CN117136238A - 包括填充多核苷酸序列的载体 - Google Patents

Abstract

本公开提供了：载体填充多核苷酸和其组合物，所述组合物包括表达构建体和载体，如病毒载体；以及向哺乳动物递送治疗剂(例如，抑制性核酸)或治疗疾病的方法。

Description

包括填充多核苷酸序列的载体

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是630264_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt。所述文本文件为163KB，创建于2022年2月4日，并通过EFS-Web以电子方式提交。

背景技术

已知腺相关病毒(AAV)载体基因组的大小受到限制，其中大约4.7kb的天然大小的载体大小被成功包装，但大得多的载体基因组会减少功能性AAV载体的产生(Wu等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》2010 18(1):80-86)。另一方面，显著小于载体基因组包装极限的载体基因组可能导致次优包装(Dong等人,《人类基因疗法(Human gene therapy)》19967:2101-2112)。而且，如果顺式质粒具有‘骨架’序列——如通常编码在细菌中繁殖质粒所需的细菌耐药性和抗生素耐药性的来源的元件——其大小接近预期的AAV载体基因组，则意外的‘反向包装’序列的量会增加(Hauck等人,《分子疗法》(2009)17:144-152)。出于这些原因，包括本身不会赋予包装的AAV不利的性质的‘填充序列’作为质粒骨架中的材料并且用于预期AAV有效载荷显著短于天然AAV包装大小的情况可能是有益的。Keiser等人,《自然医学(Nature Medicine)》(2021)27:1982-1989强调了惰性填充序列的重要性，其中表明具有填充序列的‘无有效载荷’AAV能够在非人灵长类动物中诱导显著毒性。

目前需要具有改进的包装特征的AAV载体。

附图说明

图1：在UCSC基因组浏览器上选择以鉴定碱基序列内的表达区、已知或预测的调控元件和重复元件(包括逆转录病毒和可转座元件)的轨道(track)。

图2A至2B示出了肝酶功能测试(图2A)天冬氨酸转氨酶(AST；U/L)和(图2B)丙氨酸转氨酶(ALT；U/L)，其是使用用媒剂或scAAV9载体静脉内给药的小鼠的经处理的血清在给药后13天测量的。与对照小鼠相比，仅含填充片段的载体都不具有ALT或AST的显著升高，而毒性阳性对照人工miRNA中的载体表达确实引起肝酶ALT和AST的显著升高(单因素方差分析(one-way ANOVA)，邓尼特多重比较检验(Dunnett′s multiple comparisons test))。除毒性阳性对照(N＝3)外，所有组均为N＝5。

图3A-3H：示出了柱纯化的scAAV9载体DNA的片段分析仪(Fragment Analyzer)迹线。使用代表性载体，图3A示出了标准高分子量双峰，其在mutITR(保留双峰；图3B)或wtITR(现在为单峰；图3C)的酶促切割时表明双峰代表全长群体。图3D标记了纯化的scAAV9载体DNA的片段分析仪迹线的3个组分：由最高分子量处的两个峰表示的全长载体、下一个峰或以miR为中心的截短，以及最后发生在填充序列内的截短。在图3E中是scAAV9 H1 MCS构建体PSG11_V1和PSG11_V2的迹线，分别为顶部迹线和底部迹线。在图3F所示的迹线中，当重叠时，与PSG11_V1相比，PSG11_V2具有更高的截短浓度。在图3G中是嵌入有人工miRNAmiR-1-1XD-14792(XD-14792在本文中也称为1784)的PSG11_V1载体(顶部)和PSG11_V2载体(底部)的片段分析仪迹线。图3H示出了图3G中的迹线的重叠。如由以miR为中心峰(箭头)的大小所证明的，与PSG11_V2相比，PSG11_V1中以miR为中心的截短减少。

图4A至4B示出了使用Mfold网络服务器预测的PSG11_V1(图4A)和PSG11_V2(图4B)的与人工miRNA和终止子相邻的200个核苷酸的二级结构。如由较小的负吉布斯自由能值和相对缺乏二级结构所证明的，与PSG11_V2相比，PSG11_V1具有更期望的与人工miRNA相邻的所预测DNA二级结构。

图5A至5B示出了载体结构研究的肝酶值(图5A-AST；图5B-ALT)。

图6示出了来自具有H1长启动子、miR-100骨架中的amiRNA3330和PSG11_V5填充片段(左)以及H1短启动子、miR-1-1骨架中的amRNA1784(在本文中也称为14792)和PSG11_V5填充片段(右)的代表性载体的成束RNAseq迹线。

图7：示出了在载体结构研究中测试的24个构建体的滴度。与H1天然启动子(中)和H1短启动子(右)相比，含有H1长启动子(左列)的载体始终具有更高的滴度。

图8A至8C示出了如通过片段分析仪平行毛细管电泳系统测量的具有AMELY_V3和PSG11_V5填充序列的scAAV9载体的miR和填充片段截短。在图8A中，跨所有3个启动子上下文、H1长(左小图)、H1天然(中小图)和H1短(右小图)以及不具有(圆圈)和具有(三角形)SV40聚腺苷酸化序列，在AMELY_V3和PSG11_V5载体两者中miR100与miR1-1相比具有更少的miR截短。在图8B中，与具有H1天然启动子和H1短启动子的载体相比，具有和不具有SV40聚腺苷酸化序列的具有H1长启动子的载体具有更少的填充片段截短。在图8C中，与具有H1天然启动子的载体和具有H1短启动子的载体相比，具有和不具有SV40聚腺苷酸化序列的具有H1长启动子的载体在组合的miR/填充片段截短方面具有更少的截短。

具体实施方式

在更详细地阐述本公开之前，对本发明的理解可能有助于提供本文所使用的某些术语的定义。贯穿本公开阐述了额外的定义。

在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包含所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。而且，除非另外指出，否则本文所述的涉及任何物理特征的任何数值范围，如聚合物亚基、尺寸或厚度应当理解为包含所述范围内的任何整数。如本文中所使用的，术语“约”是指所指定范围、值或结构的±20％，除非另外指明。应当理解，如本文所用，术语“一个”和“一种”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如，“或”)的使用应该理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，“包含”、“具有”和“包括”同义地使用，所述术语和其变体旨在被解释为非限制性的。

如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指由共价连接的核苷酸亚基组成的任何核酸聚合物，如聚脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸。核酸的实例包含RNA和DNA。

如本文所使用的，“RNA”是指包括一个或多个核糖核苷酸的分子，并且包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA、合成RNA、重组RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或替换一个或多个核苷酸而不同于天然RNA的经修饰的RNA。RNA分子的核苷酸可以包括标准核苷酸或非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸。

如本文所使用的，“DNA”是指包括一个或多个脱氧核糖核苷酸的分子，并且包含双链DNA、单链DNA、分离的DNA、合成DNA、重组DNA，以及通过添加、缺失、取代和/或替换一个或多个核苷酸而不同于天然DNA的经修饰的DNA。DNA分子的核苷酸可以包括标准核苷酸或非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸。

“分离的”是指从其自然环境中分离的或人工产生的物质。如本文关于细胞所使用的，“分离的”是指已从其自然环境(例如，从受试者、器官、组织或体液)中分离的细胞。如本文关于核酸所使用的，“分离的”是指已从其自然环境(例如，从细胞、细胞器或细胞质)分离的或纯化的、重组产生的、扩增的或合成的核酸。在实施方式中，分离的核酸包含载体内含有的核酸。

如本文所使用的，术语“野生型”或“非突变”形式的基因是指编码与正常或非致病性活性相关的蛋白质(例如，没有突变的蛋白质，所述突变如导致神经退行性疾病的发展、发作或进展风险更高的重复序列区域扩展)的核酸。

如本文所使用的，术语“突变”是指基因结构(例如，基因序列)的任何变化，其产生基因的改变的形式，所述基因的改变的形式可以传递给后代(遗传突变)或不传递给后代(体细胞突变)。基因突变包含DNA中单个碱基的取代、插入或缺失，或者基因或染色体的多个碱基或更大部分的取代、插入、缺失或重排，包含重复序列扩展。

如本文所使用的，术语“抑制性核酸”是指包括向导链序列的核酸，所述向导链序列与靶核酸，例如神经退行性疾病靶RNA、mRNA、mRNA前体或成熟mRNA的至少一部分杂交并且抑制其表达或活性。抑制性核酸可以靶向靶核酸的蛋白质编码区(例如，外显子)或非编码区(例如，5′UTR、3′UTR、内含子等)。在一些实施方式中，抑制性核酸是单链或双链分子。抑制性核酸可以进一步包括在单独链(例如，双链双链体)上或同一链(例如，单链、自退火双链体结构)中的过客链序列。在一些实施方式中，抑制性核酸是RNA分子，如siRNA、shRNA、miRNA或dsRNA。

如本文所使用的，“微小RNA”或“miRNA”是指能够通过靶mRNA的切割、靶mRNA的翻译抑制、靶mRNA降解或其组合介导靶基因沉默的小非编码RNA分子。通常，miRNA转录为发夹或茎环(例如，具有自互补的单链骨架)双链体结构，所述结构称为初级miRNA(pri-miRNA)，经过酶加工(例如，通过Drosha、DGCR8、Pasha等)成miRNA前体(pre-miRNA)。miRNA前体被输出到细胞质中，在那里其由Dicer酶加工以产生具有过客链的miRNA双链体，然后是单链成熟miRNA分子，所述单链成熟miRNA分子随后被加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。所提及的miRNA可以包含合成或人工miRNA。

如本文所使用的，“合成miRNA”或“人工miRNA”或“amiRNA”是指内源性、经修饰的或合成的初级miRNA或miRNA前体(例如，miRNA骨架或支架)，其中茎序列中的内源性miRNA向导序列和过客序列已被引起靶基因的高效RNA沉默的miRNA向导序列和miRNA过客序列替代(参见例如，Eamens等人《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》(2014)1062:211-224)。在一些实施方式中，所述向导序列和过客序列的互补性性质(例如，碱基数量、错配位置、凸起类型等)可以与构建所述合成miRNA的内源性miRNA骨架中所述向导序列和过客序列的互补性性质相似或不同。

如本文所使用的，术语“微小RNA骨架”、“miR骨架”、“微小RNA支架”或“miR支架”是指茎序列被所关注的miRNA替代的初级miRNA或miRNA前体支架，并且能够产生引起被所关注的miRNA靶向的基因的RNA沉默的功能性成熟miRNA。miR骨架包括5′侧接区(也称为5′miR上下文，≥9个核苷酸)、包括miRNA双链体(向导链序列和过客链序列)和基底茎(5′和3′，每个约4个至13个核苷酸)的茎区、包含末端环(对于末端环，>10个核苷酸)的至少一个环基序区、3′侧接区(也称为3′miR上下文，≥9个核苷酸)以及任选地茎中的一个或多个凸起。miR骨架可以完全或部分源自野生型miRNA支架或是完全人工序列。

如本文所使用的，抑制性核酸的术语“反义链序列”或“向导链序列”是指与靶向用于沉默的所述基因的所述mRNA的约10个到50个核苷酸(例如，约15个到30个、16个到25个、18个到23个或19个到22个核苷酸)区基本上互补(例如，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补)的序列。所述反义序列与靶mRNA序列充分互补以引起靶特异性沉默，例如，以通过RNAi机制或过程触发靶mRNA的破坏。在一些实施方式中，所述反义序列或向导链序列是指被Dicer切割后剩余的所述成熟序列。

如本文所使用的，术语抑制性核酸的“有义序列”或“过客链序列”是指与所述靶mRNA同源并且与抑制性核酸的所述反义链序列或向导链序列部分或完全互补的序列。抑制性核酸的所述反义链序列和有义链序列杂交形成双链体结构(例如，形成双链双链体或单链自退火双链体结构)。在一些实施方式中，所述有义序列或过客链序列是指被Dicer切割后剩余的所述成熟序列。

如本文所使用的，“双链体”在用于提及抑制性核酸时是指杂交在一起以形成双链体结构的两条核酸链(例如，向导链和过客链)。双链体可以由两条单独的核酸链或由具有自互补的区(例如，发夹或茎环)的单个核酸链形成。

如本文所使用的，术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链或单个自退火多核苷酸链中的核苷酸亚基之间的氢键形成。互补多核苷酸链可以以沃森-克里克方式(Watson-Crick manner)(例如，A与T、A与U、C与G)或以允许形成双链体的任何其它方式形成碱基对。如本领域技术人员显而易见的，当使用RNA而不是DNA时，认为与腺苷互补的碱基是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。此外，当在本发明的上下文中表示“U”时，可以理解其取代“T”的能力，除非另外说明。互补性还涵盖未经修饰的核碱基与经修饰的核碱基之间的沃森-克里克碱基配对(例如，5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶)。两条多核苷酸链之间的完全互补、完美互补或100％互补是其中一条多核苷酸链的每个核苷酸可以与第二条多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键。互补性百分比是指核酸分子中与对齐的参考序列(例如，靶mRNA、过客链)互补的连续核苷酸序列的核苷酸数除以核苷酸总数并乘以100。在此类对齐中，不形成碱基对的核碱基/核苷酸称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和缺失。本领域技术人员可以理解，在计算互补性时，只要保留核碱基的沃森-克里克碱基配对能力，就不会考虑对核碱基的化学修饰(例如，为了计算互补性百分比，5-甲基胞嘧啶被认为与胞嘧啶相同)。

两个或更多个核酸序列之间的“同一性百分比”是指由参考序列共享的核酸分子中连续核苷酸序列的核苷酸比例(即，同一性百分比＝相同核苷酸的数量/对齐的区中核苷酸的总数(例如，连续核苷酸序列)×100)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和缺失。本领域技术人员可以理解，在计算同一性时，只要保留核碱基的沃森-克里克碱基配对能力，就不会考虑对核碱基的化学修饰(例如，为了计算同一性百分比，5-甲基胞嘧啶被认为与胞嘧啶相同)。

如本文所使用的，术语“杂交(hybridizing或hybridizes)”是指两条核酸链在反平行链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的杂交强度可以通过解链温度(T_m)来描述，所述解链温度定义为在给定的离子强度和pH下，50％的靶序列与互补多核苷酸杂交的温度。

如本文所使用的，“表达构建体”是指任何类型的含有核酸的基因构建体(例如，转基因)，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方式中，表达包含核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。在一些实施方式中，转基因与表达控制序列可操作地连接。

如本文所使用的，术语“转基因”是指已经自然地或通过基因工程手段转移到另一个细胞中并且能够被转录和任选地翻译的外源性核酸。

如本文所使用的，术语“基因表达”是指核酸从核酸分子转录并且通常翻译成肽或蛋白质的过程。所述过程可以包含转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。提及“基因表达”的测量可以指转录产物(例如，RNA或mRNA)、翻译产物(例如，肽或蛋白质)的测量。

如本文所使用的，术语“抑制基因的表达”是指减少、下调、抑制、阻断、降低或停止所述基因的表达。基因的所述表达产物可以是从所述基因转录的RNA分子(例如，mRNA)或从所述基因转录的mRNA翻译的多肽。通常，mRNA水平的降低导致从其翻译的多肽水平的降低。可以使用用于测量mRNA或蛋白质的标准技术来确定表达水平。

如本文所使用的，“载体”是指能够在细胞之间转运核酸分子(例如，编码抑制性核酸的转基因)并且当可操作地连接到合适的表达控制序列时影响所述核酸分子表达的基因构建体。表达控制序列可以包括转录起始序列、终止序列(在本文中也称为终止子序列)、启动子序列和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强经编码的产物的分泌的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、转座子、粘粒、噬菌粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等。一旦转化到合适的宿主细胞中，所述载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者可以在一些情况下整合到所述基因组本身中。

如本文所使用的，“宿主细胞”是指含有或能够含有所关注的组合物(例如抑制性核酸)的任何细胞。在实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如啮齿动物细胞(小鼠或大鼠)或灵长类动物细胞(猴、黑猩猩或人)。在实施方式中，宿主细胞可以在体外或体内。在实施方式中，宿主细胞可以来自建立的细胞系或原代细胞。在实施方式中，宿主细胞是CNS的细胞，如神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。

如本文所使用的，“神经退行性疾病”或“神经退行性病症”是指表现出神经细胞死亡作为病理状态的疾病或病症。神经退行性疾病可以表现出慢性神经变性，例如，在若干年的时间段内缓慢的进行性神经细胞死亡，或者急性神经变性，例如，突然发作或神经细胞死亡。慢性神经退行性疾病的实例包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、2型脊髓小脑共济失调(SCA2)、额颞叶痴呆(FTD)和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。慢性神经退行性疾病包括以TDP-43蛋白病为特征的疾病，其特征在于细胞核到细胞质的错误定位、泛素化和高度磷酸化的TDP-43沉积到包涵体中、蛋白质截短导致毒性C端TDP-43片段的形成，以及蛋白质聚集。TDP-43蛋白病疾病包含ALS、FTD、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(G-PDC)、皮克氏病、海马硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。急性神经变性可能由缺血(例如，中风、外伤性脑损伤)、脱髓鞘引起的轴突横断或外伤(例如，脊髓损伤或多发性硬化)引起。神经退行性疾病可以表现出主要一种类型的神经元或多种类型的神经元的死亡。

如本文所使用的，“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指选择用于治疗或疗法的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包含人和非人哺乳动物，如灵长类动物(猴、黑猩猩)、牛、马、羊、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠、猪以及其转基因物种。

填充序列和表达构建体

AAV优先包装全长基因组，即与天然基因组大小大致相同且不太大或太小的基因组。然而，编码抑制性核酸序列的表达盒明显小于AAV全长基因组。为了避免包装片段化的基因组，可以将填充序列与包含异源核酸序列的表达构建体连接，并且侧接5′ITR和3′ITR以扩展可包装基因组，从而产生ITR之间的长度接近标准的基因组。通常，AAV的包装容量在5′ITR与3′ITR之间为约4.7kb。对于自互补AAV(scAAV)载体，包装容量在5′ITR与3′ITR之间为约2.4kb。

优选地，用于获得载体填充序列的起始序列是哺乳动物来源的，如人类来源的。可以调整填充序列的长度，使得载体基因组处于或接近AAV衣壳的(天然)包装极限。此外，载体填充序列可以被设计为在体内基因疗法的背景下最小化不良影响。例如，如果在基因组中发生整合并且启动意外转录的风险最小，则可以通过鉴定影响最小的序列来将人类基因组的区鉴定为载体填充序列的来源。因此，可以检查基因组的区，其中i)缺失和重复在群体中很常见并且与疾病相关表型无关(没有进化压力的证据)和/或ii)跨人类组织的RNA表达较低或不可检测(缺乏强大的内在增强子/启动子元件)。此外，载体填充序列可以被设计为使一个或多个元件减少、最小化、去除或缺少一个或多个元件以使载体序列惰性或安全。在一些实施方式中，载体填充序列被修饰为：减少或去除表达区(例如，任一侧的外显子+10bp，人EST)；减少或去除调控元件(例如，启动子序列、增强子序列、阻遏子序列、剪接供体或受体，或在人类基因组中发现的可能潜在地影响转基因转录的其它顺式作用元件)；减少或去除重复元件(例如，微卫星重复序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列)；减少、去除或修饰ATG密码子，以减少或消除由于潜在起始密码子而从充填或填充序列产生肽的可能性；减少或去除CpG二核苷酸以降低未甲基化CpG二核酸(来自细菌中产生的顺式质粒)诱导先天免疫反应的可能性；或其任何组合。本公开提供了具有一个或多个上述特征的载体填充序列，其进一步的优点是以下中的一者或多者：高滴度；低毒性；以及miRNA和/或填充序列中的减少的截短。

在一方面，本公开提供了一种载体填充序列，其包括长度为约1300至约2300个核苷酸并且与以下具有至少75％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ IDNO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ IDNO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1500-2000个核苷酸并且与以下具有至少75％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ IDNO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ IDNO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQID NO:50；或SEQ ID NO:51。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1600至1900个核苷酸并且与以下具有至少75％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ IDNO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ IDNO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQID NO:50；或SEQ ID NO:51。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括与以下具有至少80％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ IDNO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ IDNO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1,300-2,300个核苷酸、长度为约1,500-2,000个核苷酸或长度为约1,600-1,900的核酸。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括与以下具有至少85％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ IDNO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ IDNO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1,300-2,300个核苷酸、长度为约1,500-2,000个核苷酸或长度为约1,600-1,900的核酸。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括与以下具有至少90％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ IDNO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ IDNO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1,300-2,300个核苷酸、长度为约1,500-2,000个核苷酸或长度为约1,600-1,900的核酸。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括与以下具有至少95％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ IDNO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ IDNO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1,300-2,300个核苷酸、长度为约1,500-2,000个核苷酸或长度为约1,600-1,900的核酸。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括与以下具有至少97％同一性的核酸：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ IDNO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。在一些实施方式中，所述载体填充序列包括长度为约1,300-2,300个核苷酸、长度为约1,500-2,000个核苷酸或长度为约1,600-1,900的核酸。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ IDNO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；或SEQ ID NO:51。

在一些实施方式中，所述载体填充序列包括SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185或由其组成。

在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体，任选地其中所述AAV载体是自互补的。

在一些实施方式中，所述载体填充序列定位在包含异源核酸序列的表达构建体附近(例如，5′或3′)。在一些实施方式中，所述异源核酸序列编码治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂包含编码治疗性蛋白或抑制性核酸的核酸。在一些实施方式中，所述抑制性核酸包括siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA。在一些实施方式中，所述抑制性核酸包括靶向神经退行性疾病相关基因的siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA。在一些实施方式中，所述神经退行性疾病是脊髓小脑共济失调-2、肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆(dementiawith Lewy bodies)、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(dementia Parkinsonism ALS complex of guam，G-PDC)、皮克氏病(Pick′sdisease)、海马硬化症、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′sdisease)或阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)。在一些实施方式中，所述神经退行性疾病是多聚谷氨酰胺重复序列疾病。在一些实施方式中，所述抑制性核酸(例如siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA)靶向ATXN2。ATXN2是指由ATXN2基因编码的蛋白质，所述蛋白质含有多聚谷氨酰胺(polyQ，CAG重复序列)链。ATXN2基因或转录物可以指通常具有22个或23个重复序列的ATXN2的正常等位基因，或具有中等(～24个至32个重复序列)或更长重复序列扩展(～33个至>100个重复序列)的突变等位基因。在一些实施方式中，ATXN2是指哺乳动物ATNX2，包含人ATXN2。

在一些实施方式中，所述表达构建体包含编码靶向ATXN2的人工miRNA的异源核酸。表5中提供了编码向导序列和过客序列以及靶向ATXN2的人工miRNA的异源核酸的实例。提供了编码的向导、过客和人工miRNA序列的RNA格式，以及用于插入顺式质粒和rAAV载体中的DNA格式。在一些实施方式中，异源核酸编码靶向ATXN2的人工miRNA，并且包括选自SEQID NO:1-4和71的向导序列。在一些实施方式中，异源核酸编码人工miRNA，所述人工miRNA包含由SEQ ID NO:1提供的向导序列和由SEQ ID NO:5提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:2提供的向导序列和由SEQ ID NO:6提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:3提供的向导序列和由SEQ ID NO:7提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:4提供的向导序列和由SEQ ID NO:8提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:71提供的向导序列和由SEQ ID NO:72提供的过客序列。在一些实施方式中，所述异源核酸包括嵌入miRNA骨架(或支架)中的向导序列和过客序列。在一些实施方式中，所述miRNA骨架是miR-100或miR-1-1。在一些实施方式中，所述异源核酸编码由SEQ ID NO:9-12和73中的任一个提供的人工miRNA序列。靶向ATXN2的向导序列、过客序列、miR骨架和人工miRNA序列的额外实例提供在PCT公开WO2021/159008中，所述PCT公开通过引用整体并入。

在一些实施方式中，所述表达构建体进一步包含与转基因(例如，编码人工miRNA的核酸)可操作地连接的一种或多种表达控制序列(调控序列)。“可操作地连接的”序列包含与转基因邻接或以反式或远离转基因起作用以控制其表达的表达控制序列。表达控制序列的实例包括转录起始序列、终止序列、启动子序列、增强子序列、阻遏子序列、剪接位点序列、聚腺苷酸化(polyA)信号序列或其任何组合。

