KR102636633B1 - 헌팅턴 유전자 억제를 유도하는 RNAi - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA를 제공하며, 상기 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이며, 상기 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지고, 서열번호 1에 실질적으로 상보적이다. 상기 이중 가닥 RNA는 헌팅턴 엑손 1 서열에 대한 RNAi 유도에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 이중 가닥 RNA는 동물 모델에서 신경 세포 사멸 및 헌팅턴 응집체(aggregates)를 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 헌팅턴 유전자 억제를 유도하는 RNAi에 관한 것이다.
HTT 또는 HD(Huntington 's disease) 유전자라고도 하는 헌팅턴 유전자는 헌팅턴 단백질을 암호화한다. 헌팅턴 유전자는 약 13.5kb의 큰 유전자이다(헌팅턴 단백질은 약 350kDa). 헌팅턴 병은 헌팅턴 유전자의 유전적 돌연변이에 의한 유전적 신경 퇴행성 장애이다. 유전자 돌연변이는 CAG 삼뉴클레오타이드 반복(trinucleotide repeat)으로 알려진 헌팅턴 유전자의 DNA 부분을 포함한다. 일반적으로 인간 헌팅턴 유전자의 CAG 분절(segment)은 여러 번(약 10-35 번) 반복된다. 헌팅턴 병을 앓는 사람들은 적어도 하나의 대립 형질에서 CAG 반복 횟수가 증가한다. 발병되는 사람은 대개 영향을 받은 부모에게서 돌연변이 된 대립 유전자를 물려받는다. 드문 케이스로, 헌팅턴 병을 가졌으나, 장애를 가진 부모가 없기도 한다(산발적 HD). 36 내지 39 개의 CAG 반복을 가진 사람은 헌팅턴 병의 징후(sign)와 증상(symptom)을 나타낼 수 있지만, 40 회 이상의 반복을 갖는 사람은 거의 항상 장애가 발생한다. CAG 반복의 크기가 증가하면 연장된(돌연변이) 헌팅턴 단백질이 생성된다. 이 단백질은 세포 내에서 세포 독성을 띄고, 뉴런에 축적되며 응집되는 작은 조각으로 가공된다. 이의 결과는 정상적인 기능 방해와 최종적으로는 뉴런의 죽음이다.
RNA 간섭(RNA interference; RNAi)은 mRNA의 서열 특이적 하향 조절(down regulation)에 관계되는 자연적으로 나타나는 기작이다. mRNA의 하향 조절은 발현되는 단백질의 양을 감소시킨다. RNA 간섭은 이중 가닥 RNA에 의해 유발된다. 이중 가닥 RNA의 가닥 중 하나는 그 타겟인 mRNA와 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 이 가닥을 guide strand이라고 한다. RNA 간섭의 메카니즘은 RNA -유도 사일런싱 복합체 (RNA-induced silencing complex; RISC)에 guide strand을 결합시키는 것을 포함한다. 이 복합체는 상보적인 염기쌍을 통해 타겟 mRNA에 결합하는 다중 턴오버 복합체(multiple turnover complex)이다. 타겟 mRNA에 한 번 결합하면 mRNA를 절단하거나 번역(translation) 효율을 떨어 뜨릴 수 있다. RNA 간섭은 그 발견이 특정 타겟 유전자를 파괴하기 위해 널리 사용 되기 때문에 발생한다. siRNA 또는 shRNA의 사용과 관련하여 사용 된 RNA 간섭 유도를위한 트리거가 있다. 또한 miRNA라 불리는 RNAi를 유발할 수 있는 분자가 자연적으로 나타나는 대응자(counterpart)를 모방하는 인공 miRNA를 만드는 데 사용되었다. 이러한 전략은 공통적으로 선택 유전자를 타겟으로 하도록 설계된 실질적으로 이중 가닥인 RNA 분자를 제공한다. RNAi의 서열 특이적 양식을 이용하는 RNAi 기반의 치료법이 개발 중에 있으며 몇몇은 현재 임상 시험중에 있다(Davidson과 McCray, Nature Reviews - Genetics, 201 1; Vol.12; 329-340).
헌팅턴 병은 돌연변이 헌팅턴 단백질의 발현, 축적에 의해 병으로 진행되는 것과 관련이 있기 때문에 RNA 간섭은 헌팅턴 유전자의 발현을 감소시킬 수 있으므로 질병을 치료할 수 있는 기회를 제공한다. 이 접근법의 기본이 되는 패러다임은 변이체 Htt 단백질의 감소로 인해 Htt 단백질 돌연변이로 인한 독성 효과를 감소시켜 헌팅턴 병 증상의 감소 및/또는 지연을 이루거나 심지어는 헌팅턴 병 증상을 예방하는 것이다. 헌팅턴 유전자 억제를 타겟으로 하는 것은, 약 2,000 개의 가상의(hypothetical) siRNA 타겟 서열의 목록을 포함하는 선행 기술에서 가설화 되었다(WO 2005105995). 헌팅턴 유전자 발현을 감소시키는 전략은 당 업계에 공지되어 있고, 돌연변이 헌팅턴 유전자의 특이적 타겟화를 포함한다(예를 들어, US20090186410, US201 10172291). 그대신에 RNA 간섭은 돌연변이 및 비 돌연변이 유전자를 모두 타겟으로 하기 위해 사용되었다(Rodriguez-Lebron et al., 2005, Mol Ther., Vol 12 No.4: 618-633, Franich et al., 2008, Mol Ther., Vol.16 No.5, 947-956, Drouet et al., 2009, Annals of Neurology, Vol.65 No.3, 276-285 및 McBride 등, Mol Ther., 2011 Dec; 19(12): 2152-62; US20080015158, WO2008134646). 후자의 경우, 야생형 헌팅턴 단백질의 넉다운이 뚜렷이 해로운 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다.
본 발명은 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA를 제공하며, 여기서 상기 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이며, 상기 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며 서열번호 1에 실질적으로 상보 적이다. 많은 수의 타겟 서열이 헌팅턴 유전자의 효과적인 넉다운을 위해 테스트 되었다. 본 발명의 선택된 이중 가닥 RNA는 헌팅턴 유전자 발현을 감소 시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 상기 이중 가닥 RNA는 직접적으로 형질감염(transfection)을 통해 또는 DNA의 전달을 통하거나(예를 들어 형질감염), 또는 상기 이중 가닥 RNA가 발현 될 수 있는 벡터 매개형 발현을 통해 간접적으로 세포에 제공되는 경우 돌연변이 된 헌팅턴 유전자와 정상적인 헌팅턴 유전자 모두의 발현을 감소시키는게 가능하다. 또한, 본 발명의 이중 가닥 RNA는 siRNA로서 또는 miRNA 스캐폴드 중에 제공될 때 타겟 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 동물 모델에서 시험하였을 때, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 신경 세포 사멸 및 헌팅턴 응집체를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명에서 제공되는 이중 가닥 RNA는 헌팅턴 유전자를 타겟으로 하는 당업계의 이중 가닥 RNA와 비교하여 개선점을 제공하거나 최소한 이에 대한 대안을 제공한다.
본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 siRNA, shRNA, pre-miRNA 또는 pri-miRNA로서 제공될 수 있다. 이러한 이중 가닥 RNA는 예를 들어 형질감염 방법을 사용하여 세포 흡수를 통해 직접 타겟 세포에 전달될 수 있다. 바람직하게는, 상기 전달은 siRNA, shRNA, pre-miRNA 또는 pri-miRNA에 대한 발현 카세트(expression cassette)가 벡터에 포함되는 유전자 치료(gene therapy) 벡터를 사용하여 이루어진다. 이러한 방법으로, 세포는 반복적인 투여를 요구하지 않고 지속적인 헌팅턴 유전자 억제를 달성하기 위해 이중 가닥 RNA의 일정한 공급을 제공받을 수 있다. 바람직하게는, 선택되는 바이러스 벡터는 AAV5이다. 본 발명은 이와같이 또한 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA의 치료 또는 헌팅턴 병 같은 의학적 용도를 제공하며, 상기 의학적 용도는 또한 본 발명의 상기 이중 가닥 RNA를 발현 할 수 있는 발현 카세트 또는 AAV5 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
도 1은 인간 헌팅턴(HTT) 유전자와 타겟 서열이다.
(A) CAG 확장(검정) 및 miH1-H21(밝은 회색)에 대한 타겟 서열을 갖는 인간 HTT 유전자(L27350.1)의 모식도이다.
(B) HTT 유전자의 엑손1 RNA 서열(서열 번호 2)이다. CAG 반복 서열은 nts 367-429이다.
(C) 엑손 1에서 시험된 타겟 서열의 모식도이다(H1, 185 내지 205, H2, 186 내지 206, H3, 189 내지 209, H4, 191 내지 211, H5, 194 내지 214, H6, 196 내지 216; H7, 250 내지 270, H8, 261 내지 281, H9, 310 내지 330, H10, 311 내지 331, H11, 339 내지 359, H12, 345 내지 365, H13, 454 내지 474, H14, 459 내지 479; H15, 477 내지 497, H16, 486 내지 506, H17, 492 내지 512, H18, 498 내지 518, H19, 549 내지 569, H20, 557 내지 577, H21, 558 내지 578, H1 내지 H21은 서열번호 23 내지 43에 상응한다). 도시된 서열은 DNA 서열이다. 숫자는 서열번호 2의 대응되는 RNA 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 서열번호 2의 대응되는 RNA 타겟 서열은 RNA가 "U"를 암호화하는 "T"를 암호화하는 것을 제외하고는 C)에 열거 된 서열을 갖는다.
도 2는 이중 가닥 RNA 및 발현 카세트의 예이다.
(A) miH12 pre-miH12-155에 대한 pri-/pre-miRNA 스캐폴드(서열 번호 44) 및 miH12 가이드 (회색)가 표시된 프리 miH12-451 스캐폴드(서열 번호 45)의 예이다.
(B) 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA 및 RNAi 장치(RNAi machinery)에 의해 어떻게 가공될 수 있는지의 개략적 모식도이다. 이중 가닥 RNA는 짧은 헤어핀 RNA(1) 또는 확장된 siRNA(2) 일 수 있다. 헤어핀 RNA 또는 확장된 siRNA는 나타난 바(1 및 꺾쇠(bracket))와 같이 가까운쪽(proximal) 말단에 제 1 RNA 서열을 가지고 있다. 짧은 헤어핀 RNA 또는 연장된 siRNA는 세포 내에서 siRNA를 생성하기 위한 RNAi 기작에 의한 것(3) 일 수 있으며, 또한 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA 일 수 있고, 그 중 제 1 RNA 서열을 포함하는 하나의 가닥은 RISC 복합체로 합쳐질 수 있다(4). 이중 가닥 RNA는 pri-miRNA 서열 (5) 또는 pre-miRNA 서열 (6)에 포함될 수 있다. pri-miRNA는 RNAi 기작에 의해 처리 되어 pre-miRNA를 생성하고, 그 후 제 1 RNA 서열을 포함하는 한 가닥이 RISC 복합체에 통합 될 수 있는 성숙한 miRNA 듀플렉스(duplex)를 생성할 수 있다(7). pre-miRNA, pri-miRNA 및 miRNA 듀플렉스에서 제 1 RNA 서열의 위치는 1과 꺾쇠로 표시된다.
(C) pVD-CMV-miH12-155 발현 카세트의 DNA 서열(CMV 프로모터 (1 내지 588), 개입 서열(intervening sequence), GFP (Green Fluorescent Protein) 서열 (713 내지 32), 5' pri-miRNA 인접(flank) (1433 내지 1514), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (1520 내지 1540), 루프 서열, passenger strand(second RNA sequence) (1560 내지 1578), 3' pre-miRNA) 3' pri-miRNA 인접 (1584 내지 1704), HSV TKpolyA signal (1705 내지 1976);
(D) pVD-CAG-miH 12-451의 DNA 서열 (CAG 프로모터 (43 내지 1715), 5' pri-miRNA 인접 (1716 내지 2017), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (2034 내지2054), 제 2 RNA 서열 및 3' pre- miRNA, 3' pri-miRNA 인접(2090 내지 2320), hGH polyA signal (2321 내지 2417) 및
(E) pVD-PGK-miH12-451 발현 카세트의 DNA 서열 (PGK promoter (23 내지 277), 5' pri-miRNA 인접 (278 내지 794), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (811 내지 831), 제 2 RNA 서열 및 3' pre- miRNA, 3' pri-miRNA 인접(867 내지 1097), hGH polyA signal (1098 내지 1194).
(F) pVD-CMV-miH12-155에 의해 암호화된 pri-miH12-155 서열.
(G) pVD-CAG-miH12-451에 의해 암호화된 pri-miH12-451 서열.
(H) pVD-PGK-miH12-451에 의해 암호화된 pri-miH12-451 서열.
그림 (E), (F), (G) 및 (H)의 글꼴 유형은 해당 DNA에 대해 위에서 사용된 것과 동일하다. 프로모터 서열은 굵은 글씨, GFP 서열은 밑줄 그어진 이탤릭 (C 한정), pri-miRNA 서열은 일반적인 글꼴, guide strand(제 1 RNA 서열)은 굵은 이탤릭체, passenger strand 또는 제 2 RNA 서열은 이탤릭체 pre-miRNA 서열은 밑줄이 그어져 있고 polyA 신호는 굵게 밑줄이 그어져있다.
도 3은 miH1-21의 인비트로(in vitro)상에서 넉다운 (knockdown) 효율을 나타낸다.
