[go: up one dir, main page]

RU2716422C2 - Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als) - Google Patents

Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als) Download PDF

Info

Publication number
RU2716422C2
RU2716422C2 RU2017116576A RU2017116576A RU2716422C2 RU 2716422 C2 RU2716422 C2 RU 2716422C2 RU 2017116576 A RU2017116576 A RU 2017116576A RU 2017116576 A RU2017116576 A RU 2017116576A RU 2716422 C2 RU2716422 C2 RU 2716422C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nucleotides
sod1
aav
sirna
als
Prior art date
Application number
RU2017116576A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017116576A3 (ru
RU2017116576A (ru
Inventor
Динах Вен-Йи Сах
Цзиньчжао ХОУ
Матье Э. НОННЕНМАХЕР
Пэнчэн ЧЖОУ
Маркус ХОССБАХ
Йохен Деккерт
Original Assignee
Вояджер Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вояджер Терапьютикс, Инк. filed Critical Вояджер Терапьютикс, Инк.
Publication of RU2017116576A publication Critical patent/RU2017116576A/ru
Publication of RU2017116576A3 publication Critical patent/RU2017116576A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2716422C2 publication Critical patent/RU2716422C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен векторный геном на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке млекопитающего, а также соответствующая частица, способ ингибирования экспрессии гена, фармацевтическая композиция, способ лечения бокового амиотрофического склероза и дуплекс siРНК. Изобретения могут быть использованы в медицине для расширения спектра средств борьбы с боковым амиотрофическим склерозом. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 22 табл., 18 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 62/079588, озаглавленной «Лечение бокового амиотрофического склероза (ALS) с использованием siRNA, нацеленных на SOD-1», поданной 14 ноября 2014 года, предварительной заявки на патент США № 62/211992, озаглавленной «Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (ALS)», поданной 31 августа 2015 года, предварительной заявки на патент США № 62/234466, озаглавленной «Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (ALS)», поданной 29 сентября 2015 года; причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Данная заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с названием 1011PCTSL.txt, созданного 12 ноября 2015 года, размер которого составляет 126873 байта. Информация из перечня последовательностей в электронном формате включена в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям, способам и процессам конструирования, получения, производства, применения и/или составления модулирующих полинуклеотидов, например, молекул малых интерферирующих РНК (siRNA), которые нацелены на ген супероксиддисмутазы 1 (SOD1). В контексте настоящего описания «модулирующий полинуклеотид» представляет собой любую последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, чьей функцией является модуляция (либо повышение, либо снижение) уровня или количества целевого гена, например, уровней мРНК или белка. Целенаправленное воздействие на ген SOD1 может препятствовать экспрессии гена SOD1 и продукции фермента SOD1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу siRNA, внедряют в векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV). Также раскрыты способы применения молекул siRNA для ингибирования экспрессии гена SOD1 у субъекта с нейродегенеративным заболеванием (например, боковым амиотрофическим склерозом (ALS)).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Боковой амиотрофический склероз (ALS), также известный как болезнь Лу Герига, является наиболее губительным прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся преобладающей потерей двигательных нейронов (MN) в первичной двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Потеря двигательных нейронов подавляет основные, фундаментальные движения, такие как дыхание, и, как правило, вызывает смерть пациентов в течение 2~5 лет после постановки диагноза. Прогрессирующее ухудшение двигательной функции у пациентов тяжело нарушает их способность к дыханию, требуя некоторых видов вспомогательных устройств для дыхания для выживания пациентов. Другие симптомы также включают мышечную слабость в кистях рук, руках, ногах или глотательных мышцах. У некоторых пациентов (например, с FTD-ALS) также может развиваться лобно-височная деменция.
Согласно данным Ассоциации по борьбе с ALS в Соединенных Штатах Америки каждый год ALS диагностируют примерно у 5600 людей. Заболеваемость ALS составляет два случая на 100000 людей, и оценивается, что примерно 30000 американцев могут иметь данное заболевание в любой момент времени.
Было описано две формы ALS: одна представляет собой спорадический ALS (sALS), который является наиболее распространенной формой ALS в Соединенных Штатах Америки, и на его долю приходится 90-95% от общего числа диагностированных случаев; другая представляют собой семейный ALS (fALS), который встречается в ряду поколений в семьях с преимущественно доминантным наследованием, и на его долю приходится лишь приблизительно 5-10% от всех случаев в Соединенных Штатах Америки. sALS и fALS являются клинически неразличимыми.
Исследования патологии выявили, что после дебюта заболевания возникает нарушение некоторых клеточных процессов, включающее повышенный ER-стресс, образование свободных радикалов (т.е. активных форм кислорода (ROS)), митохондриальную дисфункцию, агрегацию белков, апоптоз, воспаление и эксайтотоксичность глутамата, особенно в двигательных нейронах (MN).
Причины ALS сложны и различны. В целом, ALS считается сложным генетическим нарушением, при котором несколько генов в сочетании с воздействиями окружающей среды объединяются, делая личность чувствительной. Было обнаружено более дюжины генов, связанных с ALS, в том числе, SOD-1 (Cu2+/Zn2+ супероксиддисмутаза), TDP-43 (TARDBP, TAR-ДНК-связывающий белок-43), FUS (подвергающийся слиянию при саркоме/подвергающийся транслокации при саркоме), ANG (ангиогенин), ATXN2 (атаксин-2), валозин-содержащий белок (VCP), OPTN (оптиневрин) и распространение некодирующего гексануклеотидного повтора GGGGCC в открытой рамке считывания 72 в хромосоме 9 (C9ORF72). Тем не менее, точные механизмы дегенерации двигательных нейронов все еще являются неясными.
В настоящее время не существует радикального лечения для ALS. Единственным одобренным FDA лекарственным средством является рилузол, который противодействует реакции на глутамат, снижая патологическое развитие ALS. Тем не менее, сообщалось о продлении жизни лишь приблизительно на три месяца для пациентов с ALS на ранних стадиях, и не наблюдалось терапевтической пользы для пациентов с ALS на поздних стадиях, что указывает на недостаток возможных методов лечения для пациентов (Bensimon G et al., J Neurol. 2002, 249, 609-615). Таким образом, все еще востребована новая стратегия лечения, которая может эффективно предупреждать развитие заболевания.
Изучаются много разных стратегий для возможного лечения как спорадического, так и семейного ALS. Одна стратегия основывается на нейропротекторном и/или регенеративном эффекте нейротрофических факторов, таких как инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), коливелин и пептид, полученный из зависимого от активности нейротрофического фактора (ADNF), которые могут способствовать выживанию нейронов. Несколько исследований продемонстрировали, что нейротрофические факторы могут сохранять функциональность двигательных нейронов, тем самым улучшая двигательную активность у трансгенных по SOD1 мышей. Тем не менее, такое лечение часто оказывается неспособно продлить жизнь SOD1 мышей, что указывает на то, что нейротрофические факторы являются недостаточными для продления срока жизни нейронов (см. обзор за авторством Yacila and Sari, Curr Med Chem., 2014, 21(31), 3583-3593).
Другая стратегия для лечения ALS фокусировалась на терапии, основанной на стволовых клетках. Стволовые клетки имеют потенциал к образованию двигательных нейронов, тем самым заменяя дегенерирующие двигательные нейроны в пораженной ALS ЦНС (центральная нервная система), как например, в первичной двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Исследовались стволовые клетки, полученные из многих источников, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), мезенхимальные стромальные клетки (MSC) (например, мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (BMSC) и адипозные стволовые клетки (ASC)) и нервные стволовые клетки, происходящие из нервной ткани (например, фетальные спинномозговые нервные стволовые клетки (NSC), мультипотентные нервные клетки-предшественники (NPC)) (например, рассматриваемые в обзоре за авторством Kim C et al., Exp. Neurobiol., 2014, 23(3), 207-214).
Мутации в гене супероксиддисмутазы типа I (SOD1; Cu2+/Zn2+ супероксиддисмутаза типа I) являются наиболее распространенной причиной fALS, лежащей в основе приблизительно 20-30% всех случаев fALS. Недавние сообщения указывают на то, что мутации SOD1 также могут быть связаны приблизительно с 4% всех случаев sALS (Robberecht and Philip, Nat. Rev. Neurosci., 2013, 14, 248-264). Связанный с SOD1 fALS наиболее вероятно вызывается не потерей нормальной активности SOD1, а скорее приобретением токсической функции. Одна из гипотез для связанной с мутантным SOD1 токсичности при fALS предполагает, что аберрантный фермент SOD1 является причиной образования повреждающих свободных радикалов из малых молекул, таких как пероксинитрит или перекись водорода. Другие гипотезы для нейротоксичности мутантной SOD1 включают подавление активности протеасомы, повреждение митохондрий, нарушение процессинга РНК и образование внутриклеточных агрегатов. Аномальное накопление мутантных вариантов SOD1 и/или SOD1 дикого типа при ALS приводит к образованию нерастворимых фибриллярных агрегатов, которые идентифицируют как патологические включения. Агрегированный белок SOD1 может индуцировать митохондриальный стресс (Vehvilainen P et al., Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126) и оказывать другие токсические эффекты в отношении клеток, в особенности, в отношении двигательных нейронов.
Эти данные указывают на то, что SOD1 может быть потенциальной терапевтической мишенью как в случае семейного, так и спорадического ALS. Терапия, которая может снизить количество белка SOD1, образующегося в центральной нервной системе пациентов с ALS, может ослабить симптомы ALS у пациентов, такие как дегенерация двигательных нейронов, а также мышечная слабость и атрофия. Средства и способы, целью которых является предупреждение образования агрегатов белка SOD1 дикого типа и/или мутантного белка SOD1, могут предупреждать развитие заболевания и обеспечивать ослабление симптомов ALS. Опосредованный РНК-интерференцией (RNAi) сайленсинг гена в последние годы привлек интерес исследователей. Молекулы малых двухцепочечных РНК (малых интерферирующих РНК), которые нацелены на ген SOD1, упоминались в уровне техники в отношении их потенциала в лечении ALS (см., например, патент США № 7632938 и публикацию патента США № 20060229268, содержание которых включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Настоящим изобретением разработан подход на основе РНК-интерференции к ингибированию или предотвращению экспрессии SOD1 у пациентов с ALS для лечения заболевания.
Настоящим изобретением предусматриваются новые двухцепочечные РНК (dsRNA) конструкции и siRNA конструкции и способы их конструирования. Кроме того, эти новые siRNA конструкции могут представлять собой синтетические молекулы или могут быть закодированы в векторе экспрессии (одной или обеих цепях) для доставки в клетки. Такие векторы включают, без ограничения, векторы на основе аденоассоциированного вируса, такие как векторные геномы любого из серотипов AAV или другие средства доставки на основе вирусов, такие как лентивирус и т.д.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к опосредованному молекулой РНК ген-специфическому препятствованию экспрессии гена и продукции белка. Способы лечения заболеваний, связанных с дегенерацией двигательных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз, также включены в настоящее изобретение. siRNA, включенные в композиции, охарактеризованные в данном документе, охватывают dsRNA, имеющую антисмысловую цепь (определенную антисмысловую цепь) с участком, имеющим длину 30 нуклеотидов или менее, обычно 19-24 нуклеотидов, который практически комплементарен по меньшей мере части мРНК транскрипта гена SOD1.
Настоящим изобретением предусматриваются молекулы коротких двухцепочечных РНК, такие как дуплексы малых интерферирующих РНК (siRNA), которые целенаправленно воздействуют на мРНК SOD1, препятствуя экспрессии гена SOD1 и/или продукции белка SOD1. Дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут препятствовать обоим аллелям гена SOD1 независимо от какой бы то ни было конкретной мутации в гене SOD1 и, в частности, могут взаимодействовать с генами SOD1, обнаруживающимися при заболевании ALS.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие молекулы siRNA или одну цепь молекул siRNA внедряют в векторы на основе аденоассоциированного вируса, подлежащие введению в клетки, в частности, двигательные нейроны и/или другие окружающие клетки в центральной нервной системе.
Дуплекс siRNA согласно настоящему изобретению содержит антисмысловую цепь и смысловую цепь, гибридизированные друг с другом с образованием дуплексной структуры, в которой антисмысловая цепь комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1, и в которой смысловая цепь гомологична последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1. В некоторых аспектах 5ʹ-конец антисмысловой цепи имеет 5ʹ-фосфатную группу, и 3ʹ-конец смысловой цепи содержит 3ʹ-гидроксильную группу. В других аспектах на 3ʹ-конце каждой цепи не присутствуют выступающие концы или присутствуют выступающие концы из одного или 2 нуклеотидов.
Согласно настоящему изобретению каждая цепь дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, имеет длину приблизительно 19-25 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотид, 22 нуклеотида, 23 нуклеотида, 24 нуклеотида или 25 нуклеотидов. В некоторых аспектах siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК.
В других аспектах siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификацией основания, сахара или остова.
В соответствии с одним вариантом осуществления siRNA или dsRNA включает в себя по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA включает в себя смысловую цепь, имеющую первую последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая цепь включает в себя нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части мРНК, кодирующей SOD1, и участок с комплементарностью имеет длину 30 нуклеотидов или менее и по меньшей мере 15 нуклеотидов. В целом, dsRNA имеет длину 19-24, например, 19-21 нуклеотид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов, и в соответствии с другими вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов.
dsRNA либо после контакта с клеткой, экспрессирующей SOD1, либо после транскрипции в клетке, экспрессирующей SOD1, ингибирует или подавляет экспрессию гена SOD1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, как например, при анализе с помощью способа, который описан в данном документе.
Согласно настоящему изобретению получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие дуплексы siRNA, одну цепь дуплекса siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, при этом серотип AAV-вектора может представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и/или AAV-DJ, а также их варианты.
Согласно настоящему изобретению дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из дуплексов siRNA, перечисленных в таблице 3, 11 или 13. Предпочтительно, дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из группы, состоящей из дуплексов siRNA: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.
Настоящим изобретением также предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую дуплекс siRNA, внедряют в AAV-вектор.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы ингибирования/сайленсинга экспрессии гена SOD1 в клетке. Соответственно, дуплексы siRNA или dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, в частности, в двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100%. Соответственно, белковый продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок SOD1 представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза, ассоциированного с аномальным геном SOD1 и/или белком SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении, причем способ предусматривает введение субъекту фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, доставку указанного дуплекса siRNA в подвергающиеся целенаправленному воздействию клетки, ингибирование экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 и ослабление симптомов ALS у субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, вводят субъекту, нуждающемуся в лечении и/или ослаблении ALS. Серотип AAV-вектора можно выбрать из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10 и AAV-DJ, а также их вариантов.
В некоторых аспектах ALS представляет собой семейный ALS, связанный с мутациями SOD1. В других аспектах ALS представляет собой спорадический ALS, который характеризуется аномальной агрегацией белка SOD1 или нарушением функции или локализации белка SOD1, при этом не обязательно в результате генетической мутации. Симптомы ALS, ослабляемые с помощью настоящего способа, могут включать денегерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, ригидность мышц, невнятную речь и /или затрудненное дыхание.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, или AAV-векторы, содержащие такие кодирующие siRNA молекулы, можно вводить непосредственно в центральную нервную систему субъекта, например, с помощью внутричерепной инъекции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве одиночной терапии. В соответствии с другими вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в комплексной терапии. Комплексная терапия может осуществляться в сочетании с одним или более нейропротекторными средствами, такими как соединения-малые молекулы, факторы роста и гормоны, которые были исследованы в том, что касается их нейропротекторного эффекта в отношении дегенерации двигательных нейронов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества плазмиды или AAV-вектора, описанных в данном документе. ALS может представлять собой семейный ALS или спорадический ALS.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Вышеизложенные и другие цели, признаки и преимущества будут понятны из следующего описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые иллюстрируются в сопутствующих графических материалах, в которых аналогичные условные обозначения относятся к одним и тем же частям на разных видах. Графические материалы не обязательно сведены к определенному масштабу, вместо этого акцент сделан на иллюстрацию принципов различных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 1 представляет собой гистограмму, показывающую активность конструкций, закодированных в AAV-векторе.
Фиг. 2 представляет собой гистограмму, показывающую активность направляющей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HEK293T клетках.
Фиг. 3 представляет собой гистограмму, показывающую активность сопровождающей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HEK293T клетках.
Фиг. 4 представляет собой гистограмму, показывающую активность направляющей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HeLa клетках.
Фиг. 5 представляет собой гистограмму, показывающую активность сопровождающей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HeLa клетках.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму для ДНК внутриклеточного AAV.
Фиг. 7 представляет собой гистограмму, показывающую активность конструкций, закодированных в AAV-векторе в двигательных нейронах человека.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий дозозависимый сайленсинг SOD1 в U251MG клетках.
Фиг. 9 представляет собой график, показывающий дозозависимый сайленсинг SOD1 в клетках астроцитов человека.
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий длительность сайленсинга SOD1 в U251MG клетках.
Фиг. 11 содержит фиг. 11A, 11B и 11C, которые представляют собой графики, показывающие дозозависимые эффекты конструкции. Фиг. 11A показывает относительную экспрессию SOD1. Фиг. 11B показывает процент направляющей цепи. Фиг. 11C показывает процент сопровождающей цепи.
Фиг. 12 представляет собой диаграмму, показывающую положение модулирующего полинуклеотида (MP) по отношению к ITR, интрону (I) и полиA (P).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к модулирующим полинуклеотидам, например, молекулам РНК или ДНК, в качестве терапевтических средств. Опосредованный РНК-интерференцией сайленсинг гена может специфически ингибировать экспрессию гена, подвергающегося целенаправленному воздействию. Таким образом, настоящим изобретением предусматриваются молекулы малой двухцепочечной РНК (dsRNA) (малой интерферирующей РНК, siRNA), нацеленные на ген SOD1, фармацевтические композиции, содержащие такие siRNA, а также способы их конструирования. Настоящим изобретением также предусматриваются способы их применения для ингибирования экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 для лечения нейродегенеративного заболевания, в частности, бокового амиотрофического склероза (ALS).
Настоящим изобретением предусматриваются дуплексы малых интерферирующих РНК (siRNA) (и модулирующих полинуклеотидов, кодирующих их), которые целенаправленно воздействуют на мРНК SOD1, препятствуя экспрессии гена SOD1 и/или продукции белка SOD1. Дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут препятствовать обоим аллелям гена SOD1 независимо от какой бы то ни было конкретной мутации в гене SOD1 и, в частности, могут взаимодействовать с генами SOD1, обнаруживающимися при заболевании ALS.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую такие молекулы siRNA или одну цепь молекул siRNA, внедряют в векторы на основе аденоассоциированного вируса и вводят в клетки, в частности, двигательные нейроны и/или другие окружающие клетки в центральной нервной системе.
Кодируемый дуплекс siRNA согласно настоящему изобретению содержит антисмысловую цепь и смысловую цепь, гибридизированные друг с другом с образованием дуплексной структуры, в которой антисмысловая цепь комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1, и в которой смысловая цепь гомологична последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1. В некоторых аспектах 5ʹ-конец антисмысловой цепи имеет 5ʹ-фосфатную группу, и 3ʹ-конец смысловой цепи содержит 3ʹ-гидроксильную группу. В других аспектах на 3ʹ-конце каждой цепи не присутствуют выступающие концы или присутствуют выступающие концы из одного или 2 нуклеотидов.
Согласно настоящему изобретению каждая цепь дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, имеет длину приблизительно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид, предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотид, 22 нуклеотида, 23 нуклеотида, 24 нуклеотида или 25 нуклеотидов. В некоторых аспектах siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК.
В других аспектах siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификацией основания, сахара или остова.
В соответствии с одним вариантом осуществления siRNA или dsRNA включает в себя по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA включает в себя смысловую цепь, имеющую первую последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая цепь включает в себя нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части мРНК, кодирующей SOD1, и участок с комплементарностью имеет длину 30 нуклеотидов или менее и по меньшей мере 15 нуклеотидов. В целом, dsRNA имеет длину 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов, и в соответствии с другими вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов.
dsRNA, или непосредственно введенная, или закодированная в векторе экспрессии, после контакта с клеткой, экспрессирующей SOD1, ингибирует экспрессию SOD1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, как например, при анализе с помощью способа, который описан в данном документе.
Молекулы siRNA, включенные в композиции, охарактеризованные в данном документе, содержат dsRNA, имеющую антисмысловую цепь (антисмысловая цепь) с участком, имеющим длину 30 нуклеотидов или менее, обычно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид, который практически комплементарен по меньшей мере части мРНК транскрипта гена SOD1.
В соответствии с настоящим изобретением получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты дуплексов siRNA, одну цепь дуплекса siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, причем серотипы AAV-вектора могут представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ, а также их варианты.
Согласно настоящему изобретению дуплексы siRNA или кодируемые dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из дуплексов siRNA, перечисленных в таблице 3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из группы, состоящей из дуплексов siRNA: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.
Настоящим изобретением также предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах дуплекс siRNA кодируется AAV-вектором.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы ингибирования/сайленсинга экспрессии гена SOD1 в клетке. Соответственно, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, в частности, в двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, как например, по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Соответственно, белок-продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок SOD1 представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии белка SOD1 по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. В качестве неограничивающего примера экспрессия белка SOD1 может быть снижена на 50-90%.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии мРНК SOD1 по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. В качестве неограничивающего примера экспрессия мРНК SOD1 может быть снижена на 50-90%.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии белка и/или мРНК SOD1 по меньшей мере в одной области ЦНС, такой как, без ограничения, спинной мозг, передний мозг, средний мозг или задний мозг. Экспрессия белка и/или мРНК SOD1 снижается по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100% по меньшей мере в одной области ЦНС. В качестве неограничивающего примера экспрессия белка и мРНК SOD1 в спинном мозге может быть снижена на 50-90%.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза, ассоциированного с аномальным геном SOD1 и/или белком SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении, причем способ предусматривает введение субъекту фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного дуплекса siRNA или нуклеиновой кислоты, кодирующей дуплекс siRNA, нацеленных на ген SOD1, доставку указанного дуплекса (или кодируемого дуплекса) siRNA в подвергающиеся целенаправленному воздействию клетки, ингибирование экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 и ослабление симптомов ALS у субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, вводят субъекту, нуждающемуся в лечении и/или ослаблении ALS. Серотип AAV-вектора можно выбрать из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 (AAVDJ8) и AAV-DJ (AAVDJ), а также их вариантов. В соответствии с одним вариантом осуществления серотип AAV-вектора представляет собой AAV2. В соответствии с другим вариантом осуществления AAV-вектор представляет собой AAVDJ. В соответствии с еще одним вариантом осуществления серотип AAV-вектора представляет собой AAVDJ8.
В соответствии с одним вариантом осуществления серотип, который может быть пригодным в настоящем изобретении, может представлять собой AAV-DJ8. Аминокислотная последовательность AAV-DJ8 может содержать две или более мутации с целью удаления гепарин-связывающего домена (HBD). В качестве неограничивающего примера последовательность AAV-DJ, описанная как SEQ ID NO: 1 в патенте США № 7588772, содержание которого включено в данный документ в его полноте посредством ссылки, могут содержать две мутации: (1) R587Q, где аргинин (R; arg) в положении аминокислоты 587 заменен на глутамин (Q; Gln), и (2) R590T, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 590 заменен на треонин (T; Thr). В качестве другого неограничивающего примера может содержать три мутации: (1) K406R, где лизин (K; Lys) в положении аминокислоты 406 заменен на аргинин (R; Arg), (2) R587Q, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 587 заменен на глутамин (Q; Gln), и (3) R590T, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 590 заменен на треонин (T; Thr).
В некоторых аспектах ALS представляет собой семейный ALS, связанный с мутациями SOD1. В других аспектах ALS представляет собой спорадический ALS, который характеризуется аномальной агрегацией белка SOD1 или отклонением в функционировании и локализации белка SOD1. Симптомы ALS, ослабляемые с помощью настоящего способа, могут включать, без ограничения, денегерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, ригидность мышц, невнятную речь и /или затрудненное дыхание.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA, нацеленные на ген SOD1, или AAV-векторы, содержащие такие молекулы siRNA, можно вводить непосредственно в центральную нервную систему субъекта, например, с помощью внутричерепной инъекции.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве одиночной терапии. В соответствии с другими вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в комплексной терапии. Комплексная терапия может осуществляться в сочетании с одним или более нейропротекторными средствами, такими как соединения-малые молекулы, факторы роста и гормоны, которые были исследованы в том, что касается их нейропротекторного эффекта в отношении дегенерации двигательных нейронов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества плазмиды или AAV-вектора, описанных в данном документе. ALS может представлять собой семейный ALS или спорадический ALS.
Подробности одного один или более вариантов осуществления настоящего изобретения изложены в сопутствующем описании ниже. Несмотря на то что любые материалы и способы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, можно применять на практике или при исследовании настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные материалы и способы. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны из описания. В описании формы единственного числа также включают множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. В случае конфликта настоящее описание будет иметь преимущество.
Боковой амиотрофический склероз (ALS)
Боковой амиотрофический склероз (ALS), нейродегенеративное нарушение, проявляющееся во взрослом возрасте, представляет собой прогрессирующее и смертельное заболевание, характеризующееся избирательной гибелью двигательных нейронов в двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Заболеваемость ALS составляет приблизительно 1,9 на 100000. У пациентов, которым был поставлен диагноз ALS, развивается прогрессирующий мышечный фенотип, характеризующийся спастичностью, гиперрефлексией или гипорефлексией, фасцикуляциями, мышечной атрофией и параличем. Эти нарушения двигательных функций вызваны денервацией мышц вследствие потери двигательных нейронов. Основные признаки патологии ALS включают дегенерацию корково-спинномозговых путей и значительную потерю периферических двигательных нейронов (LMN) или клеток передних рогов спинного мозга (Ghatak et al., J Neuropathol Exp Neurol., 1986, 45, 385-395), дегенерацию и потерю клеток Беца и других пирамидальных клеток в первичной двигательной коре (Udaka et al., Acta Neuropathol, 1986, 70, 289-295; Maekawa et al., Brain, 2004, 127, 1237-1251) и реактивный глиоз в двигательной коре и спинном мозге (Kawamata et al., Am J Pathol., 1992, 140,691-707; и Schiffer et al., J Neurol Sci., 1996, 139, 27-33). ALS обычно приводит к смертельному исходу в течение 3-5 лет после диагностирования вследствие дефектов дыхания и/или воспаления (Rowland LP and Shneibder NA, N Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700).
Отличительным признаком ALS на клеточном уровне является присутствие белковых убиквитинированных цитоплазматических включений в дегенерирующих двигательных нейронах и окружающих клетках (например, астроцитах). Убиквитинированные включения (т.е. включения, подобные тельцам Леви, или клубкообразные включения) являются наиболее распространенным и специфическим типом включений при ALS и обнаруживаются в LMN спинного мозга и ствола головного мозга, а также в корково-спинномозговых центральных двигательных нейронах (UMN) (Matsumoto et al., J Neurol Sci., 1993, 115, 208-213; и Sasak and Maruyama, Acta Neuropathol., 1994, 87, 578-585). Несколько белков были идентифицированы как компоненты включений, в том числе убиквитин, Cu/Zn супероксиддисмутаза 1 (SOD1), периферин и дорфин. Нейрофиламентные включения часто обнаруживаются во включениях в виде гиалиновых конгломератов (HCI) и аксональных «сфероидах» в двигательных нейронах спинного мозга при ALS. Другие типы и менее специфические включения включают тельца Бунина (цистатин C-содержащие включения) и серповидные включения (SCI) в верхних слоях коры головного мозга. Другие невропатологические признаки, наблюдаемые при ALS, включают фрагментацию аппарата Гольджи, вакуолизацию митохондрий и аномалии ультраструктуры синаптических окончаний (Fujita et al., Acta Neuropathol. 2002, 103, 243-247).
Кроме того, при ALS с лобно-височной деменцией (FTD-ALS) также наблюдается атрофия коры головного мозга (включающая лобные и височные доли), которая может вызвать нарушение когнитивных функций у пациентов с FTD-ALS.
ALS является сложным и многофакторным заболеванием, и несколько гипотетических механизмов, ответственных за патогенез ALS, включают, без ограничения, дисфункцию разрушения белка, эксайтотоксичность глутамата, митохондриальную дисфунцию, апоптоз, окислительный стресс, воспаление, неправильное сворачивание и агрегацию белков, аберрантный метаболизм РНК и измененную экспрессию генов.
Приблизительно 10-15% случаев ALS имеют семейный анамнез заболевания, и этих пациентов называют пациентами с семейным ALS (fALS) или пациентами с наследственным ALS, обычно с доминантным типом менделевского наследования и высокой пенетрантностью. Остальную часть (примерно 85%-95%) классифицируют как спорадический ALS (sALS), поскольку они не связаны с документально подтвержденным семейным анамнезом, а скорее, как полагают, обусловлены другими факторами риска, включающими, без ограничения, факторы окружающей среды, генетические полиморфизмы, соматические мутации и, возможно, взаимодействия генов и окружающей среды. В большинстве случаев семейный (или наследственный) ALS наследуется как аутосомно-доминантное заболевание, но существуют генеалогические схемы с аутосомно-рецессивным и X-сцепленным наследованием, а также неполной пенетрантностью. Спорадическая и семейная формы являются клинически неразличимыми, что говорит об общем патогенезе. Точная причина избирательной гибели двигательных нейронов при ALS остается неясной. Прогресс в понимании генетических факторов при fALS может пролить свет на обе формы заболевания.
В последнее время бурное развитие изучения генетических причин ALS обнаружило мутации в более чем 10 разных генах, которые, как стало известно, вызывают fALS. Наиболее часто встречающиеся мутации находятся в генах, кодирующих Cu/Zn супероксиддисмутазу 1 (SOD1; ~ 20%) (Rosen DR et al., Nature, 1993, 362, 59-62), белок, подвергающийся слиянию при саркоме/транслируемый в липосаркоме (FUS/TLS; 1-5%), и TDP-43 (TARDBP; 1-5%). Недавно распространение гексануклеотидного повтора (GGGGCC)n в гене C9orF72 идентифицировали как наиболее частую причину fALS (~ 40%) у населения на Западе (в обзоре за авторством Renton et al., Nat. Neurosci., 2014, 17, 17-23). Другие гены, подверженные мутации при ALS включают в себя ген алсина (ALS2), сенатаксина (SETX), везикуло-ассоциированного мембранного белка (VAPB) и ангиогенина (ANG). Задействованные в fALS гены контролируют различные клеточные механизмы, что говорит о том, что патогенез ALS является сложным и может быть связан с несколькими различными процессами, в конечном итоге приводящими к дегенерации двигательных нейронов.
SOD1 является одной из трех супероксиддисмутаз человека, идентифицированных и охарактеризованных у млекопитающих: медь-цинковая супероксиддисмутаза (Cu/ZnSOD или SOD1), марганцевая супероксиддисмутаза (MnSOD или SOD2) и внеклеточная супероксиддисмутаза (ECSOD или SOD3). SOD1 представляет собой 32 кДа гомодимер полипептида из 153 остатков с одним медь-связывающим и одним цинк-связывающим сайтом на субъединицу, который кодируется геном SOD1 (номер доступа в GeneBank: NM_000454.4) на хромосоме 21 человека (см. таблицу 2). SOD1 катализирует реакцию супероксид-аниона (O2-) в молекулярный кислород (O2) и перекись водорода (H2O2) при связанном ионе меди. Внутриклеточная концентрация SOD1 является высокой (в диапазоне от 10 до 100 мкМ), составляя 1% от общего содержания белка в центральной нервной системе (ЦНС). Белок локализуется не только в цитоплазме, но также в ядре, лизосомах, пероксисомах и межмембранных пространствах митоходрий в эукариотических клетках (Lindenau J et al., Glia, 2000, 29, 25-34).
Мутации в гене SOD1 несут 15-20% пациентов с fALS и 1-2% всех случаев ALS. К настоящему времени было обнаружено по меньшей мере 170 различных мутаций, распределенных по 153-аминокислотному полипептиду SOD1, которые вызывают ALS, и дополненный перечень можно найти в базе данных ALS online Genetic Database (ALSOD) (Wroe R et al., Amyotroph Lateral Scler., 2008, 9, 249-250). В таблице 1 приведены некоторые примеры мутаций в SOD1 при ALS. Эти мутации преимущественно представляют собой замены одной аминокислоты (т.е. миссенс-мутации), хотя также встречаются делеции, вставки и C-концевые усечения. Различные мутации SOD1 проявляют различный характер географического распределения. Например, 40-50% всех американцев с ALS, вызванным мутациями в гене SOD1, имеют конкретную мутацию Ala4Val (или A4V). Мутация A4V, как правило, ассоциирована с более тяжелыми признаками и симптомами, и период дожития, как правило, составляет 2-3 года. Мутация I113T, однозначно, является наиболее распространенной мутацией в Великобритании. Наиболее распространенной мутацией в Европе является замена D90A, и период дожития обычно составляет более 10 лет.
Таблица 1. Примеры мутаций SOD1 при ALS
Положение Мутации
Экзон 1 (220 п.о.) Q22L; E21K,G; F20C;N19S; G16A,S; V14M,S; G12R; G10G,V,R; L8Q,V; V7E; C6G,F; V5L; A4T,V,S
Экзон 2 (97 п.о.) T54R; E49K; H48R,Q; V47F,A; H46R; F45C; H43R; G41S,D; G37R; V29,insA
Экзон 3 (70 п.о.) D76Y,V; G72S,C; L67R; P66A; N65S; S59I,S
Экзон 4 (118 п.о.) D124G,V; V118L,InsAAAAC; L117V; T116T; R115G; G114A; I113T,F; I112M,T; G108V; L106V,F; S106L,delTCACTC; I104F; D101G,Y,H,N; E100G,K; I99V; V97L,M; D96N,V; A95T,V; G93S,V,A, C,R,D; D90V,A; A89T,V; T88delACTGCTGAC; V87A,M; N86I,S,D,K; G85R,S; L84V,F; H80R
Экзон 5 (461 п.о.) I151T,S; I149T; V148I,G; G147D,R; C146R, stop; A145T,G; L144F,S; G141E,stop; A140A,G; N139D,K,H,N; G138E; T137R; S134N; E133V,delGAA,insTT; E132insTT; G127R,InsTGGG; L126S,delITT,stop; D126,delTT
Для изучения механизма гибели нейронов, связанной с дефектами гена SOD1, в данной области было разработано несколько моделей ALS, связанного с SOD1, на грызунах, у которых экспрессировался человеческий ген SOD1 с различными мутациями, в том числе миссенс-мутации, небольшие делеции или вставки. Неограничивающие примеры мышиных моделей ALS включают SOD1G93A, SOD1A4V, SOD1G37R, SOD1G85R, SOD1D90A, SOD1L84V, SOD1I113T, SOD1H36R/H48Q, SOD1G127X, SOD1L126X и SOD1L126delTT. Существует две модели на основе трансгенных крыс, несущих две разные мутации SOD1 человека: SOD1H46R и SOD1G93R. В этих моделях ALS на грызунах может развиваться мышечная слабость, аналогичная таковой у пациентов-людей с ALS, а также другие патогенетические признаки, которые отражают несколько характеристик заболевания у человека, в частности, избирательная гибель двигательных нейронов спинного мозга, агрегация белковых включений в двигательных нейронах и микроглиальная активация. Из уровня техники хорошо известно, что трансгенные грызуны являются хорошими моделями ассоциированного с SOD1 заболевания ALS человека и обеспечивают модели для изучения патогенеза заболевания и разработки лечения заболевания.
Исследования в моделях на животных и клеточных моделях показали, что патогенные варианты SOD1 вызывают ALS за счет приобретения функции. Иными словами, фермент супероксиддисмутаза приобретает новые, но вредные свойства, когда он изменяется при мутациях SOD1. Например, некоторые мутантные варианты SOD1 при ALS повышают окислительный стресс (например, повышенное накопление токсичных супероксидных радикалов) за счет нарушения окислительно-восстановительного цикла. Другие исследования также указывают на то, что некоторые мутантные варианты SOD1 при ALS могут приобретать токсические свойства, которые не зависят от его нормальной физиологической функции (такие как аномальная агрегация неправильно свернутых вариантов SOD1). В модели с аберрантными окислительно-восстановительными химическими свойствами мутантная SOD1 нестабильна и вследствие аберрантных химических свойств взаимодействует с нетрадиционными субстратами, вызывая избыточную продукцию активных форм кислорода (ROS). В модели с токсичностью белка нестабильная, неправильно свернутая SOD1 агрегирует в цитоплазматические тельца включения, изолируя белки, критически важные для клеточных процессов. Эти две гипотезы не являются взаимоисключающими. Было показано, что окисление выбранных гистидиновых остатков, которые связывают металлы в активном центре, опосредует агрегацию SOD1.
Агрегированный мутантный белок SOD1 также может индуцировать митохондриальную дисфункцию (Vehvilainen P et al., Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126), нарушение аксонального транспорта, аберрантный метаболизм РНК, патологию глиальных клеток и эксайтотоксичность глутамата. В некоторых случаях спорадического ALS неправильно свернутый белок SOD1 дикого типа обнаруживается в пораженных заболеванием двигательных нейронах, образуя «токсическую конформацию», которая аналогична наблюдаемой с вариантами SOD1, связанными с семейным ALS (Rotunno MS and Bosco DA, Front Cell Neurosci., 2013, 16, 7, 253). Такие данные говорят о том, что ALS представляет собой заболевание, связанное со сворачиванием белка, которое аналогично другим нейродегенеративным заболеваниям, таким как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
В настоящее время средства для радикального лечения не доступны пациентам, страдающим от ALS. Единственное одобренное FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) лекарственное средство - рилузол, ингибитор высвобождения глутамата, оказывает умеренный эффект в отношении ALS, продлевая жизнь лишь на 2-3 месяца при его приеме в течение 18 месяцев. К сожалению, пациенты, принимающие рилузол, не испытывают какого-либо замедления прогрессирования заболевания или улучшения функционирования мышц. Следовательно, рилузол не является средством для излечения или даже эффективным средством лечения. Исследователи продолжают поиск лучших терапевтических средств.