在一些实施方式中，启动子是内源性启动子、合成启动子、组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子(例如，CNS特异性)或细胞特异性启动子(神经元、胶质细胞或星形胶质细胞)。组成型启动子的实例包括劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)、SV40启动子和二氢叶酸还原酶启动子。诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(dexamethasone，Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素(tetracycline)抑制系统、四环素诱导系统、RU486诱导系统和雷帕霉素(rapamycin)诱导系统。可以使用的启动子的其它实例包括例如鸡β-肌动蛋白启动子(CBA启动子)、CAG启动子、H1启动子、CD68启动子、JeT启动子、突触蛋白启动子、RNA pol II启动子或RNA pol III启动子(例如，U6、H1等)。在一些实施方式中，所述启动子是组织特异性RNA pol II启动子。在一些实施方式中，所述组织特异性RNApol II启动子源自表现出神经元特异性表达的基因。在一些实施方式中，所述神经元特异性启动子是突触蛋白1启动子或突触蛋白2启动子。

在一些实施方式中，所述启动子是H1启动子。在一些实施方式中，所述H1启动子是在本文中称为“天然”H1启动子的启动子，如包含SEQ ID NO:53中所示的序列或由其组成的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是在本文中称为“短”H1启动子的启动子，如包含SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:17、25-28和37-44中的任一个的核苷酸113-203中所示的序列或由其组成的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是在本文中称为“长”H1启动子的启动子，如包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:13-16和18-24中的任一个的核苷酸113-343中所示的序列或由其组成的启动子。

在一些实施方式中，所述终止序列是SV40终止序列。SV40终止序列的实例在SEQID NO:77；SEQ ID NO:20、21、23和24中的任一个的核苷酸489-710；SEQ ID NO:31、32、35和36中的任一个的核苷酸358-579；SEQ ID NO:40、41和44中的任一个的核苷酸349-570中示出。

在一些实施方式中，编码本公开的抑制性核酸的序列位于表达构建体的非翻译区中。在一些实施方式中，编码本公开内容的抑制性核酸的序列位于表达构建体的内含子、5′非翻译区(5′UTR)或3′非翻译区(3′UTR)中。在一些实施方式中，编码本公开的抑制性核酸的序列位于启动子下游和表达基因上游的内含子中。

载体和宿主细胞

在另一方面，提供了包括本公开的载体填充序列的载体。载体可以是质粒、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)或病毒载体。病毒载体的实例包括疱疹病毒(HSV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、杆状病毒载体等。在一些实施方式中，逆转录病毒载体是小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)载体)、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒或禽网状内皮增生症病毒载体。在一些实施方式中，慢病毒载体是HIV(人类免疫缺陷病毒，包含HIV 1型和HIV2型、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV))、马传染性贫血病毒或维斯纳-梅迪病毒载体(Maedi-Visna viral vector)。

在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体，如重组AAV(rAAV)载体，所述重组AAV载体通过重组方法产生。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括本公开的载体填充序列和包含异源核酸序列(例如，编码抑制性核酸)的表达构建体。所述载体填充序列可以定位在与包含异源核酸的表达构建体的5′或3′接邻。

AAV是单链、非包膜的DNA病毒，其基因组编码用于复制(rep)的蛋白质和衣壳(Cap)，侧接两个ITR，所述ITR作为病毒基因组复制的起点。AAV还含有包装序列，从而允许将病毒基因组包装到AAV衣壳中。重组AAV载体(rAAV)(也称为rAAV载体基因组或rAAV基因组)可以通过使用分子方法从AAV中移除全部或部分野生型基因组(例如，Rep、Cap)，并且用如异源核酸序列(例如，编码抑制性核酸的核酸分子)等非天然核酸取代从AAV的野生型基因组中获得。通常，对于AAV，一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在所述rAAV载体中。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括侧接所述表达构建体和所述载体填充序列的5′反向末端重复序列(ITR)和3′ITR。功能性ITR序列对于AAV病毒颗粒的挽救、复制和包装是必需的。因此，rAAV载体在本文中被定义为至少包含以顺式方式复制和包装病毒所需的那些序列(例如，功能性ITR)。所有其它病毒序列都可以以反式提供。在一些实施方式中，所述rAAV仅保留来自AAV基因组的5′ITR和3′ITR，以便最大化可以由载体有效包装的转基因的大小。在一些实施方式中，每个AAV ITR是全长ITR(例如，长度约为145bp，并且含有功能性Rep结合位点(RBS)和末端解离位点(trs))。在一些实施方式中，所述ITR中的一个或两个被修饰，例如，通过插入、缺失或取代，条件是所述ITR提供功能性挽救、复制和包装。在一些实施方式中，经修饰的ITR缺少功能性末端解离位点(trs)并用于产生自互补的AAV载体(scAAV载体)。在一些实施方式中，所述rAAV载体是自互补的AAV载体，所述自互补的AAV载体包括在5′侧的突变体ITR(缺乏末端解离位点)和在3′侧的野生型AAV ITR。缺乏末端解离位点的突变体5′ITR的实例在SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:13-24、29-44和78-82中的任一个的核苷酸1-106中示出。在一些实施方式中，经修饰的ITR是被称为AITR的AAV2 ITR的截短版本(D序列和TRS缺失)。

在一些实施方式中，所述rAAV载体包括包含以下或由以下组成的5′ITR：SEQ IDNO:57；或SEQ ID NO:13-24、29-44和78-82中的任一个的核苷酸1-106。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括包含以下或由以下组成的3'ITR：SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸2192-2358；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸2214-2358；SEQ ID NO:17的核苷酸2229-2395；SEQ ID NO:17的核苷酸2251-2395；SEQ ID NO:18的核苷酸2184-2350；SEQ ID NO:18的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:19的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:20的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:21的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:22的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:23的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:24的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:25的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:26的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:27的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:28的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:29的核苷酸2266-2410；SEQ ID NO:30的核苷酸2224-2368；SEQ ID NO:31的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:32的核苷酸2225-2369；SEQ ID NO:33的核苷酸2266-2410；SEQ ID NO:34的核苷酸2224-2368；SEQ ID NO:35的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:36的核苷酸2225-2369；SEQ ID NO:37的核苷酸2257-2401；SEQ ID NO:38的核苷酸2258-2402；SEQ ID NO:39的核苷酸2215-2359；SEQ ID NO:40的核苷酸2207-2351；SEQ ID NO:41的核苷酸2207-2351；SEQ ID NO:42的核苷酸2257-2401；SEQ ID NO:43的核苷酸2215-2359；SEQ ID NO:44的核苷酸2207-2351；SEQ ID NO:78的核苷酸2258-2402；SEQ ID NO:79的核苷酸2267-2411；SEQ ID NO:80的核苷酸2251-2395；SEQ ID NO:81的核苷酸2251-2395；SEQ ID NO:82的核苷酸2187-2331。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括：包含SEQ ID NO:57或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:58或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:13的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:13的核苷酸2192-2358或由其组成的3'ITR；包含SEQ ID NO:14的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:14的核苷酸2192-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:15的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:15的2192-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:16的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:16的2192-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:17的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ IDNO:17的核苷酸2229-2395或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:18的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:18的核苷酸2184-2350或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:13的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:13的核苷酸2214-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:14的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:14的核苷酸2214-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:15的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:15的2214-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:16的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:16的2214-2358或由其组成的3′ITR；包含SEQ IDNO:17的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:17的核苷酸2251-2395或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:18的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:18的核苷酸2206-2350或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:19的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:19的核苷酸2206-2350或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:20的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:20的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:21的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:21的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:22的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:22的核苷酸2206-2350或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:23的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:23的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:24的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:24的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:25的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ IDNO:25的核苷酸2161-2305或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:26的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:26的核苷酸2161-2305或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:27的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:27的核苷酸2161-2305或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:28的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:28的核苷酸2161-2305或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:29的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:29的核苷酸2266-2410或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:30的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:30的核苷酸2224-2368或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:31的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:31的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:32的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQID NO:32的核苷酸2225-2369或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:33的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:33的核苷酸2266-2410或由其组成的3′ITR；包含SEQ IDNO:34的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:34的核苷酸2224-2368或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:35的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:35的核苷酸2216-2360或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:36的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:36的核苷酸2225-2369或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:37的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:37的核苷酸2257-2401或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:38的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:38的核苷酸2258-2402或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:39的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:39的核苷酸2215-2359或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:40的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:40的核苷酸2207-2351或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:41的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:41的核苷酸2207-2351或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:42的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ IDNO:42的核苷酸2257-2401或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:43的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:43的核苷酸2215-2359或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:44的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:44的核苷酸2207-2351或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:78的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:78的核苷酸2258-2402或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:79的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:79的核苷酸2267-2411或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:80的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:80的核苷酸2251-2395或由其组成的3′ITR；包含SEQ ID NO:81的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:81的核苷酸2251-2395或由其组成的3′ITR；或包含SEQ ID NO:82的核苷酸1-106或由其组成的5′ITR和包含SEQ ID NO:82的核苷酸2187-2331或由其组成的3′ITR。

在一些实施方式中，所述rAAV载体是哺乳动物血清型AAV载体(例如，AAV基因组和源自哺乳动物血清型AAV的ITR)，包含灵长类动物血清型AAV载体或人血清型AAV载体。在一些实施方式中，所述rAAV载体是嵌合AAV载体。在一些实施方式中，所述ITR选自以下AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV 12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5或其变体。

在一些实施方式中，所述异源核酸序列编码治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂包含编码治疗性蛋白或抑制性核酸的核酸。在一些实施方式中，所述抑制性核酸包括siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA。在一些实施方式中，所述抑制性核酸包括靶向神经退行性疾病相关基因的siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA。在一些实施方式中，所述神经退行性疾病是脊髓小脑共济失调-2、肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(G-PDC)、皮克氏病、海马硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。在一些实施方式中，所述神经退行性疾病是多聚谷氨酰胺重复序列疾病。在一些实施方式中，所述抑制性核酸(例如siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA)靶向ATXN2。在一些实施方式中，ATXN2是指哺乳动物ATNX2，包含人ATXN2。

在一些实施方式中，所述表达构建体包含编码靶向ATXN2的人工miRNA的异源核酸。表5中提供了编码向导序列和过客序列以及靶向ATXN2的人工miRNA的异源核酸的实例。提供了编码的向导、过客和人工miRNA序列的RNA格式，以及用于插入顺式质粒和rAAV载体中的DNA格式。在一些实施方式中，异源核酸编码靶向ATXN2的人工miRNA，并且包括选自SEQID NO:1-4和71的向导序列。在一些实施方式中，异源核酸编码人工miRNA，所述人工miRNA包含由SEQ ID NO:1提供的向导序列和由SEQ ID NO:5提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:2提供的向导序列和由SEQ ID NO:6提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:3提供的向导序列和由SEQ ID NO:7提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:4提供的向导序列和由SEQ ID NO:8提供的过客序列。在一些实施方式中，异源核酸包括由SEQ ID NO:71提供的向导序列和由SEQ ID NO:72提供的过客序列。在一些实施方式中，所述异源核酸包括嵌入miRNA骨架(或支架)中的向导序列和过客序列。在一些实施方式中，所述miRNA骨架是miR-100或miR-1-1。在一些实施方式中，所述异源核酸编码由SEQ ID NO:9-12和73中的任一个提供的人工miRNA序列。靶向ATXN2的向导序列、过客序列、miR骨架和人工miRNA序列的额外实例提供在PCT公开WO2021/159008中，所述PCT公开通过引用整体并入。

其它表达控制序列可以存在于与所述异源核酸(例如，编码抑制性核酸)可操作地连接的所述rAAV载体中，包括转录起始序列、终止序列、启动子序列、增强子序列、阻遏子序列、剪接位点序列、聚腺苷酸化(polyA)信号序列中的一种或多种，或其任何组合。

在一些实施方式中，rAAV载体包括H1启动子。在一些实施方式中，所述H1启动子是天然H1启动子，如包含SEQ ID NO:53中所示的序列或由其组成的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是短H1启动子，如包含SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:17、25-28和37-44中的任一个的核苷酸113-203中所示的序列或由其组成的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是长H1启动子，如包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:13-16和18-24中的任一个的核苷酸113-343中所示的序列或由其组成的启动子。在一些实施方式中，所述H1启动子在表达构建体中在5′至3′方向上定向，特别是当5′ITR缺乏末端解离位点时。

在一些实施方式中，所述rAAV载体包括SV40终止序列。SV40终止序列的实例在SEQID NO:77；SEQ ID NO:20、21、23和24中的任一个的核苷酸489-710；SEQ ID NO:31、32、35和36中的任一个的核苷酸358-579；SEQ ID NO:40、41和44中的任一个的核苷酸349-570中示出。

rAAV载体可以具有一个或多个AAV野生型基因全部或部分缺失。在一些实施方式中，所述rAAV载体是复制缺陷型的。在一些实施方式中，所述rAAV载体缺乏功能性Rep蛋白和/或衣壳蛋白。在一些实施方式中，所述rAAV载体是自互补的AAV(scAAV)载体。

在一些实施方式中，所述rAAV载体包括：5′ITR、可操作地连接到编码ATXN2特异性人工miRNA的异源核酸的启动子、载体填充序列和3′ITR。在一些实施方式中，所述5′ITR被修饰为缺少末端解离位点。在一些实施方式中，所述启动子在5′至3′方向上定向。

在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:13-24、29-44和78-80中的任一个中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:14中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3'ITR包括SEQ ID NO:15中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体包括SEQ ID NO:18中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:19中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:20中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:21中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:22中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:23中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:24中所示的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ IDNO:29中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:30中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:31中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5'ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:32中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:33中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:34中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3'ITR包括SEQ ID NO:35中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:36中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:37中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:38中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:39中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:40中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:41中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ IDNO:42中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:43中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:44中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3'ITR包括SEQ ID NO:78中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-342被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:79中所示的核苷酸序列，其中核苷酸213-351被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5'ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:80中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的人工miRNA的序列取代。在一些实施方式中，所述rAAV载体从5′ITR到3′ITR包括SEQ ID NO:81中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的人工miRNA的序列取代。

本公开的重组AAV载体可以被一种或多种AAV衣壳蛋白包裹以形成rAAV颗粒。“rAAV颗粒”或“rAAV病毒粒子”是指感染性、复制缺陷型病毒，所述病毒包含AAV蛋白壳，所述AAV蛋白壳包裹包括所关注的转基因的rAAV载体，其两侧各自侧接5′AAV ITR和3′AAVITR。rAAV颗粒在合适的宿主细胞中产生，所述宿主细胞具有指定rAAV载体的序列，其中引入了AAV辅助功能(helper function)和附属功能(acessory function)，以使宿主细胞能够编码包装rAAV载体(含有所关注的转基因序列)所需的AAV多肽进入感染性rAAV颗粒用于随后的基因递送。

使用宿主细胞培养将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，包装rAAV载体所需的一种或多种组分(例如，Rep序列、cap序列和/或附属功能)可以由已被工程化以含有一种或多种所需的组分的稳定宿主细胞提供(例如，通过载体)。AAV包装所需组分的表达可能受宿主包装细胞中诱导型或组成型启动子的控制。AAV辅助载体通常用于提供反式作用的AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充AAV复制所必需的缺失的AAV功能。在一些实施方式中，AAV辅助载体缺乏AAV ITR并且既不能复制也不能自我包装。AAV辅助载体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。

在一些实施方式中，rAAV颗粒可以使用三重转染方法产生(参见例如，美国专利第6,001,650号，通过全文引用的方式并入本文)。在此方法中，所述rAAV颗粒是通过用将被包装到rAAV颗粒的rAAV载体(包括转基因)、AAV辅助载体和附属功能载体转染宿主细胞产生的。在一些实施方式中，所述AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体产生，而不产生任何可检测的野生型AAV病毒粒子(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。所述附属功能载体编码非AAV源性病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于所述非AAV源性病毒和/或细胞功能进行复制(例如，“附属功能”)。所述附属功能包含AAV复制所需的功能，包括但不限于涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成以及AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒。在一些实施方式中，其中将所述AAV辅助功能和附属功能克隆在单个载体上的双重转染方法用于生成rAAV颗粒。

所述AAV衣壳是确定所述rAAV颗粒的这些组织特异性的重要元件。因此，可以选择具有衣壳组织特异性的rAAV颗粒。在一些实施方式中，所述rAAV颗粒包括选自以下AAV血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV 12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A 15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5以及其变体。在一些实施方式中，所述AAV衣壳选自能够穿过血脑屏障的血清型，例如，AAV9、AAVrh.10、AAV-PHP-B或其变体。AAV9衣壳序列的实例提供于美国专利第7,906,111号中，所述美国专利通过引用整体并入。在一些实施方式中，所述AAV衣壳是嵌合AAV衣壳。在一些实施方式中，所述AAV颗粒是假型化AAV，具有来自不同AAV血清型的衣壳和基因组。

在一些实施方式中，所述rAAV颗粒能够转导CNS的细胞。在一些实施方式中，所述rAAV颗粒能够转导CNS的非神经元细胞或神经元细胞。在一些实施方式中，所述CNS细胞是神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞或小胶质细胞。

在另一方面，本公开提供了用包括本文所述的载体填充序列的rAAV颗粒转染的宿主细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，HEK293T、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞)、细菌细胞(大肠杆菌(E.coli))、酵母细胞、昆虫细胞(Sf9、Sf21、果蝇、蚊子)等。

使用方法

在另一方面，本公开提供了向受试者递送治疗剂的方法，所述方法包括施用本公开的组合物(例如，rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包括rAAV载体，所述rAAV载体包括本文提供的载体填充序列和表达构建体，所述表达构建体包含编码治疗剂的异源核酸序列)。在一些实施方式中，所述细胞是CNS细胞。在一些实施方式中，所述细胞是CNS的非神经元细胞或神经元细胞。在一些实施方式中，所述CNS的非神经元细胞是神经胶质细胞、星形胶质细胞或小胶质细胞。在一些实施方式中，所述细胞在体外。在一些实施方式中，所述细胞来自具有一种或多种神经退行性疾病症状或疑似患有神经退行性疾病的受试者。

如本文所使用的，术语“治疗”是指预防或延缓神经退行性疾病(例如，ALS/FTD、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病等)的发作；降低神经退行性疾病的严重程度；减少或预防神经退行性疾病症状特性的发展；防止神经退行性疾病症状特性的恶化或其任何组合。

在一些实施方式中，所述受试者患有神经退行性疾病或有罹患神经退行性疾病的风险。神经退行性疾病的实例包括脊髓小脑共济失调-2、肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(G-PDC)、皮克氏病、海马硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

在一些实施方式中，本公开的治疗方法减少、预防或减缓神经退行性疾病的一种或多种症状特性的发展或进展。神经退行性疾病的症状特性的实例包括运动功能障碍、认知功能障碍、情绪/行为功能障碍或其任何组合。麻痹、颤抖、不稳、僵硬、抽搐、肌肉无力、肌肉痉挛、肌肉僵硬、肌肉萎缩、吞咽困难、呼吸困难、言语和语言困难(例如，口齿不清)、运动缓慢、行走困难、痴呆、抑郁、焦虑或其任何组合。

在一些实施方式中，本公开的本公开的治疗方法包括作为单一疗法或与一种或多种用于治疗神经退行性疾病的另外的疗法组合施用。组合疗法可以意指在一种或多种额外的疗法同时、之前、之后向受试者施用本公开的组合物。组合疗法的同时施用可以意指调配本公开的组合物和额外的疗法用于以相同的剂型施用或以单独的剂型施用。

在一些实施方式中，在本文所描述的任何方法中治疗的受试者是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠)，优选地为灵长类动物(例如，猴、黑猩猩)或人。

在本文所述的方法中的任何方法中，本公开的组合物可以通过任何途径施用于受试者，所述途径包括肠内(例如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、软膜下、实质内、纹状体内、颅内、脑池内、脑内、脑室内、眼内、心室内、腰椎内、皮下、透皮、皮间、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏剂、霜剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或作为口服喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂。最适当的施用途径通常将取决于各种因素，包括药剂的性质(例如，其在胃肠道的环境中的稳定性)和/或受试者的病状。在一些实施方式中，将组合物直接注射到受试者的CNS中。在一些实施方式中，组合物通过鞘内、软膜下、实质内、纹状体内、颅内、脑池内、脑内、脑室内、眼内、心室内、腰椎内施用或其任何组合来注射。

在一些实施方式中，将本公开的组合物直接注射到受试者的CNS中。在一些实施方式中，直接注射到CNS中是脑内注射、脑实质内注射、鞘内注射、纹状体内注射、软膜下注射或其任何组合。在一些实施方式中，直接注射到CNS中是直接注射到受试者的脑脊液(CSF)中，任选地其中所述直接注射是脑池内注射、脑室内注射、腰椎内注射或其任何组合。

实施例

实施例1：载体“填充”序列的设计

用于碱基填充序列的“非必需”人类基因组DNA的选择

为了最小化填充序列的任何不期望的影响，人类基因组的“非必需”区被鉴定为具有两种预期性质：(a)如果基因组中发生整合，则影响最小的序列(尽管这被认为对AAV非常罕见)；以及(b)启动意外转录的风险最小的序列。因此，检查了基因组中i)缺失和重复在群体中很常见并且与疾病相关表型无关(没有进化压力的证据)的区；和/或ii)跨人类组织的RNA表达较低或不可检测(缺乏强大的内在增强子/启动子元件)。从这次搜索中，两个区被优先化：

区I：AMELY基因区(chrY：6,865,918-6,874,027，HG38)

多项证据表明AMELY基因区不在进化选择下。首先，AMELY区起源于古老的复制事件，并且在X染色体上具有经过选择的功能同源物(Lahn和Page,《科学(Science)》(1999)286,964–967)。其次，在没有近期阳性选择证据的情况下，AMELY基因具有比预期更多的蛋白质改变变体(包括预测的功能丧失变体)(《自然(Nature)》(2020)581,434–443；https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000099721？dataset＝gnomad_r2_1)。第三，AMELY区的遗传变体已被证明缺失或重复对人类没有表型影响。AMELY的重复是常见的并且没有表型(《人类遗传学(Hum Genet.)》(2015)134:789-800)。第四，缺失是常见的，并且没有可检测的表型(《人类分子遗传学(Hum Mol Genet)》(2007)16:307-16)。此外，AMELY与任何罕见的人类疾病都没有关联(在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance inMan)，OMIM.org)

AMELY mRNA在大多数人体组织中都不能检测到表达(GTEX，GTEx联盟(The GTExConsortium))(《科学》(2020)369:1318-1330)，并且只存在于Y染色体携带者(男性)中。进一步地，AMELX(AMELY的功能同源物)在发育期间与牙釉质相关(《生理学前沿(FrontPhysiol.)》(2017)8:435)。

区II：PSG基因区(chr19：43,511,809-43,530,631，HG38)

类似地，多项证据表明妊娠特异性糖蛋白(PSG)没有在明确的进化选择下。首先，PSG簇源于片段重复(Dumont和Eichler《公共科学图书馆综合(PLoS One)》(2013)8:e75949)。其次，没有证据表明所述区受到进化限制，其中预测的功能丧失变体比预期的多(《自然》(2020)581:434–443；https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000243130？dataset＝gnomad_r2_1)。第三，PSG簇与任何罕见的人类疾病都没有关联(在线人类孟德尔遗传，OMIM.org)。

PSG区通常仅在妊娠期间由胎盘高度表达，而在其它组织中无/低表达(GTEX，GTEx联盟)(《科学》(2020)369:1318-1330)。

碱基填充序列的修饰

对来自AMELY区(chrY：6,865,918-6,874,027，HG38)和PSG基因区(chr19：43,511,809-43,530,631，HG38)的DNA序列进行修饰，目的是使所述序列“惰性”，或缺乏任何表达区、已知或预测的调控元件和重复元件(包括逆转录病毒和可转座元件)。这些变化对于预期在包含包装载体基因组的区中使用的填充序列是最严格执行的。

具体地，以以下方式对碱基序列(chrY：6,865,918-6,874,027，HG38)和(chr19：43,511,809-43,530,631，HG38)进行修饰(参见图1)：

i)去除表达区：两侧的外显子+10bp(外显子是使用GENCODEv19中的基因模型定义的)，人类表达的序列标签(EST：根据Genbank数据，使用UCSC基因组浏览器上的“包括未剪接的人类EST”轨道定义：《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》(2004)32(数据库期):D23-6)。

ii)去除调控元件：使用UCSC基因组浏览器上的以下轨道来定义CpG岛(《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》(1987)196(2):261-82)、由来自ENCODE 3的CHiP-seq(转录因子结合的序列)转录因子CHIP-seq峰(129种细胞类型中的340个因子)鉴定的区(《自然》(2012)489(7414):57-74.)、保守转录因子结合位点(HMR保守转录因子-结合位点轨道)、VISTA增强子(来自LBNL轨道的Vista HMR保守非编码人类增强子)和开放调控注释“ORegAnno”(来自ORegAnno轨道的调控元件；(《核酸研究》(2016)44(D1):D126-32.)。

iii)去除重复元件：通过RepeatMasker轨道(http://www.repeatmasker.org)使用重复元件(Repeating Elements)的重复掩蔽元件(包括SINE、LINE、LTR、DNA元件)、由微卫星-二核苷酸和三核苷酸重复序列轨道定义的微卫星重复序列(《核酸研究》(1999)27(2):573-80)以及由RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org)定义的中断和简单重复序列。

iv)为了降低意外翻译的可能性，对ATG残基进行修饰以降低ATG序列的频率。

v)CpG二核苷酸的编辑。为了降低细菌中产生的顺式质粒中的未甲基化CpG二核苷酸在包装在AAV中时引发先天免疫激活的可能性，通过编辑碱基来减少CG二核苷酸的存在。

