ES2375557T3 - Adenovirus recombinantes que comprenden prote�?nas de adenovirus de simios y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus, caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16, fusionada en un péptido hexon de adenovirus heterólogo, encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición de terminal invertido 5' (ITRs) de adenovirus, un minigén, y una ITR 3' de adenovirus, en el que dicho uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se selecciona en el grupo consistente en: (a) aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID núm. 16; (b) aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID núm. 16; (c) aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID núm. 16; (d) aminoácidos 195 a 203 de SEQ ID núm. 16; (e) aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID núm. 16; (f) aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID núm. 16; (g) aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID núm. 16, y (h) aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID núm. 16.

Description

Adenovirus recombinantes que comprenden proteínas de adenovirus de simios y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

Los adenovirus recombinantes han sido descritos para usos de terapias de gen y vacunas.

Los adenovirus tienen una morfología característica con un cápside icosaédrico consistente en tres proteínas mayores, hexon (II), penton base (III) y fibra en forma de botón (IV), junto con un número de otras tres proteínas menores, VI, VIII, IX, IIIa y IVa2 [W.C. Russell, J. Gen Virol., 81:2573-2604 (Noviembre 2000)]. El genoma de virus es un ADN lineal, de doble cadena, con una proteína terminal unida covalentemente a las terminaciones 5’, la cuales tienen repeticiones terminales invertidas (ITRs). El ADN de virus está íntimamente asociado a la proteína altamente básica VII y a un pequeño péptido denominado mu. Otra proteína, V, está empaquetada con este complejo de ADNproteína y proporciona un enlace estructural para el cápside a través de la proteína VI. El virus contiene también una proteasa codificada con virus, la cual es necesaria para el procesamiento de algunas de las proteínas estructurales para producir virus infecciosos maduros.

Sigue existiendo una necesidad de vectores virales recombinantes y métodos mejorados para realizar estos vectores.

Sumario de la invención

En general, la invención se refiere a vectores adenovirales y a proteínas objetivo no virales derivadas de las proteínas de cápside C68, denominadas en la presente memoria construcciones derivadas de C-68.

En un aspecto, la invención proporciona un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID Núm. 16 fusionada a un péptido hexon de adenovirus heterólogo. El cápside encapsula una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición terminal invertida (ITRs) 5’ de adenovirus, un minigén, y una ITR 3’ de adenovirus. El uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se seleccionan a partir del grupo consistente en: aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID Núm. 16: aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 194 a 203 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID Núm. 16; aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID Núm. 16; y aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID Núm. 16.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable y un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus según se ha descrito en lo que antecede, y con el cápside encapsulando una molécula para su suministro a una célula objetivo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un adenovirus recombinante según se describe en la presente memoria, para su uso en la preparación de un medicamento.

Todavía en otro aspecto más, la invención proporciona un adenovirus recombinante según se describe en la presente memoria para su uso en el suministro de una molécula a una célula objetivo.

Otras ventajas adicionales de la presente invención se pondrán fácilmente de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 resume la organización genética del genoma C68 de adenovirus de chimpancé. En la Figura 1A el genoma del adenovirus de chimpancé C68 ha sido representado esquemáticamente por medio de la casilla de la parte superior. Las repeticiones terminales invertidas están sombreadas en negro y las regiones cercanas están sombreadas en gris. Las puntas de flecha por encima de la casilla indican la dirección de expresión de los genes primitivos. La línea por debajo de la casilla representa la división del genoma en 100 unidades de mapa. Las flechas por debajo de la línea representan las cinco últimas regiones de gen y las proteínas codificadas en cada región. Los números por debajo de la casilla o de las flechas indican el comienzo (codón promotor o de iniciación) y el final (señal PoliA canónica) para cada región. * representa el último promotor E2A. La Figura 1B ilustra los clones Pstl; la Figura 1C ilustra los clones BamHl. La Figura 1D ilustra los clones HindIII. Para las partes 1B-1D, las regiones no sombreadas indican que un fragmento fue clonado en un vector de plásmido, mientras que las regiones sombreadas indican que el fragmento de restricción no fue clonado. Para cada sección, el nombre del fragmento, alfabético con A que es el fragmento más grande, y el tamaño de fragmento han sido listados por encima de la casilla y los puntos finales de fragmento se han listado por debajo de la casilla.

La Figura 2 proporciona un alineamiento de secuencia de la proteína hexon de C68 [aa 131 a 141 de SEQ ID Núm. 16] con Ad4 [SEQ ID Núm. 34], Ad16 [SEQ ID Núm. 35], Ad3 [SEQ ID Núm. 36], Ad7 [SEQ ID Núm. 37], y Ad2 [SEQ ID Núm. 38]. Las secuencias de aminoácido deducidas de hexones de adenovirus humanos altamente similares fueron comparadas con los adenovirus de chimpancé C68 utilizando CLUSTAL X. Los serotipos y subgrupos han sido indicados en el margen izquierdo, seguidos por el número de residuo. La numeración se refiere a la posición de aminoácido con respecto al inicio de la traducción. Los aminoácidos están sombreados con respecto a C68 para las similitudes de secuencia destacadas (gris) y las identidades (negro). Las siete regiones hipervariables dentro de los dominios de bucle DE1 y FG1 han sido etiquetadas a lo largo de la parte inferior y corresponden a las secuencias Ad2 siguientes en el alineamiento: HVR1, 137-188; HVR2, 194-204; HVR3, 222-229; HVR4, 258-271; HVR5, 278294; HVR6, 316-327; y HVR7, 433-465 de SEQ ID Núm. 16. Los números de acceso de GenBank para las secuencias mostradas son los siguientes: AAD03657 (Ad4), S37216 (Ad16), S39298 (Ad3), AAD03663 (Ad7), y PN040525 (Ad2).

La Figura 3 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácido del dominio de botón de fibra de chimpancé C68 (Pan-9) [aminoácidos 247 a 425 de SEQ ID Núm. 27] y de los serotipos de adenovirus humano 2 [SEQ ID Núm. 39] y 5 [SEQ ID Núm. 40].

La Figura 4 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácido de los bucles L1 y una porción del L2 del cápside hexon sobre el serotipo de adenovirus humano 5 [SEQ ID Núm. 41] y de secuencias de adenovirus de C68 de chimpancé (Pan-9) [aminoácidos 125 a 443 de SEQ ID Núm. 16]. La región conservada interviniente forma parte del dominio pedestal conservado entre serotipos de adenovirus.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona nuevas proteínas de cápside de adenovirus derivadas a partir de las secuencias únicas de adenovirus de C68 de chimpancé. Las proteínas de cápside son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo el suministro con objetivo no viral a células y para la creación de vectores virales recombinantes. Estas proteínas y vectores virales son útiles para el suministro de moléculas heterólogas a células objetivo.

I. Adenovirus con nuevas proteínas de cápside

Las proteínas de adenovirus de C68 son particularmente adecuadas para su uso en la producción de vectores virales en cápsides derivados de C68. Adecuadamente, estos adenovirus son seudotipados de tal modo que una molécula de ácido nucleico portadora de ITRs de adenovirus procedentes de un serotipo distinto de C68 y un minigén son empaquetados en un cápside adenoviral derivado de C68. Los vectores adenovirales descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de una, o más de una cadena adenoviral. En otra alternativa más, otros elementos de C68 descritos en la presente memoria pueden ser utilizados en la producción de vectores recombinantes o de otras construcciones deseables.

Las proteínas de C68 son útiles para una pluralidad de objetivos, incluyendo la construcción de virus recombinantes. Las proteínas de cápside derivadas de C68 son útiles para la producción de vectores híbridos, virus adenoasociados de C68 híbridos, virus Epstein-Barr y retrovirus [Caplen et al., Gene Ther. 6: 454-459 (1999); Tan et al, J. Virol., 73: 7582-7589 (1999)]. Tales virus incluyen cápsides derivados de C68 con vectores encapsulados con ITRs de virus adenoasociados (AAV) [Lieber et al., J. Virol, 73: 9314-9324 (1999), Recchia et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 2615-2620 (1999); o ITRs de lentivirus (Zheng et al., Nat. Biotech., 18: 176-180 (2000), utilizando repeticiones de terminal largo de virus de leucemia de Maloney).

En una realización particularmente deseable, las proteínas de cápside derivadas de C-68, y opcionalmente las otras secuencias de C68 descritas en la presente memoria, son utilizadas para producir adenovirus recombinantes y adenovirus seudotipados. Sin embargo, se comprenderá fácilmente que las proteínas de cápside derivadas de C68 y otras secuencias nuevas de C68 pueden ser utilizadas para una diversidad de propósitos, incluyendo la producción de otros tipos de vectores virales (tal como, por ejemplo, vectores híbridos) portadores de los transgenes terapéuticos e inmunogénicos que se describen en lo que sigue. Adicionalmente, se comprenderá fácilmente que los vectores virales portadores de proteínas de C68 únicas y otras secuencias pueden utilizarse para objetivar y/o para suministrar otros tipos de moléculas, incluyendo proteínas, moléculas químicas y otras porciones útiles con fines de diagnóstico, terapéuticos y/o de inmunización.

En un aspecto, los adenovirus de la invención utilizan proteínas únicas de cápside adenoviral de C68, incluyendo la región hexon de C68, la región penton de C68 y la región de fibra de C68, y fragmentos de las mismas.

Adicionalmente, la invención utiliza proteínas de cápside derivadas de C68 únicas. Según se utiliza en la presente memoria, una proteína de cápside derivada de C68 incluye cualquier proteína de cápside de C68 o un fragmento de la misma incluyendo, sin limitación, un polipéptido, péptido o una secuencia consecutiva de al menos 8 residuos de aminoácido únicos para una proteína de cápside de C68 y que está libre de otras proteínas. Una proteína de cápside derivada de C68 incluye también una proteína de cápside que contiene una proteína de cápside de C68 o un fragmento de la misma según se ha definido en lo que antecede incluyendo, aunque sin limitación, una proteína de cápside quimérica, una proteína de cápside artificial, una proteína de cápside sintética, y proteínas de cápside recombinantes, sin limitación en cuanto a los medios de generación de estas proteínas. De forma adecuada, estas proteínas de cápside derivadas de C68 contienen una o más regiones de C68 o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un hexon) en combinación con regiones de cápside o fragmentos de las mismas de diferentes serotipos adenovirales, o de fuentes no adenovirales, según se describe en la presente memoria. Estas proteínas de cápside derivadas de C68 pueden ser utilizadas en la objetivación no viral de moléculas útiles en células, o para la producción de vectores virales, según se describe en la presente memoria.

Una “modificación de una proteína de cápside asociada con tropismo alterado” según se utiliza en la presente memoria incluye una proteína de cápside alterada, es decir, una región de proteína penton, hexon o de fibra, o un fragmento de las mismas, tal como el dominio en forma de botón o la región de fibra, o un polinucleótido que codifique las mismas, de tal modo que la especificidad se altere.

En una realización, las secuencias de aminoácido de la proteína penton de C68 se proporcionan en SEQ ID Núm.

12: MMRRAYPEGPPPSYESVMQQMAAAAMQPPLEAPYVPPRYLAPT.

EGRNSIRYSELAPLYDTTRLYLVDNKSADIASLNYQNDHSNFLTTVVQNNDFTPTEAS TQTINFDERSRWGGQLKTIMHTNMPNVNEFMYSNKFKARVMVSRKTPNGVTVTEDYDG SQDELKYEWVEFELPEGNFSVTMTIDLMNNAIIDNYLAVGRQNGVLESDIGVKFDTRN FRLGWDPVTELVMPGVYTNEAFHPDIVLLPGCGVDFTESRLSNLLGIRKRQPFQEGFQ IMYEDLEGGNIPALLDVDAYEKSKEDAAAEATAAVATASTEVRGDNFASAAAVAAAEA AETESKIVIQPVEKDSKNRSYNVLPDKINTAYRSWYLAYNYGDPEKGVRSWTLLTTSD

VTCGVEQVYWSLPDMMQPVTFRSTRQVSNYPVVGAELLPVYSKSFFNEQAVYSQQLR AFTSALTHVFNRFPENQILVRPPAPTITTVSENVPALTDHGTLPLRSSIRGVQRVTVTD ARRRTCPYVYKALGIVAPRVLSSRTF.

Adecuadamente, esta proteína penton, o fragmentos únicos de la misma, puede(n) ser utilizada(os) para una diversidad de propósitos. Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la penton de C68 que tiene truncamientos de terminal N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos, en base a la numeración de aminoácido proporcionada en lo que antecede y en SEQ ID Núm. 12. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos internos, de terminal C o de terminal N más cortos. Además, la proteína penton puede ser modificada para una diversidad de propósitos conocidos por los expertos en la materia.

Las secuencias de la hexon de C68 se proporcionan en SEQ ID Núm. 16:

MATPSMLPQWAYMHIAGQDASEYLSPGLVQFARATDTYFSLGNK FRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFVPVDREDNTYSYKVRYTLAVGDNRVLDMASTYFD IRGVLDRGPSFKPYSGTAYNSLAPKGAPNTCQWTYKADGETATEKTYTYGNAPVQGIN ITKDGIQLGTDTDDQPIYADKTYQPEPQVGDAEWHDITGTDEKYGGRALKPDTKKMPC YGSFAKPTNKEGGQANVKTGTGTTKEYDIDMAFFDNRSAAAAGLAPEIVLYTENDVDLE TPDTHIVYKAGTDDSSSSINLGQQAMPNRPNYIGFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQA SQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSLGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGVEDEL PNYCFPLDAVGRTDTYQGIKANGTDQTTWTKDDSVNDANEIGKGNPFAMEINIQANLW RNFLYANVALYLPDSYKYTPANVTLPTNTNTYDYMNGRVVAPSLVDSYINIGARWSLD

PMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKSLLLLPGSYTYEWNF

RKDVNMILQSSLGNDLRTDGASISFTSINLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSF

NDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWSFTRLKTKETPSLGSGFDPYFVY

SGSIPYLDGTFYLNHTFKKVSITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRTVDGEGYNVAQC

NMTKDWFLVQMLAHYNIGYQGFYVPEGYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDEVNYKDYQAV

TLAYQHNNSGFVGYLAPTMRQGQPYPAXYPYPLIGKSAVTSVTQKKFLCDRVMWRIPF

SSNFMSMGALTDLGQNMLYANSAHALDMNFEVDPMDESTLLYVVFEVFDVVRVHQPHR

GVIEAVYXRTPFSAGNATT.