Ранее исследовались терапевтические подходы, которые могут предупреждать или ослаблять агрегацию SOD1. Например, аримокломол, гидроксиламинное производное, представляет собой лекарственное средство, которое целенаправленно воздействует на белки теплового шока, которые представляют собой защитные механизмы клеток от этих агрегатов. Исследования продемонстрировали, что лечение аримокломолом улучшает функционирование мышц в мышиных моделях SOD1. Другие лекарственные средства, которые целенаправленно воздействуют на один или более клеточных дефектов при ALS, могут включать антагонисты AMPA, такие как талампанел, бета-лактамные антибиотики, которые могут снижать индуцируемую глутаматом эксайтотоксичность в отношении двигательных нейронов; бромокриптин, который может ингибировать индуцируемую окислением гибель двигательных нейронов (например, публикация заявки на патент США № 20110105517; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); производное 1,3-дифенилмочевины или мультикиназный ингибитор, которые могут снижать экспрессию гена SOD1 (например, публикация заявки на патент США № 20130225642; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); дофаминовый агонист прамипексол и его энантиомер декспрамипексол, которые могут ослаблять окислительный ответ в митохондриях; нимесулид, который ингибирует фермент циклооксигеназу (например, публикация заявки на патент США № 20060041022; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); лекарственные средства, которые действуют как поглотители свободных радикалов (например, патент США № 6933310 и PCT публикация патентной заявки № WO2006075434; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Другим подходом к ингибированию аномальной агрегации белка SOD1 является сайленсинг/ингибирование экспрессии гена SOD1 при ALS. Сообщалось, что малые интерферирующие РНК для специфического сайленсинга мутантного аллеля гена являются благоприятными с терапевтической точки зрения для лечения fALS (например, Ralgh GS et al., Nat. Medicine, 2005, 11(4), 429-433; и Raoul C et al., Nat. Medicine, 2005, 11(4), 423-428; и Maxwell MM et al., PNAS, 2004, 101(9), 3178-3183; и Ding H et al., Chinese Medical J., 2011, 124(1), 106-110; и Scharz DS et al., Plos Genet., 2006, 2(9), e140; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В уровне техники сообщается о многих других терапевтических средствах на основе РНК, которые целенаправленно воздействуют на ген SOD1 и модулируют экспрессию SOD1 при ALS. Такие средства на основе РНК включают антисмысловые олигонуклеотиды и двухцепочечные малые интерферирующие РНК. См., например, Wang H et al., J Biol. Chem., 2008, 283(23), 15845-15852); патенты США №№ 7498316; 7632938; 7678895; 7951784; 7977314; 8183219; 8309533 и 8586554; и публикации заявок на патент США № 2006/0229268 и № 2011/0263680; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Настоящим изобретением предусматриваются модулирующие полинуклеотиды, например, молекулы siRNA, нацеленные на ген SOD1, и способы их конструирования и производства. В частности, в настоящем изобретении используются вирусные векторы, такие как векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут повышать доставку активных средств в двигательные нейроны. Дуплексы siRNA или кодирующие dsRNA, нацеленные на ген SOD1, могут быть способны значительно ингибировать экспрессию гена SOD1 (например, уровень мРНК) внутри клеток; тем самым ослабляя индуцируемый экспрессией SOD1 стресс внутри клеток, такой как агрегация белка и образование включений, повышенный уровень свободных радикалов, митохондриальная дисфункция и метаболизм РНК.
Такое опосредованное siRNA ингибирование экспрессии SOD1 можно использовать для лечения ALS. Согласно настоящему изобретению способы лечения и/или ослабления ALS у пациента предусматривают введение пациенту в клетки эффективного количества AAV-вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. После введения AAV-вектора, содержащего такую последовательность нуклеиновой кислоты, эта последовательность будет кодировать молекулы siRNA, которые вызывают ингибирование/сайленсинг экспрессии гена SOD1.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV, кодирующий модулирующий полинуклеотид, снижают экспрессию мутантной SOD1 у субъекта. Снижение уровня мутантной SOD1 также может снижать образование токсичных агрегатов, которые могут являться причиной механизмов токсичности, таких как, без ограничения, окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, нарушенный аксональный транспорт, аберрантный метаболизм РНК, патология глиальных клеток и/или эксайтотоксичность глутамата.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-векторы, снижают количество SOD1 у субъекта, нуждающегося в этом, и, следовательно, обеспечивает терапевтическую полезность, как описано в данном документе.
Композиции согласно настоящему изобретению
Молекулы siRNA
Настоящее изобретение относится к индуцируемому РНК-интерференцией (RNAi) ингибированию экспрессии гена для лечения нейродегенеративных нарушений. В данном документе представлены дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, которые нацелены на ген SOD1 (собирательно называются в данном документе «молекулами siRNA»). Такие дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA могут снижать или подвергать саленсингу экспрессию гена SOD1 в клетках, например, двигательных нейронах, тем самым ослабляя симптомы ALS, такие как, без ограничения, гибель двигательных нейронов и мышечная атрофия.
RNAi (также известная как посттранскрипционный сайленсинг гена (PTGS), подавление или косупрессия) представляет собой процесс посттранскрипционного сайленсинга гена, при котором молекулы РНК специфическим в отношении последовательности образом ингибируют экспрессию гена, как правило, вызывая разрушение специфических молекул мРНК. Активные компоненты RNAi представляют собой короткие/малые двухцепочечные РНК (dsRNA), называемые малыми интерферирующими РНК (siRNA), которые, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов (например, 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид) и 3ʹ выступающие концы из 2 нуклеотидов и которые совпадают с последовательностью нуклеиновой кислоты целевого гена. Эти короткие молекулы РНК могут продуцироваться в естественных условиях in vivo путем опосредованного Dicer расщепления больших dsRNA, и они являются функциональными в клетках млекопитающих.
Экспрессируемые в естественных условиях молекулы малых РНК, называемые микроРНК (miRNA), вызывают сайленсинг гена посредством регуляции экспрессии мРНК. miRNA, содержащие РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), целенаправленно воздействуют на мРНК, у которых присутствует полная комплементарность последовательности с нуклеотидами 2-7 в 5ʹ-участке miRNA, который называется затравочным участком, и которые образуют другие пары оснований с ее 3ʹ-участком. Опосредованная miRNA понижающая регуляция экспрессии гена может быть вызвана расщеплением целевых мРНК, ингибированием трансляции целевых мРНК или разрушением мРНК. Последовательности, подвергающиеся целенаправленному воздействию miRNA, обычно расположены в 3ʹ-UTR целевых мРНК. Одна miRNA может целенаправленно воздействовать более чем на 100 транскриптов с различных генов, и одна мРНК может подвергаться целенаправленному воздействию различных miRNA.
Дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на конкретную мРНК, можно сконструировать, синтезировать in vitro и вводить в клетки для активации процессов RNAi. Elbashir et al. продемонстрировали, что 21-нуклеотидные дуплексы siRNA (называемые малыми интерферирующими РНК) были способны обеспечивать сильный и специфический нокдаун гена без индукции иммунного ответа в клетках млекопитающих (Elbashir SM et al., Nature, 2001, 411, 494-498). Со времени того первоначального сообщения посттранскрипционный сайленсинг гена с помощью siRNA быстро стал мощным инструментом для генетического анализа в клетках млекопитающих, и у него есть потенциал для получения новых терапевтических средств.
Синтезированные in vitro молекулы siRNA можно вводить в клетки с целью активации RNAi. Экзогенный дуплекс siRNA при введении его в клетки подобно эндогенным dsRNA может собираться с образованием РНК-индуцированного комплекса сайленсинга (RISC), комплекса из нескольких единиц, который облегчает поиск в геноме последовательностей РНК, которые комплементарны одной из двух цепей дуплекса siRNA (т.е. антисмысловой цепи). В ходе процесса смысловая цепь (или сопровождающая цепь) siRNA уходит из комплекса, тогда как антисмысловая цепь (или направляющая цепь) siRNA спаривается с комплементарной ей РНК. В частности, мишенями содержащего siRNA комплекса RISC являются мРНК, у которых присутствует полная комплементарность последовательности. Затем происходит опосредованный siRNA сайленсинг гена, заключающийся в расщеплении, разъединении и разрушении мишени.
Дуплекс siRNA, состоящий из смысловой цепи, гомологичной целевой мРНК, и антисмысловой цепи, которая комплементарна целевой мРНК, обеспечивает намного большее преимущество с точки зрения эффективности разрушения целевой РНК по сравнению с применением одноцепоченых (ss)-siRNA (например, антисмысловая цепь РНК или антисмысловые олигонуклеотиды). Во многих случаях требуются более высокая концентрация ss-siRNA для достижения эффективной действенности сайленсинга гена соответствующего дуплекса.
Любая из вышеупомянутых молекул может кодироваться AAV-вектором или векторным геномом.
Конструирование и последовательности дуплексов siRNA, нацеленных на ген SOD1
В уровне техники были предложены некоторые указания по конструированию siRNA. Эти указания обычно рекомендуют создание 19-нуклеотидного дуплексного участка, симметричных 3ʹ выступающих концов из 2-3 нуклеотидов, 5-фосфатной и 3-гидроксильной групп, нацеленных на участок в гене, подлежащем сайленсингу. Другие правила, которые могут обуславливать преимущество последовательности siRNA, включают, без ограничения, (i) A/U на 5′-конце антисмысловой цепи; (ii) G/C на 5′-конце смысловой цепи; (iii) по меньшей мере пять A/U остатков в 5′-концевой трети антисмысловой цепи и (iv) отсутствие какого-либо GC отрезка длиной более 9 нуклеотидов. Руководствуясь такими принципами, а также специфической последовательностью целевого гена, можно легко сконструировать высокоэффективные молекулы siRNA, необходимые для подавления экспрессии целевого гена у млекопитающих.
Согласно настоящему изобретению молекулы siRNA (например, дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA), которые нацелены на ген SOD1 человека, являются сконструированными. Такие молекулы siRNA могут специфически подавлять экспрессию гена SOD1 и продукцию белка SOD1. В некоторых аспектах молекулы siRNA конструируют и применяют для избирательного «нокаута» вариантов гена SOD1 в клетках, т.е. мутантных транскриптов SOD1, которые идентифицируют у пациентов с заболеванием ALS (например, мутации в таблице 1). В некоторых аспектах молекулы siRNA конструируют и применяют для избирательного «нокдауна» вариантов гена SOD1 в клетках. В других аспектах молекулы siRNA способны ингибировать или подавлять как аллель дикого типа, так и мутантные аллели гена SOD1 независимо от каких-либо конкретных мутаций в гене SOD1.
В соответствии с одним вариантом осуществления молекула siRNA согласно настоящему изобретению содержит смысловую цепь и комплементарную антисмысловую цепь, причем обе цепи гибридизированы друг с другом с образованием дуплексной структуры. Антисмысловая цепь характеризуется достаточной комплементарностью с последовательностью мРНК SOD1 для непосредственной мишень-специфической RNAi, т.е. молекула siRNA имеет последовательность, достаточную для запуска разрушения целевой мРНК с помощью аппарата или процесса RNAi.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательности антисмысловой цепи и целевой мРНК комплементарны на 100%. Антисмысловая цепь может быть комплементарна любой части последовательности целевой мРНК.
В соответствии с другими вариантами осуществления последовательности антисмысловой цепи и целевой мРНК содержат по меньшей мере одно несовпадение. В качестве неограничивающего примера, последовательность антисмысловой цепи и целевой мРНК комплементарны по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-99%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-99%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-99%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-99%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-99%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-99%, 80-90%, 80-95%, 80-99%, 90-95%, 90-99% или 95-99%.
Согласно настоящему изобретению молекула siRNA имеет длину приблизительно 10-50 или более нуклеотидов, т.е. каждая цепь содержит 10-50 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов). Предпочтительно, молекула siRNA имеет длину приблизительно 15-30, например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в каждой цепи, где одна из цепей является в значительной степени комплементарной целевому участку. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула siRNA имеет длину приблизительно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению могут представлять собой дуплексы синтетических РНК, содержащие от приблизительно 19 нуклеотидов до приблизительно 25 нуклеотидов и два нуклеотида в виде выступающего конца на 3'-конце. В некоторых аспектах молекулы siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК. В других аспектах молекулы siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификациями основания, сахара или остова.
В соответствии с другими вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению могут быть закодированы в плазмидных векторах, вирусных векторах (например, AAV-векторах), векторах экспрессии на основе генома или другой нуклеиновой кислоты для доставки в клетку.
Экспрессионные плазмиды на основе ДНК можно применять для устойчивой экспрессии дуплексов siRNA или dsRNA согласно настоящему изобретению в клетках, а также для достижения длительного ингибирования целевого гена. В одном аспекте смысловая и антисмысловая цепи дуплекса siRNA, как правило, связаны короткой спейсерной последовательностью, приводящей к экспрессии структуры по типу стебель-петля, называемой короткой шпилечной РНК (shRNA). Шпилька распознается и расщепляется Dicer с образованием таким образом зрелых молекул siRNA.
Согласно настоящему изобретению получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы siRNA, нацеленные на мРНК SOD1, причем серотипы AAV-вектора могут представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ, а также их варианты.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA согласно настоящему изобретению подавляют (или разрушают) целевую мРНК (т.е. SOD1). Соответственно, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, например, двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Соответственно, белок-продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.
Согласно настоящему изобретению, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, конструировали и исследовали в отношении их способности к снижению уровней мРНК SOD1 в культивируемых клетках. Такие дуплексы siRNA включают приведенные в таблице 3. В качестве неограничивающего примера, дуплексы siRNA могут представлять собой дуплекс siRNA с идентификационными номерами (ID): D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.
В соответствии с одним вариантом осуществления 3ʹ-ветвь стебля дуплексов siRNA или кодируемой dsRNA, нацеленных на ген SOD1 человека, может иметь 11 нуклеотидов ниже 3ʹ-конца направляющей цепи, которые комплементарны 11 из 13 нуклеотидов выше 5ʹ-конца сопровождающей цепи в 5ʹ-ветви стебля.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь цистеин, который находится на 6 нуклеотидов ниже 3ʹ-конца 3ʹ-ветви стебля модулирующего полинуклеотида.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, содержат затравочный сегмент miRNA для направляющей цепи. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, содержат затравочный сегмент miRNA для сопровождающей цепи. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, не содержат затравочный сегмент для направляющей цепи или сопровождающей цепи.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для сопровождающей цепи. Дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь менее 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1-5%, 2-6%, 3-7%, 4-8%, 5-9%, 5-10%, 6-10% нецелевых мишеней полной длины для сопровождающей цепи. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи или сопровождающей цепи. Дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь менее 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1-5%, 2-6%, 3-7%, 4-8%, 5-9%, 5-10%, 6-10% нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи или сопровождающей цепи.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь высокую активность in vitro. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь низкую активность in vitro. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro.
В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, имеют высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro. Нокдаун (KD) мишени направляющей цепью может составлять по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 100%. Нокдаун мишени направляющей цепью может составлять 60-65%, 60-70%, 60-75%, 60-80%, 60-85%, 60-90%, 60-95%, 60-99%, 60-99,5%, 60-100%, 65-70%, 65-75%, 65-80%, 65-85%, 65-90%, 65-95%, 65-99%, 65-99,5%, 65-100%, 70-75%, 70-80%, 70-85%, 70-90%, 70-95%, 70-99%, 70-99,5%, 70-100%, 75-80%, 75-85%, 75-90%, 75-95%, 75-99%, 75-99,5%, 75-100%, 80-85%, 80-90%, 80-95%, 80-99%, 80-99,5%, 80-100%, 85-90%, 85-95%, 85-99%, 85-99,5%, 85-100%, 90-95%, 90-99%, 90-99,5%, 90-100%, 95-99%, 95-99,5%, 95-100%, 99-99,5%, 99-100% или 99,5-100%. В качестве неограничивающего примера, нокдаун (KD) мишени направляющей цепью составляет более 70%.
В соответствии с одним вариантом осуществления IC50 для сопровождающей цепи в отношении ближайшей нецелевой мишени превышает 100-кратное значение IC50 для направляющей цепи в отношении мишени. В качестве неограничивающего примера, если IC50 для сопровождающей цепи в отношении ближайшей нецелевой мишени превышает 100-кратное значение IC50 для направляющей цепи в отношении мишени, то считается, что дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, имеют высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro.
В соответствии с одним вариантом осуществления процессинг 5ʹ-конца направляющей цепи характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% времени in vitro или in vivo. В качестве неограничивающего примера, 5ʹ-процессинг направляющей цепи является точным и характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 99% времени in vitro. В качестве неограничивающего примера, 5ʹ-процессинг направляющей цепи является точным и характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 99% времени in vivo.
В соответствии с одним вариантом осуществления соотношение экспрессируемых направляющей цепи и сопровождающей цепи (G:P) составляет 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5 или 99:1 in vitro или in vivo. В качестве неограничивающего примера, соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи составляет 80:20 in vitro. В качестве неограничивающего примера, соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи составляет 80:20 in vivo.
В соответствии с одним вариантом осуществления целостность векторного генома, кодирующего dsRNA, составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более 99% полной длины конструкции.
Модификация siRNA
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению в случае, когда их не доставляют в виде предшественника или ДНК, могут быть химически модифицированными для модуляции некоторых характеристик молекул РНК, как например, без ограничения, для повышения стабильности siRNA in vivo. Химически модифицированные молекулы siRNA можно использовать в терапевтических применениях у человека, при этом они являются улучшенными и не оказывают негативного влияния на активность RNAi молекул siRNA. В качестве неограничивающего примера, молекулы siRNA модифицированы и по 3′-, и по 5′-концу как смысловой цепи, так и антисмысловой цепи.
В некоторых аспектах дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, таких как, без ограничения, нуклеотиды с модифицированным сахаром, модификациями нуклеотидного основания и/или модификациями остова. В некоторых аспектах молекула siRNA может содержать комбинированные модификации, например, комбинированные модификации нуклеотидного основания и остова.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным сахаром. Нуклеотиды с модифицированным сахаром включают, без ограничения, 2′-фтор-, 2′-амино- и 2′-тио-модифицированные рибонуклеотиды, например, 2′-фтор-модифицированные рибонуклеотиды. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы в сахарном фрагменте, также как и нуклеотиды, имеющие сахара или их аналоги, которые не представляют собой рибозил. Например, сахарные фрагменты могут представлять собой или могут иметь в своей основе маннозы, арабинозы, глюкопиранозы, галактопиранозы, 4′-тиорибозу и другие сахара, гетероциклы или карбоциклы.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным нуклеотидным основанием.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным остовом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие модификации на остове. Нормальный «остов» в контексте настоящего описания относится к последовательностям из повторяющихся чередующихся сахара и фосфата в молекуле ДНК или РНК. Дезоксирибозные/рибозные сахара соединены как 3'-гидроксильной, так и 5'-гидроксильной группами с фосфатными группами через сложноэфирные связи, также известные как «фосфодиэфирные» связи/линкер (PO мостик). PO остовы могут быть модифицированными в виде «фосфоротиоатного остова» (PS мостик). В некоторых случаях природные фосфодиэфирные связи могут быть заменены амидными связями, но четыре атома между двумя звеньями сохраняются. Такие амидные модификации могут облегчить твердофазный синтез олигонуклеотидов и повысить термодинамическую стабильность образованного дуплекса с комплементарной последовательностью siRNA. См., например, Mesmaeker et al., Pure & Appl. Chem., 1997, 3, 437-440; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Модифицированные основания относятся к нуклеотидным основаниям, таким как, например, аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин, инозин и квеуозин, которые были модифицированы посредством замены или добавления одного или более атомов или групп. Некоторые примеры модификаций в фрагментах нуклеотидных оснований включают, без ограничения, алкилированные, галогенированные, тиолированные, аминированные, амидированные или ацетилированные основания по отдельности или в сочетании. Более конкретные примеры включают, например, 5-пропинилуридин, 5-пропинилцитидин, 6-метиладенин, 6-метилгуанин, N,N,-диметиладенин, 2-пропиладенин, 2-пропилгуанин, 2-аминоаденин, 1-метилинозин, 3-метилуридин, 5-метилцитидин, 5-метилуридин и другие нуклеотиды, имеющие модификацию в положении 5, 5-(2-амино)пропилуридин, 5-галогенцитидин, 5-галогенуридин, 4-ацетилцитидин, 1-метиладенозин, 2-метиладенозин, 3-метилцитидин, 6-метилуридин, 2-метилгуанозин, 7-метилгуанозин, 2,2-диметилгуанозин, 5-метиламиноэтилуридин, 5-метилоксиуридин, деазануклеотиды, такие как 7-деаза-аденозин, 6-азоуридин, 6-азоцитидин, 6-азотимидин, 5-метил-2-тиоуридин, другие тио-основания, такие как 2-тиоуридин, и 4-тиоуридин, и 2-тиоцитидин, дигидроуридин, псевдоуридин, квеуозин, археозин, нафтильные и замещенные нафтильные группы, любые O- и N-алкилированные пурины и пиримидины, такие как N6-метиладенозин, 5-метилкарбонилметилуридин, уридин-5-оксиуксусную кислоту, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенильные и модифицированные фенильные группы, такие как аминофенол или 2,4,6-триметоксибензол, модифицированные цитозины, которые действуют как нуклеотиды в G-зажиме, 8-замещенные аденины и гуанины, 5-замещенные урацилы и тимины, азапиримидины, карбоксигидроксиалкил-нуклеотиды, карбоксиалкиламиноалкил-нуклеотиды и алкилкарбонилалкилированные нуклеотиды.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать только на смысловой цепи.
В соответствии с другим вариантом осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать только на антисмысловой цепи.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать как в смысловой, так и в антисмысловой цепях.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления химически модифицированный нуклеотид не воздействует на способность антисмысловой цепи спариваться с последовательностью целевой мРНК, такой как последовательность мРНК SOD1.
Векторы
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA, описанные в данном документе, могут кодироваться векторами, такими как плазмиды или вирусные векторы. В соответствии с одним вариантом осуществления молекулы siRNA кодируются вирусными векторами. Вирусные векторы, могут представлять собой, без ограничения, векторы на основе герпесивируса (HSV), векторы на основе ретровируса, векторы на основе аденовируса, векторы на основе аденоассоциированного вируса, векторы на основе лентивируса и т.п. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления вирусные векторы представляют собой AAV-векторы.
Векторы на основе ретровируса
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, может кодироваться вектором на основе ретровируса (см., например, патенты США №№ 5399346; 5124263; 4650764 и 4980289; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Векторы на основе аденовируса
Аденовирусы представляют собой ДНК-вирусы эукариот, которые могут быть модифицированы для эффективной доставки нуклеиновой кислоты в ряд типов клеток in vivo и широко применялись в протоколах генной терапии, в том числе для целенаправленного воздействия на гены в нервных клетках. Различные векторы на основе дефектного по репликации аденовируса и векторы на основе минимального аденовируса были описаны для терапевтических средств на основе нуклеиновой кислоты (см., например, PCT публикации патентных заявок №№ WO199426914, WO 199502697, WO199428152, WO199412649, WO199502697 и WO199622378; содержание каждой из которых включено в своей полноте посредством ссылки). Такие векторы на основе аденовируса также можно применять для доставки молекул siRNA согласно настоящему изобретению в клетки.
Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV)
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой зависимый парвовирус (подобный другим парвовирусам), который представляет собой безоболочечный вирус с одноцепочечной ДНК, который имеет геном длиной приблизительно 5000 нуклеотидов и содержит две открытых рамки считывания, кодирующих белки, отвечающие за репликацию (Rep), и структурный белок капсида (Cap). Открытые рамки считывания фланкированы двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), которые служат в качестве точки начала репликации вирусного генома. Более того, геном AAV содержит упаковочную последовательность, обеспечивающую возможность упаковки вирусного генома в капсид AAV. AAV-вектор требует совместно действующий вирус-помощник (например, аденовирус) для того, чтобы обеспечить продуктивную инфекцию в инфицированных клетках. При отсутствии таких функций помощника вирионы AAV в основном проникают в клетки-хозяева и интегрируются в геном клеток.
AAV-векторы изучали в отношении доставки siRNA вследствие нескольких особенных признаков. Неограничивающие примеры признаков включают (i) способность к инфицированию как делящихся, так и неделящихся клеток; (ii) широкий спектр хозяев для инфицирования, в том числе клетки человека; (iii) AAV дикого типа не был ассоциирован с каким-либо заболеванием и не было показано, что он реплицируется в инфицированных клетках; (iv) отсутствие клеточно-опосредованного иммунного ответа на вектор и (v) природа, не предусматривающая интеграцию в хромосому хозяина, тем самым снижая возможность для длительной экспрессии. Более того, инфицирование AAV-векторами оказывает минимальное влияние на изменение характера экспрессии генов в клетке (Stilwell and Samulski et al., Biotechniques, 2003, 34, 148).
Как правило, AAV-векторы для доставки siRNA могут представлять собой рекомбинантные вирусные векторы, которые являются дефектными по репликации, поскольку они лишены последовательностей, кодирующих функциональные белки Rep и Cap в вирусном геноме. В некоторых случаях, у векторов на основе дефектных AAV могут отсутствовать большинство или все кодирующие последовательности, и они, по существу, содержат только одну или две последовательности ITR AAV и упаковочную последовательность.
AAV-векторы также могут содержать векторы на основе самокомплементарного AAV (scAAV). Векторы на основе scAAV содержат обе цепи ДНК, которые комплементарно соединены вместе с образованием двухцепочечной ДНК. За счет пропуска синтеза второй цепи scAAV обеспечивают возможность быстрой экспрессии в клетке.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой scAAV.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой ssAAV.
В уровне техники раскрыты способы получения и/или модификации AAV-векторов, таких как векторы на основе псевдотипированного AAV (PCT публикации патентных заявок №№ WO200028004; WO200123001; WO2004112727; WO 2005005610 и WO 2005072364, причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA, можно получить или доставить из различных серотипов AAV, в том числе, без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ. В некоторых случаях разные серотипы AAV могут быть смешаны вместе или с другими типами вирусов с получением химерных AAV-векторов.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в клетки млекопитающих.
AAV-векторы можно модифицировать для повышения эффективности доставки. Такие модифицированные AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут быть эффективно упакованы, и их можно применять для успешного инфицирования целевых клеток с высокой частотой и минимальной токсичностью.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может представлять собой вектор на основе человеческого серотипа AAV. Такой AAV-вектор человека можно получить из любого известного серотипа, например, из любого из серотипов AAV1-AAV11. В качестве неограничивающих примеров, AAV-векторы могут представлять собой векторы, содержащие полученный из AAV1 геном в полученном из AAV1 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV2 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV4 геном в полученном из AAV4 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV6 геном в полученном из AAV6 капсиде, или векторы, содержащие полученный из AAV9 геном в полученном из AAV9 капсиде.
В соответствии с другими вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты для кодирования молекул siRNA согласно настоящему изобретению, может представлять собой вектор на основе псевдотипированного гибридного или химерного AAV, который содержит последовательности и/или компоненты, происходящие по меньшей мере из двух разных серотипов AAV. Векторы на основе псевдотипированного AAV могут представлять собой векторы, содержащие геном AAV, полученный из одного серотипа AAV, и белок капсида, полученный по меньшей мере частично из отличающегося серотипа AAV. В качестве неограничивающих примеров, такие векторы на основе псевдотипированного AAV, могут представлять собой векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV1 капсиде; или векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV6 капсиде; или векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV4 капсиде или полученный из AAV2 геном в полученном из AAV9 капсиде. Подобным образом, настоящим изобретением предполагается любой вектор на основе гибридного или химерного AAV.
В соответствии с другими вариантами осуществления AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно применять для доставки молекул siRNA в центральную нервную систему (например, патент США № 6180613; содержание которого включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В некоторых аспектах AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут дополнительно содержать модифицированный капсид, включающий пептиды невирусного происхождения. В других аспектах AAV-вектор может содержать ЦНС-специфический химерный капсид для облегчения доставки кодируемых дуплексов siRNA в головной мозг и спинной мозг. Например, выравнивание нуклеотидных последовательностей кэп-структуры у вариантов AAV, проявляющих тропизм в отношении ЦНС, можно выполнить для идентификации последовательности и структуры вариабельного участка (VR).
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может кодировать молекулы siRNA, которые представляют собой полицистронные молекулы. Молекулы siRNA могут дополнительно содержать один или более линкеров между участками молекул siRNA.
В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться ниже промотора в векторе экспрессии, такого как, без ограничения, CMV, U6, CBA или CBA промотор с интроном SV40. Кроме того, кодируемая молекула siRNA также может располагаться выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии.
В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. Кроме того, кодируемая молекула siRNA может располагаться ниже промотора, такого как, без ограничения, CMV, U6, CBA или CBA промотор с интроном SV40, в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии.
В соответствии с одним вариантом осуществления, кодируемая молекула siRNA может располагаться в scAAV.
В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться в ssAAV.
В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 5ʹ-конца флип-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 3ʹ-конца флип-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 5ʹ-конца флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 3ʹ-конца флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться между 5ʹ-концом флип-ITR и 3ʹ-концом флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться между (например, посередине между 5ʹ-концом флип-ITR и 3ʹ-концом флоп-ITR или 3ʹ-концом флоп-ITR и 5ʹ-концом флип-ITR) 3ʹ-концом флип-ITR и 5ʹ-концом флип-ITR в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве еще одного неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии.
Вектор экспрессии
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор экспрессии (например, AAV-вектор) может содержать по меньшей мере один из модулирующих полинуклеотидов, содержащих по меньшей мере один из векторов экспрессии, описанных в данном документе.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор экспрессии может содержать, при перечислении от ITR к ITR в направлении от 5ʹ к 3ʹ, ITR, промотор, интрон, модулирующий полинуклеотид, полиA-последовательность и ITR.
Размер генома
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой одноцепочечный или двухцепочечный векторный геном. Размер векторного генома может быть небольшим, средним, большим или максимальным. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой небольшой одноцепочечный векторный геном. Небольшой одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 2,7 до 3,5 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4 и 3,5 т. о. В качестве неограничивающего примера, небольшой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 3,2 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой небольшой двухцепочечный векторный геном. Небольшой двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 1,3 до 1,7 т. о., как например, приблизительно 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 и 1,7 т. о. В качестве неограничивающего примера, небольшой двухцепочечный векторный геном может иметь размер 1,6 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, например, siRNA или dsRNA, может представлять собой средний одноцепочечный векторный геном. Средний одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 3,6 до 4,3 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2 и 4,3 т. о. В качестве неограничивающего примера, средний одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой средний двухцепочечный векторный геном. Средний двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 1,8 до 2,1 т. о., как например, приблизительно 1,8, 1,9, 2,0 и 2,1 т. о. В качестве неограничивающего примера, средний двухцепочечный векторный геном может иметь размер 2,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой большой одноцепочечный векторный геном. Большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 4,4 до 6,0 т. о., как например,приблизительно 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 и 6,0 т. о. В качестве неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,7 т. о. В качестве другого неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,8 т. о. В качестве еще одного неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 6,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой большой двухцепочечный векторный геном. Большой двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 2,2 до 3,0 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3,0 т. о. В качестве неограничивающего примера, большой двухцепочечный векторный геном может иметь размер 2,4 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.
Промоторы
Специалист в данной области техники может понять, что целевая клетка может требовать специфического промотора, включающего, без ограничения, промотор, который является видоспецифическим, индуцируемым, тканеспецифическим или специфическим в отношении фазы клеточного цикла; Parr et al., Nat. Med.3:1145-9 (1997); содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой промотор, считающийся эффективным для управления экспрессией модулирующего полинуклеотида.
В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой промотор, характеризующийся тропизмом в отношении клетки, подвергающейся целенаправленному воздействию.
В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой слабый промотор, который обеспечивает экспрессию полезного груза, например, модулирующего полинуклеотида, например, siRNA или dsRNA, в течение периода времени в тканях, подвергающихся целенаправленному воздействию, таких как, без ограничения, ткани нервной системы. Экспрессия может осуществляться в течение периода длительностью 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 1 неделя, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 2 недели, 15 суток, 16 суток, 17 суток, 18 суток, 19 суток, 20 суток, 3 недели, 22 суток, 23 суток, 24 суток, 25 суток, 26 суток, 27 суток, 28 суток, 29 суток, 30 суток, 31 суток, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяц, 22 месяца, 23 месяца, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 6 лет, 7 лет, 8 лет, 9 лет, 10 лет или более 10 лет. Экспрессия может может осуществляться в течение 1-5 часов, 1-12 часов, 1-2 суток, 1-5 суток, 1-2 недель, 1-3 недель, 1-4 недель, 1-2 месяцев, 1-4 месяцев, 1-6 месяцев, 2-6 месяцев, 3-6 месяцев, 3-9 месяцев, 4-8 месяцев, 6-12 месяцев, 1-2 лет, 1-5 лет, 2-5 лет, 3-6 лет, 3-8 лет, 4-8 лет или 5-10 лет. В качестве неограничивающего примера, промотор представляет собой слабый промотор для устойчивой экспрессии полезного груза в нервных тканях.
В соответствии с одним вариантом осуществления промотор может представлять собой промотор, который имеет длину менее 1 т. о. Промотор может иметь длину 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 или боле 800. Промотор может иметь длину 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 или 700-800.
В соответствии с одним вариантом осуществления промотор может представлять собой комбинацию двух или более компонентов, таких как, без ограничения, CMV и CBA. Каждый компонент может иметь длину 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 или более 800. Каждый компонент может иметь длину 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 или 700-800. В качестве неограничивающего примера, промотор представляет собой комбинацию 382-нуклеотидной энхансерной последовательности CMV и 260-нуклеотидной промоторной последовательности CBA.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Неограничивающие примеры элементов для повышения специфичности трансгена в отношении мишени и усиления экспрессии включают промоторы, эндогенные miRNA, посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), последовательности сигнала полиаденилирования (полиA) и вышележащие энхансеры (USE), энхансеры CMV и интроны.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки), такой как промоторы.
Промоторы, которые стимулируют экспрессию в большинстве тканей, включают, без ограничения, промотор 1α-субъединицы фактора элонгации (EF1α) человека, предранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотора β-актина курицы (CBA) и его производного CAG, β-глюкуронидазы (GUSB) или убиквитина C (UBC). Для ограничения экспрессии определенными типами клеток можно применять тканеспецифические экспрессионные элементы, такие как, без ограничения, промоторы, специфические в отношении нервной системы, которые можно применять для ограничения экспрессии нейронами, астроцитами или олигодендроцитами. Неограничивающий пример тканеспецифических экспрессионных элементов для нейронов включает промоторы нейрон-специфической енолазы (NSE), фактора роста тромобоцитов (PDGF), B-цепи фактора роста тромбоцитов (PDGF-β), синапсина (Syn), метил-CpG связывающего белка 2 (MeCP2), CaMKII, mGluR2, NFL, NFH, nβ2, PPE, Enk и EAAT2. Неограничивающий пример тканеспецифических экспрессионных элементов для астроцитов включает промоторы глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и EAAT2. Неограничивающий пример тканеспецифического экспрессионного элемента для олигодендроцитов включает промотор основного белка миелина (MBP).
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит убиквитарный промотор. Неограничивающие примеры убиквитарных промоторов включают CMV, CBA (в том числе производные CAG, CBh и т.д.), EF-1α, PGK, UBC, GUSB (hGBp) и UCOE (промотор HNRPA2B1-CBX3). Yu et al. (Molecular Pain 2011, 7:63; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали экспрессию eGFP под контролем промоторов CAG, EFIα, PGK и UBC в крысиных DRG клетках и первичных DRG клетках с использованием векторов на основе лентивируса, и обнаружили, что UBC показывал более слабую экспрессию, чем 3 другие промотора, и для всех промоторов наблюдали экспрессию только в 10-12% глии. Soderblom et al. (E. Neuro 2015; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) исследовали экспрессию eGFP в AAV8 с промоторами CMV и UBC и AAV2 с промотором CMV после инъекции в двигательную кору. Интраназальное введение плазмиды, содержащей промотор UBC или EFIα, показывало устойчивую экспрессию в дыхательных путях, большую, чем экспрессия с промотором CMV (см., например, Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539-1546; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Husain et al. (Gene Therapy 2009; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали конструкцию HβH с промотором hGUSB, промотором HSV-1LAT и промотором NSE и выяснили, что конструкция HβH показывала более слабую экспрессию в головном мозге мышей, чем NSE. Passini и Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392, содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали долговременные эффекты вектора HβH после внутрижелудочковой инъекции у новорожденных мышей и выяснили, что присутствует устойчивая экспрессия в течение по меньшей мере 1 года. Низкая экспрессия во всех областях головного мозга была обнаружена Xu et al. (Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) в случае, когда использовали промоторы NF-L и NF-H в сравнении с CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE+wpre, NSE (0,3 т. о.), NSE (1,8 т. о.) и NSE (1,8 т. о.+wpre). Xu et al. выяснили, что активность промоторов убывала в следующем порядке: NSE (1,8 т. о.), EF, NSE (0,3 т. о.), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL и NFH. NFL представляет собой 650-нуклеотидный промотор, и NFH представляет собой 920-нуклеотидный промотор, причем оба из них отсутствуют в печени, но NFH является распространенным в проприоцептивных сенсорных нейронах, головном и спинном мозге, а NFH присутствует в сердце. Scn8a представляет собой 470-нуклеотидный промотор, который экспрессируется везде в DRG, спинном мозге и головном мозге, причем особенно высокая экспрессия наблюдается в нейронах гиппокампа и мозжечковых клетках Пуркинье, коре головного мозга, таламусе и гипоталамусе (см., например, Drews et al. 2007; и Raymond et al. 2004; причем содержание каждой из которых включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор UBC. Промотор UBC может иметь размер 300-350 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор UBC имеет размер 332 нуклеотида.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор GUSB. Промотор GUSB может иметь размер 350-400 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор GUSB имеет размер 378 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.
