JP2013533847A

JP2013533847A - コレステロール関連障害のａａｖベースの治療

Info

Publication number: JP2013533847A
Application number: JP2013506335A
Authority: JP
Inventors: ガオ，グアンピン; シエ，ジュン; ツァモレ，フィリップ，ディー．
Original assignee: ユニバーシティオブマサチューセッツ
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2013-08-29
Also published as: US10731158B2; CA2833912C; US10202600B2; US20130101558A1; US20190185853A1; CA2833912A1; US9272053B2; EP2561075A2; EP2561075B1; EP3444346B1; EP3444346A1; WO2011133901A3; US11421230B2; WO2011133901A2; US20160208257A1; US20200392500A1; EP2561075A4

Abstract

本発明は、いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法および組成物に関する。本発明のその他の態様では、コレステロール関連障害を治療する方法および組成物が提供される。本発明の一態様では、ｍｉＲ−１２２に対するｍｉＲＮＡ阻害剤と、同阻害剤を含んでなるｒＡＡＶベース組成物とが提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年４月２３日に出願された「AAV-based treatment of cholesterol-related disorders」と題する米国仮特許出願第６１／３２７，３８３号の優先権を米国特許法第１１９条の下で主張する。

政府支援
本研究は、国立衛生研究所からの補助金Ｐ０１ＨＬ５９４０７−１１、２Ｒ３７ＧＭ６２８６２、２Ｒ０１ＧＭ６５２３６によって、少なくとも部分的に支援された。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。

本発明は、いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法および組成物に関する。本発明のその他の態様では、コレステロール関連障害を治療する方法および組成物が提供される。

異脂肪血症はコレステロール代謝欠陥に付随し、米国における最も一般的な死因である心血管疾患の主要危険因子に相当する。遺伝性異脂肪血症の一般的な遺伝型は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の代謝欠陥［家族性高コレステロール血症（ＦＨ）］である。ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、疾患の発症と進行において重要な小型調節ＲＮＡである。特定のｍｉｃｒｏＲＮＡは、コレステロール代謝に関与するものと理解される。肝臓中の高度に豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ＬＤＬＲｍＲＮＡを直接標的とせず、未知の機序によってコレステロール代謝を調節する。ロックド核酸ベースのオリゴヌクレオチド阻害剤ｍｉＲ−１２２は、用量依存様式で、総血漿コレステロールレベルを低下させることが示されている（例えばElmen J,et al.Nature,2008,452:896-900を参照されたい）。しかし、このようなオリゴヌクレオチドベースの阻害剤は、治療薬として非実用的な用量を必要とする。さらにオリゴヌクレオチドは有限量で投与されるため、ＦＨのような多数のコレステロール関連障害に必要とされる長期阻害効果を維持するためには、反復投与が必要である。

ｍｉＲＮＡとコレステロールの結びつき、そしてｍｉＲＮＡ機能を調節することによりコレステロール関連障害を治療する有効治療薬の可能性にもかかわらず、コレステロール関連障害の治療におけるｍｉＲＮＡ阻害の有効かつ安全なアプローチの開発は、顕著な科学的および治療上の難題であり続ける（例えばCzech,MP.N Engl.J.Med.354;11 pg.1144-1145(2006)を参照されたい）。

本発明の態様は、ｍｉＲＮＡ阻害剤機能のアセスメントおよび特性解析を可能にし、それによって例えばコレステロール関連障害などの疾患の治療および研究に役立つｍｉＲＮＡ阻害剤の発見を促進する、分子検出システムに基づく。本発明のいくつかの態様に従って、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、本明細書で、コレステロール関連障害の治療に役立つものと同定される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベースのｍｉＲＮＡ阻害剤組成物を使用して、対象中で持続性の組織特異的ｍｉＲＮＡ阻害をもたらす。いくつかの態様では、本発明のｒＡＡＶは、対象中でｍｉＲ−１２２の機能、プロセッシングおよび／または発現を阻害する、ｍｉＲＮＡ阻害剤を発現する少なくとも１つの導入遺伝子を持つ。本発明の例示的なｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号１に記載の配列を有する。

本発明のいくつかの態様に従って、対象中で高コレステロール関連障害を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象中でｍｉＲ−１２２の発現を阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤を発現する、少なくとも１つの導入遺伝子を持つ有効量のｒＡＡＶを対象に投与することを伴う。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２結合部位は、２つのステム配列で挟まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２２結合部位は、ｍｉＲ−１２２と相補的な２つの部分で挟まれる、ｍｉＲ−１２２と相補的でない非結合中央部分を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は第１のｍｉＲ−１２２結合部位および第２のｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなり、各結合部位は２つのステム配列で挟まれ、第１のステム配列はその５’末端で第１のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置し、第２のステム配列はその３’末端で第１のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に、そしてその５’末端で第２のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置し、第３のステム配列はその３’末端で第２のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置する。いくつかの実施形態では、２つのｍｉＲ−１２２阻害剤結合部位のそれぞれは、ｍｉＲ−１２２と相補的でない非結合中央部分を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分と１〜５ヌクレオチドで相補的である。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分と３ヌクレオチドで相補的である。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、４ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のｍｉＲ−１２２結合部位の非結合中央部分は、４ヌクレオチドの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合および第２のｍｉＲ−１２２結合部位は、２〜１０ヌクレオチド長さの配列で相補的である。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲ−１２２結合および第２のｍｉＲ−１２２結合部位は、４ヌクレオチド長さの配列で相補的である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は２つ以上のｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなる。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は配列番号１に記載の配列を有する。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号３に記載の配列を有するＡＡＶ９血清型カプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型カプシドの変種であるカプシドを有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４に記載の配列を有するＡＡＶ９血清型変種Ｃｓｐ−３カプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは肝臓組織を標的とする。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは肝細胞を形質導入する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、１ｋｇあたり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４個のゲノムコピーである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、対象あたり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個のゲノムコピーである。

いくつかの実施形態では、投与は静脈内で実施される。いくつかの実施形態では、投与は肝臓門脈への注入によって実施される。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール関連障害の動物モデルである。いくつかの実施形態では、高コレステロール関連障害は、Ｉ型、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高リポタンパク血症である。いくつかの実施形態では、高コレステロール関連障害は、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患（ネフローゼ症候群）、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動量に付随する。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、高コレステロール関連障害は、２００ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、対象はマウスであり、高コレステロール関連障害は、１００ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、対象はラットであり、高コレステロール関連障害は、７０ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる。

本発明のいくつかの態様に従って、ｍｉＲＮＡ阻害剤の機能を評価するために、核酸ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、（ａ）（ｉ．）タンパク質コーディング領域、および（ｉｉ．）試験ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの結合部位を含んでなる、導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターと、（ｂ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターとを含んでなり、ｍｉＲＮＡ阻害剤は試験ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、第１のプロモーターとタンパク質コーディング領域の少なくとも一部の間の第１の非翻訳領域をさらに含んでなり、第２のプロモーターおよびｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域は、第１の非翻訳領域内に配置される。いくつかの実施形態では、第１の非翻訳領域は、完全長タンパク質コーディング領域の５’末端に配置される。いくつかの実施形態では、第１の非翻訳領域は、タンパク質コーディング領域のイントロン内に配置される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、第２の非翻訳領域をさらに含んでなり、試験ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの結合部位は第２の非翻訳領域内にある。いくつかの実施形態では、第２の非翻訳領域は、完全長タンパク質コーディング領域の３’末端に配置される。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、第１のプロモーターおよび導入遺伝子の側面に位置する、１対の逆方向末端反復をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、１対の逆方向末端反復は、第２のプロモーターおよびｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域の側面にさらに位置する。いくつかの実施形態では、タンパク質コーディング領域は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、およびβ−ラクタマーゼから選択されるレポータータンパク質をコードする。

本発明のいくつかの態様では、分子検出システムが提供される。いくつかの実施形態では、分子検出システムは、ｍｉＲＮＡ阻害剤の機能を評価するための核酸ベクターを含んでなる。いくつかの実施形態では、分子検出システムの核酸ベクターは、試験ｍｉＲＮＡによって調節される導入遺伝子と作動的に連結するプロモーター、およびｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターを含んでなる。

本発明のいくつかの態様に従って、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれかで、細胞を形質移入するステップと、（ｂ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するステップを含んでなり、タンパク質の発現レベルはｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を試験ｍｉＲＮＡに接触させるステップをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞は試験ｍｉＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか１つで、第１の細胞を形質移入するステップと、（ｂ）核酸ベクターで第２の細胞を形質移入するステップと、（ｃ）第１の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルと、第２の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを比較するステップを含んでなり、試験ｍｉＲＮＡのレベルは第１の細胞と比較して第２の細胞中でより低く、（ｃ）の比較結果はｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか１つで、細胞を形質移入するステップと、（ｂ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第１の発現レベルを測定するステップと、（ｃ）細胞を試験ｍｉＲＮＡに接触させるステップと、（ｄ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第２の発現レベルを測定するステップと、（ｅ）タンパク質の第１の発現レベルと第２の発現レベルを比較するステップを含んでなり、（ｅ）の比較結果はｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか１つで、細胞を形質移入するステップと、（ｂ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第１の発現レベルを測定するステップと、（ｃ）タンパク質の第１の発現レベルと対照の発現レベルを比較するステップを含んでなり、（ｃ）の比較結果はｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。

いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡ阻害剤の機能を評価するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、前述の核酸ベクターのいずれかを収容する容器を含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、分子検出システムの構成要素を収容する容器を含んでなる。

本発明の限界のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、要素のいずれかまたはその組み合わせを含む本発明の限界のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ることが予期される。本発明は、その応用において、以下の説明に記載され、または図面に示される、構築の詳細および構成要素の配置に限定されるものではない。本発明は、その他の実施形態が可能であり、様々なやり方で実行され、または実施され得る。

ｍｉＲＮＡ阻害剤機能を評価するための分子検出システムを描写する。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現されたＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤が、その他の推定上のｍｉＲＮＡ阻害剤と比較して、２９３細胞中のレポーター遺伝子発現を抑制解除するのに高度に効果的であることを示す、分子検出システムアッセイからの結果を描写する。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現されたＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤が、その他の推定上のｍｉＲＮＡ阻害剤と比較して、単一ｍｉＲ１２２を有する核酸ベクターからのＨｕｈ−７細胞中のレポーター遺伝子の発現を完全に復元し、３つのｍｉＲ１２２結合部位を有する核酸ベクターからのＨｕｈ−７細胞中のレポーター遺伝子発現を実質的に抑制解除したことを示す、分子検出システムアッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させたマウス肝臓中で、成熟遊離ｍｉＲ−１２２を効果的にノックダウンすることを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤（配列番号１）の配列と構造的特徴を描写する。は、ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤（配列番号１）の予測された二次構造を描写する。構造は、ＭＦＯＬＤ（mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=mfold）を使用して予測された。ＴｕＤｌｅｔ−７阻害剤（配列番号２）の配列と構造的特徴を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させ、通常固形飼料を与えたマウス中で、総血清コレステロールレベルを１０週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させ、通常固形飼料を与えたマウス中で、血清ＨＤＬレベルを１０週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させ、通常固形飼料を与えたマウス中で、血清ＬＤＬレベルを２週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させたＬＤＬＲ^−／−Ａｐｏｂｅｃ１^−／−マウス（家族性高コレステロール血症モデル）中で、総血清コレステロールレベルを１０週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させたＬＤＬＲ^−／−Ａｐｏｂｅｃ１^−／−マウス中で、血清ＨＤＬレベルを２週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤を発現するｒＡＡＶベクターが、ベクター含有ｒＡＡＶ９を感染させたＬＤＬＲ^−／−Ａｐｏｂｅｃ１^−／−マウス中で、血清ＬＤＬレベルを２週目まで効果的に低下させたことを示す、生体内アッセイからの結果を描写する。ＴｏｕｇｈＤｅｃｏｙｍｉＲ−１２２（ＴｕＤ）ＲＮＡ（配列番号５）の構造である。ＴｕＤＲＮＡは、安定性を高めて核外移行を促進することが意図される二本鎖ステムで挟まれた、２つの一本鎖ｍｉＲＮＡ結合部位を含有する。培養細胞中におけるｍｉＲ−１２２阻害剤ストラテジーの比較である。（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コンストラクト。（ｂ）拮抗薬とｍｉＲ−１２２の対形成。３つの全パネルの上側の配列：ｍｉＲ１２２断片（配列番号６）。スポンジ：配列番号７。ＴｕＤ：配列番号８。ＺＩＰ：配列番号９。（ｃ）ｐＴＢＧＦｌｕｃと、対照プラスミド、抗ｍｉＲ−１２２ｓｐｏｎｇｅプラスミドまたはＵ６駆動抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤプラスミドのいずれかと共に、ｍｉＲ−１２２に相補的な１つまたは３つの部位があるｎＬａｃＺレポーター遺伝子を持つプラスミドを同時形質移入した。形質移入の４８時間後に細胞をＬａｃＺ発現について染色し、青色細胞を数えた。データをｍｉＲ−１２２結合部位を欠く対照レポータープラスミドと比較して報告する。（ｄ）Ｕ６駆動ｓｐｏｎｇｅまたはｍｉＲＺｉｐまたはＴｕＤ発現プラスミドと共に、３ｍｉＲ−１２２結合部位を含有するｎＬａｃＺｍＲＮＡを発現するレポータープラスミドをＨｕＨ−７細胞に同時形質移入した。空のプラスミドが、対照の役割を果たした。（ｅ）Ｕ６プロモーターから転写された抗ｌｅｔ−７または抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ、またはＶ４０プロモーターから転写された抗ｍｉＲ１２２ｓｐｏｎｇｅまたは抗ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅを発現するコンストラクト、ならびにｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ＲＮＡを生成する異なる量のプラスミドと共に、３つの完全に相補的なｍｉＲ−１２２結合部位を含有するｎＬａｃＺレポータープラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞を形質移入した。４８時間後に、細胞、対照（ｍｉＲ−１２２結合部位なしのｎＬａｃＺ）と比較したｎＬａｃＺ陽性細胞の百分率を求めた（ｃ、ｄ、およびｅ）。（ｆ）対照ルシフェラーゼ、７つのｍｉＲ−１２２結合部位を有する、または７つの変異部位を有するルシフェラーゼを発現するレポータープラスミド、ならびに対照プラスミドまたは抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７またはスクランブルＴｕＤＲＮＡを発現するプラスミドで、ＨｕＨ−７細胞を形質移入した。２４時間後、粗製細胞溶解産物を調製してルシフェラーゼ活性を試験した。データをウミシイタケルシフェラーゼ活性について正規化した、ホタルルシフェラーゼ活性の平均±標準偏差として提示する。ＨｅＬａ細胞中のｌｅｔ−７拮抗薬コンストラクトの評価である。（ａ，ｂ）抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ、抗ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅまたは対照プラスミドのいずれかを発現するコンストラクトで形質移入されたＨｅＬａ細胞から、全ＲＮＡおよびタンパク質を調製した。（ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによってＤｉｃｅｒｍＲＮＡの相対レベルを、（ｂ）ウエスタンブロット法によってＤｉｃｅｒタンパク質の相対レベルを測定した。図は、平均±標準偏差を報告する。抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ、抗ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅまたはプラスミド対照のいずれかを発現するコンストラクトで形質移入された、ＨｅＬａ細胞のウエスタンブロット分析である。３つの生物学的複製を示す；図２ｃはこれらのデータの定量化を報告する。ｍｉＲＮＡセンサーシステムを使用した、内在性ｍｉＲＮＡ活性のリアルタイムモニタリングである。（ａ）ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）発現ベクターの略図。ＣＢ、ＣＭＶエンハンサーがあるニワトリβアクチンプロモーター。ＡＡＶベクタープラスミドを（ｂ）ＨｕＨ−７または（ｃ）ＨｅＬａ細胞に形質移入した。４８時間後、Ｇｌｕｃ活性を測定した。（ｄ、ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、動物あたり１×１０^１２個のゲノムコピーのｓｃＡＡＶ９を尾静脈注射によって投与した。表示の時点で血液を採取し、Ｇｌｕｃ活性についてアッセイした。Ｇｌｕｃ発現は、Ｇｌｕｃを発現するが、ＴｕＤ発現カセットと３’ＵＴＲｍｉＲＮＡ結合部位の双方を欠くｓｃＡＡＶ９ベクターを注射されたマウスからのサンプルと比較した、平均±標準偏差として報告される。各群は、４匹のマウスからなる。抗ｍｉＲＮＡＴｕＤを発現するｓｃＡＡＶ９を投与したマウスからの肝臓中のｍｉＲＮＡ発現の分析である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照、抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ発現ベクターの１×１０^１２個のゲノムコピーを尾静脈を通じて注射した。動物を４週間後に殺処分して、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２、およびＵ６の（ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲ分析および（ｂ）ノーザンブロット分析のために、全肝臓ＲＮＡを調製した。データは、平均±標準偏差として提示される。Ｕ６ＲＮＡは、投与量対照を提供した。（ｃ、ｄ）ｓｃＡＡＶ注射の４週間後に、全肝臓小型ＲＮＡのハイスループット配列決定を使用して、（ｃ）ゲノムマッチングｍｉＲ−１２２、または（ｄ）接頭辞マッチングｍｉＲ−１２２の長さ分布および存在量を判定した。ｍｉＲ−１２２断片の３’末端に付加された、最も豊富な非ゲノムマッチングヌクレオチドを灰色の箱型図で示す。（ｅ）８個のｌｅｔ−７アイソフォームがマウス肝臓で発現される。ｌｅｔ−７アイソフォーム間のヌクレオチドの違いは黒で示され、それらの抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡとの対合形成が示される。ｍｉＲＮＡ誘導標的ＲＮＡ認識の重要な特徴である「シード」配列には、下線を引いた。Ｌｅｔ−７ａ：配列番号１０、Ｌｅｔ−７ｂ：配列番号１１、Ｌｅｔ−７ｃ：配列番号１２、Ｌｅｔ−７ｄ：配列番号１３、Ｌｅｔ−７ｅ：配列番号１４、Ｌｅｔ−７ｆ：配列番号１５、Ｌｅｔ−７ｇ：配列番号１６、Ｌｅｔ−７ｉ：配列番号１７、ＴｕＤ：配列番号１８。（ｆ）抗ｌｅｔ−７ＴｕＤは、対照と比較して、完全長ｌｅｔ−７の存在量を低下させ、接頭辞マッチングｌｅｔ−７配列読み取りの数を増大させた。ゲノムマッチング読み取りを４倍以上低下させ、接頭辞マッチングを増大させたアイソフォームを黒で示す。ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃ（モック）、ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｍｉＲ−１２２（抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ）、またはｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｌｅｔ−７（抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ）の１×１０^１２個のゲノムコピーを尾静脈注射によって注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓からの全ＲＮＡ中のｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２、およびＵ６小型核小体ＲＮＡ（Ｕ６ｓｎｏＲＮＡ）のノーザンブロット分析である。注射の４週間後に動物を殺処分して、全肝臓ＲＮＡを調製した。３つの生物学的複製が示され、分析して図４ｂを作成した。ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃ（モック）、ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｌｅｔ−７（抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ）の注射４週間後のマウスの肝臓中のゲノムマッチングまたは接頭辞マッチングｌｅｔ−７アイソフォーム配列読み取りの長さ分布および存在量である。ｍｉＲ−１２２接頭辞の３’末端に付加された、最も豊富な非鋳型ヌクレオチドを灰色の箱型図で示す。Ｌｅｔ−７ａ：配列番号１０、Ｌｅｔ−７ｂ：配列番号１１、Ｌｅｔ−７ｃ：配列番号１２、Ｌｅｔ−７ｄ：配列番号１３、Ｌｅｔ−７ｅ：配列番号１４、Ｌｅｔ−７ｆ：配列番号１５、Ｌｅｔ−７ｇ：配列番号１６、Ｌｅｔ−７ｉ：配列番号１７、ＴｕＤ：配列番号１８。ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃ（モック）、ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｌｅｔ−７（抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ）またはｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｍｉＲ−１２２（抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ）の注射４週間後のマウスの肝臓中のｍｉＲＮＡの存在量である。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍＶ５．０ｂ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、ピアソン相関分析を実施した。相関係数（ｒ）およびｐ値を示す。ＴｕＤの標的とされるｍｉＲＮＡは、赤色である。ＴｕＤ処理マウス中における、ｍｉＲ−１２２およびｌｅｔ−７の天然標的発現。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、対照、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤまたは抗ｌｅｔ−７ＴｕＤｓｃＡＡＶ９ベクターの１×１０^１２個のゲノムコピーを尾静脈注射投与によって投与した。動物を４週間後に殺処分し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、全肝臓（左パネル）または心臓（右パネル）ＲＮＡを代表的な内在性標的ｍｉＲ−１２２（アルドラーゼＡ、サイクリンＧ１、Ｔｍｅｄ３、Ｈｆｅ２、およびＣａｔ−１ｍＲＮＡ）、およびｌｅｔ−７（Ｋｒａｓ、Ｈｒａｓ、Ｎｒａｓ、およびＤｉｃｅｒｍＲＮＡ）について分析した。データは、対照ｓｃＡＡＶベクター処理マウス中の発現の平均百分率（±標準偏差）として提示する。対照マウスと比較した、ｍｉＲ−１２２拮抗薬処理後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６および高コレステロール血症マウス（ＬＤＬＲ^−／−、Ａｐｏｂｅｃ１^−／−）のコレステロールプロフィールの変化である。（ａ）４〜６週齢のオス野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１匹あたり１×１０^１２個のゲノムコピーのｓｃＡＡＶ９を静脈内注射した。処理したＣ５７Ｂ／６中の総コレステロール、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）、および低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の血清レベルを注射後の異なる時点で測定した。（ｂ）血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＬ）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を分析して肝臓毒性を評価した。（ｃ）成体オス（スクランブルではｎ＝５、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤではｎ＝６）およびメス（スクランブルではｎ＝９、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤではｎ＝８）ＬＤＬＲ^−／−、Ａｐｏｂｅｃ１^−／−マウスに、３×１０^１１個のゲノムコピーの抗ｍｉＲ−１２２発現ｓｃＡＡＶ９を尾静脈注射によって投与した。対照と比較した、総コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬの変化を１ヶ月後に測定した。図は、平均±標準偏差を報告する。研究動物の体重である。ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃ（モック）、ｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｍｉＲ−１２２（抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ）またはｓｃＡＡＶ９ＣＢＧｌｕｃＴｕＤｌｅｔ−７（抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ）の１×１０^１２個のゲノムコピーで、尾静脈注射によって処理したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを１０、１２、１４、１６、および１８週間後に秤量した。データは、平均±標準偏差である。