Adecuadamente, esta proteína hexon, o fragmentos únicos de la misma, puede(n) ser utilizada(os) para una diversidad de propósitos. Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la hexon de C68 que tiene truncamientos de terminal N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150, 200, 300, 400 ó 500 aminoácidos, en base a la numeración de aminoácido proporcionada en lo que antecede y en SEQ ID Núm. 16. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos internos, de terminal C o de terminal N más cortos. Por ejemplo, un fragmento adecuado es la región de bucle (dominio) de la proteína hexon, designada con DE 1 en la Figura 1, o una región hipervariable de la misma. Tales fragmentos incluyen regiones que abarcan residuos de aminoácido de aproximadamente el 125 al 443; aproximadamente del 138 al 441, o fragmentos más pequeños tales como los que abarcan aproximadamente del residuo 138 al residuo 163; aproximadamente del 170 a aproximadamente el 176; aproximadamente del 195 al 203; aproximadamente del 233 a aproximadamente el 246; aproximadamente del 253 a aproximadamente el 264; aproximadamente del 287 a aproximadamente el 297; y aproximadamente del 404 a aproximadamente el 430 de C68, con referencia a SEQ ID Núm.16. Otros fragmentos adecuados pueden ser identificados fácilmente por un experto en la materia. Además, la proteína hexon puede ser modificada para una diversidad de propósitos conocidos por el experto en la materia.

En un ejemplo, puede ser deseable generar un adenovirus que tenga una proteína hexon alterada utilizando las secuencias de proteína hexon de C68. Un método adecuado para alterar proteínas hexon ha sido descrito en la Patente US núm. 5.922.315. En este método, al menos una región en bucle de la hexon de adenovirus se cambia por al menos una región en bucle de otro serotipo de adenovirus. De ese modo, al menos una región en bucle de tal proteína hexon de adenovirus alterada es una región en bucle de hexon de C68. En una realización, una región en bucle de la proteína hexon de C68 se sustituye por una región en bucle de otro serotipo de adenovirus. En otra realización, la región en bucle de la hexon de C68 se utiliza para sustituir una región en bucle de otro serotipo de adenovirus. Serotipos de adenovirus adecuados pueden ser fácilmente seleccionados entre serotipos humanos y no humanos, según se describe en la presente memoria. Cuando se seleccionan serotipos no humanos, los serotipos se seleccionan con preferencia a partir de primates no humanos. Sin embargo, la selección de un serotipo adecuado no es una limitación de la presente invención. Incluso otros usos de las secuencias de proteína hexon de C68 resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.

Las secuencias de la proteína de fibra de C68 son: SEQ ID Núm. 27:

MSKKRVRVDDDFDPVYPYDADNAPTVPFINPPFVSSDGFQEKPL

GVLSLRLADPVTTKNGEITLKLGEGVDLDSSGKLISNTATKAAASPLSFSNNTISLNMD

PFYTKDGKLSLQVSPPLNILRTSILNTLALGFGSGLGLRGSALAVQLVSPLTFDTDGN

IKLTLDRGLHVTTGDAIESNISWAKGLKFEDGAIATNIGNGLEFGSSSTETGVDDAY

PIQVKLGSGLSFDSTGAIMAGNKEDDKLTLWTTPDPSPNCQILAENDAKLTLCLTKCG

SQILATVSVLVVGSGNLNPITGTVSSAQVFLRFDANGVLLTEHSTLKKYWGYRQGDSI

DGTPYTNAVGFMPNLKAYPLSQSSTTKNNIVCQVYMNGDVSKPMLLTITLNGTDDSNS

TYSMSFSYTWTNGSYVGATFGANSYTFSYAQE.

Adecuadamente, esta proteína de fibra, o fragmentos únicos de la misma, puede(n) ser utilizada(os) para una diversidad de propósitos. Un fragmento adecuado es el botón de fibra, el cual abarca alrededor de 247 a 425 aminoácidos de SEQ ID Núm. 27. Ejemplos de otros fragmentos adecuados incluyen la fibra de C68 que tiene truncamientos de terminal N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos en base a la

5 numeración de aminoácido proporcionada en lo que antecede y en SEQ ID Núm. 27. Incluso otros fragmentos adecuados incluye fragmentos internos. Además, la proteína de fibra puede ser modificada utilizando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Las secuencias de aminoácido de otros productos de gen útiles de C68 se proporcionan en SEQ ID Núms. 1 – 11, 13 – 15, 17 – 26, y 28 – 38 del listado de secuencia anexo. Más en particular, estas secuencias son como sigue:

Regiones

Ad C68 – CDS, Con ref. a SEQ ID Núm. 33 Ad C68 SEQ ID Núm.

E1a

11kDa 578 ... 649, 1236 ... 1469 1

28,2 kDa

578 ... 1142, 1236 ... 1444 2

24,8 kDa

578 ... 1049, 1236 ... 1444 3

E1b

20,5 kDa 1603 ... 2163 4

54,7 kDa

1908 ... 3404 5

18,5 kDa

1908 ... 2200, 3188, ... 3404 6

10,1 kDa

1908 ... 2170, 3306 ... 3324 7

IX

Proteína hexon-asociada – pIX 3489 ... 3917 8

IVa2

Proteína de maduración – pIVa2 Complemento (3976 ... 5309, 5588, ... 5600) 9

L1

21,9 kDa 7858 ... 8480 10

42,9 kDa

10825 ... 12000 11

L2

Penton – pIII 13888 ... 15492 12

Proteína de Núcleo Mayor – pVIII

15493 ... 16098 13

Proteína de Núcleo Menor – pV

16120 ... 17190 14

L3

Proteína hexon-asociada – pVI 17442 ... 18215 15

Hexon – pII

18322 ... 21123 16

E2a

Endopeptidasa de Proteína Ligante de ADN Complemento (21835 ... 23376) 17

L4

Proteína morfogénesis-asociada de virión 24,3 kDa Complemento (25529 ... 25862, 26032 ... 26366) 18

Proteína hexon-asociada

26646 ... 27129 19

Regiones

Ad C68 – CDS, Con ref. a SEQ ID Núm. 33 SEQ ID Núm.

E3

11,6 kDa 27130 ... 27450 20

16 kDa

(27404 ... 27477, 27666 ... 28032) 21

19,3 kDa

28014 ... 28544 22

22,3

28572 ... 29186 23

9,9 kDa

30722 ... 30997 24

15,6 kDa

31003 ... 31434 25

14,7 kDa

31427 ... 31834 26

L5

Fibra – PIV 32137 ... 33414 27

E4

Proteína a modo de ORF7 Complemento (33521 ...>33772) 28

Orf6 – 33kDa

Complemento (33769 ... 34674) 29

Orf4 – 13,2 kDa

Complemento (34580 ... 34945) 30

Orf3 – 12,8 kDa

Complemento (34955 ... 35308) 31

Orf2 – 14,2 kDa

Complemento (35305 ... 35694) 32

De ese modo, la invención proporciona proteínas de C68 únicas, péptidos y fragmentos de los mismos, que se producen recombinantemente o mediante otros métodos. De manera adecuada, tales fragmentos son de al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, se utilizan fácilmente fragmentos de otras longitudes. Adicionalmente, la divulgación abarca modificaciones tales que pueden ser introducidas para aumentar el rendimiento y/o la expresión de una proteína o un fragmento de C68, construcción de una molécula de fusión en la que toda o un fragmento de la proteína o fragmento de C68 se fusiona (ya sea directamente o ya sea mediante un enlazador) con un asociado que se va a intensificar. Otras modificaciones adecuadas incluyen, sin limitación, el truncamiento de una región de codificación (por ejemplo, una proteína o una enzima) para eliminar una pre- o pro-proteína escindida de forma ordinaria para producir la proteína o enzima madura y/o la mutación de una región de codificación para proporcionar un producto de gen secretable. Otras modificaciones adicionales resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia. La divulgación abarca además proteínas que tienen al menos alrededor de un 95% a un 99% de identidad con las proteínas de C68 proporcionadas en la presente memoria.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a una proteína o a un fragmento de la misma, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de aminoácido apropiadas de otra proteína, existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos alrededor del 95 al 99% de las secuencias alineadas.

El término "porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de las proteínas o de fragmentos de las mismas, se refiere a los aminoácidos de las dos secuencias que son iguales cuando están alineados con máxima correspondencia. La longitud de comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud total de una proteína, enzima, polipéptido, péptido, u otro fragmento de al menos alrededor de 200 a 500 aminoácidos, si se desea. Sin embargo, la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de al menos alrededor de 8 aminoácidos, normalmente de al menos alrededor de 20 a 24 aminoácidos, al menos de alrededor de 28 a 32 aminoácidos, al menos 50 o más aminoácidos, puede ser también deseable.

La identidad puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por el experto en la materia. Según se describe en la presente memoria, los alineamientos se realizan utilizando cualquiera de una diversidad de Múltiples Programas de Alineamiento de Secuencia disponibles públicamente o comercialmente, tal como “Clustal W”, accesible a través de Servidores de Webs por internet. Alternativamente, también se utilizan las utilidades de Vector NTI. Existe un número de algoritmos conocidos en la técnica que pueden ser utilizados para medir identidad de secuencia de aminoácido, incluyendo los contenidos en los programas descritos en lo que antecede. En general, estos programas se utilizan como disposiciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar estas disposiciones según sea necesario. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas referenciados.

Según se describe en la presente memoria, las proteínas de cápside derivadas de C68 son particularmente adecuadas para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otro serotipo de otras proteínas y vectores de objetivación basados en Ad, así como otros vectores virales. Las construcciones derivadas de C68 de la invención son particularmente ventajosas en readministración para repetición de terapia de gen o para intensificar la respuesta inmune (concentradores de vacuna).

También se proporcionan proteínas de cápside adenoviral artificiales, que incluyen modificaciones y cápsides quiméricos construidos utilizando proteínas de cápside adenoviral de C68. Tales proteínas de cápside artificiales pueden ser construidas utilizando las secuencias de aminoácido del hexon de Ad de C68 de chimpancé. Puesto que la proteína hexon es el determinante para el serotipo de un adenovirus, tales proteínas hexon artificiales podrían dar como resultado adenovirus que tengan serotipos artificiales. Otras proteínas de cápside artificiales pueden ser construidas también utilizando las secuencias penton de Ad de chimpancé y/o secuencias de fibra y/o fragmentos de las mismas.

En una realización, un cápside de C68 quimérico se construye utilizando hexon de C68 y fibra de C68 y un penton procedente de otro adenovirus. Alternativamente, un cápside de C68 quimérico comprende un hexon de C68 y una fibra y un penton de uno o más adenovirus diferentes. Otro cápside de adenovirus quimérico comprende la fibra de C68 y un penton y un hexon procedentes de uno o más serotipos diferentes de adenovirus diferentes. Incluso otro cápside de adenovirus quimérico más comprende el penton de C68 y una fibra y un hexon procedentes de uno o más serotipos de adenovirus diferentes. Adecuadamente, para tales cápsides quimérico y artificial construidos a partir de proteínas de C68, los componentes de adenovirus que no sean de C68 pueden ser seleccionados fácilmente a partir de otros serotipos de adenovirus.

Las proteínas, péptidos y fragmentos derivados de C68 que se describen en la presente memoria pueden ser producidos mediante cualquier medio adecuado, incluyendo síntesis química u otro medio sintético, o mediante metodologías de producción recombinante e ingeniería genética convencional. Por ejemplo, los péptidos pueden ser sintetizados mediante métodos bien conocidos de síntesis de péptido de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,

85: 2149 (1962); Ste3wart and Young, Síntesis de Péptido de Fase Sólida (Freeman, San Francisco, 1969), pp. 27

62). Estos y otros métodos de producción adecuados están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen ninguna limitación de la presente invención.

Alternativamente, se pueden utilizar métodos adecuados para reproducción recombinante. La selección de sistemas de expresión adecuados, incluyendo los vectores de expresión y las células anfitrión para expresión de proteína y/o empaquetamiento viral, está dentro de la capacidad de un experto en la materia y no constituye una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY).

La secuencia de ácido nucleico para el genoma C68, que es de 36521 bp de longitud, puede ser obtenida utilizando la información disponible en la Patente US 6.083.716 y en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 (Pan-9). Esta secuencia está también disponible a partir de GenBank. Otras secuencias de adenovirus de chimpancé están también disponibles en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y otras fuentes. Las cepas de chimpancé deseables Pan 5 [ATCC VR-591], Pan-6 [ATCC VR-592], y Pan 7 [ATCC VR-593]. Otra cepa de adenovirus de chimpancé particularmente deseable es la cepa de adenovirus de chimpancé Bertha o C1 [ATCC Accession núm. VR-20]. La secuencia del serotipo de C1, y la posición de los genes de adenovirus E1a, E1b, E2a, E2b, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 se proporcionan en la Patente US 6.083.716. Opcionalmente, se pueden utilizar secuencias adenovirales de simios que no sean chimpancés. Tales adenovirus que no son de chimpancé incluyen los obtenidos a partir de cepas de adenovirus de babuino [por ejemplo, ATCC VR-275], cepas de adenovirus aisladas a partir de monos rhesus [por ejemplo, ATCC VR-209, ATCC VR-275, ATCC VR-353, ATCC VR-355], y cepas de adenovirus aisladas a partir de monos verdes africanos [por ejemplo, ATCC VR-541; ATCC VR-941; ATCC VR-942; ATCC VR-943]. Alternativamente, la selección puede hacerse fácilmente entre los al menos 51 serotipos humanos diferentes, incluyendo sin limitación los serotipos de adenovirus humanos 1, 2, 3, 4, 5, 12, 35, 37 y 40, y otros serotipos de adenovirus de primates no humanos. Además, las secuencias de estos y otros serotipos adecuados están disponibles a partir de una diversidad de bases de datos que incluyen, por ejemplo, PubMed y GenBank [véase, por ejemplo, la Patente US núm. 5.240.846]. La selección de un adenovirus apropiado no es una limitación de la presente invención.