(A) 타겟 엑손 1에 의한 전체 HTT 넉다운. LucHTT는 Hek293T 세포에 miH1-miH21과 함께 형질감염(co-transfect)시켰다. 바다 팬지(Renilla)와 반딧불이(Firefly) 루시퍼레이즈(luciferase) 형광은 형질감염 후 48 시간째에 측정되었다. miScr (대조군)을 음성 대조군으로 사용하고 100 %로 기준했다. miH12는 가장 높은 넉다운 효율을 나타냈다.
(B) 19 내지 23 뉴클레오타이드 길이의 합성 siH12 에 의한 LucHTT를 넉다운한 것 이다.
도 4는 다른 프로모터를 가진 miH12-451의 인비트로상에서 넉다운 효율을 나타낸다.
(A) LucHTT 리포터는 CAG-miH12 또는 PGK-miH12 변체(variant)에 함께 형질감염되었고, 위의 도 3과 같이 넉다운 효율을 측정했다.
(B) CAG 또는 PGK 프로모터로부터 발현된 miH12-451*의 passenger (*) strand 활성은 특정 LucHTT * 리포터로 측정되었다 . passenger strand의 활성은 감지되지 않았다
도 5는 AAV5-전달 miH12(AAV5-delivered miH12)의 생체 내(in vivo) 효능을 나타낸다.
(A) 실험 세팅. 마우스에 AAV5-Luc73QHTT 및 AAV5-CMV-miScr-155 또는 AAV5-CMV-miH12-155를 1:5의 비율로 함께 주입(co-inject)하였다. 측정 시점은 화살표로 나타냈다;
(B) 마우스에서 6 주간의 AAV5-Luc73QHTT 넉다운을 MS로 측정했다;
(C) AAV5-miH12에 의한 6주째까지의 AAV5-Luc73QHTT 넉다운 경향
도 6은 랫트 HD 기전 모델에서의 인간 HTT 넉다운 개념을 입증한 것이다.
(A) 실험 세팅
(B) 뇌 조직학적 결과는 AAV5-CMV-miH12-155 그룹에서 신경퇴행(DARP32)이 덜한 것 및 돌연변이 된 Htt(EM48) 응집체가 덜한 것을 나타낸다
(C) 뇌 조직의 GFP 결과
(D) 뇌 조직의 Iba1 면역 활성화 마커 결과.
도 7은 인간화 된 Hu97 / 18 HD 마우스 모델에서 인간 HTT 넉다운 결과이다.
(A) AAV5 - CMV - miH12-155의 줄무늬체 내(intrastriatal)에 느리게 주입, 대류 강화 확산 (convection enhanced diffusion ; CED) 줄무늬체 내 주사 또는 뇌실 내(intracerebral ventricular ; ICV) 주사에 따른 쥐(murine) 뇌에서의 전달 효율. GFP 형광은 주입 5 주 후에 관찰되었다.
(B) AAV5 - miHTT 전달에 따른 쥐 뇌에서 인간 HTT 넉다운을 측정한 웨스턴 블롯 결과.
(C) HTT 웨스턴 블롯의 정량화.
도 8은 선택된 H12 타겟과 선행 타겟 서열의 비교이다. LucHTT는 표시된 siRNA (A) 및 miRNA 컨스트럭트 (B 및 C)로 Hek293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 바다 팬지와 반딧불이 루시퍼레이즈 형광은 형질감염 48 시간 후에 측정되었다. miH12와 siH12는 가장 강력한 넉다운 효율을 보였다.
(A) CAG 확장(검정) 및 miH1-H21(밝은 회색)에 대한 타겟 서열을 갖는 인간 HTT 유전자(L27350.1)의 모식도이다.
(B) HTT 유전자의 엑손1 RNA 서열(서열 번호 2)이다. CAG 반복 서열은 nts 367-429이다.
(C) 엑손 1에서 시험된 타겟 서열의 모식도이다(H1, 185 내지 205, H2, 186 내지 206, H3, 189 내지 209, H4, 191 내지 211, H5, 194 내지 214, H6, 196 내지 216; H7, 250 내지 270, H8, 261 내지 281, H9, 310 내지 330, H10, 311 내지 331, H11, 339 내지 359, H12, 345 내지 365, H13, 454 내지 474, H14, 459 내지 479; H15, 477 내지 497, H16, 486 내지 506, H17, 492 내지 512, H18, 498 내지 518, H19, 549 내지 569, H20, 557 내지 577, H21, 558 내지 578, H1 내지 H21은 서열번호 23 내지 43에 상응한다). 도시된 서열은 DNA 서열이다. 숫자는 서열번호 2의 대응되는 RNA 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 서열번호 2의 대응되는 RNA 타겟 서열은 RNA가 "U"를 암호화하는 "T"를 암호화하는 것을 제외하고는 C)에 열거 된 서열을 갖는다.
도 2는 이중 가닥 RNA 및 발현 카세트의 예이다.
(A) miH12 pre-miH12-155에 대한 pri-/pre-miRNA 스캐폴드(서열 번호 44) 및 miH12 가이드 (회색)가 표시된 프리 miH12-451 스캐폴드(서열 번호 45)의 예이다.
(B) 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA 및 RNAi 장치(RNAi machinery)에 의해 어떻게 가공될 수 있는지의 개략적 모식도이다. 이중 가닥 RNA는 짧은 헤어핀 RNA(1) 또는 확장된 siRNA(2) 일 수 있다. 헤어핀 RNA 또는 확장된 siRNA는 나타난 바(1 및 꺾쇠(bracket))와 같이 가까운쪽(proximal) 말단에 제 1 RNA 서열을 가지고 있다. 짧은 헤어핀 RNA 또는 연장된 siRNA는 세포 내에서 siRNA를 생성하기 위한 RNAi 기작에 의한 것(3) 일 수 있으며, 또한 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA 일 수 있고, 그 중 제 1 RNA 서열을 포함하는 하나의 가닥은 RISC 복합체로 합쳐질 수 있다(4). 이중 가닥 RNA는 pri-miRNA 서열 (5) 또는 pre-miRNA 서열 (6)에 포함될 수 있다. pri-miRNA는 RNAi 기작에 의해 처리 되어 pre-miRNA를 생성하고, 그 후 제 1 RNA 서열을 포함하는 한 가닥이 RISC 복합체에 통합 될 수 있는 성숙한 miRNA 듀플렉스(duplex)를 생성할 수 있다(7). pre-miRNA, pri-miRNA 및 miRNA 듀플렉스에서 제 1 RNA 서열의 위치는 1과 꺾쇠로 표시된다.
(C) pVD-CMV-miH12-155 발현 카세트의 DNA 서열(CMV 프로모터 (1 내지 588), 개입 서열(intervening sequence), GFP (Green Fluorescent Protein) 서열 (713 내지 32), 5' pri-miRNA 인접(flank) (1433 내지 1514), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (1520 내지 1540), 루프 서열, passenger strand(second RNA sequence) (1560 내지 1578), 3' pre-miRNA) 3' pri-miRNA 인접 (1584 내지 1704), HSV TKpolyA signal (1705 내지 1976);
(D) pVD-CAG-miH 12-451의 DNA 서열 (CAG 프로모터 (43 내지 1715), 5' pri-miRNA 인접 (1716 내지 2017), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (2034 내지2054), 제 2 RNA 서열 및 3' pre- miRNA, 3' pri-miRNA 인접(2090 내지 2320), hGH polyA signal (2321 내지 2417) 및
(E) pVD-PGK-miH12-451 발현 카세트의 DNA 서열 (PGK promoter (23 내지 277), 5' pri-miRNA 인접 (278 내지 794), 5' pre-miRNA, guide strand ( 제 1 RNA 서열) (811 내지 831), 제 2 RNA 서열 및 3' pre- miRNA, 3' pri-miRNA 인접(867 내지 1097), hGH polyA signal (1098 내지 1194).
(F) pVD-CMV-miH12-155에 의해 암호화된 pri-miH12-155 서열.
(G) pVD-CAG-miH12-451에 의해 암호화된 pri-miH12-451 서열.
(H) pVD-PGK-miH12-451에 의해 암호화된 pri-miH12-451 서열.
그림 (E), (F), (G) 및 (H)의 글꼴 유형은 해당 DNA에 대해 위에서 사용된 것과 동일하다. 프로모터 서열은 굵은 글씨, GFP 서열은 밑줄 그어진 이탤릭 (C 한정), pri-miRNA 서열은 일반적인 글꼴, guide strand(제 1 RNA 서열)은 굵은 이탤릭체, passenger strand 또는 제 2 RNA 서열은 이탤릭체 pre-miRNA 서열은 밑줄이 그어져 있고 polyA 신호는 굵게 밑줄이 그어져있다.
도 3은 miH1-21의 인비트로(in vitro)상에서 넉다운 (knockdown) 효율을 나타낸다.
(A) 타겟 엑손 1에 의한 전체 HTT 넉다운. LucHTT는 Hek293T 세포에 miH1-miH21과 함께 형질감염(co-transfect)시켰다. 바다 팬지(Renilla)와 반딧불이(Firefly) 루시퍼레이즈(luciferase) 형광은 형질감염 후 48 시간째에 측정되었다. miScr (대조군)을 음성 대조군으로 사용하고 100 %로 기준했다. miH12는 가장 높은 넉다운 효율을 나타냈다.
(B) 19 내지 23 뉴클레오타이드 길이의 합성 siH12 에 의한 LucHTT를 넉다운한 것 이다.
도 4는 다른 프로모터를 가진 miH12-451의 인비트로상에서 넉다운 효율을 나타낸다.
(A) LucHTT 리포터는 CAG-miH12 또는 PGK-miH12 변체(variant)에 함께 형질감염되었고, 위의 도 3과 같이 넉다운 효율을 측정했다.
(B) CAG 또는 PGK 프로모터로부터 발현된 miH12-451*의 passenger (*) strand 활성은 특정 LucHTT * 리포터로 측정되었다 . passenger strand의 활성은 감지되지 않았다
도 5는 AAV5-전달 miH12(AAV5-delivered miH12)의 생체 내(in vivo) 효능을 나타낸다.
(A) 실험 세팅. 마우스에 AAV5-Luc73QHTT 및 AAV5-CMV-miScr-155 또는 AAV5-CMV-miH12-155를 1:5의 비율로 함께 주입(co-inject)하였다. 측정 시점은 화살표로 나타냈다;
(B) 마우스에서 6 주간의 AAV5-Luc73QHTT 넉다운을 MS로 측정했다;
(C) AAV5-miH12에 의한 6주째까지의 AAV5-Luc73QHTT 넉다운 경향
도 6은 랫트 HD 기전 모델에서의 인간 HTT 넉다운 개념을 입증한 것이다.
(A) 실험 세팅
(B) 뇌 조직학적 결과는 AAV5-CMV-miH12-155 그룹에서 신경퇴행(DARP32)이 덜한 것 및 돌연변이 된 Htt(EM48) 응집체가 덜한 것을 나타낸다
(C) 뇌 조직의 GFP 결과
(D) 뇌 조직의 Iba1 면역 활성화 마커 결과.
도 7은 인간화 된 Hu97 / 18 HD 마우스 모델에서 인간 HTT 넉다운 결과이다.
(A) AAV5 - CMV - miH12-155의 줄무늬체 내(intrastriatal)에 느리게 주입, 대류 강화 확산 (convection enhanced diffusion ; CED) 줄무늬체 내 주사 또는 뇌실 내(intracerebral ventricular ; ICV) 주사에 따른 쥐(murine) 뇌에서의 전달 효율. GFP 형광은 주입 5 주 후에 관찰되었다.
(B) AAV5 - miHTT 전달에 따른 쥐 뇌에서 인간 HTT 넉다운을 측정한 웨스턴 블롯 결과.
(C) HTT 웨스턴 블롯의 정량화.
도 8은 선택된 H12 타겟과 선행 타겟 서열의 비교이다. LucHTT는 표시된 siRNA (A) 및 miRNA 컨스트럭트 (B 및 C)로 Hek293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 바다 팬지와 반딧불이 루시퍼레이즈 형광은 형질감염 48 시간 후에 측정되었다. miH12와 siH12는 가장 강력한 넉다운 효율을 보였다.
본 발명은 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA를 제공한다. 여기서 제 1 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이고, 여기서 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며, 서열 번호 1과와 실질적으로 상보적인, 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 것인, 이중 가닥(double stranded) RNA이다.
서열 번호 1(5'-CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3')은 엑손 1(서열 번호 2)의 헌팅턴 유전자 타겟 서열에 상응한다. 도 1B와 같이 엑손 1은 nt 367 내지 429에 있는 21 반복 CAG 서열을 갖는다. 도 1B와 같이 엑손 1 서열은 질병과 관련이 없는 정상적인 헌팅턴 유전자에 대응한다.
헌팅턴 병과 관련된 헌팅턴 돌연변이 유전자는 21 개 이상의 CAG 반복 서열을 포함한다. 상기 36 내지 39 회의 CAG 반복으로 인해 헌팅턴 병의 징후와 증상이 발생할 수 있으나, 40 회 이상 반복되는 경우 거의 항상 장애가 발생한다. 타겟 서열인 서열번호 1은 CAG 반복의 수에 관계없이 실질적으로 모든 엑손 1 서열에 포함된다.