本発明の態様は、コレステロール関連障害の治療と研究に役立つ、ｍｉＲＮＡ阻害剤の発見に基づく。本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡ阻害剤をコードする核酸は、対象への遺伝子移入のための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）内にパッケージされる。本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤遺伝子を含んでなる組換えＡＡＶは、治療目的ならびに研究者目的で有用である。本発明のいくつかの態様に従って、対象中でコレステロール関連障害を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、対象に有効量のｒＡＡＶを投与するステップを伴う。ｒＡＡＶは、対象中でｍｉＲ−１２２の発現を阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤を発現する、少なくとも１つの導入遺伝子を収容してもよい。例示的なｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号１に記載の配列を有する。

コレステロール関連障害
本明細書の用法では、「コレステロール関連障害」とは、対象中で、コレステロールレベルの病理学的変化（例えば病的に低いまたは病的に高い）をもたらす病状または疾患である。対象は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類であってもよい。対象は、例えばコレステロール関連障害を有する対象などのヒトであってもよい。いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール関連障害の動物モデルである。コレステロール関連障害は、総血清コレステロール、血清ＨＤＬコレステロール、または血清ＬＤＬコレステロールのレベル変化に付随することもある。コレステロール関連障害はまた、血清ＬＤＬとＨＤＬの比率（例えばＬＤＬ／ＨＤＬ比）の変化に付随することもある。異なる種の正常コレステロール範囲を下の表１に提供する。表１から明らかなように、正常な範囲は種に依存する。異常な高レベルのコレステロールに付随するコレステロール関連障害は、本明細書で「高コレステロール関連障害」と称される。ヒト対象では、高コレステロール関連障害は、２００ｍｇ／ｄｌを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。マウス対象では、高コレステロール関連障害は、１００ｍｇ／ｄｌを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。ラット対象では、高コレステロール関連障害は、７０ｍｇ／ｄｌを上回る総血清コレステロールレベルによって特徴付けられてもよい。その他の異常なコレステロールレベルは、当業者には明らかである。

本発明の態様に従って治療されてもよいコレステロール関連障害の例としては、Ｉ型、ＩＩ（ａおよびｂ）型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型高リポタンパク血症が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の態様に従って治療されてもよいさらなる障害としては、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患（ネフローゼ症候群）、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動に付随する、コレステロール関連障害が挙げられる。その他のコレステロール関連障害は、当業者には明らかである。

本発明の態様に従って治療されてもよい特定のコレステロール関連障害は、遺伝的原因の（例えば遺伝的で体細胞突然変異に起因する）障害である。例えば家族性高コレステロール血症（ＦＨ）（ＩＩ型高リポタンパク血症）は、血液中の高コレステロールレベル、具体的には非常に高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルと早発性心血管疾患によって特徴付けられる、遺伝的原因のコレステロール関連障害である。ＦＨがある多数の対象は、常態ではＬＤＬを循環から除去する、ＬＤＬ受容体タンパク質をコードするＬＤＬＲ遺伝子に、または受容体に結合するＬＤＬの一部であるアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）に突然変異を有する；その他遺伝子の突然変異は稀である。ＬＤＬＲ遺伝子の１個の異常なコピー（異種接合体）を有する対象は、３０〜４０才で早発性心血管疾患を有することもある。

ｍｉＲＮＡ阻害剤
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、広範な細胞プロセスを調節する役割を果たすようであり、ｍｉＲＮＡ発現の変化はヒト疾患と関係があるとされている。マイクロＲＮＡは、特定のコレステロール関連障害の発症と進行に関与するものと理解される。肝臓中の最も豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、未知の機序によってコレステロール代謝を調節し、直接ＬＤＬＲｍＲＮＡを標的としない。ｍｉＲ−１２２は、高コレステロール関連障害の潜在的治療標的に相当するが、治療的に有効なｍｉＲ−１２２の阻害剤の可能性は、ほとんど実現されていない。

本明細書の用法では、「ｍｉＲＮＡ阻害剤」という用語は、ｍｉＲＮＡ発現、プロセッシングおよび／または機能をブロックする作用物質を指す。多様なｍｉＲＮＡ阻害剤が、当該技術分野で開示されている。ｍｉＲＮＡ阻害剤の非限定的例としては、ｍｉＲＮＡとＤｒｏｓｈａ複合体との反応を阻害する、マイクロＲＮＡ特異的アンチセンス、マイクロＲＮＡｓｐｏｎｇｅ、ｔｏｕｇｈｄｅｃｏｙＲＮＡ（ＴｕＤＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短鎖オリゴヌクレオチド）が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＴｕＤＲＮＡに関する内容を参照によって本明細書に援用する、Ebert,M.S.Nature Methods,Epub August,12,2007；Takeshi Haraguchi,et al.,Nucleic AcidsResearch,2009,Vol.37,No.6e43を参照されたい）。

ｍｉＲＮＡ阻害剤のための分子検出システム
分子検出システムをデザインして、異なるｍｉＲＮＡ阻害剤デザインの阻害機能を定量的に評価し、当該技術分野のｍｉＲＮＡ阻害剤と比較して優れた特性を有するｍｉＲＮＡ阻害剤発見をできるようにした（分子検出システムの模式図については図１を参照されたい）。様々なｍｉＲＮＡ阻害剤を開発し、このシステムを使用して試験した（例えば例１を参照されたい）。本発明のいくつかの態様に従って、血清コレステロールレベルを効果的に低下させるｍｉＲＮＡ阻害剤ｍｉＲ−１２２を同定する。

本発明の分子検出システムは、レポーター遺伝子（例えばＥＧＦＰ、ルシフェラーゼなどのタンパク質コーディング遺伝子）のＲＮＡ転写物を発現するための構成要素を典型的に含み、レポーター遺伝子の発現は、ＲＮＡ転写物に結合するｍｉＲＮＡに対して感受性である。典型的に、ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物である。したがってレポーター遺伝子活性は、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物によってコードされるタンパク質のレベルを検出することで、評価されることが多い。しかし、レポーター遺伝子のＲＮＡ転写物それ自体が、導入遺伝子活性のレポーターの役割を果たしてもよい。例えばＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲなどの多様な標準ＲＮＡ検出ストラテジーのいずれかを使用して検出されてもよく、したがって導入遺伝子活性のレポーターの役割を果たしてもよい。典型的に、導入遺伝子のＲＮＡ転写物は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を有する。したがって細胞中で発現される場合、分子検出システムのＲＮＡ転写物は、ｍｉＲＮＡ結合部位でそれらに結合する細胞のｍｉＲＮＡ分子の存在に対して典型的に感受性である。ｍｉＲＮＡ結合部位は、典型的に転写物の３’末端にある。しかし、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡが機能性ｍｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング経路を有する細胞中の部位に結合する場合、またはｍｉＲＮＡ活性を再現する生体外システムでは、転写物の発現が阻害されるという条件で、導入遺伝子のコーディング領域内またはあらゆる非翻訳領域内にあってもよい。分子検出システムは、典型的に、試験ｍｉＲＮＡ阻害剤を発現するための構成要素もまた含んでなる。ｍｉＲＮＡ結合部位があるｍＲＮＡ転写物がｍｉＲＮＡ存在下で発現される場合、ｍｉＲＮＡは結合部位とハイブリダイズして、ｍＲＮＡによってコードされるレポータータンパク質の発現を阻害する。しかし、ｍｉＲＮＡの機能をブロックするｍｉＲＮＡ阻害剤が発現される場合、レポータータンパク質の発現は阻害されない（または発現阻害が弱まる）。したがって本発明の分子検出システムによって、レポーター遺伝子の発現レベルに基づいて、効果的な阻害特性があるｍｉＲＮＡ阻害剤の効率的なスクリーニングと同定ができるようになる。

分子検出システムは、ｍｉＲＮＡによって調節される導入遺伝子と作動的に連結するプロモーター、およびｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターを含んでなる、核酸ベクターを含むことが多い。核酸ベクターの導入遺伝子は、典型的に、少なくともタンパク質コーディング領域（例えばレポータータンパク質コーディング領域）、および少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。タンパク質コーディング領域は、例えば蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ｄｓＲｅｄなど）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、およびβ−ラクタマーゼなどのレポータータンパク質をコードしてもよい。導入遺伝子のプロモーターおよびｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域のプロモーターは、同じプロモーターであってもまたは異なるプロモーターであってもよい。導入遺伝子のプロモーターは、典型的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。ｍｉＲＮＡ阻害剤のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６プロモーター）であってもよい。

当業者は、導入遺伝子が、例えば細胞内または生体外転写／翻訳系内などの適切な発現系内で発現できるという条件で、導入遺伝子と作動的に連結するプロモーターが、核酸ベクター内のどこに配置されてもよいことを理解するであろう。同様に、当業者は、ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域が、例えば細胞内または生体外転写／翻訳系内などの適切な発現系内で発現できるという条件で、ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターが、核酸ベクター内のどこに配置されてもよいことを理解するであろう。例えばｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターは、導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターの上流に配置されてもよい（導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターに対して５’末端側）。ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターは、導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターの下流に配置されてもよい（導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターに対して３’末端側）。ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターは、第１のプロモーターと導入遺伝子コーディング領域との間（例えばイントロン内）に配置されてもよい。ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターは、導入遺伝子のあらゆるイントロン内に配置されてもよい。ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターは、導入遺伝子コーディング領域上流（例えば５’−ＵＴＲ）、または導入遺伝子コーディング領域下流（例えば３’−ＵＴＲ）の非翻訳領域内に配置されてもよい。

分子検出システムは、例えば試験ｍｉＲＮＡによって調節される導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターと、ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターとを含んでなる、核酸ベクターを含んでもよい。核酸ベクターは、組換えウイルスゲノムであってもよい。例えば核酸ベクターは、組換えＡＡＶベクターであってもよい。したがって核酸ベクターは、導入遺伝子と作動的に連結するプロモーターの側面に位置する、１対の逆方向末端反復をさらに含んでもよい。１対の逆方向末端反復は、ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結するプロモーターの側面にさらに位置してもよい。