La divulgación proporciona además moléculas útiles para la producción de las proteínas de C68 y derivadas de C68, incluyendo moléculas tales que portan nucleótidos que incluyen secuencias de ADN. De ese modo, la divulgación abarca además las secuencias de ácido nucleico que codifican las construcciones de la invención derivadas de C68, y moléculas y células anfitrión útiles en la expresión de las mismas, incluyendo moléculas y vectores adecuados de ADN, que pueden ser cualquier elemento genético adecuado según se define en la presente memoria. Con preferencia, estos vectores son vectores a base de ADN (por ejemplo, plásmidos) o virales.

En una realización, las proteínas de cápside derivadas de C68 y otras proteínas de adenovirus de C68 que se describen en la presente memoria se utilizan para el suministro de genes a base de proteína, no virales, proteínas y otras moléculas de diagnóstico, terapéuticas e inmunogénicas deseables. Una molécula deseable para su suministro a una célula objetivo puede estar asociada a una proteína de cápside derivada de C68 u otra proteína mediante cualquier medio adecuado incluyendo, por ejemplo, enlace covalente o no covalente. Por ejemplo, la proteína penton de C68 puede ser utilizada fácilmente para tal propósito mediante la producción de una proteína de fusión utilizando las secuencias penton de C68 de SEQ ID núm. 12 de una manera análoga a la que ha sido descrita por Medina-Kauwe LK, et al., en Gene Ther., Mayo de 2001; 8(10): 795-803 y por Medina-Kauwe LK et al., en Gene Ther., Diciembre de 2001; 8(23): 1753-1761. Alternativamente, las secuencias de aminoácido de la proteína IX de C68 pueden ser utilizadas para objetivar vectores asociando la proteína IX con un ligando que enlaza con una receptor de la superficie de una célula, según se describe en la Solicitud de Patente US 20010047081. Ligandos adecuados incluyen un antígeno de CD40, una secuencia que contiene RGD o que contiene polilisina, y similares. Incluso pueden usarse otras proteínas de C68 para estos propósitos y otros similares.

II. Vectores adenovirales recombinantes

Las composiciones de la presente invención incluyen vectores que suministran una molécula heteróloga a células, ya sea con fines terapéuticos o ya sea con fines de vacuna. Según se utiliza en la presente memoria, un vector puede incluir cualquier elemento genético incluyendo, sin limitación, un cósmido, un episoma, un plásmido, o un virus. En una realización particularmente preferida, estos vectores son vectores virales que tienen proteínas de cápside derivadas de las proteínas de C68. Alternativamente, estos vectores pueden contener otras secuencias de C68. Estos vectores virales contienen adecuadamente un minigén. Mediante “minigén” se entiende la combinación de un gen heterólogo seleccionado y los otros elementos reguladores necesarios para activar traducción, transcripción y/o expresión del producto de gen en una célula anfitrión.

Típicamente, un vector adenoviral está diseñado de tal modo que el minigén está flanqueado por su extremo 5’ y/o por su extremo 3’ por secuencias adenovirales que incluyen, como mínimo, los elementos cis necesarios para replicación y encapsidación de virión. Así, en una realización, el vector contiene secuencias adenovirales que abarcan al menos el extremo 5’ del genoma adenoviral, es decir, las secuencias de repetición de terminal invertido 5’

(que funcionan como orígenes de replicación) y los dominios potenciadores de empaquetamiento 5’ naturales (que contienen secuencias necesarias para empaquetar genomas de Ad lineales y elementos potenciadores para el promotor E1). El vector se proporciona también con las ITRs 3’ de actuación cis. Adecuadamente, el minigén se localiza entre los elementos adenovirales 5’ y los elementos adenovirales 3’. Un vector adenoviral de la invención puede contener también secuencias adenovirales adicionales. Por ejemplo, el minigén puede estar situado en un sitio tal como el sitio de una supresión de E1 funcional o una supresión de E3 funcional, entre otros que puedan ser seleccionados. Alternativamente, el minigén puede estar insertado en una región de gen existente para interrumpir la función de esa región, si se desea.

El término “funcionalmente suprimido” o “supresión funcional” significa que una cantidad suficiente de la región de gen ha sido eliminada o dañada de otro modo, por ejemplo mediante mutación o modificación, de modo que la región de gen ya no es capaz de generar productos funcionales de expresión de gen. Si se desea, la región de gen completa puede ser eliminada.

Adecuadamente, estos vectores adenovirales de la invención contienen uno o más elementos adenovirales derivados del C68. En una realización, los vectores contienen ITRs adenovirales de un serotipo adenoviral que difiere del C68. Alternativamente, las ITRs de C68 pueden ser utilizadas en un vector viral de la invención en el que el cápside no se produce de forma natural, pero contiene una o más proteínas de C68, o fragmentos de las mismas. La selección del serotipo de las ITRs y del serotipo de cualquier otra de las secuencias adenovirales presentes en el vector no es una limitación de la presente invención. Una diversidad de cepas de adenovirus se describen en la presente memoria.

Las secuencias virales, los virus auxiliares, si se necesitan, y las partículas virales recombinantes, y otros componentes de vector y secuencias empleadas en la construcción de los vectores descritos en la presente memoria, se obtienen según se ha descrito en lo que antecede. Véase, por ejemplo, la Patente US núm. 5.240.846. Las secuencias de ADN de las secuencias de adenovirus se emplean para construir vectores y líneas de células útiles en la preparación de tales vectores. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. núm. 6.083.716.

Las modificaciones de las secuencias de ácido nucleico que forman los vectores de la presente invención, incluyendo las supresiones, inserciones y otras mutaciones de secuencia, pueden ser generadas utilizando técnicas moleculares biológicas estándar y están dentro del alcance de la presente invención.

A. El “Minigén”

Los métodos empleados para la selección del transgén, la clonación y construcción del “minigén” y su inserción en el vector viral, están dentro de la técnica proporcionada por las enseñanzas que se dan en la presente memoria.

1. El transgén

El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, una proteína u otro producto de interés. El ácido nucleico que codifica la secuencia está enlazado operativamente a componentes reguladores de una manera que permite la transcripción, traducción y/o expresión de transgén en una célula anfitrión.

La composición de la secuencia de transgén dependerá del uso al que se destine el vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia informadora que con la expresión produce una señal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican �-lactamasa, �galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, quinasa timidina, proteína fluorescente verde (GFP), cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas de enlace de membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, proteína hemaglutinina de influenza, y otras bien conocidas en la técnica, respecto a las que existen anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas o pueden ser producidos con medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína de enlace de membrana fusionada apropiadamente en un dominio de etiqueta de antígeno a partir de, entre otros, hemaglutinina o Myc. Estas secuencias de codificación, cuando se asocian a elementos reguladores que inducen su expresión, proporcionan señales detectables con medios convencionales, incluyendo ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación celular de activación fluorescente y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo el ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector portador de la señal se detecta mediante ensayos para actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgén es GFP o luciferasa, el vector portador de la señal puede ser medido visualmente mediante color o producción de luz en un luminómetro.

Sin embargo, de manera deseable, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, o ARNs catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen tARN, dsARN, ARN ribosómico, ARNs catalíticos, y ARNs antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que extingue la expresión de una secuencia objetivada de ácido nucleico en el animal tratado.

El transgén puede ser usado para tratamiento de, por ejemplo, deficiencias genéticas, como terapéutica o vacuna para cáncer, para inducción de una respuesta inmune, y/o con fines de vacuna profiláctica. Según se utiliza en la presente memoria, la inducción de una respuesta inmune se refiere a la capacidad de una molécula (por ejemplo, un producto de gen) para inducir una célula T y/o una respuesta inmune humoral en la molécula. La divulgación incluye además utilizar múltiples transgenes, por ejemplo para corregir o mejorar una condición causada por una proteína multi-subunidad. En determinadas situaciones, se puede utilizar un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o una proteína distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína multi-subunidad, se infecta una célula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas mediante el mismo transgén. En este caso, un único transgén incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, estando el ADN para cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribozima interno (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y el IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un péptido 2A, el cual se auto-divide en un evento traslacional. Véase, por ejemplo, M .L. Donnelly, et al., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Enero 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8(11): 864-873 (Junio 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitativo. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo un producto deseable para su estudio.

Transgenes adecuados pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. La selección del transgén no se considera que sea una limitación de la presente invención.

2. Elementos reguladores

Adicionalmente a los elementos mayores identificados en lo que antecede para el minigén, el vector incluye también los elementos de control convencionales necesarios que están enlazados operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector plásmido o infectada con el virus producido mediante la invención. Según se utiliza en la presente memoria, secuencias “operativamente enlazadas” incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación, terminación, promotoras e intensificadoras de transcripción apropiadas; señales de procesamiento eficiente de ARN tal como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el mARN citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo promotores que son naturales, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido, son conocidas en la técnica y pueden ser utilizadas.

Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR de virus de sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase por ejemplo, Boshart et al., Célula, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de -actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1a [Invitrogen].

Los promotores inducibles permiten la regulación de expresión de gen y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados exógenamente, factores medioambientales tales como temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, una fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes únicamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito otros muchos sistemas y pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. Por ejemplo, los promotores inducibles incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible con zinc y el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible con dexametasona (Dex). Otros sistemas inducibles incluyen el sistema promotor de polimerasa T7 [WO 98/10088]; el promotor del insecto ecdisoma [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)]. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 que utilizan castradiol, difenol murislerona, el sistema inducible por RU486 [Wang et al, Nat. Biotech., 15: 239243 (1997) y Wang et al, Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible con rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. La efectividad de algunos promotores inducibles se incrementa con el tiempo. En tales casos, se puede incrementar la efectividad de tales sistemas insertando múltiples represores en tándem, por ejemplo TetR enlazado a TetR mediante un IRES. Alternativamente, se puede esperar al menos 3 días con

anterioridad al examen de la función deseada. Se puede intensificar una vez la expresión de las proteínas deseadas mediante medios conocidos para aumentar la efectividad de este sistema. Por ejemplo, utilizando el Elemento Regulador Post-transcripcional del Virus de la Hepatitis de Woodchuck (WPRE).

En otra realización, se utilizará el promotor natural para el transgén. Se puede preferir el promotor natural cuando se desee que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser utilizado cuando la expresión del transgén deba ser regulada temporalmente o mediante desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, otros elementos de control de expresión natural, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, pueden ser utilizados también para mimetizar la expresión natural.

Otra realización del transgén incluye un transgén enlazado operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se deberá usar un promotor que sea activo en el músculo. Éste incluye los promotores procedentes de genes que codifican la -actina esquelética, la cadena ligera 2A de miosina, la distrofina, la creatina quinasa del músculo, así como los promotores sintéticos del músculo con actividades más altas que las de los promotores que se producen de forma natural (véase Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)). Se conocen ejemplos de promotores que son específicos del tejido para el hígado (albúmina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); el promotor del núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 65464 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de célula T), neuronales tal como el promotor de enolasa específica de la neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.

Opcionalmente, los vectores portadores de transgenes que codifican productos terapéuticamente útiles o inmunogénicos pueden incluir marcadores seleccionables o genes informadores que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a geneticina, higromicina o purimicina, entre otros. Tales informadores o genes marcadores seleccionables (situados con preferencia fuera del genoma viral que va a ser empaquetado en una partícula viral) pueden ser utilizados para señalar la presencia de los plásmidos en células bacterianas, tal como resistencia a ampicilina. Otros componentes del vector pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y otros promotores y elementos de vector son convencionales y muchas de tales secuencias se encuentran disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la presente memoria].

Estos vectores se generan utilizando las técnicas y secuencias proporcionadas en la presente memoria, junto con técnicas conocidas por los expertos en la materia. Tales técnicas incluyen técnicas de clonación convencional de cADN tales como las descritas en textos [Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY], utilizan secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, reacción de cadena de polimerasa, y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada.

III. Producción de la partícula viral recombinante

En una realización, se utilizan plásmidos adenovirales de chimpancé (u otros vectores) para producir partículas adenovirales recombinantes. En una realización, los adenovirus recombinantes son suprimidos funcionalmente en los genes E1a o E1b, y opcionalmente llevan otras mutaciones, por ejemplo mutaciones sensibles a la temperatura o supresiones en otros genes. En otras realizaciones, resulta deseable mantener una región E1a y/o E1b intacta en los adenovirus recombinantes. Tal región E1 intacta puede estar situada en su posición natural en el genoma adenoviral o colocada en el sitio de una supresión en el genoma adenoviral natural (por ejemplo, en la región E3).

En la construcción de vectores de adenovirus de chimpancé útiles para el suministro de un gen a una célula humana (o de otro mamífero), se puede emplear en los vectores una gama de secuencias de ácido nucleico de adenovirus. Por ejemplo, todo o una parte del gen tempranamente retardado de adenovirus E3 puede ser eliminado de la secuencia de adenovirus de C68 que forma una parte del virus recombinante. La función del adenovirus E3 se considera irrelevante respecto a la función y producción de la partícula de virus recombinante. Se pueden construir también vectores de adenovirus que tengan una supresión de al menos la región ORF6 del gen E4, y más deseablemente debido a la redundancia en la función de esta región, de la región E4 completa. Otro vector más de la presente invención contiene una supresión en el gen tempranamente retardado E2a. Las supresiones pueden hacerse también en cualquiera de los genes posteriores L1 a L5 del genoma de adenovirus de chimpancé. De forma similar, las supresiones en los genes intermedios IX y IVa2 pueden ser útiles para algunos fines. Otras supresiones pueden hacerse en los otros genes estructurales o no estructurales. Las supresiones discutidas en lo que antecede pueden ser utilizadas individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para su uso en la presente invención puede contener supresiones en una única región simple. Alternativamente, las supresiones de genes completos o porciones de los mismos efectivas para destruir su actividad biológica, pueden ser utilizadas según cualquier

combinación. Por ejemplo, en un vector ejemplar, la secuencia de adenovirus puede tener supresiones de los genes E1 y del gen E4, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E3, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin supresión de E3, y así sucesivamente. Según se ha expuesto en lo que antecede, tales supresiones pueden ser usadas en combinación con otras mutaciones, tal como mutaciones sensibles a la temperatura, para conseguir un resultado deseado.

Un vector adenoviral que carezca de cualesquiera secuencias adenovirales esenciales (por ejemplo, e1a, E1b, E2a, E2b, E4 ORF6, L1, L2, L3, L4 y L5) puede ser cultivado en presencia de los productos de gen adenoviral faltantes que se requieran para la infectividad y propagación viral de una partícula adenoviral. Estas funciones auxiliares pueden ser proporcionadas cultivando el vector adenoviral en presencia de una o más construcciones auxiliares (por ejemplo, un plásmido o un virus) o una célula anfitrión de empaquetamiento. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas para la preparación de una vector de Ad humano “minimal” en la solicitud de Patente Internacional núm. WO96/13597, publicada el 9 de Mayo de 1996.