서열번호 1은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 nrs 345 내지 365 에 상응한다. 엑손 1의 18 개의 상이한 타겟 서열을 서열 번호 2의 서열 특이적 억제를 유도하도록 고안된 이중 가닥 RNA를 사용하여 타겟화에 대해 시험하였다(도 1 및 도 3A). 아울러 특히 엑손 1으로부터의 이 서열을 타겟으로 하는 것이 헌팅턴 유전자 발현을 감소 시키는데 유용함을 발견하였다. 추가로 2 개의 뉴클레오타이드 오버행(overhang)을 갖는 예를 들어 19, 20, 21, 22 및 23 개의 연속적인 염기쌍으로 이루어진 길이가 다른 siRNA 서열은 가이드 서열 위치에서 서열 번호 1에 상보적인 21개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 2 개의 분리된 miRNA 스캐폴드처럼 이 서열에 대해서도 효과적이라는 것이 확인되었다(도 3A, 도 3B 및 도 4). 따라서, 서열 번호 1의 헌팅턴 타겟 서열에 실질적으로 상보적인 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 갖는다.
본 발명에 따른 제 1 RNA 서열은 센스 타겟 서열과 상보적( "안티")이기 때문에 안티센스 가닥으로도 지칭되는 이중 가닥 RNA의 guide strand에 포함된다. 제 2 RNA 서열은 그것이 타겟 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖거나 동일할 수 있기 때문에 "sense strand"라고도 불리는 passenger strand에 포함된다. 제 1 및 제 2 RNA 서열은 이중 가닥 RNA에 포함되며 실질적으로 상보적이다. 본 발명에 따른 상기 이중 가닥 RNA는 RNA 간섭(RNA interference) 을 유도하여 헌팅턴 돌연변이 및 야생형 유전자 발현을 감소시킨다. 따라서, 실질적으로 상보적이라는 것은, 제 1 및 제 2 RNA 서열의 모든 뉴클레오타이드가 염기쌍을 갖도록, 즉 완전히 상보적이거나, 또는 제 1 RNA 서열의 모든 뉴클레오타이드 및 서열 번호 1의 염기쌍을 가지도록 할 필요가 없다는 것을 의미한다. 이중 가닥 RNA가 RNA 간섭을 유도하여 서열번호 1을 포함하는 서열을 특이적으로 타겟화 할 수 있는 한, 이러한 실질적인 상보성은 본 발명에서 고려된다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하고, 여기서 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이며, 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지고, 서열 번호 1에 실질적으로 상보적인 서열은 서열에 대한 RNA 간섭을 유도할 수 있으므로 서열 번호 1을 포함하는 RNA 전사물의 발현을 특이 적으로 감소시킬 수 있다. 또 다른 구현 예에서, 서열 번호 1을 포함하는 RNA 전사물의 발현을 감소시키기위한 상기 RNA 간섭의 유도는 인간 헌팅턴 유전자 발현의 감소를 의미한다.
표준 루시퍼레이즈 리포터 검정 및 실시 예에 기재된 바와 같은 당 분야에 공지된 것과 같은 적절한 대조군을 사용함으로써 이것이 사실인지 여부를 쉽게 확인할 수 있다(Zhuang 등, 2006, Methods Mol Biol., 342: 181-7). 예를 들어, 서열 번호 1을 포함하는 루시퍼레이즈 리포터는 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA가 서열 특이적 넉다운이 가능함을 나타내는 데 사용될 수 있다. 또한, 실시예에서 나타나듯이 헌팅턴 발현은 웨스턴 블롯 분석에서 특정 항체로 확인하여 발현량을 확인할 수 있으며, 또한 RNA 전사물의 양을 탐지하는 노던 블롯 분석이 가능하다.
따라서, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 RNA 간섭을 유도하는데 사용하기 위한 것이다. 상기 이중 가닥 RNA는 서열 번호 1을 포함하는 전사물, 예를 들어 서열 번호 2 또는 다양한 수의 CAG 반복되는 것의 발현을 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다.
상기와 같이, 이중 가닥 RNA는 RNA 간섭을 유도할 수 있다. RNAi를 유도하기에 적합한 이중 가닥 RNA 구조는 당 업계에 잘 알려져있다. 예를 들어, 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA)는 2 개의 분리된 RNA 가닥을 포함하는데, 하나의 가닥은 제 1 RNA 서열을 포함하고 다른 가닥은 제 2 RNA 서열을 포함한다. siRNA 디자인은 19 개의 연속적인 염기쌍과 3'에 2 개의 뉴클레오타이드 오버행을 포함하도록 종종 이용된다(도 2A). 이런 디자인은 이러한 특징을 갖는 siRNA가 생성되는 더 큰 이중 가닥 RNA의 관찰된 다이서(Dicer) 가공을 기반으로 한다. 3' 오버행은 제 1 RNA 서열에 포함될 수있다. 3'-오버행은 제 1 RNA 서열에 추가 될 수 있다. siRNA가 구성되는 2 개 가닥의 길이는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 뉴클레오타이드 이상일 수있다. 2 개의 가닥 각각은 제 1 및 제 2 RNA 서열을 포함한다. 제 1 RNA 서열을 포함하는 가닥도 또한 그것으로 구성 될 수있다. 제 1 RNA 서열을 포함하는 가닥은 또한 제 1 RNA 서열 및 오버행 서열로 이루어질 수 있다.
siRNA는 또한 다이서 기질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다이서 기질은 27 개의 연속 염기쌍을 갖는 2 개의 RNA 가닥으로 구성된 27-mer 일 수 있다. 제 1 RNA 서열은 27-mer 듀플렉스(duplex)의 3' 말단에 위치한다. siRNA와 같이 3' 말단에는 2 개의 뉴클레오타이드 오버행이 있다. 3' 오버행은 제 1 RNA 서열에 포함될 수 있다. 3' 오버행은 제 1 RNA 서열에 추가될 수 있다. 제 1 RNA 서열로부터 5' 위치에 있는 경우, 서열 번호 1에 인접한 타겟 서열과 상보적인 서열이 추가로 포함될 수 있다. siRNA 다이서 기질의 다른 끝은 무딘 말단(blunt end)형태이다. 이 다이서 기질 다지인은 다이서에 의한 프로세싱에서 우선적으로 이루어지므로, siRNA는 앞서 서술한 바와 같이 siRNA 디자인과 유사하게 형성되고, 두 개의 3'- 말단에서 19 개의 연속적인 염기쌍과 2 개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 어떤 경우에서든, siRNA들은 본 발명에 따른 제 1 및 제 2 RNA 서열을 포함하거나 이로부터 구성된 2 개의 개별 RNA 가닥으로 구성된다(Fire et al., 1998, Nature. 1998 Feb 19; 391 (6669): 806-11).
본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열 모두가 2 개의 분리된 가닥으로 포함될 필요는 없다. 또한 제 1 및 제 2 RNA 서열은, 예를 들어 shRNA 같은, 단일 가닥 RNA에 포함될 수 있다. shRNA는 5'- 제 2 RNA 서열 - 루프 서열 - 제 1 RNA 서열 - 임의의 2nt 오버행 서열 - 3' 을 포함 할 수 있다. 선택적으로, shRNA는 5'- 제 1 RNA 서열 - 루프 서열 - 제 2 RNA 서열 - 임의의 2nt 오버행 서열-3'을 포함 할 수 있다. 이러한 RNA 분자는 실질적으로 상보적인 제 1 및 제 2 RNA 서열을 통해 분자간 염기쌍을 형성한다. 적절한 루프 서열들은 당 업계에 공지되어있다(Dallas 등, 2012 Nucleic Acids Res. 2012 Oct; 40(18): 9255-71 및 Schopman et al., Antiviral Res. 2010 May; 86(2): 204-11).
루프 서열은 또한 줄기-루프(stem-loop) 서열 일 수 있어서, shRNA의 이중 가닥 영역이 연장된다. 이론에 구애됨 없이, 앞서 설명한 바와 같은, 예를 들어 siRNA가 예를 들어, 앞서 말한 두 개의 3'- 말단에서 19 개의 연속적인 염기쌍과 2 개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는 siRNA 디자인을 갖는 다이서 기질처럼, shRNA는 일반적으로 다이서에 의해 가공된다. 이중 가닥 RNA가 다이서에 의해 처리되는 경우, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA의 말단에 있는 제 1 및 제 2 RNA 서열을 pre-miRNA 또는 pri-mi-RNA 스캐폴드에 통합시킬 수 있다. 마이크로 RNA, 즉 miRNA는, 예를 들어 포유류 세포에서, 발현되는 이중 가닥 RNA 분자로부터 유래하는 guide strand이다. miRNA는 RNAi 장치에 의해 shRNA 또는 위에 설명된 확장된 siRNA의 프로세싱과 유사하게 pre-miRNA 전구체 분자로부터 처리되고 활성화된 RNA 유도 사일런싱 복합체 (RNA-induced silencing complex; RISC)에 통합된다 (Tijsterman M, Plasterk RH. Dicers at RISC; the mechanism of RNAi. Cell. 2004 Apr 2; 117(1): 1-3). 이론에 구애됨 없이, pre-miRNA는 보다 큰 RNA 분자(pri-miRNA)의 일부가 될 수 있는, 예를들어 Drosha에 의해 먼저 가공되고 pre-miRNA 헤어핀 분자를 형성하는 인트론에 포함되어 있다. pre-miRNA 분자는 siRNA와 유사한 이중 가닥 이중 가닥을 생성하기 위해 다이서에 의해 가공될 수 있는 shRNA와 유사한 분자이다. miRNA, 즉 이중 가닥 RNA 이중 가닥의 일부인 guide strand은 이후에 RISC에 통합된다. 본질적으로 자연에 존재하는 것과 같은 RNA 분자, 즉 pri-miRNA, pre-miRNA 또는 miRNA 듀플렉스는 선택되는 유전자를 특이적 타겟으로 하는 인공 miRNA를 생산하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 예상되는 RNA 구조에 기초하여, 예를 들어 m-fold 소프트웨어로 예상된, RNA 구조에 존재하는 천연 miRNA 서열(즉, 듀플렉스, pre-miRNA 또는 pri-miRNA)및 이에 상보적인 구조 내에 존재하는 서열은 제거되고 본 발명에 따른 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열로 대체된다. 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 형성된 RNA 구조, 즉 pre-miRNA, pri-miRNA 및/또는 miRNA 듀플렉스가 상응하는 예측 된 원래 서열과 유사하도록 선택될 수 있다. 자연에서 발견되는 pre-miRNA, pri-miRNA 및 miRNA 듀플렉스(상보적인 염기쌍을 통해 하이브리드화 되는 두 개의 분리된 RNA 가닥으로 이루어짐)는 완전한 염기쌍이 아니다. 즉, 제 1와 제 2 가닥에 모두 대응되는 것이 아닌 것으로 상기 정의된 바와 같이, 제 1 및 제 2 가닥은 종종 동일한 쌍을 이루지 않으며, 종종 제 1 및 제 2 가닥은 동일한 길이가 아니다. 임의의 선택된 타겟 서열 및 실질적으로 상보적인 제 1 RNA 서열에 대한 스캐폴드로서 miRNA 전구체 분자를 사용하는 방법은 예를 들어 Liu YP Nucleic Acids Res. 2008 May, 36 (9) : 281 1 -24와 같은 문헌들에 기술되어 있다.
어쨌든, 위에서 밝힌 바와 같이, 제 1 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA는 부가적인 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 서열을 포함 할 수 있다. 이중 가닥 RNA는 단일 RNA 서열에 포함되거나 분리된 두 개의 RNA 가닥으로 포함될 수 있다.
이론에 구애됨 없이, 이중 가닥 RNA에 대해 사용되는 디자인이 무엇이든 간에, 본 발명의 제 1 RNA 서열을 포함하는 안티센스 서열처럼 RNAi 장치에 의해 처리될 수 있도록 이러한 RISC 복합체 내로 통합되어 작용하는 것처럼 디자인된다. 상기 서열은 서열 번호 1을 특이적으로 타겟화 할 수 있는 본 발명의 제 1 RNA 서열을 포함하거나 이를 포함한다. 따라서, 이중 가닥 RNA가 RNAi를 유도할 수 있는 한, 이러한 이중 가닥 RNA가 본 발명에서 고려된다. 따라서 일 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 pre-miRNA 스캐폴드, pri-miRNA 스캐폴드, shRNA 또는 siRNA에 포함된다.
상보적이라는 용어는 핵산 서열의 뉴클레오타이드가 수소 결합을 통해 다른 핵산 서열에 결합 할 수 있는 것, 즉 염기쌍을 형성 할 수 있는 것으로 정의된다. RNA의 빌딩 블록인 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide)는 설탕, 인산염 및 퓨린(구아닌, 아데닌) 또는 피리미딘(우라실, 사이토신) 염기를 포함하는 단량체(monomer)(뉴클레오타이드)로 구성된다. 상보적인 RNA 가닥은 이중 가닥 RNA를 형성한다. 이중 가닥 RNA는 2 개의 분리된 상보적인 RNA 가닥으로부터 형성되거나 2 개의 상보적인 RNA 가닥이 하나의 RNA 가닥 내에 포함된 것일 수 있다. 상보적인 RNA 가닥에서 뉴클레오타이드 시토신과 구아닌 (C와 G)은 염기쌍, 구아닌과 우라실 (G와 U), 우라실과 아데닌 (U와 A)을 형성 할 수 있다. 실질적으로 상보적이라는 것은, 제 1 및 제 2 RNA 서열이 완전히 상보적이거나, 또는 제 1 RNA 서열 및 서열 번호 1이 완전히 상보적인 것을 필요로 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어,도 2A에 나타낸 바와 같은 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드는 실질적으로 상보적이고, 완전하게 상보적인 것은 아니다.