实施例2：使用填充多核苷酸包装的AAV载体基因组的安全性评估

在体内测试不包括任何额外的活性元件(如miRNA)的并入有根据实施例1描述的填充序列的载体的安全性。设计了一组4个载体，每个载体具有AMELY和PSG11衍生的填充片段的两个变体(SEQ ID NO:25-28)。每个载体在紧接在左ITR(SEQ ID NO:57)下游的5′侧含有H1短启动子，并且在H1短启动子下游包括非miRNA对照序列而不是miRNA。Pol III终止子定位于对照序列的3′处。并行地对三个对照进行测试：媒剂；编码靶向ATXN2的人工miRNA序列的载体(scAAV_H1_miR16-2-1479_AMELY_V1(SEQ ID NO:81))，所述载体先前被证明当在H1启动子的控制下在HeLa和U2OS细胞上以慢病毒形式测试时显示出毒性；和编码Atxn2特异性miRNA以及GFP的载体(scAAV_H1_miR1-1-XD-14792_CBh_GFP_SV40p(SEQ ID NO:82))。选择先前被证明表现出毒性的人工miRNA作为毒性的阳性对照，所述毒性可能是通过特定人工miRNA序列的脱靶效应引起的。

将载体通过尾静脉以1.3E11的总病毒基因组(vg)静脉内给药于16周龄的野生型C57Bl/6小鼠。基于柱纯化载体的DNA浓度来确定滴度。将该浓度与还通过载体基因组qPCR进行滴度测定的类似纯化的载体的浓度进行比较，以计算该实施例中描述的填充载体的对应滴度。对血液进行处理，并且评估血清中肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的浓度，作为任何肝毒性的指标。表达毒性阳性对照人工miRNA的载体引起肝酶ALT和AST的显著升高。相比之下，没有一种具有填充序列的载体引起肝酶的升高(图2A至2B)。

病理学家对肝脏进行组织学评估，以评估任何毒性。在给药后28天，处死动物(n＝5只动物每种填充载体处理)，并且将肝脏在4％多聚甲醛中浸入固定24小时。将每个肝脏的两个横截面包埋在石蜡中，以5微米的厚度切片，并且用苏木精和伊红染色。在OlympusBX60显微镜上拍摄显微照片。用毒性阳性对照miRNA给药的动物表现出许多病变，包括卵圆细胞增生、肝细胞融合和多核化、淋巴组织细胞性肝炎、窦性纤维化、组织细胞内色素和罕见的单细胞凋亡/坏死。在含有填充片段的载体中，组织学发现仅限于不遵循治疗相关趋势的偶发背景病变，并且跨多个处理组可见。发现包括肝糖原贮积症(肝细胞糖原积聚)和罕见的微肉芽肿的变异。这些发现不被认为反映了与化合物相关的处理毒性。

实施例3：在特定填充设计中对载体基因组截短的评估

已知rAAV载体基因组制剂含有截短的载体基因组，所述截短的载体基因组在发夹结构(如miRNA)处最为明显，但在DNA二级结构的其它区处也最为明显。因此，评估了含有不同形式填充序列的rAAV制剂中截短基因组的存在。

图3A至3C示出了来自片段分析仪分析的DNA迹线。在产生rAAV载体(scAAV9_H1_长_miR-100_3330_PSG11_V5(SEQ ID NO:16))后，提取载体DNA并且将其进行柱纯化(Zymo公司(Zymo)，P/N D3015)，并在安捷伦片段分析仪(HS NGS片段1-6000bp)上运行。可以看到双峰迹线(图3A)，并且这些双峰被确定为含有ITR的全长结构，因为它们通过在去除右侧野生型ITR的位点处的限制性消化而被分解。预期全长产物左侧的指示较短、截短的基因组的较小肩部也存在。在许多制剂中发现以amiRNA为中心的副峰，其表示在amiRNA处截短的载体基因组(图3D)。如果使用对照序列代替amiRNA但含有二级结构如回文序列，则存在类似的峰。

图3E至3F比较了两种rAAV制剂(scAAV9_H1_MCS_PSG11_V1(SEQ ID NO:27)和scAAV9_H1_MCS_PSG11_V2(SEQ ID NO:28))，所述两种rAAV制剂衍生自含有源自PSG11(PSG11_V1(SEQ ID NO:45)和PSG11_V2(SEQ ID NO:46))的填充序列的两个版本之一的顺式质粒。这些序列在结构上相似，但是在PSG11_V2中对ATG位点进行了编辑以消除ATG序列。在与表达盒邻接的填充序列的5′部分中存在一些结构差异(H1启动子和amiRNA或在图3E所示的载体中，对照序列)。迹线显示出在含PSG11_V1的载体基因组制剂中全长产物左侧的‘肩部’较小(图3F)。在这些载体制剂中，没有使用amiRNA。

图3G至3H比较了类似的一组衍生自含有填充序列PSG11_V1(SEQ ID NO:45)或PSG11_V2(SEQ ID NO:46)中任一个的顺式质粒的两种rAAV制剂(scAAV9_H1_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V1(SEQ ID NO:78)和scAAV9_H1_天然_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V2(SEQ IDNO:79))在这种情况下，两种载体都含有H1启动子下游的amiRNA元件(与含V1的载体相比，含PSG11_V2的载体上的启动子序列中插入了3个核苷酸，但除此之外，5′序列是相同的)。通过检查片段分析仪迹线(图3H)，可以看出在含有PSG11_V2填充序列的载体中，在amiRNA位点处的截短显著更大。

自互补AAV(scAAV)载体(如本文所述的载体)的复制涉及从野生型ITR开始复制。在这里描述的序列中，这是位于顺式质粒的3′侧处。因此，聚合酶最初将从3′到5′穿过填充序列至amiRNA。截短产物增加的潜在解释是，聚合酶在刚好在amiRNA发夹之前可能遇到的二级结构促进了链转换活性，从而导致截短加剧。与该假设一致，对紧接在amiRNA的3′处的PSG11_V1填充序列(SEQ ID NO:55；图4A)与PSG11_V2填充序列(SEQ ID NO:56；图4B)内的DNA序列的200个核苷酸的折叠的检查揭示了PSG11_V2填充片段中预测的二级结构增加的区。因此，PSG11_V1序列结构受到青睐。“PSG11_V5”填充序列(SEQ ID NO:48)通过使用来自PSG11_V1序列的有利序列结构而产生。这被设想为产生具有减少的截短的载体基因组的载体制剂。所述_V5填充片段结合了对CG序列和ATG序列的编辑，以降低低甲基化CpG二核苷酸或意外开放阅读框的可能性。

实施例4：当与ATXN2 AMIRNA表达盒组合时填充序列的安全性的进一步评估

进行了一项实验，其中对涵盖各种填充序列的24种不同载体设计的体内安全性进行了评估。将H1启动子的三种不同变体(H1短(SEQ ID NO:54)、H1天然(SEQ ID NO:53)、H1长(SEQ ID NO:52))、两种不同的靶向ATXN2的人工miRNA(3330或14792(在本文中也称为1784))/miR骨架(miR1.1.或miR100)组合(miR100_3330(编码SEQ ID NO:12)；miR1.1_14792(编码SEQ ID NO:73))、存在或不存在Pol-II转录终止子SV40聚腺苷酸化序列，以及不同版本的填充序列(AMELY_V3(SEQ ID NO:51)、PSG11_V2(SEQ ID NO:46)、PSG11_V3(SEQID NO:47)、PSG11_V5(SEQ ID NO:48))以各种组合组装(参见表1)。如在先前实施例中，在这些载体中，H1启动子在旨在用于包装为自互补AAV载体的顺式质粒中从5′至3′定向，其中突变体ITR(缺乏末端解离位点)在5′侧(例如SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:13-24、29-44和78-82中的任一个的核苷酸1-106)，并且野生型AAV ITR在3′侧(例如SEQ ID NO:58或SEQID NO:13-16中的任一个的核苷酸2214-2358)。使用这种启动子定向的原因是，在并入有缺乏末端解离位点的ITR的载体(自互补AAV载体)中，以miR为中心的截短是可能的。在5′至3′启动子定向上，具有以miR为中心的截短的载体将不包括启动子，并且因此应该是惰性的。如果启动子在3′至5′定向上，则启动子可以保留在具有以miR为中心的截短的载体中。

用这些顺式质粒产生rAAV载体，并且通过尾静脉注射以每克小鼠3.21E9个载体基因组的剂量向12周龄野生型C57Bl/6小鼠静脉内施用载体，所述剂量按重量调整(平均总剂量8.5E10个载体基因组)。媒剂对照动物用含有0.001％ PF-68的PBS给药。通过下颌下出血在施用后2周收集血液，并且在用各种载体设计给药的动物中测量肝酶浓度(天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT))(图5A-5B)。用含有填充片段的载体处理的动物的几乎所有数据点都在正常参考范围内。尽管有两个数据点显示AST信号上升到参考值以上，但在这些样品中发现溶血，并且一个样品来自经媒剂处理的动物。在该时间点来自用任何载体形式给药的动物的其它样品中，AST或ALT都没有上升到参考范围以上，这表明没有证据表明用编码这些填充序列的载体给药rAAV会导致急性肝损伤。

表1：所评估的每种静脉内给药的载体的动物的总结(肝脏组织学)

载体	启动子	miR	终止子	填充片段	N
						scAAV_H1_短_miR100_3330_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:44]	H1.短	miR100–3330	SV40	AMELY_V3	1
scAAV_H1_短_miR100_3330_AMELY_V3[SEQ ID NO:42]	H1.短	miR100-3330	无	AMELY_V3	1
						scAAV_H1_短_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:40]	H1.短	miR1.1–1784	SV40	AMELY_V3	1
scAAV_H1_短_miR1-1_1784_AMELY_V3[SEQ ID NO:37]	H1.短	miR1.1-1784	无	AMELY_V3	1
						scAAV_H1_天然_miR100_3330_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:35]	H1.天然	miR100.3330	SV40	AMELY_V3	1
scAAV_H1_天然_miR100_3330_AMELY_V3[SEQ ID NO:33]	H1.天然	miR100.3330	无	AMELY_V3	1
						scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:31]	H1.天然	miR1.1.1784	SV40	AMELY_V3	2
scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_AMELY_V3[SEQ ID NO:29]	H1.天然	miR1.1.1784	无	AMELY_V3	1
						scAAV_H1_长_miR100_3330_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:23]	H1.长	miR100.3330	SV40	AMELY_V3	1
scAAV_H1_长_miR100_3330_AMELY_V3[SEQ ID NO:22]	H1.长	miR100.3330	无	AMELY_V3	1
						scAAV_H1_长_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3[SEQ ID NO:20]	H1.长	miR1.1.1784	SV40	AMELY_V3	1
scAAV_H1_长_miR1-1_1784_AMELY_V3[SEQ ID NO:18]	H1.长	miR1.1.1784	无	AMELY_V3	2
						scAAV_H1_短_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V3[SEQ ID NO:41]	H1.短	miR1.1.1784	SV40	PSG11_V3	1
scAAV_H1_短_miR1-1_1784_PSG11_V3[SEQ ID NO:38]	H1.短	miR1.1.1784	无	PSG11_V3	1
						scAAV_H1_长_miR1-1_1784_PSG11_V2[SEQ ID NO:19]	H1.长	miR1.1.1784	无	PSG11_V2	1
scAAV_H1_短_miR100_3330_PSG11_V5[SEQ ID NO:43]	H1.短	miR100.3330	无	PSG11_V5	1
						scAAV_H1_短_miR1-1_1784_PSG11_V5[SEQ ID NO:39]	H1.短	miR1.1.1784	无	PSG11_V5	1
scAAV_H1_天然_miR100_3330_SV40_PSG11_V5[SEQ ID NO:36]	H1.天然	miR100.3330	SV40	PSG11_V5	1
						scAAV_H1_长_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V5[SEQ ID NO:21]	H1长	miR1.1.1784	SV40	PSG11_V5	11
scAAV_H1_天然_miR100_3330_PSG11_V5[SEQ ID NO:34]	H1.天然	miR100.3330	无	PSG11_V5	1
						scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V5[SEQ ID NO:32]	H1.天然	miR1.1.1784	SV40	PSG11_V5	1
scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_PSG11_V5[SEQ ID NO:30]	H1.天然	miR1.1.1784	无	PSG11_V5	1
						scAAV_H1_长_miR100_3330_SV40_PSG11_V5[SEQ ID NO:24]	H1.长	miR100.3330	SV40	PSG11_V5	1
scAAV_H1_长_miR100_3330_PSG11_V5[SEQ ID NO:16]	H1.长	miR100.3330	无	PSG11_V5	1

还通过组织学评估用含有填充片段的载体静脉内给药的动物的肝毒性。在给药后三周，每只动物收集两个连续的0.5cm左肝叶切片，将其包埋在石蜡中，切片至5微米，并用苏木精和伊红染色。载玻片由受过训练的病理学家进行评估。如表1所示，评估N＝每组1–2只动物。在评估后，对于所有评估的载体，静脉内施用测试制品未被解释为与肝脏检查切片的变化有关。

纹状体内测试

表2：所评估的每种纹状体内给药的载体的动物的总结(纹状体组织学)

还通过直接注射到纹状体中将这些载体以每纹状体7.5E9个载体基因组的剂量给药于8周龄的野生型C57Bl/6小鼠，并且通过组织学观察评估载体的亚组(上面的表2)的毒性。在给药后3周，将动物的纹状体切片进行石蜡包埋，其中预先将切割成5微米块的四个连续切片安装在分离的载玻片上。包括一组2个包括来自三个级别的步骤切片的载玻片。将切片用苏木精和伊红、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学、离子钙结合衔接分子1(IBA-1)免疫组织化和floro-jade B染色。后三种染色可以分别用于评估星形细胞反应性、小胶质细胞反应性和神经元死亡。

与用静脉内施用的载体处理的动物的肝脏切片一样，在检查的脑切片中没有鉴定出测试制品的影响。处理伪影限制了一些组织中的解释。通常，在注射部位处观察到变化，并且所述变化包括轻微的组织破坏，伴有轻度胶质增生(在H&E染色的载玻片上鉴定)、轻微的小胶质增生(在GFAP标记的载玻片上鉴定)和轻微的含铁血黄素色素。含铁血黄素色素是实质内注射的常见变化。在任何动物的基底核/纹状体水平下的任何检查切片中，测试制品均未被解释为引起与实验程序相关的恶化或变化。

转录分析

为了进一步评估载体的安全性，对用上述载体给药的动物的纹状体穿刺活检进行测序分析。使用Qiagen的AllPrep DNA/RNA/蛋白质迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，P/N80004)对纹状体组织进行柱纯化以提取RNA(在DNA酶处理后)。用Ribo-Zero Plus试剂盒(依诺米那公司(Illumina)，P/N 20040525)通过链式总RNAPrep Ligation制备链式RNA-seq库，然后在Illumina Novaseq 6000系统上进行配对末端2x 100bp测序。然后将这些读段与用于包装施用于该动物的rAAV的相应顺式质粒对齐。单独地从用于提取测序RNA的同一穿刺活检中纯化DNA(凯杰公司，P/N 80004)，并且确认载体暴露。表3列出了每个测试样品的暴露以及载体。

表3：通过链式RNA-seq评估样品中的载体生物分布

图6示出了来自代表性载体的读段的堆积。令人惊讶的是，H1短启动子和miR 1.1骨架以及PSG11 V5填充序列的使用导致与初级miRNA的预期转录下游的顺式质粒对齐的读段数量增加。相比之下，H1长启动子与PSG11 V5填充片段的使用实现有益的最小量的非预期转录。因此，这种元件的组合产生了具有期望的低频率非miRNA转录的载体结构。

实施例5：在不同RAAV载体形式中填充序列在与ATXN2 AMIRNA表达盒组合时的功能的展现

还对用实施例4中描述的一组24种载体组合给药的动物评估填充片段、启动子和靶向ATXN2的人工miRNA的所有组合的功能。通过在静脉内给药(剂量：3.21E9 vg/克小鼠)后3周从肝组织中提取RNA，然后用Atxn2和对照探针Hprt进行RT-ddPCR来评估Atxn2的敲低。Atxn2水平以这些ATXN2/对照转录物比率的平均值的形式进行计算，并且进一步相对于针对用媒剂给药的动物获得的比率归一化。还使用带有针对载体基因组的探针和小鼠基因组探针(Tert)的ddPCR来测量载体基因组暴露。如在表4中可见，在用填充序列和miRNA载体组分的所有组合处理的动物中发生了稳健的Atxn2敲低。

表4：含有填充序列的各种载体对肝脏Atxn2的敲低

实施例6：在不同RAAV载体形式中填充序列在与ATXN2 AMIRNA表达盒组合时的生产产量和截短的进一步评估。

实施例4显示，当启动子的“H1长”变体插入在PSG11_V5填充序列的上游时，与启动子的“H1短”变体相比，在降低人工miRNA序列下游的转录活性方面有出乎意料的益处。还评估了H1长启动子和H1短启动子以及AMELY和PSG11衍生的填充序列的组合的生产产量。使用对填充区具有特异性的引物/探针组，通过载体基因组的ddPCR评估生产产量。通常，使用具有H1长形式启动子(SEQ ID NO:52)的顺式质粒与所评估的填充序列的组合(所述填充序列包括AMELY_V3(SEQ ID NO:51)、PSG11_V5(SEQ ID NO:48)、PSG11_V3(SEQ ID NO:47)和PSG11_V2(SEQ ID NO:46))，会产生更高的生产产量(图7)。对载体截短的分析(图8A至8C)进一步表明，与H1短启动子相比，当在上游包括H1长启动子版本时，截短更少。总之，在这些填充序列的上游包括H1长启动子有许多令人惊讶的益处，这可能是由于可能影响rAAV复制和包装的局部DNA二级结构元件引起的。

实施例7：并入有填充序列与人工MIRNA的额外组合的载体的生产

评估根据实施例1产生并包括如实施例4中所述的启动子和特异性填充序列的组合的填充序列作为AAV载体基因组的一部分被包装在rAAV中的能力。还针对这些填充序列测试了在载体中不同有效载荷的情况下持续实现良好生产率的能力。

将衍生自PSG11内含子区、根据实施例1中的设计规则进行修饰并含有最佳H1长启动子变体的填充序列包装在一组含有各种靶向ATXN2的人工miRNA包装盒的载体中。5′ITR至3′ITR顺式质粒序列在SEQ ID NO:13(scAAV_H1_长_miR100_1755_PSG11_V5_ITR_至_ITR)、SEQ ID NO:14(scAAV_H1_长_miR100_2586_PSG11_V5_ITR_至_ITR)、SEQ ID NO:15(scAAV_H1_长_miR100_2945_PSG11_V5_ITR_至_ITR)和SEQ ID NO:16(scAAV_H1_长_miR100_3330_PSG11_V5_ITR_至_ITR)中示出。amiRNA向导、过客和表达盒的序列在表5中描述。

表5：RNA和DNA形式的人工miRNA序列

将H1启动子(“H1长”)(SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸113-343)并入载体中。表6列出了来自这些载体的AAV生产的产量。

表6：含有H1长-PSG11_V5填充序列的载体的AAV生产产量

将衍生自AMELY的填充序列包装在若干个载体中。针对“H1_短_miR16-2-1755_AMELY_V1”(SEQ ID NO:17)和“H1–miR1-1_1784_AMELY_V3”(SEQ ID NO:18)提供了从5′ITR至3′ITR的载体序列，所述载体序列含有靶向ATXN2的人工miRNA盒和AMELY填充序列。在这些载体中，AMELY的注释“_V1”或“_V3”是指AMELY填充序列的不同版本，其中在“_V3”版本中，编辑ATG序列并且编辑CpG二核苷酸(SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177)，并且“_V1”未如此修饰(SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222)。H1_短是指H1启动子的91bp截短形式(SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:17的核苷酸113-203)。表7列出了来自这些载体生产的产量。

表7：含有AMELY填充序列的载体的AAV生产产量

实施例8：使用填充多核苷酸与额外的AMIRNA的组合包装的AAV载体基因组的功能的展现

进行实验以测试当将有效载荷并入到并入有本文所述的填充序列和额外的amirna的载体基因组中时有效载荷的功能。这进一步建立了填充序列与amirna表达盒的相容性。上述载体均表达靶向ATXN2的人工miRNA；功能是通过ATXN2靶标的敲低来确定的。

在一项实验中，评估了表8中列出的载体在人类干细胞衍生的运动神经元中ATXN2mRNA的敲低。载体包括scAAV_H1_长_miR100_1755_PSG11_V5_ITR_至_ITR.gb(SEQ IDNO:13)、scAAV_H1_长_miR100_2586_PSG11_V5_ITR_至_ITR.gb(SEQ ID NO:14)、scAAV_H1_长_miR100_2945_PSG11_V5_ITR_至_ITR.gb(SEQ ID NO:15)和scAAV_H1_长_miR100_3330_PSG11_V5_ITR_至_ITR.gb(SEQ ID NO:16)。用包装在AAV-DJ中的指示载体处理干细胞衍生的运动神经元，并且在转导后7天，收获RNA，并使用具有针对ATXN2的探针和看家探针GUSB和B2M的RT-ddPCR评估敲低。测量针对GUSB和B2M探针以及针对未转染细胞归一化的平均ATXN2 mRNA信号。列出了用3.16E4载体基因组/细胞的剂量处理的细胞的数据。

表8：经amiRNA/AAV载体处理的人类干细胞衍生的运动神经元中的ATXN2敲低

载体	miR	平均_ATXN2_31600	SD	N
					H1-miR-PSG11_V5	miR100_1755	13.96853215	2.13651083	6
H1-miR-PSG11_V5	miR100_2586	29.25180424	1.03259645	6
					H1-miR-PSG11_V5	miR100_2945	26.83870303	2.60157362	6
H1-miR-PSG11_V5	miR100_3330	32.17946149	2.69980734	6

在另一个实验中，包括AMELY_V3填充片段(SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177)和在H1长启动子控制下的靶向ATXN2的amiRNA的载体通过向成年雄性C57Bl/6小鼠静脉内施用并在给药后3周测量靶ATXN2的敲低来进行测试。通过从肝组织中提取RNA并用Atxn2和对照探针Hprt和Gusb进行RT-ddPCR来评估Atxn2的敲低。表9列出了相对于用媒剂(PBS+0.001％ PF-68)给药的动物，从用载体给药的3只动物评估的肝组织中的平均敲低百分比。在这项研究中，施用的剂量平均为8.5E10，并且根据小鼠体重进行了调整。如在表9中可以看出，在用该载体给药的动物的肝脏中有显著的敲低，这指示了用填充片段包装的AAV的功能。

表9：经AAV载体处理的小鼠的肝脏中的ATXN2敲低

上述各个实施方式可以组合以提供另外的实施方式。在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开(包括于2021年2月5日提交的美国专利申请第63/146,522号和于2021年2月5日提交的PCT申请第PCT/US2021/016939号)以全文引用的方式并入本文中。如果需要，则可以修改实施方式的方面以采用各个专利、申请和出版物的概念来提供又另外的实施方式。

鉴于以上详细描述，可以对实施方式进行这些以和其它改变。一般而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施方式，而是应当被解释为包含所有可能的实施方式连同此类权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求并不受本公开的限制。

序列表

<110> 梅兹治疗公司（Maze Therapeutics, Inc.）

<120> 包括填充多核苷酸序列的载体

<130> 630264.402WO

<150> US 63/146,522

<151> 2021-02-05

<150> PCT/US2021/016939

<151> 2021-02-05

<160> 82

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1755向导（RNA）

<400> 1

ucggguugaa aucugaagug ug 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2945向导（RNA）

<400> 2

uguaguagaa ggcuuuggcu ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2586向导（RNA）

<400> 3

uagauucaga aguagaacuu gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3330向导（RNA）

<400> 4

uaugcugaga cugauaaugu gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1755过客（RNA）