1. Virus auxiliares

Así, dependiendo del contenido de gen de adenovirus de chimpancé de los vectores virales empleados para portar el minigén, puede hacerse necesario un fragmento de adenovirus auxiliar o de virus no replicante para proporcionar suficientes secuencias de gen de adenovirus de chimpancé necesarias para producir una partícula viral recombinante infecciosa que contenga el minigén. Los virus auxiliares útiles contienen secuencias de gen de adenovirus seleccionadas no presentes en la construcción de vector de adenovirus y/o no expresadas por la línea de célula de empaquetamiento en la que el vector es transfectado. En una realización, el virus auxiliar es defectuoso en cuanto a replicación y contiene una diversidad de genes de adenovirus adicionalmente a las secuencias descritas en lo que antecede. Tal virus auxiliar se utiliza deseablemente en combinación con una línea de célula de expresión de E1.

Los virus auxiliares pueden ser también formados según conjugados poli-catión tal y como ha sido descrito por Wu et al., en J. Biol. Chem.: 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de Abril de 1994). El virus auxiliar puede contener opcionalmente un segundo minigén informador. Se conoce una cantidad de tales genes informadores en el estado de la técnica. La presencia de un gen informador en el virus auxiliar que sea diferente del transgén del vector de adenovirus, permite que tanto el vector de Ad como el virus auxiliar sean monitorizados de forma independiente. Este segundo informador se utiliza para permitir la separación entre el virus recombinante resultante y el virus auxiliar mediante purificación.

2. Líneas celulares de complementación

Para generar adenovirus (Ad) de chimpancé recombinantes suprimidos en cualquier de los genes descritos en lo que antecede, la función de la región de gen suprimida, aunque sea esencial para la replicación e infectividad del virus, debe ser suministrada al virus recombinante mediante un virus o una línea celular auxiliar, es decir, una línea celular de complementación o empaquetamiento. En muchas circunstancias, una línea celular que expresa el E1 humano puede ser utilizada para transcomplementar el vector Ad de chimpancé. Esto es particularmente ventajoso puesto que, debido a la diversidad entre las secuencias Ad de chimpancé y las secuencias AdE1 humanas encontradas en las células de empaquetamiento actualmente disponibles, el uso de células que contienen E1 humanas normales impide la generación de adenovirus competentes para replicación durante el proceso de replicación y de producción. Sin embargo, en determinadas circunstancias, será deseable utilizar una línea celular que exprese los productos de gen E1 que puedan ser utilizados para la producción de un adenovirus de chimpancé suprimido en E1. Tales líneas de células han sido ya descritas. Véase, por ejemplo, la Patente US 6.083.716.

Si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en la presente memoria para generar una célula o línea celular de empaquetamiento que exprese, como mínimo, el gen E1 de adenovirus bajo el control transcripcional de un promotor para su expresión en una línea de célula madre seleccionada. Se pueden emplear promotores inducibles o constitutivos para este propósito. Ejemplos de tales promotores han sido descritos con detalle en la presente descripción. Se elige una célula madre para la generación de una nueva línea celular que exprese cualquier gen de Ad deseado. Sin limitación, una línea celular madre de ese tipo puede ser la de células HeLas ÂTCC Accession núm. CCL 2], A549 [ATCC Accession núm. CCL 185], KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72] y WI-38 [CCL 75], entre otras. Estas líneas celulares están disponibles en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Otras líneas de células madre adecuadas pueden ser obtenidas a partir de otras fuentes.

Tales líneas celulares de expresión de E1 son útiles en la generación de vectores suprimidos en E1 de chimpancé recombinantes. Adicionalmente, o alternativamente, la invención proporciona líneas de células que presan uno o más productos de gen adenovirales de chimpancé, por ejemplo E1a, E1b, E2a, y/o E4 ORF6, y pueden ser construidas utilizando esencialmente los mismos procedimientos para su uso en la generación de vectores virales de chimpancé recombinantes. Tales líneas celulares pueden ser utilizadas para transcomplementar vectores de adenovirus suprimidos en los genes esenciales que codifican estos productos, o para proporcionar funciones auxiliares necesarias para empaquetar un virus auxiliar-dependiente (por ejemplo, un virus adeno-asociado). La

preparación de una célula anfitrión incluye técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser llevado a cabo utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen cADN y clonación genómica, las cuales son bien conocidas y están descritas en Sambrook et al., citado anteriormente, el uso de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, combinado con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos y otros métodos adecuados que proporcionen la secuencia de nucleótido deseada.

Todavía en otra alternativa más, los productos esenciales de gen adenoviral son proporcionados en trans por el vector adenoviral y/o el virus auxiliar. En tal caso, se puede seleccionar una célula anfitrión adecuada a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo las células procarióticas (por ejemplo, bacterianas), y las células eucarióticas, incluyendo células de insectos, células de levadura y células de mamíferos. Las células anfitrión particularmente deseables se seleccionan entre especies de mamíferos cualesquiera incluyendo, sin limitación, células tales como A549, WEHI, 3T3, células 10T1/2 (que expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblasto primario, células de hepatocito y mioblasto derivadas de mamíferos que incluyen el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de las especies de mamíferos que proporcionan las células no constituye una limitación de la presente invención; ni tampoco el tipo de célula de mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc.

3. Ensamblaje de partícula viral y transfección de una línea celular

En general, cuando se suministra el vector que comprende el minigén mediante transfección, el vector es suministrado en una cantidad que va desde alrededor de 5 )g a alrededor de 100 )g de ADN, y con preferencia alrededor de 10 a alrededor de 50 )g de ADN, a alrededor de 1 x 104 células a alrededor de 1 x 1013 células, y con preferencia alrededor de 105. Sin embargo, se pueden ajustar las cantidades relativas de ADN de vector en células anfitrión, tomando en consideración factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células anfitrión seleccionadas.

El vector puede ser cualquier vector conocido en el estado de la técnica o divulgado en lo que antecede, incluyendo ADN marcado, un plásmido, fago, transposón, cósmidos, etc. La introducción en la célula anfitrión del vector puede ser lograda mediante cualquier medio conocido en el estado de la técnica o según se ha divulgado en lo que antecede, incluyendo transfección e infección. Uno o más de los genes adenovirales puede estar integrado de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, expresado de forma estable a modo de episomas, o expresado transitoriamente. Los productos de gen pueden ser expresados en su totalidad de forma transitoria, sobre un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos de gen pueden ser expresados de forma estable mientras otros son expresados de forma transitoria. Además, los promotores para cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados independientemente del promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden ser regulados mediante un estado fisiológico específico del organismo o la célula (es decir, mediante el estado de diferenciación o en células quiescentes o replicantes) o mediante factores añadidos exógenamente, por ejemplo.

La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula anfitrión puede ser también llevada a cabo utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia y según se ha expuesto a través de la descripción. En la realización preferida, se utilizan técnicas de transfección estándar, por ejemplo transfección de CaPO4 o electroporación.

El ensamblaje de las secuencias de ADN seleccionadas del adenovirus (así como del transgén y otros elementos de vector en varios plásmidos intermedios), y el uso de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante se consiguen utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen técnicas de clonación convencionales de cADN tales como las descritas en textos [Sambrook et al., citado anteriormente], uso de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, reacción de cadena de polimerasa, y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada. Se emplean técnicas de transfección y co-transfección estándar, por ejemplo, técnicas de precipitación de CaPO4. Otros métodos convencionales empleados incluyen recombinación homóloga de los genomas virales, formación de capa de virus en recubrimiento de agar, métodos de medición de generación de señal, y similares.

Por ejemplo, a continuación de la construcción y ensamblaje del vector viral que contiene el minigén deseado, el vector es transfectado in vitro en presencia de un virus auxiliar en la línea celular de empaquetamiento. La recombinación homóloga ocurre entre las secuencias auxiliar y de vector, lo que permite que las secuencias de adenovirus-transgén del vector sean replicadas y empaquetadas en cápsides de virión, dando como resultado las partículas de vector viral recombinante. El método actual para producir tales partículas de virus se basa en transfección. Sin embargo, la invención no se limita a tales métodos.

Los adenovirus de chimpancé recombinantes resultantes son útiles en la transfección de un transgén seleccionado a una célula seleccionada. En experimentos in vivo con el virus recombinante cultivado en líneas de células de empaquetamiento, los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes suprimidos en E1 de la invención

demuestran utilidad en cuanto a la transfección de un transgén a una célula que no es de chimpancé, con preferencia una célula humana.

IV. Uso de adenovirus derivados de C68

Los vectores de adenovirus recombinantes de la invención son útiles para transferencia de gen a un paciente humano o veterinario distinto de un chimpancé in vitro, ex vivo, e in vivo. Los métodos adecuados de suministro y los regímenes de dosificación se determinan fácilmente en base a la molécula objetivada y a la proteína de objetivación.

Los vectores de adenovirus recombinantes descritos en la presente memoria pueden ser utilizados como vectores de expresión para la producción de los productos codificados por los genes heterólogos in vitro. Por ejemplo, los adenovirus recombinantes que contienen un gen insertado en la posición de una supresión de E1 pueden ser transfectados en una línea celular de expresión de E1 según se ha descrito en lo que antecede. Alternativamente, los adenovirus competentes para replicación pueden ser utilizados en otra línea celular seleccionada. Las células transfectadas son cultivadas a continuación de manera convencional, permitiendo que el adenovirus recombinante exprese el producto de gen a partir del promotor. El producto de gen puede ser después recuperado del medio de cultivo mediante métodos convencionales conocidos de aislamiento de proteína y recuperación desde el cultivo.

Un vector derivado de C68 conforme a la invención proporciona un vehículo eficiente de transferencia de gen que puede suministrar un transgén seleccionado u otra molécula a una célula anfitrión seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes para uno o más serotipos de AAV. En una realización, el rAAV y las células se mezclan ex vivo; las células infectadas se cultivan utilizando metodologías convencionales; y las células transducidas son re-infundidas en el paciente. Estas composiciones son particularmente adecuadas para suministro de gen con fines terapéuticos y para inmunización, incluyendo inducción de inmunidad protectora.

Más habitualmente, los vectores derivados de C68 de la invención serán utilizados para el suministro de moléculas terapéuticas o inmunogénicas, según se describe en lo que sigue. Se comprenderá fácilmente para ambas aplicaciones, que las construcciones derivadas de C68 de la invención son útiles para su uso en regímenes que incluyen administraciones únicas, así como también en regímenes que incluyen el suministro repetido de vectores adenovirales o el suministro objetivado no viral, o el suministro repetido del transgén o de otra molécula a las células.

Tales regímenes incluyen típicamente el suministro de una serie de vectores virales en los que los cápsides virales se alternan. Los cápsides virales pueden ser cambiados para cada administración subsiguiente, o después de un número preestablecido de administraciones de un cápside de serotipo particular (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro

o más). Por ejemplo, un régimen puede incluir el suministro de un rAd con un cápside derivado de C68 y el suministro con un rAd con otro serotipo de adenovirus de primate humano o no humano. Opcionalmente, estos regímenes pueden incluir la administración de rAd con cápsides de otros adenovirus de primate no humano, adenovirus humanos, o serotipos artificiales tales como los que se han descrito en la presente memoria. Alternativamente, los regímenes incluyen la administración de proteínas derivadas de C68 para objetivación no viral con administraciones repetidas de proteínas derivadas de C68, o con otros sistemas de suministro basados en proteínas. Cada fase de estos regímenes puede incluir la administración de una serie de inyecciones (u otras rutas de suministro) con una única construcción derivada de C68 seguido de una serie con otra construcción de serotipo de Ad. Alternativamente, los vectores derivados de C68 de la invención pueden ser utilizados en regímenes que incluyen otros sistemas de suministro mediado no adenoviral, incluyendo otros sistemas virales, sistemas de suministro no viral, proteína, péptidos, y otras moléculas biológicamente activas.

Las secciones que siguen se enfocarán sobre ejemplos de moléculas que pueden ser suministradas a través de los vectores adenovirales de la invención.

A. Suministro mediado de Ad de moléculas terapéuticas

En una realización las construcciones derivadas de C68 descritas en lo que antecede se administran a humanos de acuerdo con métodos publicados para terapia de gen. Una construcción derivada de C68 que lleva un transgén, puede ser administrada a un paciente preferentemente suspendida en una solución biológicamente compatible o en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Otras soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que se sabe que son portadores farmacéuticamente aceptables y que son bien conocidas por los expertos en la materia, pueden ser empleadas para este fin.

Los vectores adenovirales derivados de C68 se administran en cantidades suficientes para transducir las células objetivo y para proporcionar niveles suficientes de transferencia de gen y expresión para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, los cuales pueden ser determinados por los expertos en las técnicas médicas. Las rutas de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, el suministro directo a la retina y otros métodos de suministro intraocular, suministro directo al hígado, intranasal, intravenoso, intramuscular, intratraqueal, subcutáneo,

intradérmico, rectal, oral y otras rutas parenterales de administración. Las rutas de administración pueden ser combinadas, si se desea, o ajustadas dependiendo del transgén o de la condición. La ruta de administración dependerá principalmente de la naturaleza de la condición que va a ser tratada.

Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición que va a ser tratada, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y puede así variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificación terapéuticamente efectiva para un humano adulto o de tipo veterinario del vector viral está en general comprendida en la gama que va desde alrededor de 100 )l a alrededor de 100 ml de un portador que contenga concentraciones de alrededor de 1 x 106 a alrededor de 1 x 1015 partículas, alrededor de 1 x 1015 a 1 x 1013 partículas, o alrededor de 1 x 109 a 1 x 1012 partículas de virus. Las gamas de dosificaciones dependerán del tamaño del animal y de la ruta de administración. Por ejemplo, una dosificación adecuada humana o veterinaria (para un animal de alrededor de 80 kg) para inyección intramuscular está comprendida en la gama de alrededor de 1 x 109 a alrededor de 5 x 1012 partículas por ml, para un único sitio. Opcionalmente, se pueden proporcionar múltiples sitios de administración. En otro ejemplo, una dosificación adecuada humana o veterinaria puede estar comprendida en la gama de alrededor de 1 x 1011 a alrededor de 1 x 1015 partículas para una formulación oral.