일 실시예에서 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 실질적인 상보성은 하나의 미스매치(mismatch) 뉴클레오타이드, 또는 2 개의 미스매치 뉴클레오타이드로 이루어지는 미스매치를 갖지 않는다. 하나의 미스매치 뉴클레오타이드는 제 1 RNA 서열의 전체 길이중 서열 번호 1과 염기쌍을 이루지 않는 곳에 걸쳐 있음을 의미한다. 미스매치가 없다는 것은 모든 뉴클레오타이드가 서열번호 1과 염기쌍을 이루며, 2 개의 미스매치를 가지면 2 개의 뉴클레오타이드가 서열번호 1과 염기쌍을 갖지 않는다는 것을 의미한다. 제 1 RNA 서열은 또한 21 개 뉴클레오타이드보다 길 수 있으며, 이 시나리오에서는 실질적인 상보성이 서열 번호 1의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 이는 서열 번호 1이 본 실시예에서 염기가 제 1 RNA 서열과 쌍을 이루는 경우 전체 길이에 걸쳐 하나 또는 두 개의 미스매치를 갖지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 도 3B 및 실시예에 나타난 바와 같이, 22 및 23 뉴클레오타이드의 제 1 뉴클레오타이드 서열 길이를 갖는 siRNA를 시험했다. 이들 첫번째 뉴클레오타이드 서열은 어떠한 미스매치도 갖지 않고, 서열 번호 1에 완전히 상보적이었다. 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA가 루시퍼레이즈 리포터 또는 서열 번호 1을 포함하는 전사물 같은 서열번호 1을 포함하는 전사물의 발현을 감소시킬 수 있다면, 제 1 뉴클레오타이드 서열과 서열 번호 1 사이에 약간의 미스매치를 갖는 것이 본 발명에 따라 허용될 수 있다. 본 실시예에서, 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 실질적인 상보성은 제 1 RNA 서열 또는 서열 번호 1 중 어느 것이든 가장 짧은 쪽의 전체 길이에 걸쳐서는 1 개 또는 2 개의 미스매치를 갖지 않는 것으로 이루어진다.
일 실시예에서, 제 1 RNA 서열 및 서열 번호 1은 염기쌍이 적어도 15, 16, 17, 18 또는 19 개 뉴클레오타이드를 갖는다. 바람직하게는, 제 1 RNA 서열 및 서열번호 1은 실질적으로 상보적이며, 상기 상보성은 적어도 19 개 염기쌍을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 제 1 RNA 서열은 서열 번호 1의 연속적인 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시예에서, 제 1 RNA 서열은 서열 번호 1의 연속적인 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이루는 적어도 19 개의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시예에서, 제 1 RNA 서열은 서열 번호 1의 19 개의 연속적인 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이루는 적어도 19 개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 제 1 RNA 서열은 서열 번호 2와 염기쌍을 갖는 17 개 이상의 뉴클레오타이드를 가지며, 서열 번호 1의 연속적인 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이루는 적어도 15 개의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 제 1 뉴클레오타이드의 서열 길이는 최대 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 개 뉴클레오타이드이다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 미스매치는 제 1 RNA 서열의 뉴클레오타이드가 서열 번호 1과 염기쌍을 형성하지 않는다는 것을 의미한다. 쌍을 이루지 않는 뉴클레오타이드는 A 와 C, C 와 U 또는 A 와 G이다. 미스매치는 또한 뉴클레오타이드의 결실(deletion) 또는 뉴클레오타이드의 삽입(insertion)의 결과일 수 있다. 미스매치가 제 1 RNA 서열에서의 결실인 경우, 이는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드가 제 1 RNA 서열의 전체 길이와 비교해서 제 1 RNA 서열과 염기쌍이 없음을 의미한다. 염기쌍을 형성 할 수있는 뉴클레오타이드는 A-U, G-C 및 G-U이다. G-U 기본 쌍은 또한 G-U 워블(wobble) 또는 워블 염기쌍이라고도 불린다. 일 실시예에서, 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 G-U 염기 쌍의 수는 0, 1 또는 2이다. 일 실시예에서, 제 1 RNA 서열과 서열번호 1 및 G-U 염기 사이에는 어떠한 미스매치도 없고, G-U 염기쌍 또는 G-U 쌍이 허용된다. 바람직하게는, 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이에 G-U 염기 쌍이 존재하지 않을 수 있거나, 또는 제 1 RNA 서열 및 서열 번호 1은 A-U 또는 G-C인 염기쌍만을 갖는다. 바람직하게는, G-U 염기 쌍이 없고, 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 미스매치가 없다. 따라서, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA의 제 1 RNA 서열은 바람직하게는 G-C 및 A-U 염기쌍으로 이루어진 서열 번호 1에 완전히 상보적이다.
이러한 제 1 뉴클레오타이드 서열은 그럼에도 불구하고, 유전자 발현을 충분히 억제할 수 있다는 것을 고려하여 제 1 뉴클레오타이드 서열과 서열 번호 1 사이에 완전한 상보성(즉, 완전한 염기쌍 (미스매치 없음) 및 G-U 염기쌍 없음)을 가질 필요는 없다. 또한, 완전히 상보적이 아닌 것은 예를 들어, 서열 번호 1을 포함하는 전사물의 서열 특이적 억제를 유지하면서 오프-타겟(off-target) 서열 특이적 유전자 억제를 회피하거나 감소시키기 위해 고려될 수 있다. 그러나, 보다 잠재된 억제를 초래할 수 있기 때문에 완전한 상보성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 완전한 상보성을 갖는 것은 상기 제 1 RNA 서열을 포함하는 활성화 된 RISC 복합체가 타겟 서열을 절단하는 것을 고려할 수 있지만, 미스매치를 가짐으로써 단지 번역의 저해만을 고려 할 수 있으며, 이는 덜 강력한 억제를 결과로 한다.
일 실시예에서, 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20 개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 적어도 21 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 갖는다. 서열 길이는 또한 적어도 22 뉴클레오타이드, 또는 적어도 23 뉴클레오타이드 일 수 있다. 본 발명에 따른 제 1 RNA 서열은 서열번호 3 내지 7로부터 선택될 수 있다.
| 서열번호 | 제 1 RNA 서열 | 길이 |
| 3 4 5 6 7 |
5'-AAGGACUUGAGGGACUCGA-3' 5'-AAGGACUUGAGGGACUCGAA-3' 5'-AAGGACUUGAGGGACUCGAAG-3' 5'-AAGGACUUGAGGGACUCGAAGG-3' 5'-AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGC-3' |
19 20 21 22 23 |
제 1 RNA 서열.
표 1의 제 1 RNA 서열은 실시예에 기재된 바와 같이 서열 번호 1을 포함하는 전사물을 특이적으로 저해하는 것으로 나타났다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA의 제 1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1과 완전히 상보적이다. 이는 제 1 RNA 서열 및 서열 번호 1의 전체 길이 중 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 중 어느 것이 든 가장 짧은쪽의 어느 것에 대해서도 미스매치가 없음을 의미한다. 바람직하게는, 제 1 뉴클레오타이드 서열 및 서열 번호 1은 G-C 및 A-U 염기쌍만을 포함하는 완전히 상보적인 것이다. 바람직하게는, 제 1 RNA 서열은 서열 번호 1과 완전히 상보적인 서열 번호 3 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 제 1 RNA 서열은 서열번호 5이다. 제 1 뉴클레오타이드 서열이 21 뉴클레오타이드 또는 그 이하일 때(서열 번호 3, 4 및 5, 제 1 뉴클레오타이드 서열의 모든 뉴클레오타이드는 서열 번호 1과 염기쌍을 이룬다. 제 1 뉴클레오타이드 서열이 21 뉴클레오타이드 보다 길 때(서열 번호 6 및 7), 서열 번호 1의 모든 뉴클레오타이드는 제 1 뉴클레오타이드 서열과 염기쌍을 이룬다. 제 1 RNA 서열에 포함되는 추가 뉴클레오타이드는 서열 번호 1과 염기쌍을 형성하지 않는다. 제 1 뉴클레오타이드 서열이 21 뉴클레오타이드보다 길고 추가적인 뉴클레오타이드가 guide strand의 일부인 경우, 바람직하게는 추가 뉴클레오타이드는 서열 번호 2에 존재하는 서열 번호 1의 인접 서열에 상보적이다.
제 2 RNA 서열과 관련하여, 제 2 RNA 서열은 제 1 RNA 서열과 실질적으로 상보적이다. 제 1 RNA 서열과 결합된 제 2 RNA 서열은 이중 가닥 RNA를 형성한다. 즉, 이것은 타겟의 발현을 특이적으로 억제하기 위해 RISC 복합체에 제 1 RNA 서열로부터 유도 된 가이드 서열, 즉 헌팅턴 유전자 발현을 포함하도록 RNA 간섭 기작을 위한 적절한 기질을 형성하는 것이다. 상기와 같이, 이러한 이중 가닥 RNA는 바람직하게는 pre-miRNA 스캐폴드, pri-miRNA 스캐폴드, shRNA 또는 siRNA에 포함된다.
제 2 RNA 서열의 서열은 타겟 서열과 유사하다. 그러나, 제 1 RNA 서열과의 실질적 상보성은 제 1 RNA 서열과 서열 번호 1 사이의 실질적인 상보성과 비교하여 실질적 상보성을 덜 가지도록 선택 될 수 있다. 따라서, 제 2 RNA 서열은 0, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 미스매치, 0, 1, 2, 3 또는 그 이상의 GU 워블 염기쌍을 포함 할 수 있고, 0, 1, 2, 3, 4 뉴클레오타이드의 삽입 및/또는 0, 1, 2, 3, 4 뉴클레오타이드의 결실을 포함 할 수 있다. 바람직하게는, 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이며, 상기 상보성은 0, 1, 2 또는 3 개의 G-U 염기쌍을 포함 및/또는 상기 상보성은 최소 17 개의 염기쌍을 포함한다.
제 1 RNA 서열에 대한 G-U 워블 염기 쌍, 삽입 및 결실 같은 미스매치는, 즉 제 1 및 제 2 RNA 서열 사이에 형성된 이중 가닥 영역에 관한 것이다. 제 1 및 제 2 RNA 서열이 실질적으로 염기쌍 일 수 있고, 서열 번호 1의 서열 특이적 억제를 유도 할 수 있는 한, 본 발명에 따라 이러한 실질적 상보성이 허용된다. 또한, 제 1 RNA 서열과 제 2 RNA 서열 사이의 실질적 상보성은 선택된 이중 가닥 RNA 디자인에 따른 것으로 이해된다. 예를 들어, 이중 가닥 RNA가 혼합되는 것으로 선택된 miRNA 스캐폴드에 따른 것일 수 있다.
| 서열번호 | 제 2 RNA 서열 | 길이 |
| 8 9 10 11 12 13 14 |
5'-UCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' 5'-UUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' 5'-CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' 5'-CCUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' 5'-GCCUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' 5'-CUUCGAGUCUCAAGUCCUU-3' 5'-ACGAGUCCCUCAAGUCCUC-3' |
19 20 21 22 23 19 19 |
제 2 RNA 서열.
일 실시예에서, 제 2 RNA 서열은 서열번호 8 내지 14. 표 2에는 본 발명에 따른 상기 제 2 RNA 서열의 예가 기재되어있다. 서열번호 8, 9, 10, 11 및 12는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1과 완전히 상보적이다. 서열번호 13 및 14는 그 전체 길이에 걸쳐 서열 번호 1과 상보적인 21 개 뉴클레오타이드의 서열 번호 5에 상응하는 서열을 갖는 제 1 뉴클레오타이드와 조합될 수 있다. 서열 번호 13은 2 개의 뉴클레오타이드 결실(서열 번호 5에 상응하는 2 개 뉴클레오타이드는 염기쌍이 아님)을 가지며 서열 번호 5와 상보적이고, 19 개 뉴클레오타이드 염기쌍을 갖는다. 서열 번호 14는 2 개의 뉴클레오타이드 결실을 가지며 서열 번호 5와 상보적이고, 2 개의 미스매치 및 17 개의 뉴클레오타이드 염기쌍을 갖는다. 서열 번호 5 및 서열 번호 13의 조합이 miH12_155에 존재하고, 서열 번호 5 및 서열 번호 14의 조합이 miH12_451a에 존재하므로, 도 2B에서와 샅이 상보성을 나타낼 수있다. 따라서, 상기와 같이, 제 2 RNA 서열은 제 1 RNA 서열과의 상보성이 필요하지 않지만, 서열 번호 1과 비교하여, 미스매치를 초래하는 결실, 삽입 및 돌연변이를 포함할 수 있다.
상기와 같이, 제 1 RNA 서열과 제 2 RNA 서열 사이의 실질적 상보성은 완전하게 상보적인(즉, 전체가 염기쌍인) 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열에 비해 미스매치, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 일 실시예에서 제 1 및 제 2 RNA 서열은 적어도 11 개의 연속된 염기쌍을 갖는다. 따라서, 제 1 RNA 서열의 적어도 11 개의 연속적인 뉴클레오타이드 및 제 2 RNA 서열의 적어도 11 개의 연속적인 뉴클레오타이드는 완전히 상보적이다. 또 다른 실시예에서, 제 1 및 제 2 RNA 서열은 염기쌍을 갖는 최소 15 개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 제 1 RNA 서열의 15 개 뉴클레오타이드와 제 2 RNA 서열의 15 개 뉴클레오타이드 사이의 상기 염기쌍은 G-U, GC 및 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있거나 G-C 및 A-U 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제 1 및 제 2 RNA 서열은 염기쌍을 갖는 적어도 15 개의 뉴클레오타이드를 가지며 적어도 11 개의 연속 염기쌍을 갖는다. 또 다른 실시예에서, 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이며, 상기 상보성은 17 염기쌍 이상을 포함한다. 상기 17 개의 염기쌍은 바람직하게는 17 개의 연속적인 염기쌍일 수 있고, 상기 염기쌍은 G-U, G-C 및 A-U 염기쌍으로 이루어지거나 G-C 및 A-U 염기쌍으로 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3 및 8; 4 및 9; 5 및 10; 5 및 13; 5 및 14; 6 및 11; 7 및 12의 조합으로부터 선택될 수 있다. 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드 서열의 이러한 조합은 siRNA 또는 miRNA 스캐폴드에 포함될 때 효과적인 것으로 나타났다.
