고한 검정을 개발하였음을 보고하였다. 이 보정 곡선은 2 내지 200 fmol의 상이한 농도 수준에서 5개의 상이한 SIL 펩티드 분석물 (각 SIL 펩티드 분석물에 대해 각각 10, 16, 23, 33 및 39의 총 표지화 위치 포함)을 사용하여 사전 제작되었다. 그러나, 하나의 표적화된 펩티드의 분석에 30 내지 40개만큼 많은 표지화 위치를 갖는 다중 상이하게 표지된 펩티드 분석물이 필요하기 때문에, 이 접근법은 특히 다중 표적화된 펩티드의 정량적 프로테오믹스의 경우에 매우 많은 비용 및 시간이 소모된다.

본 개시내용에 유용한 방법은 샘플 중 적어도 하나의 분석물의 존재를 검출하고/거나 그의 농도를 정량화하는 것을 수반하며, 방법은 하나 이상의 공지된 양(들)의 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물(들)을 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플에 첨가하여 각 첨가된 SIL 분석물(들)의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 하나 이상의 샘플내 보정 곡선(들) (ISCC)을 구축하는 것을 포함하며, 여기서 SIL 분석물의 MIRM은 SIL 분석물의 다중 동위원소 전이의 다중 반응 모니터링을 지칭하고; 여기서 각 분석물에 대한 ISCC는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 상응하는 MIRM 전이에서의 측정된 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS) 피크 면적 사이의 관계에 기초하여 샘플에서 구축되고; 여기서 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도는 확립된 ICSS 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 프로세스로부터의 분석물에 대한 측정된 피크 면적을 사용하여 정량화되고, 여기서 탠덤 질량 분광분석기는 다중 반응 모니터링 모드로 작동된다.

일부 측면에서, 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체는 질량 분광분석기에서 이온화되어 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 양성자화된 (또는 탈양성자화된) 모 이온을 생성한다. 일부 측면에서, 질량 분광분석기에서의 분석물의 모 이온, SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온은 동일한 절단 부위에서 단편화되어 중성 손실 및 딸 이온을 생성한다.

일부 측면에서, 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링되고, 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이에 대한 피크 면적이 측정된다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 다중 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링된다 ("다중 동위원소체 반응 모니터링" 또는 "MIRM").

일부 측면에서, 각 MIRM 전이의 피크 면적이 측정되며, 여기서 MIRM 전이는 SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 전이를 포함한다.

일부 측면에서, 샘플내 보정 곡선은 SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이에서의 측정된 피크 면적, 및 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량 사이의 관계에 기초하여 생성된다.

일부 측면에서, 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량은 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이의 이론적 동위원소 존재비로부터 계산되며, 여기서 이론적 동위원소 존재비는 문헌 [Analytical Chemistry, 2012, 84(11), 4844-4850]에 공개된 방법론을 사용하여 계산되며, 여기서 방법론은 SIL 분석물의 중성 손실 및 딸 이온의 동위원소 분포에 기초하여 계산된다. 다른 측면에서, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 (p+Z_p+α)/Z_p에서 (d+Z_d+β)/Z_d로의 각 MIRM 전이 (m/z)에 대한 이론적 동위원소 존재비는 식 (I)에 기초하여 계산된다:

(p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 MIRM 전이에서의 동위원소 존재비 =

[(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *

[n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포] (I)

여기서 m/z는 질량 대 전하 비이고,

p는 SIL 분석물의 모 분자의 단일동위원소 질량이고,

Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고,

d는 SIL 분석물의 딸 단편의 단일동위원소 질량이고,

Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수이고,

n은 SIL 분석물의 중성 손실의 단일동위원소 질량이고,

p = d+n이고,

α 및 β는 정수이며, 이들은 각각 모 이온 및 딸 이온 상의 추가 중성자의 수이고, α≥0, β≥0 및 α≥β이고,

Z_p 및 Z_d는 정수이다.

일부 측면에서, 동위원소 존재비 계산기는 worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html (2019년 11월 10일 접속)에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, 최고 분석물 농도 당량 (ISCC의 "정량 상한" 또는 "ULOQ")은 식 (II)에 기초하여 계산된다:

(M/V)*(M_분석물/M_{SIL 분석물}) ng/mL (II)

여기서 M (ng)은 샘플에 첨가된 SIL 분석물의 총량이고;

V는 SIL 분석물이 첨가되기 전의 샘플 부피 (mL)이고;

M_분석물은 분석물의 분자량이고;

M_{SIL 분석물}은 SIL 분석물의 분자량이다.

일부 측면에서, MIRM 전이에서의 다른 분석물 농도 당량 중 하나 이상은 식 (III)에 기초하여 계산된다:

I_a*ULOQ (ng/mL) (III)

여기서 I_a는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비이다.

본 개시내용에 유용한 방법은 분석물을 함유하는 샘플에 첨가되는 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물의 사용을 수반한다. 그 후, 이 SIL 분석물은 샘플에 존재하는 분석물의 농도를 정량화하기 위한 농도 보정 곡선을 구축하기 위해 MIRM 기술을 통해 모니터링될 수 있다. 일부 측면에서, 분석물은 단백질 또는 펩티드이고, SIL 분석물은 안정한 동위원소 표지된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 적어도 약 3개의 아미노산, 적어도 약 4개의 아미노산, 적어도 약 5개의 아미노산, 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 7개의 아미노산, 적어도 약 8개의 아미노산, 적어도 약 9개의 아미노산, 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 11개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 13개의 아미노산, 적어도 약 14개의 아미노산, 적어도 약 15개의 아미노산, 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 17개의 아미노산, 적어도 약 18개의 아미노산, 적어도 약 19개의 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 아미노산, 적어도 약 21개의 아미노산, 적어도 약 22개의 아미노산, 적어도 약 23개의 아미노산, 적어도 약 24개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 26개의 아미노산, 적어도 약 27개의 아미노산, 적어도 약 28개의 아미노산, 적어도 약 29개의 아미노산, 적어도 약 30개의 아미노산, 적어도 약 31개의 아미노산, 적어도 약 32개의 아미노산, 적어도 약 33개의 아미노산, 적어도 약 34개의 아미노산, 적어도 약 35개의 아미노산, 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 37개의 아미노산, 적어도 약 38개의 아미노산, 적어도 약 39개의 아미노산, 또는 적어도 약 40개의 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 4 내지 40개의 아미노산, 4 내지 35개의 아미노산, 5 내지 35개의 아미노산, 4 내지 34개의 아미노산, 5 내지 34개의 아미노산, 5 내지 33개의 아미노산, 5 내지 32개의 아미노산, 6 내지 35개의 아미노산, 6 내지 34개의 아미노산, 6 내지 33개의 아미노산, 6 내지 32개의 아미노산, 6 내지 31개의 아미노산, 6 내지 30개의 아미노산, 6 내지 29개의 아미노산, 6 내지 28개의 아미노산, 7 내지 35개의 아미노산, 7 내지 34개의 아미노산, 7 내지 33개의 아미노산, 7 내지 32개의 아미노산, 7 내지 31개의 아미노산, 7 내지 30개의 아미노산, 또는 7 내지 29개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 분석물 또는 SIL 분석물의 모 이온은 7 내지 11개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 8 내지 11개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 8 내지 10개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 8 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 6 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 6 내지 10개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 4 내지 30개의 아미노산, 4 내지 25개의 아미노산, 5 내지 25개의 아미노산, 4 내지 24개의 아미노산, 5 내지 24개의 아미노산, 5 내지 23개의 아미노산, 5 내지 22개의 아미노산, 6 내지 25개의 아미노산, 6 내지 24개의 아미노산, 6 내지 23개의 아미노산, 6 내지 22개의 아미노산, 6 내지 21개의 아미노산, 6 내지 20개의 아미노산, 7 내지 25개의 아미노산, 7 내지 24개의 아미노산, 7 내지 23개의 아미노산, 7 내지 22개의 아미노산, 7 내지 21개의 아미노산, 또는 7 내지 20개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 4 내지 20개의 아미노산, 4 내지 15개의 아미노산, 5 내지 15개의 아미노산, 4 내지 14개의 아미노산, 5 내지 14개의 아미노산, 5 내지 13개의 아미노산, 5 내지 12개의 아미노산, 6 내지 15개의 아미노산, 6 내지 14개의 아미노산, 6 내지 13개의 아미노산, 6 내지 12개의 아미노산, 6 내지 11개의 아미노산, 6 내지 10개의 아미노산, 6 내지 9개의 아미노산, 6 내지 8개의 아미노산, 7 내지 15개의 아미노산, 7 내지 14개의 아미노산, 7 내지 13개의 아미노산, 7 내지 12개의 아미노산, 7 내지 11개의 아미노산, 7 내지 10개의 아미노산, 또는 7 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 안정한 동위원소 표지된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 측면에서, SIL 분석물의 모 이온은 적어도 약 3개의 아미노산, 적어도 약 4개의 아미노산, 적어도 약 5개의 아미노산, 적어도 약 6개의 아미노산, 적어도 약 7개의 아미노산, 적어도 약 8개의 아미노산, 적어도 약 9개의 아미노산, 적어도 약 10개의 아미노산, 적어도 약 11개의 아미노산, 적어도 약 12개의 아미노산, 적어도 약 13개의 아미노산, 적어도 약 14개의 아미노산, 적어도 약 15개의 아미노산, 적어도 약 16개의 아미노산, 적어도 약 17개의 아미노산, 적어도 약 18개의 아미노산, 적어도 약 19개의 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, 분석물은 항체이다. 다른 측면에서, 분석물은 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 분석물은 단백질 및 이종 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 측면에서, 분석물은 Fc 융합 단백질이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1, PD-L1, CD73, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD73 항체 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 분석물은 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIM3 항체, 항-IL8 항체 또는 이들의 임의의 조합이다.

본 방법은 상응하는 SIL 분석물을 사용하여 단백질인 분석물을 검출 또는 정량화하는데 효과적이다. 일부 측면에서, 분석물은 항체이다. 일부 측면에서, 분석물은 CD73 또는 항-CD73 항체 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1 또는 항-PD-1 항체, 예컨대 니볼루맙, 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-L1 또는 항-PD-L1 항체, 예컨대 이필리무맙, 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 항-OX40 (또한 CD134, TNFRSF4, ACT35 및/또는 TXGP1L로 공지됨) 항체 (예를 들어, BMS986178 또는 MDX-1803), 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 울로쿠플루맙 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 BMS-986156 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 BMS-986016 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 BMS-986207 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 BMS-986253 또는 그의 단편이다. 일부 측면에서, 분석물은 BMS-986258 또는 그의 단편이다.