Un experto en la materia puede ajustar estas dosis, dependiendo de la ruta de administración, y de la aplicación terapéutica o de vacuna para la que se emplee la construcción derivada de C68. Los niveles de expresión del transgén, o el nivel de anticuerpo circulante para un inmunógeno, pueden ser monitorizados para determinar la frecuencia de administración de la dosificación. Otros métodos adicionales para determinar los intervalos de frecuencia de administración resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.

Una etapa de un método opcional incluye la co-administración al paciente, ya sea simultáneamente con, o ya sea antes o después de la administración de una construcción derivada de C68, de una cantidad adecuada de un modulador inmune de acción corta. El modulador inmune seleccionado se define en la presente memoria como un agente capaz de inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el vector recombinante de la presente invención o capaz de inhibir la eliminación de linfocito T citolítico (CTL) del vector. El modulador inmune puede interferir con las interacciones entre los subconjuntos auxiliares T (TH1 o TH2) y células B para inhibir la formación de anticuerpo neutralizante. Alternativamente, el modulador inmune puede inhibir la interacción entre células TH1 y CTLs para reducir la ocurrencia de eliminación de CTL del vector. Una diversidad de moduladores inmunes útiles y dosificaciones para el uso de los mismos han sido divulgados, por ejemplo, por Yang et al., en J. Virol. 70(9) (Septiembre de 1996); solicitud de Patente Internacional núm. WO96/12406, publicada el 2 de Mayo de 1996; y solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US96/03035.

1. Transgenes terapéuticos

Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagon, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), hormona de estimulación de folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vasc7ular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF-II), uno cualquiera de la superfamilia de factor de crecimiento transformante, incluyendo TGF, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs 1-15, uno cualquiera del factor de diferenciación de heregluin/neuregluin/ARIA/neu (NDF), neutrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neutrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF), neurturin, agrin, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrin-1 y netrin-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, relleno, erizo sónico y tirosina hidroxilasa.

Otros productos transgén útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitación, citoquinas y linfoquinas tales como trombopoyetina (TPO), interleuquinas (IL) IL-1 a IL-18, proteína monocito quimioatrayente, factor inhibitorio de leucemia, factor de estimulación de colonia granulocito-macrófago, ligando Fas, factores de necrosis tumoral e, interferonas, y factor de células madre, ligando flk-2/flt3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son también útiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitaciones, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de cadena simple, moléculas MHC de clase I y clase II, así como inmunoglobulinas de diseño y moléculas MHC. Los productos de gen útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tales como proteínas reguladoras de complemento, proteína cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de degradación (DAF), CR1, CF2 y CD59.

Todavía otros productos de gen útiles incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfoquinas, proteínas reguladoras y proteínas de sistema inmune. La divulgación abarca receptores para regulación del colesterol, incluyendo el receptor de lipopoteína de baja densidad (LDL), el receptor

de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), y el receptor scavenger. La divulgación abarca también productos de gen tales como miembros de la superfamilia de receptor de hormona esteroide que incluye receptores de glucocorticoide y receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP-2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de enlace de CCAAT-box, factor de regulación de interferona (IRF-1), proteínas de tumor de Wilms, proteína de enlace de ETS, STAT, proteínas de enlace de GATA-box, por ejemplo GATA-3, y la familia de cabeza horquillada de proteínas de hélice alada.

Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6fosfatasa, forfobilinógeno desaminasa, factor VIII, factor IX, cistationa beta-sintasa, quetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA-mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvirato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), y una secuencia de distrofina cADN.

Otros productos de gen útiles incluyen polipéptidos que se producen de forma no natural, tal como polipéptidos quiméricos o híbridos que tiene una secuencia de aminoácido que se produce de forma no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas diseñadas de cadena simple podrían ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de gen que se producen de forma no natural incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que podrían ser utilizadas para reducir la sobre-expresión de un objetivo.

La reducción y/o modulación de expresión de un gen resulta particularmente deseable para el tratamiento de condiciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferantes, como son los cánceres y la psoriasis. Los polipéptidos objetivo incluyen aquellos polipéptidos que se producen exclusivamente, o a niveles más altos, en células hiperproliferativas en comparación con células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncógenos tales como myb, myc, fyn y el gen de traslocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos oncógenos como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para tratamientos anticáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos realizados por linfomas de célula B y regiones variables de receptores de célula T de linfomas de célula T que, en algunas realizaciones, se utilizan también como antígenos objetivo para enfermedad autoinmune. Otros polipéptidos asociados a tumor pueden ser utilizados como polipéptidos objetivo tales como los polipéptidos que se encuentran a niveles más altos en células tumorales incluyendo el polipéptido reconocido mediante el anticuerpo monoclonal 17-1A y polipéptidos de enlace de folato. Tales polipéptidos objetivo y sus ligandos son también útiles en la formación de componentes asociados de fusión con una proteína de C68.

Otros polipéptidos terapéuticos adecuados y proteínas incluyen los que pueden ser útiles para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades y desórdenes autoinmunes confiriendo una respuesta inmune protectora de amplia base frente a objetivos que se asocian a autoinmunidad incluyendo los receptores de célula y las células que producen anticuerpos auto-dirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen la artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiples (MS), síndrome de Sjögren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn, y colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades está caracterizada por receptores de célula T (TCRs) que enlazan con antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.

Las construcciones derivadas de C68 de la invención son particularmente adecuadas para regímenes terapéuticos en los que se desean múltiples suministros de transgenes, por ejemplo en regímenes que incluyen el re-suministro del mismo transgén o en regímenes de combinación que incluyen el suministro de otros transgenes. Tales regímenes pueden incluir la administración de una construcción derivada de C68, seguida de re-administración con un vector del mismo adenovirus de serotipo. Los regímenes particularmente deseables incluyen la administración de una construcción derivada de C68 de la invención, en la que el serotipo del vector viral suministrado en la primera administración difiere del serotipo del vector viral utilizado en una o más de las administraciones posteriores. Por ejemplo, un régimen terapéutico incluye la administración de un vector derivado de C68 y la administración repetitiva con uno o más vectores adenovirales de serotipos iguales o diferentes. En otro ejemplo, un régimen terapéutico incluye la administración de un vector adenoviral seguida de administración repetitiva con un vector derivado de C68 de la invención que difiere del serotipo del primer vector adenoviral suministrado, y opcionalmente la administración adicional con otro vector que es igual que, o que con preferencia difiere, del serotipo del vector de las anteriores etapas de administración. Estos regímenes no se limitan al suministro de vectores adenovirales construidos utilizando cápsides derivados de C68. Por el contrario, estos regímenes pueden utilizar fácilmente construcciones, que incluyen proteínas de objetivación no viral y vectores virales, procedentes de otros serotipos adenovirales, incluyendo aunque sin limitación otros serotipos adenovirales de chimpancé (por ejemplo, CI, etc.), otros serotipos

adenovirales de primate no humano, o serotipos adenovirales humanos, en combinación con una o más construcciones derivadas de C68 de la invención. Ejemplos de tales serotipos adenovirales de chimpancé, de primate no humano y de humanos, han sido discutidos en otros lugares del presente documento. Además, estos regímenes terapéuticos pueden incluir tanto el suministro simultáneo como secuencial de las construcciones derivadas de C68 de la invención en combinación con vectores no adenovirales, vectores no virales, y/o una diversidad de otros compuestos o moléculas terapéuticamente útiles. La presente invención no se limita a esos regímenes terapéuticos, una diversidad de los cuales resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.

B. Suministro mediado por Ad de transgenes inmunogénicos

Las construcciones derivadas de C68 de la invención, incluyendo los vectores virales, pueden ser empleadas también como composiciones inmunogénicas. Según se utiliza en la presente memoria, una composición inmunogénica es una composición en la que una respuesta humoral (por ejemplo, un anticuerpo) o celular (por ejemplo, una célula T citotóxica) está montada en un producto de transgén suministrado por la composición inmunogénica a continuación del suministro a un mamífero, y con preferencia un primate. La presente invención proporciona un Ad derivado de C68 recombinante que puede contener en cualquiera de sus supresiones de secuencia de adenovirus, un gen que codifica un inmunógeno deseado o una proteína de C68 capacitada para objetivar una molécula inmunogénica. El adenovirus derivado de C68 es muy adecuado para su uso en una vacuna de virus recombinante vivo en diferentes especies animales en comparación con un adenovirus de origen humano, pero no se limita a tal uso. Los adenovirus recombinantes y proteínas de C68 pueden ser usados como vacunas profilácticas o terapéuticas contra cualquier patógeno para el que se ha(n) identificado el (los) antígeno(s) crucial(es) para la inducción de una respuesta inmune y capacitado(s) para limitar la expansión del patógeno, y para el cual se encuentra disponible el cADN.

Tales composiciones de vacuna (u otras inmunogénicas) están formuladas en un vehículo de suministro adecuado, según se ha descrito en lo que antecede. En general, las dosis para las composiciones inmunogénicas están comprendidas en la gama definida en lo que antecede para las composiciones terapéuticas. Los niveles de inmunidad del gen seleccionado pueden ser monitorizados de modo que se determine la necesidad, si la hay, de intensificadores. A continuación de una averiguación de títulos de anticuerpo en el suero, pueden ser deseables inmunizaciones de intensificador opcionales.

Opcionalmente, una composición de vacuna puede ser formulada de modo que contenga otros componentes, incluyendo por ejemplo adyuvantes, estabilizadores, ajustadores de pH, conservantes y similares. Tales componentes son bien conocidos por los expertos en la técnica de las vacunas. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, liposomas, alumbre, lípido monofosforil A, y cualquier factor biológicamente activo, tal como citoquina, una interleuquina, una quimoquina, un ligando, y combinaciones optimizadas de los mismos. Algunos de estos factores biológicamente activos pueden ser expresados in vivo, por ejemplo mediante un polinucleótido, plásmido o vector viral. Por ejemplo, se puede administrar un adyuvante de ese tipo con una vacuna de ADN original que codifique un antígeno para incrementar la respuesta inmune específica del antígeno en comparación con la respuesta inmune generada con la preparación con una vacuna de ADN que codifique el antígeno solamente.

Los adenovirus recombinantes se administran en una “cantidad inmunogénica”, es decir, una cantidad de adenovirus recombinante que sea efectiva en una vía de administración para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles de expresión suficientes del gen seleccionado para inducir una respuesta inmune. Cuando se proporciona inmunidad protectora, los adenovirus recombinantes son considerados como que constituyen composiciones de vacuna útiles para impedir la infección y/o enfermedad recurrente.

Alternativamente, o adicionalmente, los vectores de la invención pueden contener, el cápside de C68 u otra proteína y pueden ser utilizados para objetivar un transgén que codifique un péptido, polipéptido o proteína que induzca una respuesta inmune a un inmunógeno seleccionado. Los virus derivados de C68 de la presente invención se espera que sean eficaces en la inducción de células T citolíticas y anticuerpos respecto a la proteína antigénica heteróloga insertada expresada por el vector.

1. Transgenes inmunogénicos

Por ejemplo, los inmunógenos pueden ser seleccionados a partir de una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables frente a las que sería deseable una respuesta inmune incluyen la familia picornavirus, la cual incluye los géneros rinovirus, los cuales son responsables de alrededor del 50% de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, los cuales incluyen los poliovirus, coxsackievirus, y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A; y los géneros aptovirus, los cuales son responsables de enfermedades del pie y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus de los picornavirus, los antígenos objetivo incluyen el VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otra familia viral incluye la familia calcivirus, la cual abarca el grupo de virus Norwalk, los cuales son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Incluso otra familia viral deseable para su uso en la objetivación de antígenos para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos es la familia togavirus, la cual incluye los géneros alfavirus, la cual incluye los virus de Sindbis, virus de Ross-River, y encefalitis Venezuelan, Eastern & Western Equina, y rubivirus, que incluye el virus Rubella. La familia

flaviviridae incluye los virus del dengue, de la fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis de St. Louis y la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados a partir de la familia coronavirus o de la hepatitis C, la cual incluye una cantidad de virus no humanos tales como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo), virus de encefalomielitis hematoaglutinante porcino (cerdo), virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos), coronavirus entérico felino (gato), coronavirus canino (perro), y coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado común y/o hepatitis no de tipo A, B o C. Dentro de la familia coronavirus, los antígenos objetivo incluyen el E1 (también denominado M o proteína matriz), E2 (también conocido como S proteína Spike), E3 (también denominado HE o hemaglutina-elterosa) glicoproteína (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Incluso otros antígenos pueden objetivados contra la familia rabdovirus, la cual incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, el Virus de Estomatitis Vesicular) y el lissavirus general (por ejemplo, rabias). Dentro de la familia rabdovirus, los antígenos adecuados pueden ser derivados de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, la cual incluye virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus Marburg y el Ébola, pueden ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el Virus Tipo 1 de parainfluenza, el Virus Tipo 3 de parainfluenza, el Virus Tipo 3 de parainfluenza bovina, el rubaluvirus (virus de las paperas), el Virus Tipo 2 de parainfluenza, el Virus Tipo 4 de parainfluenza, el virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), fiebre biliosa hematúrica, morbilivirus, que incluye la cisticercosis y el moquillo canino, y neumovirus, que incluye el virus sincital respiratorio. El virus de la influenza está clasificado dentro de la familia ortomixoviurs y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N 1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis California, La Crosse), flebovirus (Fiebre del Valle del Rift), hantavirus (el puremala es un virus de la fiebre de hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi) y varios bungavirus sin asignar. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos contra LCM y el virus de la fiebre de Lassa. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (el cual causa gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre de la Garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalosis equina, lengua azul).