本発明の分子検出システムを使用して、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法が提供される。方法は、典型的に、（ａ）タンパク質コーディング領域と少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位とを含んでなる導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーターと、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズするｍｉＲＮＡ阻害剤のコーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーターとを含んでなる核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、（ｂ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定するステップとを含む。タンパク質の発現レベルは、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。例えば核酸ベクターがｍｉＲＮＡを発現する細胞に形質移入された場合、ｍｉＲＮＡは、導入遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中のその同族結合部位に結合して、ｍＲＮＡの発現を阻害する。ｍｉＲＮＡ阻害剤が効果的であれば、それは例えばｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡの発現抑制を解除する（または弱める）ことで、ｍｉＲＮＡ活性をブロックする（または低下させる）。ｍＲＮＡの発現の変化は、典型的に、ｍＲＮＡによってコードされるレポータータンパク質のレベルを評価することによって、観察される。したがってレポータータンパク質レベルに基づいて、異なるｍｉＲＮＡ阻害剤を比較し得る。当業者には理解されるように、システムを様々なやり方で微調整して、所望レベルの有効性を有する阻害剤を同定し得る。例えば導入遺伝子ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位の質をデザインまたは選択し得る。例えば試験ｍｉＲＮＡに高親和性で結合する結合部位などの高品質結合部位をデザインまたは選択し得る。結合部位は、新規にデザインし、または既知の遺伝子のｍｉＲＮＡ結合部位から選択し得る（例えばサイクリンＧ上のｍｉＲ−１２２結合部位を選択してもよい）。導入遺伝子ｍＲＮＡ中のｍｉＲＮＡ結合部位の数もまた、変更し得る。例えば複数結合部位を使用し得て、または単一結合部位を使用し得る。ｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡの結合親和性および結合部位数などのパラメータを調節することで、ｍｉＲＮＡ阻害剤がそれによって選択されるストリンジェンシーを増大または低下させることが可能になる。例えば試験ｍｉＲＮＡに対して複数の高品質結合部位を有する導入遺伝子を使用して、高品質ｍｉＲＮＡ阻害剤を選択し得る。分子検出システムは、生外体発現系中または細胞中で使用してもよい。

ｍｉＲＮＡレベルは、ｍｉＲＮＡ阻害剤をそれによって選択するストリンジェンシーを増大または低下させるために調節し得るパラメータの別の例である。したがって方法は、細胞をｍｉＲＮＡに接触させるステップ、またはｍｉＲＮＡを生体外発現系に添加するステップをさらに含んでなってもよい。異なる用量のｍｉＲＮＡを使用して、複数の実験を例えば並行して実施して、ｍｉＲＮＡ阻害剤の用量依存性阻害特性を評価できるようにしてもよい。

多様な対照値または対照実験のいずれかを得て、または実施して、試験ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価してもよい。方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、分子検出システムの核酸ベクターで、第１の細胞を形質移入するステップと、（ｂ）核酸ベクターで形第２の細胞を質移入するステップと、（ｃ）第１の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルと、第２の細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の発現レベルを比較するステップを含んでなってもよく、試験ｍｉＲＮＡのレベルは第１の細胞と比較して第２の細胞中でより低く、（ｃ）の比較結果はｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。方法は、（ａ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域がｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、前述の核酸ベクターのいずれか１つで、細胞を形質移入するステップと、（ｂ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第１の発現レベルを測定するステップと、（ｃ）細胞を試験ｍｉＲＮＡに接触させるステップと、（ｄ）細胞中のタンパク質コーディング領域によってコードされるタンパク質の第２の発現レベルを測定するステップと、（ｅ）タンパク質の第１の発現レベルと第２の発現レベルを比較するステップを含んでなってもよく、（ｅ）の比較結果は、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す。

ｍｉＲＮＡ阻害剤の構造
本発明の態様は、ｍｉＲ−１２２を標的として、その機能をブロックするｍｉＲＮＡ阻害剤の発見に基づく。例えば本発明の分子検出システムを使用して、高品質ｍｉＲＮＡ阻害剤が発見された。

本発明の典型的なｍｉＲＮＡ阻害剤は、例えばｍｉＲ−１２２結合部位などの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなる核酸分子である。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、１つのｍｉＲＮＡ結合部位、２つのｍｉＲＮＡ結合部位、３つのｍｉＲＮＡ結合部位、４つのｍｉＲＮＡ結合部位、５つのｍｉＲＮＡ結合部位、６つのｍｉＲＮＡ結合部位、７つのｍｉＲＮＡ結合部位、８つのｍｉＲＮＡ結合部位、９つのｍｉＲＮＡ結合部位、１０のｍｉＲＮＡ結合部位、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなってもよい。

本明細書の用法では、ｍｉＲＮＡ阻害剤に関連した「ｍｉＲＮＡ結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡ中のヌクレオチド配列と十分に相補的でｍｉＲＮＡ阻害剤とｍｉＲＮＡ間に塩基対形成をもたらす、ｍｉＲＮＡ阻害剤中のヌクレオチド配列を指す。典型的に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ中のヌクレオチド配列と十分に相補的でｍｉＲＮＡ阻害剤との間に塩基対形成をもたらし、それによってｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへの結合を阻害する、ヌクレオチド配列を含んでなる。本明細書の用法では「相補的」または「相補性」という用語は、伝統的なワトソン・クリック塩基対形成またはその他の非伝統的塩基対形成のどちらかによって、核酸が別のＲＮＡ配列と水素結合を形成する能力を指す。本発明の核分子に関して、核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは、例えばｍｉＲＮＡ阻害などの核酸の該当機能が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当該技術分野で良く知られている（例えばTurner et al.,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123133；Frier et al.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:93739377；Turner et al.,1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783-3785を参照されたい）。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成し得る（例えばワトソン・クリック塩基対形成）、核酸分子中で隣接する残基の百分率を示す（例えば１０個の内５、６、７、８、９、１０個であれば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての隣接残基が、第２の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相補性を有する。

２つのｍｉＲＮＡ結合部位を有するｍｉＲＮＡ阻害剤では、第１のｍｉＲＮＡ結合部位と第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば長さ２〜１０ヌクレオチドの配列で相補的であってもよい。一例では、第１のｍｉＲＮＡ結合と第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、長さ４ヌクレオチドの配列で相補的である。ｍｉＲＮＡ阻害剤の各ｍｉＲＮＡ結合部位は、多様な長さのいずれであってもよい。例えばｍｉＲＮＡ阻害剤のｍｉＲＮＡ結合部位は、５ヌクレオチド〜３５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、または１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドであってもよい。典型的にｍｉＲＮＡ結合部位の長さは、それが結合するｍｉＲＮＡの長さおよび／または構造に左右される。

本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤のｍｉＲＮＡ結合部位は、１つまたは複数のステム配列が側面にあることが多い。本明細書の用法では、「ステム配列」という用語は、分子内塩基対形成をもたらす核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ステム配列は標的ｍｉＲＮＡと相補的でない。分子内塩基対形成は、一般に回文配列であるｍｉＲＮＡ阻害剤の２つのステム配列領域が、塩基対を形成して、不対ループに終わってもよい二重らせんを形成する場合に生じてもよい。したがって塩基対形成は、ステム配列内に、または２つのステム配列間に形成してもよい。ステム配列は、多様な長さであることができる。例えばステム配列は、３ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド、３ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、３ヌクレオチド〜５０、３ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、または５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲であってもよい。ステム配列は、５ヌクレオチドまで、１０ヌクレオチドまで、２０ヌクレオチドまで、５０ヌクレオチドまで、１００ヌクレオチドまで、２００ヌクレオチドまで、またはそれ以上であってもよい。リンカー配列もまた、ｍｉＲＮＡ阻害剤に含まれてもよい。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、第１のｍｉＲＮＡ結合部位および第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなってもよく、各結合部位は２つのステム配列で挟まれる。第１のステム配列はその５’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置してもよく、第２のステム配列はその３’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位に、そしてその５’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置してもよく、第３のステム配列はその３’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置してもよい。当業者は、結合部位および側面のステム配列のその他の立体配置を容易に予測するであろう。

本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤のｍｉＲＮＡ結合部位は、標的ｍｉＲＮＡと相補的な２つの部分で挟まれる、標的ｍｉＲＮＡ（例えばｍｉＲ−１２２）と相補的でない非結合中央部分を含んでなってもよい。標的ｍｉＲＮＡと相補的でない非結合中央部分は、ｍｉＲＮＡ結合部位内で完全に中央になくてもよい。例えば非結合中央部分は、異なる長さの標的ｍｉＲＮＡと相補的な部分が、どちらの側面にあってもよい。本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤は、標的ｍｉＲＮＡと相補的でない非結合中央部分を有する、複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなってもよい。ｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、多様な長さを有してもよい。例えばｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、１ヌクレオチド〜１０ヌクレオチド、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチドの範囲であってもよい。ｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有してもよい。一例では、ｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、４ヌクレオチドの長さを有する。非結合中央部分の長さは、典型的にｍｉＲＮＡ結合部位の長さに左右される。

阻害剤の第１のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、第２のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分と、少なくとも部分的に相補的であることが多い。したがって阻害剤の２つの結合部位は、互いに塩基対形成（ハイブリダイズ）する。阻害剤の第１のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、結合部位と非結合中央部分の長さ次第で、例えば２ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドで、阻害剤の第２のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分と相補的であってもよい。阻害剤の第１のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分は、典型的に結合部位と非結合中央部分の長さ次第で、例えば２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドで、第２のｍｉＲＮＡ結合部位の非結合中央部分と相補的であってもよい。

本発明のいくつかの態様は、複数のｍｉＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡを標的にすることで、個々のｍｉＲＮＡの阻害が、関連ｍｉＲＮＡによって代償される問題を回避する。いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡは、例えばｌｅｔ−７ファミリーなどのｍｉＲＮＡファミリーに属する。いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡは、少なくともいくつかの配列同一性を有する。例えばいくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ複数のｍｉＲＮＡの全てにわたり同一である、少なくとも１つの５ヌクレオチド以上のストレッチを含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡはそれぞれ、複数の標的ｍｉＲＮＡのヌクレオチドストレッチの共通配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である、少なくとも１つの５ヌクレオチド以上のストレッチを含んでなる。

「共通配列」という用語は、本明細書の用法では、特定位置で、複数ヌクレオチド配列により共有される、最も頻度の高いヌクレオチドを反映するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチド配列は、例えば同じｍｉＲＮＡファミリーメンバーの配列などの関連ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、共通配列は、２つ以上の配列を配列比較して、整合配列中の特定位置で、最も一般的に見られまたは最も豊富なヌクレオチドを判定することによって得られる。複数の配列から共通配列を得るための配列アラインメントの方法およびアルゴリズムは、当業者に良く知られており、本発明はこの点において限定されるものではない。

いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲＮＡを標的にするｍｉＲＮＡ阻害剤は、複数のｍｉＲＮＡの共通配列に相補的な少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなるＴｕＤである。いくつかの実施形態では、共通配列は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、第１のｍｉＲＮＡ結合部位および第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり、第１のステム配列はその５’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第２のステム配列はその３’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に、そしてその５’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第３のステム配列はその３’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、ｍｉＲＮＡ結合部位の少なくとも１つは、複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、第１および第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、少なくとも７−％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ結合部位が相補的な共通配列は、第２のｍｉＲＮＡ結合部位が相補的な共通配列に直接隣接する。

いくつかの実施形態では、複数のｌｅｔ−７ファミリーメンバーｍｉＲＮＡを標的とする、ｍｉＲＮＡ阻害剤が提供される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または２６個の、配列番号１８の隣接ヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４のヌクレオチド配列を含んでなり、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞をｍｉＲＮＡ阻害剤に接触させるステップを含んでなる方法が提供される。細胞は、生体外であってもまたは生体内であってもよい。したがっていくつかの実施形態では、方法は、ｍｉＲＮＡ阻害剤を生体外細胞培養物に添加するステップを伴う。別の実施形態では、方法は、ｍｉＲＮＡ阻害剤を対象に投与するステップを伴う。

本発明のいくつかの態様は、複数のｍｉＲＮＡを標的にするｍｉＲＮＡ阻害剤を作成する方法を提供し、方法は、複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列を得るステップと、共通配列に結合できるｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなる、例えば本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ阻害剤（例えばＴｕＤ）などのｍｉＲＮＡ阻害剤を生成するステップと、ひいては複数のｍｉＲＮＡを標的にするステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、このように作成されたｍｉＲＮＡ阻害剤は、第１のｍｉＲＮＡ結合部位および第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり、第１のステム配列はその５’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第２のステム配列はその３’末端で第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に、そしてその５’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第３のステム配列はその３’末端で第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、ｍｉＲＮＡ阻害剤は複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、方法は、複数のｍｉＲＮＡを標的にするｍｉＲＮＡ阻害剤を合成するステップをさらに含んでなる。

組換えＡＡＶ
組換えＡＡＶベクターから発現される場合、本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤は、対象中で長期ｍｉＲＮＡ阻害効果を達成することが発見されている。例えばｒＡＡＶを使用して正常対象（コレステロール関連障害を有さない）に送達された、ｍｉＲ−１２２に対するｍｉＲＮＡ阻害剤は、例えば少なくとも１４週間までなどの持続期間にわたり、対象中で総血清コレステロールを顕著に低下させることが発見されている。ｒＡＡＶを使用して高コレステロール関連障害を有する対象に送達された、ｍｉＲ−１２２に対するｍｉＲＮＡ阻害剤もまた、例えば少なくとも１４週間までなどの持続期間にわたり、対象中で総血清コレステロールを顕著に低下させることもさらに発見されている。

ＡＡＶは、哺乳類中の天然生物である。哺乳類、特に非ヒト霊長類から単離されたＡＡＶは、臨床開発およびヒト遺伝子療法応用のための遺伝子移入ベクターを作成する上で有用である。本発明の態様では、組換えＡＡＶ９は、最適化ｍｉＲ−１２２阻害剤（本明細書でｍｉＲ−１２２拮抗薬（Ａｎｔａｇ）とも称される）を発現することにより、正常なＣ５７ＢＬ／６マウス中で、効率的かつ安定したｍｉＲ−１２２拮抗作用を達成する。ｍｉＲ−１２２阻害剤（ｒＡＡＶ９−ｍｉＲ−１２２Ａｎｔａｇ）をコードするｒＡＡＶベクターを含んでなるｒＡＡＶ９の単回静脈内注射は、成熟ｍｉＲ−１２２のレベルの顕著な低下と、ｍｉＲ−１２２標的遺伝子の顕著な上方制御を生じた。普通食を与えた正常対象では、総血清コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬの約５０％までの低下が観察された。

いくつかの態様では、本発明は単離ＡＡＶを提供する。本明細書の用法では、ＡＡＶに関する「単離」という用語は、その天然環境から（例えば宿主細胞、組織、または対象から）単離され、または人工的に生成されたＡＡＶを指す。単離ＡＡＶは、組換え法を使用して生成されてもよい。このようなＡＡＶは、本明細書で「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくはｒＡＡＶの導入遺伝子が、具体的には１つまたは複数の規定の組織に送達されるように、組織特異的標的能力を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的標的能力を判定する上で、重要な要素である。したがって標的とされる組織に適したカプシドを有するｒＡＡＶを選択し得る。典型的にｒＡＡＶは、肝臓組織、具体的には肝臓組織の肝細胞に対する向性を有する（それを標的とする）カプシドを有する。例えばｒＡＡＶカプシドは、配列番号３に記載の配列またはその変種を有する、ＡＡＶ９血清型であってもよい。ｒＡＡＶは、配列番号４に記載の配列を有する、ＡＡＶ９血清型変種Ｃｓｐ−３のカプシドを有する。ＡＡＶ９血清型変種の例は、ＡＡＶカプシド配列に関する内容を参照によって本明細書に援用する、２００９年５月２８日に出願された、米国仮特許出願第６１／１８２，０８４号明細書で開示される。なおも、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｒｈ．１０から選択される。別の実施形態ではＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶｒｈ．１０から選択される、ＡＡＶ血清型の変種である。

＞ｇｉ｜４６４８７８０５｜ｇｂ｜ＡＡＳ９９２６４．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス９］
（配列番号３）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

＞カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス］ＣＳｐ３
（配列番号４）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTIASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKRISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIRVKEVTDNNGVKTITNNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTRNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGVKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

組換えＡＡＶ：生成方法
所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得る方法は、当該技術分野で良く知られている。（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号明細書を参照されたい）。典型的に、方法は、以下を含有する宿主細胞を培養するステップを伴う：ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）と導入遺伝子とから構成される組換えＡＡＶベクター；および組換えＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドタンパク質内にパッケージングできるようにするのに十分なヘルパー機能。

宿主細胞中で培養され、ＡＡＶカプシド内にｒＡＡＶベクターをパッケージする構成要素は、宿主細胞にトランスに提供されてもよい。代案として、当業者に知られている方法を使用して遺伝子改変され、必要構成要素の１つ以上を含有する安定宿主細胞によって、必要構成要素（例えば組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上を提供してもよい。最も適切には、このような安定宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下にある必要構成要素を含有する。しかし、必要構成要素は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書で、導入遺伝子と共に使用するのに適した調節要素の考察において、提供される。なおも別の代案では、選択された安定宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成要素、および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下にあるその他の選択された構成要素を含有してもよい。例えば誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有するが、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来する、安定宿主細胞を作成してもよい。なおも別の安定宿主細胞が、当業者によって作成されてもよい。