В соответствии с одним вариантом осуществления, векторный геном содержит промотор NFL. Промотор NFL может иметь размер 600-700 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор NFL имеет размер 650 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор NFH. Промотор NFH может иметь размер 900-950 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор NFH имеет размер 920 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор scn8a. Промотор scn8a может иметь размер 450-500 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор scn8a имеет размер 470 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор FXN.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор PGK.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор CBA.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор CMV.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор, специфичный в отношении печени или скелетных мышц. Неограничивающие примеры промоторов, специфичных в отношении печени, включают hAAT и TBG. Неограничивающие примеры промоторов, специфичных в отношении скелетных мышц, включают десминовый промотор, MCK и C5-12.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор содержит энхансерный элемент, промотор и/или интрон 5ʹUTR. Энхансер может представлять собой, без ограничения, энхансер CMV, промотор может представлять собой, без ограничения, промотор CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, синапсина, MeCP2 и GFAP, и 5ʹUTR/интрон может представлять собой, без ограничения, SV40 и CBA-MVM. В качестве неограничивающего примера, энхансер, промотор и/или интрон, применяемые в комбинации, могут представлять собой: (1) энхансер CMV, промотор CMV, интрон 5ʹUTR SV40; (2) энхансер CMV, промотор CBA, интрон 5ʹUTR SV 40; (3) энхансер CMV, промотор CBA, интрон 5ʹUTR CBA-MVM; (4) промотор UBC; (5) промотор GUSB; (6) промотор NSE; (7) промотор синапсина; (8) промотор MeCP2 и (9) промотор GFAP.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор имеет сконструированный промотор.
Интроны
В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности трансгена в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки), такой как интрон. Неограничивающие примеры интронов включают MVM (67-97 п.о.), F.IX усеченный интрон 1 (300 п.о.), SD β-глобина /акцепторный сайт сплайсинга тяжелой цепи иммуноглобулина (250 п.о.), донорный сайт сплайсинга аденовируса/акцепторный сайт сплайсинга иммуноглобулина (500 п.о.), донорный сайт сплайсинга/акцепторный сайт сплайсинга поздних генов SV40 (19S/16S) (180 п.о.) и донорный сайт сплайсинга гибридного аденовируса/акцепторный сайт сплайсинга IgG (230 п.о.).
В соответствии с одним вариантом осуществления интрон может иметь длину 100-500 нуклеотидов. Интрон может иметь длину 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 или 500. Промотор может иметь длину 80-100, 80-120, 80-140, 80-160, 80-180, 80-200, 80-250, 80-300, 80-350, 80-400, 80-450, 80-500, 200-300, 200-400, 200-500, 300-400, 300-500 или 400-500.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-векторный геном может содержать промотор, такой как, без ограничения, CMV или U6. В качестве неограничивающего примера, промотор для AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, представляет собой промотор CMV. В качестве другого неограничивающего примера, промотор для AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, представляет собой промотор U6.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор может содержать промотор CMV и U6.
В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор может содержать промотор CBA.
Введение в клетки: синтетические dsRNA
Для обеспечения химической и биологической стабильности молекул siRNA (например, дуплексов siRNA и dsRNA) важно доставить молекулы siRNA внутрь целевых клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетки могут включать, без ограничения, клетки, происходящие из млекопитающего, клетки, происходящие из человека, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нервные стволовые клетки и клетки-предшественники нервных клеток.
Нуклеиновые кислоты, в том числе siRNA, несут суммарный отрицательный заряд на сахаро-фосфатном остове в нормальных физиологических условиях. Для попадания в клетку молекула siRNA должна прийти в контакт с липидным бислоем клеточной мембраны, группы-«головки» в котором также имеют отрицательный заряд.
Дуплексы siRNA могут присутствовать в комплексе с носителем, который позволяет им проходить через клеточные мембраны, таким как упаковочные частицы, для облегчения поглощения siRNA клетками. Упаковочные частицы могут включать, без ограничения, липосомы, наночастицы, катионные липиды, производные полиэтиленимина, дендримеры, углеродные нанотрубки и комбинацию полученных из углерода наночастиц с дендримерами. Липиды могут представлять собой катионные липиды и/или нейтральные липиды. Помимо традиционных липофильных комплексов молекул siRNA с катионными носителями, молекулы siRNA можно конъюгировать с гидрофобным фрагментом, таким как холестерин (например, публикация заявки на патент США № 20110110937; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Этот способ доставки имеет потенциал к улучшению поглощения клетками молекул siRNA in vitro и фармакологических свойств молекул siRNA in vivo. Молекулы siRNA согласно настоящему изобретению также можно ковалентно или нековалентно конъюгировать с определенными катионными пептидами, проникающими в клетку (CPP), такими как MPG, транспортан или пенетратин (например, публикация заявки на патент США № 20110086425; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Введение в клетки: AAV-векторы
Молекулы siRNA (например, дуплексы siRNA) согласно настоящему изобретению можно вводить в клетки с применением ряда подходов, таких как, без ограничения, вирусные векторы (например, AAV-векторы). Эти вирусные векторы сконструированы и оптимизированы для облегчения прохождения молекулы siRNA в клетки, которые с трудом поддаются трансфекции. Также, некоторые синтетические вирусные векторы обладают способностью интегрировать shRNA в геном клетки, тем самым приводя к устойчивой экспрессии siRNA и длительному нокдауну целевого гена. Таким образом, вирусные векторы конструируют в качестве средств для специфической доставки при отсутствии вредных признаков репликации и/или интеграции, обнаруживаемых у вируса дикого типа.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению вводят в клетку посредством приведения клетки в контакт с композицией, содержащей липофильный носитель и вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. В соответствии с другими вариантами осуществления молекулу siRNA вводят в клетку посредством трансфицирования или инфицирования клетки вектором, например, AAV-вектором, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, способные продуцировать молекулу siRNA в случае при транскрипции в клетке. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулу siRNA вводят в клетку посредством инъекции в клетку вектора, например, AAV-вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, способную продуцировать молекулу siRNA при транскрипции в клетке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления перед трансфекцией вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может трансфицироваться в клетки.
В соответствии с другими вариантами осуществления векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно доставлять в клетки с помощью электропорации (например публикация заявки на патент США № 20050014264; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Другие способы введения векторов, например, AAV-векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA, описанных в данном документе, могут включать фотохимическую интернализацию, как описано в публикации заявки на патент США № 20120264807; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления составы, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере один вектор, например, AAV-векторы, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA, описанные в данном документе. В соответствии с одним вариантом осуществления молекулы siRNA могут целенаправленно воздействовать на ген SOD1 в одном целевом сайте. В соответствии с другим вариантом осуществления состав содержит несколько векторов, например, AAV-векторов, причем каждый вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу siRNA, целенаправленно воздействующую на ген SOD1 в различном целевом сайте. SOD1 может подвергаться целенаправленному воздействию в 2, 3, 4, 5 или более чем 5 сайтах.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, из любого соответствующего вида, такого как, без ограничения, человек, собака, мышь, крыса или обезьяна, можно вводить в клетки.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые имеют отношение к заболеванию, подлежащему лечению. В качестве неограничивающего примера, болезнь представляет собой ALS, и целевые клетки представляют собой двигательные нейроны и астроциты.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые характеризуются высоким уровнем эндогенной экспрессии целевой последовательности.
В соответствии с другим вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые характеризуются низким уровнем эндогенной экспрессии целевой последовательности.
В соответствии с одним вариантом осуществления клетки могут представлять собой клетки, характеризующиеся высокой эффективностью трансдукции AAV.
Фармацевтические композиции и состав
В дополнение к фармацевтическим композициям (векторам, например, AAV-векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA) в данном документе предусматриваются фармацевтические композиции, которые являются подходящими для введения людям, причем специалисту в данной области техники будет понятно, что такие композиции обычно являются подходящими для введения любому другому животному, например, животным, отличным от человека, например, млекопитающим, отличным от человека. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения людям, для того, чтобы сделать композиции подходящими для введения различным животным, является хорошо понятной, и средний специалист в области ветеринарной фармакологии может разработать и/или выполнить такую модификацию с использованием только стандартного экспериментирования, если оно вообще будет необходимо. Субъекты, для которых предполагается введение фармацевтических композиций, включают, без ограничения, людей и/или других приматов; млекопитающих, в том числе коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки, собаки, мыши и/или крысы; и/или птиц, в том числе коммерчески значимых птиц, таких как домашняя птица, куры, утки, гуси и/или индейки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции вводят людям, пациентам-людям или субъектам-людям. В контексте настоящего раскрытия фраза «активный ингредиент» обычно относится к любому из синтетических дуплексов siRNA, вектору, например, AAV-вектору, кодирующему дуплексы siRNA, или к молекуле siRNA, доставляемой с помощью вектора, как описано в данном документе.
Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, можно получить с помощью любого способа, известного или который будет разработан в будущем в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию обеспечения объединения активного ингредиента со вспомогательным веществом и/или одним или более другими дополнительными ингредиентами, а затем, если необходимо и/или желательно, разделение, придание формы и/или упаковку продукта в предпочтительную единицу с однократной дозой или единицу с несколькими дозами.
Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением будут варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и/или состояния субъекта, получающего лечение, а также в зависимости от пути, которым следует вводить композицию.
Векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно составить с применением одного или более вспомогательных веществ для (1) повышения стабильности; (2) повышения уровня трансфекции или трансдукции клеток; (3) обеспечения возможности длительного или замедленного высвобождения или (4) изменения биораспределения (например, нацеливания вирусного вектора на конкретные ткани или типы клеток, такие как головной мозг и двигательные нейроны).
Составы согласно настоящему изобретению могут включать, без ограничения, солевой раствор, липидоиды, липосомы, липидные наночастицы, полимеры, липоплексы, наночастицы по типу ядро-оболочка, пептиды, белки, клетки, трансфицированные вирусными векторами (например, для трансплантации субъекту), средства, имитирующие наночастицы, и их комбинации. Кроме того, вирусные векторы согласно настоящему изобретению можно составить с применением самособирающихся наночастиц нуклеиновой кислоты.
Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, можно получить с помощью любого способа, известного или который будет разработан в будущем в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию объединения активного ингредиента со вспомогательным веществом и/или одним или более другими дополнительными ингредиентами.
Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим раскрытием можно получить, упаковать и/или реализовать нерасфасованной, в виде единичной стандартной дозы и/или в виде нескольких единичных стандартных доз. В контексте настоящего описания «стандартная доза» относится к дискретному количеству, фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозе активного ингредиента, которую можно вводить субъекту, и/или подходящей части такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.
Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим раскрытием могут варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и/или состояния субъекта, получающего лечение, а также в зависимости от пути, которым следует вводить композицию. Например, композиция может содержать от 0,1% до 99% (вес/вес) активного ингредиента. В качестве примера, композиция может содержать от 0,1% до 100%, например, от 0,5 до 50%, 1-30%, 5-80%, по меньшей мере 80% (вес/вес) активного ингредиента.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может иметь чистоту по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество одобрено для применения у людей и для применения в ветеринарии. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может быть одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может иметь фармацевтическую степень чистоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может отвечать стандартам Фармакопеи США (USP), Европейской фармакопеи (EP), Британской фармакопеи и/или Международной фармакопеи.
Вспомогательные вещества, которые в контексте данного описания включают, без ограничения, любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие среды, вспомогательные средства для диспергирования или суспендирования, поверхностно-активные средства, средства для обеспечения изотоничности, загущающие или эмульгирующие средства, консерванты и т.п., которые подходят для конкретной необходимой лекарственной формы. Различные вспомогательные вещества для составления фармацевтических композиций и методики получения композиции известны из уровня техники (см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; включенную в данный документ в своей полноте посредством ссылки). Применение традиционной среды для лекарственного средства может предполагаться в объеме настоящего раскрытия, за исключением того случая, когда какая-либо традиционная среда для лекарственного средства может быть несовместима с веществом или его производными, как например, являясь причиной какого-либо нежелательного биологического эффекта или иным образом пагубно взаимодействуя с любым другим компонентом(компонентами) фармацевтической композиции.
Иллюстративные разбавители включают, без ограничения, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, фосфат дикальция, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарную пудру и т.д. и/или их комбинации.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления составы могут содержать по меньшей мере один неактивный ингредиент. В контексте настоящего описания термин «неактивный ингредиент» относится к одному или более неактивным средствам, включенным в составы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления все, ни один или некоторые из неактивных ингредиентов, которые можно применять в составах согласно настоящему изобретению, могут быть одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).
Составы с векторами, содержащими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут включать катионы или анионы. В соответствии с одним вариантом осуществления составы включают катионы металлов, такие как, без ограничения, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ и их комбинации.
В контексте настоящего описания «фармацевтически приемлемые соли» относятся к производным раскрытых соединений, в которых исходное соединение модифицировано посредством превращения существующего кислотного или основного фрагмента в его солевую форму (например, путем осуществления реакции группы свободного основания с подходящей органической кислотой). Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, без ограничения, соли основных остатков, таких как амины, с минеральными или органическими кислотами; соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты, с щелочами или органическими основаниями и т.п. Типичные соли присоединения кислоты включают ацетат, соли уксусной кислоты, адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, соли бензолсульфоновой кислоты, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат, валерат и т.п. Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают катионы натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п., а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, в том числе, без ограничения, катионы аммония, тетраметиламмония, тетраэтиламмония, метиламина, диметиламина, триметиламина, триэтиламина, этиламина и т.п. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему раскрытию включают традиционные нетоксичные соли, образованные исходным соединением, например, с нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему раскрытию можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основный или кислотный фрагмент, посредством традиционных химических способов. Обычно такие соли можно получить посредством проведения реакции этих соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или же в их смеси; обычно предпочтительными являются неводные среды, подобные эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу. Перечень подходящих солей находится в Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, и Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977); причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Термин «фармацевтически приемлемый сольват» в контексте настоящего описания означает соединение согласно настоящему изобретению, причем молекулы подходящего растворителя включены в кристаллическую решетку. Подходящий растворитель является физиологически переносимым во вводимой дозе. Например, сольваты можно получить посредством кристаллизации, перекристаллизации или осаждения из раствора, который включает органические растворители, воду или их смесь. Примерами подходящих растворителей являются этанол, вода (например, моно-, ди- и тригидраты), N-метилпирролидинон (NMP), диметилсульфоксид (DMSO), N,Nʹ-диметилформамид (DMF), N,Nʹ-диметилацетамид (DMAC), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMEU), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2-(1H)-пиримидинон (DMPU), ацетонитрил (ACN), пропиленгликоль, этилацетат, бензиловый спирт, 2-пирролидон, бензилбензоат и т.п. Если растворителем является вода, сольват называется «гидратом».
Согласно настоящему изобретению вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, можно составить для доставки в ЦНС. Можно применять средства, которые пересекают гемато-энцефалический барьер. Например, некоторые пептиды, проникающие в клетку, которые могут нацеливать молекулы siRNA на эндотелий гемато-энцефалического барьера, можно применять для составления дуплексов siRNA, нацеленных на ген SOD1 (например, Mathupala, Expert Opin Ther Pat., 2009, 19, 137-140; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Введение
Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить любым путем, который приведет к терапевтически эффективному результату. Они включают, без ограничения, энтеральное введение (в кишечник), желудочно-кишечное, эпидуральное (в твердую мозговую оболочку), пероральное (через рот), трансдермальное, перидуральное, интрацеребральное (в головной мозг), интрацеребровентрикулярное (в желудочки головного мозга), накожное (нанесение на кожу), интрадермальное (в саму кожу), подкожное (под кожу), интраназальное введение (через нос), внутривенное (в вену), внутривенное струйное, внутривенное капельное, внутриартериальное (в артерию), внутримышечное (в мышцу), внутрисердечное (в сердце), внутрикостную инфузию (в костный мозг), интратекальное введение (в спинномозговой канал), внутрибрюшинное (инфузия или инъекция в брюшную полость), интравезикальную инфузию, интравитреальное введение (через глаз), интракавернозную инъекцию (в патологическую полость), интракавитарное (в сонование полового члена), интравагинальное введение, внутриматочное, экстраамниотическое введение, трансдермальное (диффузия через интактную кожу для системного распространения), трансмукозальное (диффузия через слизистую оболочку), трансвагинальное введение, инсуффляцию (втягивание носом), сублингвальное введение, сублабиальное, введение клизмой, введение в глазных каплях (на конъюнктиву), в ушных каплях, ушное введение (в или через ухо), буккальное (по направлению к щеке), конъюнктивальное введение, кожное, дентальное (в зуб или зубы), электроосмос, эндоцервикальное введение, внутрипазушное, эндотрахеальное, экстракорпоральное введение, гемодиализ, инфильтрацию, введение в интерстициальную ткань, интраабдоминальное введение, интраамниотическое, интраартикулярное, интрабилиарное, интрабронхиальное, интрабурсальное, внутрихрящевое (в хрящ), интракаудальное (в конский хвост), интрацистернальное (в большую мозжечково-мозговую цистерну), внутрироговичное (в роговицу), введение в коронку зуба, интракоронарное (в коронарные артерии), введение в пещеристое тело (в расширяющиеся участки пешеристого тела полового члена), внутридисковое введение (в диск), внутрипротоковое (в проток железы), интрадуоденальное (в двенадцатиперстную кишку), интрадуральное (в или под твердую мозговую оболочку), интраэпидермальное (в эпидермис), внутрипищеводное (в пищевод), внутрижелудочное (в желудок), интрагингивальное введение (в десны), введение в подвздошную кишку (в дистальную часть тонкого кишечника), внутриочаговое введение (введение в очаг или введение непосредственно в локализованный очаг), введение в просвет (в просвет трубки), внутрилимфатическое (в лимфу), интрамедуллярное (в мозговую полость кости), интраменингеальное (в оболочки головного мозга), внутриглазное (в глаз), внутрияичниковое (в яичник), интраперикардиальное (в перикард), интраплевральное (в плевру), внутрипростатное (в предстательную железу), внутрилегочное (в легкие или их бронхи), внутрипазушное (в носовые или окологлазничные пазухи), интраспинальное (в позвоночный столб), внутрисуставное (в синовиальную полость сустава), внутрисухожильное (в сухожилье), интратестикулярное (в яичко), интратекальное (в спинномозговую жидкость на любом уровне цереброспинальной оси), интраторакальное (в грудную клетку), интратубулярное (в канальцы органа), внутриопухолевое (в опухоль), интратимпанальное (в ушную среду), внутрисосудистое (в сосуд или сосуды), внутрижелудочковое введение (в желудочек), ионофорез (с помощью электрического тока, под действием которого ионы растворимых солей мигрируют в ткани тела), промывание (для обмывания или промывания открытых ран или полостей тела), ларингеальное (непосредственно на гортань), назогастральное введение (через нос и в желудок), методику наложения окклюзионной повязки (местный путь введения, при котором область введения затем накрывают повязкой, которая герметизирует область), глазное введение (на наружную поверхность глаза), орофарингеальное (непосредственно в рот и глотку), парентеральное, чрескожное, периартикулярное, перидуральное, периневральное, периодонтальное, ректальное, респираторное (в дыхательные пути посредством пероральной или назальной ингаляции для локального или системного эффекта), ретробульбарное введение (за варолиев мост или за глазное яблоко), введение в мягкие ткани, субарахноидальное введение, субконъюнктивальное, субмукозальное, местное, трансплацентарное (через плаценту или в плаценту), транстрахеальное (через стенку трахеи), транстимпанальное введение (через барабанную полость или в барабанную полость), введение в мочеточник (в мочеточник), уретральное введение (в мочеиспускательный канал), вагинальное введение, каудальную блокаду, диагностику, блокаду нерва, перфузию желчных протоков, перфузию сердца, фотоферез или спинальное введение.
В соответствии с конкретными вариантами осуществления композиции с вектором, например, AAV-вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить путем, который облегчает попадание векторов или молекул siRNA в центральную нервную систему и проникновение их в двигательные нейроны.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить посредством внутримышечной инъекции. Rizvanov et al. впервые продемонстрировали, что молекулы siRNA, нацеленные на мРНК мутантной SOD1 человека, поглощаются седалищным нервом, транспортируются в обратном направлении к перикарионам двигательных нейронов и ингибирует мРНК мутантной SOD1 у трансгенных по SOD1G93A мышей с ALS (Rizvanov AA et al., Exp. Brain Res., 2009, 195(1), 1-4; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Другое исследование также демонстрирует, что доставка в мышцы AAV, экспрессирующего малые шпилечные РНК (shRNA), действующие против мутантного гена SOD1, приводит к значительному нокдауну мутантной SOD1 в мышцах, а также иннервирующих двигательных нейронах (Towne C et al., Mol Ther., 2011; 19(2): 274-283; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-векторы, которые экспрессируют дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить субъекту посредством инъекций в периферические ткани и/или интраназальной доставки. В уровне техники было раскрыто, что при введении в периферические ткани AAV-векторов для дуплексов siRNA они могут транспортироваться в центральную нервную систему, например, к двигательным нейронам (например, публикации заявок на патент США № 20100240739 и № 20100130594; причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с другими вариантами осуществления композиции, содержащие по меньшей мере один вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить субъекту посредством внутричерепной доставки (см., например, патент США № 8119611; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в любой подходящей форме, либо в виде жидкого раствора или суспензии, либо в твердой форме, подходящей для получения жидкого раствора или суспендирования в жидком растворе. Дуплексы siRNA можно составить с любым соответствующим и фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.
Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в «терапевтически эффективном» количестве, т.е. в количестве, которое является достаточным для смягчения и/или предупреждения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с заболеванием, или для обеспечения улучшения состояния субъекта.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить в ЦНС в терапевтически эффективном количестве для улучшения функционирования и/или обеспечения выживания субъекта с ALS. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить субъекту (например, в ЦНС субъекта посредством интратекального введения) в терапевтически эффективном количестве для целенаправленного воздействия дуплексов siRNA или dsRNA на двигательные нейроны и астроциты в спинном мозге и/или стволе головного мозга. В качестве неограничивающего примера, дуплексы siRNA или dsRNA могут снижать экспрессию белка или мРНК SOD1. В качестве другого неограничивающего примера, дуплексы siRNA или dsRNA могут подавлять SOD1 и снижать опосредованную SOD1 токсичность. Снижение уровня белка и/или мРНК SOD1, а также опосредованной SOD1 токсичности может достигаться практически без усиленного воспаления.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить субъекту (например, в ЦНС субъекта) в терапевтически эффективном количестве для замедления ухудшения функционального состояния у субъекта (например, определенного с использованием известного способа оценки, такого как функциональная шкала оценки состояния больных ALS (ALSFRS)) и/или продления жизни субъектов без зависимости от аппарата искусственной вентиляции легких (например, уменьшенная смертность или потребность в поддержке искусственной вентиляцией легких). В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить в мозжечково-мозговую цистерну в терапевтически эффективном количестве для трансдукции двигательных нейронов и/или астроцитов спинного мозга. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить с применением интратекальной инфузии в терапевтически эффективном количестве для трансдукции двигательных нейронов и/или астроцитов спинного мозга. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.
В соответствии с одним вариантом осуществления можно получить с состав с вектором, например, AAV-вектором, содержащим модулирующий полинуклеотид. В качестве неограничивающего примера баричность и/или осмоляльность состава можно оптимизировать для обеспечения оптимального распределения лекарственного средства в центральной нервной системе или в области или компоненте центральной нервной системы.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять субъекту посредством одного пути введения.
В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять субъекту посредством пути введения в несколько мест. Субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид в 2, 3, 4, 5 или более чем 5 сайтах.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе, с применением струйной инфузии.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе, с применением длительной доставки в течение периода времени, составляющего минуты, часы или сутки. Скорость инфузии можно изменять в зависимости от субъекта, распределения, состава или другого параметра доставки.
В соответствии с одним вариантом осуществления катетер может быть расположен в более чем одном участке в позвоночнике для доставки в несколько участков. Вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять посредством продолжительной и/или струйной инфузии. Каждый участок может иметь отличающийся режим дозирования, или один и тот же режим дозирования можно применять для каждого участка доставки. В качестве неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в шейной и поясничной области. В качестве другого неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в шейной области. В качестве еще одного неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в поясничной области.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъект может подвергаться анализу в отношении анатомии и патологии позвоночника перед доставкой вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе. В качестве неограничивающего примера, субъект со сколиозом может иметь отличающийся режим дозирования и/или расположение катетера по сравнению с субъектом без сколиоза.
В соответствии с одним вариантом осуществления ориентация позвоночника субъекта в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, может быть вертикальной относительно поверхности земли.
В соответствии с другим вариантом осуществления ориентация позвоночника субъекта в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, может быть горизонтальной относительно поверхности земли.
В соответствии с одним вариантом осуществления позвоночник субъекта может находиться под углом относительно поверхности земли в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид. Угол позвоночника субъекта относительно поверхности земли может составлять по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или 180 градусов.
В соответствии с одним вариантом осуществления способ и длительность доставки выбирают для обеспечения свободной трансдукции в спинной мозг. В качестве неограничивающего примера, интратекальную доставку применяют для обеспечения свободной трансдукции по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении. В качестве другого неограничивающего примера, инфузии в несколько мест обеспечивают более равномерную трансдукцию по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении. В качестве еще одного неограничивающего примера, пролонгированные инфузии обеспечивают более равномерную трансдукцию по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении.
Дозировка
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту с применением любого количества, эффективного для сокращения, предупреждения и/или лечения нарушения, ассоциированного с SOD1 (например, ALS). Точное необходимое количество будет варьировать от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, конкретной композиции, способа ее введения, механизма ее действия и т.п.
Композиции согласно настоящему изобретению, как правило, составляют в единичной лекарственной форме для облегчения введения и равномерности дозировки. Тем не менее, будет понятно, что общее суточное потребление композиций согласно настоящему изобретению может определяться лечащим врачом по результатам тщательной клинической оценки. Конкретная терапевтическая эффективность для каждого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, в том числе от нарушения, подлежащего лечению, и тяжести нарушения; активности конкретного используемого соединения; конкретной используемой композиции; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и рациона пациента; времени введения, пути введения, а также скорости выведения из организма используемых дуплексов siRNA; длительности лечения; лекарственных средств, применяемых в сочетании или совместно с конкретным используемым соединением; и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.
В соответствии с одним вариантом осуществления возраст и пол субъекта можно использовать для определения дозы композиций согласно настоящему изобретению. В качестве неограничивающего примера, субъект, чей возраст больше, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с младшим субъектом. В качестве другого неограничивающего примера, субъект, чей возраст меньше, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению со старшим субъектом. В качестве еще одного неограничивающего примера, субъект, являющийся женщиной, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с субъектом-мужчиной. В качестве еще одного неограничивающего примера, субъект, являющийся мужчиной, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с субъектом-женщиной.
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления дозы AAV-векторов для доставки дуплексов siRNA согласно настоящему изобретению можно адаптировать в зависимости от болезненного состояния, субъекта и стратегии лечения.
В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки предусматривает скорость доставки, определяемую выражением [вг/час= мл/час * вг/мл], где вг представляет собой количество вирусных геномов, вг/мл представляет собой концентрацию композиции, и мл/час представляет собой скорость пролонгированной доставки.
В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию у субъекта от приблизительно 1×106 вг до приблизительно 1×1016 вг. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 2,1×1011, 2,2×1011, 2,3×1011, 2,4×1011, 2,5×1011, 2,6×1011, 2,7×1011, 2,8×1011, 2,9×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 7,1×1011, 7,2×1011, 7,3×1011, 7,4×1011, 7,5×1011, 7,6×1011, 7,7×1011, 7,8×1011, 7,9×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1 x1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012,4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 8,1×1012, 8,2×1012, 8,3×1012, 8,4×1012, 8,5×1012, 8,6×1012, 8,7×1012, 8,8 x1012, 8,9×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/субъект.
В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию у субъекта от приблизительно 1×106 вг/кг до приблизительно 1×1016 вг/кг. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 2,1×1011, 2,2×1011, 2,3×1011, 2,4×1011, 2,5×1011, 2,6×1011, 2,7×1011, 2,8×1011, 2,9×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 7,1×1011, 7,2×1011, 7,3×1011, 7,4×1011, 7,5×1011, 7,6×1011, 7,7×1011, 7,8×1011, 7,9×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1 x1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012,4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 8,1×1012, 8,2×1012, 8,3×1012, 8,4×1012, 8,5×1012, 8,6×1012, 8,7×1012, 8,8 x1012, 8,9×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/кг.
В соответствии с одним вариантом осуществления можно доставлять от приблизительно 105 до 106 вирусных геномов (единиц) на дозу.
В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию от приблизительно 1×106 вг/мл до приблизительно 1×1016 вг/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1×1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 2,1×1012, 2,2×1012, 2,3×1012, 2,4×1012, 2,5×1012, 2,6×1012, 2,7×1012, 2,8×1012, 2,9×1012, 3×1012, 3,1×1012, 3,2×1012, 3,3×1012, 3,4×1012, 3,5×1012, 3,6×1012, 3,7×1012, 3,8×1012, 3,9×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012, 4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/мл.
В соответствии с определенными вариантами осуществления необходимую дозу дуплекса siRNA можно доставить с помощью нескольких введений (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или большего числа введений). Если используют несколько введений, можно применять режимы дозирования с разделением дозы, такие как описанные в данном документе. В контексте настоящего описания «раздельная доза» представляет собой разделение единичной стандартной дозы или общей суточной дозы на две или более доз, например, два или более введений единичной стандартной дозы. В контексте настоящего описания «единичная стандартная доза» представляет собой дозу любого терапевтического средства на основе модулирующего полинуклеотида, вводимого в одной дозе/в одно время/одним путем/через одну точку контакта, т.е. при одном событии введения. В контексте настоящего описания «общая суточная доза» представляет собой количество, которое дают или прописывают на 24 часовой период. Его можно вводить в виде единичной стандартной дозы. В соответствии с одним вариантом осуществления вирусные векторы, содержащие модулирующие полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, вводят субъекту раздельными дозами. Их можно составить только в буфере или в составе, описанном в данном документе.
Способы лечения ALS
Настоящим изобретением обеспечиваются способы введения векторов, например, AAV-векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, в клетки, причем способ предусматривает введение в указанные клетки любого из векторов в количестве, достаточном для того, чтобы происходило разрушение целевой мРНК SOD1, тем самым активируя мишень-специфическую RNAi в клетках. В некоторых аспектах клетки могут представлять собой стволовые клетки, нейроны, такие как двигательные нейроны, мышечные клетки и глиальные клетки, такие как астроциты.
В настоящем изобретении раскрыты способы лечения ALS, ассоциированного с аномальным функционированием SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении. Способ необязательно предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. В качестве неограничивающего примера, молекулы siRNA могут подавлять экспрессию гена SOD1, ингибировать продукцию белка SOD1 и снижать интенсивность одного или более симптомов ALS у субъекта, тем самым осуществляя терапевтическое лечение ALS.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию, содержащую векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, вводят в центральную нервную систему субъекта. В соответствии с другими вариантами осуществления композицию, содержащую векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, вводят в мышцы субъекта
В частности, векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно доставлять в конкретные типы клеток, подвергающихся целенаправленному воздействию, в том числе в двигательные нейроны; глиальные клетки, в том числе олигодендроцит, астроцит и микроглию; и/или другие клетки, окружающие нейроны, такие как T-клетки. В исследования у пациентов-людей с ALS и в животных моделях ALS, связанного с SOD1, вовлекались глиальные клетки как играющие роль на начальных этапах дисфункции и гибели двигательных нейронов. Нормальная SOD1 в окружающей среде, защищающие глиальные клетки могут предотвратить гибель двигательных нейронов, даже если мутантная SOD1 присутствует в двигательных нейронах (например, в обзоре за авторством Philips and Rothstein, Exp. Neurol., 2014, May 22. pii: S0014-4886(14)00157-5; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно применять в качестве терапевтического средства для ALS.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию согласно настоящему изобретению вводят как средство для одиночной терапии или как средство в рамках комплексной терапии для лечения ALS.
Векторы, например, AAV-векторы, кодирующие дуплексы siRNA, нацеленные на ген SOD1, можно применять в сочетании с одним или более другими терапевтическими средствами. Под выражением «в сочетании с» не подразумевается, что средства нужно вводить одновременно и/или составлять для совместной доставки, хотя эти способы доставки находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Композиции можно вводить одновременно с одним или более другими необходимыми терапевтическими средствами или медицинскими процедурами, до или после них. В целом, каждое средство будут вводить в дозе и/или по временному графику, определенным для каждого средства.
Терапевтические средства, которые можно применять в сочетании с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут представлять собой соединения-малые молекулы, которые являются антиоксидантами, противовоспалительными средствами, антиапоптотическими средствами, регуляторами уровня кальция, антиглутаматергическими средствами, ингибиторами структурных белков и соединениями, вовлеченными в регуляцию ионов металлов.
