KR101299320B1 - 초과산화물 억제제 효과를 갖는 프로부콜 및테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체를 함유하는조합 약물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 조합 약물에 관한 것으로서, 이것은 상기 조합물의 상승적 초과산화물 억제제 효과에 기인하여, 급성 뇌경색 및 만성 뇌경색을 포함하는 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 (예를 들면, 당뇨병성 신장병, 신부전, 신염) 및 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하다.

<화학식 1>

식 중, R은 시클로알킬기이고, A는 저급 알킬렌기이고, 카르보스티릴 핵의 3-위치와 4-위치 사이의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합이다.

초과산화물, 실로스타졸, 프로부콜, 조합 약물

Description

초과산화물 억제제 효과를 갖는 프로부콜 및 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체를 함유하는 조합 약물 {COMBINATION DRUG CONTAINING PROBUCOL AND A TETRAZOLYLALKOXY-DIHYDROCARBOSTYRIL DERIVATIVE WITH SUPEROXIDE SUPRESSANT EFFECTS}

본 발명은 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 또는 당뇨병을 치료 및 예방하기 위한 조합 약물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 하기 화학식 1의 하나 이상의 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는, 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 또는 당뇨병을 치료 및 예방하기 위한 조합 약물에 관한 것이다.

식 중, R은 시클로알킬기이고, A는 저급 알킬렌기이고, 카르보스티릴 핵의 3-위치와 4-위치 사이의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합을 의미한다.

본 발명의 조합 약물은 상기 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1)과 프로부콜 (=4,4'-이소프로필리덴디티오비스[2,6-디-tert-부틸페놀])의 조합에 의한 상승적 효과에 기초한 초과산화물 억제 활성에 기인하여 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 또는 당뇨병에 효과적이다.

뇌혈관 발작 또는 뇌연화증으로도 알려져 있는 급성 뇌경색 및 만성 뇌경색을 포함하는 뇌경색은, 뇌 조직 또는 세포의 괴사를 초래하는 대뇌 동맥 및/또는 정맥의 폐색 또는 협착에 기인한 뇌 일부로의 혈액 공급 중단에 의해 야기된다. 이의 가장 중요한 위험 인자는 고혈압증, 심장 질환, 당뇨병 및 흡연이다. 뇌경색의 치료를 위해서는, 자유 라디칼 및 대뇌 팽창에 기인한 괴사의 발전을 저해하는 것이 중요하며, 항응고제, 혈전용해제, 예컨대 유로키나아제, 조직 플라즈미노겐 활성제 (tPA)가 사용되고 있다.

동맥경화증 (이 용어는 흔히 죽상 동맥경화증과 호환 사용됨)은 동맥벽이 두꺼워지고 경직되어 장기 및 조직으로의 혈류가 제한되는 증상이다. 원인은 알려져 있지 않지만, 이는 동맥 내층에 대한 손상 또는 상해로부터 시작되는 것으로 추정되며, 이러한 손상은 고혈압, 고콜레스테롤, 자극물질 (예를 들면, 니코틴), 및 당뇨병과 같은 특정 질환에 의해 야기될 수 있다. 동맥경화증의 치료를 위해서는, 다양한 약물, 예를 들면 항콜레스테롤제 (예를 들면, 프로부콜, 스타틴, 클로피브레이트), 항혈소판제 (예를 들면, 아스피린), 항응고제 (예를 들면, 헤파린, 와파린), 혈압 조절제 (예를 들면, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 저해제, 칼슘 채널 차단제)가 사용되고 있다.

당뇨병성 신장병, 신부전 및 신염을 포함하는 신장 질환은, 과도한 사구체 여과 및 단백뇨증과 같은 기능적 변화, 및 세포외 기질 단백질의 증가에 기인한 사구체 경화와 같은 조직학적 변화를 특징으로 한다. 신장 질환은 증가된 산화제 스트레스, 사구체 고혈압에 기인한 압력 과부하, 최종 당화 산물 (AGE)의 축적, 고혈당증에 기인한 세포내 비정상 대사 (예를 들면, 폴리올 경로 및 헥소사민 경로의 증가, 및 단백질 키나아제 C (PKC)의 활성화), 또는 지속된 고혈당에 의해 야기되는 것으로 생각되고, 활성 산소는 세포내 비정상 대사 또는 AGE 형성 과정 중에 증가한다는 보고 (Nature, 414, pp. 813-820, 2001 참고), 및 헥소사민 경로의 증가, PKC 활성화 및 AGE의 증가는 모두 미토콘드리아에서의 과도한 초과산화물 생성의 저해에 의해 저해된다는 보고 (Nature, 404, pp. 787-790, 2000 참고)에 비추어, 고혈당증뿐만 아니라 증가된 산화제 스트레스가 신장 질환의 가장 중요한 기원인 것으로 생각된다.