<400> 5

cacacuccag cuuucaaacc gu 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2945过客（RNA）

<400> 6

ucagcccaag acuucuaaua cu 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2586过客（RNA）

<400> 7

ccaaguccua auucugacuc uu 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3330过客（RNA）

<400> 8

ccacaucauc cgucucaaca uu 22

<210> 9

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_1755 (RNA)

<400> 9

cccaaaagag agaagauauu gaggccuguu gccacaucgg guugaaaucu gaaguguggu 60

auuaguccgc acacuccagc uuucaaaccg uugugucugu uaggcaaucu cacggaccug 120

gggcuuugcu uauaugcc 138

<210> 10

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_2945 (RNA)

<400> 10

cccaaaagag agaagauauu gaggccuguu gccacaugua guagaaggcu uuggcugagu 60

auuaguccgu cagcccaaga cuucuaauac uugugucugu uaggcaaucu cacggaccug 120

gggcuuugcu uauaugcc 138

<210> 11

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_2586 (RNA)

<400> 11

cccaaaagag agaagauauu gaggccuguu gccacauaga uucagaagua gaacuugggu 60

auuaguccgc caaguccuaa uucugacucu uugugucugu uaggcaaucu cacggaccug 120

gggcuuugcu uauaugcc 138

<210> 12

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_3330 (RNA)

<400> 12

cccaaaagag agaagauauu gaggccuguu gccacauaug cugagacuga uaaugugggu 60

auuaguccgc cacaucaucc gucucaacau uugugucugu uaggcaaucu cacggaccug 120

gggcuuugcu uauaugcc 138

<210> 13

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_1755_PSG11_V5_ITR_至_ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_1755

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(2185)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2214)..(2358)

<223> 3' ITR

<400> 13

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat cgggttgaaa tctgaagtgt ggtattagtc cgcacactcc 420

agctttcaaa ccgttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttac caggtcagtt gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag 540

aaggtggaag ggatttcact ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc 600

tatttgggtg aaggggcagg gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta 660

tactaggaag tagaggtaaa ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt 720

atcaaatagg ctagtgtata cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta 780

gaaaggtatt gaggcagtta tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa 840

gcaatacttt gagaagtggt tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt 900

tgttaaaaat attgaagaag gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag 960

aaacaattga gcagaggctg gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca 1020

aaaaggccag ggagaaaggg aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt 1080

gaaggaggag atccaggccc agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg 1140

cagtcagccc tgcaggaacc aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg 1200

cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt 1260

ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt 1320

gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc 1380

taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg 1440

gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag 1500

agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct 1560

gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag 1620

ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga 1680

ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt 1740

tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc 1800

ccagagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc 1860

tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt 1920

ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag 1980

caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct accacaaagg 2040

gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag gtcagtcttg 2100

agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggagg gttcaggagg 2160

agaatttggg atttgcctgt gcccagctag cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat 2220

taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2280

cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2340

gagcgagcga gcgcgcag 2358

<210> 14

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_2586_PSG11_V5_ITR_至_ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_2586

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(2185)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2214)..(2358)

<223> 3' ITR

<400> 14

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat agattcagaa gtagaacttg ggtattagtc cgccaagtcc 420

taattctgac tctttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttac caggtcagtt gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag 540

aaggtggaag ggatttcact ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc 600

tatttgggtg aaggggcagg gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta 660

tactaggaag tagaggtaaa ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt 720

atcaaatagg ctagtgtata cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta 780

gaaaggtatt gaggcagtta tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa 840

gcaatacttt gagaagtggt tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt 900

tgttaaaaat attgaagaag gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag 960

aaacaattga gcagaggctg gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca 1020

aaaaggccag ggagaaaggg aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt 1080

gaaggaggag atccaggccc agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg 1140

cagtcagccc tgcaggaacc aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg 1200

cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt 1260

ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt 1320

gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc 1380

taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg 1440

gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag 1500

agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct 1560

gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag 1620

ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga 1680

ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt 1740

tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc 1800

ccagagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc 1860

tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt 1920

ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag 1980

caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct accacaaagg 2040

gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag gtcagtcttg 2100

agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggagg gttcaggagg 2160

agaatttggg atttgcctgt gcccagctag cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat 2220

taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2280

cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2340

gagcgagcga gcgcgcag 2358

<210> 15

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_2945_PSG11_V5_ITR_至_ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_2945

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(2185)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2214)..(2358)

<223> 3' ITR

<400> 15

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat gtagtagaag gctttggctg agtattagtc cgtcagccca 420

agacttctaa tacttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttac caggtcagtt gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag 540

aaggtggaag ggatttcact ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc 600

tatttgggtg aaggggcagg gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta 660

tactaggaag tagaggtaaa ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt 720

atcaaatagg ctagtgtata cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta 780

gaaaggtatt gaggcagtta tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa 840

gcaatacttt gagaagtggt tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt 900

tgttaaaaat attgaagaag gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag 960

aaacaattga gcagaggctg gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca 1020

aaaaggccag ggagaaaggg aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt 1080

gaaggaggag atccaggccc agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg 1140

cagtcagccc tgcaggaacc aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg 1200

cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt 1260

ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt 1320

gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc 1380

taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg 1440

gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag 1500

agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct 1560

gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag 1620

ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga 1680

ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt 1740

tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc 1800

ccagagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc 1860

tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt 1920

ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag 1980

caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct accacaaagg 2040

gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag gtcagtcttg 2100

agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggagg gttcaggagg 2160

agaatttggg atttgcctgt gcccagctag cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat 2220

taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2280

cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2340

gagcgagcga gcgcgcag 2358

<210> 16

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_3330_PSG11_V5_ITR_至_ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(2185)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2214)..(2358)

<223> 3' ITR

<400> 16

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca 420

tccgtctcaa catttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttac caggtcagtt gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag 540

aaggtggaag ggatttcact ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc 600

tatttgggtg aaggggcagg gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta 660

tactaggaag tagaggtaaa ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt 720

atcaaatagg ctagtgtata cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta 780

gaaaggtatt gaggcagtta tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa 840

gcaatacttt gagaagtggt tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt 900

tgttaaaaat attgaagaag gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag 960

aaacaattga gcagaggctg gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca 1020

aaaaggccag ggagaaaggg aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt 1080

gaaggaggag atccaggccc agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg 1140

cagtcagccc tgcaggaacc aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg 1200

cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt 1260

ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt 1320

gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc 1380

taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg 1440

gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag 1500

agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct 1560

gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag 1620

ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga 1680

ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt 1740

tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc 1800

ccagagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc 1860

tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt 1920

ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag 1980

caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct accacaaagg 2040

gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag gtcagtcttg 2100

agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggagg gttcaggagg 2160

agaatttggg atttgcctgt gcccagctag cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat 2220

taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2280

cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2340

gagcgagcga gcgcgcag 2358

<210> 17

<211> 2395

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV _H1_短_miR16-2-1755_AMELY V1_ITR_至_ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(335)

<223> miR16-2-1755

<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(341)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(2222)

<223> AMELY_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2251)..(2395)

<223> 3' ITR

<400> 17

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactctc 240

gggttgaaat ctgaagtgtg tagtgaaata tatattaaac acacttcagg cttcaacccg 300

ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360

ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420

ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480

tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540

cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600

ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660

taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720

gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780

ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840

ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900

gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960

cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020

agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080

tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140

gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200

gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260

tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320

attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380

aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440

ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500

ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560

cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620

gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680

aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740

catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800

tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860

tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920

atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980

acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040

gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100

tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160

cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220

gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280

tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395

<210> 18

<211> 2350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR1-1_1784_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (488)..(2177)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2206)..(2350)

<223> 3' ITR

<400> 18

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360

tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420

gtctgaactc aggccgggac ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc 480

ctttttttat tttgcaaatc acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct 540

gaagtacaca accagtattc caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta 600

attgcaaaga aattgtcaaa taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat 660

ttgttcaaac aattttattt tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa 720

aaagatttga cctagtataa tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga 780

atttgtttga gtaattgagc agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt 840

gtctcaaaag tttcaatcaa cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc 900

agtgagtacc aattacaata cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc 960

tataatttcc aaagtttctt tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc 1020

cttcttctac ctttggaaca cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc 1080

caaaaatagc tttgtcaagg tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag 1140

agagaacttg tgctttagac tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca 1200

atcaatcaat caattttcaa aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac 1260

aaatattttg attttttaat tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata 1320

gcttgtataa attggaatta caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata 1380

tacctagaaa taagattttt tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca 1440

attgtaagtg cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa 1500

agcttaatca actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt 1560

tttttaaaga gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa 1620

ttacccaccc caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa 1680

atctttgaat tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt 1740

ttaataatat atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat 1800

aataataaaa tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata 1860

aatttgttta tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt 1920

aactactaca actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg 1980

ctgcaccaat ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga 2040

gaagcagcag tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt 2100

aactgtgtac acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg 2160

agtacacttg gtattttgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2220

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2280

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2340

gagcgcgcag 2350

<210> 19

<211> 2350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR1-1_1784_PSG11_V2（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(2177)

<223> PSG11_V2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2206)..(2350)

<223> 3'ITR

<400> 19

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360

tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420

gtctgaactc aggccgggac ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc 480

ctttttttgt atacccctgg agattcttga ttaagtgaat taactagatt ttagaaaggt 540

attgaggcag ttatttgcaa ggaacaattc aaagtctgga gacaagaagt caagcaatac 600

tttgagaagt ggttgagctt tttgggattg gagagaatta cactattgag atttgttaaa 660

aatattgaag aaggtttcac cttgtgaaat tgtgtttctc aattgaatct gagaaacaat 720

tgagcagagg ctggagataa ttttgtctaa aagacagtgg ggtacaggga gcaaaaaggc 780

cagggagaaa gggaactgca ggaattagtg ctgagaagca ggagttagtg gttgaaggag 840

gagatccagg cccagataca ggcaaataag tcaattccct ctcccaagct tggcagtcag 900

ccctgcagga accaggataa gagaaaagaa gaaaagaaaa gaaggattga aggtgttgtt 960

attttacttg ggggagcgtc aggaacaagc ttgtaacttg agatactgta taattgtttc 1020

ttcaaggact acaatatttc tgttggaaaa ttgttgggag ttgattatat tcttgcagtt 1080

ttttttccct ctcaccttgt ttctcaggtg gtgatcagtc ctctgtcaat tctctactgc 1140

actcaggtat tttggaaggc tttcagacgt gagaaaggct gattgctatt ttctttgtca 1200

gtggaacttg tcacctttgc accttttctt ggttgcaact ttttctcagt gtctctgttt 1260

ggtaaaaact aacaaaccag gcttgattct ttgcagttag ctctttatct ttctctccca 1320

caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc ggaaaaagga 1380

aggtactgtt gagttattgt tgttgatagt aatatagtag ctgacagtgg ttcctctgtt 1440

tgtggcaact tgtttcccac ctaaattgca cacttagaaa cagttattgg taagccttat 1500

attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat aattacacac tttttggcac 1560

tgcccctttc ctgccttgca gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc cagctctgca 1620

acagtcactg tactcagtgc tgtgtcccac gtgctgtgcc cacagcctca aacagccagt 1680

gacttcagag ccaggacgca gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc ttcttatttc 1740

cttgcagcct ggcccggggg aggcttggct tgaactggca gctcaattta gccaaattca 1800

ggacaggcca ccaggactct ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt tgagtgaggc 1860

agggccagtc accagaggag cccggagcag agcaggaagc agagtctgag ctgctcctcc 1920

ctcacccaag gggcttcctc ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt ttcaaagcct 1980

cagttgttcc ttgtagttct tggaagaggt acaagaaaac aaagacgtga cagaaggggt 2040

tgaggtggtg acagtgagaa gcaactcgtt gttcagcact ctccttcttg tccctctgtg 2100

aagcctcttc taccacaaag ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac ctttctcagg 2160

ccagacacaa ggtcagtgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2220

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2280

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2340

gagcgcgcag 2350

<210> 20

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(710)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (711)..(2187)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 20

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360

tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420

gtctgaactc aggccgggac ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc 480

ctttttttca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 540

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 600

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 660

ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta attgtttcca 720

gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780

ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840

ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900

aaaaatagct ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga 960

gagaacttgt gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa 1020

tcaatcaatc aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca 1080

aatattttga ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag 1140

cttgtataaa ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat 1200

acctagaaat aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa 1260

ttgtaagtgc ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa 1320

gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380

ttttaaagag atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat 1440

tacccacccc accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa 1500

tctttgaatt gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt 1560

taataatata tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata 1620

ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680

atttgtttat attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta 1740

actactacaa ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc 1800

tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860

aagcagcagt gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta 1920

actgtgtaca cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga 1980

gtacacttgg tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga 2040

atccaattga tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata 2100

agaagaaggt aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa 2160

acaaaaaatt ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 21

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(710)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (711)..(2187)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 21

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacatgcag actgcctgct 360

tgggtacaga ccaaagagta gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg 420

gtctgaactc aggccgggac ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc 480

ctttttttca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 540

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 600

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 660

ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta accaggtcag 720

ttgttgcttg tgaagaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agaaggtgga agggatttca 780

ctctgttttt agagatagga ttggaactaa gaattttaag tctatttggg tgaaggggca 840

gggaagtgta ggaagacagt tctaattagg aaggaggaat tatactagga agtagaggta 900

aaggaagtga gaaggcttag taaatagaag aaatctgaac ttatcaaata ggctagtgta 960

tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta ttgaggcagt 1020

tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact ttgagaagtg 1080

gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa atattgaaga 1140

aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt gagcagaggc 1200

tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc agggagaaag 1260

ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg agatccaggc 1320

ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc cctgcaggaa 1380

ccaggataag agaaattgtt tggtaaaaac taacaaacca ggcttgattc tttgcagtta 1440

gctctttatc tttctctccc acaagtagtc agtagccttg ttctagtgtt ttttgtgtta 1500

cctctttttc ctgaaaaagg aaggtactgt tgagttattg ttgttgatag taatatagta 1560

gctgacagtg gttcctctgt ttgtggcaac ttgtttccca cctaaattgc acacttagaa 1620

acagttattg gtaagcctta tattagatat atatagtgtc tggtagtctt accctctcta 1680

taattacaca ctttttggca ctgccccttt cctgccttgc agagccccag gggtgaatct 1740

tcctatttct ccagctctgc aacagtcact gtactcagtg ctgtgtccca cctgctgtgc 1800

ccacagcctc aaacagccag tgacttcaga gccaggaaac agctcaggag tctgccctga 1860

ggttgcttct cttcttattt ccttgcagcc tggccaaggg gaggcttggc ttgaactggc 1920

agctcaattt agccaaattc aggacaggcc accaggactc tttctccaca cttgctggtc 1980

ccaccccagg ttgagtgagg cagggccagt caccagagga gcccagagca gagcaggaag 2040

cagagtctga gctgctcctc cctcacccaa ggggcttcct cctctcaatt gggggaaaag 2100

tgtgagcttg tttcaaagcc tcagttgttc cttgtagttc ttggaagagg tacaagaaaa 2160

caaagacctg acagaagggg ttgaggtgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 22

<211> 2350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_3330_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(487)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (488)..(2177)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2206)..(2350)

<223> 3'ITR

<400> 22

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca 420

tccgtctcaa catttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttat tttgcaaatc acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct 540

gaagtacaca accagtattc caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta 600

attgcaaaga aattgtcaaa taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat 660

ttgttcaaac aattttattt tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa 720

aaagatttga cctagtataa tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga 780

atttgtttga gtaattgagc agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt 840

gtctcaaaag tttcaatcaa cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc 900

agtgagtacc aattacaata cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc 960

tataatttcc aaagtttctt tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc 1020

cttcttctac ctttggaaca cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc 1080

caaaaatagc tttgtcaagg tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag 1140

agagaacttg tgctttagac tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca 1200

atcaatcaat caattttcaa aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac 1260

aaatattttg attttttaat tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata 1320

gcttgtataa attggaatta caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata 1380

tacctagaaa taagattttt tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca 1440

attgtaagtg cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa 1500

agcttaatca actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt 1560

tttttaaaga gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa 1620

ttacccaccc caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa 1680

atctttgaat tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt 1740

ttaataatat atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat 1800

aataataaaa tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata 1860

aatttgttta tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt 1920

aactactaca actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg 1980

ctgcaccaat ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga 2040

gaagcagcag tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt 2100

aactgtgtac acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg 2160

agtacacttg gtattttgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2220

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2280

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2340

gagcgcgcag 2350

<210> 23

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_3330_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(710)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (711)..(2187)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 23

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca 420

tccgtctcaa catttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 540

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 600

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 660

ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta attgtttcca 720

gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780

ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840

ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900

aaaaatagct ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga 960

gagaacttgt gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa 1020

tcaatcaatc aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca 1080

aatattttga ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag 1140

cttgtataaa ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat 1200

acctagaaat aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa 1260

ttgtaagtgc ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa 1320

gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380

ttttaaagag atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat 1440

tacccacccc accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa 1500

tctttgaatt gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt 1560

taataatata tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata 1620

ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680

atttgtttat attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta 1740

actactacaa ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc 1800

tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860

aagcagcagt gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta 1920

actgtgtaca cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga 1980

gtacacttgg tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga 2040

atccaattga tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata 2100

agaagaaggt aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa 2160

acaaaaaatt ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 24

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_长_miR100_3330_SV40_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(343)

<223> H1长启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (344)..(481)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (482)..(488)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (489)..(710)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (711)..(2187)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 24

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtggaattcg 120

aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 180

acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 240

gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 300

atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc ccacccaaaa gagagaagat 360

attgaggcct gttgccacat atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca 420

tccgtctcaa catttgtgtc tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc 480

ctttttttca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 540

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 600

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 660

ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta accaggtcag 720

ttgttgcttg tgaagaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agaaggtgga agggatttca 780

ctctgttttt agagatagga ttggaactaa gaattttaag tctatttggg tgaaggggca 840

gggaagtgta ggaagacagt tctaattagg aaggaggaat tatactagga agtagaggta 900

aaggaagtga gaaggcttag taaatagaag aaatctgaac ttatcaaata ggctagtgta 960

tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta ttgaggcagt 1020

tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact ttgagaagtg 1080

gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa atattgaaga 1140

aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt gagcagaggc 1200

tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc agggagaaag 1260

ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg agatccaggc 1320

ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc cctgcaggaa 1380

ccaggataag agaaattgtt tggtaaaaac taacaaacca ggcttgattc tttgcagtta 1440

gctctttatc tttctctccc acaagtagtc agtagccttg ttctagtgtt ttttgtgtta 1500

cctctttttc ctgaaaaagg aaggtactgt tgagttattg ttgttgatag taatatagta 1560

gctgacagtg gttcctctgt ttgtggcaac ttgtttccca cctaaattgc acacttagaa 1620

acagttattg gtaagcctta tattagatat atatagtgtc tggtagtctt accctctcta 1680

taattacaca ctttttggca ctgccccttt cctgccttgc agagccccag gggtgaatct 1740

tcctatttct ccagctctgc aacagtcact gtactcagtg ctgtgtccca cctgctgtgc 1800

ccacagcctc aaacagccag tgacttcaga gccaggaaac agctcaggag tctgccctga 1860

ggttgcttct cttcttattt ccttgcagcc tggccaaggg gaggcttggc ttgaactggc 1920

agctcaattt agccaaattc aggacaggcc accaggactc tttctccaca cttgctggtc 1980

ccaccccagg ttgagtgagg cagggccagt caccagagga gcccagagca gagcaggaag 2040

cagagtctga gctgctcctc cctcacccaa ggggcttcct cctctcaatt gggggaaaag 2100

tgtgagcttg tttcaaagcc tcagttgttc cttgtagttc ttggaagagg tacaagaaaa 2160

caaagacctg acagaagggg ttgaggtgct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 25

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_AMELY_V1 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(245)

<223> 多克隆位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (246)..(251)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..(2132)

<223> AMELY_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2161)..(2305)

<223> 3'ITR

<400> 25

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacctacata agcaggtgat atgtaaattt cacctgctta 240

aatagttttt ttattatgca tatcacataa ttttatttaa aaatcattta gattttgatt 300

gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa 360

gttaaatgca aagaaattgt catataaact tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt 420

gtatatgttc atacattttt attttatcaa cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt 480

ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg 540

gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct taccttattc aagaatactc attcataata 600

tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt 660

ttccagtgag taccatttac aatacatgta ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga 720

actctataat ttccaaagtt tctttgttca ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg 780

aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa gcctattatt ttataacaaa ataacaattc 840

tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag cacattataa atccacggca ttttctatgc 900

acagagagaa catgtgcttt agactagaat agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga 960

ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc tgccccatat cacaattatt aagccattta 1020

taacatatat tatgattttt taattcagaa gttatcacat ttatacagta gtatatcatc 1080

aatagcttgt ataaattgga attacaggtg gatacatata agtgatagat cacataatct 1140

tatatacgta gaaataagat tttatggatg tggataaagt ttttttattg attattccca 1200

ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag attcagtcat aaattgaggt aacttctttt 1260

taaaagctta atcatctcaa gttagactga aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata 1320

ggttttttta aagagatttc ccatctacct ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta 1380

aaaattaccc accccatctt atcttaagcc ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag 1440

tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga 1500

gggtttaata atatattttt ctattaatgg gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt 1560

caataataat aaaatttaaa cctatcataa aaactgtgtt cttaattacc aagccattta 1620

gataaatttg tttataatgt aaagatacaa catattactt ggactaatag aatcatagat 1680

ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt tgttggaccc cttagaactc tggggccacc 1740

tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat tgtagtggct tcacagagag tgactccaac 1800

cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt atggccatag gaatattgta tttcaaaaat 1860

ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat 1920

gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat gcctaatatt ttcagggaat tacagatata 1980

ttagaatcca tttgatttaa tttactttca tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg 2040

aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa 2100

agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt gagctagcgt agataagtag catggcgggt 2160

taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 2220

gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2280

cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2305

<210> 26

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_AMELY_V2 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(245)

<223> 多克隆位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (246)..(251)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..(2132)

<223> AMELY_V2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2161)..(2305)

<223> 3'ITR

<400> 26

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacctacata agcaggtgat atgtaaattt cacctgctta 240

aatagttttt ttattttgca aatcacaaaa ttttatttaa aaatcaatta gattttgatt 300

gcgtgaagta cacaaccagt attccaaatc ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa 360

gttaattgca aagaaattgt caaataaact tcccttcaat tggttcaggt ttcagtgatt 420

gtatttgttc aaacaatttt attttatcaa cgattttaac tgttgtgtaa acttcaattt 480

ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag ttttctctaa aaagaaatat agtccaattg 540

gtgaatttgt ttgagtaatt gagcagttct taccttattc aagaatactc aatcaaaatt 600

tgttgtctca aaagtttcaa tcaacacaaa gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt 660

ttccagtgag taccaattac aatacttgta ttcaaaccag tgtacaacca cttaagttga 720

actctataat ttccaaagtt tctttgttca atcgttgtca atagatatta ggtgtccttg 780

aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa gcctattatt ttataacaaa ataacaattc 840

tttccaaaaa tagctttgtc aaggtgtgag cacaatataa atccacggca atttctttgc 900

acagagagaa cttgtgcttt agactagaat agccagtgat agtcgtcaga ttacttggga 960

ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc tgccccaaat cacaattatt aagccaatta 1020

taacaaatat tttgattttt taattcagaa gttatcacaa ttatacagta gtatatcaac 1080

aatagcttgt ataaattgga attacaggtg gatacaaata agtgatagat cacaaaatct 1140

tatatacgta gaaataagat tttttggttg tggataaagt ttttttattg attattccca 1200

atcaattgta agtgcttctt gtattgggag attcagtcaa aaattgaggt aacttctttt 1260

taaaagctta atcaactcaa gttagactga aaactactga aattgggaaa ccttcgtata 1320

ggttttttta aagagatttc ccacctacct ttcaaagctt gttcaaatat ttgcactcta 1380

aaaattaccc accccacctt atcttaagcc ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag 1440

tcaaatcttt gaattgaaag aactgatatt cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga 1500

gggtttaata atatattttt ctattattgg gttgtcaaaa tatacagtct ggtagaaatt 1560

caataataat aaaatttaaa cctatcaaaa aaactgtgtt cttaattacc aagccaatta 1620

gataaatttg tttatattgt aaagatacaa caaattactt ggactaatag aatcaaagat 1680

ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt tgttggaccc cttagaactc tggggccacc 1740

tttgctgcac caatttcaca ggatttgcag tgtagtggct tcacagagag tgactccaac 1800

cagagaagca gcagtgttgt ctttgccaat ttggccaaag gaatattgta tttcaaaaat 1860

ttgtaactgt gtacacagac ttgatttttt acaaactaaa tttcccaata gtgtctgttt 1920

gtggagtaca cttggtattt tcttaaaatt gcctaatatt ttcagggaat tacagatata 1980

ttagaatcca attgatttaa tttactttca acccttgcag aaattcactg ttgcggtagg 2040

aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc caaaggtcct gcttttcagt gtaagagcaa 2100

agcaaacaaa aaattttgcc gcaatattgt gagctagcgt agataagtag catggcgggt 2160

taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 2220

gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2280

cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2305

<210> 27

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V1 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(245)