Соединения, исследуемые в отношении лечения ALS, которые можно применять в сочетании с векторами, описанными в данном документе, включают, без ограничения, антиглутаматергические средства: рилузол, топирамат, талампанел, ламотригин,декстрометорфан, габапентин и антагонист AMPA; антиапоптотические средства: миноциклин, фенилбутират натрия и аримокломол; противовоспалительное средство: ганглиозид, целекоксиб, циклоспорин, азатиоприн, циклофосфамид, плазмаферез, глатирамер ацетат и талидомид; цефтриаксон (Berry et al., Plos One, 2013, 8(4)); бета-лактамные антибиотики; прамипексол (дофаминовый агонист) (Wang et al., Amyotrophic Lateral Scler., 2008, 9(1), 50-58); нимесулид в публикации заявки на патент США № 20060074991; диазоксид, раскрытый в публикации заявки на патент США № 20130143873); пиразолоновые производные, раскрытые в публикации заявки на патент США № 20080161378; поглотители свободных радикалов, которые ингибируют индуцируемую окислительным стрессом гибель клетки, такие как бромокриптин (публикация заявки на патент США № 20110105517); фенилкарбаматные соединения, обсуждаемые в PCT публикации патентной заявки № 2013100571; нейропротекторные соединения, раскрытые в патентах США № 6933310 и № 8399514 и в публикациях заявок на патент США № 20110237907 и № 20140038927; и гликопептиды, обсуждаемые в публикации заявки на патент США № 20070185012; причем содержание каждого из этих источников включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Терапевтические средства, которые можно применять в комплексной терапии с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут представлять собой гормоны или варианты, которые могут защищать от потери нейронов, такие как адренокортикотропный гормон (ACTH) или его фрагменты (например, публикация заявки на патент США № 20130259875); эстроген (например, патенты США № 6334998 и № 6592845); причем содержание каждого из этих источников включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Нейротрофические факторы можно использовать в комплексной терапии с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, для лечения ALS. В целом, нейротрофический фактор определяется как вещество, которое способствует выживанию, росту, дифференцировке, пролиферации и/или созреванию нейрона или стимулирует повышенную активность нейрона. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы согласно настоящему изобретению дополнительно предусматривают доставку одного или более трофических факторов субъекту, нуждающемуся в лечении. Трофические факторы могут включать, без ограничения, IGF-I, GDNF, BDNF, CTNF, VEGF, коливелин, ксалипроден, тиреотропин-рилизинг гормони ADNF, а также их варианты.
В одном аспекте вектор, например, AAV-вектор, кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты для по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, можно вводить совместно с AAV-векторами, экспрессирующими нейротрофические факторы, такие как AAV-IGF-I (Vincent et al., Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки) и AAV-GDNF (Wang et al., J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию согласно настоящему изобретению для лечения ALS вводят нуждающемуся субъекту внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, интратекально и/или внутрь желудочка, что позволяет молекулам siRNA или векторам, содержащим молекулы siRNA, проходить через один из или оба из гемато-энцефалического барьера и гемато-спинномозгового барьера. В некоторых аспектах способ включает введение (например, внутрижелудочковое введение и/или интратекальное введение) непосредственно в центральную нервную систему (ЦНС) субъекта (при использовании, например, инфузионного насоса и/или каркаса для доставки) терапевтически эффективного количества композиции, содержащей векторы, например, AAV-векторы, кодирующие последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению. Векторы можно применять для осуществления сайленсинга или подавления экспрессии гена SOD1 и/или для снижения интенсивности одного или более симптомов ALS у субъекта, тем самым осуществляя терапевтическое лечение ALS.
В определенных аспектах симптомы ALS, включающие, без ограничения, дегенерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, мышечную атрофию, ригидность мышц, затрудненное дыхание, невнятную речь, развитие фасцикуляций, лобно-височную деменцию и/или преждевременную смерть, улучшены у субъекта, получающего лечение. В других аспектах композицию согласно настоящему изобретению применяют в одном из или обоих из головного мозга и спинного мозга. В других аспектах улучшены одна или обе из мышечной координации и мышечной функции. В других аспектах жизнь субъекта продлевается.
В соответствии с одним вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, кодирующих siRNA согласно настоящему изобретению, может снизить уровень мутантной SOD1 в ЦНС субъекта. В соответствии с другим вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, может снизить уровень SOD1 дикого типа в ЦНС субъекта. В соответствии с еще одним вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, может снизить уровень как мутантной SOD1, так и SOD1 дикого типа в ЦНС субъекта. Уровень мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа может снижаться приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100% в ЦНС, области ЦНС или конкретной клетке ЦНС субъекта. В качестве неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию SOD1 дикого типа по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах. В качестве другого неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию мутантной SOD1 по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах. В качестве еще одного неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию SOD1 дикого типа и мутантной SOD1 по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах.
В соответствии с одним вариантом осуществления введение векторов, например, AAV-векторов, субъекту будет снижать экспрессию мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа в спинном мозге, и снижение экспрессии мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа будет снижать эффекты ALS у субъекта.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на ранних стадиях ALS. Симптомы каждой стадии включают, без ограничения, мышцы, которые являются слабыми и мягкими или жесткими, плотными и спастическими, судороги и подергивания (фасцикуляции) мышц, потерю мышечной массы (атрофию), утомляемость, плохую способность удерживать равновесие, невнятную речь, слабый контроль и/или спотыкание при ходьбе. Симптомы могут ограничиваться одной областью тела, или слабо выраженный симптом может затрагивать более чем одну область. В качестве неограничивающего примера, введение векторов, например, AAV-векторов, могут снижать тяжесть и/или распространенность симптомов ALS.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на промежуточных стадиях ALS. Промежуточная стадия ALS включает, без ограничения, более распространенные мышечные симптомы по сравнению с ранней стадией, некоторые мышцы являются парализованными, тогда как остальные являются ослабленными или незатронутыми, продолжающиеся подергивания мышц (фасцикуляции), неиспользуемые мышцы могут вызывать контрактуры там, где суставы стали ригидными, болезненными и иногда деформированными, слабость в глотательных мышцах может вызвать поперхивание и большую сложность при приеме пищи и контроле слюноотделения, слабость в дыхательных мышцах может вызвать дыхательную недостаточность, которая может быть проявляться при лежании, и/или субъект может иметь приступы неконтролируемого и неуместного смеха или плача (псевдобульбарный аффект). В качестве неограничивающего примера, введение векторов, например, AAV-векторов, могут снижать тяжесть и/или распространенность симптомов ALS.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на поздних стадиях ALS. Поздняя стадия ALS включает, без ограничения, произвольно сокращающиеся мышцы, которые в основном парализованы, мышцы, которые помогают перемещать воздух в и из легких, имеют сильные нарушения, подвижность крайне ограничена, слабое дыхание может вызвать утомляемость, спутанные мысли, головные боли и чувствительность к инфекции или заболеваниям (например, пневмонии), речь затруднительна, а принятие пищи или питья через рот может быть невозможно.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутацию C9orf72.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутации TDP-43.
В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутации FUS.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указано иное, следующие термины и фразы имеют значения, описанные ниже. Определения не считаются ограничивающими по своей природе и служат для обеспечения более четкого понимания определенных аспектов настоящего изобретения.
В контексте настоящего описания термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» относятся к любым полимерам нуклеиновой кислоты, состоящим или из полидезоксирибонуклеотидов (содержащих 2-дезокси-D-рибозу), или из полирибонуклеотидов (содержащих D-рибозу), или из любого другого типа полинуклеотида, который представляет собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания или модифицированных пуриновых или пиримидиновых оснований. Не предполагаются различия по длине между терминами «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид», и эти термины используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся только к первичной структуре молекулы. Таким образом, эти термины включают двух- и одноцепочечную ДНК, а также двух- и одноцепочечную РНК.
В контексте настоящего описания термины «РНК», или «молекула РНК», или «молекула рибонуклеиновой кислоты» относятся к полимеру из рибонуклеотидов; термин «ДНК», или «молекула ДНК», или «молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты» относится к полимеру из дезоксирибонуклеотидов. ДНК и РНК могут синтезироваться в естественных условиях, например, при репликации ДНК и транскрипции ДНК, соответственно; или их можно химически синтезировать. ДНК и РНК могут быть одноцепочечными (т.е. ssRNA или ssDNA, соответственно) или многоцепочечными (например, двухцепочечными, т.е. dsRNA и dsDNA, соответственно). Термины «мРНК» или «информационная РНК», которые используются в данном документе, относятся к одноцепочечной РНК, которая кодирует аминокислотную последовательность одной или более полипептидных цепей.
В контексте настоящего описания термины «РНК-интерференция» или «RNAi» относятся к специфическому в отношении последовательности регуляторному механизму, опосредованному молекулами РНК, который приводит в результате к ингибированию, или препятствованию, или «сайленсингу» экспрессии соответствующего гена, кодирующего белок. RNAi наблюдалась во многих типах организмов, в том числе в растениях, животных и грибах. RNAi происходит в клетках в естественных условиях для удаления чужеродных РНК (например, вирусных РНК). Природная RNAi происходит посредством фрагментов, отщепляемых от свободной dsRNA, которая управляет разрушающим механизмом для других подобных последовательностей РНК. RNAi контролируется РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC) и инициируется молекулами короткой/малой dsRNA в цитоплазме клетки, где они взаимодействуют с каталитическим компонентом RISC - белком Argonaute. Молекулы dsRNA можно вводить в клетки из экзогенных источников. Экзогенная dsRNA инициирует RNAi посредством активации белка-рибонуклеазы Dicer, который связывает и расщепляет dsRNA с образованием двухцепочечных фрагментов из 21-25 пар оснований с выступающими концами из нескольких неспаренных оснований на каждом конце. Эти короткие двухцепочечные фрагменты называются малыми интерферирующими РНК (siRNA).
В контексте настоящего описания термины «короткая интерферирующая РНК», «малая интерферирующая РНК» или «siRNA» относятся к молекуле РНК (или аналога РНК), содержащей приблизительно 5-60 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов), которая способна управлять или опосредовать RNAi. Предпочтительно, молекула siRNA содержит приблизительно 15-30 нуклеотидов или нуклеотидных аналогов, как например, приблизительно 16-25 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов), приблизительно 18-23 нуклеотида (или нуклеотидных аналога), приблизительно 19-22 нуклеотида (или нуклеотидных аналога) (например, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида или нуклеотидных аналога), приблизительно 19-25 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов) и приблизительно 19-24 нуклеотида (или нуклеотидных аналога). Термин «короткая» siRNA относится к siRNA, содержащей 5-23 нуклеотида, предпочтительно 21 нуклеотид (или нуклеотидный аналог), например, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида. Термин «длинная» siRNA относится к siRNA, содержащей 24-60 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 24-25 нуклеотидов, например, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов. Короткие siRNA в некоторых случаях могут включать в себя менее 19 нуклеотидов, например, 16, 17 или 18 нуклеотидов, или всего лишь 5 нуклеотидов при условии, что более короткая siRNA сохраняет способность опосредовать RNAi. Аналогичным образом, длинные siRNA в некоторых случаях могут включать в себя более 26 нуклеотидов, например, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или даже 60 нуклеотидов, при условии, что более длинная siRNA сохраняет способность опосредовать RNAi или трансляционную репрессию при отсутствии дополнительного процессинга, например, ферментативного процессинга, в короткие siRNA. siRNA могут представлять собой молекулы одноцепочечной РНК (ss-siRNA) или молекулы двухцепочечной РНК (ds-siRNA), содержащие смысловую цепь и антисмысловую цепь, которые гибридизируются с образованием дуплексной структуры, называемой дуплексом siRNA.
В контексте настоящего описания термины «антисмысловая цепь», или «первая цепь», или «направляющая цепь» молекулы siRNA относится к цепи, которая практически комплементарна участку приблизительно из 10-50 нуклеотидов, например, приблизительно из 15-30, 16-25, 18-23 или 19-22 нуклеотидов, в мРНК гена, подвергающегося целенаправленному воздействию с целью сайленсинга. Антисмысловая цепь или первая цепь имеет последовательность, в достаточной степени комплементарную последовательности необходимой целевой мРНК для непосредственного мишень-специфического сайленсинга, например, комплементарную в достаточной степени для запуска разрушения необходимой целевой мРНК с помощью аппарата или процесса RNAi.
В контексте настоящего описания термины «смысловая цепь», или «вторая цепь», или «сопровождающая цепь» молекулы siRNA относятся к цепи, которая комплементарна антисмысловой цепи или первой цепи. Антисмысловая и смысловая цепи молекулы siRNA гибридизируются с образованием дуплексной структуры. В контексте настоящего описания «дуплекс siRNA» включает в себя цепь siRNA, характеризующуюся достаточной комплементарностью с участком приблизительно из 10-50 нуклеотидов в мРНК гена, подвергающегося целенаправленному воздействию с целью сайленсинга, и цепь siRNA, характеризующуюся достаточной комплементарностью для образования дуплекса с цепью siRNA.
В контексте настоящего описания термин «комплементарный» относится к способности полинуклеотидов к образованию пар оснований друг с другом. Пары оснований, как правило, образуются с помощью водородных связей между нуклеотидными звеньями в антипараллельных полинуклеотидных цепях. Комплементарные полинуклеотидные цепи могут образовывать пару оснований посредством образования уотсон-криковских пар (например, A с T, A с U, C с G) или любым другим способом, который обеспечивает возможность образования дуплексов. Поскольку специалисты в данной области техники осведомлены, что при использовании РНК в отличие от ДНК урацил, а не тимин является основанием, которое считается комплементарным аденозину. Тем не менее, если U обозначен в контексте настоящего изобретения, предполагается возможность замены T, если не указано иное. Полная комплементарность или 100% комплементарность относится к ситуации, в которой каждое нуклеотидное звено в одной полинуклеотидной цепи может образовать водородную связь с нуклеотидным звеном во второй полинуклеотидной цепи. Менее чем полная комплементарность относится к ситуации, в которой некоторые, но не все нуклеотидные звенья в двух цепях могут образовывать водородную связь друг с другом. Например, в случае двух последовательностей из 20 мономерных звеньев, если только две пары оснований на каждой цепи могут образовывать водородные связи друг с другом, полинуклеотидные цепи проявляют 10% комплементарность. В том же примере, если 18 пар оснований на каждой цепи могут образовывать водородные связи друг с другом, полинуклеотидные цепи проявляют 90% комплементарность.
В контексте настоящего описания термин «практически комплементарный» означает, что siRNA имеет последовательность (например, в антисмысловой цепи), которая является достаточной для связывания необходимой целевой мРНК и для запуска РНК-сайленсинга целевой мРНК.
В контексте настоящего описания «нацеливание» означает процесс конструирования и выбора последовательности нуклеиновой кислоты, которая будет гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой и индуцировать желаемый эффект.
Термин «экспрессия гена» относится к процессу, при котором последовательность нуклеиновой кислоты подвергается успешной транскрипции и, в большинстве случаев, трансляции с образованием белка или пептида. Для ясности, в случае, когда упоминается измерение «экспрессии гена», это следует понимать как означающее, что измерения могут относиться к продукту транскрипции нуклеиновой кислоты, например, РНК или мРНК, или к состоящему из аминокислот продукту трансляции, например, полипептидам или пептидам. Способы измерения количества или уровней РНК, мРНК, полипептидов и пептидов хорошо известны в уровне техники.
В контексте настоящего описания термин «мутация» относится к любому изменению структуры гена, приводящему в результате к вариантной (также называемой «мутантной») форме, которая может передаваться дальнейшим поколениям. Мутации в гене могут быть вызваны изменением отдельных оснований в ДНК, или делецией, вставкой или перегруппировкой более крупных участков генов или хромосом.
В контексте настоящего описания термин «вектор» означает любую молекулу или фрагмент, который транспортирует, трансдуцирует или иным образом действует как носитель гетерологичной молекулы, такой как молекула siRNA согласно настоящему изобретению. «Вирусный вектор» представляет собой вектор, который содержит один или более полинуклеотидных участков, кодирующих или содержащих молекулу, представляющую интерес, например, трансген, полинуклеотид, кодирующий полипептид или несколько полипептидов, или модулирующую нуклеиновую кислоту, такую как малая интерферирующая РНК (siRNA). Вирусные векторы обычно используются для доставки генетических материалов в клетки. Вирусные векторы часто модифицируют для конкретных применений. Типы вирусных векторов включают векторы на основе ретровируса, векторы на основе лентивируса, векторы на основе аденовируса и векторы на основе аденоассоциированного вируса.
Термины «аденоассоциированный вирус», или «AAV», или «AAV-вектор», которые используются в данном документе, относятся к любому вектору, который содержит или получен из компонентов вектора на основе аденоассоциированного вируса и является подходящим для инфицирования клеток млекопитающего, предпочтительно клеток человека. Термином «AAV-вектор», как правило, обозначают вирусную частицу или вирион AAV типа, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую дуплекс siRNA. AAV-вектор может быть получен из различных серотипов, в том числе из комбинаций серотипов (т.е. «псевдотипированный» AAV), или из различных геномов (например, одноцепочечный или самокомплементарный). Кроме того, AAV-вектор может быть дефектным по репликации и/или подвергшимся целенаправленному воздействию.
Используемая в данном документе фраза «ингибирует экспрессию гена» означает, что это приводит к снижению количества продукта экспрессии гена. Продукт экспрессии может представлять собой молекулу РНК, транскрибируемую с гена (например, мРНК), или полипептид, транслируемый с мРНК, которая транскрибируется с гена. Как правило, снижение уровня мРНК приводит в результате к снижению уровня полипептида, транслируемого с нее. Уровень экспрессии можно определить с применением стандартных методик для измерения уровня мРНК или белка.
В контексте настоящего описания термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например, в исследуемой пробирке или реакционном сосуде, в клеточной культуре, в чашке Петри и т.д., а не внутри организма (например, животного, растения или микроба).
В контексте настоящего описания термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят внутри организма (например, животного, растения или микроба или в их клетке или ткани).
В контексте настоящего описания термин «модифицированный» относится к измененному состоянию или структуре молекулы согласно настоящему изобретению. Молекулы можно модифицировать разнообразными путями, в том числе химически, структурно и функционально.
В контексте настоящего описания термин «синтетический» означает полученный, приготовленный и/или произведенный руками человека. Синтез полинуклеотидов, или полипептидов, или других молекул согласно настоящему изобретению может быть химическим или ферментативным.
В контексте настоящего описания термин «трансфекция» относится к способам введения в клетку экзогенных нуклеиновых кислот. Способы трансфекции включают, без ограничения, химические способы, физическую обработку и обработку катионными липидами или смесями. Перечень средств, которые могут быть трансфицированы в клетку, является большим и включает, без ограничения, siRNA, смысловые и/или антисмысловые последовательности, ДНК, кодирующую один или более генов и организованную в экспрессионную плазмиду, белки, белковые фрагменты и т.д.
В контексте настоящего описания «нецелевой» относится к любому непредусмотренному эффекту в отношении любой одной или более мишени, гена или клеточного транскрипта.
В контексте настоящего описания фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном документе для обозначения тех соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые, по результатам тщательной клинической оценки, являются подходящими для применения в контакте с тканями человеческих организмов и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соизмеримых с разумным соотношением выгоды и риска.
В контексте настоящего описания термин «эффективное количество» средства, представляет собой такое количество, достаточное для обеспечения полезных или желаемых результатов, например, клинических результатов, и само по себе «эффективное количество» зависит от контекста, в котором это выражение употребляется. Например, в контексте введения средства, которое обеспечивает лечение ALS, эффективное количество средства представляет собой, например, количество, достаточное для осуществления лечения ALS, которое определено в данном документе, по сравнению с ответом, полученным без введения средства.
В контексте настоящего описания термин «терапевтически эффективное количество» означает количество средства, подлежащего доставке (например, нуклеиновой кислоты, лекарственного средства, терапевтического средства, диагностического средства, профилактического средства и т.д.), которое при введении субъекту, страдающему от инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния или подверженному их развитию, является достаточным для лечения, улучшения симптомов, диагностики, предупреждения и/или задержки проявления инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния.
В контексте настоящего описания термины «субъект» или «пациент» относятся к любому организму, которому можно вводить композицию в соответствии с настоящим изобретением, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целей. Типичные субъекты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, приматы, за исключением человека, такие как шимпанзе, и другие виды высших обезьян и низших обезьян, и люди) и/или растения.
В контексте настоящего описания термины «предупреждающий» или «предупреждение» относятся к задержке или препятствованию появлению, развитию или прогрессу состояния или заболевания в течение периода времени, включающего недели, месяцы или годы.
Термины «лечение» или «осуществление лечения» при использовании в данном документе относятся к применению одной или более конкретных процедур, применяемых для излечения или ослабления заболевания. В соответствии с определенными вариантами осуществления конкретная процедура представляет собой введение одного или более фармацевтических средств. В контексте настоящего изобретения конкретная процедура представляет собой введение одного или более дуплексов siRNA или кодируемой dsRNA, нацеленных на ген SOD1.
В контексте настоящего описания термины «ослабление» или «ослабляющий» относятся к снижению тяжести по меньшей мере одного показателя состояния или заболевания. Например, в контексте нейрогенеративного заболевания, ослабление включает уменьшение потери нейронов.
В контексте настоящего описания термин «введение» относится к обеспечению субъекта фармацевтическим средством или композицией.
В контексте настоящего описания термин «нейродегенерация» относится к патологическому состоянию, результатом которого является гибель нервных клеток. Большое число неврологических нарушений характеризуются нейродегенерацией как обычным патологическим состоянием. Например, все из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза (ALS) вызывают хроническую нейродегенерацию, которая характеризуется медленной прогрессирующей гибелью нервных клеток в течение периода нескольких лет, тогда как острая нейродегенерация характеризуется внезапным началом гибели нервных клеток в результате ишемии, как например, при инсульте, или травмы, как например, при травматическом повреждении головного мозга, или в результате перерезки аксона вследствие демиелинизации или травмы, например, повреждения спинного мозга или рассеянного склероза. При некоторых неврологических нарушениях дегенерируют преимущественно клетки одного типа нейронов, например, дегенерация двигательных нейронов при ALS.
ЭКВИВАЛЕНТЫ И ОБЪЕМ
Специалисты в данной области техники поймут или будут способны установить с использованием не более чем стандартного экспериментирования многие эквиваленты конкретным вариантам осуществления в соответствии с настоящим изобретением, описанным в данном документе. Не предполагается, чтобы объем настоящего изобретения ограничивался вышеизложенным описанием, вместо этого он изложен в прилагаемой формуле изобретения.
В пунктах формулы изобретения формы единственного числа, такие как «некоторый», «некий» и «данный», могут означать один или более чем один, если не указано обратное, или это иным образом очевидно из контекста. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворительными, если один, более чем один или все из членов группы присутствуют в, используются в или иным образом относятся к заданному продукту или процессу, если не указано обратное, или это иным образом очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых именно один член группы присутствует в, используется в или иным образом относится к заданному продукту или процессу. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых более чем один или все члены группы присутствуют в, используются в или иным образом относятся к заданному продукту или процессу.
Также отмечается, что термин «содержащий» предполагается открытым и позволяет, но не требует включения дополнительных элементов или стадий. Если термин «содержащий» используется в данном документе, термин «состоящий из», следовательно, также охватывается и раскрывается.
В случае, если приведены диапазоны, конечные значения включены. Более того, следует понимать, что если не указано иное, или это в иных условиях не является очевидным из контекста и понимания специалиста в данной области техники, величины, которые выражены в виде диапазонов, могут предполагать любое конкретное значение или поддиапазон в приведенных диапазонах в разных вариантах осуществления настоящего изобретения, до десятой части единицы измерения на нижней границе диапазона, если контекст явно не предписывает иное.
Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который попадает в уровень техники, может быть явно исключен из любого одного или более пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалисту в данной области техники, их можно исключить, даже если исключение явно не изложено в данном документе. Любой конкретный вариант осуществления композиций согласно настоящему изобретению (например, любой антибиотик, терапевтическое средство или активный ингредиент; любой способ получения; любой способ применения и т.д.) может быть исключен из любого одного или более пунктов формулы изобретения по любой причине, связанной или не связанной с его присутствием в уровне техники.
Следует понимать, что слова, которые использовались, представляют собой слова для описания, а не для ограничения, и что в рамках прилагаемой формулы изобретения можно выполнить изменения, не отходя от истинного объема и сущности настоящего изобретения в его широких аспектах.
Хотя настоящее изобретение было описано в некотором объеме и с некоторыми подробностями в отношении нескольких описанных вариантов осуществления, не предполагается, что оно должно ограничиваться любыми такими подробностями или вариантами осуществления или любым конкретным вариантом осуществления, а его следует толковать с учетом прилагаемой формулы изобретения для того, чтобы обеспечить наиболее широкую возможную интерпретацию таких пунктов формулы изобретения в связи с уровнем техники и, следовательно, чтобы эффективно охватить предусмотренный объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование и синтез siRNA для SOD1
Конструирование siRNA для SOD1
Конструирование siRNA выполняли для идентификации siRNA, нацеленных на ген SOD1 человека. В конструировании использовали транскрипты SOD1 для человека ((номер доступа в Genebank: NM_ 000454.4 (SEQ ID NO: 1)), яванского макака ((номер доступа в Genebank: XM_005548833.1) из собрания NCBI Refseq (выпуск 63) (SEQ ID NO: 2)) и макака-резуса (транскрипт SOD1 ENSMMUT00000002415 (SEQ ID NO: 3) из проекта Ensembl (выпуск 75)), которые описаны в таблице 2.
Таблица 2. Последовательности гена SOD1
Транскрипты SOD1 Номер доступа SEQ ID NO.
кДНК SOD1 человека (981 п.о.) NM_000454.4 1
кДНК SOD1 яванского макака (465 п.о.) XM_005548833.1 2
кДНК SOD1 макак-резуса (464 п.о.) ENSMMUT00000002415 3
Конструировали дуплексы siRNA, имеющие 100% идентичность с транскриптом SOD1 человека для положений 2-18 в антисмысловой цепи, и частичную или 100% идентичность с транскриптом SOD1 примата, помимо человека, для положений 2-18 в антисмысловой цепи. Во всех дуплексах siRNA в положении 1 в антисмысловой цепи с помощью методов генной инженерии помещали U, и в положение 19 в смысловой цепи с помощью методов генной инженерии помещали C для того, чтобы в этом положении в дуплексе не образовывалась пара.
Подбор последовательности siRNA для SOD1
Исходя из прогнозируемой селективности антисмысловой цепи в отношении генов SOD1 человека, яванского макака и макака-резуса и отсутствия совпадения затравочной последовательности в положениях 2-7 в антисмысловой цепи с последовательностями человека в miRBase20.0, всего 169 антисмысловых и 169 смысловых олигонуклеотидов, полученных из SOD1 человека, синтезировали и из них образовывали дуплексы (таблица 3). Дуплексы siRNA затем исследовали в отношении ингибирующей активности in vitro по отношению к экспрессии эндогенного гена SOD1 (уровни мРНК SOD1).
Таблица 3. Последовательности смысловой и антисмысловой цепей dsRNA для SOD1 человека
Старт ID дуплекса siRNA ID SS Последовательность смысловой цепи (5´-3´) SEQ ID NO ID AS Последовательность антисмысловой цепи (5´-3´) SEQ ID NO
26 D-2741 7414 CGGAGGUCUGGCCUAUAACdTdT 4 7415 UUUAUAGGCCAGACCUCCGdTdT 173
27 D-2742 7416 GGAGGUCUGGCCUAUAAACdTdT 5 7417 UUUUAUAGGCCAGACCUCCdTdT 174
28 D-2743 7418 GAGGUCUGGCCUAUAAAGCdTdT 6 7419 UCUUUAUAGGCCAGACCUCdTdT 175
29 D-2744 7420 AGGUCUGGCCUAUAAAGUCdTdT 7 7421 UACUUUAUAGGCCAGACCUdTdT 176
30 D-2745 7422 GGUCUGGCCUAUAAAGUACdTdT 8 7423 UUACUUUAUAGGCCAGACCdTdT 177
32 D-2746 7424 UCUGGCCUAUAAAGUAGUCdTdT 9 7425 UACUACUUUAUAGGCCAGAdTdT 178
33 D-2747 7426 CUGGCCUAUAAAGUAGUCCdTdT 10 7427 UGACUACUUUAUAGGCCAGdTdT 179
34 D-2748 7428 UGGCCUAUAAAGUAGUCGCdTdT 11 7429 UCGACUACUUUAUAGGCCAdTdT 180
35 D-2749 7430 GGCCUAUAAAGUAGUCGCCdTdT 12 7431 UGCGACUACUUUAUAGGCCdTdT 181
36 D-2750 7432 GCCUAUAAAGUAGUCGCGCdTdT 13 7433 UCGCGACUACUUUAUAGGCdTdT 182
37 D-2751 7434 CCUAUAAAGUAGUCGCGGCdTdT 14 7435 UCCGCGACUACUUUAUAGGdTdT 183
74 D-2752 7436 GUCGUAGUCUCCUGCAGCCdTdT 15 7437 UGCUGCAGGAGACUACGACdTdT 184
76 D-2753 7438 CGUAGUCUCCUGCAGCGUCdTdT 16 7439 UACGCUGCAGGAGACUACGdTdT 185
77 D-2754 7440 GUAGUCUCCUGCAGCGUCCdTdT 17 7441 UGACGCUGCAGGAGACUACdTdT 186
78 D-2755 7442 UAGUCUCCUGCAGCGUCUCdTdT 18 7443 UAGACGCUGCAGGAGACUAdTdT 187
149 D-2756 7444 AUGGCGACGAAGGCCGUGCdTdT 19 7445 UCACGGCCUUCGUCGCCAUdTdT 188
153 D-2757 7446 CGACGAAGGCCGUGUGCGCdTdT 20 7447 UCGCACACGGCCUUCGUCGdTdT 189
157 D-2758 7448 GAAGGCCGUGUGCGUGCUCdTdT 21 7449 UAGCACGCACACGGCCUUCdTdT 190
160 D-2759 7450 GGCCGUGUGCGUGCUGAACdTdT 22 7451 UUUCAGCACGCACACGGCCdTdT 191
177 D-2760 7452 AGGGCGACGGCCCAGUGCCdTdT 23 7453 UGCACUGGGCCGUCGCCCUdTdT 192
192 D-2761 7454 UGCAGGGCAUCAUCAAUUCdTdT 24 7455 UAAUUGAUGAUGCCCUGCAdTdT 193
193 D-2762 7456 GCAGGGCAUCAUCAAUUUCdTdT 25 7457 UAAAUUGAUGAUGCCCUGCdTdT 194
195 D-2763 7458 AGGGCAUCAUCAAUUUCGCdTdT 26 7459 UCGAAAUUGAUGAUGCCCUdTdT 195
196 D-2764 7460 GGGCAUCAUCAAUUUCGACdTdT 27 7461 UUCGAAAUUGAUGAUGCCCdTdT 196
197 D-2765 7462 GGCAUCAUCAAUUUCGAGCdTdT 28 7463 UCUCGAAAUUGAUGAUGCCdTdT 197
198 D-2766 7464 GCAUCAUCAAUUUCGAGCCdTdT 29 7465 UGCUCGAAAUUGAUGAUGCdTdT 198
199 D-2767 7466 CAUCAUCAAUUUCGAGCACdTdT 30 7467 UUGCUCGAAAUUGAUGAUGdTdT 199
206 D-2768 7468 AAUUUCGAGCAGAAGGAACdTdT 31 7469 UUUCCUUCUGCUCGAAAUUdTdT 200
209 D-2769 7470 UUCGAGCAGAAGGAAAGUCdTdT 32 7471 UACUUUCCUUCUGCUCGAAdTdT 201
210 D-2770 7472 UCGAGCAGAAGGAAAGUACdTdT 33 7473 UUACUUUCCUUCUGCUCGAdTdT 202
239 D-2771 7474 AAGGUGUGGGGAAGCAUUCdTdT 34 7475 UAAUGCUUCCCCACACCUUdTdT 203
241 D-2772 7476 GGUGUGGGGAAGCAUUAACdTdT 35 7477 UUUAAUGCUUCCCCACACCdTdT 204
261 D-2773 7478 GACUGACUGAAGGCCUGCCdTdT 36 7479 UGCAGGCCUUCAGUCAGUCdTdT 205
263 D-2774 7480 CUGACUGAAGGCCUGCAUCdTdT 37 7481 UAUGCAGGCCUUCAGUCAGdTdT 206
264 D-2775 7482 UGACUGAAGGCCUGCAUGCdTdT 38 7483 UCAUGCAGGCCUUCAGUCAdTdT 207
268 D-2776 7484 UGAAGGCCUGCAUGGAUUCdTdT 39 7485 UAAUCCAUGCAGGCCUUCAdTdT 208
269 D-2777 7486 GAAGGCCUGCAUGGAUUCCdTdT 40 7487 UGAAUCCAUGCAGGCCUUCdTdT 209
276 D-2778 7488 UGCAUGGAUUCCAUGUUCCdTdT 41 7489 UGAACAUGGAAUCCAUGCAdTdT 210
278 D-2779 7490 CAUGGAUUCCAUGUUCAUCdTdT 42 7491 UAUGAACAUGGAAUCCAUGdTdT 211
281 D-2780 7492 GGAUUCCAUGUUCAUGAGCdTdT 43 7493 UCUCAUGAACAUGGAAUCCdTdT 212
284 D-2781 7494 UUCCAUGUUCAUGAGUUUCdTdT 44 7495 UAAACUCAUGAACAUGGAAdTdT 213
290 D-2782 7496 GUUCAUGAGUUUGGAGAUCdTdT 45 7497 UAUCUCCAAACUCAUGAACdTdT 214
291 D-2783 7498 UUCAUGAGUUUGGAGAUACdTdT 46 7499 UUAUCUCCAAACUCAUGAAdTdT 215
295 D-2784 7500 UGAGUUUGGAGAUAAUACCdTdT 47 7501 UGUAUUAUCUCCAAACUCAdTdT 216
296 D-2785 7502 GAGUUUGGAGAUAAUACACdTdT 48 7503 UUGUAUUAUCUCCAAACUCdTdT 217
316 D-2786 7504 AGGCUGUACCAGUGCAGGCdTdT 49 7505 UCCUGCACUGGUACAGCCUdTdT 218
317 D-2787 7506 GGCUGUACCAGUGCAGGUCdTdT 50 7507 UACCUGCACUGGUACAGCCdTdT 219
329 D-2788 7508 GCAGGUCCUCACUUUAAUCdTdT 51 7509 UAUUAAAGUGAGGACCUGCdTdT 220
330 D-2789 7510 CAGGUCCUCACUUUAAUCCdTdT 52 7511 UGAUUAAAGUGAGGACCUGdTdT 221
337 D-2790 7512 UCACUUUAAUCCUCUAUCCdTdT 53 7513 UGAUAGAGGAUUAAAGUGAdTdT 222
350 D-2791 7514 CUAUCCAGAAAACACGGUCdTdT 54 7515 UACCGUGUUUUCUGGAUAGdTdT 223
351 D-2792 7516 UAUCCAGAAAACACGGUGCdTdT 55 7517 UCACCGUGUUUUCUGGAUAdTdT 224
352 D-2793 7518 AUCCAGAAAACACGGUGGCdTdT 56 7519 UCCACCGUGUUUUCUGGAUdTdT 225
354 D-2794 7520 CCAGAAAACACGGUGGGCCdTdT 57 7521 UGCCCACCGUGUUUUCUGGdTdT 226
357 D-2795 7522 GAAAACACGGUGGGCCAACdTdT 58 7523 UUUGGCCCACCGUGUUUUCdTdT 227
358 D-2796 7524 AAAACACGGUGGGCCAAACdTdT 59 7525 UUUUGGCCCACCGUGUUUUdTdT 228
364 D-2797 7526 CGGUGGGCCAAAGGAUGACdTdT 60 7527 UUCAUCCUUUGGCCCACCGdTdT 229
375 D-2798 7528 AGGAUGAAGAGAGGCAUGCdTdT 61 7529 UCAUGCCUCUCUUCAUCCUdTdT 230
378 D-2799 7530 AUGAAGAGAGGCAUGUUGCdTdT 62 7531 UCAACAUGCCUCUCUUCAUdTdT 231
383 D-2800 7532 GAGAGGCAUGUUGGAGACCdTdT 63 7533 UGUCUCCAACAUGCCUCUCdTdT 232
384 D-2801 7534 AGAGGCAUGUUGGAGACUCdTdT 64 7535 UAGUCUCCAACAUGCCUCUdTdT 233
390 D-2802 7536 AUGUUGGAGACUUGGGCACdTdT 65 7537 UUGCCCAAGUCUCCAACAUdTdT 234
392 D-2803 7538 GUUGGAGACUUGGGCAAUCdTdT 66 7539 UAUUGCCCAAGUCUCCAACdTdT 235
395 D-2804 7540 GGAGACUUGGGCAAUGUGCdTdT 67 7541 UCACAUUGCCCAAGUCUCCdTdT 236
404 D-2805 7542 GGCAAUGUGACUGCUGACCdTdT 68 7543 UGUCAGCAGUCACAUUGCCdTdT 237
406 D-2806 7544 CAAUGUGACUGCUGACAACdTdT 69 7545 UUUGUCAGCAGUCACAUUGdTdT 238
417 D-2807 7546 CUGACAAAGAUGGUGUGGCdTdT 70 7547 UCCACACCAUCUUUGUCAGdTdT 239
418 D-2808 7548 UGACAAAGAUGGUGUGGCCdTdT 71 7549 UGCCACACCAUCUUUGUCAdTdT 240
469 D-2809 7550 CUCAGGAGACCAUUGCAUCdTdT 72 7551 UAUGCAAUGGUCUCCUGAGdTdT 241
470 D-2810 7552 UCAGGAGACCAUUGCAUCCdTdT 73 7553 UGAUGCAAUGGUCUCCUGAdTdT 242
475 D-2811 7554 AGACCAUUGCAUCAUUGGCdTdT 74 7555 UCCAAUGAUGCAAUGGUCUdTdT 243
476 D-2812 7556 GACCAUUGCAUCAUUGGCCdTdT 75 7557 UGCCAAUGAUGCAAUGGUCdTdT 244
480 D-2813 7558 AUUGCAUCAUUGGCCGCACdTdT 76 7559 UUGCGGCCAAUGAUGCAAUdTdT 245
487 D-2814 7560 CAUUGGCCGCACACUGGUCdTdT 77 7561 UACCAGUGUGCGGCCAAUGdTdT 246
494 D-2815 7562 CGCACACUGGUGGUCCAUCdTdT 78 7563 UAUGGACCACCAGUGUGCGdTdT 247
496 D-2816 7564 CACACUGGUGGUCCAUGACdTdT 79 7565 UUCAUGGACCACCAGUGUGdTdT 248
497 D-2817 7566 ACACUGGUGGUCCAUGAACdTdT 80 7567 UUUCAUGGACCACCAGUGUdTdT 249
501 D-2818 7568 UGGUGGUCCAUGAAAAAGCdTdT 81 7569 UCUUUUUCAUGGACCACCAdTdT 250
504 D-2819 7570 UGGUCCAUGAAAAAGCAGCdTdT 82 7571 UCUGCUUUUUCAUGGACCAdTdT 251
515 D-2820 7572 AAAGCAGAUGACUUGGGCCdTdT 83 7573 UGCCCAAGUCAUCUGCUUUdTdT 252
518 D-2821 7574 GCAGAUGACUUGGGCAAACdTdT 84 7575 UUUUGCCCAAGUCAUCUGCdTdT 253
522 D-2822 7576 AUGACUUGGGCAAAGGUGCdTdT 85 7577 UCACCUUUGCCCAAGUCAUdTdT 254
523 D-2823 7578 UGACUUGGGCAAAGGUGGCdTdT 86 7579 UCCACCUUUGCCCAAGUCAdTdT 255
524 D-2824 7580 GACUUGGGCAAAGGUGGACdTdT 87 7581 UUCCACCUUUGCCCAAGUCdTdT 256
552 D-2825 7582 GUACAAAGACAGGAAACGCdTdT 88 7583 UCGUUUCCUGUCUUUGUACdTdT 257
554 D-2826 7584 ACAAAGACAGGAAACGCUCdTdT 89 7585 UAGCGUUUCCUGUCUUUGUdTdT 258
555 D-2827 7586 CAAAGACAGGAAACGCUGCdTdT 90 7587 UCAGCGUUUCCUGUCUUUGdTdT 259
562 D-2828 7588 AGGAAACGCUGGAAGUCGCdTdT 91 7589 UCGACUUCCAGCGUUUCCUdTdT 260
576 D-2829 7590 GUCGUUUGGCUUGUGGUGCdTdT 92 7591 UCACCACAAGCCAAACGACdTdT 261
577 D-2830 7592 UCGUUUGGCUUGUGGUGUCdTdT 93 7593 UACACCACAAGCCAAACGAdTdT 262
578 D-2831 7594 CGUUUGGCUUGUGGUGUACdTdT 94 7595 UUACACCACAAGCCAAACGdTdT 263
579 D-2832 7596 GUUUGGCUUGUGGUGUAACdTdT 95 7597 UUUACACCACAAGCCAAACdTdT 264
581 D-2833 7598 UUGGCUUGUGGUGUAAUUCdTdT 96 7599 UAAUUACACCACAAGCCAAdTdT 265
583 D-2834 7600 GGCUUGUGGUGUAAUUGGCdTdT 97 7601 UCCAAUUACACCACAAGCCdTdT 266
584 D-2835 7602 GCUUGUGGUGUAAUUGGGCdTdT 98 7603 UCCCAAUUACACCACAAGCdTdT 267
585 D-2836 7604 CUUGUGGUGUAAUUGGGACdTdT 99 7605 UUCCCAAUUACACCACAAGdTdT 268
587 D-2837 7606 UGUGGUGUAAUUGGGAUCCdTdT 100 7607 UGAUCCCAAUUACACCACAdTdT 269
588 D-2838 7608 GUGGUGUAAUUGGGAUCGCdTdT 101 7609 UCGAUCCCAAUUACACCACdTdT 270
589 D-2839 7610 UGGUGUAAUUGGGAUCGCCdTdT 102 7611 UGCGAUCCCAAUUACACCAdTdT 271
593 D-2840 7612 GUAAUUGGGAUCGCCCAACdTdT 103 7613 UUUGGGCGAUCCCAAUUACdTdT 272
594 D-2841 7614 UAAUUGGGAUCGCCCAAUCdTdT 104 7615 UAUUGGGCGAUCCCAAUUAdTdT 273
595 D-2842 7616 AAUUGGGAUCGCCCAAUACdTdT 105 7617 UUAUUGGGCGAUCCCAAUUdTdT 274
596 D-2843 7618 AUUGGGAUCGCCCAAUAACdTdT 106 7619 UUUAUUGGGCGAUCCCAAUdTdT 275
597 D-2844 7620 UUGGGAUCGCCCAAUAAACdTdT 107 7621 UUUUAUUGGGCGAUCCCAAdTdT 276
598 D-2845 7622 UGGGAUCGCCCAAUAAACCdTdT 108 7623 UGUUUAUUGGGCGAUCCCAdTdT 277
599 D-2846 7624 GGGAUCGCCCAAUAAACACdTdT 109 7625 UUGUUUAUUGGGCGAUCCCdTdT 278
602 D-2847 7626 AUCGCCCAAUAAACAUUCCdTdT 110 7627 UGAAUGUUUAUUGGGCGAUdTdT 279
607 D-2848 7628 CCAAUAAACAUUCCCUUGCdTdT 111 7629 UCAAGGGAAUGUUUAUUGGdTdT 280
608 D-2849 7630 CAAUAAACAUUCCCUUGGCdTdT 112 7631 UCCAAGGGAAUGUUUAUUGdTdT 281
609 D-2850 7632 AAUAAACAUUCCCUUGGACdTdT 113 7633 UUCCAAGGGAAUGUUUAUUdTdT 282
610 D-2851 7634 AUAAACAUUCCCUUGGAUCdTdT 114 7635 UAUCCAAGGGAAUGUUUAUdTdT 283
611 D-2852 7636 UAAACAUUCCCUUGGAUGCdTdT 115 7637 UCAUCCAAGGGAAUGUUUAdTdT 284
612 D-2853 7638 AAACAUUCCCUUGGAUGUCdTdT 116 7639 UACAUCCAAGGGAAUGUUUdTdT 285
613 D-2854 7640 AACAUUCCCUUGGAUGUACdTdT 117 7641 UUACAUCCAAGGGAAUGUUdTdT 286
616 D-2855 7642 AUUCCCUUGGAUGUAGUCCdTdT 118 7643 UGACUACAUCCAAGGGAAUdTdT 287
621 D-2856 7644 CUUGGAUGUAGUCUGAGGCdTdT 119 7645 UCCUCAGACUACAUCCAAGdTdT 288
633 D-2857 7646 CUGAGGCCCCUUAACUCACdTdT 120 7647 UUGAGUUAAGGGGCCUCAGdTdT 289
635 D-2858 7648 GAGGCCCCUUAACUCAUCCdTdT 121 7649 UGAUGAGUUAAGGGGCCUCdTdT 290
636 D-2859 7650 AGGCCCCUUAACUCAUCUCdTdT 122 7651 UAGAUGAGUUAAGGGGCCUdTdT 291
639 D-2860 7652 CCCCUUAACUCAUCUGUUCdTdT 123 7653 UAACAGAUGAGUUAAGGGGdTdT 292
640 D-2861 7654 CCCUUAACUCAUCUGUUACdTdT 124 7655 UUAACAGAUGAGUUAAGGGdTdT 293
641 D-2862 7656 CCUUAACUCAUCUGUUAUCdTdT 125 7657 UAUAACAGAUGAGUUAAGGdTdT 294
642 D-2863 7658 CUUAACUCAUCUGUUAUCCdTdT 126 7659 UGAUAACAGAUGAGUUAAGdTdT 295
643 D-2864 7660 UUAACUCAUCUGUUAUCCCdTdT 127 7661 UGGAUAACAGAUGAGUUAAdTdT 296
644 D-2865 7662 UAACUCAUCUGUUAUCCUCdTdT 128 7663 UAGGAUAACAGAUGAGUUAdTdT 297
645 D-2866 7664 AACUCAUCUGUUAUCCUGCdTdT 129 7665 UCAGGAUAACAGAUGAGUUdTdT 298
654 D-2867 7666 GUUAUCCUGCUAGCUGUACdTdT 130 7667 UUACAGCUAGCAGGAUAACdTdT 299
660 D-2868 7668 CUGCUAGCUGUAGAAAUGCdTdT 131 7669 UCAUUUCUACAGCUAGCAGdTdT 300
661 D-2869 7670 UGCUAGCUGUAGAAAUGUCdTdT 132 7671 UACAUUUCUACAGCUAGCAdTdT 301
666 D-2870 7672 GCUGUAGAAAUGUAUCCUCdTdT 133 7673 UAGGAUACAUUUCUACAGCdTdT 302
667 D-2871 7674 CUGUAGAAAUGUAUCCUGCdTdT 134 7675 UCAGGAUACAUUUCUACAGdTdT 303
668 D-2872 7676 UGUAGAAAUGUAUCCUGACdTdT 135 7677 UUCAGGAUACAUUUCUACAdTdT 304
669 D-2873 7678 GUAGAAAUGUAUCCUGAUCdTdT 136 7679 UAUCAGGAUACAUUUCUACdTdT 305
673 D-2874 7680 AAAUGUAUCCUGAUAAACCdTdT 137 7681 UGUUUAUCAGGAUACAUUUdTdT 306
677 D-2875 7682 GUAUCCUGAUAAACAUUACdTdT 138 7683 UUAAUGUUUAUCAGGAUACdTdT 307
692 D-2876 7684 UUAAACACUGUAAUCUUACdTdT 139 7685 UUAAGAUUACAGUGUUUAAdTdT 308
698 D-2877 7686 ACUGUAAUCUUAAAAGUGCdTdT 140 7687 UCACUUUUAAGAUUACAGUdTdT 309
699 D-2878 7688 CUGUAAUCUUAAAAGUGUCdTdT 141 7689 UACACUUUUAAGAUUACAGdTdT 310
700 D-2879 7690 UGUAAUCUUAAAAGUGUACdTdT 142 7691 UUACACUUUUAAGAUUACAdTdT 311
701 D-2880 7692 GUAAUCUUAAAAGUGUAACdTdT 143 7693 UUUACACUUUUAAGAUUACdTdT 312
706 D-2881 7694 CUUAAAAGUGUAAUUGUGCdTdT 144 7695 UCACAAUUACACUUUUAAGdTdT 313
749 D-2882 7696 UACCUGUAGUGAGAAACUCdTdT 145 7697 UAGUUUCUCACUACAGGUAdTdT 314
770 D-2883 7698 UUAUGAUCACUUGGAAGACdTdT 146 7699 UUCUUCCAAGUGAUCAUAAdTdT 315
772 D-2884 7700 AUGAUCACUUGGAAGAUUCdTdT 147 7701 UAAUCUUCCAAGUGAUCAUdTdT 316
775 D-2885 7702 AUCACUUGGAAGAUUUGUCdTdT 148 7703 UACAAAUCUUCCAAGUGAUdTdT 317
781 D-2886 7704 UGGAAGAUUUGUAUAGUUCdTdT 149 7705 UAACUAUACAAAUCUUCCAdTdT 318
800 D-2887 7706 UAUAAAACUCAGUUAAAACdTdT 150 7707 UUUUUAACUGAGUUUUAUAdTdT 319
804 D-2888 7708 AAACUCAGUUAAAAUGUCCdTdT 151 7709 UGACAUUUUAACUGAGUUUdTdT 320
819 D-2889 7710 GUCUGUUUCAAUGACCUGCdTdT 152 7711 UCAGGUCAUUGAAACAGACdTdT 321
829 D-2890 7712 AUGACCUGUAUUUUGCCACdTdT 153 7713 UUGGCAAAAUACAGGUCAUdTdT 322
832 D-2891 7714 ACCUGUAUUUUGCCAGACCdTdT 154 7715 UGUCUGGCAAAAUACAGGUdTdT 323
833 D-2892 7716 CCUGUAUUUUGCCAGACUCdTdT 155 7717 UAGUCUGGCAAAAUACAGGdTdT 324
851 D-2893 7718 UAAAUCACAGAUGGGUAUCdTdT 156 7719 UAUACCCAUCUGUGAUUUAdTdT 325
854 D-2894 7720 AUCACAGAUGGGUAUUAACdTdT 157 7721 UUUAAUACCCAUCUGUGAUdTdT 326
855 D-2895 7722 UCACAGAUGGGUAUUAAACdTdT 158 7723 UUUUAAUACCCAUCUGUGAdTdT 327
857 D-2896 7724 ACAGAUGGGUAUUAAACUCdTdT 159 7725 UAGUUUAAUACCCAUCUGUdTdT 328
858 D-2897 7726 CAGAUGGGUAUUAAACUUCdTdT 160 7727 UAAGUUUAAUACCCAUCUGdTdT 329
859 D-2898 7728 AGAUGGGUAUUAAACUUGCdTdT 161 7729 UCAAGUUUAAUACCCAUCUdTdT 330
861 D-2899 7730 AUGGGUAUUAAACUUGUCCdTdT 162 7731 UGACAAGUUUAAUACCCAUdTdT 331
869 D-2900 7732 UAAACUUGUCAGAAUUUCCdTdT 163 7733 UGAAAUUCUGACAAGUUUAdTdT 332
891 D-2901 7734 UCAUUCAAGCCUGUGAAUCdTdT 164 7735 UAUUCACAGGCUUGAAUGAdTdT 333
892 D-2902 7736 CAUUCAAGCCUGUGAAUACdTdT 165 7737 UUAUUCACAGGCUUGAAUGdTdT 334
906 D-2903 7738 AAUAAAAACCCUGUAUGGCdTdT 166 7739 UCCAUACAGGGUUUUUAUUdTdT 335
907 D-2904 7740 AUAAAAACCCUGUAUGGCCdTdT 167 7741 UGCCAUACAGGGUUUUUAUdTdT 336
912 D-2905 7742 AACCCUGUAUGGCACUUACdTdT 168 7743 UUAAGUGCCAUACAGGGUUdTdT 337
913 D-2906 7744 ACCCUGUAUGGCACUUAUCdTdT 169 7745 UAUAAGUGCCAUACAGGGUdTdT 338
934 D-2907 7746 GAGGCUAUUAAAAGAAUCCdTdT 170 7747 UGAUUCUUUUAAUAGCCUCdTdT 339
944 D-2908 7748 AAAGAAUCCAAAUUCAAACdTdT 171 7749 UUUUGAAUUUGGAUUCUUUdTdT 340
947 D-2909 7750 GAAUCCAAAUUCAAACUACdTdT 172 7751 UUAGUUUGAAUUUGGAUUCdTdT 341
Синтез siRNA для SOD1