La familia retrovirus incluye la subfamilia oncovirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como el virus de leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), el virus de inmunodeficiencia del simio (SIV), el virus de inmunodeficiencia felina, el virus de anemia infecciosa equina, y espumavirinal). Entre los lentivirus, se han descrito muchos antígenos adecuados y pueden ser fácilmente seleccionados. Ejemplos de antígenos de HIV y SIV adecuados incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef, así como también diversos fragmentos de las mismas. Por ejemplo, los fragmentos adecuados de la proteína Env pueden incluir cualquiera de sus subunidades tales como el gp120, gp160, gp41, o fragmentos más pequeños de las mismas, por ejemplo, de al menos alrededor de 8 aminoácidos de longitud. De forma similar, pueden ser seleccionados los fragmentos de la proteína tat. [Véase la Patente US 5.891.994 y la Patente US 6.193.981]. Véase también las proteínas HIV y SIV descritas por D.H. Barouch et al., en J. Virol., 75(5): 2462-2467 (Marzo 2001), y por R.R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001). En otro aspecto, los péptidos o las proteínas inmunogénicas de HIV y/o SIV pueden ser utilizados para formar proteínas de fusión u otras moléculas inmunogénicas. Véase, por ejemplo, las proteínas de fusión Tat y/o Nef de HIV-1 y los regímenes de inmunización descritos en WO 01/54719, publicada el 2 de Agosto de 2001, y en WO 99/16884, publicada el 8 de Abril de 1999. La invención no se limita a las proteínas o péptidos inmunogénicos de HIV y/o SIV descritos en la presente memoria. Además, se han descrito una diversidad de modificaciones para estas proteínas o podrían ser realizadas fácilmente por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se ha descrito en la Patente US 5.972.596. Además, los inmunógenos de HIV y/o SIV deseados pueden ser suministrados solos o en combinación. Tales combinaciones pueden incluir expresión a partir de un único vector o a partir de múltiples vectores. Opcionalmente, otra combinación puede incluir el suministro de uno o más inmunógenos expresados con el suministro de uno o más de los inmunógenos en forma de proteína. Tales combinaciones se discuten con mayor detalle en lo que sigue.

La familia papovavirus incluye la subfamilia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia (asociada con cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia de adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causa enfermedad respiratoria y/o enteritis. El parvovirus felino de la familia parvovirus (enteritis felina), el panleucopeniavirus felino, el parvovirus canino, y el parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirus, la cual abarca los géneros simplesvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (seudo-rabias, varicela zoster), y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los géneros linfocriptovirus, EBV (linfoma Burkitts), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, la cual abarca los géneros ortopoxvirus (Variola (Smalipox) y Vaccinia (Cowpox)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis

B. Un virus sin clasificar que puede ser una fuente adecuada de antígenos es el virus de la Hepatitis delta. Incluso otras fuentes virales pueden incluir el virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de encefalitis.

La presente divulgación puede abarcar también inmunógenos que sean útiles para inmunizar a un humano o animal no humano contra otros patógenos incluyendo bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos

multicelulares que infectan vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de una célula cancerígena o de una célula tumoral. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos patogénicos gram positivos incluyendo los neumococos; estafilococos, y estreptococos. Los cocos patogénicos gram negativos incluyen los meningococos; gonococos. Los bacilos gram negativos entéricos patogénicos incluyen los enterobacteriáceos; seudomonas, acinetobacteria y eikenella; salmonella; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreil (que causa cancroide); brucella; Franisella tularensis (que causa tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacilus monliformis y spirilium; bacilos Gram positivos que incluyen listeria monocitógenos; eysipelothrix rhusiopathiae; corynebacterium difteria (difteria); cólera;

B. anthracis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonelosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaeróbicas patogénicas incluyen tétanos; botulismo; otra clostridia; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen la sífilis; treponematosis; sífilis pian, pinta y endémica; y leftoespirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas mas importantes y hongos patógenos incluyen actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis; aspergilosis; y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiyodomicosis, petrielidosis, turolopsosis, miceloma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones ricketsias incluyen fiebre del tifus, fiebre de las Montañas Rocosas, fiebre Q, y Rickettsialpox. Ejemplos de infecciones clamidiales y de micoplasma incluyen: mycoplasma pneumoniae; lymphogranuloma venereum; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Los eucariotas patogénicos abarcan protozoos y helmintos patogénicos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocistis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos o flukes; e infecciones de cestodo (solitaria).

Muchos de estos organismos y/o toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros para el Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Sanidad y Servicios Humanos, USA], como agentes que tienen un potencial para su uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de estos agentes biológicos incluyen Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebre hemorrágica viral, todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría A; Coxiella burneti (fiebre Q); especies Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermos), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especies Staphylococcus y sus toxinas (enterotoxina B), todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría B; y virus Nipan, tuberculosis resistente a múltiples medicamentos, fiebre amarilla, virus de la fiebre amarilla transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, y hantavirus, los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría C. Además, otros organismos, que están clasificados de ese modo o de forma diferente, pueden ser identificados y/o utilizados para fines de este tipo en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para suministrar antígenos a partir de estos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que impedirán y/o tratarán la infección u otras reacciones adversas con estos agentes biológicos.

La administración de los vectores y proteínas para suministrar inmunógenos contra la región variable de las células T da lugar a una respuesta inmune incluyendo CTL para eliminar esas células T. En RA, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucrados en la enfermedad han podido ser caracterizadas. Estos TCRs incluyen el V-3, V-14, V-17 y Va-17. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de estos polipéptidos dará lugar a una respuesta inmune que tendrá por objetivo células T involucradas en RA. En MS, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucrados en la enfermedad han podido ser caracterizadas. Estos TCRs incluyen el V-7 y Va-10. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifique al menos uno de esos polipéptidos proporcionará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en MS. En escleroma, varia regiones variables específicas de TCRs que están involucrados en la enfermedad han podido ser caracterizadas. Estos TCRs incluyen el V-6, V-8, V-14 y Va-16, Va-3C, Va-7, Va-14, Va15, Va-16, Va-28 y Va-12. De ese modo, el suministro de un adenovirus de chimpancé recombinante que codifique al menos uno de esos polipéptidos dará lugar a una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en escleroderma.

C. Métodos de suministro mediados con Ad

Se pueden monitorizar los niveles terapéuticos, o niveles de inmunidad, del gen seleccionado para determinar la necesidad, si la hay, de intensificadores. A continuación de la averiguación de una respuesta de célula T de CD8+, u opcionalmente, de títulos de anticuerpo, en el suero, pueden ser deseables inmunizaciones intensificadoras opcionales. Opcionalmente, las construcciones derivadas de C68 de la invención pueden ser suministradas en una administración única o en varios regímenes de combinación, por ejemplo en combinación con un régimen o curso de tratamiento que incluya otros ingredientes activos o en un régimen de intensificación original. Unas diversidad de tales regímenes han sido descritos en el estado actual de la técnica y pueden ser seleccionados fácilmente.

Por ejemplo, los regímenes de intensificación original pueden incluir la administración de un vector a base de ADN (por ejemplo, un plásmido) para preparar el sistema inmune para la segunda administración, intensificadora, con un antígeno tradicional, tal como una proteína o un virus recombinante portador de las secuencias que codifican tal antígeno. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/11140, publicado el 2 de Marzo de 2000. Alternativamente, un

régimen de inmunización puede incluir la administración de un vector adenoviral recombinante de chimpancé para intensificar la respuesta inmune a un vector (ya sea viral o ya sea a base de ADN) portador de un antígeno, o una proteína. Todavía según otra alternativa, un régimen de inmunización incluye la administración de una proteína seguida de un intensificador con un vector que codifique el antígeno.

En una realización, la divulgación proporciona un método de preparación e intensificación de una respuesta inmune a un antígeno seleccionado, suministrando un vector de ADN de plásmido portador de dicho antígeno, seguido de intensificación con un vector adenoviral recombinante de chimpancé. En una realización, el régimen de intensificación original incluye la expresión de multiproteínas procedentes del vehículo original y/o de intensificación. Véase, por ejemplo, R.R. Amara, Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001) que describe un régimen de multiproteína para expresión de subunidades de proteína útiles para generar una respuesta inmune contra HIV y SIV. Por ejemplo, una preparación de ADN puede suministrar la Gag, Pol, Vif, VPX y Vpr y Env, Tat y Rev a partir de una transcripción única. Alternativamente, el Gag, Pol de SIV, y Env de HIV, se suministran en una construcción de adenovirus recombinante de la invención. Incluso se describen otros regímenes más en los documentos WO 99/16884 y WO 01/54719.

Sin embargo, los regímenes de intensificación original no se limitan a inmunización para HIV o al suministro de estos antígenos. Por ejemplo, la preparación puede incluir el suministro con un primer vector de chimpancé seguido de un segundo vector de chimpancé, o con una composición que contenga el propio antígeno en forma de proteína. En un ejemplo, el régimen de intensificación original puede proporcionar una respuesta protectora inmune al virus, bacteria u otro organismo del que se derive el antígeno. En otra realización deseada, el régimen de intensificación original proporciona un efecto terapéutico que puede ser medido utilizando ensayos convencionales para la detección de la presencia de la condición para la que se está administrando la terapia.

La composición de preparación puede ser administrada en varios lugares del cuerpo de una manera dependiente de la dosis, la cual depende del antígeno para el que se haya objetivado la respuesta inmune deseada. La invención no se limita a la cantidad o al sitio de la(s) inyección(es) o al portador farmacéutico. Por el contrario, el régimen puede incluir una etapa de preparación y/o intensificación, cada una de las cuales puede incluir una dosis simple o dosificación que se administra cada hora, diariamente, semanalmente o mensualmente, o anualmente. Como ejemplo, los mamíferos pueden recibir una o dos dosis que contengan entre alrededor de 10 Ig y alrededor de 50 Ig de plásmido en el portador. Una cantidad deseable de una composición de ADN está comprendida en la gama de entre alrededor de 1 Ig y alrededor de 10.000 Ig del vector de ADN. Las dosificaciones pueden variar desde alrededor de 1 Ig hasta 1000 Ig de ADN por kg de peso corporal del sujeto. La cantidad o el sitio de suministro se selecciona deseablemente en base a la identidad y la condición del mamífero.

La unidad de dosificación del vector adecuado para el suministro del antígeno va a ser descrita en la presente memoria. El vector se prepara para su administración siendo suspendido o disuelto en un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina isotónica; solución de sales isotónicas u otras formulaciones que resultarán evidentes para los expertos en dicha administración. El portador adecuado resultará evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran medida de la ruta de administración. Las composiciones pueden ser administradas a un mamífero de acuerdo con las rutas descritas en lo que antecede, en una formulación de liberación sostenida que utiliza un polímero biocompatible biodegradable, o mediante suministro en el sitio utilizando micelas, geles y liposomas. Opcionalmente, la etapa de preparación incluye también administrar con la composición de preparación una cantidad adecuada de un adyuvante, tal y como se define en la presente memoria.

Con preferencia, una composición intensificadora se administra entre alrededor de 2 y alrededor de 27 semanas después de la administración de la composición de preparación al sujeto mamífero. La administración de la composición intensificadora se lleva a cabo utilizando una cantidad efectiva de una composición intensificadora que contiene, o que es capaz de suministrar, el mismo antígeno que el administrado por la vacuna de ADN original. La composición intensificadora puede estar compuesta por un vector viral recombinante derivado de la misma fuente viral (por ejemplo, secuencias adenovirales) o de otra fuente. Alternativamente, la “composición intensificadora” puede ser una composición que contenga el mismo antígeno que el codificado en la vacuna de ADN original, pero en forma de proteína o de péptido, cuya composición induce una respuesta inmune en el anfitrión. En otra realización, la composición intensificadora contiene una secuencia de ADN que codifica el antígeno bajo el control de una secuencia reguladora que dirige su expresión en una célula de mamífero, por ejemplo vectores tales como los vectores bacterianos o virales bien conocidos. Los requisitos originales de la composición intensificadora son que el antígeno de la composición sea el mismo antígeno, o un antígeno reactivo cruzado, como el codificado por la composición original.

En otra realización, los vectores adenovirales de chimpancé son también muy adecuados para su uso en una diversidad de otros regímenes de inmunización y terapéuticos. Tales regímenes pueden incluir el suministro de construcciones de C68 de la invención simultáneamente o secuencialmente con construcciones de Ad de diferentes cápsides de serotipo, regímenes en los que se suministran construcciones derivadas de C68 de la invención simultáneamente o secuencialmente con vectores que no son de Ad, regímenes en los que los vectores adenovirales de la invención se suministran simultáneamente o secuencialmente con proteínas, péptidos y/o otros

compuestos terapéuticos o inmunogénicos biológicamente útiles. Tales usos resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.

Los ejemplos que siguen se proporcionan para ilustrar la invención y no limitan el alcance de la misma.

Ejemplo 1 – Creación de un vector suprimido en E1 a base de C68 de adenovirus de chimpancé utilizando selección verde-blanca de recombinantes

Se aisló una versión de replicación defectuosa de C68 para su uso en transferencia de gen. Se siguió la estrategia clásica de creación de un recombinante con E1 suprimido, mediante recombinación homóloga en una línea de célula de expresión de E1. La primera etapa fue la creación de un plásmido que contenía m.u. 0 a 1,3 seguido por la adición de una proteína fluorescente verde (GFP) potenciada de expresión de minigén, procedente de un promotor de CMV y abarcando la secuencia de C68 de 9-16,7 m.u. Este plásmido linealizado fue co-transfectado en una línea de célula de expresión de E1 con plásmido de C68 digestado en Ssp I (SspI corta a 3,6 m.u. dejando 644 kp para recombinación homóloga). Los experimentos fueron inicialmente conducidos con células 293 con E1 de hospedaje procedente de Ad5 humano, con la esperanza de que esto fuera suficiente para la transcomplementación. En efecto, se formaron placas que representaban el recombinante deseado. El vector resultante se denominó C68-CMV-GFP.

Se modificó la estrategia de regeneración de recombinantes para permitir un aislamiento rápido y eficiente de recombinantes. En primer lugar, el ADN de fosfatasa alcalina del vector lanzadera inicial fue sustituido por un gen de GFP procariótico activado por el promotor procariótico del lacZ. Esto permitió un examen eficiente de transformaciones bacterianas cuando se intentó incorporar una unidad transcripcional pol II de ARN eucariótico en el vector lanzadera. La transformación resultante pudo ser examinada en cuanto a expresión de GFP; las colonias blancas son recombinantes mientras que las colonias verdes son plásmido parental residual.