일부 측면에서, 분석물은 항-PD-1 항체이다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (또한 옵디보(OPDIVO)®, 5C4, BMS-936558, MDX-1106 및 ONO-4538로 공지됨), 펨브롤리주맙 (머크(Merck); 또한 키트루다(KEYTRUDA)®, 램브롤리주맙 및 MK-3475로 공지됨; WO2008/156712 참조), PDR001 (노바티스(Novartis); WO 2015/112900 참조), MEDI-0680 (아스트라제네카(AstraZeneca); 또한 AMP-514로 공지됨; WO 2012/145493 참조), 세미플리맙 (리제네론(Regeneron); 또한 REGN-2810으로 공지됨; WO 2015/112800 참조), JS001 (타이저우 준시 파마(TAIZHOU JUNSHI PHARMA); 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), BGB-A317 (베이진(Beigene); WO 2015/35606 및 US 2015/0079109 참조), INCSHR1210 (장쑤 헝루이 메디슨(Jiangsu Hengrui Medicine); 또한 SHR-1210으로 공지됨; WO 2015/085847; 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), TSR-042 (테사로 바이오파마슈티칼(Tesaro Biopharmaceutical); 또한 ANB011로 공지됨; WO2014/179664 참조), GLS-010 (우시시/하얼빈 글로리아 파마슈티칼스(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals); 또한 WBP3055로 공지됨; 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), AM-0001 (아르모(Armo)), STI-1110 (소렌토 테라퓨틱스(Sorrento Therapeutics); WO 2014/194302 참조), AGEN2034 (아제너스(Agenus); WO 2017/040790 참조), MGA012 (매크로제닉스(Macrogenics), WO 2017/19846 참조), 및 IBI308 (이노벤트(Innovent); WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825 및 WO 2017/133540 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 측면에서, 분석물은 항-PD-L1 항체이다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559 (또한 12A4, MDX-1105로 공지됨; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,943,743 및 WO 2013/173223 참조), 아테졸리주맙 (로슈(Roche); 또한 티쎈트릭(TECENTRIQ)®; MPDL3280A, RG7446으로 공지됨; US 8,217,149 참조; 또한, 문헌 [Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000] 참조), 더발루맙 (아스트라제네카; 또한 임핀지(IMFINZI)™, MEDI-4736으로 공지됨; WO 2011/066389 참조), 아벨루맙 (화이자(Pfizer); 또한 바벤시오(BAVENCIO)®, MSB-0010718C로 공지됨; WO 2013/079174 참조), STI-1014 (소렌토; WO2013/181634 참조), CX-072 (사이톰엑스; WO2016/149201 참조), KN035 (3D 메드/알파맵(3D Med/Alphamab); 문헌 [Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)] 참조, LY3300054 (일라이 릴리 캄파니(Eli Lilly Co.); 예를 들어, WO 2017/034916 참조), 및 CK-301 (체크포인트 테라퓨틱스(Checkpoint Therapeutics); 문헌 [Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)] 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 측면에서, 분석물은 CD73 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-1 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 LAAFPED[Arg(¹³C₆, ¹⁵N₄)] (서열식별번호: 2)이다. 일부 측면에서, 분석물은 PD-L1 또는 그의 일부이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3)이다. 일부 측면에서, 분석물은 다클라타스비르이다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르이다.

일부 측면에서, 분석물은 비-펩티드 분자이다. 일부 측면에서, 분석물은 적어도 100 g/mol, 적어도 200 g/mol, 적어도 300 g/mol, 적어도 400 g/mol, 적어도 500 g/mol, 적어도 600 g/mol, 적어도 700 g/mol, 적어도 800 g/mol, 적어도 900 g/mol, 적어도 1000 g/mol, 적어도 1100 g/mol, 적어도 1200 g/mol, 적어도 1300 g/mol, 적어도 1400 g/mol, 적어도 1500 g/mol, 적어도 1600 g/mol, 적어도 1700 g/mol, 적어도 1800 g/mol, 적어도 1900 g/mol, 또는 적어도 2000 g/mol의 분자량을 갖는다.

일부 측면에서, 분석물은 항균제 또는 항바이러스제이다. 일부 측면에서, 분석물은 B형 간염, C형 간염, HIV, 매독 또는 이들의 임의의 조합에 대한 작용제이다. 다른 측면에서, 항-HCV 활성을 갖는 분석물은 HCV 메탈로프로테아제, HCV 세린 프로테아제, HCV 폴리머라제, HCV 헬리카제, HCV NS4B 단백질, HCV 진입, HCV 어셈블리, HCV 유출, HCV NS5A 단백질 및 IMPDH로부터 선택된 표적의 기능을 억제하는데 효과적인 것들, 및/또는 HCV 또는 플라비비리다에 감염의 치료를 위한 사이클로스포린 유사체 및/또는 뉴클레오시드 유사체이다.

본 개시내용에서 사용될 수 있는 분석물 중에서, 선택적 HCV 세린 프로테아제 억제제로서, 특허 번호 WO/1999/007733, WO/2005/007681, WO/2005/028502, WO/2005/035525, WO/2005/037860, WO/2005/077969, WO/2006/039488, WO/2007/022459, WO/2008/106058, WO 2008/106139, WO/2000/009558, WO/2000/009543, WO/1999/064442, WO/1999/007733, WO/1999/07734, WO/1999/050230 및 WO/1998/017679에 개시된 펩티드 화합물이다. NS5B 폴리머라제 억제제가 또한 활성을 나타내었다. 이들 작용제는 HCV RNA 의존적 RNA 폴리머라제의 다른 억제제, 예컨대, 예를 들어, WO01/90121(A2), 또는 미국 특허 번호 6,348,587B1 또는 WO01/60315 또는 WO01/32153에 기재된 뉴클레오시드 유형 폴리머라제 억제제, 또는 비-뉴클레오시드 억제제, 예컨대 EP 162196A1 또는 WO02/04425에 기재된 벤즈이미다졸 폴리머라제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

페길화된 알파-인터페론 및 리바비린의 조합 외에도, HCV 바이러스 복제를 선택적으로 억제하는, HCV-감염된 환자를 치료하는데 유용한 화합물의 다른 조합이 바람직하다. 특히, 다른 바이러스 표적을 억제하는데 효과적인 것과 조합하여 NS5A 단백질의 기능을 억제하는데 효과적인 약제가 바람직하다. HCV NS5A 단백질은 예를 들어, 문헌 [Tan, S.-L.; Katzel, M. G. Virology (2001) 284, 1-12] 및 [Park, K.-J.; Choi, S.-H, J. Biological Chemistry (2003)]에 기재되어 있다. HCV NS5A 억제제의 합성을 기재한 관련 특허 개시내용은 US 2009/0202478; US 2009/0202483; WO 2009/020828; WO 2009/020825; WO 2009/102318; WO 2009/102325; WO 2009/102694; WO 2008/144380; WO 2008/021927; WO 2008/021928; WO 2008/021936; WO 2006/133326; WO 2004/014852; WO 2008/070447; WO 2009/034390; WO 2006/079833; WO 2007/031791; WO 2007/070556; WO 2007/070600; WO 2008/064218; WO 2008/154601; WO 2007/082554; WO 2008/048589; WO 2010/017401; WO 2010/065668; WO 2010/065674; WO 2010/065681이며, 이들 각각의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.

일부 측면에서, 분석물은 소분자이다. 일부 측면에서, 분석물은 탁솔, 클로피도그렐, 아픽사반, 다파글리플로진, 삭사글립틴, 템사비르, 레디파스비르, 소포스부비르, 또는 로수바스타틴이다. 일부 측면에서, 분석물은 탁솔이다. 일부 측면에서, 분석물은 클로피도그렐이다. 일부 측면에서, 분석물은 아픽사반이다. 일부 측면에서, 분석물은 다파글리플로진이다. 일부 측면에서, 분석물은 삭사글립틴이다. 일부 측면에서, 분석물은 템사비르이다. 일부 측면에서, 분석물은 레디파스비르이다. 일부 측면에서, 분석물은 소포스부비르이다. 일부 측면에서, 분석물은 로수바스타틴이다.

다른 측면에서, 분석물은 핵산 분자, 예를 들어, DNA, RNA, 예를 들어, mRNA이다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 적어도 약 10개의 핵산, 적어도 약 15개의 핵산, 적어도 약 20개의 핵산, 적어도 약 25개의 핵산, 적어도 약 30개의 핵산, 적어도 약 40개의 핵산, 적어도 약 50개의 핵산, 적어도 약 100개의 핵산, 적어도 약 200개의 핵산, 적어도 약 300개의 핵산, 적어도 약 400개의 핵산, 적어도 약 500개의 핵산, 적어도 약 600개의 핵산, 적어도 약 700개의 핵산, 적어도 약 800개의 핵산, 적어도 약 900개의 핵산, 적어도 약 1000개의 핵산, 적어도 약 1200개의 핵산, 적어도 약 1400개의 핵산, 적어도 약 1600개의 핵산, 적어도 약 1800개의 핵산, 적어도 약 2000개의 핵산, 적어도 약 2200개의 핵산, 적어도 약 2400개의 핵산, 적어도 약 2600개의 핵산, 적어도 약 2800개의 핵산, 또는 적어도 약 3000개의 핵산이다.

일부 측면에서, 분석물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 측면에서, 분석물은 siRNA 또는 miRNA이다. 다른 측면에서, 분석물은 유전자 요법 벡터 또는 플라스미드이다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 6개, 적어도 약 7개, 적어도 약 8개, 적어도 약 9개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개의 동위원소 표지, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 26개, 적어도 약 27개, 적어도 약 28개, 적어도 약 29개, 적어도 약 30개, 적어도 약 31개, 적어도 약 32개, 적어도 약 33개, 적어도 약 34개, 적어도 약 35개, 적어도 약 36개, 적어도 약 37개, 적어도 약 38개, 적어도 약 39개, 또는 적어도 약 40개의 동위원소 표지를 함유한다.

측정을 위한 MIRM 전이의 선택은 견고하고 정확한 검정 성능을 보장하기 위한 본 방법의 중요한 요소이다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 각각은 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 15% 미만의 편차를 갖는다.

일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 중 적어도 하나는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.08% 미만, 0.07% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만, 0.01% 미만, 0.009% 미만, 0.008% 미만, 0.007% 미만, 0.006% 미만, 0.005% 미만, 0.004% 미만, 0.003% 미만, 0.002% 미만, 0.001% 미만, 0.009% 미만, 0.008% 미만, 0.007% 미만, 0.006% 미만, 0.005% 미만, 0.004% 미만, 0.003% 미만, 0.002% 미만, 또는 0.0001% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 14% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 13% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 12% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 11% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 10% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 9% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 8% 미만의 편차를 갖는다. 일부 측면에서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 모두는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 7% 미만의 편차를 갖는다.

일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 4 내지 15, 4 내지 14, 5 내지 13, 5 내지 12, 6 내지 12, 6 내지 11, 7 내지 11, 7 내지 10, 8 내지 10, 또는 8 내지 9이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 4 내지 10, 4 내지 9, 5 내지 9, 6 내지 9, 6 내지 8, 또는 7 내지 8이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 6이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 7이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 10이다. 일부 측면에서, MIRM 전이의 수는 15이다.