이들은 이중 가닥 RNA(dsRNA)-활성화 단백질 키나아제 경로(double-stranded RNA- activated protein kinase pathway)를 통해 선천성 면역 반응을 일으킬 수 있기 때문에 실질적 상보성을 갖는 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 30 개 염기쌍 이상의 연속적인 이중 가닥 RNA를 형성하지 않는다. 따라서, 이중 가닥 RNA는 바람직하게는 30 개 미만의 연속되는 염기쌍이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA를 포함하는 pre-miRNA 스캐폴드, pri-miRNA 스캐폴드, shRNA 또는 siRNA는 30 개의 연속적인 염기쌍을 포함하지 않는다
바람직하게는, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 pre-miRNA 또는 pri-miRNA 스캐폴드에 포함된다. pri-miRNA 스캐폴드는 pre-miRNA 스캐폴드를 포함한다. pre-miRNA 스캐폴드는 본 발명의 이중 가닥 RNA, 즉 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중 가닥 DNA는 miR-451a(또는 miR-451) 또는 miR-155로부터 유래된 pri-miRNA 스캐폴드에 포함된다. pre-miRNA 스캐폴드에 포함된 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA의 예는 도 2A에 도시되어 있다. 이러한 pre-miRNA의 서열은 하기 표 3과 같다.
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 15 | pre-miR451a | 5'-CUUGGGAAUGGCAAGGAAGGACUUGAGGGACUCG AAGACGAGUCCCUCAAGUCCUCUCUUGCUAUACCCAGA-3' |
| 16 | pre-miR155 | 5'-UGCUGAAGGACUUGAGGGACUCGAAGGUUUUGGCCA CUGACUGACCUUCGAGUCUCAAGUCCUUCAGGA-3' |
서열 번호 5의 Pre-miRNA 스캐폴드
서열 번호 15의 pre-mRNA 서열은 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 16에 대응하는 5' 팔 부분(arm), 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 17 내지 37로부터의 서열 번호 5에 대응하는 제 1 RNA 서열, 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 38 내지 56으로부터의 서열 번호 14에 상응하는 제 2 RNA 서열 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 57 내지 72에 상응하는 3'-팔 부분으로 구성된다. 본 발명에 따른 pre-miR451a 스캐폴드는 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 16에 상응하는 5'-팔 부분에 이어 본 발명에 따른 제 1 뉴클레오타이드 서열, 본 발명에 따른 제 2 뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 57 내지 72에 대응하는 3'-팔 부분을 포함한다. 바람직하게는, pri-miR451a 스캐폴드에 포함될 때 제 1 및 제 2 RNA 서열은 도 2B에 나타난 바와 같은 예측된 구조 또는 매우 유사한 구조처럼 얻어지도록 선택된다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 RNA 서열 사이에 형성된 염기쌍은 G-C, G-U 및 A-U 염기쌍이고, 바람직하게는 제 1 RNA 서열의 서열 길이는 21 뉴클레오타이드며, 제 2 RNA 서열의 길이는 바람직하게는 19 뉴클레오타이드다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 RNA 서열 사이에 형성된 염기쌍은 G-C 및 A-U 염기쌍이며, 바람직하게는 제 1 RNA 서열의 서열 길이는 21 뉴클레오타이드고, 제 2 RNA 서열의 길이는 바람직하게는 19 뉴클레오타이드다. 이론에 구애됨 없이, 이런 pri-R451a 스캐폴드는 RISC에 통합될 RNAi 장치에 의해 passenger strand이 처리되지 않으므로, 선호 될 수 있다(Cheloufi et al., 2010 Jun 3; 465(7298): 584-9). siRNA 또는 miRNA 듀플렉스로부터, 원칙적으로 두 가닥 모두 RISC에 통합 될 수 있다. passenger strand(제 2 서열에 대응)이 헌팅턴 전사물 이외 전사물의 타겟화를 초래할 수 있으므로, pri-miR451 a 또는 pre-miR451 스캐폴드를 사용하면 이러한 원하지 않는 타겟을 피할 수 있게 된다. 잠재적인 "passenger strand" 활성을 테스트했을 때, pri-451 스캐폴드는 활성이 검출되지 않았다(도 4A 및 4B). pre-miRNA 헤어핀의 프로세싱은 다이서 독립적이고 Ago2에 의해 절단되는 것으로 이해된다 (Yang 등, Proc Natl Acad Sci US A. 2010, 24, 107 (34) : 15163-8).
서열 번호 16의 pre-mRNA 서열은 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 1 내지 5에 상응하는 5'-팔 부분, 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 6 내지 26으로부터의 서열 번호 5에 상응하는 제 1 RNA 서열, 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 27 내지 45로부터의 루프 서열, 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 46 내지 64로부터의 서열 번호 13에 상응하는 제 2 RNA 서열 및 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 65 내지 69에 상응하는 3'-팔 부분으로 구성된다. 본 발명에 따른 pre-155 스캐폴드에 포함되는 제 1 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 1 내지 5에 상응하는 5'-팔 부분, 제 1 RNA 서열, 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 27-45에 상응하는 루프 서열, 제 2 RNA 서열, 및 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 65-69에 상응하는 3'-팔 부분을 포함한다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 RNA 서열은 pre-miR155 스캐폴드(또는 pri-miRNA 스캐폴드)에 포함될 때도 도 2B에 나타난 것과 매우 유사한 예측된 구조가 얻어 지도록 선택된다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 RNA 서열 사이에 형성된 염기쌍은 G-C 또는 A-U 염기쌍이고, 바람직하게는 제 1 RNA 서열의 서열 길이는 21 뉴클레오타이드고, 제 2 RNA 서열의 길이는 바람직하게는 19 뉴클레오타이드다. 상기 19 개 뉴클레오타이드는 바람직하게는 21 개 뉴클레오타이드 길이의 제 1 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 2-18과 완전히 상보적이다.
더 큰 RNA 서열에 포함될 때 pre-miRNA 서열은 Drosha 인식 및 절단을 허용하는 5'- 및 3'- 단일 가닥 인접 서열을 필요로한다. 상기 Drosha 인식 및 절단을 허용하기에 적합한 서열은 5'-pri-miRNA 서열 및 3'-pri-miRNA 서열이다. 예를 들어, 도 5A에 나타낸 바와 같이 표현된 pre-miH12_155 서열은 발현 벡터 CMV-miH12-155(도 2C)에서 5'-pri-miRNA 및 miR155의 3'-pri-miRNA 서열에 인접해 있다. pri-miRNA 서열은 도 2F에 기재된 miRH 12_155, 뉴클레오티드 1-87에 상응하는 5'- pri-miRNA 및 147-272에 상응하는 3'-pri-miRNA를 포함한다. 마찬가지로, 도면 2D 및 2E에서 각각의 벡터에 의해 발현되는 CAG-miH12-451 및 PGK-miH12-451 pri-miRNA 서열이 도 2G 및 2H에 도시되어있다. 발현된 CAG-miH 12-451 RNA의 5'-pri-miRNA 및 3'-pri-miRNA는 뉴클레오타이드 1 내지 302 및 375 내지 605에 상응하고, 발현된 PGK-miH12-451 RNA의 5'-pri-miRNA 및 3'- pri-miRNA는 뉴클레오타이드 1 내지 516 및 589 내지 819에 각기 상응한다. 단일 가닥 인접 길이는 변할 수 있지만 일반적으로는 약 80nt이다(Zeng and Cullen, J Biol Chem., 2005 Jul 29, 280(30): 27595-603; Cullen, Mol Cell, 2004 Dec 22, 16(6): 861-5). 단일 가닥 인접(the single- stranded flanks)의 최소 길이는 너무 짧아지면 Drosha 처리(processing)가 실패하고, 서열 특이적 억제가 감소되거나 소실되는 것이 쉽게 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 제 1 및 제 2 RNA 서열을 갖는 pri-miRNA 스캐폴드는 최소한 50 개 뉴클레오타이드의 예측된 재조합 pre-miRNA 구조에 대해 5' 서열 인접 및 3' 서열 인접을 갖는다. pre-miRNA 및 pri-miRNA 유래 서열은 바람직하게는 모두 동일한 자연 발생 pri-miRNA 서열로부터 유도된다.
서열 번호 15 및 서열 번호 16의 pre-miRNA 서열은 도 2C(서열 번호 16), 2D(서열 번호 15) 및 2E(서열 번호 16)에 나타낸 바와 같은 DNA 서열에 의해 암호화된다. 상기 pre-miRNA 서열을 포함하는 pri-miRNA 서열은 도 2F(서열 번호 16), 2G(서열 번호 15) 및 2H(서열 번호 15)에 도시되어 있다. CMV-miH12-155에 의해 암호화된 pri-miRNA는 도 2C의 뉴클레오타이드 1433 내지 1704, CAG-miH12-451에 의한 것은 도 2D의 뉴클레오타이드 1716 내지 2320, PGK-miH12-451에 의한 것은 도 2E의 뉴클레오타이드 278 내지 1097에 대응된다. 마찬가지로 제 1 및 제 2 RNA 서열은 상기 pre-miRNA에 통합되어야 한다.
siRNA, shRNA, pri-mRNA 스캐폴드 또는 pre-miRNA 스캐폴드에 통합된 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 당 업계에 공지 된 방법, 예컨대 리포펙션(lipofection), 형질감염(transfection) 또는 임의의 다른 적절한 수단을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA는 합성 이중 가닥 RNA 또는 천연 이중 가닥 RNA 일 수 있다. 합성 이중 가닥 RNA는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함 할 수 있다. 상기 이중 가닥 RNA는 천연의 것과 비교하여 유사한 성질을 가지며, 완전히 비합성 이중 가닥 RNA로 이루어진 이중 가닥 RNA와 유사하거나 개선된 RNA 간섭 활성을 갖는다. 예를 들어, 합성 siRNA는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid) (2'-0와 4'-C 원자 사이의 메틸렌 브릿지(오렌지)에 의해 연결된 리보스 고리), 포스포로티오에이트(phosphorothioate)를 가진 뉴클레오티드처럼 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸(Me), 2'-O-알릴(allyl) 및 2'-데옥시(deoxy)-플루오로오리딘(fluorouridine)을 그들의 디자인에 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이중 가닥 RNA, 예를 들어, siRNA는 활성을 크게 상실하지 않으면서 염기쌍 및 비염기 쌍 위치에서 많은 수의 변형을 수용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 이중 가닥 RNA는 이중 가닥 RNA의 발현으로부터 얻어지는 것과 같은 천연 뉴클레오타이드로 구성되는 이중 가닥 RNA이다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 상기 이중 가닥 RNA는 상기 DNA 서열에 의해 암호화된다. siRNA, shRNA, pri-mRNA 스캐폴드 또는 pre-miRNA 스캐폴드에 포함된 것과 같은 상기 이중 가닥 RNA를 암호화하는 상기 DNA 서열은 발현 카세트에 포함된다. 이중 가닥 RNA가 예를 들어 2 개의 RNA 가닥으로 이루어진 siRNA일 때 2 개의 발현 카세트(expression cassette)가 필요하다는 것이 이해된다. 한 카세트는 제 1 RNA 서열을 포함하는 RNA 가닥을 암호화하고, 다른 카세트는 제 1 RNA 가닥을 포함하는 RNA 가닥을 암호화한다. 이중 가닥 RNA가 단일 RNA 분자, 예를 들어 shRNA, pre-miRNA 또는 pri-miRNA를 암호화 하는 경우, 하나의 발현 카세트로 충분할 수 있다. pol II 발현 카세트는 발현될 RNA를 암호화하는 프로모터 서열, 이어서 발현될 RNA를 암호화하는 서열, 이어서 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열을 포함 할 수 있다. 발현되는 이중 가닥 RNA가 pri-miRNA 스캐폴드를 포함하는 경우, 암호화된 RNA 서열은 인트론 서열 및 엑손 서열 과 3'-UTR' 및 3'-UTR을 암호화 할 수 있다. pol III 발현 카세트는 일반적으로 프로모터 서열, 이어서 RNA(예를 들어, shRNA 서열, pre-miRNA 또는 siRNA 또는 연장 된 siRNA에 포함되는 이중 가닥 RNA의 가닥)를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. pol I 발현 카세트는 pol I 프로모터를 포함 할 수 있으며, 이어서 RNA 암호화 서열 및 3'- 박스를 포함할 수 있다. 이중 가닥 RNA에 대한 발현 카세트는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 임의의 유형의 발현 카세트, 예를들어 pol III 프로모터, pol II 프로모터 또는 pol I 프로모터를 사용하는 것으로 충분할 수 있다. (i.a. ter Brake et al., Mol Ther. 2008 Mar; 16(3): 557-64, Maczuga 외, BMC Biotechnol. 24; 12:42). 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA를 발현하는 발현 카세트의 예는 도 2C 내지 2E에 도시되어 있다.