Олигорибонуклеотиды собирали на синтезаторе ABI 3900 (Applied Biosystems) в соответствии с фосфорамидитным химическим процессом олигомеризации. Твердая подложка представляла собой полистрирол, нагруженный 2ʹ-дезокси-тимидином (приобретен у Glen Research, Серлинг, Виргиния, США), с получением масштаба синтеза 0,2 мкмоля. Вспомогательные реактивы для синтеза, фосфорамидиты ДНК и РНК, получали от SAFC Proligo (Гамбург, Германия). В частности, 5ʹ-O-(4,4ʹ-диметокситритил)-3ʹ-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропил)фосфорамидитные мономеры уридина (U), тимидина (dT), 4-N-ацетилцитидина (CAc), 6-N-бензоиладенозина (Abz) и 2-N-изобутилгуанозина (GiBu) с 2ʹ-O-t-бутилдиметилсилилом использовали для построения последовательности олигомеров(13). Время связывания для всех фосфорамидитов (70 мМ в ацетонитриле) составляло 3 мин. При использовании 5-этилтио-1H-тетразола (ETT) в качестве активатора (0,5 М в ацетонитриле). Последовательности синтезировали с удалением конечной диметокситритильной защитной группы на синтезаторе (синтез «с удалением DMT»). По завершении твердофазного синтеза олигорибонуклеотиды отщепляли от твердой подложки и удаляли защитную группу с использованием смеси 1:1 (об./об.) водного метиламина (40%) и метиламина в этаноле (33%). Спустя 90 минут при 45°C раствор разбавляли N,N-диметилформамидом (DMF) и добавляли триэтиламин-тригидрофторид (TEA.HF). После инкубирования при 45°C в течение 2 часов олигорибонуклеотиды осаждали с использованием 1 М NaOAc и смеси ацетона и этанола 4:1 (об./об.). Осадки растворяли в 1 М водном растворе NaCl и обессоливали с помощью гель-хроматографии. Это обеспечивалось применением системы очистки AKTA Purifier HPLC System (GE Healthcare, Фрайбург, Германия), оснащенной 5 мл колонкой HiTrap (GE Healthcare). Отличительные свойства олигорибонуклеотидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии с использованием MALDI или масс-спектрометрии с использованием ESI. Для получения siRNA из отдельных цепей РНК эквимолярные количества комплементарных смысловой и антисмысловой цепей смешивали и проводили их гибридизацию в 20 мМ NaCl, 4 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 6,8. siRNA хранили замороженными до применения.
Пример 2. In vitro скрининг siRNA для SOD1 в отношении супрессии мРНК SOD1 человека
siRNA, нацеленные на SOD1 человека (описаны в таблице 3) анализировали в отношении ингибирования экспрессии эндогенной SOD1 в HeLa клетках с помощью анализа с использованием bDNA (разветвленная ДНК) для количественного определения мРНК SOD1. Результаты анализов с использованием двух доз использовали для выбора подгруппы дуплексов dsRNA для SOD1 для экспериментов по определению зависимости доза-эффект у 4 типов культивируемых клеток для расчета IC50.
Клеточная культура и трансфекция
HeLa клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в среде HAM F-12 (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 10% фетальной телячьей сыворотки (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies) и 1% Pen/Strep (пенициллин/стрептомицин) (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.
Для трансфекции siRNA HeLa клетки высевали с плотностью 19000-20000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты. Трансфекцию siRNA выполняли с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen/Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Для скрининга с двумя дозами использовали концентрации siRNA для SOD1, составляющие 1 нМ или 0,1 нМ. Эксперименты по определению зависимости доза-эффект выполняли с концентрациями siRNA для SOD1, составляющими 10, 2,5, 0,6, 0,16, 0,039, 0,0098, 0,0024, 0,0006, 0,00015 и 0,000038 нМ. Контрольные лунки трансфицировали siRNA для люциферазы, siRNA для Aha-1, siRNA для PLGF или контрольной смесью неродственных siRNA.
Анализы с использованием разветвленной ДНК - QuantiGene 2.0
Спустя 24 часа инкубирования с siRNA среду удаляли и клетки лизировали в 150 мкл лизирующей смеси (1 объем лизирующей смеси, 2 объема воды, не содержащей нуклеазы), затем инкубировали при 53°C в течение 60 минут. 80 мкл рабочего набора зондов для SOD1 (целевой ген), и 90 мкл рабочего набора зондов для GAPDH (эндогенный контроль), и 20 мкл или 10 мкл клеточного лизата затем добавляли на планшеты для захвата. Планшеты для захвата инкубировали при 55°C (для SOD1) и 53°C (для GAPDH) (примерно 16-20 часов). На следующие сутки планшеты для захвата промывали 3 раза по меньшей мере 300 мкл 1X промывочного буфера (вода, не содержащая нуклеазы, компонент 1 буфера и компонент 2 промывочного буфера) (после последнего промывания переворачивали планшет и промакивали его чистыми бумажными полотенцами). 100 мкл рабочего реактива для воздействия перед амплификацией добавляли в планшеты для захвата SOD1, которые запечатывали алюминиевой фольгой и инкубировали в течение 1 часа при 55°C. Спустя 1 час инкубирования стадию промывания повторяли, затем добавляли 100 мкл рабочего реактива для амплификации как в планшеты для захвата SOD1, так и GAPDH. Спустя 1 час инкубирования при 55°C (SOD1) или 53°C (GAPDH) повторяли стадии промывания и высушивания и добавляли 100 мкл меченого зонда. Планшеты для захвата инкубировали при 50°C (SOD1) или 53°C (GAPDH) в течение 1 часа. Планшеты затем промывали 1X промывочным буфером и сушили, а затем 100 мкл субстрата добавляли в планшеты для захвата. Люминисценцию считывали с использованием люминесцентного счетчика 1420 Luminescence Counter (WALLAC VICTOR Light, Perkin Elmer, Родгау-Югесхайм, Германия) после 30 минут инкубирования в темноте.
Анализ данных, полученных с помощью bDNA
Для каждой siRNA для SOD1 или контрольной siRNA трансфицировали четыре лунки в параллели, и отдельные экспериментальные точки собирали из каждой лунки. Для каждой лунки уровень мРНК SOD1 нормализовали к уровню мРНК GAPDH. Активность заданной siRNA для SOD1 выражали в процентах концентрации мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH) в обработанных клетках в сравнении с концентрацией мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH), усредненной по контрольным лункам.
В таблице 4 представлены результаты in vitro скрининга HeLa, при котором siRNA для SOD1, последовательности которых приведены в таблице 3, исследовались в концентрациях либо 1 нМ, либо 0,1 нМ. Среднее процентное содержание мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH), оставшейся в обработанных клетках в сравнении с контролями, а также стандартное отклонение, показаны в таблице 4 для каждой siRNA для SOD1. Ряд siRNA для SOD1 в концентрации 1 нМ были эффективны при снижении уровней мРНК SOD1 более чем на 80% в HeLa клетках. Более того, ряд siRNA для SOD1 в концентрации 0,1 нМ были эффективны при снижении уровней мРНК SOD1 более чем на 80% в HeLa клетках.
Таблица 4. Результаты in vitro скрининга с двумя дозами siRNA для SOD1 в HeLa клетках в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1
ID дуплекса siRNA Оставшаяся мРНК SOD1 [% от контроля] через 24 часа после воздействия 1 нМ siRNA для SOD1 SD [%] Оставшаяся мРНК SOD1 [% от контроля] через 24 часа после воздействия 0,1 нМ siRNA для SOD1 SD [%]
D-2741 87.2 2.7 70.6 3
D-2742 86.9 4.3 79.5 8.5
D-2743 89.6 3.6 80.6 8.8
D-2744 83.8 7.2 75.9 8.5
D-2745 95.1 9.1 84.1 6.8
D-2746 111.3 3.6 92.0 7.2
D-2747 100.0 6.1 92.9 4.4
D-2748 100.4 3.1 91.6 12
D-2749 87.1 2.9 96.4 13
D-2750 94.2 7.1 93.1 8
D-2751 85.4 7.2 96.1 8
D-2752 27.2 3.6 70.2 6.5
D-2753 25.5 4.8 67.5 4.5
D-2754 23.2 4 70.2 2.3
D-2755 36.6 3.7 75.5 11
D-2756 9.1 0.7 29.2 2.6
D-2757 3.9 0.6 9.0 1.8
D-2758 6.4 1.1 13.9 2.8
D-2759 6.7 1.1 14.1 1
D-2760 32.3 3.4 61.9 8.8
D-2761 12.9 3.6 41.7 8.3
D-2762 16.9 2.6 41.2 10
D-2763 5.7 1.3 10.5 3.4
D-2764 9.2 2.7 19.5 4.9
D-2765 13.6 1.9 29.4 8.8
D-2766 8.7 1.1 28.1 6.6
D-2767 10.4 1.6 24.7 5.9
D-2768 13.0 1.4 27.7 7.3
D-2769 25.3 1.9 57.4 7.5
D-2770 14.9 1.6 35.5 4.4
D-2771 11.4 1.8 32.6 8.6
D-2772 10.6 1.3 27.9 4.7
D-2773 14.3 1.4 35.7 3.1
D-2774 7.1 1.3 23.0 1.5
D-2775 9.8 0.9 31.3 3.3
D-2776 11.1 2.9 31.3 5.3
D-2777 47.8 5.5 80.9 4.6
D-2778 7.4 0.6 26.5 4.2
D-2779 7.9 0.6 17.9 3
D-2780 12.5 1.3 31.7 5.6
D-2781 16.3 2.3 39.1 8
D-2782 10.2 3.1 25.4 3
D-2783 13.5 3.5 33.4 6.5
D-2784 12.3 2.5 36.3 5.4
D-2785 14.6 3 30.5 7.4
D-2786 16.2 3.5 42.6 8
D-2787 14.4 4.2 37.3 6.5
D-2788 9.8 3 21.6 6.6
D-2789 18.5 5.9 48.9 12
D-2790 11.6 3.8 28.1 5.6
D-2791 8.9 1.8 26.6 5.6
D-2792 8.1 1.4 25.6 5.3
D-2793 9.3 1.6 26.6 3
D-2794 8.9 1.9 25.8 4.2
D-2795 22.6 3.4 59.5 9.9
D-2796 15.1 0.7 43.0 1.9
D-2797 21.1 2.5 43.0 1.3
D-2798 10.4 1.2 28.0 5.1
D-2799 11.0 1.2 29.8 3.3
D-2800 21.3 2.4 52.4 4.7
D-2801 12.3 3.3 28.7 4
D-2802 8.4 1.8 18.8 3.7
D-2803 5.9 1 12.1 4.1
D-2804 11.8 1.6 28.9 7.5
D-2805 13.5 2.6 34.5 7.5
D-2806 5.5 1.1 10.4 2.5
D-2807 8.5 1.3 24.2 6.6
D-2808 9.5 1.5 26.0 1.4
D-2809 7.5 0.9 17.7 2.8
D-2810 12.1 2 43.1 8.3
D-2811 5.6 0.8 16.7 7
D-2812 14.2 1.4 42.5 8.2
D-2813 29.0 3.4 66.7 13
D-2814 35.7 3.5 73.4 15
D-2815 30.3 1.9 74.3 12
D-2816 14.6 2.1 47.2 5.1
D-2817 27.5 1.8 70.5 6.6
D-2818 9.6 0.8 32.9 7.2
D-2819 9.0 0.8 29.1 3
D-2820 10.8 1.4 38.7 3.5
D-2821 5.8 0.4 19.4 6.1
D-2822 10.5 2.5 46.3 6.8
D-2823 3.5 1.1 18.8 3.5
D-2824 9.9 3.2 43.8 0.8
D-2825 6.6 2.6 29.7 1.1
D-2826 8.0 1.9 40.6 7.2
D-2827 7.0 1.2 25.2 4.5
D-2828 6.4 2.2 22.4 1.7
D-2829 14.8 2.7 45.5 7.4
D-2830 9.4 2 28.5 6.5
D-2831 8.6 2.8 28.4 6.6
D-2832 12.3 3.2 43.4 3.2
D-2833 20.5 5.2 66.7 9.1
D-2834 10.7 2.5 35.9 2.2
D-2835 11.6 2.4 37.7 4
D-2836 24.1 3.3 57.0 4.2
D-2837 98.7 12 96.7 4.3
D-2838 20.5 4 49.5 1.4
D-2839 10.0 2.4 31.9 4.3
D-2840 50.2 8.3 89.2 7.4
D-2841 70.8 11 87.1 7.9
D-2842 79.7 21 90.9 3.6
D-2843 24.2 1.2 57.2 8.4
D-2844 21.5 6.4 51.4 1
D-2845 12.9 2.2 39.4 7.3
D-2846 10.2 2.6 30.5 2.6
D-2847 40.5 9.7 70.0 6.5
D-2848 41.8 7 63.7 6
D-2849 24.7 6.8 51.3 8.1
D-2850 79.4 7.5 76.5 16
D-2851 28.1 6.5 72.0 8.8
D-2852 13.8 2.1 56.9 4.8
D-2853 32.1 9.5 72.2 12
D-2854 21.5 3.9 58.8 10
D-2855 39.8 10 75.4 5.5
D-2856 14.4 3.4 40.4 5.8
D-2857 8.6 1 18.4 4.5
D-2858 10.1 1.1 19.1 4.8
D-2859 10.9 1.3 20.9 5.4
D-2860 7.4 1.3 11.7 3.8
D-2861 5.0 1.4 12.6 2.6
D-2862 5.5 1 13.8 2.7
D-2863 8.2 1.3 26.5 4.3
D-2864 9.1 1.6 40.2 3.4
D-2865 6.3 0.6 22.8 3.4
D-2866 7.0 1.7 17.8 4.3
D-2867 9.3 0.8 31.7 6.2
D-2868 10.3 2.5 30.8 6.5
D-2869 9.4 4.3 34.7 4.6
D-2870 5.9 0.6 18.1 2.6
D-2871 6.5 1.1 13.5 1.5
D-2872 10.5 1 31.3 5.3
D-2873 7.0 1.1 20.8 3.7
D-2874 9.4 2.4 35.3 5.7
D-2875 5.4 1.1 13.5 2.4
D-2876 14.1 4.6 45.9 5.2
D-2877 64.5 9.8 64.0 9
D-2878 57.0 14 62.9 8.1
D-2879 71.4 12 79.4 8.6
D-2880 79.7 11 100.9 4.9
D-2881 72.8 12 82.8 5.6
D-2882 64.4 8.8 73.2 6.9
D-2883 80.1 4.9 86.3 13
D-2884 69.6 5.8 74.2 13
D-2885 76.9 2 76.7 18
D-2886 74.0 0.7 80.4 3.4
D-2887 77.7 8.7 88.6 16
D-2888 70.3 5.1 66.2 2.2
D-2889 71.2 3 67.3 7.3
D-2890 75.3 7.9 71.2 6.4
D-2891 74.6 8.4 72.4 4.3
D-2892 72.5 6.9 71.6 5.7
D-2893 73.9 3.8 83.7 2.9
D-2894 66.9 5.7 72.4 4.9
D-2895 71.6 8.9 72.1 9
D-2896 71.0 5.6 74.4 1.3
D-2897 74.4 7.9 78.0 3.8
D-2898 74.0 5.8 73.5 1.6
D-2899 71.0 10 74.1 9.7
D-2900 71.3 4.1 77.8 5.8
D-2901 64.8 9.4 82.0 11
D-2902 53.6 5.2 82.7 15
D-2903 66.8 2.6 101.1 13
D-2904 62.6 7.8 87.5 20
D-2905 67.1 14 74.0 4.1
D-2906 64.0 3.2 73.9 12
D-2907 66.4 7.3 82.0 11
D-2908 72.6 20 85.2 23
D-2909 80.0 7.3 77.2 12
Двенадцать наиболее активных siRNA для SOD1 в концентрации 0,1 нМ в HeLa клетках оценивали в экспериментах по определению зависимости доза-эффект. В таблице 5 представлены концентрации IC50, приводящие в результате к 50% супрессии мРНК SOD1 относительно контроля для этих двенадцати выбранных siRNA для SOD1 в HeLa клетках. Эти двенадцать siRNA для SOD1 были особенно сильнодействующими в этой экспериментальной системе, и проявляли значения IC50 от 1 до 8 pM.
Таблица 5. Результаты IC50 in vitro анализа siRNA для SOD1 в HeLa клетках в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1
ID дуплекса siRNA Среднее значение IC50 (пМ)
D-2757 1
D-2806 4
D-2860 2
D-2861 2
D-2875 4
D-2871 5
D-2758 5
D-2759 5
D-2866 4
D-2870 4
D-2823 6
D-2858 8
Данные определения зависимости доза-эффект от HeLa клеток, используемые для определения IC50 для этих двенадцати siRNA для SOD1, подробно представлены ниже в таблице 6. Все двенадцать siRNA, как было определено, имели IC50 порядка пМ в HeLa клетках. Данные IC50 для siRNA для SOD1 в таблице 5 представляют собой обобщение данных, представленных в таблице 6 ниже.
Таблица 6. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в HeLa клетках
Оставшаяся мРНК SOD1 (% от контроля)
ID дуплекса siRNA 10
нМ		 2.5
нМ		 0.6
нМ		 0.16
нМ		 0.039
нМ		 0.0098
нМ		 0.0024
нМ		 0.0006
нМ		 0.00015
нМ		 0.000038
нМ		 IC50
(нМ)
D-2757 2 2 2 3 6 16 33 57 77 86 0.001
D-2806 2 3 3 6 13 32 59 83 90 105 0.004
D-2860 5 5 5 6 10 22 50 68 87 92 0.002
D-2861 4 4 4 5 10 25 51 73 81 92 0.002
D-2875 4 4 4 7 15 34 62 78 82 92 0.004
D-2871 4 5 4 8 18 43 62 78 87 90 0.005
D-2758 5 5 5 9 17 41 70 81 97 111 0.005
D-2759 4 4 4 7 15 35 63 82 87 94 0.005
D-2866 3 3 4 8 17 39 54 79 80 76 0.004
D-2870 4 5 5 8 18 41 59 77 93 101 0.004
D-2823 3 3 4 7 20 42 65 81 86 92 0.006
D-2858 5 5 5 9 21 46 72 82 88 94 0.008
Пример 3. In vitro скрининг выбранных siRNA для SOD1 в отношении экспрессии эндогенной мРНК SOD1 в SH-SY5Y клетках, U87 клетках и первичных астроцитах человека
SH-SY5Y клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в среде MEM в модификации Дульбекко (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 15% FCS (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies), 1% L-глутамина (Biochrom GmbH, Берлин, Германия) и 1% Pen/Strep (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.
U87MG клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в составленной ATCC минимальной среде Игла (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 10% FCS (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies) и 1% Pen/Strep (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.
Первичные астроциты человека получали от LONZA (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария) и культивировали в базовой среде ABM (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария), дополненной набором AGM SingleQuot Kit (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.
Трансфекцию SH-SY5Y клеток, U87MG клеток и первичных астроцитов человека двенадцатью выбранными siRNA (D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858) и количественное определение уровней мРНК SOD1 и GAPDH с использованием bDNA осуществляли аналогично тому, как описано для HeLa клеток, за исключением того, что реактивы для трансфекции представляли собой Lipofectamine2000 (Invitrogen/Life Technologies) для SH-SY5Y клеток, RNAiMAX (Invitrogen/Life Technologies) для U87 клеток и Lipofectamine2000 (Invitrogen/Life Technologies) для первичных астроцитов человека.
Данные зависимости доза-эффект от SH-SY5Y клеток, U87MG клеток и первичных астроцитов человека, используемые для определения IC50 для этих двенадцати siRNA для SOD1 (D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858), подробно представлены ниже в таблицах 7, 8 и 9, соответственно. Все двенадцать siRNA, как было определено, имели IC50 порядка пМ в U87 клетках.
Значения IC50 представлены в таблице 10. В первичных астроцитах человека IC50 были, в целом, выше, чем в SH-SY5Y и U87MG клетках.
Таблица 7. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в SH-SY5Y клетках
Оставшаяся мРНК SOD1 (% от контроля)
ID дуплек-са siRNA 10
нМ 		2.5
нМ 		0.6
нМ 		0.16
нМ 		0.039
нМ 		0.0098
нМ 		0.0024
нМ 		0.0006
нМ 		0.00015
нМ 		0.000038
нМ 		IC50 (нМ)
D-2757 8 13 16 22 36 55 72 92 107 114 0.013
D-2806 11 12 15 26 40 71 103 121 117 131 0.025
D-2860 11 15 17 26 42 63 79 86 92 96 0.022
D-2861 12 14 16 19 37 60 82 83 87 94 0.017
D-2875 20 25 35 59 79 92 96 95 99 104 0.234
D-2871 15 19 23 42 71 87 95 94 99 96 0.103
D-2758 24 35 36 58 91 96 134 123 105 94 0.369
D-2759 10 11 16 25 43 67 85 94 104 108 0.026
D-2866 17 19 24 42 72 93 93 102 103 101 0.105
D-2870 19 22 26 40 62 88 100 105 105 105 0.078
D-2823 11 16 25 47 64 84 91 98 105 95 0.099
D-2858 16 21 25 46 68 91 92 95 103 116 0.106
Таблица 8. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в U87MG клетках
Оставшаяся мРНК SOD1 (% от контроля)
ID дуплекса siRNA 10
нМ		 2.5
нМ		 0.6
нМ		 0.16
нМ		 0.039
нМ		 0.0098
нМ		 0.0024
нМ		 0.0006
нМ		 0.00015
нМ		 0.000038
нМ		 IC50 (нМ)
D-2757 3 4 3 4 5 8 19 50 86 99 0.001
D-2806 4 3 3 3 4 8 18 49 81 106 0.001
D-2860 4 4 5 5 6 8 20 46 72 93 0.001
D-2861 5 6 6 6 8 15 39 67 87 93 0.001
D-2875 4 5 5 5 6 9 19 45 76 99 0.001
D-2871 5 5 5 5 6 11 24 50 77 86 0.001
D-2758 7 9 6 7 10 25 64 99 103 112 0.004
D-2759 6 6 5 6 8 21 50 80 93 104 0.002
D-2866 4 4 4 5 8 17 38 64 86 94 0.001
D-2870 5 5 5 5 7 7 13 31 63 85 0.003
D-2823 4 4 4 4 6 13 34 61 74 94 0.001
D-2858 7 6 6 7 8 14 33 54 71 94 0.001
Таблица 9. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в первичных астроцитах человека
Оставшаяся мРНК SOD1 (% от контроля)
ID дуплекса siRNA 10
нМ		 2.5
нМ		 0.6
нМ		 0.16
нМ		 0.039
нМ		 0.0098
нМ		 0.0024
нМ		 0.0006
нМ		 0.00015
нМ		 0.000038
нМ		 IC50 (нМ)
D-2757 29 30 35 48 66 87 95 101 95 103 0.123
D-2806 26 32 35 47 63 78 87 95 95 98 0.113
D-2860 29 38 39 51 68 82 94 93 94 101 0.192
D-2861 27 33 38 47 62 73 88 93 96 102 0.114
D-2875 25 28 39 47 72 80 100 105 105 118 0.151
D-2871 25 34 42 52 63 83 97 100 97 108 0.182
D-2758 27 29 31 41 51 71 86 91 95 98 0.049
D-2759 34 39 41 53 70 83 97 101 98 103 0.219
D-2866 30 32 35 46 65 78 84 87 92 95 0.118
D-2870 34 34 38 48 71 74 82 91 92 98 0.163
D-2823 27 31 40 53 67 80 84 86 92 97 0.186
D-2858 29 30 37 55 72 91 93 100 104 104 0.197
Данные IC50 для siRNA для SOD1 в таблице 10 представляют собой обобщение данных, представленных в таблицах 7, 8 и 9.
Таблица 10. Результаты IC50 in vitro анализов siRNA для SOD1 в SH-SY5Y клетках, U87MG клетках и первичных астроцитах человека в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1
ID дуплекса siRNA SH-SY5Y
Среднее значение IC50 (пМ)		 U87MG
Среднее значение IC50 (пМ)		 Первичные астроциты человека Среднее значение IC 50 (пМ)
D-2757 13 1 123
D-2806 25 1 113
D-2860 22 1 192
D-2861 17 1 114
D-2875 234 1 151
D-2871 103 1 182
D-2758 369 4 49
D-2759 26 2 219
D-2866 105 1 118
D-2870 78 3 163
D-2823 99 1 186
D-2858 106 1 197
Пример 4. Целенаправленное воздействие siRNA на SOD1
Дуплексы из сопровождающей цепи и направляющей цепи siRNA для SOD1, оказавшиеся эффективными, встраивали в векторы экспрессии с помощью методов генной инженерии и трансфицировали в клетки центральной нервной системы или линии нервных клеток. Даже если выступающий конец, используемый в исследовании нокдауна под действием siRNA, являлся каноническим dTdT для siRNA, выступающий конец в конструкциях может содержать любой динуклеотидный выступающий конец.
Используемые клетки могут представлять собой первичные клетки, или их можно получить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS клеток).
Нокдаун SOD1 затем измеряли и осуществляли глубокое секвенирование для определения точных сопровождающей цепи и направляющей цепи, получаемых в результате процессинга из каждой конструкции, введенной в векторе экспрессии.
Соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи рассчитывали для определения эффективности нокдауна, например, обработки РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC).
N-конец секвенировали для определения сайта расщепления и для определения процента равномерного расщепления мишени. Ожидалось, что расщепление составит более 90 процентов.
HeLa клетки подвергали совместной трансфекции в параллельном исследовании для in vitro анализа нокдауна SOD1. Конструкцию для люциферазы использовали в качестве контроля для определения нецелевых эффектов.
Снова осуществляли глубокое секвенирование.
Пример 5. Последовательности сопровождающей цепи и направляющей цепи, нацеленные на SOD1
Согласно настоящему изобретению конструировали siRNA для SOD1. Они приведены в таблицах 11A и 11B. Сопровождающие цепи и направляющие цепи описаны в таблицах. В таблицах 11A и 11B составляющая «miR» в названии последовательности не обязательно соответствует нумерации последовательности генов miRNA (например, VOYmiR-101 является названием последовательности и не обязательно означает, что miR-101 является частью последовательности).
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Пример 6. Конструкции siRNA для SOD1 в AAV-miRNA векторах
Дуплексы из сопровождающей цепи и направляющей цепи siRNA для SOD1, приведенные в таблице 11, встраивали с помощью методов генной инженерии в AAV-miRNA векторы экспрессии. Конструкция при перечислении от ITR к ITR в направлении от 5ʹ к 3ʹ содержит мутантный ITR, промотор (любой из промотора CMV, U6 или CB6 (который включает в себя энхансер CMVie, промотор CBA и интрон SV40), сопровождающая цепь и направляющая цепь (с петлей между сопровождающей цепью и направляющей цепью, 5ʹ-фланкирующим участком перед сопровождающей цепью и 3ʹ-фланкирующим участком после направляющей цепи) из таблицы 11, полиA из гена глобина кролика и ITR дикого типа. In vitro и in vivo исследования осуществляли для оценки эффективности AAV-miRNA векторов экспрессии.
Пример 7. Активность конструкций в HeLa клетках
Семь конструкций с siRNA для SOD1, описанных в примере 6 (VOYmiR-103, VOYmiR-105, VOYmiR-108, VOYmiR-114, VOYmiR-119, VOYmiR-120 и VOYmiR-127), и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в HeLa для исследования активности конструкций.
A. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи
Семь конструкций с siRNA для SOD1 и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в HeLa клетки. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Все семь из конструкций с siRNA для SOD1 показывали высокую активность направляющей цепи с 75-80% нокдауном и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи. Направляющие цепи в векторах-кандидатах с siRNA для SOD1 показывали высокую активность, обеспечивая результат с 75-80% нокдауном SOD1, тогда как сопровождающие цепи демонстрировали незначительную активность или ее отсутствие.
B. Активность конструкций в отношении SOD1
Семь конструкций с siRNA для SOD1 и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry (dsCherry) трансфицировали в HeLa клетки при MOI (множественность заражения) 1e4 вг/клетку, 1e3 вг/клетку или 1e2 вг/клетку. Спустя 72 часа оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Все семь из конструкций с siRNA для SOD1 показывали эффективный нокдаун при 1e3 вг/клетку. Большинство конструкций с siRNA для SOD1 показывали высокую активность (75-80% нокдаун), что показано на фиг. 1.
Пример 8. Активность конструкций в HEK клетках
Тридцать из конструкций с siRNA для SOD1, описанных в примере 6 (VOYmiR-102.860, VOYmiR-102.861, VOYmiR-102.866, VOYmiR-102.870, VOYmiR-102.823, VOYmiR-104.860, VOYmiR-104.861, VOYmiR-104.866, VOYmiR-104.870, VOYmiR-104.823, VOYmiR-109.860, VOYmiR-109.861, VOYmiR-109.866, VOYmiR-109.870, VOYmiR-109.823, VOYmiR-114.860, VOYmiR-114.861, VOYmiR-114.866, VOYmiR-114.870, VOYmiR-114.823, VOYmiR-116.860, VOYmiR-116.861, VOYmiR-116.866, VOYmiR-116.870, VOYmiR-116.823, VOYmiR-127.860, VOYmiR-127.861, VOYmiR-127.866, VOYmiR-127.870, VOYmiR-127.823) и контроль в виде VOYmiR-114 и двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в клетки для исследования активности конструкций.
A. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи в HEK293
Тридцать конструкций и два контроля трансфицировали в HEK293T клетки. Спустя 24 часа оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Большинство из конструкций показывали высокую активность направляющей цепи (фиг. 2) и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи (фиг. 3).
B. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи в HeLa
Тридцать конструкций и два контроля трансфицировали в HeLa клетки. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Большинство из конструкций показывали высокую активность направляющей цепи (фиг. 4) и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи (фиг. 5).
C. Корреляция HeLa и HEK293
Нокдауны для тридцати конструкций были подобными у HeLa и HEK293 клеток. Тридцать конструкций показывали нокдаун для направляющей цепи для конструкций (см. фигуры 2 и 4). Большинство направляющих цепей в конструкциях показывали 70-90% нокдаун.
D. Выбор капсида
Лучшие конструкции из HeLa и HEK293 упаковывали в AAV и инфицированию ими подвергали HeLa. Для определения лучшего AAV для упаковки конструкций вектор с mCherry, упакованный либо в AAV2, либо в AAV-DJ8, инфицировали в HeLa при MOI 10 вг/клетку, 1e2 вг/клетку, 1e3 вг/клетку, 1e4 вг/клетку или 1e5 вг/клетку и экспрессию оценивали через 40 часов. AAV2 выбрали в качестве капсида для упаковки лучших конструкций.
E. Получение AAV2
Лучшие конструкции из HeLa и HEK293 упаковывали в AAV2 (1,6 т. о.), также упаковывали и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry (dsmCherry). Упакованные конструкции подвергали очистке с использованием йодиксанола перед анализом. Титр AAV показан в таблице 12.
Таблица 12. Титр AAV
Конструкция Титр AAV (геномов на мкл)
VOYmir-102.860 5,5E+08
VOYmir-102.861 1,0E+09
VOYmir-102.823 9,1E+08
VOYmir-104.861 1,2E+09
VOYmir-104.866 8,0E+08
VOYmir-104.823 5,7E+08
VOYmir-109.860 3,1E+08
VOYmir-109.861 8,9E+08
VOYmir-109.866 6,0E+08
VOYmir-109.823 6,0E+08
VOYmir-114.860 4,7E+08
VOYmir-114.861 3,7E+08
VOYmir-114.866 1,0E+09
VOYmir-144.823 1,7E+09
VOYmir-116.860 1,0E+09
VOYmir-116.866 9,1E+08
VOYmir-127.860 1,2E+09
VOYmir-127.866 9,0E+08
dsmCherry 1,2E+09
Влияние трансдукции на нокдаун SOD1 в HeLa клетках показано на фигуре 6. Кроме того, в HeLa клетках большая MOI (1,0E+04 по сравнению с 1,0E+05) не показывала повышенный нокдаун для каждой конструкции.
F. Активность конструкций в предшественниках двигательных нейронов человека (HMNP)
Лучшие 18 конструкций с pri-miRNA, которые описаны в примере 8E, и контроль с mCherry инфицировали в клетки-предшественники двигательных нейронов человека (HMNP) при MOI 10E5. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Приблизительно половина конструкций давали более чем 50% сайленсинг SOD1 в HMNP, и 4 из них давали более чем 70% сайленсинг (фигура 7).
G. Выбор конструкции для in vivo исследований
Выбирали лучшие двенадцать конструкций, которые оказывали значительное влияние на целевую последовательность и незначительное влияние на кассету. Эти конструкции, упакованные в капсиды AAV-rh10, составляли для инъекции и вводили млекопитающим для изучения in vivo эффектов конструкций.
Пример 9. In vitro исследование конструкций
18 конструкций и контроль с mCherry, описанные в примере 8D, упакованные в AAV2, использовали для этого исследования. Для этого исследования HEK293T клетки (Fisher Scientific, кат. № HCL4517) в среде культивирования (500 мл DMEM/F-12 с добавкой GLUTAMAXTM (Life Technologies, кат. № 10565-018), 50 мл FBS (Life Technologies, кат. № 16000-044, партия:1347556), 5 мл раствора заменимых аминокислот в MEM (100x) (кат. № 11140-050) и 5 мл HEPES (1 М) (Life Technologies, кат. № 15630-080)), U251MG клетки (P18) (Sigma, кат. № 09063001-1VL) в среде культивирования (500 мл DMEM/F-12 с добавкой GLUTAMAXTM (Life Technologies, кат. № 10565-018), 50 мл FBS (Life Technologies, кат. № 16000-044, партия:1347556), 5 мл раствора заменимых аминокислот в MEM (100x) (кат. № 11140-050) и 5 мл HEPES (1 М) (Life Technologies, кат. № 15630-080)) или нормальные астроциты человека (HA) (Lonza, кат. № CC-2565) в среде культивирования (базовая среда ABM, 500 мл (Lonza, кат. № CC-3186), дополненной набором AGM SingleQuot Kit Suppl. и ростовыми факторами (Lonza, кат. № CC-4123)) использовали для исследования конструкций. Высевали HEK293T клетки (5×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете), U251MG клетки (2×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете) и HA клетки (2×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете) и значение MOI, используемое для инфицирования клеток, составляло 1,0E+05. Спустя 48 часов клетки анализировали, и результаты показаны в таблице 13.
Таблица 13. Относительный уровень мРНК SOD1
Конструкция Относительный уровень мРНК SOD1 (%) (нормализован к GAPDH)
HEK293T U251MG HA
VOYmiR-102.823 19.5 49.6 87.3
VOYmiR-102.860 1.7 5.3 19.2
VOYmiR-102.861 1.1 13.9 42.6
VOYmiR-104.823 49.9 69.6 102.7
VOYmiR-104.861 1.0 10.7 36.3
VOYmiR-104.866 12.3 54.6 85.5
VOYmiR-109.823 23.0 46.1 84.6
VOYmiR-109.860 1.9 8.3 35.6
VOYmiR-109.861 1.9 22.7 57.3
VOYmiR-109.866 4.1 38.5 67.9
VOYmiR-114.823 19.3 44.7 82.3
VOYmiR-114.860 1.4 4.7 17.6
VOYmiR-114.861 1.1 9.7 48.1
VOYmiR-114.866 4.0 38.7 78.2
VOYmiR-116.860 1.1 4.8 15.8
VOYmiR-116.866 5.5 40.2 73.7
VOYmiR-127.860 1.0 2.1 7.4
VOYmiR-127.866 1.0 15.4 43.8
mCherry 100.0 100.2 100.1
Более чем 80% нокдаун наблюдали в HEK293T клетках для большинства конструкций. Более чем половина конструкций показывала более чем 80% нокдаун в U251MG клетках и в HA клетках.
Пример 10. Дозозависимое снижение уровня SOD1
Четыре из лучших 18 конструкций с pri-miRNA, которые описаны в примере 8E, и контроль с mCherry трансфицировали в клеточную линию астроцитов человека (U251MG) или первичные астроциты человека (HA) при MOI 1,0E+02, 1,0E+03, 1,0E+04, 1,0E+05 или 1,0E+06. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК, и дозозависимый сайленсинг показан на фиг. 8 (U251MG) и фиг. 9 (HA). Для всех конструкций повышение дозы также коррелировало с повышением количества мРНК SOD1, которая подверглась нокдауну.
Пример 11. Длительность нокдауна SOD1
Две конструкции с pri-miRNA (VOYmiR-120 и VOYmiR-122), отрицательный контроль и положительный контроль с siRNA для SOD1 трансфицировали в клеточную линию астроцитов человека (U251MG). Относительное количество мРНК SOD1 определяли в течение 60 часов, как показано на фиг. 10. 70-75% нокдаун hSOD1 наблюдали в случае обеих конструкций с pri-miR после трансфекции с использованием нуклеофектора, причем наибольший нокдаун наблюдали во временном интервале 12-24 часа.
Пример 12. Нокдаун SOD1 и процентные соотношения цепей
VOYmiR-104 трансфицировали в HeLa клетки в концентрации 50 пМ, 100 пМ и 150 пМ и сравнивали с необработанными (UT) клетками. Относительное количество мРНК SOD1, процент направляющей цепи и процент сопровождающей цепи определяли через 36, 72, 108 и 144 часа, как показано на фиг. 11A-11C. Наиболее высокая концентрация (150 пМ) показывала наибольшее снижение экспрессии, но все три дозы показывали значительное снижение экспрессии SOD1.
Пример 13. Конструкции, нацеленные на SOD1
Разрабатывали конструкции для SOD1 собаки, и конструкции приведены в таблице 14. SOD1 собаки является на 100% консервативной с человеческой в участке, подвергающемся целенаправленному воздействию согласно настоящему изобретению. Последовательности сопровождающих цепей и направляющих цепей описаны в таблице. В таблице 14 составляющая «miR» в названии последовательности не обязательно соответствует нумерации последовательности генов miRNA (например, dVOYmiR-102 является названием последовательности и не обязательно означает, что miR-102 является частью последовательности).
Figure 00000012
Figure 00000013
Пример 14. Эффект положения модулирующих полинуклеотидов
A. Эффект в отношении титров вируса
Молекулу siRNA (VOYmiR-114 или VOYmiR-126) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan для 6 положений и для контроля (конструкция без модулирующего полинуклеотида; scAAV), и результаты показаны в таблице 15.
Таблица 15. Титры вируса
Молекула siRNA Положение молекулы siRNA Титр вируса
(вг на 15 см чашку)
VOYmiR-114 Положение 1 5,5E+10
VOYmiR-114 Положение 2 5,5E+10
VOYmiR-114 Положение 3 4,5E+10
VOYmiR-114 Положение 4 3,7E+10
VOYmiR-114 Положение 5 6,5E+10
VOYmiR-114 Положение 6 2,5E+10
VOYmiR-126 Положение 1 1,6E+10
VOYmiR-126 Положение 2 3,2E+10
VOYmiR-126 Положение 3 6,0E+10
VOYmiR-126 Положение 4 1,6E+10
VOYmiR-126 Положение 5 9,5E+09
VOYmiR-126 Положение 6 6,0E+10
- Контроль 2,1E+11
B. Эффект в отношении целостности генома
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, а также использовали контроль без модулирующего полинуклеотида (scAAV), как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Вирусные геномы экстрагировали из очищенных препаратов AAV и разгоняли на нейтральном агарозном геле. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 16.
Таблица 16. Усеченные геномы
Конструкция % от общего числа
Положение 1 50
Положение 2 41
Положение 3 49
Положение 4 34
Положение 5 33
Положение 6 59
Контроль 9
Положение 6 характеризовалось наибольшим числом усеченных геномов, в то время как положения 4 и 5 характеризовались наименьшим количеством усеченных геномов.
C. Эффект в отношении эффективности нокдауна
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (AAV2) (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Трансдукцию HeLa клеток проводили при 1×104 вг/клетку, 1×103 вг/клетку и 1×102 вг/клетку. Экспрессию мРНК SOD1 (в виде % от контроля (eGFP)) определяли через 72 часа после инфицирования и результаты показаны в таблице 17.
Таблица 17. Экспрессия SOD1
Конструкция Экспрессия мРНК SOD1 (% от контроля)
1×104 вг/клетка 1×103 вг/клетка 1×102 вг/клетка
Положение 1 40 59 69
Положение 2 31 46 75
Положение 3 50 66 81
Положение 4 21 34 55
Положение 5 49 52 67
Положение 6 31 37 62
Контроль (eGFP) 100 100 94
Положение 3 характеризовалось наивысшей экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля), а положение 4 характеризовалось самой низкой экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля).
Пример 15. Эффект в отношении размера генома
A. Эффект в отношении титров вируса
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2 т. о.; scAAV) в положениях 1, 2, 5 и 6, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Сравнивали контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (scAAV miR114; ITR (105 нуклеотидов) -промотор (~900 нуклеотидов)-модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA (158 нуклеотидов)- последовательность полиA (127 нуклеотидов) и ITR), а также контроль (eGFP; scAAV) без молекулы siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan, и результаты показаны в таблице 18.
Таблица 18. Титры вируса
Конструкция Размер Титр вируса (вг на 15 см чашку)
Положение 1 2 т. о. 9,5E+10
Положение 2 2 т. о. 1,2E+11
scAAV miR114 1,6 т. о. 1,1E+11
Положение 5 2 т. о. 2,4E+10
Положение 6 2 т. о. 1,1E+11
Контроль 2 т. о. 2,2E+11
Самые низкие титры вируса наблюдали с конструкцией в положении 5, а самые высокие - с конструкцией в положении 2.
B. Эффект в отношении целостности генома
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2 т. о.; scAAV) в положениях 1, 2, 5 и 6, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Сравнивали контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (scAAV miR114; ITR (105 нуклеотидов) -промотор (~900 нуклеотидов)-модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA (158 нуклеотидов)- последовательность полиA (127 нуклеотидов) и ITR), а также контроль (eGFP; scAAV) без молекулы siRNA. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 19.
Таблица 19. Усеченные геномы
Конструкция Размер % от общего числа
Положение 1 2 т. о. 34
Положение 2 2 т. о. 30
scAAV miR114 1,6 т. о. 20
Положение 5 2 т. о. 21
Положение 6 2 т. о. 46
Контроль 2 т. о. 5
Было определено, что у все конструкции имели некоторое количество усеченных геномов.
Проводили дополнительное исследование для определения эффекта разных молекул siRNA. VOYmiR-114 и VOYmiR-126 внедряли в отдельные векторы экспрессии (размер генома 1,6 т. о.; scAAV) в положении 3, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. В случае конструкции с VOYmiR-114 расстояние между 5ʹ-концом векторного генома (1526 нуклеотидов) и центром модулирующего полинуклеотида (серединой гибкой петли) составляло 1115 нуклеотидов. В случае конструкции с VOYmiR-126 расстояние между 5ʹ-концом векторного генома (1626 нуклеотидов) и центром модулирующего полинуклеотида (серединой гибкой петли) составляло 1164 нуклеотидов.
В случае конструкции с VOYmiR-114 титр вируса (вг на 15 см чашку) составлял приблизительно 1,1E+11. В случае конструкции с VOYmiR-126 титр вируса с зондом-интроном (вг на 15 см чашку) составлял приблизительно 1,2E+12. У контроля он составлял приблизительно 2,1E+11 (вг на 15 см чашку). VOYmir-114 имел приблизительно 20% усеченных геномов, VOYmiR-126 имел приблизительно 15% усеченных геномов, и контроль имел приблизительно 5% усеченных геномов.
Пример 16. Эффект одноцепочечных конструкций
A. Эффект в отношении титров вируса
Полинуклеотид siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, также исследовали контроль без полинуклеотида siRNA (размер генома 2 т. о.; ssAAV). На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan, и результаты показаны в таблице 20.
Таблица 20. Титры вируса
Конструкция Титр вируса (вг на 15 см чашку)
Положение 1 5,0E+11
Положение 3 7,5E+11
Положение 5 3,5E+11
Контроль 2,5E+11
Положение 3 показывало наибольшие титры вируса, за ним следовало положение 1, а затем положение 5.
B. Эффект в отношении целостности генома
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, также исследовали контроль без модулирующего полинуклеотида (размер генома 2 т. о.; ssAAV). На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Вирусные геномы экстрагировали из очищенных препаратов AAV и разгоняли на нейтральном агарозном геле. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 21.
Таблица 21. Усеченные геномы
Конструкция % от общего числа
Положение 1 48
Положение 3 30
Положение 5 72
Контроль 0
Положение 5 характеризовалось наибольшим числом усеченных геномов, в то время как положение 3 характеризовалось наименьшим количеством усеченных геномов.
C. Эффект в отношении эффективности нокдауна
Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, и присутствовал контроль в виде одноцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 2 т. о.; ssAAV ctrl), контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (размер генома 2,4 т. о.; scAAV miR114) с молекулой siRNA. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Трансдукцию HeLa клеток проводили при 1×104 вг/клетку, 1×103 вг/клетку и 1×102 вг/клетку. Экспрессию мРНК SOD1 (в виде % от контроля (eGFP)) определяли через 72 часа после инфицирования и результаты показаны в таблице 22.
Таблица 22. Экспрессия SOD1
Конструкция Экспрессия мРНК SOD1 (% от контроля)
1×104 вг/клетка 1×103 вг/клетка 1×102 вг/клетка
Положение 1 62 85 87
Положение 3 77 93 99
Положение 5 59 82 84
ssAAV ctrl 100 101 108
scAAV ctrl 95 97 102
scAAV miR114 23 33 62
Положение 3 характеризовалось наивысшей экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля), затем следовало положение 1, и у одноцепочечных конструкций самая низкая экспрессия мРНК SOD1 (в виде % от контроля) была в положении 5. Ни одна из одноцепочечных конструкций не характеризовалась эффективностью нокдауна, которая была больше чем у контроля в виде двухцепочечного вектора с полинуклеотидом siRNA.
Пример 17. Нокдаун SOD1 in vivo
Для оценки in vivo биологической активности pri-miRNA самокомплементарные pri-miRNA (VOYmiR-114.806, VOYmiR127.806, VOYmiR102.860, VOYmiR109.860, VOYmiR114.860, VOYmiR116.860, VOYmiR127.860, VOYmiR102.861, VOYmiR104.861, VOYmiR109.861, VOYmiR114.861, VOYmiR109.866, VOYmiR116.866 или VOYmiR127.866) упаковывали в AAV-DJ с промотором CBA.
У мышей эти упакованные pri-miRNA или контроль, содержащий только среду (фосфатно-солевой буферный раствор с 5% сорбита и 0,001% F-68), вводили посредством 10-минутной интрастриарной инфузии. Самки или самцы Tg(SOD1)3Cje/J мышей (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн), у которых экспрессировалась SOD1 человека и которые имели массу тела примерно 20-30 г, получали односторонние инъекции 5 мкл исследуемого препарата, которые были нацелены на стриатум (+0,5 мм в передне-заднем направлении,+2 мм в срединно-боковом направлении относительно брегмы; 3,8 мм в спинно-брюшном направлении относительно поверхности черепа). Исследуемые препараты вводили инъекцией (5 животных на исследуемый препарат) со скоростью 0,5 мкл/мин. с использованием предварительно заполненных, регулируемых насосом микрошприцов Hamilton (модель 1701, 10 μмкл) с иглами 33 калибра. Через 1, 2, 3, 4 или 6 недель после инъекции животных умерщвляли, головной мозг удаляли и ипсилатеральный стриатум, охватывающий места инфузии из 1 мм слоя в коронарной проекции, а также ткань стриатума из смежных 1 мм слоев в коронарной проекции, вырезали и подвергали быстрой заморозке. Образцы ткани мышей лизировали и проводили количественное определение уровней белка SOD1 человека и уровней мРНК SOD1 и GAPDH мыши (mGAPDH). Уровни белка SOD1 количественно определяли с помощью ELISA (eBioscience (Affymetrix, Сан-Диего, Калифорния)) и уровни общего белка количественно определяли с помощью BCA анализа (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Для каждого образца ткани уровень белка SOD1, нормализованный к общему белку, рассчитывали в виде среднего значения от 2 определений. Эти нормализованные уровни белка SOD1 дополнительно нормализовали к группе, получавшей среду, затем усредняли с получением среднего значения для группы (подвергавшейся обработке). Уровни мРНК SOD1 и mGAPDH количественно определяли с помощью qRT-PCR (количественная ПЦР в реальном времени). Для каждого образца ткани соотношение SOD1/mGAPDH (нормализованный уровень мРНК SOD1) рассчитывали в виде среднего значения от 3 определений. Эти соотношения затем усредняли с получением среднего значения для группы (подвергавшейся обработке). Эти средние значения для групп дополнительно нормализовали к группе, получавшей среду.
У приматов, за исключением человека, исследуемые препараты (1×1013-3×1013вг с pri-miRNA, упакованных в AAV-DJ с промотором CBA) или среду вводили посредством интратекальной струйной инъекции в позвоночный отдел. Самкам яванского макака (Macaca fascicularis, CR Research Model Houston, Хьюстон, Техас) с массой тела примерно 2,5-8,5 кг имплантировали один интратекальный катетер, причем кончик катетера располагался в поясничном отделе позвоночника. Вводили исследуемые препараты (4 животных на исследуемый препарат), причем введение предусматривало три струйные инъекции 1 мл (1 мл/минуту) с интервалами примерно 60 минут. Через 4-6 недель после введения животных умерщвляли и выбранные ткани собирали для биоаналитической и гистологической оценки. Уровни белка SOD1 и мРНК оценивали в отношении супрессии после обработки pri-miRNA, упакованной в AAV-DJ с промотором CBA в сравнении с группой, получавшей среду.
Пример 18. Нокдаун SOD1 in vivo с использованием VOYmiR-114.806
У Tg(SOD1)3Cje/J мышей VOYmiR-114.806 была упакована в AAVDJ с промотором CBA, как описано в примере 17. Мышам вводили посредством одностороннего интрастриатарного введения дозу 3,7×109 вг. Спустя 1 или 2 недели не наблюдалось существенного снижения нормализованных уровней белка SOD1; нормализованные уровни белка SOD1 составляли 98+11% (стандартное отклонение) и 98+10% от уровня у контрольной группы, получавшей среду, спустя 1 и 2 недели, соответственно. К 3 неделе VOYmiR-114.806 снижала нормализованный уровень белка SOD1 до 84+9,0% относительно контрольной группы, получавшей среду, что было статистически значимым (p<0,05, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным анализом с использованием критерия Даннетта). К 4 и 6 неделям VOYmiR-114.806 снижала нормализованный уровень белка SOD1 до 73+7,9% (p < 0,0001) и 75+7,4% (p<0,0001), соответственно, от уровня у контрольной группы, получавшей среду. Эти результаты демонстрируют, что VOYmiR-114.806, упакованная в AAV-DJ с промотором CBA, является эффективной in vivo в понижающей модуляции уровней белка SOD1. Кроме того, эти результаты демонстрируют, что суммарная интрастриарная доза от 3,7×109 вг с VOYmiR-114.806, упакованной в AAVDJ с промотором CBA, приводила в результате к значительной понижающей модуляции уровней белка SOD1.
Хотя настоящее изобретение было описано в некотором объеме и с некоторыми подробностями в отношении нескольких описанных вариантов осуществления, не предполагается, что оно должно ограничиваться любыми такими подробностями или вариантами осуществления или любым конкретным вариантом осуществления, а его следует толковать с учетом прилагаемой формулы изобретения для того, чтобы обеспечить наиболее широкую возможную интерпретацию таких пунктов формулы изобретения в связи с уровнем техники и, следовательно, чтобы эффективно охватить предусмотренный объем настоящего изобретения.
Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в данном документе, включены во всей своей полноте посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущество. Кроме того, заголовки разделов, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Claims (23)