本発明のｒＡＡＶの生成に必要な組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、あらゆる適切な遺伝要素（ベクター）を使用して、包装宿主細胞に送達されてもよい。選択された遺伝要素は、本明細書に記載されるものをはじめとする、あらゆる適切な方法によって送達されてもよい。本発明のいずれかの実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の当業者に知られており、遺伝子操作、組換え遺伝子操作、および合成技術が挙げられる。例えばSambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は良く知られており、適切な方法の選択は本発明を制限しない。例えばK.Fisher et al,J.Virol.,70:520-532(1993)、および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、三つ組み形質移入法を使用して生成されてもよい（米国特許番号第６，００１，６５０号明細書で詳述される）。典型的に、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子中にパッケージされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含んでなる）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターで、宿主細胞を形質移入することにより生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製およびカプシド形成のためにトランスに機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくはＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち機能性ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子含有ＡＡＶビリオン）を生じることなく、効率的なＡＡＶベクター生成を支援する。本発明で使用するのに適するベクターの非限定的例としては、どちらもその内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，００１，６５０号明細書に記載されるｐＨＬＰ１９、および、米国特許第６，１５６，３０３号明細書に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、それにＡＡＶが複製のために依存する、非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／またはセルラーゼ機能（すなわち「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、制限なしに、ＡＡＶ遺伝子転写活性化、段階特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリーに関与する部分をはじめとする、ＡＡＶ複製に必要な機能が挙げられる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスルのいずれかに由来し得る。

いくつかの態様では、本発明は形質移入宿主細胞を提供する。「形質移入」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指すのに使用され、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入」されている。いくつかの形質移入技術が、当該技術分野で一般に知られている。例えばGraham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、およびChu et al.(1981)Gene 13:197を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞に、ヌクレオチド組み込み型ベクターやその他の核酸分子などの１つまたは複数の外来性核酸を導入するのに使用し得る。形質移入は、例えば細胞に、ｒＡＡＶベクターを持つｒＡＡＶを感染させることで達成されてもよい。

「宿主細胞」は、対象物質を収容し、または収容できる、あらゆる細胞を指す。宿主細胞は、哺乳類細胞であることが多い。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、例えばｍｉＲＮＡ阻害剤と作動的に連結するプロモーターを含んでなるＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えＡＡＶ生産に関連したその他のトランスファーＤＮＡの受容体として使用してもよい。本用語は、形質移入された最初の細胞の子孫を含む。したがって「宿主細胞」は、本明細書の用法では、外来性ＤＮＡ配列で形質移入された細胞を指してもよい。単一親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異、または意図的変異の理由から、形態学的にまたはゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡ補体中で、最初の親細胞とは必ずしも完全に同一でなくてもよいものと理解される。

本明細書の用法では、「細胞系」という用語は、生体外で連続的または長期成長および分裂ができる細胞集団を指す。細胞系は、単一前駆細胞に由来するクローン集団であることが多い。このようなクローン集団の保存または導入中に、核型中で自然発生的または誘導性変化が生じ得ることが、当該技術分野でさらに知られている。したがって言及される細胞系に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同じでないこともあり得て、言及される細胞系はこのような変種を含む。

本明細書の用法では、「組換え細胞」という用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の生成をもたらすＤＮＡ断片などの外来性ＤＮＡ断片が、その中に導入された細胞を指す。

本明細書の用法では、「ベクター」という用語は、適切な制御要素との結合時に複製可能であり、細胞間に遺伝子配列を導入し得る、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどのあらゆる遺伝要素を含む。したがって本用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸断片が、プロモーターの転写調節下に置かれるベクターであることが検討された。「プロモーター」は、細胞の合成機構、または導入合成機構によって認識される、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要なＤＮＡ配列を指す。「作動可能に位置する」、「制御下」または「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸に対して正しい位置と配向にあり、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御することを意味する。「発現ベクターまたはコンストラクト」という用語は、その中で、核酸をコードする配列の一部または全部が転写されることができる、核酸を含有するあらゆるタイプの遺伝子コンストラクトを意味する。いくつかの実施形態では、発現は、例えば転写された遺伝子から、生物学的活性ポリペプチド生成物または阻害ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）を生じる、核酸の転写を含む。

組換えベクターを所望のＡＡＶカプシド内にパッケージングして、本発明のｒＡＡＶを生成する前述の方法は、制限を意図するものでなく、その他の適切な方法は当業者には明らかである。

組換えＡＡＶベクター
本発明の「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的に、少なくとも、例えばｍｉＲＮＡ阻害剤または分子検出システムの核酸をコードする導入遺伝子と、その制御配列と、５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とから構成される。カプシドタンパク質内にパッケージされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ阻害剤をコードするベクター配列とは異種の核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織細胞中における、導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で、調節構成要素と作動可能に結合している。ｍｉＲＮＡ阻害剤を肝臓組織に標的指向化してｍｉＲ−１２２の機能を妨げ、コレステロールレベルを低下させるために、組換えＡＡＶベースのベクターを開発してもよい。また細胞中のｍｉＲＮＡ阻害剤を評価またはスクリーニングするために、分子検出システムの核ベクターを細胞に標的指向化するために、組換えＡＡＶベースのベクターを開発してもよい。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的に、シス作用５’および３’逆方向末端反復配列を含んでなる（例えばB.J.Carter,in“Handbook of Parvoviruses”,ed.,P.Tijsser,CRC Press,pp.155 168(1990)を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。好ましくは、実質的に、ＩＴＲをコードする配列全体を分子中で使用するが、これらの配列のある程度の軽微な修正は許容できる。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当該分野の技術範囲内である。（例えばSambrook et al,“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；およびK.Fisher et al.,J Virol.,70:520 532(1996)などの教科書を参照されたい）。本発明で用いられるこのような分子の一例は、その中で選択された導入遺伝子配列と結合調節要素が５’および３’ＡＡＶＩＴＲ配列で挟まれる、導入遺伝子を含有する「シス作用」プラスミドである。ＡＡＶＩＴＲ配列は、目下同定されている哺乳類ＡＡＶ型をはじめとする、あらゆる既知のＡＡＶから得られてもよい。

組換えＡＡＶベクターについて上で同定された主要要素の他に、ベクターは、プラスミドベクターで形質移入しまたは本発明によって生成されたウイルスで感染させた細胞中における、転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で、導入遺伝子と作動的に連結する、必要な従来の制御要素もまた含む。本明細書の用法では、「作動的に連結する」配列は、関心のある遺伝子に隣接する発現調節配列、および関心のある遺伝子とトランスにまたはそれから離れて作用する発現調節配列の双方を含む。

発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザック共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；および所望ならば、コードされる生成物の分泌を高める配列以下を含む。天然、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターをはじめとする多数の発現調節配列が当該技術分野で知られており、利用してもよい。

本明細書の用法では、核酸配列の発現または転写が、制御配列の影響または調節下に置かれるように、核酸配列（例えばコード配列）と制御配列が共有結合する場合、それらは「作動可能に」結合すると言われる。核酸配列を機能性タンパク質に翻訳することが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列中のプロモーターの誘発がコード配列の転写をもたらす場合、そして２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、コード配列の転写を導くプロモーター領域の能力を妨げず、または対応するＲＮＡ転写物の機能を妨げない場合に、作動的に連結するとされる。したがってプロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、得られた転写物が機能性ＲＮＡ分子（例えば適切に折りたたまれたｍｉＲＮＡ阻害剤）になってもよいように、プロモーター領域は核酸配列と作動的に連結する。

いくつかの実施形態では、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。場合によっては、組織特異的制御配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子と結合する。このような組織特異的制御配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど）は、当該技術分野で良く知られている。ｍｉＲＮＡ阻害剤は、例えばＵ６プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現されることが多い。しかし、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなどのその他の適切なプロモーターが使用されてもよい。

組換えＡＡＶ投与法
ｒＡＡＶは、当該技術分野で既知のあらゆる適切な方法に従った組成物中で、対象に送達されてもよい。好ましくは生理学的適合性キャリアに懸濁された（すなわち組成物中の）ｒＡＡＶは、例えばヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えばマカク）などの対象に投与されてもよい。

ｒＡＡＶは、過度の悪影響なしに、所望の組織の細胞を形質移入し、十分なレベルの遺伝子移入と発現を提供するのに十分な量で投与される。従来のそして薬学的に許容できる投与経路としては、選択された臓器への直接送達（例えば肝臓への門脈内送達）、経口、（鼻腔内および気管内送達をはじめとする）吸入、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、およびその他の非経口投与経路が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定状況では、ｒＡＡＶベース治療用コンストラクトは、皮下、膵臓中、鼻腔内、非経口的、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、または経口的、腹腔内、または吸入のいずれかによって、本明細書で開示される適切に調合された医薬組成物中で送達することが望ましいであろう。いくつかの実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号明細書；米国特許第５，６４１，５１５号明細書、および米国特許第５，３９９，３６３号明細書（個々にその内容全体を参照によって本明細書に援用する）に記載されるような投与法を使用して、ｒＡＡＶを送達してもよい。

哺乳類対象へのｒＡＡＶの送達は、静脈内注射によってもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの投与様式は門脈注射による。血流内投与は、静脈、動脈、またはあらゆるその他の脈管内への注射によってもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの血流内投与は、外科技術分野で良く知られている技術である分離式肢灌流の手段により、本方法は本質的に、当業者がｒＡＡＶビリオンの投与前に、四肢を体循環から分離できるようにする。米国特許第６，１７７，４０３号明細書に記載される分離式肢灌流技術の変法もまた当業者によって用いられて、ｒＡＡＶが分離四肢血管系に投与され、筋肉細胞または組織内への導入を潜在的に高め得る。投与経路は、所望ならば組み合わせてもよい。

さらに場合によっては、ビリオンを対象のＣＮＳに送達することが望ましいことがある。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。したがって本用語には、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨などが含まれるが、これに限定されるものではない。組換えＡＡＶは、定位的注入などの脳神経外科技術分野で知られている技術を使用して、注射針、カテーテルまたは関連機器を用いて、例えば脳室領域、ならびに線条体（例えば線条体の尾状核または被殻）、脊髄神経筋接合部、または小脳葉内への注射によって、ＣＮＳまたは脳に直接送達されてもよい。（例えばStein et al.,J Virol 73:3424-3429,1999；Davidson et al.,PNAS 97:3428-3432,2000；Davidson et al.,Nat.Genet.3:219-223,1993；およびAlisky and Davidson,Hum.Gene Ther.11:2315-2329,2000を参照されたい）。

本発明の組成物は、１つのｒＡＡＶのみを含んでなってもよく、または１つまたは複数のその他のウイルス（例えば１つまたは複数の異なるｍｉＲＮＡ阻害剤など、例えば１つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードする有する第２のｒＡＡＶ）が組み合わさっていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、それぞれが１つまたは複数の異なる導入遺伝子を有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の異なるｒＡＡＶを含んでなる。

適切なキャリアは、当業者によって、ｒＡＡＶが対象とする適応症を考慮して容易に選択されてもよい。例えば１つの適切キャリアは、多様な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）と配合されてもよい、生理食塩水を含む。その他の例示的なキャリアとしては、無菌生理食塩水、乳糖、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、および水が挙げられる。キャリアの選択は、本発明を制限しない。

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよびキャリアに加えて、保存料、または化学安定剤などのその他の従来の医薬品成分を含有してもよい。適切な例示的保存料としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

特定の「治療効果」を達成するのに必要なｒＡＡＶビリオンの用量、例えばゲノムコピー／キログラム体重（ＧＣ／ｋｇ）の用量単位は、ＡＡＶビリオン投与経路、治療効果の達成に必要な遺伝子またはＲＮＡ発現レベル、治療される特定疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡ生成物の安定性をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの要素に基づいて変動する。当業者は、前述の要素、ならびに当該技術分野で良く知られているその他の要素に基づいて、特定の疾患または障害を有する対象を治療するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に判定し得る。

ｒＡＡＶの有効量は、動物への感染を標的とし、所望の組織を標的とするのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞遺伝子導入動物モデルを生成するのに十分な量である。有効量は、主に対象の種、年齢、体重、健康、および標的とされる組織などの要素に左右され、したがって動物および組織間で変動してもよい。例えばｒＡＡＶの有効量は、概して、約１０^９〜１０^１６個のゲノムコピーを含有する、約１ｍｌ〜約１００ｍｌの溶液の範囲内である。場合によっては、約１０^１１〜１０^１２のｒＡＡＶ個のゲノムコピーの投与量が適切である。特定の好ましい実施形態では、１０^１２ｒＡＡＶ個のゲノムコピーが、心臓、肝臓、および膵臓組織を標的とするのに有効である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの投与量は、１ｋｇあたり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４個のゲノムコピーである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの投与量は、対象あたり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個のゲノムコピーである。場合によっては、安定遺伝子導入動物は、ｒＡＡＶの複数回投与によって作られる。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高ｒＡＡＶ濃度が存在する（例えば約１０^１３ＧＣ／ｍｌ以上）場合に、組成中のＡＡＶ粒子凝集を低下させるように配合される。ｒＡＡＶの凝集を低下させる方法は、当該技術分野で良く知られており、例えば界面活性剤添加、ｐＨ調節、塩濃度調節などが挙げられる（例えばその内容を参照によって本明細書に援用する、Wright FR,et al.,Molecular Therapy(2005)12,171-178を参照されたい。）

薬理的に許容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は、当業者に良く知られており、多様な治療計画において、本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な用量と治療計画の開発についても同様である。

典型的に、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性化合物を含有してもよいが、活性成分の百分率はもちろん変動してもよく、好都合には全製剤の重量または体積の約１％または２％〜約７０％または８０％またはそれ以上であってもよい。必然的に、治療に有用な各組成物中の活性化合物の量は、化合物のあらゆる所与の単位用量中で、適切な投与量が得られるように調製されてもよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、ならびにその他の薬理学的考察などの要素が、このような医薬製剤を調製する当業者によって検討され、したがって多様な投与量および治療計画が望ましくあってもよい。

注射用途に適した医薬品形態としては、無菌水溶液または分散体、および無菌注射液または分散体を即時調合するための無菌粉末が挙げられる。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、そして油中で調製されてもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製品は微生物の成長を妨げる保存料を含有する。多くの場合、形態は、無菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性を有する。その形態は製造条件および保存条件下で安定していなくてはならず、細菌や真菌などの微生物汚染作用から保護されていなくてはならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保ってもよい。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌性および抗真菌性作用物質によってもたらし得る。多くの場合、例えば糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延作用物質組成物中で使用することで、もたらし得る。

注射用水溶液を投与するために、例えば溶液は必要ならば適切に緩衝してもよく、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースによって等張にしてもよい。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適する。これに関連して、用い得る無菌水性培地は、当業者には既知である。例えば、１回投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加してもよく、または提案される輸液部位に注入してもよい（例えば“Remington's Pharmaceutical Sciences” 15th Edition,pages 1035-1038および1570-1580を参照されたい）。投与量のいくらかの変動は、宿主の病状に応じて必然的に起きる。投与の役割を担う個人は、いずれにしても個々の宿主のための適切な用量を判定するであろう。

無菌注射液は、必要に応じて本明細書に列挙されるその他の様々な成分と共に、必要量の活性ｒＡＡＶを適切な溶媒に組み込み、それに続いて濾過滅菌することで調製される。一般に、分散体は、基礎的分散媒と、上に列挙したものからの必要なその他の成分とを含有する無菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を組み込むことで調製される。無菌注射液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それによって、あらゆる追加的な所望成分が添加された活性成分の粉末が、あらかじめ無菌濾過されたその溶液からもたらされる。

本明細書で開示されるｒＡＡＶ組成物はまた、中性形態または塩形態で調合されてもよい。薬理的に許容可能な塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）酸付加塩、および例えば塩酸またはリン酸などの無機酸によって、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形成されたものが挙げられる。遊離カルボン酸基で形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導し得る。ひとたび処方されると、溶液は、用量剤形に適合する様式で、および治療的有効量で投与される。製剤は、注射液、薬剤放出カプセルなどの多様な剤形で、容易に投与される。

本明細書の用法では、「キャリア」は、あらゆる全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌性および抗真菌性作用物質、等張吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬理的活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で知られている。補給的活性成分もまた、組成物に組み込み得る。「薬理的に許容可能」と言う語句は、宿主に投与した際に、アレルギーまたは類似の有害反応を生じない、分子実体および組成物を指す。

リポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルもまた、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために使用してもよい。特にｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、またはナノ粒子などの中でカプセル化して、送達のために調合されてもよい。