바람직하게는 PGK 프로모터, CBA 프로모터 또는 CMV 프로모터와 같은 pol II 프로모터가 사용된다 (도 2C 및 2D). 헌팅턴 병은 뉴런에 영향을 미치므로 신경특이적 프로모터를 사용하는 것이 특히 유용할 수 있다. 적절한 신경특이적 프로모터의 예는 뉴런-특이적 에놀레이즈(Neuron-Specific Enolase; NSE), 인간 시냅신 1(human synapsin 1), caMK 카이네이즈(kinase) 및 튜블린(tubuline)이다. 고려될 수 있는 다른 적합한 프로모터는 유도성 프로모터, 즉 숙주 세포가 특정 자극에 노출된 경우에만 전사를 개시하는 프로모터이다.
본 발명에 따른 상기 발현 카세트는 예를 들어 형질감염 방법을 사용하여 세포로 전달 될 수 있다. 임의의 적합한 수단이 본 발명에 따른 발현 카세트를 전달하기에 충분할 수 있다. 바람직하게는, 앞서 서술한 바와 같이 헌팅턴 유전자의 서열 특이적 억제를 유도하는 이중 가닥 RNA의 안정적 발현을 이루기 위해 발현 카세트를 세포에 안정적으로 전이시키는 유전자 치료 벡터가 사용된다. 적합한 벡터는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector), 레트로트랜스포존(retrotransposon) 기반 벡터 시스템, 또는 AAV 벡터 일 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터가 RNA 게놈을 지니고 있기 때문에, RNA 게놈은 세포의 형질 도입 후에 상기 DNA 서열 및 상기 발현 카세트가 형성되도록 상기 발현 카세트를 암호화 할 것이 이해된다. 바람직하게는 AAV와 같은 바이러스 벡터가 사용된다. 바람직하게는 사용되는 AAV 벡터는 혈청형(serotype) 5의 AAV 벡터이다. 혈청형 5의 AAV는 실시 예에 나타낸 바와 같이 뉴런에 형질 도입하는데 특히 유용할 수 있다. 관심있는 임의의 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터의 생산은 WO2007/046703, WO2007/148971, WO2009/014445, WO2009/104964, WO2011/122950, WO2013/036118에 개시되어있으며, 이들 모두 본 명세서에 포함된다.
예를 들어 곤충 또는 포유 동물 세포주에서 생산되는 AAV 벡터의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유도 될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 상당한 상동성(homology)을 갖는 게놈 서열을 가지며, 동일한 유전적 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적 및 기능적으로 동등한 비리온(virion)을 생성하며, 실질적으로 동일한 메카니즘에 의해 복제 및 조립된다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성에 대한 개요는 예를 들어 GenBank 수탁 번호 U89790; GenBank 수탁 번호 J01901; GenBank 수탁 번호 AF043303; GenBank 수탁 번호 AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71 : 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir., 45 : 555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73 : 1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72 : 309-319); 및 Wu 등. (2000, J. Vir. 74 : 8635-47)에서 볼 수 있다.
AAV 혈청형 1, 2, 3, 4 및 5는 본 발명과 관련하여 사용함에 있어 AAV 뉴클레오타이드 서열의 바람직한 공급원이다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2 및/또는 AAV5로부터 유도된다. 마찬가지로 Rep52, Rep40, Rep78 및/또는 Rep68 암호화 서열은 바람직하게는 AAV1, AAV2 및 AAV5로부터 유도된다. 그러나, 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 암호화하는 서열은 공지된 42 가지 혈청형 중 임의의 것, 보다 바람직하게는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , AAV8 또는 AAV9 또는 예를 들어 캡시드 셔플링(capsid shuffling) 기법 및 AAV 캡시드 라이브러리에 의해 얻어지는 새롭게 개발된 AAV-유사 입자에서 선별된다.
또 다른 실시예에서, 상기 DNA 서열, 또는 본 발명에 따른 상기 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 상기 발현 카세트 또는 DNA 서열은 박테리아에 함유된 플라스미드에 포함될 수 있다. 상기 발현 카세트 또는 DNA 서열은 또한 예를 들어 바이러스 벡터를 생산하는 생산 세포에 포함될 수 있다.
예시 부분(example section)에서 보고, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 가닥 RNA, 본 발명에 따른 DNA 서열, 본 발명에 따른 발현 카세트 및 본 발명에 따른 유전자 치료 벡터는 의학적 용도, 특히 헌팅턴 병의 치료에 사용하기 위한 치료에 유용하다. 상기 치료는 뇌에 본 발명의 AAV 벡터의 직접 주입(direct infusion)을 포함하는 AAV 벡터(또는 유전자 치료 벡터와 마찬가지로)를 사용할 때의 치료이다. 다른 실시예에서 상기 직접 주입은 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 내로의 벡터의 척수강 내 주입(intrathecal infusion)을 포함한다. 그러한 뇌척수 내 주입은 CNS에 유전자 치료 벡터를 전달하고 뉴런을 타겟화 하는 효율적인 방법을 나타낸다. 바람직하게는 줄무늬체(striatal, 선조체) 및 피질(cortex) 구조는 줄무늬체로의 주사를 통한 AAV 벡터의 선내 대류 강화 확산(convection enhanced diffusion; CED) 전달을 통해 타겟화 된다. 보다 바람직하게는, CNS의 더 큰 적용 범위를 위해 줄무늬체 및 시상(thalamus)에 또한 주사된다. 따라서 AAV 벡터는 줄무늬 또는 striatum과 시상에 대류 증식 확산 (CED) 주사를 통해 intrastriatally 전달하거나 intrarastriatally 및 intrathalamically 제공된다. 이러한 주사는 바람직하게는 MRI 유도 주사(MRI-guided injection)를 통해 수행된다. 상기 치료 방법은 특히 헌팅턴 병을 갖는 인간을 대상으로 유용하다. 헌팅턴 병의 치료는 헌팅턴 병의 증상을 보이지 않는 헌팅턴 병의 유전적 소인(genetic predisposition)을 갖는 사람을 포함하는 헌팅턴 병 환자를 포함한다. 따라서, 헌팅턴 병을 가진 인간을 대상으로 치료하는 것은 35 개 이상의 CAG 반복을 갖는 헌팅턴 대립 유전자를 보유하는 임의의 인간을 대상으로 한 치료를 포함한다.
<실시예(Embodiments)>
1. 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥(double stranded) RNA로, 여기서 제 1 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이고, 여기서 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며, 서열 번호 1과 실질적으로 상보적인 이중 가닥 RNA.
2. 실시예 1에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 헌팅턴 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 이중 가닥 RNA.
3. 실시예 1 또는 실시예 2에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 pre-miRNA 스캐폴드(scaffold), pri-miRNA 스캐폴드, shRNA 또는 siRNA, 바람직하게는 pre-miRNA 스캐폴드에 포함되는 것인, 이중 가닥 RNA.
4. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 RNA 서열은 20 개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 21 개 이상의 뉴클레오타이드의 서열 길이를 갖는 것인, 이중 가닥 RNA.
5. 실시예 1 내지 실시예 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 RNA 서열은 서열 번호 1과 완전하게 상보적인 것인, 이중 가닥 RNA.
6. 실시예 1 내지 실시예 5 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 가닥은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 이중 가닥 RNA.
7. 실시예 1 내지 실시예 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 가닥 및 제 2 가닥은 서열 번호 3 및 8; 서열 번호 4 및 9; 서열 번호 5 및 10; 서열 번호 5 및 13; 서열 번호 5 및 14; 서열 번호 6 및 11; 및 서열 번호 7 및 12의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인, 이중 가닥 RNA.
8. 실시예 1 내지 실시예 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 miR-451a 또는 miR-155로부터 유래 된 pre-miRNA 스캐폴드에 포함되는 것인, 이중 가닥 RNA.
9. 실시예 1 내지 실시예 8 중 어느 한 항에 따른 이중 가닥 RNA를 암호화(coding)하는, DNA 서열.
10. 실시예 1 내지 실시예 9 중 어느 한 항에 따른 이중 가닥 RNA를 암호화하는, 발현 카세트.
11. 실시예 10에 있어서, 상기 발현 카세트는 PGK 프로모터, CMV 프로모터, 신경 특이적 프로모터 또는 CBA 프로모터를 포함하는 것인, 발현 카세트.
12. 실시예 10 또는 실시예 11에 따른 발현 카세트를 포함하는, 유전자 치료용 벡터.
13. 실시예 12에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 혈청형(serottype) 5의 AAV 벡터인 것인, 유전자 치료 벡터.
14. 실시예 9에 따른 DNA 서열 또는 실시예 10 또는 실시예 11에 따른 발현 카세트를 포함하는, 숙주 세포.
15. 의학적 치료에 사용하기 위한, 실시예 1 내지 실시예 8 중 어느 한 항에 따른 이중 가닥 RNA, 실시예 9에 따른 DNA 서열, 실시예 10 또는 실시예 11에 따른 발현 카세트, 실시예 12 또는 실시예 13에 따른 유전자 치료용 벡터.
16. 헌팅턴 병 치료에 사용하기 위한, 실시예 1 내지 실시예 8 중 어느 한 항에 따른 이중 가닥 RNA, 실시예 9에 따른 DNA 서열, 실시예 10 또는 실시예 11에 따른 발현 카세트, 실시예 12 또는 실시예 13에 따른 유전자 치료용 벡터.
<예시 (Examples)>
miRNA
스캐폴드
발현
컨스트럭트
및
siRNA
miR155를 기반으로 miRNA 스캐폴드 벡터를 만들기 위해 도 1에 표시된 HTT에서 선택된 타겟 서열과 완전히 상보적인 21 개의 뉴클레오타이드(bp) 서열을 pcDNA6.2-GW/EmGFP-1의 pri-mir-155 백본에 끼워 넣었다. pVD-CMV-miHTT-155 (발현 카세트 서열의 예는 도 2C에 묘사되어 있으며, 발현된 RNA에 포함된 pre-miRNA 및 pri-miRNA 서열은 도 2B 및 2F). pri-mir-155 컨스트럭트는 Invitrogen에서 제공된 지침(BLOCK-iT, Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트, Verson E, June 22, 2007, 25-0857)에 기반하여 pcDNA6.2-GW/emGFP-mir155의 BsaI 부위에서 합성 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 어닐링함으로써 설계되었다. miHtt 구조체에 의해 암호화 된 모든 인공 pre-miRNA의 구조는 Mfold 소프트웨어를 사용하여 확인되었다(Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003), using mfold version 3.5, as available online on http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold). 서열 번호 5에 상응하는 서열을 갖는 pre-miRNA-155 스캐폴드의 예측된 구조가 도 2B에 나타나 있다. 선택된 제 1 서열로서 서열 번호 5를 갖는 pri-miRNA-155 스캐폴드에 대한 발현 구조물을 암호화하는 DNA 서열은 도 2C (서열 번호 17)에 나열되어 있으며, 이 구조물은 miH12로도 지칭되고, 다른 20 개의 선택된 타겟 서열에 대해, 서열은 도 1에 나타낸 바와 같이 타겟 서열과 완전하게 상보적으로 디자인되었고, 도 1에 도시된 것과 동일한 구조적 특징을 갖는 miRNA 스캐폴드가 디자인되었다. 즉, 스캐폴드에 포함된 제 2 RNA 서열은 선택된 제 1 RNA 서열이 완전히 상보적이지만 중심에서 2 뉴클레오타이드 결실(deletion)을 갖는 서열에 상응한다. 유사하게, 스크램블 RNA 서열이 제 1 RNA 서열로서 사용되고, 상기와 같이, 제 2 RNA 서열이 벡터 pVD-CMV-miScr-155를 생성하도록 설계되었다. 이 구조물은 in vitro 및 in vivo에서 miRNA 발현 및 형질 도입 시각화를 허용하는 GFP를 포함하고 있다.
miR451을 기반으로 한 miRNA 스캐폴드 벡터가 만들어졌다. pri-miR-451 스캐폴드를 암호화하는 DNA 서열은 예측된 성숙한(mature) mir-451 서열을 H12 타겟 서열, 즉 제 1 RNA 서열로서 서열 번호 5로 대체하여 합성하였다. 제 2 RNA 서열은 제 1 RNA 서열의 뉴클레오타이드 2 내지 18 에 완전히 상보적으로 디자인되었다. 제 2 RNA 서열은 인공 pre-miRNA 서열의 예측 된 RNA 구조가 원래 야생형 구조와 유사한 구조를 채택하도록 선택되었다. 구조에 의해 암호화된 pre-miRNA의 구조는 Mfold 소프트웨어를 사용하여 확인되었다(Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003), using mfold version 3.5, as available online on http://mfold.rna. albany.edu/?q=mfold). 서열 번호 5를 사용하여 예측된 구조가 도 2B에 도시되어있다. 벡터를 발현하는 두 개의 다른 miR451 스캐폴드가 제작되었다. 발현 구조물의 DNA 서열을 도 2D 및 2E에 나타내었으며, 발현된 RNA에 포함된 상응하는 각각의 pri-miRNA 스캐폴드 서열을 도 2G 및도 2H에 나타내었다. 도 2D는 CAG 프로모터로 miRNA 스캐폴드를 발현하는 pVD-CAG-miH 12-451의 발현 카세트의 DNA 서열을 도시하고, 도 2E에서 pVD-PGK-miH12-451의 발현 카세트의 DNA 서열은 이것은 PGK 프로모터를 사용한다.
miH12 타겟에서 HTT를 타겟으로하는 합성 siRNA, 즉 서열번호 1은 19-23 bp의 길이로 설계되었다 (표 1). siRNA는 서열번호 3 및 8; 4 및 9; 5 및 10; 6 및 11; 7 및 12에 상응하는 제 1 및 제 2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. siRNA는 두 가닥 모두에서 3'-UU 오버행을 갖도록 디자인 되었다.