일부 측면에서, 최고 MIRM 채널 및 최저 MIRM 채널의 분석물 농도 당량은 적어도 약 10, 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 적어도 약 2000, 적어도 약 2100, 적어도 약 2200, 적어도 약 2300, 적어도 약 2400, 적어도 약 2500, 적어도 약 2600, 적어도 약 2700, 적어도 약 2800, 적어도 약 2900, 적어도 약 3000, 적어도 약 3100, 적어도 약 3200, 적어도 약 3300, 적어도 약 3400, 적어도 약 3500, 적어도 약 3600, 적어도 약 3700, 적어도 약 3800, 적어도 약 3900, 적어도 약 4000, 적어도 약 4100, 적어도 약 4200, 적어도 약 4300, 적어도 약 4400, 적어도 약 4500, 적어도 약 4600, 적어도 약 4700, 적어도 약 4800, 적어도 약 4900, 적어도 약 5000, 적어도 약 5100, 적어도 약 5200, 적어도 약 5300, 적어도 약 5400, 적어도 약 5500, 적어도 약 5600, 적어도 약 5700, 적어도 약 5800, 적어도 약 5900, 또는 적어도 약 6000배 차이이다.

일부 측면에서, 2개의 선택된 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비는 적어도 0.01% 이격, 적어도 0.05% 이격, 적어도 0.1% 이격, 적어도 0.5% 이격, 적어도 1% 이격, 적어도 1.5% 이격, 적어도 2% 이격, 적어도 2.5% 이격, 적어도 3% 이격, 적어도 3.5% 이격, 적어도 4% 이격, 적어도 4.5% 이격, 적어도 5% 이격, 적어도 5.5% 이격, 적어도 6% 이격, 적어도 6.5% 이격, 적어도 7% 이격, 적어도 7.5% 이격, 적어도 8% 이격, 적어도 8.5% 이격, 적어도 9% 이격, 적어도 9.5% 이격, 적어도 10% 이격, 적어도 20% 이격, 적어도 30% 이격, 적어도 40% 이격 또는 적어도 약 50% 이격된다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 미량의 비-표지된 분석물을 함유한다. 일부 측면에서, SIL 분석물은 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 비-표지된 분석물을 함유한다.

일부 측면에서, SIL 분석물은 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 안정한 동위원소로 표지된다. 일부 측면에서, 안정한 동위원소 표지는 ²H, ¹³C, ¹⁵N, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ¹⁷O 또는 ¹⁸O이다. 일부 측면에서, 안정한 동위원소 표지는 ¹³C 및/또는 ¹⁵N이다. 일부 측면에서, 안정한 동위원소 표지는 ¹³C이다. 일부 측면에서, 안정한 동위원소 표지는 ¹⁵N이다.

일반적으로, 삼중-사중극자 질량 분광분석기에 대한 실험의 경우, 제1 사중극자 (Q1)는 샘플에서 예상된 화학적 종의 특정된 m/z (전구체 이온)의 이온만 통과하도록 설정된다. 제2 사중극자 (즉, Q2 또는 충돌 셀)는 Q1을 통해 통과하는 이온을 단편화하는데 사용된다. 제3 사중극자 (Q3)는 예상된 화학적 종의 예상된 단편화 생성물에 상응하는 특정된 m/z (단편 이온)의 이온만 검출기로 통과하도록 설정된다. 일부 측면에서, 샘플은 질량 분광분석기에서 이온화되어 하나 이상의 양성자화된 또는 탈양성자화된 분자 이온을 생성한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 양성자화된 또는 탈양성자화된 분자는 단일 하전, 이중 하전, 삼중 하전 또는 그 초과로 하전된다. 일부 측면에서, 질량 분광분석기는 삼중 사중극자 질량 분광분석기이다. 일부 측면에서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도는 단위 해상도이다. 다른 측면에서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도는 상이하다. 다른 측면에서, Q1에 사용되는 해상도는 Q3의 단위 해상도보다 더 높다.

고성능 액체 크로마토그래피에 의한 분리의 유용성은 저분자량에서 고분자량까지의 범위의 분자의 분석 및 정제를 포함한 광범위한 범위의 적용에서 입증되었다. 액체 크로마토그래피에서, 특히 분석에 필요한 시간으로 인해 발생하는 상당한 제한사항이 있다. 본 방법은 특히 외부 보정 곡선이 기기에서 실행될 필요가 없는 경우에 고도로 효과적이고 총 필요한 기기 시간을 개선시킨다. 일부 측면에서, 방법은 총 기기 실행 시간을 감소시킨다. 일부 측면에서, 외부 보정 곡선은 사용되지 않는다. 일부 측면에서, 분석물은 바이오마커이다. 일부 측면에서, 분석물은 대사산물이다.

본 방법은 생물학적 공급원을 포함한 다양한 공급원으로부터의 분석물을 검출 또는 정량화하는데 효과적이다. 일부 측면에서, 샘플은 혈청, 조직, 생검 조직, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE), 혈장, 타액, 뇌척수액, 누액, 소변, 윤활액, 건조 혈반 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 샘플은 혈청이다. 일부 측면에서, 샘플은 조직이다. 일부 측면에서, 샘플은 생검 조직이다. 일부 측면에서, 샘플은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE)이다. 일부 측면에서, 샘플은 혈장이다. 일부 측면에서, 샘플은 타액이다. 일부 측면에서, 샘플은 뇌척수액이다. 일부 측면에서, 샘플은 누액이다. 일부 측면에서, 샘플은 소변이다. 일부 측면에서, 샘플은 윤활액이다. 일부 측면에서, 샘플은 건조 혈반이다.

본 방법은 또한 생물학적 매트릭스로부터 분석물을 분리할 수 있는 적어도 하나의 액체 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 액체 크로마토그래피, 관심 분석물을 포함하는 샘플, 샘플에 첨가된 적어도 하나의 안정한 동위원소 표지된 분석물, 및 분석물 및 안정한 동위원소 표지된 분석물에 특이적인 하나 이상의 양성자화된 또는 탈양성자화된 모 이온 및 딸 이온을 이온화, 단편화 및 검출할 수 있는 질량 분광분석기를 포함하는 액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법 시스템을 구축하는데 유용하다. 일반적으로, 크로마토그래피는 혼합물에 존재하는 다른 분자 (예를 들어, 오염물질)로부터 분자 (예를 들어, 항체)를 분리하는 임의의 종류의 기술이다.

액체 크로마토그래피 (LC)는 후속 분석 및/또는 확인을 위해 유체 혼합물의 성분을 분리하기 위한 잘 확립된 분석 기술이며, 여기서 칼럼, 미세유체 칩-기반 채널 또는 튜브는 전형적으로 미분된 고체 또는 겔, 예컨대 수 마이크로미터의 직경을 갖는 작은 입자인 고정상 물질로 패킹된다. 작은 입자 크기는 고정상을 생성하는 다양한 화학으로 변형될 수 있는 큰 표면적을 제공한다. 액체 용출액은 칼럼 치수 및 입자 크기에 기초하여 원하는 유속으로 액체 크로마토그래피 칼럼 ("LC 칼럼")을 통해 펌핑된다. 이 액체 용출액은 때때로 이동상으로 지칭된다. 분석될 샘플은 LC 칼럼 이전에 이동상의 스트림에 작은 부피로 도입 (예를 들어, 주사)된다. 샘플 내 분석물의 이동 속도는 칼럼의 길이를 횡단하기 때문에 고정상과의 특정 화학적 및/또는 물리적 상호작용에 의해 영향받는다. 특정 분석물이 용출되거나 칼럼의 끝에서 나오는 시간은 체류 시간 또는 용출 시간이라고 하며, 특히 주어진 분석물의 다른 분석 특징, 예컨대 정확한 질량과 조합될 때 주어진 분석물의 합리적으로 확인되는 특징일 수 있다. 분리된 성분은 추가 분석을 위해 액체 크로마토그래피 칼럼에서 다른 유형의 분석 기기로 통과될 수 있으며, 예를 들어 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC/MS 또는 LC/MS/MS)은 질량 분광분석기의 이온 공급원에 도입되기 전에 화합물을 크로마토그래피적으로 분리한다.

질량 분광분석법 ("MS" 또는 "질량-스펙")은 질량-대-전하 비 이온을 측정하는데 사용되는 분석 기술이다. 이는 샘플을 이온화하고 상이한 질량의 이온을 분리하고 이온 플럭스의 강도를 측정하여 이들의 상대 존재비를 기록함으로써 달성된다. 전형적인 질량 분광분석기는 세 부분을 포함한다: 이온 공급원, 질량 분석기 및 검출기 시스템. 이온 공급원은 분석 중인 물질 (분석물)을 이온화하는 질량 분광분석기의 일부이다. 그 후, 이온은 자기장 또는 전기장에 의해 이들의 질량-대-전하 비 (m/z)에 따라 이온을 분리하는 질량 분석기로 수송된다. 많은 질량 분광분석기는 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS)을 위해 2개 이상의 질량 분석기를 사용한다. 검출기는 이온이 표면을 통과하거나 표면에 부딪힐 때 유도된 전하 또는 생성된 전류를 기록한다. 질량 스펙트럼은 질량 분석기로 m/z 이온을 스캔할 때 검출기에서 생성된 신호를 측정한 결과이다.

본 방법은 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 포함하는 조성물을 개시하며, 여기서 ISCC는 안정한 동위원소 표지된 분석물의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)을 포함한다. 안정한 동위원소 표지된 분석물의 MIRM을 포함하는 ISCC를 생성하는 본 방법은 바이오마커의 분석에 유용하다. 바이오마커는 예를 들어 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 생물학적 샘플에서 직접 측정되거나, 생물학적 샘플에서 검출되거나 생물학적 샘플에 존재하는 것으로 결정될 수 있다. 바이오마커는 기능적, 부분적으로 기능적 또는 비-기능적일 수 있다. 바이오마커가 단백질 또는 그의 단편인 경우, 이는 시퀀싱될 수 있고, 그의 코딩 유전자는 잘 확립된 기술을 사용하여 클로닝될 수 있다. 본 방법은 또한 대리 종점으로서 규제 수용을 위한 바이오마커의 개발 및/또는 검증에 유용하다. 대리 종점은 임상 종점에 대한 대체물로서 규제 기관에 의해 승인된 바이오마커이고, 임상적으로 의미있는 종점에 대한 대체물로서 사용되는 것으로 의도된다. 대리 종점이 승인될 수 있기 전에, 임상적 이점을 예측하거나 이와 상관관계를 보여주는데 신뢰할 수 있음을 제시하는 광범위한 증거가 있어야 한다.