Una selección verde-blanco ha sido utilizada para examinar los productos de co-transfección para el aislamiento de recombinantes de Ad5 humano (A.R. Davis et al., Gene Thera., 5: 1148-1152 (1998)). En el presente sistema, y en contraste con Davis, el vector lanzadera inicial fue revisado para que incluyera las secuencias 3’ extendidas de 9 a 26 MU. Este vector fue co-transfectado con ADN viral procedente del aislado de C68-CMV-GFP original que había sido restringido con Xba I, el cual corta a MU 16,5 permitiendo 9,5 kb de solapamiento para recombinación homóloga. Las placas resultantes fueron examinadas bajo microscopia fluorescente de contraste de fase en cuanto a aislados no fluorescentes que representan los recombinantes deseados. Esto simplificó considerablemente el examen en comparación con los métodos estándar basados en expresión de estructura o de transgén. De ese modo, el método puede ser adaptado fácilmente para su uso en la generación de otros tipos de vectores virales adenovirales o no adenovirales.

A. Plásmido lanzadera

Para construir un vector lanzadera de plásmido para la creación del virus de C68 recombinante, el plásmido pSP72 (Promega, Madison, WI) fue modificado mediante digestión con BgI II seguido de relleno de los extremos con enzima de Klenow (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) y ligación con un enlazador Pac I de 12 bp sintético (New England Biolabs, Beverly, MA) para producir pSP72-Pac. Un fragmento de Pac I/Snab I de 456 bp que abarca una unidad de mapa (m.u. o MU) 0-13 del genoma C68, fue aislada del plásmido pNEB-BamE que contenía el fragmento E de BamHI del genoma C68 y clonada en pS72-Pac tratada de Pac I y EcoR V para producir la pSPC68-MU 0-1,3. Un casete de minigén consistente en el promotor inicial de citomegalovirus que activa lacZ con una señal poliA de SV40 fue separado del pCMV (Clontech, Palo Alto, CA) como un fragmento EcoR/SaII de 4,5 kb y ligado a pSP-C68-MU 0-1,3 restringido con el mismo conjunto de enzimas, dando como resultado pSP-C68-MU 0-1,3-CMVLacZ.

Durante la etapa inicial en el aislamiento de la región de 9-16,7 MU de C68, ambos pGEM-3AZ (Promega, Madison, MI) y pBS-C68-BamF fueron doblemente digestados con enzimas BamHI y Sph I. A continuación, el fragmento de 293 bp del pBS-C68-BamF fue ligado con el espinazo del pGEM-3Z para formar pGEM-C68-MU 9-9,8. Se obtuvo un fragmento de 2,4 kb que incluía el C68 MU 9,8-16,7 a partir del clon pBS-C68 BamHB tras digestión de Xbal, relleno en reacción y posterior tratamiento de BamHI y clonado en pGEM-C68-MU 9-9,8 digestado doble de BamH/SmaI para generar pGEM-C68-MU 9-16,7. La región de 9-16,7 m.u. de C68 fue aislada del pGEM-C68-MU 9-16,7 mediante digestión con EcoRI, relleno en los extremos con enzima de Klenow (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), ligación de un enlazador HindII de 12 bp sintético (NEB) y a continuación digestión con HindII. Este fragmento de 2,7 kb que abarca las 9-16,7 MU de C68, fue clonado en el sitio HindII de pSP-C68-MU 0-1,3-CMVIacZ para formar el plásmido lanzadera final pC68-CMV-LacZ. Adicionalmente, un fragmento de cADN de fosfatasa alcalina (AP) de 820 bp fue aislado del pAdCMVALP (K.J. Fischer, et al., J. Virol. 70: 520-532 (1996)) e intercambiado en cuanto a lacZ en los sitios Not I de pC68-CMV-lacZ, dando como resultado pC68-CMV-AP.

B. Construcción de virus recombinante

Para crear el vector C68-CMVEGFP recombinante suprimido en E1, se construyó en primer lugar un plásmido lanzadera de pC68-CMV-EGFP sustituyendo el transgén lacZ en pC68-CMV-lacZ por el gen de proteína

fluorescente verde potenciada (EGFP). El proceso de clonación por sustitución fue llevado a cabo tal y como sigue. Se introdujo un sitio de restricción NortI adicional en el extremo 5’ de la secuencia de codificación de EGFP en la pEGFP-1 (Clontech, Palo Alto, CA) mediante digestión de BamHI, relleno en reacción y ligación de un enlazador NotI sintético (NEB) de 8 bp. Tras la restricción NotI de ambas construcciones, la secuencia EGFP fue aislada de la pEGFP-1 modificada y se utilizó para reemplazar el gen lacZ en el pC68-CMV-lacZ. La construcción de pC68-CMVEGFP (3 Ig) fue co-transfectada con ADN genómico de C68 digestado en Ssp I (1 Ig) en células 293 para recombinación homóloga según se ha descrito anteriormente (G. Gao, et al., J. Virol., 70: 8934-8943 (1996)). Las placas verdes visualizadas mediante microscopía fluorescente fueron aisladas mediante 2 rondas de purificación de placa, expansión y purificación mediante sedimentación de gradiente de CsCl (G. Gao, et al., citado anteriormente).

La invención proporciona una versión modificada de forma única del proceso de selección verde/blanco (A. R. Davis, et al., Gene Thera., 5: 1148-1152 (1998)). El presente ejemplo ilustra el uso de este método para la construcción de vectores de C68 recombinantes. Un fragmento de 7,2 kb que abarca 9 a 36 MU fue aislado del plásmido pBSC68-BamB mediante tratamiento con endonucleasas de restricción Agel y Bsiwl, y clonado en los sitios Asp718 y Agel del plásmido lanzadera pC68-CMV-AP, dando como resultado un nuevo plásmido denominado pC68CMV-AP-MU36. Se realizó una modificación adicional para eliminar de 26 a 36 m.u. del pC68CMV-Ap-MKU36 mediante digestiones de Eco47III y NruI. El nuevo plásmido lanzadera denominado pC68CMV-AP-MU26 tiene una región más corta para recombinación homóloga (es decir, 16,7-26 MU) 3’ para el minigén. Para realizar un vector recombinante de C68, la fosfatasa alcalina (AP) se sustituye por el gen de interés. La construcción pC68CMV-Nugene-MU26 resultante es cotransfectada con ADN viral de C68-CMVGFP restringido en Xba I (16,5 MU) en células 293, seguido de recubrimiento superior de agar. Las placas (blancas) de virus recombinante se generan mediante la recombinación homóloga en la región de 16,7-26 MU que es compartida entre la construcción pC68CMV-Nugene y el espinazo viral de C68; los recombinantes que forman placas blancas son seleccionados a partir de placas verdes de virus C68-CMVGFP sin cortar.

El mecanismo de selección de verde/blanco fue también introducido en el proceso de clonación del gen de interés en el plásmido lanzadera pC68. El gen de AP de ambos pC68CMV-AP-MU36 y pC68CMV-AP-MU26 fue sustituido por un casete de gen de GFP procariótico activado por el promotor lacZ aislado a partir del pGFPMU31 (Clontech, Palo Alto, CA). De ese modo, las colonias blancas de transformantes bacterianos contendrán el plásmido recombinante. Este proceso de selección de verde/blanco para colonias bacterianas evitó la necesidad de realizar y caracterizar grandes cantidades de ADNs mini-preparados y de ese modo se incrementó además la eficacia en cuanto a creación de vectores de C68 recombinantes.

Ejemplo 2 – Cepa y replicación de virus C68 de chimpancé

Los ejemplos 3 a 5 que siguen proporcionan caracterización adicional del C68 de chimpancé. El experto en la materia apreciará que esta información puede ser utilizada fácilmente en la construcción de nuevas construcciones adenovirales recombinantes de chimpancé.

La cepa de virus C68 fue obtenida en ATCC (Rockville, MD) y propagada en células 293 (ATCC) cultivadas en DMEM (Sigma, St. Louis, MO) suplementada con un 10% de suero de ternero fetal (FCS; Sigma o Hyclone, Logan, UT) y un 1% de Penicilina-Estreptomicina (Sigma). La infección de células 293 se llevó a cabo en DMEM suplementado con un 2% de FCS durante las primeras 24 horas, después de lo cual se añadió FCS para llevar la concentración final al 10%. Las células infectadas se cultivaron cuando el 100% de las células presentaron un efecto citopático (CPE) inducido por virus, se recogieron y se concentraron por centrifugación. Las bolitas de células fueron re-suspendidas en 10 mM de Tris (pH 8,0), y lisadas mediante 3 ciclos de congelación y licuación. Se obtuvieron preparaciones de virus después de 2 etapas de ultracentrifugación sobre gradientes de densidad de cloruro de cesio y las cepas de virus fueron diluidas hasta 1 x 1012 partículas/ml en 10 mM de Tris/100 mM de NaCl/50% de glicerol y se almacenaron a -70 ºC.

Ejemplo 3 – Clonación y secuenciación de ADN genómico viral

Se aisló ADN genómico procedente de la preparación de virus purificado siguiendo métodos estándar, y fue digestado con un panel de 16 enzimas de restricción siguiendo las recomendaciones del fabricante. Excepto lo que se ha indicado, todas las enzimas de restricción y modificación fueron obtenidas en Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN. El ADN genómico fue digestado con BamHI, pstI SaII, HindII o XbaI y los fragmentos fueron subclonados en plásmidos (K.L. Berkner y P.A. Sharp, �?cidos Nucl. Res., 11: 6003-20 (1983)). Tras la desproteinación, enlazadores PacI sintéticos de 10 bp (New England Biolabs, Beverly, MA) fueron digestados doblemente con PacI y BamHI, o PstI.

Los clones de PstI, BamHI y HindIII generados a partir de C68, han sido ilustrados en la Figura 1, partes C, D y E, respectivamente. Los fragmentos indicados mediante las casillas sombreadas no fueron clonados, pero la secuencia del genoma completo ha sido determinada mediante secuenciación de clones solapantes y ADN viral directamente (casillas sin sombrear). Los fragmentos clonados y los tamaños de inserto se describen en la Tabla 1. En la tabla que sigue, pBS = clon pBluescript SK+; pNEB = clon pNEB 193; pBR = clon pBR322; Sin prefijo = fragmento no clonado.

Tabla 1. Clones de plásmido de C68 y tamaños de inserto

Nombre de la construcción

Tamaño de inserto (pares de base) Extremo 5’ de fragmento Extremo 3’ de fragmento Unidad de mapa de extremo 5’ Unidad de mapa de extremo 3’

Fragmentos Pst-I

C68-Pst-A

6768 24784 31551 67,9% 86,4%

pBS:C68-Pst-B

6713 4838 11550 13,2% 31,6%

pBS:C68-Pst-C

5228 14811 20038 40,6% 54,9%

pBS:C68-Pst-D

2739 12072 14810 33,1% 40,6%

pBS:C68-Pst-E

2647 20039 22685 54,9% 32,1%

pBS:C68-Pst-F

1951 32046 33996 87,8% 93,1%

pNEB:C68-Pst-G

1874 1 1874 0,0% 5,1%

pBS:C68-Pst-H

1690 23094 24783 63,2% 67,9%

pBS:C68-Pst-I

1343 33997 35339 93,1% 96,8%

pNEB:C68-Pst-J

1180 35340 36519 96,8% 100,0%

pBS:C68-Pst-K

1111 2763 3873 7,6% 10,6%

pBS:C68-Pst-L

964 3874 4837 10,6% 13,2%

PBS:C68-Pst-M

888 1875 2762 5,1% 7,6%

pBS:C68-Pst-N

408 22686 23093 62,1% 63,2%

C68-Pst-O

380 31666 32045 86,7% 87,7%

pBS:C68-Pst-P

285 11551 11835 31,6% 32,4%

C68-Pst-Q

236 11836 12071 32,4% 33,1%

pBS:C68-Pst-R

114 31552 31665 86,4% 86,7%

Fragmentos BamHI

C68-Bam-A

16684 19836 36519 54,3% 100,0%

pBS:C68-Bam-B

8858 3582 12439 9,8% 34,1%

pBS:C68-Bam-C

4410 12440 16849 34,1% 46,1%

pBS:C68-Bam-D

2986 16850 19835 46,1% 54,3%

pNEB:C68-Bam-E

2041 1 2041 0,0% 5,6%

pBS:C68-Bam-F

1540 2042 3581 5,6% 9,8%

Fragmentos HindIII

pBR:C68-Hind-B

9150 23471 32620 64,3% 89,3%

El adenovirus de chimpancé, C68, fue obtenido en ATCC y se propagó en células 293 humanas. El ADN genómico viral fue aislado a partir del virión purificado utilizando procedimientos establecidos (A. R. Davis, et al., Gene Thera.,

5: 1148-1152 (1998)) y digestado con un panel de enzimas de restricción; los datos fueron consistentes con estudios previos (datos no representados) (G. R. Kitchingman, Gene, 20: 205-210 (1982); Q. Li y G. Wadeli, Archi. Virol. 101: 65-77 (1998); R. Wigand, et al., Intervirology. 30: 1-9 (1989)). Los fragmentos de restricción que se extienden al genoma completo de C68 fueron subclonados en plásmidos. Un dibujo esquemático del genoma de C68 ha sido mostrado en la Figura 1A, y los fragmentos Pst-I, BamHI y HindIII que fueron clonados en vectores de plásmido han sido indicados mediante las casillas sin sombrear, en las Figuras 1B, 1C y 1D, respectivamente. Los fragmentos

clonados, tamaños de fragmento y posición genómica han sido listados en la Tabla 1. Tanto los clones de plásmido como el ADN genómico fueron usados como plantillas para secuenciación. El genoma fue secuenciado mediante iniciador que se mueve en ambas direcciones y cada base fue incluida en una media de aproximadamente cuatro reacciones.

El genoma de C68 es de 36521 bp de longitud [véase la Patente US 6.083.76]. La comparación preliminar con secuencias de GenBank indicaron grados de similitud variables con otros adenovirus humanos y animales a lo largo de la longitud completa del genoma viral. Las regiones con homología para todas las unidades genéticas adenovirales descritas anteriormente, las regiones iniciales 1-4 y las regiones finales mayores, fueron encontradas en el genoma de C68 (Figura 1A). La homología de ADN entre los adenovirus C68 y humano que han sido completamente secuenciados, Ad2 (NC001405), Ad5 (NC001405), Ad12 (NC001460), Ad17 (NC002067) y Ad40 (NC01464), se utilizó para ordenar los clones. Se determinaron los cuadros de lectura abierta (ORF) y los genes fueron identificados en base a homología con otros adenovirus humanos. Todos los genes iniciales y finales adenovirales mayores están presentes en C68. Las repeticiones terminales invertidas (ITR=s) son de 130 bp de longitud.