このような製剤はまた、本明細書で開示される核酸またはｒＡＡＶコンストラクトの薬学的に許容できる製剤を導入する上で、好ましくあってもよい。リポソームの形成および使用は、当業者に一般に知られている。最近、血清安定性と循環半減期が改善されたリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号明細書）。さらに潜在的薬剤キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製品の様々な方法について、記載されている（；米国特許第５，５６７，４３４号明細書；米国特許第５，５５２，１５７号明細書；米国特許第５，５６５，２１３号明細書；米国特許第５，７３８，８６８号明細書、および米国特許第５，７９５，５８７号明細書）。

リポソームは、常態ではその他の手順による形質移入に抵抗性である、いくつかの細胞型で成功裏に使用されている。これに加えて、リポソームには、ウイルスベース送達系に典型的なＤＮＡ長さの制約がない。リポソームは、多様な培養細胞系および動物に、遺伝子、薬剤、放射線治療薬、ウイルス、転写因子、およびアロステリック効果剤を導入するのに、効果的に使用されている。これに加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を調べる、いくつかの成功裏の臨床試験が完了している。

リポソームは、水性媒体中に分散するリン脂質から形成され、自然発生的に多層同心性二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも称されるを形成する。ＭＬＶは、一般に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コアに水溶液を含有する、直径が２００〜５００Åの範囲内の小型単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。

代案としては、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは、一般に、物質を安定かつ再現可能な様式で封入し得る。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、このような超微粒子（サイズ約０．１μｍ）は、生体内で分解可能なポリマーを使用してデザインされるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の使用が検討される。

上述の送達方法の他に、以下の技術もまた、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替え方法として検討される。ソノフォレーシス（例えば超音波）が、薬剤の循環系への浸透と通過の速度および有効性を高める機器として使用されており、米国特許第５，６５６，０１６号明細書に記載される。検討されるその他の薬物送達代替案は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号明細書）、マイクロチップ機器（米国特許第５，７９７，８９８号明細書）、点眼剤（Bourlais et al.,1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号明細書および米国特許第５，７８３，２０８号明細書）、およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号明細書）である。

キットおよび関連組成物
本明細書に記載される作用物質は、いくつかの実施形態では、医薬または診断または研究キットに仕上げて、治療、診断または研究用途におけるそれらの使用を容易にしてもよい。キットは、本発明の構成要素と使用説明を収容する、１つまたは複数の容器を含んでもよい。具体的には、このようなキットは、本明細書に記載される１つまたは複数の作用物質を、これらの作用物質の意図される用途および適切な使用を記載する使用説明と共に含んでもよい。特定の実施形態では、キット中の作用物質は、作用物質の特定用途および投与方法に適した、製剤処方および剤形であってもよい。研究用キットは、様々な実験を実施するのに適した濃度または量で、構成要素を含有してもよい。

キットは、本明細書に記載される方法を研究者が使用するのを容易にするようにデザインされてもよく、多数の形態を取り得る。キットの各組成物は、当てはまる場合、液体形態（例えば溶液）で提供されても、または固体形態（例えば乾燥粉末）で提供されてもよい。特定例では、組成物のいくつかは、例えば、キット中で提供されてもされなくてもよい、適切な溶媒またはその他の化学種（例えば水または細胞培地）の添加によって戻すことができ、または別のやり方で（例えば活性形態に）加工できる。本明細書の用法では、「使用説明」は、説明および／または広報宣伝の構成要素を定義し得て、典型的に、本発明の包装上の、またはそれに付随する、書面による使用説明を含む。使用説明はまた、例えば音響と映像（例えばビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースのコミュニケーションなど、使用者が、使用説明がキットに付随することを明らかに認識するようなあらゆる様式で提供される、あらゆる口頭のまたは電子使用説明をも含み得る。書面による使用説明は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定される形態であってもよく、その使用説明はまた、当局による、動物に投与するための製造、使用または販売の認可も反映し得る。

キットは、１つまたは複数の容器内に、本明細書に記載される構成要素のいずれか１つまたは複数を含有してもよい。一例として、一実施形態では、キットは、キットの１つまたは複数の構成要素を混合するための、および／またはサンプルを単離し混合して対象に適用するための使用説明を含んでもよい。キットは、本明細書に記載される作用物質を収容する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは分子検出システムの作用物質（構成要素）を収容する容器を含んでなる。作用物質は、液体、ゲルまたは固形（粉末）の形態であってもよい。作用物質を無菌的に調製して、シリンジ内に包装し、冷蔵輸送してもよい。代案としては、それはバイアルまたはその他の保存容器内に収容されてもよい。第２の容器は、無菌的に調製されたその他の作用物質を有してもよい。代案としては、キットは、予備混合された活性薬剤を含み、シリンジ、バイアル、チューブ、アンプルまたはその他の容器内で輸送されてもよい。特に特定の体細胞動物モデルを作成するためのキットの場合、キットは、シリンジ、局所適用機器、または点滴用針管材料およびバッグなど、動物に作用物質を投与するのに必要な構成要素の１つまたは複数または全てを有してもよい。

例１：マイクロＲＮＡスカベンジャーのｒＡＡＶ媒介送達は、同族のマイクロＲＮＡの効率的かつ安定したノックダウン、それらの天然標的遺伝子の上方制御、およびマウスの表現型の変化をもたらす
成体マウス中における、ｍｉＲＮＡ拮抗薬（ｍｉＲ−Ａｎｔａｇｓ）送達のためのｒＡＡＶの使用を検討した。特定のｍｉＲＮＡの効率的な体細胞阻害について、異なるデザインのベクター主鎖（ｓｓ対ｓｃ）、プロモーター（ＰｏｌＩＩ対ＰｏｌＩＩＩ）、およびｍｉＲＮＡ拮抗薬（Ｓｐｏｎｇｅ、Ｚｉｐ、ＴｕＤなど）を評価した。例えばｂｕｌｇｅｄ結合部位、多重縦列コピーｓｐｏｎｇｅなどの異なるデザインのｍｉＲＮＡ拮抗薬（阻害剤）もまた、評価した。肝臓中でコレステロール生合成を調節することが報告されているＭｉＲ−１２２、および抗発がん性ｍｉＲＮＡであるＬｅｔ−７を阻害標的として使用した。高機能阻害剤を選択するために、化学発光ｍｉＲＮＡセンサーを開発した（図１参照）。化学発光ｍｉＲＮＡセンサーはポリメラーゼＩＩプロモーターを含有し、ｒＡＡＶベクター中のレポーター遺伝子の発現を駆動した。レポーター遺伝子は、プロモーターのすぐ下流にイントロンを、ポリＡ尾部上流に一連のｍｉＲＮＡ結合部位（ｓｐｏｎｇｅ）を有した。ポリメラーゼＩＩプロモーターおよびレポーター遺伝子は、逆方向末端反復配列で挟まれた。試験ｍｉＲＮＡ阻害剤の発現を駆動するＵ６プロモーターは、レポーター遺伝子のイントロン中に存在した。したがってｍｉＲＮＡセンサーは、レポーター遺伝子の逐次抑制および抑制解除と、標的検証のための二重ｍｉＲＮＡ制御因子を含んでなる。

ｍｉＲ−１２２ｔｏｕｇｈｄｅｃｏｙＲＮＡデザインの有効性を評価した。β−ガラクトシダーゼをコードして、ｍｉＲ１２２ｔｏｕｇｈｄｅｃｏｙＲＮＡを発現するｍｉＲＮＡセンサーで、２９３細胞を感染させた。ｍｉＲ１２２ｄｅｃｏｙｓＲＮＡを発現しない対照ｍｉＲＮＡセンサーもまた、形質移入した。試験および対照ｍｉＲＮＡセンサーは、それぞれ３つのｍｉＲ−１２２結合部位を有した。２９３細胞は、０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、および４００ｎｇで形質移入した。標準技術を使用してＬａｃＺ染色を実施し、レポーター遺伝子の発現を評価した。対照ｍｉＲＮＡセンサー中では、レポーター遺伝子発現の用量依存的阻害が観察された。しかし、ｍｉＲ１２２阻害剤を発現した試験ｍｉＲＮＡセンサーは、全ての用量において、レポーター遺伝子発現阻害の顕著な減衰を示した。対照的に、β−ガラクトシダーゼをコードしてｍｉＲ１２２ｓｐｏｎｇｅＲＮＡを発現するｍｉＲＮＡセンサーで感染させた細胞は、対照ｍｉＲＮＡセンサーと比較して、レポーター遺伝子発現を減衰させなかった。したがってＴｕＤｍｉＲ１２２デザインは、ｓｐｏｎｇｅデザインよりも優れていた。細胞あたり約１．６×１０^４個のｍｉＲ−１２２分子の定常状態レベルを発現したＨｕｈ−７細胞中で、同様の実験を実施した。Ｈｕｈ−７細胞中で、ｍｉＲＮＡ結合部位数の効果を評価した。試験および対照ｍｉＲＮＡセンサーは、それぞれ１つまたは３つのｍｉＲ−１２２結合部位のどちらかを有した。ＴｕＤｍｉＲ−１２２ＲＮＡ（配列番号１）は、Ｈｕｈ−７細胞中のＬａｃＺレポーター遺伝子の後にある１コピーのｍｉＲ−１２２結合部位に関係する下方制御を、完全にレスキューしたことが分かった。プロモーター（ＰｏｌＩＩおよびＰｏｌＩＩＩ）とｍｉＲＮＡ阻害剤の異なる組み合わせもまた、評価した。ポリメラーゼＩＩＩが駆動するＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤の発現は、２９３およびＨｕｈ−７細胞の双方において優れた結果を有する（図２ＡおよびＢ）。ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子を有する同様のｍｉＲＮＡセンサーを開発して、Ｈｕｈ−７細胞中で試験した。この場合も、ＴｕＤｍｉＲ−１２２ＲＮＡは、Ｈｕｈ−７細胞中のｍｉＲ−１２２結合部位によって媒介されるＦｌｕｃの下方制御を、効率的にレスキューした。

ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤遺伝子を持つｒＡＡＶ（血清型９型）を感染させたマウス（成体Ｂ６）は、（感染後７週目まで）肝臓酵素レベルによる評価で、肝機能に対する悪影響を示さなかった。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤遺伝子を持つｒＡＡＶ（血清型９型）を感染させたマウス中では、感染の１ヶ月後に、スクランブル阻害剤を持つｒＡＡＶ９を感染させた対照マウスと比較して、ｍｉＲ−１２２標的遺伝子の効果的な誘導が観察された。評価された標的遺伝子には、アルドラーゼＡ、サイクリンＧ１、Ｔｍｅｄ３、およびＨｆｅ２が含まれる。ｒＡＡＶ９によって送達されるｍｉＲ−１２２阻害剤は、その細胞がｍｉＲ１２２を発現しないマウス心臓中では、これらの標的遺伝子に対する効果を有さなかった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｒＡＡＶｍｉＲ−１２２−Ａｎｔａｇの単回ＩＶ注射は、成熟ｍｉＲ−１２２（図２Ｃ）レベルの８０％の低下と、ｍｉＲ−１２２標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの３倍の増大を生じた。ｍｉＲ−１２２の阻害は、普通食を与えたマウスで、総血清コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬを５０％低下させた。ＴｕＤｍｉＲ−１２２阻害剤の配列および二次構造をそれぞれ図３Ａおよび３Ｂに示す。

同様の実験を実施して、Ｌｅｔ−７のｍｉＲＮＡ阻害剤を評価した。７コピーまでのＬｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅ配列（Ｌｅｔ−７結合部位）によって媒介される、ルシフェラーゼ発現を抑制解除し得る、ＴｕＤｌｅｔ−７阻害剤を同定した。Ｌｅｔ−７の標的である、ＤｉｃｅｒｍＲＮＡの発現における２倍の増大もまた観察された。同様にＴｕＤｌｅｔ−７もＨｅＬａ細胞中でＤｉｃｅｒタンパク質レベルを誘発したが、Ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅはしなかった。Ｄｉｃｅｒ遺伝子発現誘導はまた、ＴｕＤｌｅｔ−７阻害遺伝子を持つｒＡＡＶ（血清型９型）を感染させたマウス肝臓および心臓中でも、肝機能への悪影響が観察されることなく（感染後７週目まで）観察された。ｒＡＡＶ−Ｌｅｔ−７−Ａｎｔａｇの投与は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからｍｉＲＮＡを生成する酵素であって常態ではＬｅｔ−７によって抑制される、ＤｉｃｅｒのｍＲＮＡレベルを２倍に増大させた。この研究の結果は、ｒＡＡＶ−ｍｉＲ−Ａｎｔａｇｓが効率的かつ安定したｍｉＲＮＡの体細胞阻害を媒介し、ｍｉＲＮＡ機能を研究する効率的なツールと、ｍｉＲ１２２の場合は異脂肪血症、およびｍｉＲＮＡ調節解除によって引き起こされる他の疾患の潜在的治療との双方を提供することを示す。

例２：ｍｉＲ−１２２のｒＡＡＶ媒介治療的サイレンシングは、ＤＬＤＲ^−／−／Ａｐｏｂｅｃ１^−／−マウス中でＬＤＬに迅速かつ顕著な低下をもたらす
ＦＨ遺伝子療法の代案として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）調節を評価した。ｍｉＲＮＡは、ほとんどの細胞プロセスを調節する上で重要な役割を果たす。肝臓中の最も豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、未知の機序によってコレステロール代謝を調節し、直接ＬＤＬＲｍＲＮＡを標的としない。最適化ｍｉＲＮＡ−１２２拮抗薬（Ａｎｔａｇ）を発現させることで、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス中の効率的かつ安定したｍｉＲ−１２２拮抗作用について、組換えＡＡＶ９を調べた。ｒＡＡＶ９−ｍｉＲ−１２２Ａｎｔａｇ（配列番号１）の単回静脈内注射は、普通食を与えたオスマウス（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）中で、成熟ｍｉＲ−１２２レベルを８０％低下させ、４つのｍｉＲ−１２２標的遺伝子を３倍に上方制御し、ならびに総血清コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬを５０％低下させた。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）遺伝子発現レベルで評価される肝機能に対する顕著な影響なしに、この阻害は感染後１４週間にわたり観察された。ＡＬＴおよびＡＳＴは、肝臓細胞中に位置する酵素であり、肝細胞が損傷した際、全身循環中に漏出する。ｍｉＲ−１２２阻害剤の治療的可能性を評価するために、ヒトＦＨに最も比較できるマウスモデルである、成体オスおよびメスのＬＤＬＲ−／−／Ａｐｏｂｅｃ１Ａ−／−マウスに、普通固形飼料と共に同一ベクターを投与した（Powell-BraxtonL,et al., Nature Medicine, Volume4, Number 8, August 1998）。投与の１週間後、オスとメスの双方で、総血清コレステロールに２０％の低下が観察された。興味深いことに、オスにおける低下がＨＤＬ画分に限定されたのに対し、メスにおける低下はＬＤＬに限定された。第２週目には、処理メス中の総コレステロールおよびＬＤＬは、約３０％低下したが、ＨＤＬレベルは変化がないままであった。（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ参照。）オス中の総コレステロールの低下は２０％のままであり、１週目のマウスと比較して、ＨＤＬの５０％増大およびＬＤＬの１３％低下が反映された。ｍｉＲ−１２２阻害で観察された性別特異的相違は、先に報告されたメスマウスにおけるｒＡＡＶ媒介肝臓形質導入の低い効率の反映であってもよく、ＦＨを治療するためのｍｉＲ−１２２のｒＡＡＶ媒介治療的阻害のために、用量が最適化されてもよいことが示唆される（Davidoff AM,et al.,Blood.2003;102:480-488）。この研究結果は、ｒＡＡＶが効率的かつ安定した体細胞ｍｉＲＮＡ阻害を達成し得ることを示し、ｍｉＲＮＡ調節解除によって引き起こされる、異脂肪血症およびその他の疾患の治療法の原理を提供する。

例３：高脂血症を治療するためのＡＡＶベクター媒介生体内ｍｉＲＮＡ拮抗作用
ｍｉＲＮＡ遺伝子の遺伝子破壊は、ｍｉＲＮＡ機能を研究する強力なストラテジーに相当するが、多くのｍｉＲＮＡ遺伝子は同一シード配列、すなわちその標的レパートリーを確定する６〜８ｎｔのｍｉＲＮＡ領域を共有し、したがってｍｉＲＮＡファミリーの１メンバーが、他のメンバーの損失を代償し得る。ｍｉＲＮＡファミリーの全メンバーが消去された動物モデルの作成は、困難である。さらにヒトとマウスは２７６を超えるｍｉＲＮＡを共有し、成体マウスで、各保存ｍｉＲＮＡの機能と、疾患への寄与を評価するには、数百の条件付きノックアウト系統が必要である。成熟ｍｉＲＮＡに相補的な化学修飾抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）は、生体外および生体内ｍｉＲＮＡ阻害のための一般的に利用可能なツールである^３〜９。効果的なＡＭＯでは、典型的に２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’，４’−メチレン（ロックド核酸；ＬＮＡ）などの高価なまたは独自仕様の化学修飾が用いられ、現行の化学および製剤は、多数の組織または臓器に、ＡＭＯを安全かつ有効に送達できない。さらにＡＭＯによるｍｉＲＮＡ阻害では、同族のｍｉＲＮＡの発現を抑制するために、反復投与が必要である^{３，７〜１１}。