인슐린 저항성의 악화는 당뇨병 발병의 중요한 인자이지만, 이러한 인슐린 저항성의 악화는 당뇨병과 같은 대사 증후군의 병인이 될 뿐만 아니라, 심혈관 질환과 신장 질환의 발병 및 발전도 촉진하는 것으로 알려져 있고 (Arterioscler. Thromb: Vase. Biol., 24, pp. 816-823, 2004 참고), 그러므로 인슐린 저항성의 개선이 당뇨병 및 당뇨병성 합병증의 치료에 유용할 것으로 생각된다. 또한, 증가된 산화제 스트레스가 인슐린 저항성을 유도하는 중요한 인자일 수 있다고 보고되어 있고 (Nature, 440, pp. 944-948, 2006 참고), 그러므로 인슐린 저항성 개선 활성에 비추어, 산화제 스트레스 저해제가 신장 질환의 발병과 발전 및 당뇨병의 예방 및 치료에 유용할 수 있다.

신장 질환이 있는 당뇨병 환자의 수는 매년 증가하고 있지만, 신장 질환을 치료하기에 적절한 요법은 발견되지 않았다.

한편, 산소는 생명을 유지하기 위해서, 예를 들면 정상적인 에너지 생성 및 대사를 유지하기 위해서 생체에 필수인 것으로 알려져 있다. 산소는 생체 내에서 소위 활성 산소로 변화될 수 있다. 활성 산소에는 라디칼 산소 및 비-라디칼 산소가 포함된다. 지질 관련 물질을 포함하는 광의의 활성 산소 중에서, 전자의 라디칼 산소에는 히드록실 라디칼 (^·OH), 알콕시 라디칼, 퍼옥시 라디칼, 히드로퍼옥시 라디칼, 일산화질소, 이산화질소, 초과산화물 (O₂ ^·-) 등이 포함된다. 후자의 비-라디칼 산소군에는 일중항 산소, 오존, 과산화수소 (H₂O₂), 지질 히드로과산화물 등이 포함된다.

조직 세포에 영향을 줄 수 있는 활성 산소로서는, O₂ ^·- 및 ^·OH의 라디칼 산소, 및 H₂O₂의 비-라디칼 산소가 있다 (YAKUGAKU ZASSHI 122(3), pp. 203-218 (2002) 참조). O₂ ^·-는 생체 내에서 초과산화물 불균등화효소 (SOD)의 작용에 의해 산소 및 과산화수소를 생성한다. 과산화수소는 세포에 포함된 철 이온, 구리 이온의 촉매 작용에 의해 ^·OH로 변화된다. 히드록실 라디칼은 생체 내에서 DNA, 단백 질을 직접 공격한다. 한편으로, 히드록실 라디칼은 지질과 반응함으로써 지질 라디칼로 전환된 다음, 지질 히드로과산화물을 생성한다.

따라서, 심각한 질환과 관계된 ^·OH, H₂O₂와 같은 이들 활성 산소는 대부분 O₂ ^·-에 의해 야기되고, 그러므로 O₂ ^·-를 억제할 수 있는 물질을 발견하는 것이 요구되고 있다.