리포터 제작
완전한 HTT 엑손 1 서열을 함유하는 psiCheck-2 컨스트럭트는 Promega (siCHECK ™ Vectors, C801 1, Promega Benelux b.v., Leiden, The Netherlands)에서 제공된 지침에 따라 디자인되고 복제되었다. LucHTT는 서열 번호 1에 포함 된 서열 번호 1 및 그의 인접 서열을 포함한다(도 1B). LucH12_451a 리포터는 pVD-CAG-miH 12-451 및 pVD-PGK-miH12-451에 의해 발현되도록 고안된 제 2 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 모든 구조가 순서가 정해져 있고 올바른 순서가 검증되었다. 모든 miRNA 스캐폴드 및 siRNA의 넉다운 효율은 시험관 내 특정 루시퍼 라제 리포터에서 측정되었다. Hek293T 세포를 1:1 비율(miR-155, PGK-miH12-451) 또는 1:10 비율(CAG-miH12-451, 즉 CAG 프로모터는 매우강함)로 miHtt 및 루시퍼레이즈 리포터와 함께 형질감염시켰다. 바다팬지(Renilla) 루시퍼레이즈의 넉다운을 형질감염 후(pt) 48시간째에 측정하고 반딧불이(Firefly)를 내부 대조군(internal control)으로 측정했다. miScr을 음성 대조군으로 사용하고 100 %로 기준하였다.
시험관 내(In vitro) 결과
엑손 1을 타겟으로하는 miH1-miH21 구조물 중 miH12는 루시퍼레이즈 리포터 넉다운시켜 75-80 % 감소시켰다(도 3A). H12, 즉 서열 번호 1을 타겟으로하는 siRNA는 모두 유사한 넉다운 효율을 갖는 것으로 나타났으며, 투여량이 증가하면 더 강한 넉다운을 나타냈다. 19 및 21 염기쌍의 siRNA는 시험 된 다른 siRNA와 비교하여 더 많은 억제를 나타냈다. pVD-CMV-miHTT-155에서 발현 된 RNA의 차세대 시퀀싱(Next generation sequencing; NGS) 분석을 수행하여 miRNA 스캐폴드의 일부로 설계된 제 1 RNA 및 제 2 RNA 서열에 해당하는 가이드 및 passenger strand(도 2B (7))의 선호도를 보였다. pVD-CAG-miH12-451 및 pVD-PGK-miH12-451은 LucHTT 및 LucH12_451a 모두를 타겟으로 하는 것으로 시험하였다. Luc 리포터가 구조의 제 2 RNA 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 반면, CAG 및 PGK 구조는 서열 특이적인 억제를 나타내지만(도 4A), 감소되지는 않았다.
마우스에서
AAV
벡터를 이용한 체내(In
vivo
)
넉다운
pVD-CMV-miHTT-155의 발현 구조물 CMV-miH12-155를 AAV5 벡터 백본에 클로닝하고 AAV5를 배큘로바이러스(baculovirus) 생산 시스템을 사용하여 생산하였다. 대조군으로서 CMV-miScr-155는 음성 대조군 역할을 하는 AAV5 백본에 통합되었다. 뇌 전달 효율을 모니터링하기 위해, 발현 카세트에 GFP를 포함시켰다(도 5A). 서열 번호 1에 기재되어있는 타겟 서열(즉, 73 CAG 반복을 갖는 완전한 HTT 엑손 1 서열) 및 서열 번호 2에 존재하는 그 인접 서열을 포함하는 루시퍼레이즈 리포터 컨스트럭트, Luc73QHTT를 갖는 AAV-5 벡터(도 1B). BALB/6 마우스(N5)는 AAV5- Luc73QHtt/SNP(3.6x1012 gc/ml)과, AAV5-miScr(1.8x1013 gc/㎖) 또는 AAV5-miH12 (1.8x1013 gc/ml)을 1:5의 비율로 줄무늬체 내에(intrastriatally) 함께 주사했다(co-injected). 별도의 그룹에는 AAV5-Luc73QHtt / SNP 및 PBS를 주사하였다. 루시퍼레이즈 발현은 MS로 2, 4 및 6 p.i.에서 모니터링 되었다. 이미 p.i. 1 주일째에 miScr 및 Luc19QHtt/wt-only 동물(도 7B 및 C)과 비교하여 miH12에 의한 Luc19QHtt/wt의 명확한 넉다운이 나타났다. CMV-miH12-155에 의한 HTT 타겟의 강한 넉다운을 나타내는 대조군과 비교하여 루시퍼레이즈 리포터 발현이 현저히 감소해 뇌에서 거의 검출되지 않는(miH12 # 1 및 # 2) 경향이 나타났다. 실험 종료시, CMV-miH12-155 그룹의 Luc73QHtt / SNP 형광은 miScr에 비해 약 1 로그 낮았다.
헌팅턴 병 동물 모델에서
AAV
vector를 이용한 체내
넉다운
AAV5-CMV-miH12-155는 LV-171-82Q HD 랫트(rat) 모델에서 시험되었다(Drouet et al., 2009, Ann Neurol, 2009 Mar; 65 (3) : 276-85). 상기 모델은 SNP C/T를 함유하는 엑손 67 단편에 연결된 82 개의 CAG 반복을 갖는 HTT 돌연변이 단편의 처음 171 개 아미노산의 선조체 과발현을 기본으로 한다. HD 랫트에게 AAV5-CMV-miH12-155 또는 대조군 AAV5-CMV-miScr-155 (도 6A)를 주사하였다. 랫트에게 LV-171 -82Q를 주입하고 1 주일 후에 AAV5-CMV-miH12-155 또는 AAV5-CMV-miScr-155를 랫트에 주사 하였다. AAV5-CMV-miH12-155의 신경 보호(neuroprotective) 효과는 초기 및 후기 시점에서 HD 랫트 뇌 절편의 조직학적 염색 (DARP32, EM48, GFP 및 Iba1)에 기초하여 결정되었다 (도 6B, 6C 및 6D, 2주 p.i.). DARP32 병변 (도 6B)은 신경 변성을 나타내며 뇌 절편상의 흰 반점으로 관찰될 수 있다. 이 패널은 AAV5-CMV-miH12-155 랫트의 뇌 절편에서 더 적은 신경 세포 사멸 및 따라서 백색 반점을 나타내지 않았다. 슬라이드에서 작은 갈색 점으로 보이는 돌연변이 HTT 응집체(EM48, 도 6B)에 대해 뇌 절편을 염색했다. 대조군과 비교하여 AAV5-CMV-miH12-155를 주사한 HD 랫트에서는 분명히 신경 퇴화가 적고 돌연변이 된 HTT 응집체가 적었다(도 6B). 주사 후 8 주 후반 시점에서도 유사한 결과가 얻어졌다. GFP 조직학적 결과(갈색 염색)는 본 발명에서 사용된 모든 벡터와 함께 줄무늬체에 형질도입(transduction)이 효율적으로 수행된 것을 나타냈다(도 6C) 또한, Iba1 염색에 기초한 8 주 p.i.에서 면역 반응은 거의 검출되지 않았다(도 6D).
AV5-CMV-miH12-155는 인간화 Hu97/18 HD 마우스 모델 (Southwell et al., 2013, Hum Mol Genet. 2013 Jan 1, 22 (1) : 18-34)에서 추가로 테스트되었다. 이 모델은 쥐의 Hdh 유전자가 인간 HTT 카피 2 개로 대체되었으며, 하나는 97 개의 CAG 반복을 포함하고 다른 하나는 18 개를 포함했다. 마우스 모델의 질병 진행 결과로서 운동, 정신병적(psychiatric), 인지적(cognitive), 전기 생리학적(electrophysiological), 신경 병리학적(neuropathological) 및 생화학적(biochemical) 상세한 특성의 변화가 검사되었다. AAV5-CMV-miH12-155는 2 개월 된 인간화 Hu97/18 HD 마우스 모델에 줄무늬체의 대류 강화 확산을 통한 뇌내 전달(intracerebral delivery via convection-enhanced diffusion; IC-CED) 또는 줄무늬체에서 느린 뇌내 전달(IC-slow delivery) 또는 뇌의 뇌실(ventricle)내에서 뇌실내 전달(intracerebroventricular delivery; ICV)로 주입되었다. GFP 형광은 느리게 CED(convection-enhanced diffusion) 전달로 마우스 줄무늬체에 완전한 형질 도입된 것을 나타내었다(도 7A). 인간 HTT의 웨스턴 블롯 분석을 통해 CED 전달이 적용될 때 줄무늬체에서 AAV5-CMV-miH12-155에 의한 넉다운을 보았다(도 7B).
선행
타겟
서열과 H12의 비교
H12 서열 부근에서 선행 기술의 타겟 서열을 H12 서열과 비교하였다. siRNA 및 miRNA 스캐폴드를 구성하고 상기 루시퍼레이즈 리포터 시스템을 사용하여 직접 비교를 수행하였다. 결과를 왜곡시키는 오프-타겟 효과를 피하기 위해 낮은 농도(0.25 nM)의 siRNA를 트리플리케이트(triplicate)로 형질감염시켰다. siRNA는 완전히 상보적인 guide strand 및 passenger strand(G-C 및 A-U 염기쌍)이며, 두 가닥 모두 UU-3' 오버행이 있게 제작되었다. 스크램블(scramble) siRNA를 대조군으로 사용하고 값을 대조군과 비교하여 측정하였다. H12 siRNA는 가장 강한 억제를 보였다(도 8A). 마찬가지로, miRNA 스캐폴드는 Invitrogen의 매뉴얼에(with the instruction) 따라 상기와 같이 miR-155에 기초하여 만들어졌으며, 직접 비교가 이루어졌다. R6.1 및 R6.2 스캐폴드는 R6.1 및 R6.2 타겟 서열에 완벽하게 상보적인 19 개 및 18 개의 뉴클레오타이드를 Invitrogen의 공학적(engineered) miR-155 스캐폴드의 가이드 서열로 대체하여 제조되었다. 따라서 다이서의 pre-miRNA 프로세싱(processing)에 따라 가공된 R6 guide strand은 miR-155 스캐폴드의 뉴클레오타이드를 서열의 끝 부분에 포함할 수 있다. miRNA 구조물과 리포터(miRNA 스캐폴드 컨스트럭트: 루시퍼레이즈 리포터) 사이에 다른 비율로 miRNA 스캐폴드를 앞에서 서술한 바와 같이 형질감염시켰다. 스크램블 miRNA 컨스트럭트를 대조군으로 사용하고, 대조군과 비교하여 값을 측정하였다. 도 8B는 1:1 비율을, 도 8C는 1:10 비율을 나타냈다. H12 miRNA 스캐폴드는 가장 강력한 억제를 보였다. H12는 특히 체내(in vivo) 적용과 가장 관련이 있다고 여겨지는 낮은 농도에서는 siRNA와 miRNA 모두에 대해 강한 저해를 보였다.
| 타겟 | 타겟 서열 | SI. | L. | Id. |
| H12 | 5'-CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3' | 34 | 21 | 21 |
| H11 | 5'-GAAGGCCUUCGAGUCCCUCAA-3' | 33 | 21 | 15 |
| R1(siHUNT-2) | 5'-GGCCUCGAGUCCCUCAAGUCC-3' | 46 | 21 | 18 |
| R2(shD2) | 5'-GGCCUUCGAGUCCCUCAAGUC----3' | 47 | 21 | 18 |
| R3(siRNA-DExon1) | 5'-AGGCCUUCGAGUCCCUCAAGU-3' | 48 | 21 | 17 |
| R4(HDAS 07) | 5'-AUGAAGGCCUUCGAGUCCCUC-3' | 49 | 21 | 13 |
| R6.1 (54) R6.2 (55) |
5'-GCCUUCGAGUCCCUCAAGU-3' 5'-CCUUCGAGUCCCUCAAGU-3' |
50 51 |
19 18 |
17 17 |
표 4는 선행 기술의 타겟과 H12의 비교로 표적서열을 나타냈다. H12 표적 서열과 동일성(identity)을 갖는 표적 뉴클레오타이드는 밑줄로 표시했다. (SI는 서열 번호, L은 뉴클레오타이드 길이, Id는 H12와 동일성을 갖는 뉴클레오타이드의 수를 나타낸다). (R1은 Rodriguez-Lebron et al., 2005, Mol Ther., Vol 12 No.4 : 618-633의 siRNA siHUNT-2에서 유래되었으며, R2는 Franich et al., 2008, Mol에 의해 발현된 shRNA shD2에서 유래되었다.) R3는 US20080015158의 siRNA-DExon1으로부터 유도되고, R4는 HDAS 07 WO2008134646으로부터 유래되며, R6.1 및 R6.2는 약 1750 개의 가상의 siRNA 리스트로부터 유도된다 헌팅턴 유전자를 표적으로 하도록 디자인 되었다(WO2005105995).
<110> uniQure IP B.V.