1. Векторный геном на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке млекопитающего, где указанный векторный геном AAV содержит последовательность нуклеиновой кислоты, расположенную между двумя инвертированными концевыми повторами (ITR), где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность смысловой цепи и последовательность антисмысловой цепи, причем последовательность смысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и отличается не более чем 3 нуклеотидами от SEQ ID NO. 51, последовательность антисмысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и отличается не более чем 3 нуклеотидами от SEQ ID NO. 220, и где указанная последовательность смысловой цепи и последовательность антисмысловой цепи имеют общий участок комплементарности длиной по меньшей мере семь нуклеотидов.
2. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где последовательность смысловой цепи отличается не более чем 2 нуклеотидами от SEQ ID NO. 51.
3. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где последовательность антисмысловой цепи отличается не более чем 2 нуклеотидами от SEQ ID NO. 220.
4. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где последовательность нуклеиновой кислоты кодирует последовательность смысловой цепи и последовательность антисмысловой цепи дуплекса siРНК, где последовательность смысловой цепи содержит нуклеотиды 1-18 SEQ ID NO. 51 и где последовательность антисмысловой цепи содержит нуклеотиды 1-19 SEQ ID NO. 220.
5. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где участок комплементарности имеет длину 17-20 нуклеотидов.
6. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где последовательность смысловой цепи содержит нуклеотиды 1-18 SEQ ID NO. 51.
7. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где последовательность антисмысловой цепи содержит нуклеотиды 1-19 SEQ ID NO. 220.
8. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где по меньшей мере одна из последовательности смысловой цепи и последовательности антисмысловой цепи содержит 3' выступающий конец из по меньшей мере 1 нуклеотида.
9. Векторный геном на основе AAV по п. 1, где по меньшей мере одна из последовательности смысловой цепи и последовательности антисмысловой цепи содержит 3' выступающий конец из по меньшей мере 2 нуклеотидов.
10. Частица аденоассоциированного вируса (AAV) для ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке млекопитающего, указанная частица AAV содержит векторный геном на основе AAV по п. 1 и капсид AAVrh10, где последовательность смысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-18 SEQ ID NO. 51 и где последовательность антисмысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-19 последовательности SEQ ID NO. 220.
11. Способ ингибирования или подавления экспрессии гена SOD1 в клетке млекопитающего, включающий введение в клетку векторного генома на основе AAV по п. 1, где последовательность смысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-18 SEQ ID NO. 51 и где последовательность антисмысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-19 последовательности SEQ ID NO. 220.
12. Способ по п. 11, где клетка млекопитающего представляет собой астроцит.
13. Способ по п. 11, где клетка млекопитающего представляет собой двигательный нейрон.
14. Фармацевтическая композиция для лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) у субъекта, указанная фармацевтическая композиция содержит частицу AAV по п.10 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) у субъекта путем ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке субъекта, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции по п. 14.
16. Способ по п. 15, где экспрессия мРНК SOD1 ингибируется или подавляется от 20 до 93%.
17. Способ по п. 15, где экспрессию мРНК SOD1 ингибируют или подавляют на величину от 50 до 93%.
18. Способ по п. 15, где ALS представляет собой семейный ALS с идентифицированной мутацией в гене SOD1.
19. Способ по п. 15, где ALS представляет собой спорадический ALS.
20. Способ по п.15, где ген SOD1 включает в себя мутацию, которая вызывает эффект приобретения функции внутри клетки, где фермент супероксиддисмутазы приобретает вредные свойства при изменении мутацией.
21. Способ по п. 15, где введение композиции включает внутрипаренхиматозное введение в позвоночник.
22. Дуплекс siRNA для ингибирования или подавления экспрессии гена SOD1 в клетке млекопитающего, причем указанный дуплекс siRNA включает последовательность смысловой цепи и последовательность антисмысловой цепи, где последовательность смысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и отличается не более чем 3 нуклеотидами от SEQ ID NO. 51 и где последовательность антисмысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и отличается не более чем 3 нуклеотидами от SEQ ID NO. 220.
23. Дуплекс siRNA для ингибирования или подавления экспрессии гена SOD1 в клетке млекопитающего, причем указанный дуплекс siRNA включает последовательность смысловой цепи и последовательность антисмысловой цепи, где последовательность смысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-18 SEQ ID NO. 51 и где последовательность антисмысловой цепи имеет длину 20-22 нуклеотида и содержит нуклеотиды 1-19 SEQ ID NO. 220.
RU2017116576A 2014-11-14 2015-11-13 Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als) RU2716422C2 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462079588P 2014-11-14 2014-11-14
US62/079,588 2014-11-14
US201562211992P 2015-08-31 2015-08-31
US62/211,992 2015-08-31
US201562234466P 2015-09-29 2015-09-29
US62/234,466 2015-09-29
PCT/US2015/060562 WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2015-11-13 Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020108189A Division RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2015-11-13 Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017116576A RU2017116576A (ru) 2018-11-14
RU2017116576A3 RU2017116576A3 (ru) 2019-04-16
RU2716422C2 true RU2716422C2 (ru) 2020-03-11