본 개시내용의 방법은 또한 바이오마커, 대사산물 또는 대사 프로파일의 분석에 유용하다. 바이오마커 또는 대사산물의 분석은 건강 또는 질환에서 생물학적 상태의 민감한 측정을 나타낸다. 모든 개체에게 고유한 변경된 대사 지문은 시스템 생물학을 더 잘 이해하고, 다양한 질환에 대한 잠재적인 위험을 검출 또는 확인하고, 궁극적으로 개인맞춤 의학 (즉, 알맞은 시간에 알맞은 사람에 대한 알맞은 용량의 알맞은 약물(들))의 목표를 달성하는데 도움이 되는 새로운 길을 제공한다. 본 발명에서 사용된 바와 같은 대사산물 프로파일은 또 다른 샘플 또는 샘플 그룹으로부터 유래된 프로파일 또는 참조 값과의 비교에 사용될 수 있는 대사산물에 대한 정량적 결과의 임의의 정의된 값 세트로 이해되어야 한다. 예를 들어, 질환에 걸린 환자로부터의 샘플의 대사산물 프로파일은 유의하게 일치하는 건강한 환자로부터의 샘플의 대사산물 프로파일과 유의하게 상이할 수 있다. 대사산물 프로파일은 프로파일을 참조 또는 표준 프로파일과 비교함으로써 장애에 대한 대상체의 감수성을 예측하는데 도움이 될 수 있다.

본 방법은 또한 특정 환자에 대한 최적의 치료 프로토콜 및/또는 최적의 약물 선택, 조합 및 투여량을 추천 또는 선택하는 것에 관한 것이다. 각 용량 후 약물의 피크 농도가 측정될 수 있다. 각 용량 후 약물의 최저 농도가 또한 측정될 수 있다. 해당 시간의 변동을 포함하는 투여 간격 (시간)은 바이오마커 또는 대사산물의 분석으로부터 식별된 정보에 기초하여 최적화될 수 있다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 본 방법에 의해 사용되는 액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법 시스템을 포함한다. 일부 측면에서, LC-MS/MS는 하기를 포함한다:

(i) 생물학적 매트릭스로부터 분석물을 분리할 수 있는 적어도 하나의 액체 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 액체 크로마토그래피;

(ii) 관심 분석물을 포함하는 샘플;

(iii) 샘플에 첨가된 적어도 하나의 안정한 동위원소 표지된 분석물; 및

(iv) 분석물 및 안정한 동위원소 표지된 분석물에 특이적인 하나 이상의 양성자화된 (또는 탈양성자화된) 모 이온 및 딸 이온을 이온화, 단편화 및 검출할 수 있는 질량 분광분석기.

다른 측면에서, 본 개시내용은 샘플내 보정 곡선 (ISCC)을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 ISCC는 안정한 동위원소 표지된 분석물을 포함한다.

본 개시내용은 또한 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 (OSMECC)의 제작에 관한 것이다. 이 접근법은 안정적으로 표지된 동위원소 (SIL) 분석물을 사용하지 않고, 대신에 공지된 양의 분석물을 블랭크 매트릭스 샘플에 스파이킹하는 것을 수반한다. 블랭크 매트릭스는 관심 분석물을 함유하지 않는 매트릭스 유형이다. 공지된 양의 분석물을 하나의 블랭크 매트릭스 샘플에 스파이킹함으로써, 블랭크 매트릭스 샘플에서 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선은 분석물의 상응하는 MIRM 채널에서 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 측정된 MS/MS 피크 면적 (또는 내부 표준이 검정에 사용되는 경우의 피크 면적 비) 사이의 관계에 기초하여 확립될 수 있다. 이 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선은 정량적 LC-MS/MS-기반 생분석을 위한 전통적 다중샘플 외부 보정 곡선과 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 이 접근법은 LC-MS/MS 정량적 분석에서 전통적 다중샘플 외부 보정 곡선을 제작할 필요를 제거하기 위한 대안 방법으로 작용한다.

각 MIRM 채널에서의 동위원소 존재비는 정확하게 계산 및 측정될 수 있으므로, 동위원소 샘플 희석은 연구 샘플에 대해 가장 풍부한 MIRM 채널 외에도 분석물의 MIRM 채널 중 하나 또는 몇 개를 간단히 모니터링함으로써 달성될 수 있다. 가장 풍부한 MIRM 채널 (100%의 동위원소 존재비)은 검정 보정 곡선 범위 내의 농도를 갖는 샘플의 정량화에 사용되는 반면, 덜 풍부한 MIRM 채널 (IA%의 동위원소 존재비)은 검정 정량 상한 (ULOQ) 초과의 농도를 갖는 샘플의 정량화에 사용되어, 100%/IA%의 동위원소 희석 인자 (IDF)가 생성될 수 있다. 이 접근법은 LC-MS/MS 정량적 분석에서 연구 샘플을 물리적으로 희석할 필요를 제거하기 위한 대안 방법으로서 작용한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 연구 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도를 정량화하는 방법에 관한 것이며, 방법은 하나 이상의 공지된 양(들)의 하나 이상의 분석물(들)을 블랭크 매트릭스 샘플에 첨가하여 각 첨가된 분석물(들)의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 하나 이상의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선(들) (OSMECC)을 구축하는 것을 포함하며, 여기서 분석물의 MIRM은 분석물의 다중 동위원소 전이의 다중 반응 모니터링을 지칭하고; 여기서 각 분석물에 대한 OSMECC는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 상응하는 MIRM 전이에서의 측정된 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS) 피크 면적 (또는 내부 표준이 검정에 사용되는 경우의 피크 면적 비) 사이의 관계에 기초하여 블랭크 매트릭스 샘플에서 구축되고; 여기서 연구 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 프로세스로부터의 분석물에 대한 확립된 OSMECC 및 측정된 피크 면적 (또는 내부 표준이 검정에 사용되는 경우의 피크 면적 비)을 사용하여 정량화되고, 여기서 분석물에 대한 피크 면적 비는 분석물의 피크 면적을 내부 표준의 피크 면적으로 나눈 값이고, 여기서 탠덤 질량 분광분석기는 다중 반응 모니터링 모드로 작동된다.

본 개시내용은 추가 제한으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1

MIRM-ISCC-LC-MS/MS 분석을 위한 SIL 분석물의 제작

포름산 (수프라퍼(SupraPur) 등급)은 EMD 케미칼스 (EMD Chemicals, 미국 뉴저지주 깁스타운)로부터 구입하였다. HPLC 등급 메탄올 및 아세토니트릴은 제이.티. 베이커 (미국 뉴저지주 필립스버그)로부터 구입하였다. LC 등급 중탄산암모늄 및 0.05% 트윈 (PBST)을 포함하는 포스페이트 완충된 염수는 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. 다이나비즈(Dynabeads)® M-280 스트렙트아비딘은 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드)으로부터 구입하였다. 시퀀싱 등급 변형된 트립신은 프로메가 코포레이션 (Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨)으로부터 구입하였다. 분화 클러스터 73 (CD73)에 대한 모든 비-표지된 및 표지된 대리 펩티드: VIYPAVEGR (서열식별번호: 1) 및 V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1); 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1): LAAFPEDR (서열식별번호: 2) 및 LAAFPED[Arg(¹³C₆, ¹⁵N₄)] (서열식별번호: 2); 및 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1): LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 및 LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3)은 진스크립트 (Genscript, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로부터 구입하였다. 반스테드 인터내셔날 (Barnstead International, 미국 아이오와주 더뷰크)로부터의 나노퓨어(NANOpure) 다이아몬드 초순수 시스템을 사용하여 탈이온수를 생성하였다. 재조합 인간 CD73 (61,084 Da), 항-인간 CD73 모노클로날 항체 (mAb), 소분자 약물 다클라타스비르 및 SIL 약물, ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르를 생성하였다.

사용된 LC-MS/MS 시스템은 넥세라(Nexera) UPLC 시스템 (시마즈(Shimadzu), 미국 메릴랜드주 칼럼비아)과 커플링된 삼중 사중극자 6500 질량 분광분석기 (에이비 사이엑스(AB Sciex), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)였다. UPLC 시스템은 2개의 LC-30AD 펌프, 1개의 SIL-30ACMP 오토샘플러 및 1개의 CTO-30AS 칼럼 히터로 이루어진다. 물 중 0.01% 포름산 (A) 및 아세토니트릴 중 0.01% 포름산 (B)의 이동상을 사용하여 구배 용출하여 어큐티(Acquity) HSS T3 분석용 칼럼 (2.1 mm x 50 mm, 입자 크기 1.8 μm) (워터스(Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드)에서 분리를 달성하였다. 애널리스트(Analyst)® 소프트웨어 (1.6.2)에 의해 LC-MS/MS 데이터를 획득하였다.

모니터링을 위한 MIRM 채널의 선택

도 1은 예로서 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 펩티드 LQDAGVYR (서열식별번호: 3)의 정량적 분석을 사용한 일반적인 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 방법론을 제시한다. 공지된 양의 SIL 분석물 LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3) (20 μL의 500 ng/mL = 10 ng)을 각 100 μL 연구 샘플에 스파이킹함으로써, 이 표지된 분석물의 MIRM 채널에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비를 상응하는 MIRM 채널에서의 SIL 분석물의 동위원소 농도 (또는 분석물 농도 당량)로 전환할 수 있다. 따라서, 이론적 동위원소 농도 (또는 분석물 농도 당량) 및 측정된 MS/MS 반응 사이의 ISCC를 각 연구 샘플에서 확립할 수 있고, 확립된 보정 곡선 및 분석물의 피크 면적에 기초하여 이 샘플에 대한 분석물 농도를 즉시 계산할 수 있다.

인간 및 원숭이 혈청에서 내인성 CD73의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 정량화

CD73은 70 kDa 단백질이며, 많은 종양에서 높은 발현을 갖는다. 용량 선택을 돕고 항-CD73 전임상 및 임상 약물 개발을 위한 약역학적 정보를 제공하기 위해 인간 및 원숭이 혈청에서 CD73의 정량적 분석이 필요하다. 원래, 대리 매트릭스에서 재조합 CD73 참조 표준 (61,084 Da)의 연속 희석에 의해 전통적 외부 보정 곡선을 사용한 면역포획 LC-MS/MS 검정이 개발되고 검증되었다. CD73의 면역포획에 항-CD73 mAb를 사용한 후, 변성, 트립신 소화 및 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. LC-MS/MS 검정에서 모니터링된 대리 펩티드 (인간 및 원숭이 CD73 둘 다에 대해 고유함)는 이중 하전된 모 이온에서 y6 이온으로의 SRM 전이 (m/z) (502.3⁺⁺→628.3⁺)를 갖는 VIYPAVEGR (서열식별번호: 1)이었다. 트립신 소화 후 각 샘플에 100 ng/mL 농도의 SIL 대리 펩티드, V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1) 10 μL 부피를 첨가하였다. 이 검정에 대한 원래 혈청 샘플 부피가 100 μL였으므로, 이는 원래 혈청 샘플에서 10 ng/mL ([10μL·100ng/mL]/100 μL)의 SIL 펩티드, 또는 604.792 ng/mL의 재조합 CD73 (10ng/mL·[61,084Da/1010Da])와 당량이다. 이 실험에서, 이 표지된 펩티드를 외부 보정 곡선과 함께 검정 내부 표준으로 사용하였을 뿐만 아니라, 각 개별 연구 샘플에 대한 ISCC로도 사용하였다. 이를 수행함으로써, 측정된 CD73 농도를 외부 보정 곡선 및 ISCC와 나란히 비교할 수 있다.