<223> 多克隆位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (246)..(251)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..(2132)

<223> PSG11_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2161)..(2305)

<223> 3'ITR

<400> 27

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacctacata agcaggtgat atgtaaattt cacctgctta 240

aatagttttt tacgaggtca gatgttgctt gtgatgaagg gtgtggttaa gtctgcagtg 300

cagatggtgg aagggatttc actctgtttt tagacatagc attggaacta agaattttat 360

gtctatatgg gtgaaggggc agggatgtgt aggaagacag ttctaattag gatggaggaa 420

ttatactagg aagtagaggt aaaggaagtg agaaggctta gtaaatagaa gaaatgtgaa 480

cttatcaaat aggctagtgt atacccctgg agattcttga ttaagtgaat taactagatt 540

ttagaaaggt aatgaggcag ttatatgcaa ggaacatttc aaagtctgga gacaagaagt 600

caagcaatac tttgagaagt ggttgagctt tatgggaatg gagagaatta cactattgag 660

atatgttaaa aataatgaag aaggtttcac catgtgaaat tgtgtttctc atttgaatct 720

gagaaacaaa tgagcagagg ctggagataa ttatgtctaa aagacagtgg ggtacaggga 780

gcataaaggc cagggagaaa gggaactgca ggaattagtg ctgagaagca ggagttagtg 840

gatgaaggag gagatccagg cccagataca ggcaaataag tcatttccct ctcccaagca 900

tggcagtcag ccctgcagga accaggataa gagaaaaatg gttggtaaaa actaacatac 960

caggcttgat tctttgcagt tagctcttta tctttctctc ccacaagtag tcagtagcct 1020

tgttctagtg ttttatgtgt tacctctttt tccggaaaaa ggaaggtact gttgagttaa 1080

tgatgatgat agtaatatag tagctgacat tggttcctct gtatgtggca tcttgtttcc 1140

catctaaatt gcacacttag aaacagttaa tggtaagcct tatattagat atatatagtg 1200

tctggtagtc ttaccctctc tataattaca cactttttgg cactgcccct ttcctgccat 1260

gcagagcccc aggggtgaat cttcctattt ctccagctct gcatcagtca ctgtactcag 1320

tgctgtgtcc cacgtgctgt gcccacagcc tcatacagcc agtgacttca gagccaggac 1380

gcagctcagg agtctgccct gaggttgctt ctcttcttat ttccttgcag cctggcccgg 1440

gggaggcttg gcttgaactg gcagctcaat ttagccaaat tcaggacagg ccaccaggac 1500

tctttctcca cacatgctgg tcccacccca ggttgagtga ggcagggcca gtcaccagag 1560

gagcccggag cagagcagga agcagagtct gagctgctcc tccctcaccc aaggggcttc 1620

ctcctctcat ttgggggaaa agtgtgagct tgtttcaaag cctcagatgt tccttgtagt 1680

tcatggaaga ggtacaagaa aacaaagacg tgacagaagg ggatgaggtg gtgacagtga 1740

gaagcaactc gatgttcagc actctccttc ttgtccctct gtgaagcctc ttctaccaca 1800

tagggctcag ggctgataaa gccccctccc tacctttctc aggccagaca caaggtcagt 1860

catgagaaaa cagaaaaaaa aggagaagag agtctgtaga gacaaattgg gagggttcag 1920

gaggagaatt tgggatttgc ctgtgcccat gggacacagg ctgggaataa aaatgttttc 1980

ctgactcttc tctgaaagct agatagactc cacctaaaac cctattgcca aggatgctgg 2040

gcccacagtt gatgtcatct gagggaaggg gaagctcctt gtctcttaaa gggacacagt 2100

gaccctctga gccaagacac accctcaagt ccgctagcgt agataagtag catggcgggt 2160

taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 2220

gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2280

cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2305

<210> 28

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V2 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(245)

<223> 多克隆位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (246)..(251)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (252)..(2132)

<223> PSG11_V2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2161)..(2305)

<223> 3'ITR

<400> 28

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacctacata agcaggtgat atgtaaattt cacctgctta 240

aatagttttt tgtatacccc tggagattct tgattaagtg aattaactag attttagaaa 300

ggtattgagg cagttatttg caaggaacaa ttcaaagtct ggagacaaga agtcaagcaa 360

tactttgaga agtggttgag ctttttggga ttggagagaa ttacactatt gagatttgtt 420

aaaaatattg aagaaggttt caccttgtga aattgtgttt ctcaattgaa tctgagaaac 480

aattgagcag aggctggaga taattttgtc taaaagacag tggggtacag ggagcaaaaa 540

ggccagggag aaagggaact gcaggaatta gtgctgagaa gcaggagtta gtggttgaag 600

gaggagatcc aggcccagat acaggcaaat aagtcaattc cctctcccaa gcttggcagt 660

cagccctgca ggaaccagga taagagaaaa gaagaaaaga aaagaaggat tgaaggtgtt 720

gttattttac ttgggggagc gtcaggaaca agcttgtaac ttgagatact gtataattgt 780

ttcttcaagg actacaatat ttctgttgga aaattgttgg gagttgatta tattcttgca 840

gttttttttc cctctcacct tgtttctcag gtggtgatca gtcctctgtc aattctctac 900

tgcactcagg tattttggaa ggctttcaga cgtgagaaag gctgattgct attttctttg 960

tcagtggaac ttgtcacctt tgcacctttt cttggttgca actttttctc agtgtctctg 1020

tttggtaaaa actaacaaac caggcttgat tctttgcagt tagctcttta tctttctctc 1080

ccacaagtag tcagtagcct tgttctagtg ttttttgtgt tacctctttt tccggaaaaa 1140

ggaaggtact gttgagttat tgttgttgat agtaatatag tagctgacag tggttcctct 1200

gtttgtggca acttgtttcc cacctaaatt gcacacttag aaacagttat tggtaagcct 1260

tatattagat atatatagtg tctggtagtc ttaccctctc tataattaca cactttttgg 1320

cactgcccct ttcctgcctt gcagagcccc aggggtgaat cttcctattt ctccagctct 1380

gcaacagtca ctgtactcag tgctgtgtcc cacgtgctgt gcccacagcc tcaaacagcc 1440

agtgacttca gagccaggac gcagctcagg agtctgccct gaggttgctt ctcttcttat 1500

ttccttgcag cctggcccgg gggaggcttg gcttgaactg gcagctcaat ttagccaaat 1560

tcaggacagg ccaccaggac tctttctcca cacttgctgg tcccacccca ggttgagtga 1620

ggcagggcca gtcaccagag gagcccggag cagagcagga agcagagtct gagctgctcc 1680

tccctcaccc aaggggcttc ctcctctcaa ttgggggaaa agtgtgagct tgtttcaaag 1740

cctcagttgt tccttgtagt tcttggaaga ggtacaagaa aacaaagacg tgacagaagg 1800

ggttgaggtg gtgacagtga gaagcaactc gttgttcagc actctccttc ttgtccctct 1860

gtgaagcctc ttctaccaca aagggctcag ggctgataaa gccccctccc tacctttctc 1920

aggccagaca caaggtcagt cttgagaaaa cagaaaaaaa aggagaagag agtctgtaga 1980

gacaaattgg gcaaattgtt ttcctgactc ttctctgaaa gctagataga ctccacctaa 2040

aaccctattg ccaaggttgc tggggagaat aaagccacag ttgttgtcaa ctgagggaag 2100

gggaagctcc ttgtctctta aagggacaca gtgctagcgt agataagtag catggcgggt 2160

taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 2220

gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2280

cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2305

<210> 29

<211> 2410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(356)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (357)..(2237)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2266)..(2410)

<223> 3'ITR

<400> 29

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240

caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300

ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc tttttttatt 360

ttgcaaatca caaaatttta tttaaaaatc aattagattt tgattgcctg aagtacacaa 420

ccagtattcc aaatcctaat ttgttttgta atacagtctt caaaagttaa ttgcaaagaa 480

attgtcaaat aaacttccct tcaattggtt caggtttcag tgattgtatt tgttcaaaca 540

attttatttt atcaaggatt ttaactgttg tgtaaacttc aatttttaaa aagatttgac 600

ctagtataat ttcagttttc tctaaaaaga aatatagtcc aattggtgaa tttgtttgag 660

taattgagca gttcttacct tattcaagaa tactcaatca aaatttgttg tctcaaaagt 720

ttcaatcaac acaaagcaaa aggaacaatt aaataattta attgtttcca gtgagtacca 780

attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct ataatttcca 840

aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc ttcttctacc 900

tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc aaaaatagct 960

ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga gagaacttgt 1020

gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa tcaatcaatc 1080

aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca aatattttga 1140

ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag cttgtataaa 1200

ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat acctagaaat 1260

aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa ttgtaagtgc 1320

ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa gcttaatcaa 1380

ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt ttttaaagag 1440

atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat tacccacccc 1500

accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa tctttgaatt 1560

gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt taataatata 1620

tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata ataataaaat 1680

ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa atttgtttat 1740

attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta actactacaa 1800

ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc tgcaccaatt 1860

tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag aagcagcagt 1920

gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta actgtgtaca 1980

cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga gtacacttgg 2040

tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga atccaattga 2100

tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata agaagaaggt 2160

aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa acaaaaaatt 2220

ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2280

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2340

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2400

gagcgcgcag 2410

<210> 30

<211> 2368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(2195)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2224)..(2368)

<223> 3'ITR

<400> 30

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240

caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300

ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc tttttttacc 360

aggtcagttg ttgcttgtga agaagggtgt ggttaagtct gcagtgcaga aggtggaagg 420

gatttcactc tgtttttaga gataggattg gaactaagaa ttttaagtct atttgggtga 480

aggggcaggg aagtgtagga agacagttct aattaggaag gaggaattat actaggaagt 540

agaggtaaag gaagtgagaa ggcttagtaa atagaagaaa tctgaactta tcaaataggc 600

tagtgtatac ccctggagat tcttgattaa gtgaattaac tagattttag aaaggtattg 660

aggcagttat ttgcaaggaa caattcaaag tctggagaca agaagtcaag caatactttg 720

agaagtggtt gagctttttg ggattggaga gaattacact attgagattt gttaaaaata 780

ttgaagaagg tttcaccttg tgaaattgtg tttctcaatt gaatctgaga aacaattgag 840

cagaggctgg agataatttt gtctaaaaga cagtggggta cagggagcaa aaaggccagg 900

gagaaaggga actgcaggaa ttagtgctga gaagcaggag ttagtggttg aaggaggaga 960

tccaggccca gatacaggca aataagtcaa ttccctctcc caagcttggc agtcagccct 1020

gcaggaacca ggataagaga aattgtttgg taaaaactaa caaaccaggc ttgattcttt 1080

gcagttagct ctttatcttt ctctcccaca agtagtcagt agccttgttc tagtgttttt 1140

tgtgttacct ctttttcctg aaaaaggaag gtactgttga gttattgttg ttgatagtaa 1200

tatagtagct gacagtggtt cctctgtttg tggcaacttg tttcccacct aaattgcaca 1260

cttagaaaca gttattggta agccttatat tagatatata tagtgtctgg tagtcttacc 1320

ctctctataa ttacacactt tttggcactg cccctttcct gccttgcaga gccccagggg 1380

tgaatcttcc tatttctcca gctctgcaac agtcactgta ctcagtgctg tgtcccacct 1440

gctgtgccca cagcctcaaa cagccagtga cttcagagcc aggaaacagc tcaggagtct 1500

gccctgaggt tgcttctctt cttatttcct tgcagcctgg ccaaggggag gcttggcttg 1560

aactggcagc tcaatttagc caaattcagg acaggccacc aggactcttt ctccacactt 1620

gctggtccca ccccaggttg agtgaggcag ggccagtcac cagaggagcc cagagcagag 1680

caggaagcag agtctgagct gctcctccct cacccaaggg gcttcctcct ctcaattggg 1740

ggaaaagtgt gagcttgttt caaagcctca gttgttcctt gtagttcttg gaagaggtac 1800

aagaaaacaa agacctgaca gaaggggttg aggtggtgac agtgagaagc aactggttgt 1860

tcagcactct ccttcttgtc cctctgtgaa gcctcttcta cccaaagggc tcagggctga 1920

taaagccccc tccctacctt tctcaggcca gacacaaggt cagtcttgag aaaacagaaa 1980

aaaaaggaga agagagtctg tagagacaaa ttgggagggt tcaggaggag aatttgggat 2040

ttgcctgtgc ccaagggaca caggctggga atcaaattgt tttcctgact cttctctgaa 2100

agctagatag actccaccta aaaccctatt gccaaggttg ctgggccaca gttgttgtca 2160

actgagggaa ggggaagctc cttgtctctt aaagggctag cgtagataag tagcatggcg 2220

ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 2280

ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 2340

cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 2368

<210> 31

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(579)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (580)..(2187)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 31

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240

caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300

ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc tttttttcag 360

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatatagtcc aattggtgaa 600

tttgtttgag taattgagca gttcttacct tattcaagaa tactcaatca aaatttgttg 660

tctcaaaagt ttcaatcaac acaaagcaaa aggaacaatt aaataattta attgtttcca 720

gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780

ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840

ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900

aaaaatagct ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga 960

gagaacttgt gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa 1020

tcaatcaatc aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca 1080

aatattttga ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag 1140

cttgtataaa ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat 1200

acctagaaat aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa 1260

ttgtaagtgc ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa 1320

gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380

ttttaaagag atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat 1440

tacccacccc accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa 1500

tctttgaatt gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt 1560

taataatata tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata 1620

ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680

atttgtttat attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta 1740

actactacaa ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc 1800

tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860

aagcagcagt gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta 1920

actgtgtaca cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga 1980

gtacacttgg tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga 2040

atccaattga tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata 2100

agaagaaggt aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa 2160

acaaaaaatt ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 32

<211> 2369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(579)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (580)..(2196)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2225)..(2369)

<223> 3'ITR

<400> 32

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240

caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300

ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc tttttttcag 360

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa ccaggtcagt tgttgcttgt 600

gaagaagggt gtggttaagt ctgcagtgca gaaggtggaa gggatttcac tctgttttta 660

gagataggat tggaactaag aattttaagt ctatttgggt gaaggggcag ggaagtgtag 720

gaagacagtt ctaattagga aggaggaatt atactaggaa gtagaggtaa aggaagtgag 780

aaggcttagt aaatagaaga aatctgaact tatcaaatag gctagtgtat acccctggag 840

attcttgatt aagtgaatta actagatttt agaaaggtat tgaggcagtt atttgcaagg 900

aacaattcaa agtctggaga caagaagtca agcaatactt tgagaagtgg ttgagctttt 960

tgggattgga gagaattaca ctattgagat ttgttaaaaa tattgaagaa ggtttcacct 1020

tgtgaaattg tgtttctcaa ttgaatctga gaaacaattg agcagaggct ggagataatt 1080

ttgtctaaaa gacagtgggg tacagggagc aaaaaggcca gggagaaagg gaactgcagg 1140

aattagtgct gagaagcagg agttagtggt tgaaggagga gatccaggcc cagatacagg 1200

caaataagtc aattccctct cccaagcttg gcagtcagcc ctgcaggaac caggataaga 1260

gaaattgttt ggtaaaaact aacaaaccag gcttgattct ttgcagttag ctctttatct 1320

ttctctccca caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc 1380

tgaaaaagga aggtactgtt gagttattgt tgttgatagt aatatagtag ctgacagtgg 1440

ttcctctgtt tgtggcaact tgtttcccac ctaaattgca cacttagaaa cagttattgg 1500

taagccttat attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat aattacacac 1560

tttttggcac tgcccctttc ctgccttgca gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc 1620

cagctctgca acagtcactg tactcagtgc tgtgtcccac ctgctgtgcc cacagcctca 1680

aacagccagt gacttcagag ccaggaaaca gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc 1740

ttcttatttc cttgcagcct ggccaagggg aggcttggct tgaactggca gctcaattta 1800

gccaaattca ggacaggcca ccaggactct ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt 1860

tgagtgaggc agggccagtc accagaggag cccagagcag agcaggaagc agagtctgag 1920

ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt 1980

ttcaaagcct cagttgttcc ttgtagttct tggaagaggt acaagaaaac aaagacctga 2040

cagaaggggt tgaggtggtg acagtgagaa gcaactggtt gttcagcact ctccttcttg 2100

tccctctgtg aagcctcttc taccacaaag ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac 2160

ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtctt gagaaagcta gcgtagataa gtagcatggc 2220

gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 2280

gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 2340

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 2369

<210> 33

<211> 2410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR100_3330_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(356)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (357)..(2237)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2266)..(2410)

<223> 3'ITR

<400> 33

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240

ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300

atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttatt 360

ttgcaaatca caaaatttta tttaaaaatc aattagattt tgattgcctg aagtacacaa 420

ccagtattcc aaatcctaat ttgttttgta atacagtctt caaaagttaa ttgcaaagaa 480

attgtcaaat aaacttccct tcaattggtt caggtttcag tgattgtatt tgttcaaaca 540

attttatttt atcaaggatt ttaactgttg tgtaaacttc aatttttaaa aagatttgac 600

ctagtataat ttcagttttc tctaaaaaga aatatagtcc aattggtgaa tttgtttgag 660

taattgagca gttcttacct tattcaagaa tactcaatca aaatttgttg tctcaaaagt 720

ttcaatcaac acaaagcaaa aggaacaatt aaataattta attgtttcca gtgagtacca 780

attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct ataatttcca 840

aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc ttcttctacc 900

tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc aaaaatagct 960

ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga gagaacttgt 1020

gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa tcaatcaatc 1080

aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca aatattttga 1140

ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag cttgtataaa 1200

ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat acctagaaat 1260

aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa ttgtaagtgc 1320

ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa gcttaatcaa 1380

ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt ttttaaagag 1440

atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat tacccacccc 1500

accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa tctttgaatt 1560

gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt taataatata 1620

tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata ataataaaat 1680

ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa atttgtttat 1740

attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta actactacaa 1800

ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc tgcaccaatt 1860

tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag aagcagcagt 1920

gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta actgtgtaca 1980

cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga gtacacttgg 2040

tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga atccaattga 2100

tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata agaagaaggt 2160

aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa acaaaaaatt 2220

ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca 2280

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 2340

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 2400

gagcgcgcag 2410

<210> 34

<211> 2368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR100_3330_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(2195)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2224)..(2368)

<223> 3'ITR

<400> 34

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240

ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300

atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttacc 360

aggtcagttg ttgcttgtga agaagggtgt ggttaagtct gcagtgcaga aggtggaagg 420

gatttcactc tgtttttaga gataggattg gaactaagaa ttttaagtct atttgggtga 480

aggggcaggg aagtgtagga agacagttct aattaggaag gaggaattat actaggaagt 540

agaggtaaag gaagtgagaa ggcttagtaa atagaagaaa tctgaactta tcaaataggc 600

tagtgtatac ccctggagat tcttgattaa gtgaattaac tagattttag aaaggtattg 660

aggcagttat ttgcaaggaa caattcaaag tctggagaca agaagtcaag caatactttg 720

agaagtggtt gagctttttg ggattggaga gaattacact attgagattt gttaaaaata 780

ttgaagaagg tttcaccttg tgaaattgtg tttctcaatt gaatctgaga aacaattgag 840

cagaggctgg agataatttt gtctaaaaga cagtggggta cagggagcaa aaaggccagg 900

gagaaaggga actgcaggaa ttagtgctga gaagcaggag ttagtggttg aaggaggaga 960

tccaggccca gatacaggca aataagtcaa ttccctctcc caagcttggc agtcagccct 1020

gcaggaacca ggataagaga aattgtttgg taaaaactaa caaaccaggc ttgattcttt 1080

gcagttagct ctttatcttt ctctcccaca agtagtcagt agccttgttc tagtgttttt 1140

tgtgttacct ctttttcctg aaaaaggaag gtactgttga gttattgttg ttgatagtaa 1200

tatagtagct gacagtggtt cctctgtttg tggcaacttg tttcccacct aaattgcaca 1260

cttagaaaca gttattggta agccttatat tagatatata tagtgtctgg tagtcttacc 1320

ctctctataa ttacacactt tttggcactg cccctttcct gccttgcaga gccccagggg 1380

tgaatcttcc tatttctcca gctctgcaac agtcactgta ctcagtgctg tgtcccacct 1440

gctgtgccca cagcctcaaa cagccagtga cttcagagcc aggaaacagc tcaggagtct 1500

gccctgaggt tgcttctctt cttatttcct tgcagcctgg ccaaggggag gcttggcttg 1560

aactggcagc tcaatttagc caaattcagg acaggccacc aggactcttt ctccacactt 1620

gctggtccca ccccaggttg agtgaggcag ggccagtcac cagaggagcc cagagcagag 1680

caggaagcag agtctgagct gctcctccct cacccaaggg gcttcctcct ctcaattggg 1740

ggaaaagtgt gagcttgttt caaagcctca gttgttcctt gtagttcttg gaagaggtac 1800

aagaaaacaa agacctgaca gaaggggttg aggtggtgac agtgagaagc aactggttgt 1860

tcagcactct ccttcttgtc cctctgtgaa gcctcttcta cccaaagggc tcagggctga 1920

taaagccccc tccctacctt tctcaggcca gacacaaggt cagtcttgag aaaacagaaa 1980

aaaaaggaga agagagtctg tagagacaaa ttgggagggt tcaggaggag aatttgggat 2040

ttgcctgtgc ccaagggaca caggctggga atcaaattgt tttcctgact cttctctgaa 2100

agctagatag actccaccta aaaccctatt gccaaggttg ctgggccaca gttgttgtca 2160

actgagggaa ggggaagctc cttgtctctt aaagggctag cgtagataag tagcatggcg 2220

ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 2280

ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 2340

cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 2368

<210> 35

<211> 2360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR100_3330_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(579)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (580)..(2187)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2216)..(2360)

<223> 3'ITR

<400> 35

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240

ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300

atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttcag 360

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatatagtcc aattggtgaa 600

tttgtttgag taattgagca gttcttacct tattcaagaa tactcaatca aaatttgttg 660

tctcaaaagt ttcaatcaac acaaagcaaa aggaacaatt aaataattta attgtttcca 720

gtgagtacca attacaatac ttgtattcaa accagtgtac aaccacttaa gttgaactct 780

ataatttcca aagtttcttt gttcaatcct tgtcaataga tattaggtgt ccttgaagcc 840

ttcttctacc tttggaacac ttaaagccta ttattttata acaaaataac aattctttcc 900

aaaaatagct ttgtcaaggt gtgagcacaa tataaatcca gggcaatttc tttgcacaga 960

gagaacttgt gctttagact agaatagcca gtgatagtcc tcagattact tgggattcaa 1020

tcaatcaatc aattttcaaa aattctgccc caaatcacaa ttattaagcc aattataaca 1080

aatattttga ttttttaatt cagaagttat cacaattata cagtagtata tcaacaatag 1140

cttgtataaa ttggaattac aggtggatac aaataagtga tagatcacaa aatcttatat 1200

acctagaaat aagatttttt ggttgtggat aaagtttttt tattgattat tcccaatcaa 1260

ttgtaagtgc ttcttgtatt gggagattca gtcaaaaatt gaggtaactt ctttttaaaa 1320

gcttaatcaa ctcaagttag actgaaaact actgaaattg ggaaaccttc ctataggttt 1380

ttttaaagag atttcccacc tacctttcaa agcttgttca aatatttgca ctctaaaaat 1440

tacccacccc accttatctt aagccttcac tgcaattcta gcctcttctt gtgagtcaaa 1500

tctttgaatt gaaagaactg atattccctt attgctgttg cccttaaaat taagagggtt 1560

taataatata tttttctatt attgggttgt caaaatatac agtctggtag aaattcaata 1620

ataataaaat ttaaacctat caaaaaaact gtgttcttaa ttaccaagcc aattagataa 1680

atttgtttat attgtaaaga tacaacaaat tacttggact aatagaatca aagatctgta 1740

actactacaa ctctagaccc tgagttgttg gaccccttag aactctgggg ccacctttgc 1800

tgcaccaatt tcacaggatt tgcagtgtag tggcttcaca gagagtgact ccaaccagag 1860

aagcagcagt gttgtctttg ccaatttggc caaaggaata ttgtatttca aaaatttgta 1920

actgtgtaca cagacttgat tttttacaaa ctaaatttcc caatagtgtc tgtttgtgga 1980

gtacacttgg tattttctta aaattgccta atattttcag ggaattacag atatattaga 2040

atccaattga tttaatttac tttcaaccct tgcagaaatt cactgttggg gtaggaaata 2100

agaagaaggt aaaactgttt atttccaaag gtcctgcttt tcagtgtaag agcaaagcaa 2160

acaaaaaatt ttgccccaat attgtgagct agcgtagata agtagcatgg cgggttaatc 2220

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 2280

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 2340

gtgagcgagc gagcgcgcag 2360

<210> 36

<211> 2369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_天然_miR100_3330_SV40_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(350)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (351)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(579)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (580)..(2196)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2225)..(2369)