ＡＭＯの代案として、ｍｉＲＮＡ機能を競合的に阻害するようにデザインされ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現される、複数タンデムｍｉＲＮＡ結合部位であるｍｉＲＮＡ「ｓｐｏｎｇｅ」を発現する、プラスミドＤＮＡベクターを使用して、培養細胞中^１２およびハエの生体内^１３で、ｍｉＲＮＡ機能が研究されている。生体外で造血幹細胞を安定して修飾するための、ｓｐｏｎｇｅ発現レンチウイルスベクターを使用した造血細胞中のｍｉＲ−２２３の枯渇と、それに続くマウス中の骨髄再建からは、遺伝子ｍｉＲＮＡノックアウトで観察されたのと同様の表現型が生じた^１４。しかし、挿入変異誘発のリスクと生体外操作の必要条件によって、機能性ゲノムの研究および治療用途のための、レンチウイルスベクターベースのｍｉＲＮＡ阻害の使用が制限されることもある。より最近では、そのどちらも培養細胞および生体内におけるｍｉＲＮＡの安定した恒久的阻害を可能にする、「ＴｏｕｇｈＤｅｃｏｙ」（ＴｕＤ）ＲＮＡおよびｍｉＲＺｉｐｓをはじめとする、コンパクトなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ駆動性ｍｉＲＮＡｄｅｃｏｙが報告されている^１６。それでもなお、成体哺乳類中でｍｉＲＮＡ標的相互作用を研究するために、ｍｉＲＮＡを安定して効率的に拮抗する方法は、未だに開発されていない。

４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡパルボウイルスアデノ随伴ウイルス^１７（ＡＡＶ）は、ヒトをはじめとする霊長類にまん延する非病原性常在ウイルスである^{１８，１９}。過去１０年間に、新しい組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターが天然ＡＡＶ血清型から作り出されており、マウスおよび非ヒト霊長類中の多様な組織を標的とする、効率的な遺伝子移入ビヒクルが提供されている^{２０〜２３}。

ここでは、肝臓中の高度に豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２^２４と、がんおよび発育における機能を有するｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７^２５とを阻害するための、マウス中におけるｒＡＡＶベクターの使用を報告する。異なるプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ対ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ）およびｍｉＲＮＡ拮抗薬のデザイン（ｓｐｏｎｇｅ、ＴｕＤ、およびｍｉＲＺｉｐ）が培養細胞中で評価され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ駆動性ＴｕＤが最も強力なｍｉＲＮＡ拮抗薬として同定された。抗ｍｉＲ−１２２および抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡを発現するようにｒＡＡＶ９ベクターを遺伝子改変して使用し、生体内で効率的かつ持続性の標的特異性ｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７阻害を達成した。各ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成体マウス中で、対応するｍｉＲＮＡ標的遺伝子の発現を増大した。処理マウスからの肝臓ｍｉＲＮＡのハイスループット配列決定によって、標的ｍｉＲＮＡは枯渇したが、他のｍｉＲＮＡは枯渇しなかったことを確認した。さらに生体内ｍｉＲＮＡ枯渇は、非鋳型ヌクレオチドの３’付加、ならびに３’から５’へのｍｉＲＮＡの短縮を伴い、これは先にキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）生体内で、および生体外形質転換培養ヒト細胞中で観察された分解経路である^３３。重要なことに、抗ｍｉＲ−１２２発現ｒＡＡＶ９で処理した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと低密度リポタンパク（ＬＤＬ）受容体欠乏症マウスの双方で、血清コレステロールプロフィール中で持続性の表現型変化が観察されたが、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡでは変化が観察されなかった。本明細書で提供されるデータは、ｒＡＡＶ−発現ＴｕＤＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ発現によって引き起こされる、高コレステロール血症およびその他の障害のための、安定した治療法を可能にし得ることを示唆する。

培養細胞中の転写されたｍｉＲＮＡ拮抗薬の評価
異なる転写されたｍｉＲＮＡ拮抗薬を試験するために、肝臓中でコレステロール生合成を調節する高度に豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２、および抗発がん性ｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７を阻害標的として選択した。ｍｉＲＮＡｓｐｏｎｇｅ、ＴｕＤＲＮＡ（図６）、およびｍｉＲＺｉｐｓ^{１２，１５}をはじめとする、一連のｍｉＲ−１２２およびｌｅｔ−７拮抗薬をデザインした（ｗｗｗ．ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ／ｍｉｒｚｉｐ／）（表２）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩサル空胞化ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、または肝臓特異的ヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、または代案としてはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩＵ６プロモーターを使用して、ｍｉＲＮＡｓｐｏｎｇｅを発現させ；Ｕ６プロモーターは、ＴｕＤおよびｍｉＲＺｉｐの発現を駆動するために使用した（図７ａおよびｂ）。

各ｍｉＲＮＡ拮抗薬の効率を評価するために、発現コンストラクトが、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に１または３コピーの完全相補的ｍｉＲ−１２２結合部位を含有する核標的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）レポーターｍＲＮＡを抑制解除する能力を試験した。様々なｍｉＲ−１２２阻害剤コンストラクトまたは対照プラスミドと共に、ｎＬａｃＺレポータープラスミドを細胞あたり約１６，０００個のｍｉＲ−１２２分子を発現するヒト肝細胞腫細胞系^２７であるＨｕＨ−７細胞^２７に、同時形質移入した。予期されたように、ｎＬａｃＺ３’ＵＴＲ中に１つのｍｉＲ−１２２結合部位が存在する場合、レポーター発現は約５０％低下し、３つの部位が存在する場合は＞８０％低下した（図７ｃ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ駆動性抗ｍｉＲ−１２２ｓｐｏｎｇｅの中で、強力肝臓特異的プロモーターであるＴＢＧプロモーターだけが、単一ｍｉＲ−１２２結合部位を保有するｎＬａｃＺの発現を検出可能に増大させ、ｓｐｏｎｇｅがｍｉＲ−１２２を部分的に阻害したことが示された。しかし、レポーターが３つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有する場合、ｎＬａｃＺ発現はこのｓｐｏｎｇｅによって顕著に増大せず（図７ｃ）、３つのｍｉＲＮＡ標的部位によって与えられるより大きな抑制を克服するには、ｍｉＲ−１２２の活性または濃度の変化が小さすぎることが示唆された。

対照的に、１および３部位レポーターのどちらも、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ駆動性抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡによって抑制解除された。１部位レポーターでは、ＴｕＤは、レポーター中にｍｉＲ−１２標的部位が存在しない場合に観察された発現に、ｎＬａｃＺ発現を復元する（図７ｃ）。ＴｕＤＲＮＡのより大きな有効性は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと比較して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって可能なより高い転写レベル、ＴｕＤデザインによるより大きなｍｉＲＮＡ阻害、またはその双方を反映してもよい。これらの可能性を識別するために、３つの異なるＵ６駆動性ｍｉＲ−１２２拮抗薬コンストラクトであるｓｐｏｎｇｅ、ＴｕＤ、およびｍｉＲＺｉｐが、３つのｍｉＲ−１２２結合部位を含有するｎＬａｃＺレポーターを抑制解除する能力を比較した。この場合もまた、ＴｕＤだけが、ＨｕＨ−７細胞中のｍｉＲ−１２２によるｎＬａｃＺ抑制を顕著に（ｐ値≦０．００１）抑制解除した（図７ｄ）。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ発現コンストラクトはまた、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞中でも同様に有効であった。ＨＥＫ２９３細胞はｍｉＲ−１２２をほとんど発現しないので、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２は、３つのｍｉＲ−１２２結合部位があるまたはないｎＬａｃＺレポーター、およびＴｕＤ発現プラスミドで同時形質移入されたプラスミドから発現させた。ｎＬａｃＺ発現を４８時間後に評点した。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤは、ｍｉＲ−１２２発現プラスミドの存在下でレポーター発現を顕著に抑制解除したが、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤまたは抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅは、抑制解除しなかった（図７ｅ）。

それらの標的と高い相補性を持つｍｉＲＮＡがＡｒｇｏｎａｕｔｅ２タンパク質を誘導してｍＲＮＡを切断したのに対し、より低い相補性は一般にｍＲＮＡ安定性を低下させた。ＴｕＤＲＮＡが、その標的と不完全に相補的なｍｉＲＮＡによって誘導される抑制もまた阻害し得るかどうかを試験するために、その３’ＵＴＲに７コピーのｂｕｌｇｅｄｍｉＲ−１２２結合部位があるホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーターｍＲＮＡをデザインした；７つの突然変異部位があるＦｌｕｃが、対照の役割を果たした。形質移入によって、ｍｉＲ−１２２応答性Ｆｌｕｃレポーター、抗ｍｉＲ−１２２、抗ｌｅｔ−７または対照ＴｕＤプラスミド、そして内部対照としてウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）発現プラスミドをＨｕＨ−７細胞に導入した。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤは、Ｆｌｕｃ発現を完全に抑制解除したが、対照または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤは抑制解除しなかった（図７ｆ）。ＴｕＤＲＮＡは、強力な特異的ｍｉＲＮＡ阻害剤であると結論される。

最終的に、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤはＤｉｃｅｒｍＲＮＡおよびタンパク質の双方の発現を増大させた；ｄｉｃｅｒは内在性ｌｅｔ−７標的である^{２８，２９}（図８ａ、８ｂ、および図９）。総合して、生体外データは、Ｕ６プロモーターから転写されたＴｕＤＲＮＡが、調査したｍｉＲＮＡ拮抗薬中で最強であることを示唆する。

生きている動物中の特異的内在性ｍｉＲＮＡ活性のリアルタイムモニタリング
生体内でｍｉＲＮＡ機能を阻害するＴｕＤＲＮＡの能力を試験するために、ｍｉＲＮＡ応答性Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）^３０ｍＲＮＡを発現する一連のｒＡＡＶベクターゲノムを構築した（図１０ａ）。Ｇｌｕｃは、生きている動物の血液または尿中のレポーターの検出を可能にする、分泌タンパク質である。７つのｂｕｌｇｅｄｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７標的部位をＧｌｕｃｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入して、それをｍｉＲＮＡ応答性にした。Ｇｌｕｃ転写ユニットのイントロン内に、抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡどちらかのためのＵ６プロモーター駆動性発現カセットを挿入した。７つのｍｉＲＮＡ結合部位またはＴｕＤ発現カセットの片方または双方を欠くレポーターが、対照の役割を果たした。ｍｉＲ−１２２は肝臓中の全ｍｉＲＮＡの７０％を構成し^２７、最も豊富なｍｉＲＮＡ種であってもその機能を阻害するＴｕＤＲＮＡの能力のためのストリンジェントな試験となる。生体外では、ＨｕＨ−７細胞および抗ｍｉＲ−１２２中で、ＴｕＤＲＮＡは７つのｍｉＲ−１２２結合部位を保有するＧｌｕｃレポーターを抑制解除したが、抗ｌｅｔ−７中ではしなかった（図１０ｂ）。同様にＨｅＬａ細胞中では、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡは、７つのｌｅｔ−７結合部位を保有するＧｌｕｃレポーターを抑制解除した（図１０ｃ）。

ｍｉＲ−１２２およびｌｅｔ−７はどちらも肝臓^２７中に存在し、ｌｅｔ−７は心臓^３１中にもまた見られる。ｒＡＡＶゲノムは、肝臓および心臓に優先的に形質導入するＡＡＶ９カプシドによって、パッケージされる。形質導入をさらに改善するために、全てのｒＡＡＶを自己相補的（ｓｃ）ゲノムとして調製した^３２。ベクターを成体オスＣ５７Ｂ／６マウスに静脈内投与して、Ｇｌｕｃ活性を血液中でモニターした。最初に、Ｇｌｕｃ活性は、ＴｕＤＲＮＡ発現カセットの存在に関わりなく、ｍｉＲ−１２２調節レポーターを発現するベクターを注射した動物中で同等であった（３および７日目）。２週目には、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤを欠くベクターを投与したマウス中でＧｌｕｃ活性が低下したのに対し、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ発現ベクターで処理されたマウス中ではＧｌｕｃ活性は増大した（図１０ｄ）。同様に、ｌｅｔ−７調節レポーターを投与したマウス中でＧｌｕｃ活性は低く、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ発現カセットを含有する同一レポーターを投与したマウス中では高かった。ｍｉＲ−１２２調節Ｇｌｕｃレポーターとｌｅｔ−７調節Ｇｌｕｃレポーター間の１つの顕著な差は、ｌｅｔ−７調節レポーターが最も早い時点（３日目）でサイレンシングされたのに対し、ｍｉＲ−１２２調節レポーターはサイレンシングを達成する上で初期遅延を示したことであった（図１０、ｅ）。抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡのどちらかによるＧｌｕｃ発現の抑制解除は、１８週間の研究期間にわたり持続した（図１０ｄ、ｅ）。

マウス肝臓中のｓｃＡＡＶ９送達ＴｕＤＲＮＡ媒介特異的ｍｉＲＮＡの枯渇
ｓｃＡＡＶ９ベクター投与の４週間後、定量的ＲＴ−ＰＣＲ使用して、肝臓中でｍｉＲＮＡ発現を分析した。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤ発現ベクターを投与したマウス中では、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ発現ベクターまたはＴｕＤを欠く対照ベクターと比較して、ｍｉＲ−１２２の約８０％の低下が観察された（図１１ａ）。ノーザンブロット分析によって、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤを投与したマウス中のｍｉＲ−１２２の低下を確認した（図１１ｂおよび図１２）。ｌｅｔ−７は、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ発現ｓｃＡＡＶ９ベクターで処理したマウス中で同様に低下した（用いられたｌｅｔ−７Ｎｏｒｔｈｅｒｎプローブは、８つのマウスｌｅｔ−７アイソフォームを識別し得ない）。対照的に、他の２つの豊富な肝臓ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２６ａまたはｍｉＲ−２２では、低下は検出されなかった（図１１ｂおよび図１２）。

処理肝臓からのｍｉＲＮＡのハイスループット配列決定は、ｓｃＡＡＶ９送達ＴｕＤＲＮＡが、効果的かつ特異的に相補的ｍｉＲＮＡの破壊を引き起こすという見解をさらに指示する。ｍｉＲ−１２２（図７ｂ）を標的にするＴｕＤは、完全長２３ｎｔｍｉＲ−１２２の存在量を４．３倍（図１１ｃ）低下させ、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果（図１１ａ）と一致する。２１および２２ｎｔのｍｉＲ−１２２アイソフォームの低下がより少なかったのに対し、２０および１９ｎｔのアイソフォームは増大し、ｍｉＲ−１２２のＴｕＤ誘発性３’−５’ヌクレオチド末端加水分解トリミングが示唆される（図１１ｃ）。拮抗ｍｉｒが誘導するヒト細胞培養物中のｍｉＲＮＡ破壊^３３と同様に、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤは、ｍｉＲ−１２２の３’末端への非鋳型ヌクレオチドの付加を促進する（図１１ｄ）。最初はマウスゲノムに一致するが、次に非鋳型ヌクレオチドに終わる接頭辞マッチング読み取り配列は、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤを発現するマウス中で、対照と比較して倍になる（図１１ｄ）。３’非鋳型ヌクレオチドは、１つまたは複数のアデノシンを含んでなる。ＴｕＤ不在下であってさえも、ｍｉＲ−１２２の３０％はアデノシンでテーリングされ、おそらくはその自然の代謝回転の一部として、ｍｉＲ−１２２が転写後修飾を被ることが示唆される。