외부 보정 곡선 및 ISCC 접근법을 사용하여 인간 및 원숭이 혈청에서 CD73의 정량화를 수행하기 전에, 표지된 대리 펩티드, V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)에 대한 MIRM 채널에서의 동위원소 존재비는 선택된 MIRM 채널이 예상치 못한 간섭 없이 ISCC를 확립하기 위해 신뢰가능하고 정확한지 확인하기 위해 계산 및 측정될 필요가 있다.

삼중 사중극자 질량 분광분석기에서 펩티드의 단편화는 온라인 도구, 예컨대 스카이라인(Skyline) (맥코스 랩(MacCoss Lab), 워싱턴대학교 게놈 과학부)을 사용하여 쉽게 해결될 수 있다. 이 경우, y6 이온이 딸 이온으로서 모니터링되기 때문에, 딸 이온 및 중성 손실은 각각 C₂₆H₄₆N₉O₉ ⁺ 및 ¹³C₆ ¹⁵NC₁₄H₂₉N₂O₄로 결정된다. 온라인 계산기 (worldwideweb.sisweb.com/mstools/isotope.html (2019년 11월 10일 접속)를 사용하여 딸 이온 (C₂₆H₄₆N₉O₉ ⁺) 및 중성 손실 (¹³C₆ ¹⁵NC₁₄H₂₉N₂O₄)의 동위원소 분포를 계산하였으며, 표 1에 나열되어 있다. V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)에 대한 가장 풍부한 MIRM 채널 (100% 존재비) 및 인접 MIRM 채널에서의 동위원소 존재비를 계산하였다. 이들 MIRM 채널에서 계산된 이론적 동위원소 존재비 및 V[ILE(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)에 대한 상응하는 MIRM 채널에서 사이엑스 API 6500 질량 분광분석기를 사용한 측정된 결과 (피크 면적)는 표 2에 제시된다. 존재비는 가장 풍부한 MIRM 채널에서 가장 적은 풍부한 MIRM 채널까지 6,000배 이상을 커버한다. 더 낮은 동위원소 존재비는 또한 필요한 경우에 계산 및 사용될 수 있지만, 많은 경우에, 삼중 사중극자 질량 분광분석기에 대한 선형 범위를 벗어날 것이다. 표 2에 제시된 바와 같이, 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 측정된 결과에 대한 백분율 차이는 13.5% 이내이고, 이는 측정된 결과가 임의의 간섭, 예컨대 동위원소 불순물 및 내인성 매트릭스로부터의 간섭 없이 정확하고 신뢰가능한 것이고, 따라서 이들 MIRM 채널이 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 절대 정량적 분석을 위해 선택될 수 있음을 나타낸다.

SIL 펩티드에 대한 MIRM 채널에서 계산된 이론적 동위원소 존재비로, ISCC에 사용되는 선택된 10개의 MIRM 채널에서 스파이킹된 SIL 펩티드 동위원소 농도 (및 CD73 단백질 농도 당량)를 계산하였고, 표 2의 오른쪽 2개 칼럼에 나열하였다. 이들 농도 (x 축) 및 상응하는 MIRM 채널에서 측정된 MS/MS 피크 면적 (y 축)을 사용하여 각 연구 샘플에서 ISCC를 구축하였다. 사내 개발된 소프트웨어를 사용하여 보정 곡선 회귀 및 농도 계산을 수행하였다. 모든 ISCC에 대해 가중 (1/x²) 최소 제곱 선형 회귀를 사용하였다. ISCC 성능, 선형 곡선 (절편 및 선형 기울기) 및 인간 혈장에서 샘플 번호 1에 대한 처음 3회 주사에 대한 계산된 농도 (모든 샘플을 추출하고 3개 복제물에서 분석함)는 각각 표 3 및 4에 제시된다. 표 3에 제시된 바와 같이, 이들 3개 복제물에 대해 우수한 ISCC 성능이 관찰되었다. ISCC에 사용된 10개의 MIRM 채널 및 제2 주사로부터의 분석물에 대한 1개의 SRM 채널에 대한 대표적인 크로마토그램은 도 2a 및 2b에 제시된다.

외부 보정 곡선 및 ISCC 접근법을 사용한 인간 및 원숭이 혈청 중 내인성 CD73 수준의 정량적 분석에 대한 결과는 표 5에 나열되어 있다. 전체적으로, ISCC 접근법으로 측정된 CD73 농도는 외부 보정 곡선을 사용하여 측정된 농도보다 약 11% 내지 17% 더 낮다. 이는 면역포획 및 소화에 대한 86.0% 회수에 의해 유발되었으며, 이는 연구 샘플에 대한 면역포획 및 소화 손실이 추적되고 외부 보정 곡선에 의해 보상되었기 때문이다. 그러나, 이는 ISCC 접근법에 대한 사례가 아니었으며, 이는 SIL 펩티드가 소화 후 스파이킹되었기 때문이다. 따라서, ISCC 접근법으로 측정된 농도는 86.0% 회수로 조정되어야 하며, 조정된 농도는 표 5에 제시된 바와 같이 외부 보정 곡선을 사용하여 측정된 농도와 매우 잘 일치하였다.

최종 검정에서 모든 유망한 MIRM 채널을 포함할 필요는 없다. 인간 혈청에서 CD73의 정량화를 위해 선택된 MIRM 채널은 표 2에 나타낸다. 샘플 분석 실행에 사용되는 MIRM 채널을 선택할 때 여러 고려사항이 있다:

ISCC 곡선 범위는 선택된 MIRM 채널의 동위원소 존재비 범위에 의해 정의된다. 따라서, 예상된 농도 범위를 커버하기 위해 적절한 MIRM 채널을 선택해야 한다. 이 연구에서, 선택된 MIRM 채널은 용량 후 CD73의 예상된 증가를 커버하기 위해 약 1,600배 곡선 범위를 커버하였다.

계산된 및 측정된 동위원소 존재비 사이에 큰 %Dev (>15%)를 갖는 임의의 MIRM 채널을 선택하지 않아야 하며, 이는 큰 % Dev가 일반적으로 동위원소 불순물 및 내인성 매트릭스로부터의 간섭을 포함하여 MIRM 채널에 잠재적인 간섭이 있음을 의미하기 때문이다. 따라서, MIRM 채널 선택을 위해 다중 매트릭스 로트를 시험해야 한다.

근접 동위원소 존재비를 갖는 다중 MIRM 채널 중에서 단 하나의 MIRM 채널을 선택해야 한다. 이 실시예에서, 표 2에 제시된 바와 같이, MIRM 채널 4 및 5, 7 및 8이 각각 매우 근접한 동위원소 존재비를 갖기 때문에 MIRM 채널 4 및 8을 선택하지 않았다.

입증 목적만을 위해 이 실시예에서 총 10개의 MIRM 채널을 사용하였다. 더 적은 수의 MIRM 채널 (1,000배 곡선의 경우에 4 내지 5개 MIRM 채널)의 사용은 데이터 품질에 영향을 주지 않는다.

표 1

안정한 동위원소 표지된 펩티드 V[Ile( ¹³ C ₆ , ¹⁵ N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)에 대한 중성 손실 ( ¹³ C ₆ ¹⁵ NC ₁₄ H ₂₉ N ₂ O ₄ ) 및 딸 이온 ([C ₂₆ H ₄₆ N ₉ O ₉ ] ⁺ )에 대한 동위원소 분포

주: 모 이온: [¹³C₆ ¹⁵NC₄₀H₇₆N₁₁O₁₃]⁺⁺, 이중 하전됨 (Z_p=2)

표 2

SIL 펩티드 V[ILE( ¹³ C ₆ , ¹⁵ N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)의 MIRM 채널에서 계산된 및 측정된 상대 동위원소 존재비

^a 100 ng/mL (1 ng)의 SIL 펩티드 10 μL를 소화된 샘플에 스파이킹하였다. 검정에 사용된 원래 샘플 부피가 100 μL였기 때문에, 이는 원래 샘플에서 그의 가장 풍부한 MIRM 채널에 10 ng/mL의 SIL 펩티드가 있는 것과 당량이다. 인접 MIRM 채널에서의 다른 SIL 펩티드 동위원소 농도는 계산된 이론적 상대 동위원소 존재비를 기준으로 계산되었다.

^b CD73 단백질 농도 당량 = SIL 펩티드 동위원소 농도 * (61,084의 재조합 CD73 분자량 /1010의 SIL 펩티드 분자량).

표 3, 처음 3회 주사에 대한 1/x ² 가중 선형 회귀를 사용한 ISCC의 성능

표 4, 처음 3회 주사에 대한 ISCC 선형 곡선 절편, 선형 기울기 및 계산된 농도

주: 계산된 농도 = (샘플 피크 면적 - 절편)/선형 기울기

표 5, 외부 보정 곡선 및 ISCC 접근법을 사용한 인간 및 원숭이 혈청에서 내인성 CD73의 정량적 분석 결과

^a 외부 보정 곡선을 사용한 CD73 단백질 농도로부터 ISCC를 사용한 CD73 단백질 농도에 대한 백분율 차이.

^b 스파이킹된 SIL 펩티드가 면역포획 및 소화 단계를 거치지 않았기 때문에 CD73 농도는 면역포획 및 소화의 회수 (86.0%)로 조정되었다.

^c 외부 보정 곡선을 사용한 CD73 단백질 농도로부터 ISCC를 사용한 회수 조정된 CD73 단백질 농도에 대한 백분율 차이

실시예 2

소화된 인간 결장 균질물에서 단백질 바이오마커 PD-1, PD-L1 및 CD73에 대한 대리 펩티드의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 정량화

상기 기재된 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 방법론은 공지된 양의 다중 SIL 대리 펩티드를 다중 펩티드 표적에 대한 절대 정량적 프로테오믹스에 대한 소화된 샘플에 스파이킹함으로써 정량적 프로테오믹스에 쉽게 적용될 수 있다. AQUA 접근법과 유사하게, ISCC 정량화는 또한 샘플에 스파이킹된 SIL 대리 펩티드의 농도에 기초한다. 그러나, 각 표적 펩티드에 대해 AQUA 접근법에서 하나의 보정 포인트만이 사용되기 때문에, 특히 표적 펩티드에 대한 농도가 스파이킹된 SIL 대리 펩티드의 농도보다 훨씬 더 높거나 훨씬 더 낮을 때, 정량화의 정확도가 크게 손상될 수 있다. 반면에, MIRM-ISCC-LC-MS/MS 접근법은 각 표적 펩티드에 대해 3 내지 4 자릿수의 전체 보정 곡선 범위를 제공할 수 있으며, 전체 곡선 범위 내에서 정량화의 정확도를 보장할 수 있다.