<223> 3'ITR

<400> 36

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cacccaaaag agagaagata ttgaggcctg 240

ttgccacata tgctgagact gataatgtgg gtattagtcc gccacatcat ccgtctcaac 300

atttgtgtct gttaggcaat ctcacggacc tggggctttg cttatatgcc tttttttcag 360

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 420

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 480

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg 540

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa ccaggtcagt tgttgcttgt 600

gaagaagggt gtggttaagt ctgcagtgca gaaggtggaa gggatttcac tctgttttta 660

gagataggat tggaactaag aattttaagt ctatttgggt gaaggggcag ggaagtgtag 720

gaagacagtt ctaattagga aggaggaatt atactaggaa gtagaggtaa aggaagtgag 780

aaggcttagt aaatagaaga aatctgaact tatcaaatag gctagtgtat acccctggag 840

attcttgatt aagtgaatta actagatttt agaaaggtat tgaggcagtt atttgcaagg 900

aacaattcaa agtctggaga caagaagtca agcaatactt tgagaagtgg ttgagctttt 960

tgggattgga gagaattaca ctattgagat ttgttaaaaa tattgaagaa ggtttcacct 1020

tgtgaaattg tgtttctcaa ttgaatctga gaaacaattg agcagaggct ggagataatt 1080

ttgtctaaaa gacagtgggg tacagggagc aaaaaggcca gggagaaagg gaactgcagg 1140

aattagtgct gagaagcagg agttagtggt tgaaggagga gatccaggcc cagatacagg 1200

caaataagtc aattccctct cccaagcttg gcagtcagcc ctgcaggaac caggataaga 1260

gaaattgttt ggtaaaaact aacaaaccag gcttgattct ttgcagttag ctctttatct 1320

ttctctccca caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc 1380

tgaaaaagga aggtactgtt gagttattgt tgttgatagt aatatagtag ctgacagtgg 1440

ttcctctgtt tgtggcaact tgtttcccac ctaaattgca cacttagaaa cagttattgg 1500

taagccttat attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat aattacacac 1560

tttttggcac tgcccctttc ctgccttgca gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc 1620

cagctctgca acagtcactg tactcagtgc tgtgtcccac ctgctgtgcc cacagcctca 1680

aacagccagt gacttcagag ccaggaaaca gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc 1740

ttcttatttc cttgcagcct ggccaagggg aggcttggct tgaactggca gctcaattta 1800

gccaaattca ggacaggcca ccaggactct ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt 1860

tgagtgaggc agggccagtc accagaggag cccagagcag agcaggaagc agagtctgag 1920

ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt 1980

ttcaaagcct cagttgttcc ttgtagttct tggaagaggt acaagaaaac aaagacctga 2040

cagaaggggt tgaggtggtg acagtgagaa gcaactggtt gttcagcact ctccttcttg 2100

tccctctgtg aagcctcttc taccacaaag ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac 2160

ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtctt gagaaagcta gcgtagataa gtagcatggc 2220

gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 2280

gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 2340

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 2369

<210> 37

<211> 2401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR1-1_1784_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(347)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (348)..(2228)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2257)..(2401)

<223> 3' ITR

<400> 37

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttat tttgcaaatc 360

acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct gaagtacaca accagtattc 420

caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta attgcaaaga aattgtcaaa 480

taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat ttgttcaaac aattttattt 540

tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa aaagatttga cctagtataa 600

tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga atttgtttga gtaattgagc 660

agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt gtctcaaaag tttcaatcaa 720

cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc agtgagtacc aattacaata 780

cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc tataatttcc aaagtttctt 840

tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc cttcttctac ctttggaaca 900

cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc caaaaatagc tttgtcaagg 960

tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag agagaacttg tgctttagac 1020

tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca atcaatcaat caattttcaa 1080

aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac aaatattttg attttttaat 1140

tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata gcttgtataa attggaatta 1200

caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata tacctagaaa taagattttt 1260

tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca attgtaagtg cttcttgtat 1320

tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca actcaagtta 1380

gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga gatttcccac 1440

ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc caccttatct 1500

taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat tgaaagaact 1560

gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat atttttctat 1620

tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa tttaaaccta 1680

tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta tattgtaaag 1740

atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca actctagacc 1800

ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat ttcacaggat 1860

ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag tgttgtcttt 1920

gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac acagacttga 1980

ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg gtattttctt 2040

aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg atttaattta 2100

ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg taaaactgtt 2160

tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat tttgccccaa 2220

tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 2280

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 2340

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 2400

g 2401

<210> 38

<211> 2402

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR1-1_1784_PSG11_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR-1-1 1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(2229)

<223> PSG11_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2258)..(2402)

<223> 3'ITR

<400> 38

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttgt atacccctgg 360

agattcttga ttaagtgaat taactagatt ttagaaaggt attgaggcag ttatttgcaa 420

ggaacaattc aaagtctgga gacaagaagt caagcaatac tttgagaagt ggttgagctt 480

tttgggattg gagagaatta cactattgag atttgttaaa aatattgaag aaggtttcac 540

cttgtgaaat tgtgtttctc aattgaatct gagaaacaat tgagcagagg ctggagataa 600

ttttgtctaa aagacagtgg ggtacaggga gcaaaaaggc cagggagaaa gggaactgca 660

ggaattagtg ctgagaagca ggagttagtg gttgaaggag gagatccagg cccagataca 720

ggcaaataag tcaattccct ctcccaagct tggcagtcag ccctgcagga accaggataa 780

gagaaaagaa gaaaagaaaa gaaggattga aggtgttgtt attttacttg ggggagcctc 840

aggaacaagc ttgtaacttg agatactgta taattgtttc ttcaaggact acaatatttc 900

tgttggaaaa ttgttgggag ttgattatat tcttgcagtt ttttttccct ctcaccttgt 960

ttctcaggtg gtgatcagtc ctctgtcaat tctctactgc actcaggtat tttggaaggc 1020

tttcagaggt gagaaaggct gattgctatt ttctttgtca gtggaacttg tcacctttgc 1080

accttttctt ggttgcaact ttttctcagt gtctctgttt ggtaaaaact aacaaaccag 1140

gcttgattct ttgcagttag ctctttatct ttctctccca caagtagtca gtagccttgt 1200

tctagtgttt tttgtgttac ctctttttcc tgaaaaagga aggtactgtt gagttattgt 1260

tgttgatagt aatatagtag ctgacagtgg ttcctctgtt tgtggcaact tgtttcccac 1320

ctaaattgca cacttagaaa cagttattgg taagccttat attagatata tatagtgtct 1380

ggtagtctta ccctctctat aattacacac tttttggcac tgcccctttc ctgccttgca 1440

gagccccagg ggtgaatctt cctatttctc cagctctgca acagtcactg tactcagtgc 1500

tgtgtcccac ctgctgtgcc cacagcctca aacagccagt gacttcagag ccaggaccca 1560

gctcaggagt ctgccctgag gttgcttctc ttcttatttc cttgcagcct ggccctgggg 1620

aggcttggct tgaactggca gctcaattta gccaaattca ggacaggcca ccaggactct 1680

ttctccacac ttgctggtcc caccccaggt tgagtgaggc agggccagtc accagaggag 1740

ccctgagcag agcaggaagc agagtctgag ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc 1800

ctctcaattg ggggaaaagt gtgagcttgt ttcaaagcct cagttgttcc ttgtagttct 1860

tggaagaggt acaagaaaac aaagacctga cagaaggggt tgaggtggtg acagtgagaa 1920

gcaactggtt gttcagcact ctccttcttg tccctctgtg aagcctcttc taccacaaag 1980

ggctcagggc tgataaagcc ccctccctac ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtctt 2040

gagaaaacag aaaaaaaagg agaagagagt ctgtagagac aaattgggca aattgttttc 2100

ctgactcttc tctgaaagct agatagactc cacctaaaac cctattgcca aggttgctgg 2160

ggagaataaa gccacagttg ttgtcaactg agggaagggg aagctccttg tctcttaaag 2220

ggacacagtg ctagcgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 2280

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2340

ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2400

ag 2402

<210> 39

<211> 2359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR1-1_1784_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(2186)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2215)..(2359)

<223> 3'ITR

<400> 39

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttac caggtcagtt 360

gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag aaggtggaag ggatttcact 420

ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc tatttgggtg aaggggcagg 480

gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta tactaggaag tagaggtaaa 540

ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt atcaaatagg ctagtgtata 600

cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta gaaaggtatt gaggcagtta 660

tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa gcaatacttt gagaagtggt 720

tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt tgttaaaaat attgaagaag 780

gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag aaacaattga gcagaggctg 840

gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca aaaaggccag ggagaaaggg 900

aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt gaaggaggag atccaggccc 960

agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg cagtcagccc tgcaggaacc 1020

aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc 1080

tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc 1140

tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt gttgatagta atatagtagc 1200

tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc taaattgcac acttagaaac 1260

agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg gtagtcttac cctctctata 1320

attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag agccccaggg gtgaatcttc 1380

ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct gtgtcccacc tgctgtgccc 1440

acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag ctcaggagtc tgccctgagg 1500

ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga ggcttggctt gaactggcag 1560

ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt tctccacact tgctggtccc 1620

accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc ccagagcaga gcaggaagca 1680

gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg 1740

tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca 1800

aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag caactggttg ttcagcactc 1860

tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct acccaaaggg ctcagggctg ataaagcccc 1920

ctccctacct ttctcaggcc agacacaagg tcagtcttga gaaaacagaa aaaaaaggag 1980

aagagagtct gtagagacaa attgggaggg ttcaggagga gaatttggga tttgcctgtg 2040

cccaagggac acaggctggg aatcaaattg ttttcctgac tcttctctga aagctagata 2100

gactccacct aaaaccctat tgccaaggtt gctgggccac agttgttgtc aactgaggga 2160

aggggaagct ccttgtctct taaagggcta gcgtagataa gtagcatggc gggttaatca 2220

ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 2280

tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 2340

tgagcgagcg agcgcgcag 2359

<210> 40

<211> 2351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR1-1_1784_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(570)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (571)..(2178)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2207)..(2351)

<223> 3' ITR

<400> 40

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttca gacatgataa 360

gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 420

gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 480

acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt 540

aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatatagtc caattggtga atttgtttga 600

gtaattgagc agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt gtctcaaaag 660

tttcaatcaa cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc agtgagtacc 720

aattacaata cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc tataatttcc 780

aaagtttctt tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc cttcttctac 840

ctttggaaca cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc caaaaatagc 900

tttgtcaagg tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag agagaacttg 960

tgctttagac tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca atcaatcaat 1020

caattttcaa aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac aaatattttg 1080

attttttaat tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata gcttgtataa 1140

attggaatta caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata tacctagaaa 1200

taagattttt tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca attgtaagtg 1260

cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca 1320

actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga 1380

gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc 1440

caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat 1500

tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat 1560

atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa 1620

tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta 1680

tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca 1740

actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat 1800

ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag 1860

tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac 1920

acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg 1980

gtattttctt aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg 2040

atttaattta ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg 2100

taaaactgtt tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat 2160

tttgccccaa tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2220

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2280

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2340

cgagcgcgca g 2351

<210> 41

<211> 2351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR1-1_1784_SV40_PSG11_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR1-1_1784

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(570)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (571)..(2178)

<223> PSG11_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2207)..(2351)

<223> 3' ITR

<400> 41

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc ctttttttca gacatgataa 360

gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 420

gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 480

acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt 540

aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta gtacagggag caaaaaggcc agggagaaag 600

ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg agatccaggc 660

ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc cctgcaggaa 720

ccaggataag agaaaagaag aaaagaaaag aaggattgaa ggtgttgtta ttttacttgg 780

gggagcctca ggaacaagct tgtaacttga gatactgtat aattgtttct tcaaggacta 840

caatatttct gttggaaaat tgttgggagt tgattatatt cttgcagttt tttttccctc 900

tcaccttgtt tctcaggtgg tgatcagtcc tctgtcaatt ctctactgca ctcaggtatt 960

ttggaaggct ttcagaggtg agaaaggctg attgctattt tctttgtcag tggaacttgt 1020

cacctttgca ccttttcttg gttgcaactt tttctcagtg tctctgtttg gtaaaaacta 1080

acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag 1140

tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg 1200

agttattgtt gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt 1260

gtttcccacc taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat 1320

atagtgtctg gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc 1380

tgccttgcag agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt 1440

actcagtgct gtgtcccacc tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc 1500

caggacccag ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg 1560

gccctgggga ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac 1620

caggactctt tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca 1680

ccagaggagc cctgagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg 1740

ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct 1800

tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga 1860

cagtgagaag caactggttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct 1920

accacaaagg gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag 1980

gtcagtcttg agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggcaa 2040

attgttttcc tgactcttct ctgaaagcta gatagactcc acctaaaacc ctattgccaa 2100

ggttgctggg gagaataaag ccacagttgt tgtcaactga gggaagggga agctccttgt 2160

ctcttaaagg gacacagtgc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2220

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2280

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2340

cgagcgcgca g 2351

<210> 42

<211> 2401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR100_3330_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(347)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (348)..(2228)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2257)..(2401)

<223> 3'ITR

<400> 42

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccccaaaa gagagaagat attgaggcct gttgccacat 240

atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca tccgtctcaa catttgtgtc 300

tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc ctttttttat tttgcaaatc 360

acaaaatttt atttaaaaat caattagatt ttgattgcct gaagtacaca accagtattc 420

caaatcctaa tttgttttgt aatacagtct tcaaaagtta attgcaaaga aattgtcaaa 480

taaacttccc ttcaattggt tcaggtttca gtgattgtat ttgttcaaac aattttattt 540

tatcaaggat tttaactgtt gtgtaaactt caatttttaa aaagatttga cctagtataa 600

tttcagtttt ctctaaaaag aaatatagtc caattggtga atttgtttga gtaattgagc 660

agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt gtctcaaaag tttcaatcaa 720

cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc agtgagtacc aattacaata 780

cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc tataatttcc aaagtttctt 840

tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc cttcttctac ctttggaaca 900

cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc caaaaatagc tttgtcaagg 960

tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag agagaacttg tgctttagac 1020

tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca atcaatcaat caattttcaa 1080

aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac aaatattttg attttttaat 1140

tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata gcttgtataa attggaatta 1200

caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata tacctagaaa taagattttt 1260

tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca attgtaagtg cttcttgtat 1320

tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca actcaagtta 1380

gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga gatttcccac 1440

ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc caccttatct 1500

taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat tgaaagaact 1560

gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat atttttctat 1620

tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa tttaaaccta 1680

tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta tattgtaaag 1740

atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca actctagacc 1800

ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat ttcacaggat 1860

ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag tgttgtcttt 1920

gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac acagacttga 1980

ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg gtattttctt 2040

aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg atttaattta 2100

ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg taaaactgtt 2160

tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat tttgccccaa 2220

tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 2280

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 2340

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 2400

g 2401

<210> 43

<211> 2359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR100_3330_PSG11_V5（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(2186)

<223> PSG11_V5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2215)..(2359)

<223> 3'ITR

<400> 43

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccccaaaa gagagaagat attgaggcct gttgccacat 240

atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca tccgtctcaa catttgtgtc 300

tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc ctttttttac caggtcagtt 360

gttgcttgtg aagaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag aaggtggaag ggatttcact 420

ctgtttttag agataggatt ggaactaaga attttaagtc tatttgggtg aaggggcagg 480

gaagtgtagg aagacagttc taattaggaa ggaggaatta tactaggaag tagaggtaaa 540

ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atctgaactt atcaaatagg ctagtgtata 600

cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta gaaaggtatt gaggcagtta 660

tttgcaagga acaattcaaa gtctggagac aagaagtcaa gcaatacttt gagaagtggt 720

tgagcttttt gggattggag agaattacac tattgagatt tgttaaaaat attgaagaag 780

gtttcacctt gtgaaattgt gtttctcaat tgaatctgag aaacaattga gcagaggctg 840

gagataattt tgtctaaaag acagtggggt acagggagca aaaaggccag ggagaaaggg 900

aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggtt gaaggaggag atccaggccc 960

agatacaggc aaataagtca attccctctc ccaagcttgg cagtcagccc tgcaggaacc 1020

aggataagag aaattgtttg gtaaaaacta acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc 1080

tctttatctt tctctcccac aagtagtcag tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc 1140

tctttttcct gaaaaaggaa ggtactgttg agttattgtt gttgatagta atatagtagc 1200

tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt gtttcccacc taaattgcac acttagaaac 1260

agttattggt aagccttata ttagatatat atagtgtctg gtagtcttac cctctctata 1320

attacacact ttttggcact gcccctttcc tgccttgcag agccccaggg gtgaatcttc 1380

ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt actcagtgct gtgtcccacc tgctgtgccc 1440

acagcctcaa acagccagtg acttcagagc caggaaacag ctcaggagtc tgccctgagg 1500

ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg gccaagggga ggcttggctt gaactggcag 1560

ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac caggactctt tctccacact tgctggtccc 1620

accccaggtt gagtgaggca gggccagtca ccagaggagc ccagagcaga gcaggaagca 1680

gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg 1740

tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca 1800

aagacctgac agaaggggtt gaggtggtga cagtgagaag caactggttg ttcagcactc 1860

tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct acccaaaggg ctcagggctg ataaagcccc 1920

ctccctacct ttctcaggcc agacacaagg tcagtcttga gaaaacagaa aaaaaaggag 1980

aagagagtct gtagagacaa attgggaggg ttcaggagga gaatttggga tttgcctgtg 2040

cccaagggac acaggctggg aatcaaattg ttttcctgac tcttctctga aagctagata 2100

gactccacct aaaaccctat tgccaaggtt gctgggccac agttgttgtc aactgaggga 2160

aggggaagct ccttgtctct taaagggcta gcgtagataa gtagcatggc gggttaatca 2220

ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 2280

tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 2340

tgagcgagcg agcgcgcag 2359

<210> 44

<211> 2351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_短_miR100_3330_SV40_AMELY_V3（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(341)

<223> miR100_3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(570)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (571)..(2178)

<223> AMELY_V3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2207)..(2351)

<223> 3'ITR

<400> 44

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccccaaaa gagagaagat attgaggcct gttgccacat 240

atgctgagac tgataatgtg ggtattagtc cgccacatca tccgtctcaa catttgtgtc 300

tgttaggcaa tctcacggac ctggggcttt gcttatatgc ctttttttca gacatgataa 360

gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 420

gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 480

acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt 540

aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatatagtc caattggtga atttgtttga 600

gtaattgagc agttcttacc ttattcaaga atactcaatc aaaatttgtt gtctcaaaag 660

tttcaatcaa cacaaagcaa aaggaacaat taaataattt aattgtttcc agtgagtacc 720

aattacaata cttgtattca aaccagtgta caaccactta agttgaactc tataatttcc 780

aaagtttctt tgttcaatcc ttgtcaatag atattaggtg tccttgaagc cttcttctac 840

ctttggaaca cttaaagcct attattttat aacaaaataa caattctttc caaaaatagc 900

tttgtcaagg tgtgagcaca atataaatcc agggcaattt ctttgcacag agagaacttg 960

tgctttagac tagaatagcc agtgatagtc ctcagattac ttgggattca atcaatcaat 1020

caattttcaa aaattctgcc ccaaatcaca attattaagc caattataac aaatattttg 1080

attttttaat tcagaagtta tcacaattat acagtagtat atcaacaata gcttgtataa 1140

attggaatta caggtggata caaataagtg atagatcaca aaatcttata tacctagaaa 1200

taagattttt tggttgtgga taaagttttt ttattgatta ttcccaatca attgtaagtg 1260

cttcttgtat tgggagattc agtcaaaaat tgaggtaact tctttttaaa agcttaatca 1320

actcaagtta gactgaaaac tactgaaatt gggaaacctt cctataggtt tttttaaaga 1380

gatttcccac ctacctttca aagcttgttc aaatatttgc actctaaaaa ttacccaccc 1440

caccttatct taagccttca ctgcaattct agcctcttct tgtgagtcaa atctttgaat 1500

tgaaagaact gatattccct tattgctgtt gcccttaaaa ttaagagggt ttaataatat 1560

atttttctat tattgggttg tcaaaatata cagtctggta gaaattcaat aataataaaa 1620

tttaaaccta tcaaaaaaac tgtgttctta attaccaagc caattagata aatttgttta 1680

tattgtaaag atacaacaaa ttacttggac taatagaatc aaagatctgt aactactaca 1740

actctagacc ctgagttgtt ggacccctta gaactctggg gccacctttg ctgcaccaat 1800

ttcacaggat ttgcagtgta gtggcttcac agagagtgac tccaaccaga gaagcagcag 1860

tgttgtcttt gccaatttgg ccaaaggaat attgtatttc aaaaatttgt aactgtgtac 1920

acagacttga ttttttacaa actaaatttc ccaatagtgt ctgtttgtgg agtacacttg 1980

gtattttctt aaaattgcct aatattttca gggaattaca gatatattag aatccaattg 2040

atttaattta ctttcaaccc ttgcagaaat tcactgttgg ggtaggaaat aagaagaagg 2100

taaaactgtt tatttccaaa ggtcctgctt ttcagtgtaa gagcaaagca aacaaaaaat 2160

tttgccccaa tattgtgagc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2220

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2280

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2340

cgagcgcgca g 2351

<210> 45

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSG11_V1填充序列

<400> 45

acgaggtcag atgttgcttg tgatgaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agatggtgga 60

agggatttca ctctgttttt agacatagca ttggaactaa gaattttatg tctatatggg 120

tgaaggggca gggatgtgta ggaagacagt tctaattagg atggaggaat tatactagga 180

agtagaggta aaggaagtga gaaggcttag taaatagaag aaatgtgaac ttatcaaata 240

ggctagtgta tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta 300

atgaggcagt tatatgcaag gaacatttca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact 360