マウス肝臓は、全て８つのｌｅｔ−７アイソフォームを発現する（図１３）。これらのアイソフォームは、それらの共通シード配列の外側の１〜４ヌクレオチドが異なる（図１１ｅ）。抗ｌｅｔ−７ＴｕＤは、ＴｕＤ配列と完全に相補的な完全長ｌｅｔ−７アイソフォームの存在量（ｌｅｔ−７ａ、１２．１倍）、またはＴｕＤに対して単一非シードミスマッチのみを含有するｌｅｔ−７アイソフォームの存在量を強力に低下させる（ｌｅｔ−７ｃ、５．１倍；ｌｅｔ−７ｄ、５．０倍；およびｌｅｔ−７ｆ、１１．０倍）。対照的に、ＴｕＤに対して２つの３’ミスマッチを含有するｌｅｔ−７ｂ（１．６倍）およびｌｅｔ−７ｇ（２．７倍）、ＴｕＤに対して３つの３’ミスマッチを含有するｌｅｔ−７ｉ（１．５倍）、およびＴｕＤに対してプリン：プリンミスマッチをシード配列のすぐ側面にある９位に含有するｌｅｔ−７ｅ（３．６倍）では、低下はより小さかった（図１１ｅ、１１ｆ）。接頭辞マッチング読み取りは、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤに応えて最も低下したｌｅｔ−７アイソフォームであるｌｅｔ−７ａ、ｃ、ｄ、およびｆでさらに増大したのに対し、減少が最も小さかったｌｅｔ−７ｂ、ｅ、ｇ、およびｉは、このようなトリムアンドテイル（ｔｒｉｍｍｅｄ−ａｎｄ−ｔａｉｌｅｄ）種では増大を示さなかった（図１１ｇ）。これらの知見は、抗ｌｅｔ−７ＴｕＤ誘導ｍｉＲＮＡｄｅｃａｙが、ＴｕＤ−ＲＮＡとｍｉＲＮＡの間に、ほぼ完璧な相補性を要求することを示す。抗ｍｉＲ−１２２および抗ｌｅｔ−７ＴｕＤのどちらでも、他のｍｉＲＮＡの全体的存在量に変化はなかった（図１４）。

ｓｃＡＡＶ９が送達する抗ｍｉＲＮＡＴｕＤＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡ調節ｍＲＮＡの発現を特に増大させる
ｓｃＡＡＶ９を使用して送達された場合、抗ｍｉＲＮＡＴｕＤＲＮＡもまた、ｄｍｉＲ−１２２調節内在性ｍＲＮＡおよびｌｅｔ−７調節内在性ｍＲＮＡを抑制解除する（図１５）。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＴｕＤ−発現ｓｃＡＡＶ９ベクター注射の４週間後、肝臓および心臓における、検証されたｍｉＲ−１２２およびｌｅｔ−７標的の発現を分析する。Ｇｌｕｃレポーターを発現するｓｃＡＡＶ９を注射したが、ＴｕＤＲＮＡは注射しなかったマウスが対照の役割を果たした。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡを発現するベクターで処理したマウスでは、先にｍｉＲ−１２２によって調節されることが示された４つの遺伝子である、アルドラーゼＡ（３．３±０．５；ｐ値≦０．０４）、Ｔｍｅｄ３（４．２±１．５；ｐ値≦０．０１）、Ｈｆｅ２（３．３±１．０；ｐ値≦０．０２）、およびサイクリンＧ１（２．５±０．４；ｐ値≦０．００１）ｍＲＮＡ^７，３４の２．５〜３．５倍の増大が肝臓中で検出され；これら４つのｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲ−１２２を欠く心臓中では変化しなかった（図１５）。抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡを発現するベクターを投与したマウスからの肝臓または心臓のどちらでも、４つのｍｉＲ−１２２調節ｍＲＮＡの発現に、統計的に有意な変化は見られなかった（図１５）。

ｍｉＲＮＡ−生成酵素Ｄｉｃｅｒ^２９それ自体は、ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡによって抑制される。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、抗ｍｉＲ−１２２または抗ｌｅｔ−７ＴｕＤＲＮＡのどちらかを発現するｓｃＡＡＶ９ベクターを投与したマウス中のＤｉｃｅｒｍＲＮＡの存在量を測定した（図１５）。ｌｅｔ−７が阻害された場合、ＤｉｃｅｒｍＲＮＡは肝臓（１．９±０．２；ｐ値≦０．００１）および心臓（２．４±０．４；ｐ値≦０．００３）の双方で増大する。ＲＡＳファミリー遺伝子、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＫＲＡＳもまた、ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡによって抑制されることが報告されている^{３５〜３７}。抗ｌｅｔ−７発現ｓｃＡＡＶ９を投与したが、抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡは投与しなかったマウスでは、対照と比較して、Ｎｒａｓの発現増大は、肝臓（１．３±０．１；ｐ値≦０．０１）および心臓（１．３±０．１；ｐ値≦０．０２）の双方で観察され、Ｈｒａｓ１（１．３±０．１；ｐ値≦０．０４）の発現増大は、心臓中で観察された（図１５）。

抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡはコレステロールレベルを低下させる
ｍｉＲ−１２２は、正常なコレステロール生合成のために必要である；ＡＭＯによるｍｉＲ−１２２の阻害は、成体マウス^{７，９，１１}および非ヒト霊長類^８，１０において、コレステロール代謝を低下させる。野生型マウスでは、抗ｍｉＲ−１２２ＲＮＡを発現するｓｃＡＡＶ９の単回静脈内注射が、注射後２週目に始まって、総血清コレステロール（４５±５％；ｐ値≦０．００１）および高密度リポタンパク（ＨＤＬ、４２±５％；ｐ値≦０．００１）レベルを顕著に低下させ、この低下は１８週間の研究継続期間にわたって持続した。第３週目にはＬＤＬレベルもまた低下し（８８±１０２％；ｐ値≦０．０５）、研究継続期間にわたって持続した。（図１６ａ）。抗ｌｅｔ−７ＴｕＤを投与したマウス中では、総血清コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬのレベルは変化しなかった。研究全体を通じて、マウスの体重および肝機能は正常であった：体重減少（図１７）、または血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの統計的に有意な増大は、検出されなかった（図１６ｂ）。

高コレステロールは、米国における最も一般的な死因および病因である心血管疾患の大きな危険因子である。ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の突然変異は、一般的遺伝性異脂肪血症、家族性高コレステロール血症^３８を引き起こす。ｒＡＡＶが媒介するＬＤＬ受容体の置換は、この遺伝障害の処置の有望なアプローチに相当するが、治療遺伝子産物に対する宿主の免疫によって制限されることもある^{３９，４０}。持続性のｍｉＲ−１２２阻害剤は、家族性高コレステロール血症の代案の治療法を提供し得る。ヒト疾患のマウスモデルを使用して、家族性高コレステロール血症の可能な処置として、ｓｃＡＡＶ９が送達する抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡを評価した：ＬＤＬＲ^−／−、Ａｐｏｂｅｃ１Ａ^−／−二重変異体マウスは、正常な普通固形飼料を与えられた^４１。抗ｍｉＲ−１２２ＴｕＤＲＮＡを発現するｓｃＡＡＶ９の単回静脈内投与の１ヶ月後、スクランブルＴｕＤ対照を投与したマウスと比較して、メスマウスでは、総血清コレステロールが３４±３％（ｐ値≦０．０００６）低下し、血清ＨＤＬが１８±２％（ｐ値≦０．０２）低下し、家族性高コレステロール血症の治療標的である血清ＬＤＬは、５３±６％（ｐ値≦０．００６）低下した（図１６ｃ）。オスマウスでは、総コレステロールの２１±１％（ｐ値≦０．０５）の低下、ＨＤＬの２６±２％（ｐ値≦０．００４）の低下、およびＬＤＬ２０±１％（ｐ値≦０．０２）の低下が測定された（図１６ｃ）。ＬＤＬＲ^−／−、Ａｐｏｂｅｃ１Ａ^−／−マウス中のコレステロール低下において観察された性差は、さらなる研究を正当化する。

考察
哺乳類ｍｉＲＮＡは多数あるので、それらの生物学的機能を同定することは難題である。ｍｉＲＮＡ機能の阻害剤は、特に成体哺乳類におけるｍｉＲＮＡの生物学の理解を加速させる見込みがある。ｍｉＲＮＡを阻害するストラテジーとしては、相補的化学修飾オリゴヌクレオチドおよび転写ｍｉＲＮＡ結合性競合ＲＮＡが挙げられる。効果的なｍｉＲＮＡ阻害剤である化学修飾オリゴヌクレオチドは、目下高価である一方、いくつかの修飾は商業的に利用できず、また長期毒性の危険がある反復投与を要する。さらに多数の組織は、目下オリゴヌクレオチド送達のためにアクセスできない。

転写ｍｉＲＮＡ結合性ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドの代替物を提供する。それらの転写物の小さなサイズは、それらを多様な遺伝子移入ベクター内に容易に組み込めるようにする。霊長類ＡＡＶ由来ベクターは、それらのユニークな組織向性、高い形質導入効率、生体内遺伝子移入の安定性、および低毒性のために、本出願の魅力的なツールに相当する^{２２，４２}。

最近、ｍｉＲＮＡ拮抗薬のいくつかのデザイン、すなわちｓｐｏｎｇｅ、ＴｕＤＲＮＡ、およびｍｉＲＺｉｐが開発され、生体外においてレンチウイルスベクター内で^{１２，１５}、そして生体内において遺伝子ノックアウト動物モデルで^{１３，１４，１６}試験されている。これらのｍｉＲＮＡ拮抗薬を生体外で比較し、最も有効なデザインであるＴｕＤＲＮＡを生体内で使用して、ＴｕＤ発現カセットをｓｃＡＶＶ９に組み込むことで、ｍｉＲ−１２２およびｌｅｔ−７を阻害した。本明細書で提供されるデータは、ＴｕＤＲＮＡを発現するｒＡＡＶ９の単回投与が、標的ｍｉＲＮＡレベルの安定かつ効率的な低下を提供し（図１１）、その内在性標的ｍＲＮＡの発現増大をもたらして（図８および１５）、代謝における表現型の変化に相当することを実証する（図１６）。本明細書で提供されるハイスループット配列決定データは、最近遺伝子改変^３３および内在性ｍＲＮＡ^４３についてハエで、そして合成オリゴヌクレオチド「ａｎｔａｇｏｍｉｒｓ」について培養ヒトＨｅＬａ細胞^３３中で記載されたのと同じ、標的ＲＮＡ誘発テーリングおよびトリミング経路を通じて、マウス中で、ＴｕＤＲＮＡが、それらのｍｉＲＮＡ標的を阻害することを示唆する（図１１）。生きている哺乳類中における、標的ＲＮＡが誘導するｍｉＲＮＡテーリング、トリミング、および破壊の初めての観察である、本明細書で提示されるデータは、この経路が動物で広く保存されていることもあり得ることを示唆する。

今まで、生きている成体哺乳類中でｍｉＲＮＡ機能をモニターする方法は、記述されていなかった。本明細書に記載される生体内Ｇｌｕｃセンサーシステムは、ｍｉＲＮＡ阻害剤によって引き起こされるものなどの特定ｍｉＲＮＡ機能の変化を検出する、単純な手段を提供する（図１０）。このシステムは、生体外細胞系中で、または生体内組織または臓器中で、特定ｍｉＲＮＡの活性を評価できるようにし、経時的に生きている動物中におけるｍｉＲＮＡ拮抗薬の有効性の定量的尺度を提供する。

遡及的プロファイリングは、異常なｍｉＲＮＡ発現を多様な疾患と関連づけ、ｍｉＲＮＡが治療法のための新たな標的を提供してもよいことを示唆した^{４４〜４８}。実際、ＡＭＯ^７〜１１またはｓｃＡＡＶが送達するＴｕＤＲＮＡによるｍｉＲ−１２２阻害（図１６）は、ＨＤＬおよびＬＤＬの双方を低下させる。しかし、ＨＤＬが心臓麻痺を防ぐという現在の見解^４９は、異脂肪血症の治療法はＬＤＬ低下させ、ＨＤＬレベルを上昇させることであると主張する。最近、ｍｉＲ−３３はＨＤＬバイオジェネシスのリプレッサーとして同定された；ｍｉＲ−３３阻害は、血清ＨＤＬレベルを上昇させる^１６。おそらくは、単一ｓｃＡＡＶベクターから発現される１対のＴｕＤＲＮＡによるｍｉＲ−１２２とｍｉＲ−３３の同時阻害が、より均衡のとれた健康的なコレステロールプロフィールを達成して、家族性高コレステロール血症に対する長期治療法を提供してもよい。

直接的因果関係は確立されていないものの^{５１，５２}、低いｍｉＲ−１２２レベルは、齧歯類およびヒトにおける肝細胞がんと関連づけされている^{５０〜５２}。ＡＡＶベクターの発現は、齧歯類および霊長類モデル中で多年にわたり安定しているので、抗ｍｉＲ−１２２を発現するｓｃＡＡＶ９で処理された動物は、特に肝細胞がんを発症する一般的リスクおよびリスク増加における、長期ｍｉＲ−１２２阻害の安全性試験を可能にするであろう。

材料と方法
ｍｉＲＮＡ拮抗薬およびセンサープラスミドの構築
ｐＲＮＡ−Ｕ６．１／Ｎｅｏ−ｓｉＦｌｕｃ中のｓｉＦｌｕｃ断片（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を先に記載された（http://www.systembio.com/micrornaresearch/microrna-knockdown/mirzip/）ようにデザインされた^{１２，１５}、ＴｕＤｍｉＲ−１２２、ＴｕＤｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１２２Ｚｉｐ、ｌｅｔ−７Ｚｉｐ、ｍｉＲ−１２２ｓｐｏｎｇｅおよびｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅで置換して、異なるｍｉＲＮＡ拮抗薬の発現のためのＵ６駆動性発現カセットを作成した。ｌｅｔ−７拮抗薬のデザインは、全てのｌｅｔ−７ファミリーメンバーの共通配列に基づいた。オリゴヌクレオチド対、ＸｂａＩ−ＡｐａＩリンカーＦ、およびＸｂａＩ−ＡｐａＩリンカーＲ（表２）をアニーリングしてＸｂａＩ−ＡｐａＩリンカーを作成し、ｐＧＬ３−対照プラスミド中のＦｌｕｃ遺伝子後のＡｐａＩ部位へのクローニングが、それに続いた。ＸｂａＩおよびＡｐａＩ部位に挟まれた化学合成ｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅ配列を消化して、ｐＧＬ３−ＸｂａＩ−ＡｐａＩリンカープラスミド中にクローンし、ＳＶ４０プロモーター駆動性ｓｐｏｎｇｅ発現カセットを作り出した。次に、ｐＧＬ３ｍｉＲ−１２２ｓｐｏｎｇｅまたはｐＧＬ３ｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅから、ＮｃｏＩおよびＡｐａＩ二重消化によって、Ｆｌｕｃ遺伝子とｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７ｓｐｏｎｇｅとを含有する断片を単離して、ｐＡＡＶＣＢＰＩベクタープラスミドのＫｐｎＩ部位、またはｐＡＡＶＴＢＧＰＩベクタープラスミドのＰｓｔＩおよびＭｌｕＩ部位の間にクローンして、それぞれＣＢプロモーターおよびＴＢＧプロモーター駆動性ｓｐｏｎｇｅ発現ベクターを作成した。

ｍｉＲＢａｓｅ中のアノテートされたｍｉＲＮＡ配列^５３に基づいて、完璧に相補的なｍｉＲＮＡ標的部位の１または３コピーをデザインし、合成オリゴヌクレオチドを使用して、遍在的に発現したｐＡＡＶＣＢ核標的β−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）プラスミドのｎＬａｃＺ発現カセットの３’ＵＴＲ中のＢｓｔＢＩ制限部位に挿入した（表２）。ｍｉＲ−１２２を発現するために、特定オリゴヌクレオチドがあるマウスゲノムＤＮＡから、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２断片をＰＣＲによって増幅し（表２）、ｐＡＡＶＣＢＦｌｕｃプラスミド中のホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ直後のＸｂａＩ制限部位にクローンした。ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２の同一性を配列決定によって確認した。この研究で使用したｓｃＡＡＶ９ベクターは、前述^１８のようにして、作成、精製、および力価測定した。

ＡＡＶベクターを作り出すために、ｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７のための７コピーのｂｕｌｇｅｄ標的部位を合成し、ｐｓｃＡＡＶＣＢＰＩＧｌｕｃプラスミド中のＧｌｕｃレポーター遺伝子後のＢｃｌＩ部位にクローンした。ｐＲＮＡ−Ｕ６．１／Ｎｅｏ−ＴｕＤｍｉＲ−１２２またはｐＲＮＡ−Ｕ６．１／Ｎｅｏ−ＴｕＤｌｅｔ−７プラスミドから、Ｕ６−ＴｕＤｍｉＲ−１２２またはＵ６−ＴｕＤｌｅｔ−７発現カセットを持つＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離し、ｍｉＲ−１２２またはｌｅｔ−７のためのｂｕｌｇｅｄ標的部位があるまたはないｐｓｃＡＡＶＣＢＰＩＧｌｕｃのイントロン領域中のＰｐｕＭＩ部位にクローンした。