이 실시예에서, 3개의 대리 펩티드, PD-1의 경우에 LAAFPEDR (서열식별번호: 2), PD-L1의 경우에 LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 및 CD73의 경우에 VIYPAVEGR (서열식별번호: 1)을 혼합하고, 완전히 트립신 소화된 인간 결장 조직 균질물에 각각 1.00, 10.0 및 50.0 ng/mL의 농도로 스파이킹하였다. 100 μL 부피의 제조된 샘플을 검정에서 사용하였다. 10% 메탄올 90% 물 중 각 SIL 펩티드 LAAFPED[Arg(¹³C₆, ¹⁵N₄)] (서열식별번호: 2), LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3) 및 V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)에 대한 10 ng (20 μL의 500 ng/mL)의 혼합물을 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 분석을 위한 제조된 샘플에 첨가하였다. 샘플 내 각 SIL 펩티드에 대한 농도는 100 ng/mL (10ng/100μL)이다. 표 6은 이들 세 가지 펩티드의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 정량적 분석에 사용된 MIRM 채널, 이들의 동위원소 농도 및 분석물 농도 당량을 제시한다. 모든 ISCC 곡선에 대해 가중 (1/x²) 최소 제곱 선형 회귀를 사용하였다. 우수한 ISCC 곡선 성능은 모든 보정 포인트에 대한 매우 정확한 예측된 농도에 의해 입증되었다 (공칭 농도의 10.0% 이내, 데이터는 제시되지 않음). 이들 세 가지 펩티드에 대한 측정된 농도는 표 7에 나열되어 있고, MIRM-ISCC-LC-MS/MS 측정의 정확도는 시험된 모든 샘플에 의해 확인되었다.

표 6

소화된 인간 결장 균질물에서 LAAFPEDR (서열식별번호: 2), LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 및 VIYPAVEGR (서열식별번호: 1)의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 정량적 분석에 사용된 MIRM 채널 및 이들의 동위원소 농도

^a: ISCC LAAFPEDR (서열식별번호: 2) 농도 당량 = ISCC SIL-LAAFPEDR (서열식별번호: 2) 동위원소 농도 * (918의 LAAFPEDR (서열식별번호: 2) 분자량 / 928의 SIL-LAAFPEDR (서열식별번호: 2) 분자량)

^b: ISCC LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 농도 당량 = ISCC SIL-LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 동위원소 농도 * (921의 LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 분자량 / 927의 SIL-LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 분자량)

^c: ISCC VIYPAVEGR (서열식별번호: 1) 농도 당량 = ISCC SIL-VIYPAVEGR (서열식별번호: 1) 동위원소 농도 * (1003의 VIYPAVEGR (서열식별번호: 1) 분자량 / 1010의 SIL-VIYPAVEGR (서열식별번호: 1) 분자량)

표 7, MIRM-ISCC-LC-MS/MS를 사용한 완전히 소화된 결장 조직 균질물에서 대리 펩티드 LAAFPEDR (서열식별번호: 2), LQDAGVYR (서열식별번호: 3) 및 VIYPAVEGR (서열식별번호: 1)의 정량적 분석

다중 펩티드에 대한 표적화된 정량적 프로테오믹스에서 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 접근법에 대한 한 가지 잠재적인 문제는 LC-MS/MS 실행에서 모니터링해야 하는 MIRM 채널의 총 수가 삼중 사중극자 질량 분광분석기에 의해 취급되기에 너무 많을 수 있다는 것이다. 이 문제는 각 표적 펩티드에 대해 상이한 체류 시간 창에 기초하여 계획된 MIRM을 사용하고 각 ISCC에서 더 적은 MIRM 채널을 사용하여 완화될 수 있었다. 결과는 다중 방식으로 2 내지 3 자릿수의 농도 범위에 대해 3 내지 4개의 MIRM 채널을 사용함으로써 정확하고 신뢰가능한 정량화를 여전히 달성할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3

인간 및 래트 혈장에서 소분자 약물 다클라타스비르의 MIRM-ICSS-LC-MS/MS 분석

딸 이온 및 중성 손실이 결정된 후, 동일한 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 워크플로우는 또한 소분자 약물 및 바이오마커를 포함하는 소분자 분석물의 측정에 사용될 수 있다. 여기에서는 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 접근법을 사용한 인간 및 래트 혈장에서 소분자 약물, 다클라타스비르의 즉각적인 정량적 분석의 예를 제시한다.

10, 100, 500 및 1,000 ng/mL의 다클라타스비르에서 100 μL의 인간 및 래트 혈장 샘플을 각각 인간 및 래트 혈장에서 5,000 ng/mL의 SIL ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르 20 μL와 혼합하였다. 인간 및 래트 혈장 샘플에서 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르의 당량 농도는 1,000 ng/mL ([20 μLx5,000 ng/mL]/100 μL=1,000 ng/mL)였다. 샘플을 액체-액체 추출로 추출하고 (H. Jiang et al., Journal of Chromatography A 2012, 1245, 117-121) MIRM-ISCC-LC-MS/MS 분석을 위해 주사하였다. 표 8은 다클라타스비르의 정량화를 위해 ISCC에서 사용된 MIRM 채널 및 이들의 동위원소 농도를 제시한다. 모든 ISCC는 가중 (1/x²) 최소 제곱 선형 회귀를 사용하여 구축하였다. 모든 보정 포인트에 대한 예측된 농도는 조절된 LC-MS/MS 생분석을 위한 허용 기준 내에 있다 (데이터는 제시되지 않음). 표 9는 인간 및 래트 혈장에서 다클라타스비르에 대한 측정된 결과를 제시하며, 이는 다클라타스비르의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 분석이 정확하였음을 나타낸다.

표 8, 다클라타스비르의 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 정량적 분석에 사용된 MIRM 채널 및 이들의 동위원소 농도

^a: ISCC 다클라타스비르 농도 당량 = ISCC SIL-다클라타스비르 동위원소 농도 * (739의 다클라타스비르 분자량 / 745의 SIL-다클라타스비르 분자량)

표 9, MIRM-ISCC-LC-MS/MS를 사용한 인간 및 래트 혈장에서 다클라타스비르의 정량적 분석

MIRM-ISCC-LC-MS/MS 검정에 대한 추가 고려사항

성공적인 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 검정 개발 및 샘플 분석에 대한 여러 추가 고려사항이 있다. 적절한 SIL 분석물의 선택은 신뢰가능하고 견고한 정량적 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 검정을 개발하는데 중요한 인자 중 하나이다. 선택된 MIRM 채널에서 이 표지된 분석물의 동위원소 존재비가 분석물의 정량적 분석을 위한 보정 곡선으로서 사용될 것이므로, 이 간섭이 검정 정확도를 손상시킬 수 있으므로, 표지된 분석물은 분석물로부터 동위원소 간섭을 회피하도록 설계되어야 한다. 경험상 대부분의 소분자 화합물 및 6 내지 12개의 아미노산을 갖는 펩티드 분석물에 대한 간섭을 회피하기 위해 4 내지 6개의 표지가 필요하다. SIL 분석물 내의 불순물 (비-표지된 분석물의 양)은 SIL 분석물로부터 분석물로의 간섭을 회피하기에 충분히 낮아야 하며, 이는 ISCC 접근법의 경우, 검정 정량 상한 (ULOQ)을 정의하기 위해 각 연구 샘플에 다량의 SIL 분석물이 필요하기 때문이다. 또한, 표지화 불순물 (SIL 분석물의 것보다 더 적거나 더 많은 표지된 위치를 갖는 표지된 분석물의 양)은 또한 SIL 분석물의 MIRM 채널에서 동위원소 존재비에 대한 간섭을 회피하기에 충분히 낮아야 한다.

중수소 표지화가 매우 비용 효과적이고 쉽게 이용가능하지만, 비-표지된 분석물로부터 중수소 표지된 분석물을 쉽게 분리할 수 있기 때문에 ISCC 접근법에서 중수소 표지된 분석물을 회피해야 하며, 더 중요하게는, 교환가능한 양성자 및 중양성자에서 쉽게 발생할 수 있는 수소-중수소 교환 반응은 MIRM 채널에서 동위원소 존재비의 정확한 계산을 불가능하게 만든다.

적절하게 보정된 삼중 사중극자 질량 분광분석기를 사용하는 것은 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 접근법의 성공을 위한 또 다른 인자이다. 단일- 및 이중- 하전된 모 이온의 경우, Q1 및 Q3 둘 다에 대한 단위 해상도 (절반 높이에서 전체 너비-FWHH = 0.7 질량 단위)는 상응하는 MIRM 채널에서 계산된 이론적 동위원소 존재비에 근접한 정확한 MS/MS 반응을 생성하기에 충분히 양호하다. 필요한 경우, Q1에서 더 높은 해상도 (FWHH = 0.5 질량 단위)는 일부 기기 민감도를 손실시키는 비용으로 측정 정확도를 개선시킬 수 있다. 본 발명자들의 시험 결과는 Q3에서 더 높은 해상도 (FWHH = 0.5 질량 단위)의 사용이 측정 정확도를 개선시키는데 도움이 되지 않음을 제시하였다.

동위원소 간격 (Zp=1의 경우에 1 Da, Zp=2의 경우에 0.5 Da, Zp=3의 경우에 0.33 Da 등)이 전하의 수 (Zp)의 증가에 따라 점진적으로 감소하기 때문에, FWHH ≤ 0.5 질량 단위를 갖는 해상도를 사용하는 경우에도 삼중 (및 더 높은) 하전된 모 이온을 갖는 MIRM 채널에서 동위원소 존재비의 정확한 측정이 어려울 수 있음이 예상된다. 이 연구에서, 높은 MS/MS 반응을 갖는 삼중 (또는 더 높은) 하전된 모 이온이 이용가능하지 않았기 때문에, 삼중 (또는 더 높은) 하전된 모 이온을 갖는 MIRM 채널에서 동위원소 존재비를 시험하지 않았다.

ISCC는 선택된 MIRM 채널에서 자연 발생 동위원소 존재비를 사용하여 구축되기 때문에, 확립된 ISCC에 대한 성능은 검정 적격성 평가 및 샘플 분석 동안 샘플에서 샘플로 매우 유사해야 하며, 인간 및 기기 작동이 수반되지 않는다. 일부 샘플에 대한 1개의 MIRM 채널에서 임의의 예상치 못한 유의한 편향은 일반적으로 해당 매트릭스 로트로부터의 내인성 간섭을 나타내며, 이 점을 배제해도 데이터 정확도에 상당한 영향을 미치지 않는다. 반면에, 많은 샘플에 대한 대부분의 MIRM 채널에서 임의의 예상치 못한 유의한 편향은 MS 기기 보정의 실패를 나타낸다.