<120> Huntingtin gene suppression
<130> P32194PC00
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaggacuuga gggacucgaa ggc 23
<210> 2
<211> 614
<212> RNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
uugcugugug aggcagaacc ugcgggggca ggggcgggcu gguucccugg ccagccauug 60
gcagaguccg caggcuaggg cugucaauca ugcuggccgg cguggccccg ccuccgccgg 120
cgcggccccg ccuccgccgg cgcacgucug ggacgcaagg cgccgugggg gcugccggga 180
cggguccaag auggacggcc gcucagguuc ugcuuuuacc ugcggcccag agccccauuc 240
auugccccgg ugcugagcgg cgccgcgagu cggcccgagg ccuccgggga cugccgugcc 300
gggcgggaga ccgccauggc gacccuggaa aagcugauga aggccuucga gucccucaag 360
uccuuccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 420
cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgccuccuca gcuuccucag 480
ccgccgccgc aggcacagcc gcugcugccu cagccgcagc cgcccccgcc gccgcccccg 540
ccgccacccg gcccggcugu ggcugaggag ccgcugcacc gaccgugagu uugggcccgc 600
ugcagcuccc uguc 614
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first sequence targeting huntingtin (guide)
<400> 3
aaggacuuga gggacucga 19
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first sequence targeting huntingtin (guide)
<400> 4
aaggacuuga gggacucgaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first sequence targeting huntingtin (guide)
<400> 5
aaggacuuga gggacucgaa g 21
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first sequence targeting huntingtin (guide)
<400> 6
aaggacuuga gggacucgaa gg 22
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> first sequence targeting huntingtin (guide)
<400> 7
aaggacuuga gggacucgaa ggc 23
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 8
ucgagucccu caaguccuu 19
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 9
uucgaguccc ucaaguccuu 20
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 10
cuucgagucc cucaaguccu u 21
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 11
ccuucgaguc ccucaagucc uu 22
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 12
gccuucgagu cccucaaguc cuu 23
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 13
cuucgagucu caaguccuu 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second sequence (passenger)
<400> 14
acgagucccu caaguccuc 19
<210> 15
<211> 72
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miR451a scaffold
<400> 15
cuugggaaug gcaaggaagg acuugaggga cucgaagacg agucccucaa guccucucuu 60
gcuauaccca ga 72
<210> 16
<211> 69
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miR155 scaffold
<400> 16
ugcugaagga cuugagggac ucgaagguuu uggccacuga cugaccuucg agucucaagu 60
ccuucagga 69
<210> 17
<211> 1989
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVD-CMV-miH12-155
<400> 17
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagtcccaag 660
ctggctagtt aagctatcaa caagtttgta caaaaaagca ggctttaaaa ccatggtgag 720
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 780
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 840
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 900
caccttcacc tacggcgtgc agtgcttcgc ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 960
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 1020
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 1080
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 1140
gtacaactac aacagccaca aggtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 1200
ggtgaacttc aagacccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 1260
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 1320
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 1380
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagctaagca 1440
cttcgtggcc gtcgatcgtt taaagggagg tagtgagtcg accagtggat cctggaggct 1500
tgctgaaggc tgtatgctga aggacttgag ggactcgaag gttttggcca ctgactgacc 1560
ttcgagtctc aagtccttca ggacacaagg cctgttacta gcactcacat ggaacaaatg 1620
gcccagatct ggccgcactc gagatatcta gacccagctt tcttgtacaa agtggttgat 1680
ctagagggcc cgcggttcgc tgatggggga ggctaactga aacacggaag gagacaatac 1740
cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg 1800
tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg 1860
tgaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt 1920
tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc catagcatcc 1980
cctatagtg 1989
<210> 18
<211> 2444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVD-CAG-miH12-451
<400> 18
cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattcgccc ttaattcggt accctagtta 60
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 120
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 180
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 240
ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 300
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 360
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 420
cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat 480
tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggg 540
gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc 600
ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg 660
gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcga cgctgccttc 720
gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt 780
tactcccaca agtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg 840
tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg 900
gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc 960
gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt 1020
gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg 1080
ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg 1140
gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg agttgctgag 1200
cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg 1260
ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag 1320
ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgcgc 1380
cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 1440
atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg gcgcggggcg 1500
aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc 1560
cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg 1620
gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct 1680
gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt 1740
gtgctgtctc atcattttgg caaagaatta agggcgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 1800
tgcatctaga tatcggcgct atgcttcctg tgcccccagt ggggccctgg ctgggatttc 1860
atcatatact gtaagtttgc gatgagacac tacagtatag atgatgtact agtccgggca 1920
cccccagctc tggagcctga caaggaggac aggagagatg ctgcaagccc aagaagctct 1980
ctgctcagcc tgtcacaacc tactgactgc cagggcactt gggaatggca aggaaggact 2040
tgagggactc gaagacgagt ccctcaagtc ctctcttgct atacccagaa aacgtgccag 2100
gaagagaact caggaccctg aagcagacta ctggaaggga gactccagct caaacaaggc 2160
aggggtgggg gcgtgggatt gggggtaggg gagggaatag atacattttc tctttcctgt 2220
tgtaaagaaa taaagataag ccaggcacag tggctcacgc ctgtaatccc accactttca 2280
gaggccaagg cgctggatcc agatctcgag cggccgcccg tggcatccct gtgacccctc 2340
cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 2400
aaaattaagt tgcatcaaga tcgacgggcc cgtcgactgc agag 2444
<210> 19
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVD-PGK-miH12-451
<400> 19
gttgtaaaac gacggccagt gaattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt 60
ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc 120
ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 180
tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt 240
cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca 300
ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct 360
tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc 420
tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa 480
agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acccggatcc 540
cccgggctgc aggaattcga gctcggtacc tcgcgaatgc atctagatat cggcgctatg 600
cttcctgtgc ccccagtggg gccctggctg ggatttcatc atatactgta agtttgcgat 660
gagacactac agtatagatg atgtactagt ccgggcaccc ccagctctgg agcctgacaa 720
ggaggacagg agagatgctg caagcccaag aagctctctg ctcagcctgt cacaacctac 780
tgactgccag ggcacttggg aatggcaagg aaggacttga gggactcgaa gacgagtccc 840
tcaagtcctc tcttgctata cccagaaaac gtgccaggaa gagaactcag gaccctgaag 900
cagactactg gaagggagac tccagctcaa acaaggcagg ggtgggggcg tgggattggg 960
ggtaggggag ggaatagata cattttctct ttcctgttgt aaagaaataa agataagcca 1020
ggcacagtgg ctcacgcctg taatcccacc actttcagag gccaaggcgc tggatccaga 1080
tctcgagcgg ccgcccgtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg 1140
aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcaagatcg 1200
acgggcccgt cgactgcaga ggcc 1224
<210> 20
<211> 272
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scaffold pri-miH12-155
<400> 20
gcuaagcacu ucguggccgu cgaucguuua aagggaggua gugagucgac caguggaucc 60
uggaggcuug cugaaggcug uaugcugaag gacuugaggg acucgaaggu uuuggccacu 120
gacugaccuu cgagucucaa guccuucagg acacaaggcc uguuacuagc acucacaugg 180
aacaaauggc ccagaucugg ccgcacucga gauaucuaga cccagcuuuc uuguacaaag 240
ugguugaucu agagggcccg cgguucgcug au 272
<210> 21
<211> 605
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scaffold pri-miH12-451
<400> 21
gcuccugggc aacgugcugg uuauugugcu gucucaucau uuuggcaaag aauuaagggc 60
gaauucgagc ucgguaccuc gcgaaugcau cuagauaucg gcgcuaugcu uccugugccc 120
ccaguggggc ccuggcuggg auuucaucau auacuguaag uuugcgauga gacacuacag 180
uauagaugau guacuagucc gggcaccccc agcucuggag ccugacaagg aggacaggag 240
agaugcugca agcccaagaa gcucucugcu cagccuguca caaccuacug acugccaggg 300
cacuugggaa uggcaaggaa ggacuugagg gacucgaaga cgagucccuc aaguccucuc 360
uugcuauacc cagaaaacgu gccaggaaga gaacucagga cccugaagca gacuacugga 420
agggagacuc cagcucaaac aaggcagggg ugggggcgug ggauuggggg uaggggaggg 480
aauagauaca uuuucucuuu ccuguuguaa agaaauaaag auaagccagg cacaguggcu 540
cacgccugua aucccaccac uuucagaggc caaggcgcug gauccagauc ucgagcggcc 600
gcccg 605
<210> 22
<211> 819
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scaffold pri-miH12-451
<400> 22
agucucgugc agauggacag caccgcugag caauggaagc ggguaggccu uuggggcagc 60
ggccaauagc agcuuugcuc cuucgcuuuc ugggcucaga ggcugggaag gggugggucc 120
gggggcgggc ucaggggcgg gcucaggggc ggggcgggcg cccgaagguc cuccggaggc 180
ccggcauucu gcacgcuuca aaagcgcacg ucugccgcgc uguucuccuc uuccucaucu 240
ccgggccuuu cgacccggau cccccgggcu gcaggaauuc gagcucggua ccucgcgaau 300
gcaucuagau aucggcgcua ugcuuccugu gcccccagug gggcccuggc ugggauuuca 360
ucauauacug uaaguuugcg augagacacu acaguauaga ugauguacua guccgggcac 420
ccccagcucu ggagccugac aaggaggaca ggagagaugc ugcaagccca agaagcucuc 480
ugcucagccu gucacaaccu acugacugcc agggcacuug ggaauggcaa ggaaggacuu 540
gagggacucg aagacgaguc ccucaagucc ucucuugcua uacccagaaa acgugccagg 600
aagagaacuc aggacccuga agcagacuac uggaagggag acuccagcuc aaacaaggca 660
gggguggggg cgugggauug gggguagggg agggaauaga uacauuuucu cuuuccuguu 720
guaaagaaau aaagauaagc caggcacagu ggcucacgcc uguaauccca ccacuuucag 780
aggccaaggc gcuggaucca gaucucgagc ggccgcccg 819
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 23
tccaagatgg acggccgctc a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 24
ccaagatgga cggccgctca g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 25
agatggacgg ccgctcaggt t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 26
atggacggcc gctcaggttc t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 27
gacggccgct caggttctgc t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 28
cggccgctca ggttctgctt t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 29
gtgctgagcg gcgccgcgag t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 30
cgccgcgagt cggcccgagg c 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 31
accgccatgg cgaccctgga a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 32
ccgccatggc gaccctggaa a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 33
gaaggccttc gagtccctca a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 34
cttcgagtcc ctcaagtcct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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ccgccgccgc ctcctcagct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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tcagccgccg ccgcaggcac a 21
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<213> homo sapiens
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ggcacagccg ctgctgcctc a 21
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<213> homo sapiens
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gccgctgctg cctcagccgc a 21
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cggcccggct gtggctgagg a 21
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ctgtggctga ggagccgctg c 21
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<212> DNA
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tgtggctgag gagccgctgc a 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miH12_155 scaffold sequence figure 2A
<400> 44
ugcugaagga cuugagggac ucgaagguuu uggccacuga cugaccuucg agucucaagu 60
ccuucagga 69
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miH12_451a scaffold sequence figure 2A
<400> 45
cuugggaaug gcaaggaagg acuugaggga cucgaagacg agucccucaa guccucucuu 60
gcuauaccca ga 72
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<213> homo sapiens
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ggccuucgag ucccucaagu c 21
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aggccuucga gucccucaag u 21
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augaaggccu ucgagucccu c 21
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gccuucgagu cccucaagu 19
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<211> 18
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 51
ccuucgaguc ccucaagu 18
Claims (17)
- 제 1 RNA 서열 및 제 2 RNA 서열을 포함하는 이중 가닥(double stranded) RNA로,
여기서 제 1 및 제 2 RNA 서열은 실질적으로 상보적이고,
여기서 제 1 RNA 서열은 적어도 19 개 뉴클레오타이드의 서열 길이를 가지며, 서열 번호 1에 상보적이고,
여기서 제1 RNA 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 및 서열 번호 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 상기 이중 가닥 RNA는 헌팅턴 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 것인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 pre-miRNA 스캐폴드(scaffold), pri-miRNA 스캐폴드, shRNA 또는 siRNA에 포함되는 것인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 RNA 서열은 20 개 이상의 뉴클레오타이드의 서열 길이를 갖는 것인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 RNA 서열은 21 개 이상의 뉴클레오타이드의 서열 길이를 갖는 것인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 가닥 및 제 2 가닥은 서열 번호 3 및 8; 서열 번호 4 및 9; 서열 번호 5 및 10; 서열 번호 5 및 13; 서열 번호 5 및 14; 서열 번호 6 및 11; 및 서열 번호 7 및 12의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA는 miR-451a 또는 miR-155로부터 유래된 pre-miRNA 스캐폴드에 포함되는 것인, 이중 가닥 RNA.
- 제 1 항에 따른 이중 가닥 RNA를 암호화(coding)하는, 핵산.
- 제 1 항에 따른 이중 가닥 RNA를 암호화하는, 발현 카세트(cassette).
- 제 8 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 PGK 프로모터, CMV 프로모터, 신경 특이적 프로모터 또는 CBA 프로모터를 포함하는 것인, 발현 카세트.
- 제 8 항에 따른 발현 카세트를 포함하는, 유전자 치료(gene therapy)용 벡터.
- 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 치료용 벡터는 AAV 벡터인 것인, 유전자 치료 벡터.
- 제 7 항에 따른 핵산 또는 제 8 항에 따른 발현 카세트를 포함하는, 숙주 세포.
- 제 1 항에 따른 이중 가닥 RNA, 제 7 항에 따른 핵산, 제 8 항에 따른 발현 카세트 또는 제 10 항에 따른 유전자 치료용 벡터를 포함하는 헌팅턴 병 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제11항에 있어서, 상기 유전자 치료용 벡터는 혈청형(serotype) 5의 AAV 벡터인 것인, 유전자 치료용 벡터
- 삭제
- 삭제
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