Ejemplo 4 – Análisis de secuencia de C68

La secuencia de nucleótido completa de cada miembro del Mastadenovirus genus accesible a partir de GenBank, incluyendo los aislados procedentes de diferentes especies, fueron examinados en cuanto a identidad respecto a C68. El minigenoma de Ad4 fue ensamblado a partir de las secuencias de GenBank siguientes: IRT del lado izquierdo (J01964); región E1A (M14918); pol y pTP de ADN (X74508, 74672); VA ARN-I, II (U10682); 52. 55K (U52535); pVII (U70921); hexon (X84646); endoproteasa (M16692); proteína de enlace de ADN (M12407); fibra (X76547); ITR del lado derecho (J01965). El genoma compuesto de Ad7 se creó a partir de los siguientes datos de secuencia: Mu 3-21 (X03000); VA ARN-I, II, pTP & 52, 55K (U52574); penton (AD001675); pVI, hexon y endoproteasa (AF065065); proteína de enlace de ADN (K02530); E3 y región de fibra (AF104384); ITR del lado derecho (V00037).

El alineamiento de secuencia de aminoácido fue generado con Clustal X, editado con Jalview (http://www.ebi.ac.uk/ ~michele/jalview/) , y analizado con Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/ BOX_form.html). Las secuencias de proteína hexon públicamente disponibles procedentes de serotipos de adenovirus humano fueron alineadas inicialmente para identificar el conjunto que muestra la homología más alta con C68.

La secuencia de nucleótido y las secuencias de aminoácido pronosticadas de todos los cuadros significativos de lectura abierta del genoma de C68 fueron comparadas con secuencias de ADN y de proteína conocidas. La secuencia de nucleótido de C68 fue comparada con secuencias de Ad 2, 4, 5, 7, 12, 17 y 40. En conformidad con análisis de restricción previos (Kitchingman, citado anteriormente), el C68 es el más similar al Ad4 humano (subgrupo E).

La región E1A de C68 se extiende desde la casilla TATA en nt 480 hasta el sitio de adición de poliA en 1521. Los sitios de donante y aceptador de unión de consenso están en la posición análoga de las contrapartes de Ad humano, y las proteínas 28.2K y 24.8K son de tamaño similar a las proteínas de Ad humano. La ORF para la proteína E1A más pequeña de C68 ha sido pronosticada para codificar 101 residuos en oposición a aproximadamente 60 aminoácidos para otros adenovirus. Existe un codón TTA en el residuo 60 para C68 en el que otros adenovirus tienen con frecuencia un codón de interrupción de TGA. Los primeros 60 residuos de la proteína 100R de E1A de C68 tienen un 80% de identidad con el homólogo de Ad4.

El genoma de C68 codifica genes para las cuatro proteínas de E1B, 20.5K, 54.7K, 10.1K y 18.5K así como pIX. Las cinco proteínas codificadas de C68 son de tamaño similar al de otras proteínas E1B y pIX de Ad. El homólogo de Ad de la proteína E1B 21K tiene solamente 142 aminoácidos, donde C68 tiene 186 residuos y otros adenovirus humanos tienen 163-178 residuos.

El C68 y las proteínas de Ad4 comparten el 95% de identidad sobre las primeras 134 aa, a continuación termina la similitud y la proteína de Ad4 termina en 142 aminoácidos.

El genoma de C68 codifica homólogos de la proteína de enlace E2A 55K de ADN y de la proteína de maduración Iva2, así como de la proteína terminal E2B y de la polimerasa de ADN. Todas las proteínas de la región E2 son de tamaño similar a sus contrapartes de Ad humano, y las proteínas E2B están particularmente bien conservadas. La polimerasa de ADN E2B 123.6K de C68 se ha pronosticado que es de 1124 residuos, mientras que Ad4 se ha pronosticado que tiene 1193 aunque los otros adenovirus humanos tienen polimerasas más pequeñas. Los residuos 1-71 de la polimerasa de Ad4 no tienen similitud con ninguna otra polimerasa de Ad, y es posible que esta proteína se inicie realmente en un codón de ATG interno. A partir de los aminoácidos 72-1193, las polimerasas de Ad4 y de C68 tienen un 96% de identidad de aminoácido.

Las regiones E3 de adenovirus humanos secuenciados presentan una variabilidad considerable de secuencia y de capacidad de codificación. El Ad40 tiene cinco genes de región E3, el Ad12 tiene seis, el C68 y el Ad5 tienen siete,

el Ad38 tiene ocho y tanto el Ad3 como el Ad7 (adenovirus humanos de subgrupo B) tienen nueve genes de región E3 putativa. La región E3 de Ad4 no ha sido aún secuenciada. En comparación con la región E3 de Ad35, la totalidad de los 7 homólogos del gen E3 fueron identificados en el genoma de C68 (C. F. Basler y M.S. Horwitz, Virology, 215: 165-177 (1998)).

La región E4 de C68 tiene 6 ORFs y cada una es homóloga respecto a proteínas de la región E4 de Ad5, 12 y 40 humana. La nomenclatura E4 es confusa debido a que los homólogos de ORF2 de C68, Ad2 y Ad40 son aproximadamente 130 residuos, mientras que en Ad5 existen dos ORFs que codifican proteínas de 64 y 67 residuos con homología, respectivamente, respecto a los extremos terminales amino y carboxi de las proteínas de ORF2 más grandes. La ORF5 ha sido omitida en nuestra nomenclatura debido a que la 5ª ORF de la región E4 es homóloga con la proteína ORF6 ampliamente estudiada del Ad5 humano.

Se localizaron el promotor final mayor y las secuencias líder tripartito del genoma C68. Las ORFs con el potencial de codificar las 15 proteínas finales mayores fueron localizadas. Todas las proteínas finales de C68 son de tamaño similar a sus contrapartes de Ad humano. El porcentaje de identidad de aminoácido entre proteínas finales de Ad de chimpancé y humano varía considerablemente. La proteína fibra de C68 se pronosticó que tenía el 90% de identidad de aminoácido con la proteína Ad4, pero mucha menos similitud con las otras proteínas fibra de Ad humano. El sitio de enlace CAR en el botón de fibra se encuentra presente en C68.

Ejemplo 5 – Ensayos de anticuerpo neutralizante de virus

Se realizaron varios estudios para determinar si existe reactividad cruzada entre el tipo específico de suero de C68 y el adenovirus humano. La actividad neutralizante de los sueros fue probada como sigue. Paneles de sueros procedentes de sujetos humanos normales (N = 50), monos rhesus (N = 52) y chimpancés (N = 20) fueron evaluados en cuanto a anticuerpos neutralizantes frente a vectores basados en Ad5 y C68 utilizando células 293 como línea celular indicadora. Los sueros recogidos en individuos humanos, monos rhesus, o chimpancés fueron desactivados a 56 ºC durante 30 minutos. Una dilución en serie de cada muestra (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160,

1:320 en 100 Il de DMEM que contenía un 10% de FCS) fue añadida a cantidades iguales de H5.010CMVEGFP (1000 PFU/pocillo) o virus C68CMVEGFP y se incubó a 4 ºC durante dos horas. Ciento cincuenta microlitros de la mezcla fueron transferidos sobre 2 x 10 células 293 en 96 placas de pocillo de fondo plano. Pocillos de control fueron infectados con cantidades iguales de virus (sin adición de suero). Las muestras fueron incubadas a 37 ºC en 5% de CO2 durante 48 horas y examinadas bajo un microscopio fluorescente. Las diluciones de muestra que mostraron una reducción >50% de focos fluorescentes verdes en comparación con los controles infectados fueron clasificadas como positivas para anticuerpos neutralizantes.

Según se esperaba, aproximadamente el 35% de los sujetos humanos normales demostraron anticuerpos neutralizantes frente a Ad5, una frecuencia mucho más alta que la observada en sueros de monos rhesus y de chimpancés. El anticuerpo neutralizante respecto al C68 fue observado en el 80% de chimpancés y solamente en un 2% de los sujetos humanos o de monos rhesus. Las concentraciones de anticuerpos neutralizantes en las especies no objetivo fueron generalmente bajas.

Para evaluar mejor la reactividad cruzada de C68 con vectores de adenovirus humano, se inmunizaron ratones con 2 x 107 unidades de formación de placa (pfu) de Ad 2, 4, 5, 7 y 12, así como de C68. Los sueros fueron cultivados 2 semanas después y probados en cuanto a anticuerpos que neutralizaban los vectores Ad5 o C68. El anticuerpo neutralizante para el vector Ad5 fue detectado únicamente en animales inmunizados con Ad5. De manera importante, los únicos animales con anticuerpo neutralizante para el vector C68 fueron los inmunizados con vector C68; ninguno de los serotipos humanos probados, incluyendo el Ad4, generaron anticuerpos en ratones que neutralizaran el C68 in vitro.

Importante para la utilidad del vector C68 en pruebas humanas es la ausencia de anticuerpo neutralizante en la población humana. En nuestro estudio, un examen de 50 sujetos humanos normales falló en cuanto a detectar cualesquiera anticuerpos neutralizantes significativos (>1:10) utilizando el mismo ensayo que mostró anticuerpos neutralizantes en >50% de chimpancés. Además, los sueros de ratones inmunizados con múltiples serotipos de Ad humano incluyendo Ad4, no neutralizaron la infección con C68.

Ejemplo 6 – Análisis estructural de proteínas hexon

La ausencia de anticuerpos neutralizantes entre serotipos de C68 y humanos nos obligó a evaluar más cuidadosamente las diferencias estructurales en las regiones de hexon que se presumía que albergaban epítopes de tipo específico. Los estudios previos han sugerido que esos epítopes se localizan dentro de las 7 regiones hipervariables de hexon determinadas por Crawford-Miksza y Schnurr (J. Virol. 70: 1836-1844 (1996)). Una comparación de las secuencias de aminoácido de proteínas hexon entre C68 y adenovirus humano ha sido mostrada en la Figura 3. En efecto, el C68 es sustancialmente disimilar en regiones significativas de esas regiones hipervariables.

Ejemplo 7 – Construcción de cápside derivado de C68 que contiene un gen fibra humano

Para generar un vector derivado de C68 con un tropismo alterado, la construcción de gen fibra quimérico que contiene el botón de fibra de Ad5 fusionado en la cola y el eje de C68 está incorporada en un plásmido portador del genoma de C68. Para la sustitución precisa del gen fibra de C68 de tipo silvestre, se utiliza un plásmido portador de 5 la proteína fluorescente verde activada por un promotor de CMV para la modificación de fibra de C68. El vector de transferencia resultante contiene un casete de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) activada por un promotor de CMV insertado en la región E3, El gen quimérico de C68/fibra de Ad5, y E4. Este vector de transferencia fue utilizado para incorporación de casete de GFP y de gen fibra modificado en el espinazo de un plásmido infeccioso de C68 suprimido en E3, a través de una recombinación homóloga en E. coli. El genoma viral

10 fue extraído del plásmido mediante digestión de PacI y utilizado para transfectar células 293. El virus derivado de C68 quimérico se produjo alrededor de 3 semanas después de la transfección utilizando técnicas descritas en la presente memoria. Técnicas similares pueden ser fácilmente utilizadas para construir otros cápsides derivados de C68.

LISTADO DE SECUENCIA

<110> Los fiduciarios de la Universidad de Pennsylvania

Gao, Guangping 5 Wilson, James M.

<120> Método para Examen Rápido de Transformantes Bacterianos y Nuevas Proteínas de Adenovirus de Simio

10 <130> UPN-N2630PCT

<150> US 60/300.501

<151>

15 <150> US 60/385.632

<151>

<160> 41

20 <170> Patentin versión 3.1

<210> 1

<211> 101

<212> PRT 25 <213> proteína de adenovirus C68 de chimpancé

<400> 1

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un adenovirus recombinante que comprende un cápside de adenovirus, caracterizado porque el cápside comprende una proteína hexon compuesta por uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16, fusionada en un péptido hexon de adenovirus heterólogo,

   encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo, en el que la molécula comprende una secuencia de repetición de terminal invertido 5’ (ITRs) de adenovirus, un minigén, y una ITR 3’ de adenovirus, en el que dicho uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 se selecciona en el grupo consistente en:

   (a)

   aminoácidos 131 a 441 de SEQ ID núm. 16;

   (b)

   aminoácidos 138 a 163 de SEQ ID núm. 16;

   (c)

   aminoácidos 169 a 176 de SEQ ID núm. 16;

   (d)

   aminoácidos 195 a 203 de SEQ ID núm. 16;

   (e)

   aminoácidos 233 a 246 de SEQ ID núm. 16;

   (f)

   aminoácidos 253 a 264 de SEQ ID núm. 16;

   (g)

   aminoácidos 287 a 297 de SEQ ID núm. 16, y

   (h)

   aminoácidos 404 a 430 de SEQ ID núm. 16.

2. 2.- El virus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cápside comprende además una proteína fibra, una proteína penton, o ambas proteína fibra y proteína penton procedentes de un adenovirus distinto del C68.
3. 3.- El virus recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el fragmento de las proteínas hexon de C68 es una región de bucle.
4. 4.- El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en el que al menos una región de bucle de la proteína hexon de C68 se ha sustituido por una región de bucle de un adenovirus heterólogo.
5. 5.- El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la penton y la fibra son procedentes de un adenovirus humano.
6. 6.- El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera e las reivindicaciones 2 a 4, en el que la penton procede del C68 y la fibra procede de un adenovirus diferente.
7. 7.- El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la penton está caracterizada por la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 12.
8. 8.- El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la fibra procede de C68 y la penton procede de un adenovirus diferente.
9. 9.- El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína fibra está caracterizada por la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 27.
10. 10.- El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las ITRs de adenovirus son procedentes de un serotipo heterólogo respecto a C68.
11. 11.- El adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el adenovirus está funcionalmente suprimido en el gen EIa de adenovirus y en el gen EIb de adenovirus.
12. 12.- El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el uno o más fragmentos de la proteína hexon de C68 SEQ ID núm. 16 está fusionado en un péptido de hexon heterólogo por medio de un enlazador.
13. 13.- Una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable y un virus recombinante que comprende un cápside adenoviral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, encapsidando dicho cápside una molécula para su suministro a una célula objetivo.
14. 14.- Un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la preparación de un medicamento.
15. 15.- Un adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el suministro de una molécula a una célula objetivo.
16. 16.- Un adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 15 en el que la molécula codifica un inmunógeno.
17. 17.- Un adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la molécula codifica una molécula terapéutica.