ISCC가 각 연구 샘플에 있기 때문에 MIRM-ISCC-LC-MS/MS 접근법에서 추가 검정 내부 표준을 추가할 필요가 없으며, 따라서 추출, 주사, 이온화, 단편화 및 검출 등으로부터의 변경을 포함하여, SIL 분석물을 연구 샘플에 스파이킹한 후 모든 변경은 ISCC 자체에 의해 추적되고 보상된다. 이 때문에, 샘플 제조의 시작에 SIL 다클라타스비르가 샘플에 스파이킹된 실시예 3에서 소분자 약물 다클라타스비르의 분석과 같이 샘플 제조 동안 가능한 빨리 SIL 분석물을 스파이킹함으로써 검정 성능을 더욱 개선시킬 수 있었다. 그러나, 면역포획을 사용한 단백질 분석의 경우, 표지된 펩티드는 면역포획 후에만 스파이킹될 수 있고, 실시예 1에서 CD73 단백질의 분석과 같이 면역포획 및 트립신 소화 동안 임의의 변경은 추적 및 보상되지 않는다. 이 문제는 샘플 제조의 시작에 표지된 대리 펩티드 부분으로 SIL 단백질을 스파이킹함으로써 해결될 수 있다.

ISCC가 각 개별 샘플에 있고 현재 다중 MIRM 채널로부터의 피크 면적을 사용하여 ISCC를 구축할 수 있는 상업용 소프트웨어가 없기 때문에, 가중 최소 제곱 회귀 알고리즘으로 ISCC를 생성하고 배치로 샘플 농도를 계산하기 위해 이 연구에서 사내 개발된 소프트웨어를 사용하였다. MIRM-ISCC-LC-MS/MS 방법론의 광범위한 적용은 주요 질량 분광분석기 회사에 의한 상업용 소프트웨어 개발에 의존한다.

실시예 4

MIRM 기술을 사용한 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 및 동위원소 샘플 희석을 사용한 정량적 LC-MS/MS 생분석

사용된 LC-MS/MS 시스템은 넥세라 UPLC 시스템 (시마즈, 미국 메릴랜드주 칼럼비아)과 커플링된 삼중-사중극자 6500 질량 분광분석기 (에이비 사이엑스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)였다. UPLC 시스템은 2개의 LC-30AD 펌프, 1개의 SIL-30ACMP 오토샘플러 및 1개의 CTO-30AS 칼럼 히터로 이루어진다. 0.1% 포름산을 함유하는 물/아세토니트릴 (90/10) 중 10 mM 암모늄 아세테이트 및 0.1% 포름산을 함유하는 물/아세토니트릴 (10/90) 중 10 mM 암모늄 아세테이트의 이동상을 사용한 구배 용출로 어큐티 HSS T3 분석용 칼럼 (2.1 mm × 50 mm, 입자 크기 1.8 μm) (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드)에서 분리를 달성하였다. 유속은 0.8 mL/분이었다. 애널리스트 소프트웨어 (1.6.2) (에이비 사이엑스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)에 의해 LC-MS/MS 데이터를 획득하였다.

다중샘플 외부 보정 곡선, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 및 ISCC를 사용한 다클라타스비르의 LC-MS/MS 정량화를 위한 샘플 제조. 다클라타스비르 및 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르에 대한 모든 스톡 용액을 아세토니트릴/DMSO (1/1, v/v)에서 제조하였다. 0.5 mg/mL 스톡 용액을 인간 혈장으로 적절히 희석하여 20000 ng/mL의 다클라타스비르를 제조하였다. 인간 혈장에서 20000 ng/mL의 다클라타스비르로부터 연속 희석에 의해 다클라타스비르에 대한 1000, 800, 500, 100, 20, 4, 2 및 1 ng/mL 농도의 다중샘플 외부 보정 곡선을 제작하였다. 0.5 mg/mL 다클라타스비르 스톡 용액으로부터 연속 희석에 의해 다클라타스비르에 대한 20000, 5000, 800, 500, 40, 3 및 1 ng/mL의 QC 샘플을 제조하였다.

0.5 mg/mL의 다클라타스비르 스톡 용액의 적절한 희석에 의해 메탄올/물 (10/90)에서 5000 ng/mL 농도의 다클라타스비르를 제조하고, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선을 구축하기 위해 이 용액을 사용하였다. 0.5 mg/mL ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르 스톡 용액을 메탄올/물 (10/90)에 의해 적절히 희석하여 5040.6 ng/mL의 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르를 제조하고, 각 샘플에서 ISCC를 구축하기 위해 이 용액을 사용하고, 또한 다중샘플 외부 보정 곡선 및 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 접근법 둘 다에 대한 검정 안정한 동위원소 표지된 내부 표준 (SIL-IS)으로서 사용하였다.

1 내지 1000 ng/mL의 2개의 다중샘플 외부 보정 곡선, 1, 3, 40, 500 및 800 ng/mL의 QC 샘플의 6개의 복제물, 및 2개의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선에 대한 100 μL의 혈장 샘플의 분취액 (공지된 양의 다클라타스비르로 스파이킹될 2개의 블랭크 혈장 샘플)을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 5000 및 20000 ng/mL의 QC 샘플을 각각 100배 및 200배 희석하고, 100 μL의 희석된 및 비-희석된 5000 및 20000 ng/mL의 QC 샘플 둘 다 (각각 6개의 복제물)를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 10% 메탄올 및 90% 물 중 5000 ng/mL의 다클라타스비르 20 μL 부피를 2개의 블랭크 인간 혈장 샘플에 첨가하여, 2개의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선을 구축하고, 20 μL 부피의 10% 메탄올 및 90% 물을 메이크업으로서 다른 샘플에 첨가하였다. 10% 메탄올 및 90% 물 중 5040.6 ng/mL ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르 분취액 20 μL를 96-웰 플레이트에서 각 혈장 샘플에 첨가하였다. ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르를 다중샘플 외부 보정 곡선 및 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선에 대한 검정 SIL-IS로서 사용하였다. 이를 또한 각 샘플에 대한 ISCC를 구축하기 위해 SIL 분석물로 사용하였다.

샘플을 야누스 미니 액체 핸들러 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 액체-액체 추출 (H. Jiang et al., Journal of Chromatography A 2012, 1245, 117-121)로 추출하였다. 50 μL 부피의 1 M 중탄산암모늄 완충액을 각 샘플에 첨가한 후, 600 μL의 MTBE를 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 5분 동안 볼텍싱하고, 400 μL의 상청액을 깨끗한 96-웰 플레이트로 옮기고, 50℃에서 증발 건조시켰다. LC-MS/MS 분석을 위해 샘플을 물 중 10% 메탄올 100 μL로 재구성하였다.

다중샘플 외부 보정 곡선, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 (OSMECC) 및 샘플내 보정 곡선 (ISCC) 각각에 대해 모니터링된 MRM 및 MIRM 전이의 요약이 도 4a에 제시되어 있다. 동위원소 샘플 희석에 사용되는 SRM 채널 및 상응하는 동위원소 희석 인자 (IDF)가 또한 도 4a에 제시되어 있다. 사용된 2개의 다중샘플 외부 보정 곡선 및 2개의 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선, 뿐만 아니라 2개의 ISCC에 대한 보정 곡선 성능이 도 4b에 제시되어 있다.

다중샘플 외부 보정 곡선, 단일-샘플 다중점 외부 보정 곡선 및 ISCC를 사용한 QC 샘플에 대한 정확도 및 정밀도 데이터가 도 5a에 제시되어 있다. 5000 및 20000 ng/mL의 QC 샘플을 각각 2-단계 희석으로 물리적으로 100배 및 200배 희석하였다. 이 실시예에서, 동일한 QC 샘플 세트의 농도를 3개의 상이한 유형의 보정 곡선으로 계산하였다. 이들 3개의 유형의 보정 곡선으로 모든 농도 수준에서 QC 샘플에 대한 정확한 측정은 단일-샘플 다중점 보정 곡선 및 ISCC 둘 다가 전통적 다중샘플 외부 보정 곡선과 동일한 수준의 정확도로 생분석적인 데이터를 전달할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이는 다중샘플 외부 보정 곡선이 전통적으로 사용되는 LC-MS/MS 생분석적인 검정에서 사용될 수 있다.

검정의 ULOQ 초과의 농도를 갖는 샘플에 대한 샘플 희석 단계를 제거하기 위해, 3개의 유형의 보정 곡선 모두로 5000, 20000 및 50000 ng/mL의 QC 샘플을 사용함으로써 MIRM 기술을 사용한 동위원소 샘플 희석 접근법을 평가하였다. 도 5b에 제시된 바와 같이, 동위원소 희석 인자 (IDF) 최대 1040배를 갖는 3개의 상이한 보정 곡선을 사용하여 5000 및 20000 ng/mL의 QC 샘플에 대한 정확한 측정을 달성하였다. ISCC만이 1695 및 4386의 IDF를 갖는 20000 ng/mL의 QC 샘플에 대한 정확한 측정을 제공하였다. 또한, 50000 ng/mL 농도의 QC 샘플을 사용함으로써 ISCC에 대해 1695 및 4386의 IDF를 평가하고, IDF 둘 다에 대해 정확한 측정을 달성하였다. 따라서, 동위원소 샘플 희석 접근법은 물리적 샘플 희석 단계를 제거하기 위해 LC-MS/MS 생분석적인 분석에서 사용될 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 간행물은 저자 이름 및 날짜, 또는 특허 번호 또는 특허 공개 번호로 괄호 안에 언급된다. 본원에 설명되고 청구된 개시일에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 최신 기술을 보다 완전히 설명하기 위해, 이들 간행물의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원에서 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 개시내용에 대한 선행 기술이라는 인정으로 해석되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> METHODS OF ANALYSIS USING IN-SAMPLE CALIBRATION CURVE BY MULTIPLE ISOTOPOLOGUE REACTION MONITORING <130> 3338.148PC01 <150> US 62/775,318 <151> 2018-12-04 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg 1 5

Claims (68)