細胞培養
１０％ＦＢＳおよび１００ｍｇ／Ｌのペニシリン−ストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＳｏｕｔｈＬｏｇａｎ，ＵＴ）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地中で、ＨＥＫ２９３、ＨｕＨ−７、およびＨｅＬａ細胞を培養した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で維持した。リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、製造会社の使用説明に従って、プラスミドを細胞中に一過性に形質移入した。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ
細胞を受動的溶解緩衝液（Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で溶解し、１０μｌの溶解物をアッセイのために使用した。Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、製造会社の使用説明に従って、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を評価した。以前記載された手順^３０に従って、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）アッセイを実施した。簡単に述べると、生体外Ｇｌｕｃアッセイのために、示される形質移入からの各１０μｌの培養液を使用した。生体内でＧｌｕｃ発現をモニターするために、ＡＡＶ９ベクター処理後の異なる時点で、５．５ｍｍ動物用ランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎｔ，Ｍｉｎｅｏｌａ，ＮＪ）によって作成した顔面静脈の浅い切り込みから、研究動物を出血させた。Ｇｌｕｃアッセイのために、各５μｌの血液サンプルを使用した。

マウス
Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Massachusetts Medical Schoolのガイドラインに準じて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＬＤＬＲ^−／−／Ａｐｏｂｅｃ１Ａ^−／−マウス（Ｄｒ．ＪａｍｅｓＷｉｌｓｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を維持し、研究で使用した。尾静脈注射によって、１×１０^１２個のゲノムコピー／マウスまたは５×１０^１３個のゲノムコピー／ｋｇのＡＡＶベクターで、４〜６週齢の野性型Ｃ５７ＢＬ／６オスマウスを処理した。ｓｃＡＡＶ９ＴｕＤｍｉＲ１２２の治療能力を評価するために、尾静脈注射によって、用量３×１０^１１個のゲノムコピー／マウスまたは１．５×１０^１３個のゲノムコピー／ｋｇのＴｕＤ−ｍｉＲ−１２２またはスクランブルベクターで、４〜６週齢のＬＤＬＲ^−／−／Ａｐｏｂｅｃ１Ａ^−／−マウスを処理した。研究動物の脂質プロフィールをモニターするために、ＡＡＶ９ベクター注射後の異なる時点で血清サンプルを収集し、ＣＯＢＡＳＣ１１１分析器（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）上で、総コレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬについて分析した。ＲＮＡ分析のためには、処理の４週間後に動物を解剖した；肝臓および心臓組織をＲＮＡ調製のために採取した。

ｑＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、製造会社の使用説明に従って抽出した。全ＲＮＡ（０．５〜１μｇ）をランダムヘキサマーでプライムし、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で逆転写した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）内で、ＧｏＴａｑｑＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、０．３μＭの遺伝子特異的プライマー対を用いて、定量的ＰＣＲ反応を三連で実施した（表２）。ＴａｑＭａｎｍｉｃｒｏＲＮＡＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、成熟ｍｉＲ−１２２およびＵ６の発現をアッセイした。

ノーザンブロット分析
全肝臓ＲＮＡ中のｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２、およびｌｅｔ−７を検出するために、１０μｇの全ＲＮＡを変性１５％ポリアクリルアミドゲルによって分離し、ＨｙｂｏｎｄＮ＋ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に転写して、２５４ｎｍ光（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）で架橋した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、γ−^３２ＰＡＴＰで５’末端標識した合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（表２）をｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２およびｌｅｔ−７およびＵ６（表２）のためのプローブとして使用し、Ｃｈｕｒｃｈ緩衝液（０．５ＭＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１ｍＭＥＤＴＡ、７％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ）中で３７℃でハイブリダイズした。１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ緩衝液を使用してメンブランを洗浄し、次にＦＬＡ−５１００Ｉｍａｇｅｒ（日本国東京の富士フイルム）を使用して視覚化した。

小型ＲＮＡ配列決定
記載されたようにして^３３、小型ＲＮＡライブラリーを構築し配列決定した。簡単に述べると、ｍｉｒＶａｎａキット（ＡｍｂｉｏｎＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）によって５０μｇの全ＲＮＡを単離し、１９〜２９ｎｔの小型ＲＮＡを分離して、１５％ポリアクリルアミド／尿素ゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，ＮａｔｉｏｎａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）を使用して、ゲル電気泳動により単離した。トランケート型Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、ＩＤＴｍｉＲＮＡクローニングリンカー１を小型ＲＮＡの３’にライゲートし、ゲル精製した；Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって、５’ＲＮＡアダプターを３’ライゲートＲＮＡにライゲートした。ライゲーション生成物を小型ＲＮＡＲＴプライマーによる逆転写のための鋳型として使用した。小型ＲＮＡＰＣＲプライマー１およびＲＮＡＰＣＲプライマー２で、ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製して、ハイスループット配列決定にかけた。配列決定統計については、表３および４を参照されたい。小型ＲＮＡ分析は、先に記載されたようにして^３３実施した。配列データはＮＣＢＩＳｈｏｒｔＲｅａｄＡｒｃｈｉｖｅ（www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/sra）を通じて、ＧＳＥ２５９７１として入手できる。

ウエスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤混合物を含有するＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ４０［ｖ／ｖ］、１％デオキシコール酸ナトリウム［ｗ／ｖ］、０．１％ＳＤＳ［ｗ／ｖ］）（ＢｏｓｔｏｎＢＰ）で、タンパク質を抽出した。ブラッドフォード法を使用して、タンパク質濃度を測定した。各５０μｇのタンパク質サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲルに載せて電気泳動し、ニトロセルロースメンブラン（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，）に転写した。ＬＩ−ＣＯＲ赤外線撮像システムを使用して、免疫ブロット法を実施した。簡単に述べると、メンブランをブロック緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）で室温で２時間ブロックし、それに続いて抗ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗Ｄｉｃｅｒ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）のどちらかと共に、室温で２時間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）添加ＰＢＳによる３回の洗浄後、ＬＩ−ＣＯＲＩＲＤｙｅに対する二次抗体コンジュゲートを使用して、メンブランを室温で１時間インキュベートした。シグナルは、ＯｄｙｓｓｅｙＩｍａｇｅｒ（ＬＩＣＯＲ）を使用して検出した。

統計学的分析
全ての結果は平均±標準偏差として提示され、マンホイットニー検定を使用してｐ値が計算された図１６ｃ以外は、両側スチューデントのｔ試験を使用して、実験群間で比較される。

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上に列挙される参考文献１〜５３、および本明細書で特定される全てのその他の参考文献、出版物、またはデータベースエントリーは、それぞれの各参考文献、出版物、またはデータベースエントリーが、参照によって具体的に個々に援用されたかのように、参照によって本明細書に援用する。矛盾がある場合は、本開示が優先する。

本発明は、その応用において、この説明に記載されるまたは図面に示される、構成要素の構築および配置の詳細に限定されるものではない。本発明は、その他の実施形態が可能であり、様々なやり方で実行されまたは実施され得る。また本明細書で使用される表現法および用語法は、説明を目的とするものであって、限定的と見なすべきではない。本明細書で使用される「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」または「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ」、およびそのバリエーションは、その後に列挙される項目それ自体、およびその同等物ならびに追加項目を包含することが意図される。

請求項構成要素を修飾するための、特許請求の範囲中の「第１の」、「第２の」、「第３の」などの序数用語の使用は、単独では、１つの請求項構成要素の他に対するいかなる優先、先行、または順序も、またはその中で方法の行為が実行される時間的順序も包摂しないが、単に特定の名称を有する１つの請求項構成要素を（序数用語の使用を別にすれば）同じ名称を有する別の要素から識別する標識として使用されて、請求項構成要素を識別する。

このように本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明したが、様々な変更、修正、および改善が、当業者によって容易に行われるものと理解されたい。このような変更、修正、および改善は、本開示の一部であることが意図され、本発明の精神と範囲内であることが意図される。したがって前述の説明および図面は、単なる例である。

Claims

対象中でｍｉＲ−１２２の発現を阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤を発現する、少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与するステップを含んでなる、対象中で高コレステロール関連障害を治療する方法。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなる、請求項１に記載の方法。
前記ｍｉＲ−１２２結合部位が２つのステム配列で挟まれる、請求項１または２に記載の方法。
前記ｍｉＲ−１２２結合部位が、前記ｍｉＲ−１２２と相補的な２つの部分で挟まれる、ｍｉＲ−１２２と相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が第１のｍｉＲ−１２２結合部位および第２のｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなり、第１のステム配列がその５’末端で前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置し、第２のステム配列がその３’末端で前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に、そしてその５’末端で前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置し、第３のステム配列がその３’末端で前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の側面に位置する、請求項１に記載の方法。
前記２つのｍｉＲ−１２２阻害剤結合部位のそれぞれが、ｍｉＲ−１２２と相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項５に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である、請求項６に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分と１〜５ヌクレオチドで相補的である、請求項６または７に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分と３ヌクレオチドで相補的である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、４ヌクレオチドの長さを有する、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位の前記非結合中央部分が、４ヌクレオチドの長さを有する、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合および前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位が、２〜１０ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲ−１２２結合および前記第２のｍｉＲ−１２２結合部位が、４ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、２つ以上のｍｉＲ−１２２結合部位を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号１、配列番号５、配列番号２１、または配列番号２３に記載の配列を含んでなる、またはそれからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶが、配列番号３に記載の配列を有する、ＡＡＶ９血清型カプシドを有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶが、前記ＡＡＶ９血清型カプシドの変種であるカプシドを有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶが、配列番号４に記載の配列を有する、ＡＡＶ９血清型変種Ｃｓｐ−３カプシドを有する、請求項２１に記載の方法。
前記ｒＡＡＶが、肝臓組織を標的とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶが、肝臓組織を形質導入する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶの有効量が、１０^１０、１０^１１、１０^１２、または１０^１３個のゲノムコピーである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
投与が静脈内に実施される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
投与が肝臓門脈内への注入によって実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または非ヒト霊長類である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、高コレステロール関連障害の動物モデルである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
前記高コレステロール関連障害が、Ｉ型、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高リポタンパク血症である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
前記高コレステロール関連障害が、糖尿病、代謝症候群、腎臓疾患（ネフローゼ症候群）、甲状腺機能低下、クッシング症候群、神経性食欲不振症、睡眠剥奪、ジーブ症候群、抗レトロウイルス薬、食餌、高体重、または低身体活動量に付随する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトであり、前記高コレステロール関連障害が２００ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がマウスであり、前記高コレステロール関連障害が１００ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がラットであり、前記高コレステロール関連障害が７０ｍｇ／ｄｌ以上の総血清コレステロールレベルによって特徴付けられる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）（ｉ．）タンパク質コーディング領域、および
（ｉｉ．）試験ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの結合部位
を含んでなる、導入遺伝子と作動的に連結する第１のプロモーター、および
（ｂ）ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域と作動的に連結する第２のプロモーター
を含んでなり、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が前記試験ｍｉＲＮＡと特異的に結合する、核酸ベクター。
前記第１のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項３６に記載の核酸ベクター。
前記第２のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項３６または３７に記載の核酸ベクター。
前記第１のプロモーターと前記タンパク質コーディング領域の少なくとも一部との間の第１の非翻訳領域をさらに含んでなり、前記第２のプロモーターおよび前記ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域が前記第１の非翻訳領域内に配置される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
前記第１の非翻訳領域が、前記完全長タンパク質コーディング領域の５’末端に配置される、請求項３９に記載の核酸ベクター。
前記第１の非翻訳領域が、前記タンパク質コーディング領域のイントロン内に配置される、請求項３９に記載の核酸ベクター。
前記導入遺伝子が第２の非翻訳領域をさらに含んでなり、前記試験ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの結合部位が前記第２の非翻訳領域内にある、請求項３６〜４１の少なくとも１ついずれか一項に記載の核酸ベクター。
前記第２の非翻訳領域が、前記完全長タンパク質コーディング領域の３’末端に配置される、請求項４２に記載の核酸ベクター。
前記第１のプロモーターおよび前記導入遺伝子の側面に位置する１対の逆方向末端反復をさらに含んでなる、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
前記１対の逆方向末端反復が、前記第２のプロモーターおよび前記ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域の側面にさらに位置する、請求項４４に記載の核酸ベクター。
前記タンパク質コーディング領域が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、およびβ−ラクタマーゼから選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
（ａ）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域が前記ｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、
（ｂ）前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の発現レベルを測定するステップと
を含んでなり、前記タンパク質の発現レベルが前記ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法。
前記細胞を前記試験ｍｉＲＮＡに接触させるステップをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
前記細胞が前記試験ｍｉＲＮＡを発現する請求項４７または４８に記載の方法。
前記試験ｍｉＲＮＡが哺乳類ｍｉＲＮＡである、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
前記試験ｍｉＲＮＡがヒトｍｉＲＮＡである、請求項３６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がｍｉＲＮＡｓｐｏｎｇｅ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｔｏｕｇｈｄｅｃｏｙＲＮＡである、請求項３６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域が前記ｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、第１の細胞を形質移入するステップと、
（ｂ）前記核酸ベクターで第２の細胞を形質移入するステップと、
（ｃ）前記第１の細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパクの質発現のレベルと、前記第２の細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の発現レベルを比較するステップと
を含んでなり、前記試験ｍｉＲＮＡのレベルが前記第１の細胞と比較して前記第２の細胞中でより低く、（ｃ）における比較の結果が前記ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法。
（ａ）前記ｍｉＲＮＡ阻害剤コーディング領域が前記ｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の核酸ベクターで、細胞を形質移入するステップと、
（ｂ）前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の第１の発現レベルを測定するステップと、
（ｃ）前記細胞を前記試験ｍｉＲＮＡに接触させるステップと、
（ｄ）前記細胞中の前記タンパク質コーディング領域によってコードされる前記タンパク質の第２の発現レベルを測定するステップと、
（ｅ）前記タンパク質の前記第１の発現レベルと前記第２の発現レベルを比較するステップと
を含んでなり、（ｅ）における比較の結果が前記ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を示す、ｍｉＲＮＡ阻害剤の有効性を評価する方法。
請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の核酸ベクターを収容する容器を含んでなる、ｍｉＲＮＡ阻害剤機能を評価するためのキット。
分子検出システムの構成要素を収容する容器を含んでなる、ｍｉＲＮＡ阻害剤機能を評価するためのキット。
第１のｍｉＲＮＡ結合部位および第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり、第１のステム配列がその５’末端で前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第２のステム配列がその３’末端で前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に、そしてその５’末端で前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第３のステム配列がその３’末端で前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、前記ｍｉＲＮＡ結合部位の少なくとも１つが複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、ｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記２つのｍｉＲＮＡ阻害剤結合部位のそれぞれが、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤によって標的とされる前記複数のｍｉＲＮＡのいずれとも相補的でない非結合中央部分を含んでなる、請求項５７に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分と少なくとも部分的に相補的である、請求項５８に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分と１〜５ヌクレオチドで相補的である、請求項５８または５９に記載の方法。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分と３ヌクレオチドで相補的である、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、４ヌクレオチドの長さを有する、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、１〜１０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、３〜５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の前記非結合中央部分が、４ヌクレオチドの長さを有する、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位および前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位が、２〜１０ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項５８〜６７のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位および前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位が、４ヌクレオチド長の配列で相補的である、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、２つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなる、請求項５７〜６９のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤がＴｕＤである、請求項５７〜７０のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、複数のｌｅｔ−７ファミリーメンバーを標的とする、請求項５７〜７１のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号１８の少なくとも８個の隣接ヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７１または７２に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号１８の最初の１０個のヌクレオチドおよび／または最後の１０個のヌクレオチドを含んでなる、請求項７３に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
前記ｍｉＲＮＡ阻害剤が、配列番号１８または配列番号２０のヌクレオチド配列を含んでなる、またはそれからなる、請求項５７〜７１のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
複数のｍｉＲＮＡから共通配列を得るステップと、
複数のｍｉＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を作成するステップと
を含んでなり、ｍｉＲＮＡ阻害剤が第１のｍｉＲＮＡ結合部位および第２のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでなり、第１のステム配列がその５’末端で前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第２のステム配列がその3’末端で前記第１のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に、そしてその５’末端で前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、第３のステム配列がその３’末端で前記第２のｍｉＲＮＡ結合部位の側面に位置し、ｍｉＲＮＡ阻害剤が複数の標的ｍｉＲＮＡの共通配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、方法。
前記共通配列が５〜４０ヌクレオチド長である、請求項７６に記載の方法。
前記ｍｉＲＮＡがＴｕＤである、請求項７６または７７に記載の方法。
配列番号２２、または配列番号２４のヌクレオチド配列を含んでなるｍｉＲＮＡ阻害剤。
細胞を請求項５７〜７５および７９のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤に接触させるステップを含んでなる方法。