<발명의 개시>

본 발명자들은 활성 산소 억제 활성을 가진 것으로 알려져 있는 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1)과 공지된 항고지혈증제인 프로부콜의 조합물의 약리학적 활성을 예의 연구하여, 상기 조합물이 뇌경색, 동맥경화증 및 신장 질환을 야기하는 초과산화물을 억제하는 우수한 상승적 활성뿐만 아니라 우수한 상승적 항산화제 활성을 나타내고, 추가로 인슐린 저항성의 유의적인 개선을 나타내며, 신장 기능장애의 지표 중 하나인 글루코오스의 뇨중 배설을 현저하게 감소시키는 것을 발견한 데 이어, 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1)과 프로부콜의 조합물이 우수한 초과산화물 억제 활성에 기인하여 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 (예를 들면, 당뇨병성 신장병, 신부전, 신증) 또는 당뇨병의 예방 및/또는 치료에 효과적임을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1) 및 프로부콜을 포함하는, 뇌경색을 예방 및 치료하기 위한 조합 약물을 제공하 는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1) 및 프로부콜을 포함하는, 동맥경화증을 예방 및 치료하기 위한 조합 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1) 및 프로부콜을 포함하는, 신장 질환을 예방 및 치료하기 위한 조합 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1) 및 프로부콜을 포함하는, 당뇨병을 예방 및 치료하기 위한 조합 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 보다 추가적인 목적은 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 (1)과 프로부콜의 조합물을 포함하는, 개선된 초과산화물 억제제를 제공하는 것이다.

도 1은 NAD(P)H 의존성 O₂ ^·- 생성에 대한 실로스타졸 단독 또는 실로스타졸과 프로부콜의 조합물에 의한 저해에서의 실로스타졸 농도와 NAD(P)H 의존성 O₂ ^·- 생성 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.

도 2는 고콜레스테롤을 공급한 저밀도 지단백질 수용체 녹아웃 마우스에서의 죽상 동맥경화증 병변에 대한 0.3％ 실로스타졸 단독, 0.1％ 프로부콜 단독, 또는 0.3％ 실로스타졸과 0.1％ 프로부콜의 조합물의 저해 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 고콜레스테롤을 공급한 저밀도 지단백질 수용체 녹아웃 마우스에서의 죽상 동맥경화증 병변에 대한 0.3％ 실로스타졸 단독, 0.5％ 프로부콜 단독, 또는 0.3％ 실로스타졸과 0.5％ 프로부콜의 조합물의 저해 효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 래트에서의 국소 대뇌 허혈 상해에 대한 프로부콜 및 실로스타졸 단독, 및 프로부콜과 실로스타졸의 조합물의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 래트에서의 글루코오스 뇨중 배설에 대한 프로부콜 및 실로스타졸 단독, 및 프로부콜과 실로스타졸의 조합물의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 래트에서의 인슐린 저항성에 대한 프로부콜 및 실로스타졸 단독, 및 프로부콜과 실로스타졸의 조합물의 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 조합 약물 성분 중 하나로서 포함되는 카르보스티릴 유도체는 하기 화학식 1의 테트라졸릴알콕시-디히드로카르보스티릴 유도체 또는 그의 염이다.

<화학식 1>

식 중, R은 시클로알킬기이고, A는 저급 알킬렌기이고, 카르보스티릴 핵의 3-위치와 4-위치 사이의 결합은 단일 결합 또는 이중 결합을 의미한다.

상기 화학식 1에서, 시클로알킬기에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸과 같은 C₃-C₈ 시클로알킬기가 포함된다. 바람직한 것은 시클로헥실이다. 저급 알킬렌기에는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 테트라메틸렌, 부티렌 및 펜틸렌과 같은 C₁-C₆ 알킬렌기가 포함되고, 이들 중에서 바람직한 것은 테트라메틸렌이다.

바람직한 카르보스티릴 유도체는 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴이고, 이는 항혈소판제로서 실로스타졸의 상표명으로 시판중이다.

이들 카르보스티릴 유도체 (1) 및 그의 염, 및 이들의 제조 방법은 미국 특허 제4,277,479호에 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 제6,743,806호에는 카르보스티릴 유도체 (1)이 활성 산소 억제 활성을 갖는 것으로 개시되어 있다.

또 다른 활성 성분인 프로부콜은 4,4'-이소프로필리덴디티오비스[2,6-디-tert-부틸페놀]의 화학명을 갖는 화합물이며, 이미 항고지혈증제로서 시판중이다. 또한, 이 화합물은 산화 LDL (저밀도 지단백질) 생성의 저해 활성을 갖는 것으로 알려져 있다 (J. Clin. Invest., 77, p. 641, 1986 참조).

이들 활성 성분인 카르보스티릴 유도체 (1) 및 프로부콜은 동일한 시간 또는 상이한 시간에, 함께 또는 개별적으로 투여할 수 있다. 이들 성분은 보통 통상적인 약학적 제형으로 사용될 수 있다. 그 다음, 이들 성분은 단일 투여형 또는 개별 투여형의 약학적 제형으로 제조될 수 있다.