1. 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도를 정량화하는 방법으로서, 방법은 하나 이상의 공지된 양(들)의 안정한 동위원소 표지된 (SIL) 분석물(들)을 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플에 첨가하여 각 첨가된 SIL 분석물(들)의 다중 동위원소체 반응 모니터링 (MIRM)에 의해 하나 이상의 샘플내 보정 곡선(들) (ISCC)을 구축하는 것을 포함하며;
   여기서 SIL 분석물의 MIRM은 SIL 분석물의 다중 동위원소 전이의 다중 반응 모니터링을 지칭하고;
   여기서 각 분석물에 대한 ISCC는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비 (분석물 농도 당량) 및 상응하는 MIRM 전이에서의 측정된 탠덤 질량 분광분석법 (MS/MS) 피크 면적에 기초하여 샘플에서 구축되고;
   여기서 ISCC는 SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이에서의 측정된 피크 면적, 및 각 MIRM 전이에 대한 분석물 농도 당량에 기초하여 생성되고;
   여기서 샘플 내 적어도 하나의 분석물의 농도는 확립된 ISCC 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS) 프로세스로부터의 분석물에 대한 측정된 피크 면적을 사용하여 정량화되고, 여기서 탠덤 질량 분광분석기는 다중 반응 모니터링 모드로 작동되고;
   여기서 SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 (p+Z_p+α)/Z_p에서 (d+Z_d+β)/Z_d로의 각 MIRM 전이 (m/z)에 대한 이론적 동위원소 존재비가 식 (I)에 기초하여 계산되고:
   (p+Z_p+α)/Z_p → (d+Z_d+β)/Z_d의 MIRM 전이에서의 동위원소 존재비 =
   [(d+Z_d+β)의 질량에서 딸 이온의 상대 동위원소 분포] *
   [n+(α-β)의 질량에서 중성 손실의 상대 동위원소 분포] (I)
   여기서
   m/z는 질량 대 전하 비이고,
   p는 SIL 분석물의 모 분자의 단일동위원소 질량이고,
   Z_p는 모 이온에 대한 전하의 수이고,
   d는 SIL 분석물의 딸 단편의 단일동위원소 질량이고,
   Z_d는 딸 이온에 대한 전하의 수이고,
   n은 SIL 분석물의 중성 손실의 단일동위원소 질량이고,
   p = d+n이고,
   α 및 β는 정수이며, 이들은 각각 모 이온 및 딸 이온 상의 추가 중성자의 수이고, α≥0, β≥0 및 α≥β이고,
   Z_p 및 Z_d는 정수인 방법.
2. 제1항에 있어서,
   (i) 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체가 질량 분광분석기에서 이온화되어 분석물, SIL 분석물 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 양성자화된 (또는 탈양성자화된) 모 이온을 생성하고;
   (ii) 질량 분광분석기에서의 분석물의 모 이온, SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온이 동일한 절단 부위에서 단편화되어 중성 손실 및 딸 이온을 생성하고;
   (iii) 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링되고;
   (iv) 분석물에 대한 모 이온에서 딸 이온으로의 전이에 대한 피크 면적이 측정되고;
   (v) SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 다중 전이가 질량 분광분석기에서 모니터링되고 ("다중 동위원소체 반응 모니터링" 또는 "MIRM");
   (vi) 각 MIRM 전이의 피크 면적이 측정되며, 여기서 MIRM 전이는 SIL 분석물의 모 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 모 이온에서 SIL 분석물의 딸 이온 및 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 딸 이온으로의 선택된 전이를 포함하는 것인
   방법.
3. 제1항에 있어서, 최고 분석물 농도 당량 (ISCC의 "정량 상한" 또는 "ULOQ")이 식 (II)에 기초하여 계산되는 것인 방법:
   (M/V)*(M_분석물/M_{SIL 분석물}) ng/mL (II)
   여기서 M (ng)은 샘플에 첨가된 SIL 분석물의 총량이고;
   V는 SIL 분석물이 첨가되기 전의 샘플 부피 (mL)이고;
   M_분석물은 분석물의 분자량이고;
   M_{SIL 분석물}은 SIL 분석물의 분자량이다.
4. 제3항에 있어서, MIRM 전이에서의 다른 분석물 농도 당량 중 하나 이상이 식 (III)에 기초하여 계산되는 것인 방법:
   I_a*ULOQ (ng/mL) (III)
   여기서 I_a는 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비이다.
5. 제1항에 있어서, 분석물이 단백질 또는 펩티드인 방법.
6. 제1항에 있어서, SIL 분석물이 안정한 동위원소 표지된 단백질 또는 펩티드인 방법.
7. 제6항에 있어서, SIL 분석물의 모 이온이 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 9개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 11개의 아미노산, 적어도 12개의 아미노산, 적어도 13개의 아미노산, 적어도 14개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 16개의 아미노산, 적어도 17개의 아미노산, 적어도 18개의 아미노산, 적어도 19개의 아미노산, 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, SIL 분석물의 모 이온이 4 내지 20개의 아미노산, 4 내지 15개의 아미노산, 5 내지 15개의 아미노산, 4 내지 14개의 아미노산, 5 내지 14개의 아미노산, 5 내지 13개의 아미노산, 5 내지 12개의 아미노산, 6 내지 15개의 아미노산, 6 내지 14개의 아미노산, 6 내지 13개의 아미노산, 6 내지 12개의 아미노산, 6 내지 11개의 아미노산, 6 내지 10개의 아미노산, 6 내지 9개의 아미노산, 6 내지 8개의 아미노산, 7 내지 15개의 아미노산, 7 내지 14개의 아미노산, 7 내지 13개의 아미노산, 7 내지 12개의 아미노산, 7 내지 11개의 아미노산, 7 내지 10개의 아미노산, 또는 7 내지 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 분석물이 항체인 방법.
10. 제1항에 있어서, 분석물이 융합 단백질인 방법.
11. 제1항에 있어서, 분석물이 PD-1, PD-L1, CD73, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CD73 항체 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
12. 제1항에 있어서, 분석물이 소분자인 방법.
13. 제12항에 있어서, 소분자가 적어도 100 g/mol, 적어도 200 g/mol, 적어도 300 g/mol, 적어도 400 g/mol, 적어도 500 g/mol, 적어도 600 g/mol, 적어도 700 g/mol, 적어도 800 g/mol, 적어도 900 g/mol, 적어도 1000 g/mol, 적어도 1100 g/mol, 적어도 1200 g/mol, 적어도 1300 g/mol, 적어도 1400 g/mol, 적어도 1500 g/mol, 적어도 1600 g/mol, 적어도 1700 g/mol, 적어도 1800 g/mol, 적어도 1900 g/mol, 또는 적어도 2000 g/mol의 몰 질량을 갖는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, SIL 분석물이 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 안정한 동위원소 표지를 함유하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, SIL 분석물이 3 내지 20개의 동위원소 표지, 3 내지 19개의 동위원소 표지, 3 내지 15개의 동위원소 표지, 3 내지 10개의 동위원소 표지, 3 내지 8개의 동위원소 표지, 3 내지 7개의 동위원소 표지, 3 내지 6개의 동위원소 표지, 4 내지 15개의 동위원소 표지, 4 내지 10개의 동위원소 표지, 4 내지 8개의 동위원소 표지, 4 내지 7개의 동위원소 표지, 4 내지 6개의 동위원소 표지, 5 내지 8개의 동위원소 표지, 5 내지 7개의 동위원소 표지, 6 내지 10개의 동위원소 표지, 6 내지 8개의 동위원소 표지, 7 내지 16개의 동위원소 표지, 7 내지 16개의 동위원소 표지, 8 내지 16개의 동위원소 표지, 8 내지 15개의 동위원소 표지, 9 내지 15개의 동위원소 표지, 9 내지 14개의 동위원소 표지, 10 내지 14개의 동위원소 표지, 10 내지 13개의 동위원소 표지, 또는 11 내지 13개의 동위원소 표지를 함유하는 것인 방법.
16. 제2항에 있어서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 각각이 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 15% 미만의 편차를 갖는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 중 적어도 하나가 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 MIRM 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만, 또는 0.0001% 미만의 편차를 갖는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, MIRM 전이에서의 측정된 상대 피크 면적 중 적어도 하나가 SIL 분석물 또는 SIL 분석물의 자연 발생 동위원소체의 상응하는 전이에서의 계산된 이론적 동위원소 존재비로부터 1% 내지 15% 편차를 갖는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, MIRM 전이의 수가 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20인 방법.
20. 제19항에 있어서, MIRM 전이의 수가 2 내지 20인 방법.
21. 제2항에 있어서, 최고 MIRM 및 최저 MIRM의 분석물 농도 당량이 적어도 10, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1100, 적어도 1200, 적어도 1300, 적어도 1400, 적어도 1500, 적어도 1600, 적어도 1700, 적어도 1800, 적어도 1900, 또는 적어도 2000배 차이인 방법.
22. 제1항에 있어서, 2개의 선택된 MIRM 전이의 계산된 이론적 동위원소 존재비가 적어도 0.01% 이격, 적어도 0.05% 이격, 적어도 0.1% 이격, 적어도 0.5% 이격, 적어도 1% 이격, 적어도 1.5% 이격, 적어도 2% 이격, 적어도 2.5% 이격, 적어도 3% 이격, 적어도 3.5% 이격, 적어도 4% 이격, 적어도 4.5% 이격, 적어도 5% 이격, 적어도 5.5% 이격, 적어도 6% 이격, 적어도 6.5% 이격, 적어도 7% 이격, 적어도 7.5% 이격, 적어도 8% 이격, 적어도 8.5% 이격, 적어도 9% 이격, 적어도 9.5% 이격, 적어도 10% 이격, 적어도 20% 이격, 적어도 30% 이격, 적어도 40% 이격 또는 적어도 50% 이격된 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, SIL 분석물이 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 비-표지된 분석물을 함유하는 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, 표지가 ²H, ¹³C, ¹⁵N, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ¹⁷O 또는 ¹⁸O인 방법.
25. 제1항에 있어서, 하나 이상의 양성자화된 또는 탈양성자화된 분자 이온이 단일 하전, 이중 하전, 삼중 하전 또는 그 초과로 하전된 것인 방법.
26. 제1항에 있어서, 질량 분광분석기가 Q1, Q2 및 Q3을 포함하는 삼중 사중극자 질량 분광분석기인 방법.
27. 제26항에 있어서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도가 단위 해상도인 방법.
28. 제26항에 있어서, Q1 및 Q3에 사용되는 해상도가 상이한 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, Q1에 사용되는 해상도가 Q3의 단위 해상도보다 더 높은 것인 방법.
30. 제1항에 있어서, 샘플내 보정 곡선 (ISCC) 조성물이 샘플 제조 전에 또는 동안에 첨가되는 것인 방법.
31. 제1항에 있어서, 총 기기 실행 시간을 감소시키는 방법.
32. 제1항에 있어서, 외부 보정 곡선이 사용되지 않는 것인 방법.
33. 제1항에 있어서, 분석물이 바이오마커인 방법.
34. 제1항에 있어서, 분석물이 대사산물인 방법.
35. 제1항에 있어서, 샘플이 혈청, 조직, 생검 조직, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE), 혈장, 타액, 뇌척수액, 누액, 소변, 윤활액, 건조 혈반 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
36. 제1항 내지 제8항 및 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 CD73 또는 그의 일부인 방법.
37. 제36항에 있어서, SIL 분석물이 V[Ile(¹³C₆, ¹⁵N)]YPAVEGR (서열식별번호: 1)인 SIL 펩티드인 방법.
38. 제1항 내지 제8항 및 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 PD-1 또는 그의 일부인 방법.
39. 제38항에 있어서, SIL 분석물이 LAAFPED[Arg(¹³C₆, ¹⁵N₄)] (서열식별번호: 2)인 SIL 펩티드인 방법.
40. 제1항 내지 제8항 및 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 PD-L1 또는 그의 일부인 방법.
41. 제40항에 있어서, SIL 분석물이 LQDAG[Val(¹³C₅, ¹⁵N)]YR (서열식별번호: 3)인 펩티드인 방법.
42. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 다클라타스비르인 방법.
43. 제42항에 있어서, SIL 분석물이 ¹³C₂ ¹⁵N₄-다클라타스비르인 방법.
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. 삭제