Family

ID=55955103

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017116576A RU2716422C2 (ru) 2014-11-14 2015-11-13 Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
RU2020108189A RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2015-11-13 Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020108189A RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2015-11-13 Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)

Country Status (14)

Country Link
US (5) US10597660B2 (ru)
EP (1) EP3218484A4 (ru)
JP (4) JP2017535266A (ru)
KR (2) KR102599909B1 (ru)
CN (2) CN114717264A (ru)
AU (2) AU2015346162B2 (ru)
CA (2) CA3193811A1 (ru)
HK (1) HK1244299A1 (ru)
IL (3) IL292999A (ru)
MX (2) MX2017006216A (ru)
RU (2) RU2716422C2 (ru)
SG (1) SG11201703281RA (ru)
WO (1) WO2016077687A1 (ru)
ZA (1) ZA201702991B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2804196C1 (ru) * 2023-07-18 2023-09-26 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ терапии бокового амиотрофического склероза

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3126499T1 (sl) 2014-04-01 2020-09-30 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
RU2716422C2 (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
CN112410339A (zh) 2014-11-14 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
CA3252099A1 (en) 2016-05-18 2025-06-05 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
CN109831916B (zh) 2016-05-18 2023-07-21 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法
GB201609597D0 (en) 2016-06-01 2016-07-13 Univ Sheffield Therapy
JP2020518259A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ハンチントン病治療組成物および方法
SG11201909777YA (en) * 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
JP2020518258A (ja) * 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
CN119242711A (zh) * 2017-10-16 2025-01-03 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症（als）的治疗
US20200237799A1 (en) * 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111819281B (zh) * 2017-10-23 2024-12-31 普利维尔治疗公司 用于神经变性疾病的基因疗法
KR102112476B1 (ko) * 2017-12-29 2020-05-19 주식회사 헬릭스미스 하이브리드 HGF 유전자가 도입된 AAV(Adeno-Associated Virus) 벡터
JP7350019B2 (ja) * 2018-05-31 2023-09-25 イミュニティ ファルマ リミテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）を治療するための組成物、及び治療のためにそれを使用する方法
WO2019241486A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
US20210254103A1 (en) * 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
WO2020023612A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
WO2020072849A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
CA3115248A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
CA3116701A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
CN113365640A (zh) * 2018-12-06 2021-09-07 比奥根Ma公司 引导肌萎缩侧索硬化症的治疗性干预的神经丝蛋白
UY38506A (es) * 2018-12-14 2020-06-30 Biogen Ma Inc Composiciones y metodos para tratar y prevenir la esclerosis lateral amiotrofica
AU2020208467A1 (en) 2019-01-18 2021-08-05 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing AAV particles
CN119390787A (zh) 2019-01-31 2025-02-07 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
WO2020223296A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
US20220243225A1 (en) 2019-04-29 2022-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BACULOVIRAL INFECTED INSECT CELLS (BIICs) IN BIOREACTORS
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2021092166A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of treating neurodegenerative diseases caused by g4c2 expansion in c90rf72
EP3892283A1 (en) * 2020-04-09 2021-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Nucleic acids encoding human fus protein and use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
BR112023001648A2 (pt) 2020-07-27 2023-04-04 Anjarium Biosciences Ag Moléculas de dna de fita dupla, veículo de entrega e método para preparar uma molécula de dna com extremidade em grampo
US20230295656A1 (en) 2020-08-06 2023-09-21 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CA3188748A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 UCB Biopharma SRL Gene therapy using nucleic acid constructs comprising methyl cpg binding protein 2 (mecp2) promoter sequences
WO2022109368A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Texas Tech University System Methods of treating or preventing neurological disorders using zpr1
WO2022174000A2 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117915952A (zh) 2021-09-16 2024-04-19 H.隆德贝克有限公司 用于治疗突触核蛋白病的组合物和方法
CA3232577A1 (en) * 2021-09-20 2023-03-23 Alexander SHTILBANS Combination therapy for neurodegenerative diseases
EP4430191A2 (en) * 2021-11-08 2024-09-18 University Of Massachusetts Oligonucleotides for sod1 modulation
US11912997B2 (en) 2022-06-15 2024-02-27 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for inhibiting expression of Superoxide Dismutase 1 (SOD1), compositions thereof, and methods of use
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN116270704A (zh) * 2023-02-24 2023-06-23 西交利物浦大学 一种抑制sod1基因表达的药物组合物及其应用
TW202449167A (zh) 2023-04-26 2024-12-16 美商航海家醫療公司 用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之組成物及方法
AU2024279767A1 (en) * 2023-05-26 2025-12-04 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Sod1-modulating compositions and methods of use thereof
CN116832050A (zh) * 2023-07-06 2023-10-03 南京大学 一种用于治疗肌萎缩侧索硬化症的rna递送系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180756A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Yang Shi Compositions and methods for suppressing eukaryotic gene expression
US20110039914A1 (en) * 2008-02-11 2011-02-17 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified rnai polynucleotides and uses thereof