ttgagaagtg gttgagcttt atgggaatgg agagaattac actattgaga tatgttaaaa 420

ataatgaaga aggtttcacc atgtgaaatt gtgtttctca tttgaatctg agaaacaaat 480

gagcagaggc tggagataat tatgtctaaa agacagtggg gtacagggag cataaaggcc 540

agggagaaag ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg atgaaggagg 600

agatccaggc ccagatacag gcaaataagt catttccctc tcccaagcat ggcagtcagc 660

cctgcaggaa ccaggataag agaaaaatgg ttggtaaaaa ctaacatacc aggcttgatt 720

ctttgcagtt agctctttat ctttctctcc cacaagtagt cagtagcctt gttctagtgt 780

tttatgtgtt acctcttttt ccggaaaaag gaaggtactg ttgagttaat gatgatgata 840

gtaatatagt agctgacatt ggttcctctg tatgtggcat cttgtttccc atctaaattg 900

cacacttaga aacagttaat ggtaagcctt atattagata tatatagtgt ctggtagtct 960

taccctctct ataattacac actttttggc actgcccctt tcctgccatg cagagcccca 1020

ggggtgaatc ttcctatttc tccagctctg catcagtcac tgtactcagt gctgtgtccc 1080

acgtgctgtg cccacagcct catacagcca gtgacttcag agccaggacg cagctcagga 1140

gtctgccctg aggttgcttc tcttcttatt tccttgcagc ctggcccggg ggaggcttgg 1200

cttgaactgg cagctcaatt tagccaaatt caggacaggc caccaggact ctttctccac 1260

acatgctggt cccaccccag gttgagtgag gcagggccag tcaccagagg agcccggagc 1320

agagcaggaa gcagagtctg agctgctcct ccctcaccca aggggcttcc tcctctcatt 1380

tgggggaaaa gtgtgagctt gtttcaaagc ctcagatgtt ccttgtagtt catggaagag 1440

gtacaagaaa acaaagacgt gacagaaggg gatgaggtgg tgacagtgag aagcaactcg 1500

atgttcagca ctctccttct tgtccctctg tgaagcctct tctaccacat agggctcagg 1560

gctgataaag ccccctccct acctttctca ggccagacac aaggtcagtc atgagaaaac 1620

agaaaaaaaa ggagaagaga gtctgtagag acaaattggg agggttcagg aggagaattt 1680

gggatttgcc tgtgcccatg ggacacaggc tgggaataaa aatgttttcc tgactcttct 1740

ctgaaagcta gatagactcc acctaaaacc ctattgccaa ggatgctggg cccacagttg 1800

atgtcatctg agggaagggg aagctccttg tctcttaaag ggacacagtg accctctgag 1860

ccaagacaca ccctcaagtc c 1881

<210> 46

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSG11_V2填充序列

<400> 46

gtatacccct ggagattctt gattaagtga attaactaga ttttagaaag gtattgaggc 60

agttatttgc aaggaacaat tcaaagtctg gagacaagaa gtcaagcaat actttgagaa 120

gtggttgagc tttttgggat tggagagaat tacactattg agatttgtta aaaatattga 180

agaaggtttc accttgtgaa attgtgtttc tcaattgaat ctgagaaaca attgagcaga 240

ggctggagat aattttgtct aaaagacagt ggggtacagg gagcaaaaag gccagggaga 300

aagggaactg caggaattag tgctgagaag caggagttag tggttgaagg aggagatcca 360

ggcccagata caggcaaata agtcaattcc ctctcccaag cttggcagtc agccctgcag 420

gaaccaggat aagagaaaag aagaaaagaa aagaaggatt gaaggtgttg ttattttact 480

tgggggagcg tcaggaacaa gcttgtaact tgagatactg tataattgtt tcttcaagga 540

ctacaatatt tctgttggaa aattgttggg agttgattat attcttgcag ttttttttcc 600

ctctcacctt gtttctcagg tggtgatcag tcctctgtca attctctact gcactcaggt 660

attttggaag gctttcagac gtgagaaagg ctgattgcta ttttctttgt cagtggaact 720

tgtcaccttt gcaccttttc ttggttgcaa ctttttctca gtgtctctgt ttggtaaaaa 780

ctaacaaacc aggcttgatt ctttgcagtt agctctttat ctttctctcc cacaagtagt 840

cagtagcctt gttctagtgt tttttgtgtt acctcttttt ccggaaaaag gaaggtactg 900

ttgagttatt gttgttgata gtaatatagt agctgacagt ggttcctctg tttgtggcaa 960

cttgtttccc acctaaattg cacacttaga aacagttatt ggtaagcctt atattagata 1020

tatatagtgt ctggtagtct taccctctct ataattacac actttttggc actgcccctt 1080

tcctgccttg cagagcccca ggggtgaatc ttcctatttc tccagctctg caacagtcac 1140

tgtactcagt gctgtgtccc acgtgctgtg cccacagcct caaacagcca gtgacttcag 1200

agccaggacg cagctcagga gtctgccctg aggttgcttc tcttcttatt tccttgcagc 1260

ctggcccggg ggaggcttgg cttgaactgg cagctcaatt tagccaaatt caggacaggc 1320

caccaggact ctttctccac acttgctggt cccaccccag gttgagtgag gcagggccag 1380

tcaccagagg agcccggagc agagcaggaa gcagagtctg agctgctcct ccctcaccca 1440

aggggcttcc tcctctcaat tgggggaaaa gtgtgagctt gtttcaaagc ctcagttgtt 1500

ccttgtagtt cttggaagag gtacaagaaa acaaagacgt gacagaaggg gttgaggtgg 1560

tgacagtgag aagcaactcg ttgttcagca ctctccttct tgtccctctg tgaagcctct 1620

tctaccacaa agggctcagg gctgataaag ccccctccct acctttctca ggccagacac 1680

aaggtcagtc ttgagaaaac agaaaaaaaa ggagaagaga gtctgtagag acaaattggg 1740

caaattgttt tcctgactct tctctgaaag ctagatagac tccacctaaa accctattgc 1800

caaggttgct ggggagaata aagccacagt tgttgtcaac tgagggaagg ggaagctcct 1860

tgtctcttaa agggacacag t 1881

<210> 47

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSG11_V3填充序列

<400> 47

gtatacccct ggagattctt gattaagtga attaactaga ttttagaaag gtattgaggc 60

agttatttgc aaggaacaat tcaaagtctg gagacaagaa gtcaagcaat actttgagaa 120

gtggttgagc tttttgggat tggagagaat tacactattg agatttgtta aaaatattga 180

agaaggtttc accttgtgaa attgtgtttc tcaattgaat ctgagaaaca attgagcaga 240

ggctggagat aattttgtct aaaagacagt ggggtacagg gagcaaaaag gccagggaga 300

aagggaactg caggaattag tgctgagaag caggagttag tggttgaagg aggagatcca 360

ggcccagata caggcaaata agtcaattcc ctctcccaag cttggcagtc agccctgcag 420

gaaccaggat aagagaaaag aagaaaagaa aagaaggatt gaaggtgttg ttattttact 480

tgggggagcc tcaggaacaa gcttgtaact tgagatactg tataattgtt tcttcaagga 540

ctacaatatt tctgttggaa aattgttggg agttgattat attcttgcag ttttttttcc 600

ctctcacctt gtttctcagg tggtgatcag tcctctgtca attctctact gcactcaggt 660

attttggaag gctttcagag gtgagaaagg ctgattgcta ttttctttgt cagtggaact 720

tgtcaccttt gcaccttttc ttggttgcaa ctttttctca gtgtctctgt ttggtaaaaa 780

ctaacaaacc aggcttgatt ctttgcagtt agctctttat ctttctctcc cacaagtagt 840

cagtagcctt gttctagtgt tttttgtgtt acctcttttt cctgaaaaag gaaggtactg 900

ttgagttatt gttgttgata gtaatatagt agctgacagt ggttcctctg tttgtggcaa 960

cttgtttccc acctaaattg cacacttaga aacagttatt ggtaagcctt atattagata 1020

tatatagtgt ctggtagtct taccctctct ataattacac actttttggc actgcccctt 1080

tcctgccttg cagagcccca ggggtgaatc ttcctatttc tccagctctg caacagtcac 1140

tgtactcagt gctgtgtccc acctgctgtg cccacagcct caaacagcca gtgacttcag 1200

agccaggacc cagctcagga gtctgccctg aggttgcttc tcttcttatt tccttgcagc 1260

ctggccctgg ggaggcttgg cttgaactgg cagctcaatt tagccaaatt caggacaggc 1320

caccaggact ctttctccac acttgctggt cccaccccag gttgagtgag gcagggccag 1380

tcaccagagg agccctgagc agagcaggaa gcagagtctg agctgctcct ccctcaccca 1440

aggggcttcc tcctctcaat tgggggaaaa gtgtgagctt gtttcaaagc ctcagttgtt 1500

ccttgtagtt cttggaagag gtacaagaaa acaaagacct gacagaaggg gttgaggtgg 1560

tgacagtgag aagcaactgg ttgttcagca ctctccttct tgtccctctg tgaagcctct 1620

tctaccacaa agggctcagg gctgataaag ccccctccct acctttctca ggccagacac 1680

aaggtcagtc ttgagaaaac agaaaaaaaa ggagaagaga gtctgtagag acaaattggg 1740

caaattgttt tcctgactct tctctgaaag ctagatagac tccacctaaa accctattgc 1800

caaggttgct ggggagaata aagccacagt tgttgtcaac tgagggaagg ggaagctcct 1860

tgtctcttaa agggacacag t 1881

<210> 48

<211> 1697

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSG11_V5填充序列

<400> 48

accaggtcag ttgttgcttg tgaagaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agaaggtgga 60

agggatttca ctctgttttt agagatagga ttggaactaa gaattttaag tctatttggg 120

tgaaggggca gggaagtgta ggaagacagt tctaattagg aaggaggaat tatactagga 180

agtagaggta aaggaagtga gaaggcttag taaatagaag aaatctgaac ttatcaaata 240

ggctagtgta tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta 300

ttgaggcagt tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact 360

ttgagaagtg gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa 420

atattgaaga aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt 480

gagcagaggc tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc 540

agggagaaag ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg 600

agatccaggc ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc 660

cctgcaggaa ccaggataag agaaattgtt tggtaaaaac taacaaacca ggcttgattc 720

tttgcagtta gctctttatc tttctctccc acaagtagtc agtagccttg ttctagtgtt 780

ttttgtgtta cctctttttc ctgaaaaagg aaggtactgt tgagttattg ttgttgatag 840

taatatagta gctgacagtg gttcctctgt ttgtggcaac ttgtttccca cctaaattgc 900

acacttagaa acagttattg gtaagcctta tattagatat atatagtgtc tggtagtctt 960

accctctcta taattacaca ctttttggca ctgccccttt cctgccttgc agagccccag 1020

gggtgaatct tcctatttct ccagctctgc aacagtcact gtactcagtg ctgtgtccca 1080

cctgctgtgc ccacagcctc aaacagccag tgacttcaga gccaggaaac agctcaggag 1140

tctgccctga ggttgcttct cttcttattt ccttgcagcc tggccaaggg gaggcttggc 1200

ttgaactggc agctcaattt agccaaattc aggacaggcc accaggactc tttctccaca 1260

cttgctggtc ccaccccagg ttgagtgagg cagggccagt caccagagga gcccagagca 1320

gagcaggaag cagagtctga gctgctcctc cctcacccaa ggggcttcct cctctcaatt 1380

gggggaaaag tgtgagcttg tttcaaagcc tcagttgttc cttgtagttc ttggaagagg 1440

tacaagaaaa caaagacctg acagaagggg ttgaggtggt gacagtgaga agcaactggt 1500

tgttcagcac tctccttctt gtccctctgt gaagcctctt ctaccacaaa gggctcaggg 1560

ctgataaagc cccctcccta cctttctcag gccagacaca aggtcagtct tgagaaaaca 1620

gaaaaaaaag gagaagagag tctgtagaga caaattggga gggttcagga ggagaatttg 1680

ggatttgcct gtgccca 1697

<210> 49

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMELY_V1填充序列

<400> 49

tattatgcat atcacataat tttatttaaa aatcatttag attttgattg cgtgaagtac 60

acaaccagta ttccatatcc taatttgttt tgtaatacag tcttcaaaag ttaaatgcaa 120

agaaattgtc atataaactt cccttcattt ggttcaggtt tcagtgattg tatatgttca 180

tacattttta ttttatcaac gattttaact gatgtgtaaa cttcattttt taaaaagatt 240

tgacgtagta taatttcagt tttctctaaa aagaaatata gtccaaatgg tgaatttgta 300

tgagtaaatg agcagttctt accttattca agaatactca ttcataatat gttgtctcaa 360

aagtttcatt caacacatag caaaaggaac aattaaataa tttaattgtt tccagtgagt 420

accatttaca atacatgtat tcaaaccaat gtacaaccac ttaagttgaa ctctataatt 480

tccaaagttt ctttgttcat tcgttgtcat tagatattag gtgtccatga agccttcttc 540

tacctttgga acacttaaag cctattattt tataacaaaa taacaattct ttccataaat 600

agctttgtca aggtgtgagc acattataaa tccacggcat tttctatgca cagagagaac 660

atgtgcttta gactagaata gccaatgata gtcgtcagat tacttgggat tcaatcaatc 720

aatcaatttt caaaaattct gccccatatc acaattatta agccatttat aacatatatt 780

atgatttttt aattcagaag ttatcacatt tatacagtag tatatcatca atagcttgta 840

taaattggaa ttacaggtgg atacatataa gtgatagatc acataatctt atatacgtag 900

aaataagatt ttatggatgt ggataaagtt tttttattga ttattcccat tcatttgtaa 960

gtgcttcttg taatgggaga ttcagtcata aattgaggta acttcttttt aaaagcttaa 1020

tcatctcaag ttagactgaa aactactgaa aatgggaaac cttcgtatag gtttttttaa 1080

agagatttcc catctacctt tcatagcttg ttcaaatata tgcactctaa aaattaccca 1140

ccccatctta tcttaagcct tcactgcaat tctagcctct tcttgtgagt caaatctttg 1200

aaatgaaaga actgatattc ccttattgct gttgccctta aaattaagag ggtttaataa 1260

tatatttttc tattaatggg ttgtcataat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320

aaatttaaac ctatcataaa aactgtgttc ttaattacca agccatttag ataaatttgt 1380

ttataatgta aagatacaac atattacttg gactaataga atcatagatc tgtaactact 1440

acaactctag accctgagtt gttggacccc ttagaactct ggggccacct ttgctgcacc 1500

attttcacag gatttgcatt gtagtggctt cacagagagt gactccaacc agagaagcag 1560

cagtgttgtc tttgccatta tggccatagg aatattgtat ttcaaaaatt tgtaactgtg 1620

tacacagaca tgatttttta caaactaaat ttcccattag tgtctgtatg tggagtacac 1680

atggtatttt cttaaaaatg cctaatattt tcagggaatt acagatatat tagaatccat 1740

ttgatttaat ttactttcat cccatgcaga aattcactga tgcggtagga aataagaaga 1800

aggtaaaact gtttatttcc ataggtcctg cttttcattg taagagcaaa gcaaacataa 1860

aattatgccg caataatgtg a 1881

<210> 50

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMELY_V2填充序列

<400> 50

tattttgcaa atcacaaaat tttatttaaa aatcaattag attttgattg cgtgaagtac 60

acaaccagta ttccaaatcc taatttgttt tgtaatacag tcttcaaaag ttaattgcaa 120

agaaattgtc aaataaactt cccttcaatt ggttcaggtt tcagtgattg tatttgttca 180

aacaatttta ttttatcaac gattttaact gttgtgtaaa cttcaatttt taaaaagatt 240

tgacgtagta taatttcagt tttctctaaa aagaaatata gtccaattgg tgaatttgtt 300

tgagtaattg agcagttctt accttattca agaatactca atcaaaattt gttgtctcaa 360

aagtttcaat caacacaaag caaaaggaac aattaaataa tttaattgtt tccagtgagt 420

accaattaca atacttgtat tcaaaccagt gtacaaccac ttaagttgaa ctctataatt 480

tccaaagttt ctttgttcaa tcgttgtcaa tagatattag gtgtccttga agccttcttc 540

tacctttgga acacttaaag cctattattt tataacaaaa taacaattct ttccaaaaat 600

agctttgtca aggtgtgagc acaatataaa tccacggcaa tttctttgca cagagagaac 660

ttgtgcttta gactagaata gccagtgata gtcgtcagat tacttgggat tcaatcaatc 720

aatcaatttt caaaaattct gccccaaatc acaattatta agccaattat aacaaatatt 780

ttgatttttt aattcagaag ttatcacaat tatacagtag tatatcaaca atagcttgta 840

taaattggaa ttacaggtgg atacaaataa gtgatagatc acaaaatctt atatacgtag 900

aaataagatt ttttggttgt ggataaagtt tttttattga ttattcccaa tcaattgtaa 960

gtgcttcttg tattgggaga ttcagtcaaa aattgaggta acttcttttt aaaagcttaa 1020

tcaactcaag ttagactgaa aactactgaa attgggaaac cttcgtatag gtttttttaa 1080

agagatttcc cacctacctt tcaaagcttg ttcaaatatt tgcactctaa aaattaccca 1140

ccccacctta tcttaagcct tcactgcaat tctagcctct tcttgtgagt caaatctttg 1200

aattgaaaga actgatattc ccttattgct gttgccctta aaattaagag ggtttaataa 1260

tatatttttc tattattggg ttgtcaaaat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320

aaatttaaac ctatcaaaaa aactgtgttc ttaattacca agccaattag ataaatttgt 1380

ttatattgta aagatacaac aaattacttg gactaataga atcaaagatc tgtaactact 1440

acaactctag accctgagtt gttggacccc ttagaactct ggggccacct ttgctgcacc 1500

aatttcacag gatttgcagt gtagtggctt cacagagagt gactccaacc agagaagcag 1560

cagtgttgtc tttgccaatt tggccaaagg aatattgtat ttcaaaaatt tgtaactgtg 1620

tacacagact tgatttttta caaactaaat ttcccaatag tgtctgtttg tggagtacac 1680

ttggtatttt cttaaaattg cctaatattt tcagggaatt acagatatat tagaatccaa 1740

ttgatttaat ttactttcaa cccttgcaga aattcactgt tgcggtagga aataagaaga 1800

aggtaaaact gtttatttcc aaaggtcctg cttttcagtg taagagcaaa gcaaacaaaa 1860

aattttgccg caatattgtg a 1881

<210> 51

<211> 1690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMELY_V3填充序列

<400> 51

tattttgcaa atcacaaaat tttatttaaa aatcaattag attttgattg cctgaagtac 60

acaaccagta ttccaaatcc taatttgttt tgtaatacag tcttcaaaag ttaattgcaa 120

agaaattgtc aaataaactt cccttcaatt ggttcaggtt tcagtgattg tatttgttca 180

aacaatttta ttttatcaag gattttaact gttgtgtaaa cttcaatttt taaaaagatt 240

tgacctagta taatttcagt tttctctaaa aagaaatata gtccaattgg tgaatttgtt 300

tgagtaattg agcagttctt accttattca agaatactca atcaaaattt gttgtctcaa 360

aagtttcaat caacacaaag caaaaggaac aattaaataa tttaattgtt tccagtgagt 420

accaattaca atacttgtat tcaaaccagt gtacaaccac ttaagttgaa ctctataatt 480

tccaaagttt ctttgttcaa tccttgtcaa tagatattag gtgtccttga agccttcttc 540

tacctttgga acacttaaag cctattattt tataacaaaa taacaattct ttccaaaaat 600

agctttgtca aggtgtgagc acaatataaa tccagggcaa tttctttgca cagagagaac 660

ttgtgcttta gactagaata gccagtgata gtcctcagat tacttgggat tcaatcaatc 720

aatcaatttt caaaaattct gccccaaatc acaattatta agccaattat aacaaatatt 780

ttgatttttt aattcagaag ttatcacaat tatacagtag tatatcaaca atagcttgta 840

taaattggaa ttacaggtgg atacaaataa gtgatagatc acaaaatctt atatacctag 900

aaataagatt ttttggttgt ggataaagtt tttttattga ttattcccaa tcaattgtaa 960

gtgcttcttg tattgggaga ttcagtcaaa aattgaggta acttcttttt aaaagcttaa 1020

tcaactcaag ttagactgaa aactactgaa attgggaaac cttcctatag gtttttttaa 1080

agagatttcc cacctacctt tcaaagcttg ttcaaatatt tgcactctaa aaattaccca 1140

ccccacctta tcttaagcct tcactgcaat tctagcctct tcttgtgagt caaatctttg 1200

aattgaaaga actgatattc ccttattgct gttgccctta aaattaagag ggtttaataa 1260

tatatttttc tattattggg ttgtcaaaat atacagtctg gtagaaattc aataataata 1320

aaatttaaac ctatcaaaaa aactgtgttc ttaattacca agccaattag ataaatttgt 1380

ttatattgta aagatacaac aaattacttg gactaataga atcaaagatc tgtaactact 1440

acaactctag accctgagtt gttggacccc ttagaactct ggggccacct ttgctgcacc 1500

aatttcacag gatttgcagt gtagtggctt cacagagagt gactccaacc agagaagcag 1560

cagtgttgtc tttgccaatt tggccaaagg aatattgtat ttcaaaaatt tgtaactgtg 1620

tacacagact tgatttttta caaactaaat ttcccaatag tgtctgtttg tggagtacac 1680

ttggtatttt 1690

<210> 52

<211> 231

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(231)

<223> H1长启动子

<400> 52

ggaattcgaa cgctgacgtc atcaacccgc tccaaggaat cgcgggccca gtgtcactag 60

gcgggaacac ccagcgcgcg tgcgccctgg caggaagatg gctgtgaggg acaggggagt 120

ggcgccctgc aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat 180

gtctttggat ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actctttccc a 231

<210> 53

<211> 100

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<223> H1天然启动子

<400> 53

atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60

tgggaatctt ataagttctg tatgagacca ctctttccca 100

<210> 54

<211> 91

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(91)

<223> H1短启动子

<400> 54

atatttgcat gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt 60

tgggaatctt ataagttctg tatgagacca c 91

<210> 55

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V1

<400> 55

acgaggtcag atgttgcttg tgatgaaggg tgtggttaag tctgcagtgc agatggtgga 60

agggatttca ctctgttttt agacatagca ttggaactaa gaattttatg tctatatggg 120

tgaaggggca gggatgtgta ggaagacagt tctaattagg atggaggaat tatactagga 180

agtagaggta aaggaagtga 200

<210> 56

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_MCS_PSG11_V2

<400> 56

gtatacccct ggagattctt gattaagtga attaactaga ttttagaaag gtattgaggc 60

agttatttgc aaggaacaat tcaaagtctg gagacaagaa gtcaagcaat actttgagaa 120

gtggttgagc tttttgggat tggagagaat tacactattg agatttgtta aaaatattga 180

agaaggtttc accttgtgaa 200

<210> 57

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 缺少TRS的5' ITR

<400> 57

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgg 106

<210> 58

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3' ITR

<400> 58

taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 60

gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 120

cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 145

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1755向导（DNA）

<400> 59

tcgggttgaa atctgaagtg tg 22

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1755过客（DNA）

<400> 60

cacactccag ctttcaaacc gt 22

<210> 61

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_1755 (DNA)

<400> 61

cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatcgg gttgaaatct gaagtgtggt 60

attagtccgc acactccagc tttcaaaccg ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120

gggctttgct tatatgcc 138

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2945向导（DNA）

<400> 62

tgtagtagaa ggctttggct ga 22

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2945过客（DNA）

<400> 63

tcagcccaag acttctaata ct 22

<210> 64

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_2945 (DNA)

<400> 64

cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatgta gtagaaggct ttggctgagt 60

attagtccgt cagcccaaga cttctaatac ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120

gggctttgct tatatgcc 138

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2586向导（DNA）

<400> 65

tagattcaga agtagaactt gg 22

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2586过客（DNA）

<400> 66

ccaagtccta attctgactc tt 22

<210> 67

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_2586 (DNA)

<400> 67

cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacataga ttcagaagta gaacttgggt 60

attagtccgc caagtcctaa ttctgactct ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120

gggctttgct tatatgcc 138

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3330向导（DNA）

<400> 68

tatgctgaga ctgataatgt gg 22

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3330过客（DNA）

<400> 69

ccacatcatc cgtctcaaca tt 22

<210> 70

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR100_3330 (DNA)

<400> 70

cccaaaagag agaagatatt gaggcctgtt gccacatatg ctgagactga taatgtgggt 60

attagtccgc cacatcatcc gtctcaacat ttgtgtctgt taggcaatct cacggacctg 120

gggctttgct tatatgcc 138

<210> 71

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1784（也为14792）向导（RNA）

<400> 71

auuaacuacu cuuuggucug aa 22

<210> 72

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1784（也为14792）过客（RNA）

<400> 72

uccagaccaa auauuaguua au 22

<210> 73

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR1.1_1784（或miR1.1_14792）（RNA）

<400> 73

caugcagacu gccugcuugg guacagacca aagaguaguc gaauuaugga ccugcuaagc 60

uaauuaacua cucuuugguc ugaacucagg ccgggaccuc ucucgccgca cugaggggca 120

cuccacacca cgggggcc 138

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1784（也为14792）向导（DNA）

<400> 74

attaactact ctttggtctg aa 22

<210> 75

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1784（也为14792）过客（DNA）

<400> 75

tccagaccaa atattagtta at 22

<210> 76

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR1.1_1784（或miR1.1_14792）（DNA）

<400> 76

catgcagact gcctgcttgg gtacagacca aagagtagtc gaattatgga cctgctaagc 60

taattaacta ctctttggtc tgaactcagg ccgggacctc tctcgccgca ctgaggggca 120

ctccacacca cgggggcc 138

<210> 77

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40转录终止信号

<400> 77

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222

<210> 78

<211> 2402

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV9_H1_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V1 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(342)