Family Cites Families (523)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5171680A (en) 1988-06-14 1992-12-15 Chiron Corporation Superoxide dismutase analogs having novel binding properties
ATE125566T1 (de) 1988-06-14 1995-08-15 Chiron Corp Superoxid-dismutaseanaloge mit neuen bindeeigenschaften.
FR2640638B1 (fr) 1988-12-20 1991-02-15 Commissariat Energie Atomique Bioreacteur et dispositif pour la culture de cellules animales
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
DE69435108D1 (de) 1993-07-13 2008-08-14 Centelion Defekte adenovirus-vektoren und deren verwendung in der gentherapie
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
EP0755454B1 (en) 1994-04-13 2008-02-13 The Rockefeller University Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5756283A (en) 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5688676A (en) 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US6197293B1 (en) 1997-03-03 2001-03-06 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing androgen receptor and methods of use thereof
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
US5858351A (en) 1996-01-18 1999-01-12 Avigen, Inc. Methods for delivering DNA to muscle cells using recombinant adeno-associated virus vectors
US5846528A (en) 1996-01-18 1998-12-08 Avigen, Inc. Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
AU730633B2 (en) 1996-05-29 2001-03-08 Phillip Belgrader Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US7026468B2 (en) 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
US5866552A (en) 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
CN1233291A (zh) 1996-09-06 1999-10-27 宾西法尼亚大学托管会 重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法
AU4255397A (en) 1996-09-06 1998-03-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Chimpanzee adenovirus vectors
CA2264499A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US20020037867A1 (en) 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
EP0931158A1 (en) 1996-09-06 1999-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
CA2265460A1 (en) 1996-09-11 1998-03-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Aav4 vector and uses thereof
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
WO1998022588A2 (en) 1996-11-20 1998-05-28 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors
US6541258B2 (en) 1996-12-18 2003-04-01 Targeted Genetics Corporation AAV split-packaging genes and cell lines comprising such genes for use in the production of recombinant AAV vectors
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6710036B2 (en) 1997-07-25 2004-03-23 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO1999015677A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
JP2001517454A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスの産生に有用な方法および細胞株
WO1999014354A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
IT1297074B1 (it) 1997-11-21 1999-08-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Forme ormone-dipendenti delle proteine rep del virus adeno-associato (aav-2), sequenze di dna codificanti per esse, vettori che le
EP1042494A1 (en) 1997-12-23 2000-10-11 Introgene B.V. Adeno-associated virus and adenovirus chimeric recombinant viruses useful for the integration of foreign genetic information into the chromosomal dna of target cells
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
WO1999043360A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stable protection from dystrophic sarcolemmal degeneration and restoration of the sarcoglycan complex
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6521426B1 (en) 1998-04-08 2003-02-18 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus
FR2778413B1 (fr) 1998-05-07 2000-08-04 Immunotech Sa Nouveaux reactifs et methode de lyse des erythrocytes
WO1999058700A1 (en) 1998-05-11 1999-11-18 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Multiviral compositions and uses thereof
EP1849872A1 (en) 1998-05-20 2007-10-31 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
JP2002516345A (ja) 1998-05-27 2002-06-04 セル ジェネシス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子活性のアデノ随伴ウイルスベクター媒介性発現
US6984517B1 (en) 1998-05-28 2006-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector and uses thereof
ES2313784T3 (es) 1998-05-28 2009-03-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vector aav5 y usos del mismo.
GB2338236B (en) 1998-06-13 2003-04-09 Aea Technology Plc Microbiological cell processing
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
WO2000022152A1 (en) 1998-10-13 2000-04-20 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
AU764130B2 (en) 1998-10-27 2003-08-14 Crucell Holland B.V. Improved AAV vector production
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
DE69941905D1 (de) 1998-11-10 2010-02-25 Univ North Carolina Virusvektoren und verfahren für ihre herstellung und verabreichung.
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6225113B1 (en) 1998-12-04 2001-05-01 Genvec, Inc. Use of trans-activation and cis-activation to modulate the persistence of expression of a transgene in an at least E4-deficient adenovirus
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
US6509150B1 (en) 1999-03-05 2003-01-21 Universite De Nantes Compositions and methods for recombinant Adeno-Associated Virus production
JP4693244B2 (ja) 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
WO2000066780A2 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
EP1183380A1 (en) 1999-06-02 2002-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
JP4969002B2 (ja) 1999-06-08 2012-07-04 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン ｒＡＡＶ形質導入を増加するための化合物および方法
AU781478B2 (en) 1999-08-20 2005-05-26 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
WO2001023001A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rapid peg-modification
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
CA2386546A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated viruses and uses thereof
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
AU1436401A (en) 1999-10-21 2001-05-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The RepO-associated virus AAV REP78 major regulatory protein, mutants thereof and uses thereof
WO2001036623A2 (en) 1999-11-05 2001-05-25 Avigen, Inc. Ecdysone-inducible adeno-associated virus expression vectors
WO2001036603A2 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Avigen, Inc. Recombinant adeno-associated virus virions for the treatment of lysosomal disorders
JP2003516147A (ja) 1999-12-10 2003-05-13 アリアド ジーン セラピューティクス インコーポレイテッド 霊長類における高レベルの遺伝子発現方法
US7638120B2 (en) 2000-03-14 2009-12-29 Thomas Jefferson University High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type
CA2373110A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Neurologix, Inc. Production of chimeric capsid vectors
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
US7048920B2 (en) 2000-03-24 2006-05-23 Cell Genesys, Inc. Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma
EP1309726B2 (en) 2000-03-30 2018-10-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
GB0009887D0 (en) 2000-04-20 2000-06-07 Btg Int Ltd Cytotoxic agents
AU2001255575B2 (en) 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
AU2001257611A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US20030013189A1 (en) 2000-04-28 2003-01-16 Wilson James M. Compositions and methods useful for non-invasive delivery of therapeutic molecules to the bloodstream
AU6972301A (en) 2000-06-01 2001-12-11 Univ North Carolina Duplexed parvovirus vectors
WO2001096587A2 (en) 2000-06-13 2001-12-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods for administering recombinant adeno-associated virus virions to humans previously exposed to adeno-associated virus
AU2001272735A1 (en) 2000-07-18 2002-01-30 Takeda Chemical Industries Ltd. Novel physiologically active peptide and use thereof
US6329181B1 (en) 2000-08-07 2001-12-11 Neurologix, Inc. Helper functions for recombinant vector production
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
JP2004506658A (ja) 2000-08-17 2004-03-04 小澤　敬也 アデノ随伴ウイルスを介した血管形成因子のデリバリー
DE10066104A1 (de) 2000-09-08 2003-01-09 Medigene Ag Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung
FR2813891B1 (fr) 2000-09-14 2005-01-14 Immunotech Sa Reactif multifonctionnel pour erythrocytes mettant en jeu des carbamates et applications
ATE303808T1 (de) 2000-10-24 2005-09-15 Mitsubishi Pharma Corp Mittel zur behandlung der amyotrophischen lateralsklerose (als)
JP2002153278A (ja) 2000-11-22 2002-05-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc ウイルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクターの製造方法
WO2002070719A2 (en) 2001-01-19 2002-09-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulatable gene expression system
US20030147853A1 (en) 2001-03-14 2003-08-07 Mcclelland Alan Recombinant adeno-associated virus-mediated gene transfer via retroductal infusion of virions
EP2221376B1 (en) 2001-06-21 2012-11-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
ES2375557T3 (es) 2001-06-22 2012-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus recombinantes que comprenden prote�?nas de adenovirus de simios y usos de los mismos.
EP1900815B1 (en) 2001-07-12 2016-09-07 University of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
AU2007201330C1 (en) 2001-07-12 2011-06-09 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
JP4210737B2 (ja) 2001-07-12 2009-01-21 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 遺伝子サイレンシングを仲介する低分子干渉リボ核酸のインビボにおける製造方法
US8241622B2 (en) 2001-07-13 2012-08-14 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences
US20030016777A1 (en) 2001-07-18 2003-01-23 Alain Vandergheynst TIG welded MOX fuel rod
EP1279740A1 (en) 2001-07-26 2003-01-29 Vrije Universiteit Brussel Recombinant vector derived from adeno-associated virus for gene therapy
WO2003014367A1 (en) 2001-08-08 2003-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for purification of viral vectors having proteins which bind sialic acid
US20030092161A1 (en) 2001-09-19 2003-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for production of recombinant viruses, and uses therefor
EP2428568B1 (en) 2001-09-28 2018-04-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
EP1572893B1 (en) 2001-11-09 2009-01-07 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY of the DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Production of adeno-associated virus in insect cells
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ618298A (en) 2001-11-13 2015-04-24 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
EP1944043A1 (en) 2001-11-21 2008-07-16 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
SG2013034475A (en) 2001-11-21 2016-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
CA2469623C (en) 2001-12-12 2012-05-29 F H Faulding & Co Limited Composition for the preservation of viruses
DK2573170T3 (en) 2001-12-17 2018-04-09 Univ Pennsylvania Sequences of adeno-associated virus (AAV) serotype 9, vectors containing them, and their use
PT2359869T (pt) 2001-12-17 2019-04-16 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
WO2003053476A1 (en) 2001-12-19 2003-07-03 Lijun Wang Adeno-associated virus-mediated delivery of gdnf to skeletal muscles
CA2473376A1 (en) 2002-01-16 2003-07-31 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
GB0208390D0 (en) 2002-04-11 2002-05-22 Univ London Adeno-associated virus producer system
US20030198620A1 (en) 2002-04-16 2003-10-23 Keiya Ozawa Method of treating amino acid metabolic disorders using recombinant adeno-associated virus virions
US7235393B2 (en) 2002-04-29 2007-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
BR0309659A (pt) 2002-04-30 2005-02-22 Oncolytics Biotech Inc Método para produzir vìrus de uma cultura de células, composição, e, método para produzir reovìrus infeccioso
US8802080B2 (en) 2002-05-01 2014-08-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Raav expression systems for genetic modification of specific capsid proteins
ES2465574T3 (es) 2002-05-03 2014-06-06 Duke University Un método para regular la expresión génica
US7326555B2 (en) 2002-05-14 2008-02-05 Merck & Co., Inc. Methods of adenovirus purification
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
WO2003104413A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
US20050255086A1 (en) 2002-08-05 2005-11-17 Davidson Beverly L Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
RU2005106999A (ru) 2002-08-29 2005-08-27 Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити (Us) Кольцевые векторы нуклеиновой кислоты и способы их создания и использования
AU2003273336A1 (en) 2002-09-18 2004-04-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US20060041022A1 (en) 2002-11-06 2006-02-23 Pasinetti Giulio M Treatment of amyotrophic lateral sclerosis with nimesulide
US7169612B2 (en) 2002-11-11 2007-01-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure
EP1418185A1 (en) 2002-11-11 2004-05-12 Aventis Pharma Deutschland GmbH Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
US7618948B2 (en) 2002-11-26 2009-11-17 Medtronic, Inc. Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA
JP2006523103A (ja) 2003-02-21 2006-10-12 ザ ペン ステイト リサーチ ファウンデーション Ｒｎａ干渉組成物および方法
WO2004075861A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus production
WO2004083441A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Random peptide library displayed on aav vectors
WO2004108922A2 (en) 2003-04-25 2004-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver
WO2005017101A2 (en) 2003-05-19 2005-02-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof
DK2277996T3 (da) 2003-05-21 2014-10-20 Genzyme Corp Fremgangsmåder til fremstilling af præparationer af rekombinante aav-virioner, der i hovedsagen er fri for tomme capsider
EP3502252B1 (en) 2003-06-02 2023-04-05 University of Massachusetts Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
ATE485394T1 (de) 2003-06-02 2010-11-15 Univ Massachusetts Verfahren und zusammensetzungen zur verbesserung der wirksamkeit und spezifität von fnai
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
PT2657248T (pt) 2003-06-19 2017-06-26 Genzyme Corp Viriões aav com imunorreatividade diminuída e seus usos
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7491508B2 (en) 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
WO2005007875A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 University Of Massachusetts Enhanced promoters for synthesis of small hairpin rna
ES2391975T3 (es) 2003-07-25 2012-12-03 Genvec, Inc. Vacunas a base de vector adenovírico
EP2530157B1 (en) 2003-07-31 2016-09-28 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of miRNAs
US20070003977A1 (en) 2003-08-20 2007-01-04 Amorfix Life Sciences Ltd Epitope protection assay and method for detecting protein conformations
DK2821085T3 (da) 2003-09-12 2020-08-03 Univ Massachusetts Rna-interferens til behandling af "gain-of-function"-forstyrrelser
US20050064489A1 (en) 2003-09-24 2005-03-24 Zhang Fang Liang Engineered U6 and H1 promoters
EP2292780B1 (en) 2003-09-30 2017-08-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses thereof
AU2004286261B2 (en) 2003-10-27 2010-06-24 Merck Sharp & Dohme Llc Method of designing siRNAs for gene silencing
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
US20050182424A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Schulte Gregory T. Methods and apparatus for securing a therapy delivery device within a burr hole
CA2558771C (en) 2004-03-05 2013-01-08 Benitec, Inc. Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents
US7498316B2 (en) 2004-04-06 2009-03-03 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using RNA interference
DE602005026269D1 (de) 2004-04-28 2011-03-24 Univ Pennsylvania Sequenzielle freisetzung immunogener moleküle über adenoviren und adeno-assoziierte viren vermittelte abgaben
GB0412072D0 (en) * 2004-05-28 2004-06-30 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
JP2008501339A (ja) 2004-06-01 2008-01-24 ジェンザイム・コーポレイション Ａａｖベクターの凝集を防ぐための組成物およびその方法
PL1807009T3 (pl) 2004-10-05 2015-06-30 Genzyme Corp Stopniowana kaniula
US7901921B2 (en) 2004-10-22 2011-03-08 Oncolytics Biotech Inc. Viral purification methods
ES2556272T3 (es) 2004-11-18 2016-01-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Constructos de ARNsi multicistrónico para inhibir tumores
CN1286981C (zh) 2004-11-30 2006-11-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
EP1828390B1 (en) 2004-12-15 2012-06-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
US20060229268A1 (en) * 2004-12-16 2006-10-12 Alsgen, Llc Small interference RNA (siRNA) molecules for modulating superoxide dismutase (SOD)
JP4292416B2 (ja) 2005-01-12 2009-07-08 住友電気工業株式会社 超電導ケーブルの端末構造
US8076471B2 (en) 2005-02-03 2011-12-13 Benitec, Inc. RNAi expression constructs
US8614101B2 (en) 2008-05-20 2013-12-24 Rapid Pathogen Screening, Inc. In situ lysis of cells in lateral flow immunoassays
US7625570B1 (en) 2005-03-10 2009-12-01 The Regents Of The University Of California Methods for purifying adeno-associated virus
WO2006102072A2 (en) 2005-03-23 2006-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a pa131 polypeptide in treatment of atherosclerosis
EP2359865B1 (en) 2005-04-07 2013-10-02 The Trustees of The University of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
CN101212988A (zh) 2005-05-02 2008-07-02 建新公司 神经代谢疾病的基因治疗
US20070105803A1 (en) 2005-08-18 2007-05-10 Muthiah Manoharan Methods and compositions for treating neurological disease
CA2619882C (en) 2005-08-23 2015-05-26 The Regents Of The University Of California Reflux resistant cannula and system for chronic delivery of therapeutic agents using convection-enhanced delivery
EP1857552A1 (en) 2006-05-20 2007-11-21 Cargill Incorporated Thermostable xylose isomerase enzyme
CN101287837B (zh) 2005-10-20 2015-03-18 尤尼克尔生物制药股份有限公司 昆虫细胞中生产的改进的aav载体
US7887803B2 (en) 2005-12-02 2011-02-15 Amorfix Life Sciences Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases
US7794692B2 (en) 2005-12-02 2010-09-14 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis
WO2007092182A2 (en) 2006-01-26 2007-08-16 University Of Massachusetts Rna interference agents for therapeutic use
WO2007089632A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
EP1979485A2 (en) 2006-01-31 2008-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
DK2495327T3 (da) 2006-03-03 2017-01-02 Promis Neurosciences Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til at behandle og opdage sygdomme fremkaldt af fejlfoldet SOD1
WO2007109097A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi MODULATION OF TGF-BETA AND THERAPEUTIC USES THEREOF
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
WO2007112754A2 (en) 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
CN101528916B (zh) 2006-04-28 2013-09-04 宾夕法尼亚大学托管会 规模可调的aav生产方法
CN101495624A (zh) 2006-04-28 2009-07-29 宾夕法尼亚州立大学托管会 衣壳免疫原性降低的经修饰aav载体及其用途
JP5889514B2 (ja) 2006-04-28 2016-03-22 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 改変アデノウイルスヘキソンタンパク質およびその用途
US20080003565A1 (en) 2006-05-02 2008-01-03 Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Viral nucleic acid microarray and method of use
JP5825754B2 (ja) 2006-05-05 2015-12-02 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ａｐｏｂの発現を調節するための化合物および方法
AU2007267874B2 (en) 2006-05-25 2012-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
US8512981B2 (en) 2006-06-21 2013-08-20 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Vectors with modified initiation codon for the translation of AAV-Rep78 useful for production of AAV
WO2008011636A2 (en) 2006-07-21 2008-01-24 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
DK2061891T3 (da) 2006-08-24 2012-07-23 Virovek Inc Ekspression i insektceller af gener med overlappende åbne læserammer, fremgangsmåder og sammensætninger hertil
FR2905806B1 (fr) 2006-09-13 2008-12-26 Valeo Equip Electr Moteur Arbre de rotor a griffes, rotor a griffes equipe d'un tel arbre et machine electrique tournante equipee d'un tel rotor
ES2391789T3 (es) 2006-10-03 2012-11-29 Genzyme Corporation Terapia génica para la esclerosis lateral amiotrófica y otros trastornos de la médula espinal
US7794443B2 (en) 2006-10-24 2010-09-14 Medtronic, Inc. System and method for intraparenchymal drug infusion
WO2008067398A2 (en) 2006-11-29 2008-06-05 University Of Iowa Research Foundation Alternative export pathways for vector expressed rna interference
EP2097095B1 (en) 2006-11-29 2016-01-27 Nationwide Children's Hospital Myostatin inhibition for enhancing muscle and/or improving muscle function
WO2008086079A2 (en) 2007-01-03 2008-07-17 Medtronic, Inc. Compositions comprising rnai and a neurotrophic factor and uses thereof
US8173614B2 (en) 2007-01-03 2012-05-08 Medtronic, Inc. Therapeuting compositions comprising an RNAi agent and a neurotrophic factor and methods of use thereof
WO2008094516A2 (en) 2007-01-29 2008-08-07 City Of Hope Multi-targeting short interfering rnas
WO2008097503A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Biogen Idec Ma Inc. Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
WO2008128251A1 (en) 2007-04-17 2008-10-23 The Children's Hospital Of Philadelphia Humanized viral vectors and methods of use thereof
US20090036395A1 (en) 2007-04-26 2009-02-05 Davidson Beverly L Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
EP2158211B1 (en) 2007-05-31 2016-08-10 Medigene AG Mutated structural protein of a parvovirus
CA2691617C (en) 2007-05-31 2020-07-21 University Of Iowa Research Foundation Reduction of off-target rna interference toxicity
EP2012122A1 (en) 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
US8841437B2 (en) 2008-06-20 2014-09-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Precursor miRNA loop-modulated target regulation
MX2009013120A (es) 2007-06-29 2010-01-15 Hoffmann La Roche Promotor.
WO2009006450A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Boston Biomedical, Inc. Bacteria-mediated gene modulation via microrna machinery
CA3002933A1 (en) 2007-07-14 2009-01-22 Beverly L. Davidson Methods and compositions for treating brain diseases
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
DK2173888T3 (en) 2007-07-26 2016-11-28 Uniqure Ip Bv Baculovirus vectors comprising repeating coding sequences WITH differential preferred codons
WO2009029688A2 (en) 2007-08-27 2009-03-05 Boston Biomedical, Inc. Compositions of asymmetric interfering rna and uses thereof
US8420372B2 (en) 2007-09-04 2013-04-16 Alexander Bello Porcine adeno-associated viruses
EP2195439B1 (en) 2007-09-19 2013-06-19 UniQure IP B.V. Use of aav replication machinery for improved protein production
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
EP2186283A4 (en) 2007-10-18 2011-03-09 Lg Electronics Inc METHOD AND SYSTEM FOR TRANSMITTING AND RECEIVING SIGNALS
ES2621165T3 (es) 2007-11-28 2017-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus de simio de la subfamilia B SADV-28, -27, -29, -32, -33 y -35 y usos de los mismos
MX2010005860A (es) 2007-11-28 2010-06-22 Univ Pennsylvania Adenovirus simianos de la subfamilia c sadv-40, sadv-31 y sadv-34 y usos de los mismos.
SI2220241T1 (sl) 2007-11-28 2017-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus, ki obsega kapsidni heksonski protein opičjega E adenovirusa SAdV-39, in njegove uporabe
US8480626B2 (en) 2007-11-30 2013-07-09 Medtronic, Inc. Infusion catheter assembly with reduced backflow
JP5523345B2 (ja) 2008-01-18 2014-06-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｋ６３結合型ポリユビキチンを標的とする方法と組成物
EP2242840B1 (en) 2008-01-29 2019-07-24 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant adeno-associated virus production using bhk cells in suspension
CA2715924C (en) 2008-02-19 2021-01-12 Andrew Christian BAKKER Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells
JP5661476B2 (ja) 2008-03-04 2015-01-28 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途
US8632764B2 (en) 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
WO2009134681A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav7 viral vectors for targeted delivery of rpe cells
US20120093772A1 (en) 2008-05-20 2012-04-19 Alan Horsager Vectors for delivery of light sensitive proteins and methods of use
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
WO2009151620A2 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Cornell Research Foundation, Inc. Wmc Pain treatment using erk2 inhibitors
EP2297185A1 (en) 2008-06-17 2011-03-23 Amsterdam Molecular Therapeutics (AMT) B.V. Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region
US8945885B2 (en) 2008-07-03 2015-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Minicircle DNA vector preparations and methods of making and using the same
JP5328244B2 (ja) 2008-07-07 2013-10-30 株式会社ニュージェン・ファーマ 筋萎縮性側索硬化症治療剤
CA2731779A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
WO2010014857A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 University Of Massachusetts Chromosome therapy
CN102405286A (zh) 2008-09-22 2012-04-04 阿克赛医药公司 减小大小的自递送RNAi化合物
ES2507540T3 (es) 2008-09-29 2014-10-15 Uniqure Ip B.V. Terapia génica de porfobilinógeno deaminasa
CA2741089A1 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
US8940290B2 (en) 2008-10-31 2015-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50 and uses thereof
EP2396343B1 (en) 2009-02-11 2017-05-17 The University of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
BRPI1013364A2 (pt) 2009-03-04 2016-03-29 Deutsches Krebsforsch proteína ativadora de montagem (aap) e seu uso para a fabricação de partículas de parvovírus que consistem essencialmente em vp3.
AU2010227419A1 (en) 2009-03-27 2011-10-20 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Methods and compositions for the treatment of cirrhosis and liver fibrosis
WO2010127097A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for targeting conducting airway cells comprising adeno-associated virus constructs
US8476418B2 (en) 2009-05-28 2013-07-02 Deutsches Krebsforschungszentrum Modified AAV capsid polypeptides
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
CA2762203A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Soumitra Roy Simian adenovirus 41 and uses thereof
JP5956331B2 (ja) 2009-06-16 2016-07-27 ジェンザイム・コーポレーション 組換えａａｖベクターの改良された精製方法
EP2451823A4 (en) 2009-07-06 2013-07-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE PRODUCTION OF A BIOLOGICAL PRODUCT
CA2767972A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Calimmune Inc. Dual vector for inhibition of human immunodeficiency virus
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
WO2011038187A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Controlled adeno-associated virus (aav) diversification and libraries prepared therefrom
KR20120089743A (ko) 2009-11-09 2012-08-13 제네포드 테라퓨틱스 에이비 생체 내에서 최적화된 뉴런 특이적 연속 도파 합성을 위한 신규한 바이러스 벡터 구성물
WO2011062298A1 (ja) 2009-11-19 2011-05-26 国立大学法人岡山大学 遺伝子発現を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
EP2524037B1 (en) 2010-01-12 2018-05-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
ES2628889T3 (es) 2010-02-05 2017-08-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Composiciones y métodos para la transducción mejorada del parvovirus
US9163261B2 (en) 2010-02-22 2015-10-20 Koteswara Rao KOLLIPARA Adeno-associated virus 2/8—micro RNA-101 therapy for liver cancer
US9228174B2 (en) 2010-03-11 2016-01-05 Uniqure Ip B.V. Mutated rep encoding sequences for use in AAV production
WO2011117258A2 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Association Institut De Myologie Methods of increasing efficiency of vector penetration of target tissue
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
SG183929A1 (en) 2010-03-29 2012-10-30 Univ Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
US9102949B2 (en) 2010-04-23 2015-08-11 University Of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP2561075B1 (en) 2010-04-23 2018-06-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US9839696B2 (en) 2010-04-30 2017-12-12 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
WO2012029994A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Kyoto University Pharmaceutical composition for prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US8808684B2 (en) 2010-09-10 2014-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epidermal growth factor receptor (EGFR) and methods of use in adenoviral-associated virus type 6 (AAV6) transduction
WO2012046727A1 (ja) 2010-10-05 2012-04-12 タカラバイオ株式会社 ウイルスベクターの製造方法
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
JP5704361B2 (ja) 2010-10-27 2015-04-22 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
US20130236433A1 (en) 2010-11-11 2013-09-12 Keith A. Webster Methods, compositions, cells, and kits for treating ischemic injury
EP3075860A1 (en) 2010-11-23 2016-10-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Subfamily e simian adenovirus a1295 and uses thereof
EP2673286B1 (en) 2011-02-12 2019-07-03 University of Iowa Research Foundation Therapeutic compounds
AU2012219380B2 (en) 2011-02-17 2017-04-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving AAV9-mediated gene transfer
GB201103062D0 (en) 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
EP2500434A1 (en) 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
CN103476399A (zh) 2011-04-18 2013-12-25 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 药剂递送粒子及其制造方法
WO2012145572A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
EP3318634A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating diseases involving dominant-negative or gain of function mutations
DK2699270T3 (en) 2011-04-22 2017-10-02 Univ California ADENO-ASSOCIATED VIRUS VIRUSES WITH VARIANT CAPSID AND METHODS FOR USING IT
WO2012149646A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Sunnybrook Research Institute Mirna inhibitors and their uses
US9249425B2 (en) 2011-05-16 2016-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Proviral plasmids and production of recombinant adeno-associated virus
WO2012159006A2 (en) 2011-05-18 2012-11-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Polypeptides and vectors for targeting her2/neu expressing cells and uses thereof
CA2831969A1 (en) 2011-06-06 2012-12-30 Biocartis S.A. Selective lysis of cells by ionic surfactants
US20130019580A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Anderson Noel W Bidirectional harvesting system
EP3290055B1 (en) 2011-07-25 2024-08-28 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
IN2014CN00688A (ru) 2011-07-27 2015-04-03 Genethon
US8852911B2 (en) 2011-08-04 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Method of producing dicer
WO2013036118A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Uniqure Ip B.V. Removal of contaminating viruses from aav preparations
WO2013036889A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 University Of Washington Retrograde transport peptide and use of same for delivery to central nervous system
JP6165752B2 (ja) 2011-10-28 2017-07-19 ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル アデノ随伴ウイルスの産生のための細胞株
CA2856137A1 (en) 2011-11-22 2013-05-30 The Children's Hospital Of Philadelphia Virus vectors for highly efficient transgene delivery
WO2013078199A2 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Children's Medical Center Corporation Methods for enhanced in vivo delivery of synthetic, modified rnas
WO2013103896A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
JP2013143917A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Mie Univ 線維症予防又は治療剤
BR112014020127A2 (pt) 2012-02-14 2020-06-30 The Regents Of The University Of Calefornia métodos para tratamento, melhoramento ou proteção (prevenção) de um indivíduo ou um paciente, e de uma disfunção, uma doença, uma infecção ou uma condição, e, método para suprimir o ganho de peso, ou suprimir o apepite, ou estimular ou iniciar a perda de peso
CA2864879C (en) 2012-02-17 2021-07-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
ES2862912T3 (es) 2012-04-18 2021-10-08 Childrens Hospital Philadelphia Composición y procedimientos para la transferencia genética de alta eficiencia utilizando variantes de cápside de VAA
EP2660325A3 (en) 2012-05-02 2014-02-12 Christian Medical College AAV vectors and corresponding nucleotide sequences and methods
US9163259B2 (en) 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
JP6385920B2 (ja) 2012-05-09 2018-09-05 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
TWI702955B (zh) 2012-05-15 2020-09-01 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒（ａａｖ）ｓｆｌｔ-１治療老年性黃斑部退化（ａｍｄ）
MX358019B (es) 2012-05-18 2018-08-02 Univ Pennsylvania Adenovirus de simio de la subfamilia e a1302, a1320, a1331 y a1337 y sus usos.
WO2013177367A2 (en) 2012-05-23 2013-11-28 The Johns Hopkins University Compounds and methods of use thereof for treating neurodegenerative disorders
KR101738438B1 (ko) 2012-07-06 2017-05-22 다카라 바이오 가부시키가이샤 아데노-관련 바이러스 벡터의 생산세포
RU2679843C2 (ru) 2012-07-06 2019-02-13 Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн Векторные композиции с модифицированным аденоассоциированным вирусом
JP2015524264A (ja) 2012-07-17 2015-08-24 ユニベルシテ ドゥ ジュネーブ 遺伝子発現の下方制御のための核酸
PT2879719T (pt) 2012-08-01 2018-10-08 Ohio State Innovation Foundation Administração intratecal do vírus adeno-associado 9 recombinante
JP2015529685A (ja) 2012-09-17 2015-10-08 ザ・リサーチ・インスティテュート・アット・ネイションワイド・チルドレンズ・ホスピタルＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｔｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ 筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物および方法
PL2900686T3 (pl) 2012-09-28 2021-01-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Wektory aav ukierunkowane na oligodendrocyty
US20140243783A1 (en) 2012-10-06 2014-08-28 Raghu Raghavan Method of backflow reduction during material delivery through a needle into tissue
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2014071042A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying candidates for the treatment of neurodegenerative diseases
KR102315098B1 (ko) 2012-11-01 2021-10-21 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
EP4299741A3 (en) 2012-12-12 2024-02-28 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
JP6363958B2 (ja) 2012-12-25 2018-07-25 タカラバイオ株式会社 Ａａｖ変異体
CN105008523B (zh) 2013-01-08 2020-03-27 建新公司 iNOS抑制剂用于增加培养物中病毒产率的用途
KR20150103280A (ko) 2013-01-08 2015-09-09 베니텍 바이오파마 리미티드 연령-관련 황반 변성 치료
EP2954051B1 (en) 2013-02-08 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified aav8 capsid for gene transfer for retinal therapies
AU2014244167A1 (en) 2013-03-13 2015-10-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
BR112015021884A8 (pt) 2013-03-15 2019-11-26 Childrens Hospital Philadelphia vetores de plasmídeo recombinantes, partícula viral avv ou pluralidade de partículas virais, seus métodos de produção e seus usos, e composição farmacêutica
WO2014144844A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY
US9447433B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic adeno-associated virus inverted terminal repeats
CA2909085C (en) 2013-04-08 2023-08-29 University Of Iowa Research Foundation Chimeric adeno-associated virus/ bocavirus parvovirus vector
EP2792742A1 (en) 2013-04-17 2014-10-22 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) Gene-therapy vectors for treating cardiomyopathy
DK2986635T3 (en) 2013-04-18 2019-01-28 Fond Telethon EFFECTIVE DELIVERY OF BIG GENES THROUGH DUAL-AAV VECTORS
CA2909807C (en) 2013-04-20 2023-08-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus delivery of exon 2-targeted u7snrna polynucleotide constructs
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
HK1222093A1 (zh) 2013-05-15 2017-06-23 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
US10006049B2 (en) 2013-05-16 2018-06-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Hairpin mRNA elements and methods for the regulation of protein translation
ES2897508T3 (es) 2013-05-31 2022-03-01 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
WO2014201308A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 Washington University Endothelial-targeted adenoviral vectors, methods and uses therefor
US20160122727A1 (en) 2013-06-13 2016-05-05 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Messenger rna based viral production
IL297919A (en) 2013-07-22 2023-01-01 Childrens Hospital Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
DK3024497T3 (da) 2013-07-26 2021-04-12 Univ Iowa Res Found Fremgangsmåder og præparater til behandling af hjernesygdomme
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
EP3033434A2 (en) 2013-08-14 2016-06-22 Qiagen Mansfield, Inc. Compositions and methods for multimodal analysis of cmet nucleic acids
PT3039146T (pt) 2013-08-27 2020-08-11 The Res Institute At Nationwide Childrens Hospital Produtos e métodos para tratamento de esclerose lateral amiotrófica
EP3039129B1 (en) 2013-08-30 2018-06-27 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
EP3564379A1 (en) 2013-09-13 2019-11-06 California Institute of Technology Selective recovery
US20160354489A1 (en) 2013-09-26 2016-12-08 Universitat Autònome de Barcelona Gene therapy compositions for use in the prevention and/or treatment of non-alcoholic fatty liver disease
US20160369298A1 (en) 2013-09-26 2016-12-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
CN115141258B (zh) 2013-10-11 2025-05-20 马萨诸塞眼科耳科诊所 预测祖先病毒序列的方法及其用途
CA2927366A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
AU2014346987A1 (en) 2013-11-05 2016-06-23 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for inhibiting NF-kB and SOD-1 to treat amyotrophic lateral sclerosis
US20160272687A1 (en) 2013-11-08 2016-09-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus "x" oncogene
CA2930872C (en) 2013-11-26 2022-05-31 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Adeno-associated virus vectors for treatment of glycogen storage disease
WO2015080223A1 (ja) 2013-11-29 2015-06-04 タカラバイオ株式会社 アデノ随伴ウイルスの定量方法
SG11201604505QA (en) 2013-12-03 2016-07-28 Agency Science Tech & Res Tailed Mirtron Effectors For RNAi-Mediated Gene Silencing
EP3572513B1 (en) 2013-12-09 2025-09-24 Baylor College of Medicine Hippo and dystrophin complex signaling in cardiomyocyte renewal
EP3653703A1 (en) 2013-12-12 2020-05-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
WO2015106273A2 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Trustees Of Boston University Methods and assays relating to huntingtons disease and parkinson's disease
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
WO2015124546A1 (en) 2014-02-19 2015-08-27 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii- Cnic Aav vectors for the treatment of ischemic and non-ischemic heart disease
US20170007720A1 (en) 2014-02-21 2017-01-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for gene delivery to on bipolar cells
ES2768763T3 (es) 2014-03-04 2020-06-23 Univ Florida Vectores rAAV mejorados y métodos para la transducción de fotorreceptores y células EPR
MX385339B (es) 2014-03-10 2025-03-18 Uniqure Ip Bv Vectores aav mejorados adicionales producidos en células de insecto.
AU2015231294B2 (en) 2014-03-18 2020-10-29 University Of Massachusetts rAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
SI3126499T1 (sl) 2014-04-01 2020-09-30 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
JP6741590B2 (ja) 2014-04-25 2020-08-19 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア コレステロールレベルを低下させるためのｌｄｌｒ変異体および組成物中でのそれらの使用
US10975391B2 (en) 2014-04-25 2021-04-13 University Of Massachusetts Recombinant AAV vectors useful for reducing immunity against transgene products
US9194250B1 (en) 2014-05-07 2015-11-24 General Electric Company Embedded wireless sensors for turbomachine component defect monitoring
AU2015255877B2 (en) 2014-05-08 2020-03-26 Chdi Foundation, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
EP3142706A1 (en) 2014-05-16 2017-03-22 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
RU2711147C2 (ru) 2014-05-20 2020-01-15 Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн Терапевтические соединения для лечения болезни хантингтона
EP3160980B1 (en) 2014-05-28 2020-05-20 The Regents of the University of California HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
WO2015192063A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Yasuhiro Ikeda Methods and materials for increasing viral vector infectivity
WO2015196179A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of packaging multiple adeno-associated virus vectors
WO2016004319A1 (en) 2014-07-02 2016-01-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for purifying recombinant adeno-associated virus
US10023846B2 (en) 2014-07-10 2018-07-17 Takara Bio Inc. Production method for non-enveloped virus particles
EP3174981B1 (en) 2014-07-31 2020-03-25 Association Institut de Myologie Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US10392622B2 (en) 2014-08-01 2019-08-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for self-regulated inducible gene expression
WO2016054554A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted aavs
WO2016054557A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 University Of Massachusetts Novel high efficiency library-identified aav vectors
US10842886B2 (en) 2014-10-10 2020-11-24 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Guided injections for AAV gene transfer to muscle
CA2964272A1 (en) 2014-10-21 2016-04-28 Guangping Gao Recombinant aav variants and uses thereof
EP3690024A1 (en) 2014-11-05 2020-08-05 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital Methods and materials for producing recombinant viruses in eukaryotic microalgae
US10758264B2 (en) 2014-11-13 2020-09-01 The Regents Of The University Of California Adjustable stepped cannula
RU2716422C2 (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
CN112410339A (zh) 2014-11-14 2021-02-26 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
EP3221456B1 (en) 2014-11-21 2021-09-22 University of Florida Research Foundation, Inc. Genome-modified recombinant adeno-associated virus vectors
KR20240063169A (ko) 2014-11-21 2024-05-10 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 중추 신경계에 표적화된 aav 벡터
WO2016083560A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Uniqure Ip B.V. Dna impurities in a composition comprising a parvoviral virion
HK1245326A1 (zh) 2014-12-12 2018-08-24 Voyager Therapeutics, Inc. 用於生产scaav的组合物和方法
SMT201900347T1 (it) 2014-12-24 2019-07-11 Uniqure Ip Bv Soppressione del gene huntingtina indotta da rnai
CA2971687C (en) 2014-12-30 2024-05-28 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
US10907176B2 (en) 2015-01-14 2021-02-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeted gene transfer
CA2970730A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Voyager Therapeutics, Inc. Central nervous system targeting polynucleotides
JP2018506530A (ja) 2015-01-30 2018-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 脊柱軟膜下遺伝子送達システム
US20180030096A1 (en) 2015-02-03 2018-02-01 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2018-03-08 ジェンザイム・コーポレーション バリアントＲＮＡｉ
CA2976082A1 (en) 2015-02-10 2016-08-18 Genzyme Corporation Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
EP3262162A4 (en) 2015-02-23 2018-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
CN107614008A (zh) 2015-03-20 2018-01-19 蓝鸟生物公司 载体制剂
US10883117B2 (en) 2015-03-24 2021-01-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
EP3277811B1 (en) 2015-04-03 2020-12-23 University of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
HRP20201200T1 (hr) 2015-04-03 2020-11-13 University Of Massachusetts OLIGONUKLEOTIDNI SPOJEVI ZA CILJANJE HUNTINGTIN mRNK
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
CN108093639B (zh) 2015-04-16 2022-07-19 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
US11020443B2 (en) 2015-04-23 2021-06-01 University Of Massachusetts Modulation of AAV vector transgene expression
CA3021949C (en) 2015-04-24 2023-10-17 University Of Massachusetts Modified aav constructs and uses thereof
US20160346359A1 (en) 2015-05-01 2016-12-01 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated Virus-Mediated CRISPR-Cas9 Treatment of Ocular Disease
CA2985223A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of delivering an agent to the eye
CN107735140B (zh) 2015-05-11 2021-04-20 亚克安娜生命科学有限公司 药物输送系统和方法
EP3294894B8 (en) 2015-05-12 2019-09-25 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Aav isolate and fusion protein comprising nerve growth factor signal peptide and parathyroid hormone
US20170067028A1 (en) 2015-05-15 2017-03-09 Douglas J. Ballon Radiolabeling of adeno associated virus
WO2016191418A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Salk Institute For Biological Studies Motor neuron-specific expression vectors
US11027024B2 (en) 2015-05-29 2021-06-08 University Of Iowa Research Foundation Methods of delivery of transgenes for treating brain diseases
EP3302706A4 (en) 2015-05-29 2019-05-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR REMOVING MISINTEGRATED PROTEINS
WO2017004514A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors to target medullary thyroid carcinoma
WO2017005806A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for expressing a polynucleotide of interest in the peripheral nervous system of a subject
US20170007669A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of active agents across the blood-brain barrier
US20170009304A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Splicingcodes.Com Method and kit for detecting fusion transcripts
US20180216133A1 (en) 2015-07-17 2018-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for achieving high levels of transduction in human liver cells
US20180214576A1 (en) 2015-07-28 2018-08-02 University Of Massachusetts Transgenic expression of dnasei in vivo delivered by an adeno-associated virus vector
JP7166168B2 (ja) 2015-07-30 2022-11-07 マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー 祖先ウイルス配列およびその使用
US20180201937A1 (en) 2015-08-04 2018-07-19 The University Of Chicago Inhibitors of cacna1a/alpha1a subunit internal ribosomal entry site (ires) and methods of treating spinocerebellar ataxia type 6
US10047377B2 (en) 2015-09-22 2018-08-14 Loyola University Of Chicago Methods for modulating KLHL1 levels, methods for modulating current activity in T-type calcium channels, molecules therefor, and methods for identifying molecules therefor
CN108137655B (zh) 2015-09-28 2022-04-22 北卡罗来纳-查佩尔山大学 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物
AU2016335572B2 (en) 2015-10-09 2022-12-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating Huntington's disease and related disorders
HUE069884T2 (hu) 2015-10-09 2025-04-28 Genzyme Corp Javított flare (áramlási citometriával csillapított reporter expresszió) technológia gyors tömeges válogatáshoz
US10123969B2 (en) 2015-10-15 2018-11-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Osmotic enhancement of drug/therapeutic delivery to the brain following infusion or injection into the cerebrospinal fluid
US12188037B2 (en) 2015-10-22 2025-01-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Synthetic combinatorial AAV3 capsid library
CA3002980A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
DK3364997T5 (da) 2015-10-22 2024-09-30 Univ Massachusetts Aspartoacylase genterapi til behandling af canavans sygdom
AU2016341428B2 (en) 2015-10-23 2021-12-02 University Of Iowa Research Foundation Methods for treating neurodegenerative diseases using gene therapy to delay disease onset and progression while providing cognitive protection
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
CN108602884B (zh) 2015-11-08 2024-06-25 豪夫迈·罗氏有限公司 筛选多特异性抗体的方法
US10633662B2 (en) 2015-11-10 2020-04-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating AAV infection
SG11201804400SA (en) 2015-12-01 2018-06-28 Spark Therapeutics Inc Scalable methods for producing recombinant adeno-associated viral (aav) vector in serum-free suspension cell culture system suitable for clinical use
WO2017095753A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Invivo Therapeutics Corporation Compositions and methods for preparing an injectable medium for administration into the central nervous system
US10385320B2 (en) 2015-12-02 2019-08-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Recombinant adeno-associated virus capsids with enhanced human skeletal muscle tropism
US10406244B2 (en) 2015-12-02 2019-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University AAV vectors with expanded packaging capacity
CN108699135B (zh) 2015-12-03 2022-10-04 吉尼松公司 用于改善病毒载体效率的组合物和方法
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
ES2918998T3 (es) 2015-12-11 2022-07-21 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAVrh10
US11098286B2 (en) 2015-12-11 2021-08-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV9
DK3387137T3 (da) 2015-12-11 2021-05-03 California Inst Of Techn Målretningspeptider til styring af adeno-associerede virusser (aav`er)
EP3387117B1 (en) 2015-12-11 2022-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
US11124546B2 (en) 2015-12-14 2021-09-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified capsid proteins for enhanced delivery of parvovirus vectors
WO2017112948A1 (en) 2015-12-24 2017-06-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved aav production using suspension adapted cells
EP3403675B1 (en) 2016-01-15 2021-04-21 Jichi Medical University Adeno-associated virus virion for use in treatment of epilepsy
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
FI3411484T3 (fi) 2016-02-05 2023-11-15 Univ Emory Yksisäikeisen tai itsekomplementaarisen adenoassosioidun viruksen 9 injektio serebrospinaaliseen fluidiin
US11702672B2 (en) 2016-02-08 2023-07-18 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
EP3417055B1 (en) 2016-02-16 2021-10-13 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Novel recombinant adeno-associated virus capsids resistant to pre-existing human neutralizing antibodies
US20190071681A1 (en) 2016-02-26 2019-03-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav heparin mutants that display significantly improved eye and brain transduction
MX2018010633A (es) 2016-03-03 2019-06-13 Univ Massachusetts Acido desoxirribonucleico (adn) lineal duplex de extremos cerrados para transferencia genica no viral.
US11684679B2 (en) 2016-03-07 2023-06-27 University Of Iowa Research Foundation AAV-mediated expression using a synthetic promoter and enhancer
WO2017165859A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
AU2017245099B2 (en) 2016-03-28 2021-07-29 The Regents Of The University Of California Anti-Ryk antibodies and methods of using the same
PT3436593T (pt) 2016-03-28 2023-01-31 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Métodos de inativação pelo calor de adenovírus
EP3436576A4 (en) 2016-03-30 2019-10-30 Spark Therapeutics, Inc. CELL LINE FOR RECOMBINANT PROTEIN AND / OR VIRUS VECTOR PRODUCTION
HUE056854T2 (hu) 2016-03-31 2022-03-28 Spark Therapeutics Inc Oszlop alapú, teljes mértékben méretezhetõ rAAV elõállítási eljárás
SG11201808812RA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Univ Pennsylvania Novel aav8 mutant capsids and compositions containing same
AU2017248840B2 (en) 2016-04-16 2022-07-28 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods of enhancing biological potency of baculovirus system-produced recombinant adeno-associated virus
NZ744418A (en) 2016-04-21 2025-10-31 Virovek Inc Aav production in insect cells, methods and compositions therefor
EP3235516B1 (en) 2016-04-22 2019-06-26 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin Regulatable adeno-associated virus (aav) vector
WO2017190031A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Indiana University Research And Technology Corporation Methods and compositions for resolving components of a virus preparation
EP3448875A4 (en) 2016-04-29 2020-04-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US10882886B2 (en) 2016-05-03 2021-01-05 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus polynucleotides, polypeptides and virions
WO2017192750A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Oregon Health & Science University Recombinant adeno-associated viral vectors
CN109831916B (zh) 2016-05-18 2023-07-21 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法
CA3252099A1 (en) 2016-05-18 2025-06-05 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
SG11201909777YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
CN111108207A (zh) 2017-06-02 2020-05-05 国家健康与医学研究院 用于遗传障碍的基因疗法的基因组编辑手段和结合病毒载体的基因疗法
KR102850887B1 (ko) 2017-08-03 2025-08-28 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN119242711A (zh) 2017-10-16 2025-01-03 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症（als）的治疗
WO2019222329A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
US20210254103A1 (en) 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
US20210371470A1 (en) 2018-10-12 2021-12-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2020223296A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
WO2023092002A2 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis and disorders associatedwith the spinal cord

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180756A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Yang Shi Compositions and methods for suppressing eukaryotic gene expression
US20110039914A1 (en) * 2008-02-11 2011-02-17 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified rnai polynucleotides and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ТРАНСДУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. Составители: МИТРОШИНА Е.В., ВЕДУНОВА Е.В., СИМОНОВ А.Ю., БАБАЕВ А.А.: учебно-методическое пособие. Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2013. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2804196C1 (ru) * 2023-07-18 2023-09-26 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ терапии бокового амиотрофического склероза

Also Published As

Publication number Publication date
CN114717264A (zh) 2022-07-08
US20250146000A1 (en) 2025-05-08
AU2015346162A1 (en) 2017-05-11
US10597660B2 (en) 2020-03-24
AU2015346162B2 (en) 2022-02-10
US11542506B2 (en) 2023-01-03
CA2967367C (en) 2023-05-16
CA2967367A1 (en) 2016-05-19
EP3218484A4 (en) 2018-05-30
BR112017010087A2 (pt) 2018-06-05
HK1244299A1 (zh) 2018-08-03
CN107109407A (zh) 2017-08-29
ZA201702991B (en) 2019-12-18
IL251911B (en) 2020-11-30
CA3193811A1 (en) 2016-05-19
SG11201703281RA (en) 2017-05-30
MX2023007728A (es) 2023-09-11
US10920227B2 (en) 2021-02-16
JP2024079794A (ja) 2024-06-11
US12123002B2 (en) 2024-10-22
IL251911A0 (en) 2017-06-29
IL278001B (en) 2022-06-01
JP2022081546A (ja) 2022-05-31
JP2021007394A (ja) 2021-01-28
US20200157547A1 (en) 2020-05-21
US20180282732A1 (en) 2018-10-04
KR20230169197A (ko) 2023-12-15
IL278001A (en) 2020-11-30
EP3218484A1 (en) 2017-09-20
WO2016077687A1 (en) 2016-05-19
MX2017006216A (es) 2018-08-29
KR102599909B1 (ko) 2023-11-09
RU2017116576A3 (ru) 2019-04-16
RU2020108189A (ru) 2020-03-11
WO2016077687A4 (en) 2016-08-04
US20230332156A1 (en) 2023-10-19
JP2017535266A (ja) 2017-11-30
IL292999A (en) 2022-07-01
RU2017116576A (ru) 2018-11-14
KR20170071541A (ko) 2017-06-23
AU2022202979A1 (en) 2022-05-26
US20210139915A1 (en) 2021-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12123002B2 (en) Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
US20230295663A1 (en) Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JP7502991B2 (ja) 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
US11951121B2 (en) Compositions and methods for treating Huntington&#39;s disease
CN107207556B (zh) 调节性多核苷酸
JP7565218B2 (ja) 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
US20200237799A1 (en) Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US20220168450A1 (en) Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
BR112017010087B1 (pt) Genoma de vetor viral adeno-associado (aav) e usos do mesmo