<223> miR-1-1_XD-14792

<220>

<221> misc_feature

<222> (343)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(2229)

<223> PSG11_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2258)..(2402)

<223> 3' ITR

<400> 78

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc cgttttttac gaggtcagat 360

gttgcttgtg atgaagggtg tggttaagtc tgcagtgcag atggtggaag ggatttcact 420

ctgtttttag acatagcatt ggaactaaga attttatgtc tatatgggtg aaggggcagg 480

gatgtgtagg aagacagttc taattaggat ggaggaatta tactaggaag tagaggtaaa 540

ggaagtgaga aggcttagta aatagaagaa atgtgaactt atcaaatagg ctagtgtata 600

cccctggaga ttcttgatta agtgaattaa ctagatttta gaaaggtaat gaggcagtta 660

tatgcaagga acatttcaaa gtctggagac aagaagtcaa gcaatacttt gagaagtggt 720

tgagctttat gggaatggag agaattacac tattgagata tgttaaaaat aatgaagaag 780

gtttcaccat gtgaaattgt gtttctcatt tgaatctgag aaacaaatga gcagaggctg 840

gagataatta tgtctaaaag acagtggggt acagggagca taaaggccag ggagaaaggg 900

aactgcagga attagtgctg agaagcagga gttagtggat gaaggaggag atccaggccc 960

agatacaggc aaataagtca tttccctctc ccaagcatgg cagtcagccc tgcaggaacc 1020

aggataagag aaaaatggtt ggtaaaaact aacataccag gcttgattct ttgcagttag 1080

ctctttatct ttctctccca caagtagtca gtagccttgt tctagtgttt tatgtgttac 1140

ctctttttcc ggaaaaagga aggtactgtt gagttaatga tgatgatagt aatatagtag 1200

ctgacattgg ttcctctgta tgtggcatct tgtttcccat ctaaattgca cacttagaaa 1260

cagttaatgg taagccttat attagatata tatagtgtct ggtagtctta ccctctctat 1320

aattacacac tttttggcac tgcccctttc ctgccatgca gagccccagg ggtgaatctt 1380

cctatttctc cagctctgca tcagtcactg tactcagtgc tgtgtcccac gtgctgtgcc 1440

cacagcctca tacagccagt gacttcagag ccaggacgca gctcaggagt ctgccctgag 1500

gttgcttctc ttcttatttc cttgcagcct ggcccggggg aggcttggct tgaactggca 1560

gctcaattta gccaaattca ggacaggcca ccaggactct ttctccacac atgctggtcc 1620

caccccaggt tgagtgaggc agggccagtc accagaggag cccggagcag agcaggaagc 1680

agagtctgag ctgctcctcc ctcacccaag gggcttcctc ctctcatttg ggggaaaagt 1740

gtgagcttgt ttcaaagcct cagatgttcc ttgtagttca tggaagaggt acaagaaaac 1800

aaagacgtga cagaagggga tgaggtggtg acagtgagaa gcaactcgat gttcagcact 1860

ctccttcttg tccctctgtg aagcctcttc taccacatag ggctcagggc tgataaagcc 1920

ccctccctac ctttctcagg ccagacacaa ggtcagtcat gagaaaacag aaaaaaaagg 1980

agaagagagt ctgtagagac aaattgggag ggttcaggag gagaatttgg gatttgcctg 2040

tgcccatggg acacaggctg ggaataaaaa tgttttcctg actcttctct gaaagctaga 2100

tagactccac ctaaaaccct attgccaagg atgctgggcc cacagttgat gtcatctgag 2160

ggaaggggaa gctccttgtc tcttaaaggg acacagtgac cctctgagcc aagacacacc 2220

ctcaagtccg ctagcgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 2280

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2340

ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2400

ag 2402

<210> 79

<211> 2411

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV9_H1_天然_miR-1-1-XD-14792_PSG11_V2（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(212)

<223> H1天然启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (213)..(351)

<223> miR1-1-XD-14792

<220>

<221> misc_feature

<222> (352)..(357)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (358)..(2238)

<223> PSG11_V2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2267)..(2411)

<223> 3' ITR

<400> 79

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cactctttcc cgcatgcaga ctgcctgctt gggtacagac 240

caaagagtag tcgaattatg gacctgctaa gctaattaac tactctttgg tctgaactca 300

ggccgggacc tctctcgccg cactgagggg cactccacac cacgggggcc gttttttgta 360

tacccctgga gattcttgat taagtgaatt aactagattt tagaaaggta ttgaggcagt 420

tatttgcaag gaacaattca aagtctggag acaagaagtc aagcaatact ttgagaagtg 480

gttgagcttt ttgggattgg agagaattac actattgaga tttgttaaaa atattgaaga 540

aggtttcacc ttgtgaaatt gtgtttctca attgaatctg agaaacaatt gagcagaggc 600

tggagataat tttgtctaaa agacagtggg gtacagggag caaaaaggcc agggagaaag 660

ggaactgcag gaattagtgc tgagaagcag gagttagtgg ttgaaggagg agatccaggc 720

ccagatacag gcaaataagt caattccctc tcccaagctt ggcagtcagc cctgcaggaa 780

ccaggataag agaaaagaag aaaagaaaag aaggattgaa ggtgttgtta ttttacttgg 840

gggagcgtca ggaacaagct tgtaacttga gatactgtat aattgtttct tcaaggacta 900

caatatttct gttggaaaat tgttgggagt tgattatatt cttgcagttt tttttccctc 960

tcaccttgtt tctcaggtgg tgatcagtcc tctgtcaatt ctctactgca ctcaggtatt 1020

ttggaaggct ttcagacgtg agaaaggctg attgctattt tctttgtcag tggaacttgt 1080

cacctttgca ccttttcttg gttgcaactt tttctcagtg tctctgtttg gtaaaaacta 1140

acaaaccagg cttgattctt tgcagttagc tctttatctt tctctcccac aagtagtcag 1200

tagccttgtt ctagtgtttt ttgtgttacc tctttttccg gaaaaaggaa ggtactgttg 1260

agttattgtt gttgatagta atatagtagc tgacagtggt tcctctgttt gtggcaactt 1320

gtttcccacc taaattgcac acttagaaac agttattggt aagccttata ttagatatat 1380

atagtgtctg gtagtcttac cctctctata attacacact ttttggcact gcccctttcc 1440

tgccttgcag agccccaggg gtgaatcttc ctatttctcc agctctgcaa cagtcactgt 1500

actcagtgct gtgtcccacg tgctgtgccc acagcctcaa acagccagtg acttcagagc 1560

caggacgcag ctcaggagtc tgccctgagg ttgcttctct tcttatttcc ttgcagcctg 1620

gcccggggga ggcttggctt gaactggcag ctcaatttag ccaaattcag gacaggccac 1680

caggactctt tctccacact tgctggtccc accccaggtt gagtgaggca gggccagtca 1740

ccagaggagc ccggagcaga gcaggaagca gagtctgagc tgctcctccc tcacccaagg 1800

ggcttcctcc tctcaattgg gggaaaagtg tgagcttgtt tcaaagcctc agttgttcct 1860

tgtagttctt ggaagaggta caagaaaaca aagacgtgac agaaggggtt gaggtggtga 1920

cagtgagaag caactcgttg ttcagcactc tccttcttgt ccctctgtga agcctcttct 1980

accacaaagg gctcagggct gataaagccc cctccctacc tttctcaggc cagacacaag 2040

gtcagtcttg agaaaacaga aaaaaaagga gaagagagtc tgtagagaca aattgggcaa 2100

attgttttcc tgactcttct ctgaaagcta gatagactcc acctaaaacc ctattgccaa 2160

ggttgctggg gagaataaag ccacagttgt tgtcaactga gggaagggga agctccttgt 2220

ctcttaaagg gacacagtgc tagcgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac 2280

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2340

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2400

cgagcgcgca g 2411

<210> 80

<211> 2395

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1_短_miR16-2-3330_AMELY_V1（5' ITR .. 3' ITR）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(335)

<223> miR16-2-3330

<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(341)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(2222)

<223> AMELY_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2251)..(2395)

<223> 3' ITR

<400> 80

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactcta 240

tgctgagact gataatgtgg tagtgaaata tatattaaac cacattatcg ttctcagcat 300

ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360

ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420

ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480

tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540

cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600

ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660

taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720

gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780

ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840

ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900

gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960

cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020

agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080

tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140

gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200

gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260

tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320

attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380

aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440

ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500

ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560

cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620

gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680

aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740

catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800

tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860

tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920

atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980

acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040

gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100

tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160

cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220

gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280

tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395

<210> 81

<211> 2395

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_miR16-2-1479_AMELY_V1 (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1短启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(335)

<223> miR16-2-1479

<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(341)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(2222)

<223> AMELY_V1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2251)..(2395)

<223> 3' ITR

<400> 81

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacgc gtatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac cacttatgtt tggatgaact gacatacttg ttccactctt 240

gctaactggt ttgcccttgc tagtgaaata tatattaaag caagggcaag acagttagca 300

ttagtgtgac agggatacag caactatttt atcaattttt ttattatgca tatcacataa 360

ttttatttaa aaatcattta gattttgatt gcgtgaagta cacaaccagt attccatatc 420

ctaatttgtt ttgtaataca gtcttcaaaa gttaaatgca aagaaattgt catataaact 480

tcccttcatt tggttcaggt ttcagtgatt gtatatgttc atacattttt attttatcaa 540

cgattttaac tgatgtgtaa acttcatttt ttaaaaagat ttgacgtagt ataatttcag 600

ttttctctaa aaagaaatat agtccaaatg gtgaatttgt atgagtaaat gagcagttct 660

taccttattc aagaatactc attcataata tgttgtctca aaagtttcat tcaacacata 720

gcaaaaggaa caattaaata atttaattgt ttccagtgag taccatttac aatacatgta 780

ttcaaaccaa tgtacaacca cttaagttga actctataat ttccaaagtt tctttgttca 840

ttcgttgtca ttagatatta ggtgtccatg aagccttctt ctacctttgg aacacttaaa 900

gcctattatt ttataacaaa ataacaattc tttccataaa tagctttgtc aaggtgtgag 960

cacattataa atccacggca ttttctatgc acagagagaa catgtgcttt agactagaat 1020

agccaatgat agtcgtcaga ttacttggga ttcaatcaat caatcaattt tcaaaaattc 1080

tgccccatat cacaattatt aagccattta taacatatat tatgattttt taattcagaa 1140

gttatcacat ttatacagta gtatatcatc aatagcttgt ataaattgga attacaggtg 1200

gatacatata agtgatagat cacataatct tatatacgta gaaataagat tttatggatg 1260

tggataaagt ttttttattg attattccca ttcatttgta agtgcttctt gtaatgggag 1320

attcagtcat aaattgaggt aacttctttt taaaagctta atcatctcaa gttagactga 1380

aaactactga aaatgggaaa ccttcgtata ggttttttta aagagatttc ccatctacct 1440

ttcatagctt gttcaaatat atgcactcta aaaattaccc accccatctt atcttaagcc 1500

ttcactgcaa ttctagcctc ttcttgtgag tcaaatcttt gaaatgaaag aactgatatt 1560

cccttattgc tgttgccctt aaaattaaga gggtttaata atatattttt ctattaatgg 1620

gttgtcataa tatacagtct ggtagaaatt caataataat aaaatttaaa cctatcataa 1680

aaactgtgtt cttaattacc aagccattta gataaatttg tttataatgt aaagatacaa 1740

catattactt ggactaatag aatcatagat ctgtaactac tacaactcta gaccctgagt 1800

tgttggaccc cttagaactc tggggccacc tttgctgcac cattttcaca ggatttgcat 1860

tgtagtggct tcacagagag tgactccaac cagagaagca gcagtgttgt ctttgccatt 1920

atggccatag gaatattgta tttcaaaaat ttgtaactgt gtacacagac atgatttttt 1980

acaaactaaa tttcccatta gtgtctgtat gtggagtaca catggtattt tcttaaaaat 2040

gcctaatatt ttcagggaat tacagatata ttagaatcca tttgatttaa tttactttca 2100

tcccatgcag aaattcactg atgcggtagg aaataagaag aaggtaaaac tgtttatttc 2160

cataggtcct gcttttcatt gtaagagcaa agcaaacata aaattatgcc gcaataatgt 2220

gagctagcgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga 2280

tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg 2340

tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 2395

<210> 82

<211> 2331

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scAAV_H1_miR1-1-XD-14792_CBh_GFP_SV40p (5' ITR .. 3' ITR)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(106)

<223> 5' ITR

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(203)

<223> H1启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(342)

<223> miR1-1-XD-14792

<220>

<221> misc_feature

<222> (343)..(348)

<223> 终止子

<220>

<221> misc_feature

<222> (349)..(634)

<223> CMV早期增强子相对于标准CMV增强子含有18-bp缺失

<220>

<221> misc_feature

<222> (636)..(913)

<223> 鸡β肌动蛋白启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (983)..(1079)

<223> 具有剪接供体和受体位点的SV40内含子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1153)..(1869)

<223> GFP，哺乳动物密码子优化

<220>

<221> misc_feature

<222> (1870)..(1899)

<223> Myc表位标签

<220>

<221> misc_feature

<222> (1939)..(2161)

<223> SV40终止

<220>

<221> misc_feature

<222> (2187)..(2331)

<223> 3' ITR

<400> 82

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggctcg agatatttgc 120

atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa tgtctttgga tttgggaatc 180

ttataagttc tgtatgagac caccatgcag actgcctgct tgggtacaga ccaaagagta 240

gtcgaattat ggacctgcta agctaattaa ctactctttg gtctgaactc aggccgggac 300

ctctctcgcc gcactgaggg gcactccaca ccacgggggc cgttttttcg ttacataact 360

tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt 420

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 480

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 540

taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 600

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 660

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 720

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 780

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 840

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 900

cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg gcctagagtc gacgaggaac 960

tgaaaaacca gaaagttaac tggtaagttt agtctttttg tcttttattt caggtcccgg 1020

atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt tacttctagg 1080

cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc ggccgatcca 1140

ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 1200

gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 1260

gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 1320

ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 1380

gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 1440

cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 1500

ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 1560

atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 1620

aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1680

gttcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1740

cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1800

gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1860

ctgtacaagg agcagaagct gatcagcgag gaggacctgt agcctgcagg ggccctcgac 1920

ccgggcggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa 1980

ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 2040

taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 2100

aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta 2160

accggtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 2220

gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 2280

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca g 2331

Claims (39)

1.一种载体填充序列，其包括长度为约1300至约2300个核苷酸并且与以下中的任一个具有至少75％同一性的核酸：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ IDNO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ IDNO:81的核苷酸342-2222。

2.根据权利要求1所述的载体填充序列，其中所述核酸的长度为约1500-2000个核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的载体填充序列，其中所述核酸的长度为约1600至1900个核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸与以下中的任一个具有至少80％同一性：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ IDNO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ IDNO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ IDNO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；以及SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ IDNO:81的核苷酸342-2222。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸与以下中的任一个具有至少85％同一性：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:19的核苷酸489-2177；SEQ ID NO:20的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ IDNO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ IDNO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸与以下中的任一个具有至少90％同一性：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ IDNO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；以及SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸与以下中的任一个具有至少95％同一性：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ IDNO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ IDNO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；和SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸与以下中的任一个具有至少97％同一性：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ IDNO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ IDNO:31的核苷酸580-2187；SEQID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；以及SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的载体填充序列，其中所述核酸包含以下中的任一个或由以下中的任一个组成：SEQ ID NO:45-51；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸489-2185；SEQ ID NO:17的核苷酸342-2222；SEQ ID NO:18的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:21的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:22的核苷酸488-2177；SEQ ID NO:23的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:24的核苷酸711-2187；SEQ ID NO:25的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:26的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:27的核苷酸252-2132；SEQ ID NO:28的核苷酸252-2132；SEQ IDNO:29的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:30的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:31的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:32的核苷酸580-2196；SEQ ID NO:33的核苷酸357-2237；SEQ ID NO:34的核苷酸358-2195；SEQ ID NO:35的核苷酸580-2187；SEQ ID NO:36的核苷酸580-2196；SEQID NO:37的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:38的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:39的核苷酸349-2186；SEQ ID NO:40的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:41的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:42的核苷酸348-2228；SEQ ID NO:43的核苷酸349-2186；以及SEQ ID NO:44的核苷酸571-2178；SEQ ID NO:78的核苷酸349-2229；SEQ ID NO:79的核苷酸358-2238；SEQ ID NO:80的核苷酸342-2222；和SEQ ID NO:81的核苷酸342-2222。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的载体填充序列，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体，任选地其中所述AAV载体是自互补的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的载体填充序列，其中所述载体填充序列与包含异源核酸序列的表达构建体相邻。

12.根据权利要求11所述的载体填充序列，其中所述异源核酸序列编码治疗剂。

13.根据权利要求12所述的载体填充序列，其中所述治疗剂包含编码抑制性核酸的核酸。

14.根据权利要求13所述的载体填充序列，其中所述抑制性核酸包括siRNA、miRNA、shRNA或dsRNA。

15.根据权利要求14所述的载体填充序列，其中所述抑制性核酸包括靶向神经退行性疾病相关基因的miRNA，任选地其中所述神经退行性疾病是脊髓小脑共济失调-2、肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(G-PDC)、皮克氏病、海马硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。

16.根据权利要求15所述的载体填充序列，其中所述神经退行性疾病是多聚谷氨酰胺重复序列疾病。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的载体填充序列，其中所述抑制性核酸靶向ATXN2。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的载体填充序列，其中所述异源核酸编码人工miRNA，所述人工miRNA包含：

(a)选自SEQ ID NO:1-4和71的向导序列；

(b)在SEQ ID NO:1中提供的向导序列和由SEQ ID NO:5提供的过客序列；在SEQ IDNO:2中提供的向导序列和由SEQ ID NO:6提供的过客序列；在SEQ ID NO:3中提供的向导序列和由SEQ ID NO:7提供的过客序列；由SEQ ID NO:4提供的向导序列和由SEQ ID NO:8提供的过客序列；或由SEQ ID NO:71提供的向导序列和由SEQ ID NO:72提供的过客序列；或者

(c)由SEQ ID NO:9-12和73中的任一个提供的序列。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的载体填充序列，其中所述表达构建体包括启动子、聚腺苷酸化信号、终止信号或其任何组合。

20.根据权利要求19所述的载体填充序列，其中所述启动子是H1启动子，任选地其中：

(a)所述H1启动子是H1长启动子，其包含SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:13-16和18-24中的任一个的核苷酸113-343；

(b)所述H1启动子是包含SEQ ID NO:53的H1启动子；或者

(c)所述H1启动子是H1短启动子，其包含SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:17、25-28和37-44中的任一个的核苷酸113-203。

21.根据权利要求19或20所述的载体填充序列，其中所述终止信号是SV40终止信号，任选地其中所述SV40终止信号包含由SEQ ID NO:77提供的序列。

22.一种重组AAV载体，其包括根据权利要求1至21中任一项所述的载体填充序列。

23.根据权利要求22所述的重组AAV载体，其中所述AAV载体是自互补的。

24.根据权利要求22或23所述的重组AAV载体，其中所述AAV载体包括侧接所述表达构建体和所述载体填充序列的5'反向末端重复序列(ITR)和3'ITR。

25.根据权利要求24所述的重组AAV载体，其中所述5'ITR和所述3'ITR从选自由以下组成的组的AAV血清型获得：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10、AAV11以及其变体。

26.根据权利要求24或25所述的重组AAV载体，其中所述5'ITR和所述3'ITR之一缺少功能性末端解离位点。

27.根据权利要求26所述的重组AAV载体，其中所述5'ITR缺少功能性末端解离位点。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的重组AAV载体，其中：

(a)所述5'ITR包含SEQ ID NO:57；或SEQ ID NO:13-24、29-44和78-82中的任一个的核苷酸1-106；和/或

(b)所述3'ITR包含SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸2192-2358；SEQ ID NO:17的核苷酸2229-2395；SEQ ID NO:18的核苷酸2184-2350；SEQ ID NO:13-16中的任一个的核苷酸2214-2358；SEQ ID NO:17的核苷酸2251-2395；SEQ ID NO:18的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:19的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:20的核苷酸2216-2360；SEQ IDNO:21的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:22的核苷酸2206-2350；SEQ ID NO:23的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:24的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:25的核苷酸2161-2305；SEQ IDNO:26的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:27的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:28的核苷酸2161-2305；SEQ ID NO:29的核苷酸2266-2410；SEQ ID NO:30的核苷酸2224-2368；SEQ IDNO:31的核苷酸2216-2360；SEQ ID NO:32的核苷酸2225-2369；SEQ ID NO:33的核苷酸2266-2410；SEQ ID NO:34的核苷酸2224-2368；SEQ ID NO:35的核苷酸2216-2360；SEQ IDNO:36的核苷酸2225-2369；SEQ ID NO:37的核苷酸2257-2401；SEQ ID NO:38的核苷酸2258-2402；SEQ ID NO:39的核苷酸2215-2359；SEQ ID NO:40的核苷酸2207-2351；SEQ IDNO:41的核苷酸2207-2351；SEQ ID NO:42的核苷酸2257-2401；SEQ ID NO:43的核苷酸2215-2359；SEQ ID NO:44的核苷酸2207-2351；SEQ ID NO:78的核苷酸2258-2402；SEQ IDNO:79的核苷酸2267-2411；SEQ ID NO:80的核苷酸2251-2395；SEQ ID NO:81的核苷酸2251-2395；或SEQ ID NO:82的核苷酸2187-2331。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的重组AAV载体，其包括：

(a)SEQ ID NO:13-24、29-44和78-80中的任一个的核苷酸序列；

(b)SEQ ID NO:13的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(b)SEQ ID NO:14的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(c)SEQ ID NO:15的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(d)SEQ ID NO:16的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(e)SEQ ID NO:17的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的miRNA的序列取代；

(f)SEQ ID NO:18的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(g)SEQ ID NO:19的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(h)SEQ ID NO:20的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(i)SEQ ID NO:21的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(j)SEQ ID NO:22的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(k)SEQ ID NO:23的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(l)SEQ ID NO:24的核苷酸序列，其中核苷酸344-481被编码所关注的miRNA的序列取代；

(m)SEQ ID NO:29的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(n)SEQ ID NO:30的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(o)SEQ ID NO:31的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(p)SEQ ID NO:32的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(q)SEQ ID NO:33的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(r)SEQ ID NO:34的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(s)SEQ ID NO:35的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(t)SEQ ID NO:36的核苷酸序列，其中核苷酸213-350被编码所关注的miRNA的序列取代；

(u)SEQ ID NO:37的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(v)SEQ ID NO:38的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(w)SEQ ID NO:39的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(x)SEQ ID NO:40的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(y)SEQ ID NO:41的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(z)SEQ ID NO:42的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(aa)SEQ ID NO:43的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(bb)SEQ ID NO:44的核苷酸序列，其中核苷酸204-341被编码所关注的miRNA的序列取代；

(cc)SEQ ID NO:78的核苷酸序列，其中核苷酸204-342被编码所关注的人工miRNA的序列取代；

(dd)SEQ ID NO:79的核苷酸序列，其中核苷酸213-351被编码所关注的人工miRNA的序列取代；

(ee)SEQ ID NO:80中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的人工miRNA的序列取代；或者

(ff)SEQ ID NO:81中所示的核苷酸序列，其中核苷酸204-335被编码所关注的人工miRNA的序列取代。

30.一种rAAV颗粒，其包括根据权利要求22至29中任一项所述的rAAV载体。

31.根据权利要求30所述的rAAV颗粒，其中所述rAAV颗粒包括衣壳蛋白。

32.根据权利要求31所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳蛋白能够穿过血脑屏障。

33.根据权利要求31或32所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。

34.一种向受试者递送治疗剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求28至32中任一项所述的rAAV颗粒。

35.根据权利要求34所述的方法，其中受试者患有神经退行性疾病或有罹患神经退行性疾病的风险。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述施用包括直接注射到所述受试者的CNS。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述直接注射是脑内注射、脑实质内注射、鞘内注射、纹状体内注射、软膜下注射或其任何组合。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述直接注射是直接注射到所述受试者的脑脊液(CSF)中，任选地其中所述直接注射是脑池内注射、脑室内注射和/或腰椎内注射。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是脊髓小脑共济失调-2、肌萎缩性侧索硬化症、额颞叶痴呆、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、边缘为主的年龄相关性TDP-43脑病、慢性创伤性脑病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹(PSP)、关岛型痴呆帕金森氏症ALS复合征(G-PDC)、皮克氏病、海马硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。