투여형은 특정되는 것은 아니고, 임의의 통상적인 약학적 제형, 예를 들면 정제, 캡슐, 과립, 경구 투여에 적절한 다양한 액체 제제와 같은 경구 투여용 제제, 또는 주사제, 좌제와 같은 비경구 투여용 제제일 수 있다.

이들 활성 성분의 투여량은 특정한 범위로 제한되지 않는다. 카르보스티릴 유도체 (1) 또는 그의 염은 성인 (체중 50 kg)에게 50 내지 200 mg/일의 양으로 사용할 수 있고, 이는 1 일 1 회 또는 1 일당 2 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 프로부콜은 성인 (체중 50 kg)에게 100 내지 1000 mg/일의 양으로 사용할 수 있고, 이는 한번에 투여할 수도 있지만, 바람직하게는 1 일 투여량을 1 일당 2 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이들 성분을 단일 투여형으로 제조하는 경우, 이들은 카르보스티릴 유도체 (1) 또는 그의 염 1 중량부당 프로부콜 0.25 내지 10 중량부의 비율로 혼입시킨다.

정제, 캡슐, 경구 투여용 액체와 같은 제제는 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 정제는 활성 성분(들)과 젤라틴, 전분, 락토오스, 스테아르산 마그네슘, 탤크, 아라비아 검 등과 같은 통상적인 약학적 담체를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 캡슐은 불활성의 약학적 충전제 또는 희석제와 혼합하여 경질 젤라틴 캡슐 또는 연질 캡슐에 충전함으로써 제조할 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르와 같은 경구 액체 제제는 활성 성분(들)과 감미제 (예를 들면, 수크로오스), 보존제 (예를 들면, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 착색제, 풍미제 등을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 비경구 투여용 제제 또한 통상적인 방법으로, 예를 들면 멸균된 수성 담체, 바람직하게는 물 또는 식염수에 본 발명의 활성 성분(들)을 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 비경구 투여에 적절한 바람직한 액체 제제는, 앞서 언급한 바와 같은 활성 성분의 1 일 투여량을 물 및 유기 용매, 및 추가로 300 내지 5000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 용해시킴으로써 제조할 수 있고, 이는 바람직하게는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐 알코올과 같은 윤활제와 함께 혼입시킨다. 상기 액체 제제는 바람직하게는 소독제 (예를 들면, 벤질 알코올, 페놀, 티메로살), 살균제와 함께, 추가로 임의적으로는 등장제 (예를 들면, 수크로오스, 염화 나트륨), 국소 마취제, 안정제, 완충제 등과 함께 추가로 혼입시킬 수도 있다. 안정성 유지의 관점에서, 비경구 투여용 제제는 캡슐에 충전한 후, 통상적인 냉동건조 기술에 의해 수성 매질을 제거할 수 있고, 사용 시에 수성 매질에 용해시킴으로써 액체 제제로 회복시킨다.

본 발명에 따르면, 카르보스티릴 유도체 (1), 구체적으로는 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴, 또는 그의 염과 프로부콜을 조합함으로써, 이들은 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 (예를 들면, 당뇨병성 신장병, 신부전, 신증) 또는 당뇨병에 효과적이게 된다.

이러한 효과를 나타내는 메커니즘 중 하나는 우수한 초과산화물 억제 활성에 기인할 수 있는데, 즉 이들은 우수한 상승적 항산화제 활성 및 상승적 초과산화물 억제 효과를 나타내고, 이로써 조직 세포에 영향을 주는 초과산화물을 효과적으로 제거한다. 게다가, 초과산화물을 억제함으로써, 이는 또한 초과산화물로부터 유도되는 ^·OH, H₂O₂의 생성을 저해하게 된다. 본 발명의 조합 약물은 또한 심각한 질환의 주요 원인인 O₂ ^·-, ^·OH, H₂O₂와 같은 활성 산소의 생성을 저해할 수 있다. 초과산화물은 뇌경색 (예를 들면, 급성 뇌경색, 만성 뇌경색), 동맥경화증, 신장 질환 (예를 들면, 당뇨병성 신장병, 신부전, 신증)을 야기시키는 것으로 알려져 있다 (뇌경색에 대한 O₂ ^·-의 관여를 개시하는 문헌 [Antioxidants ＆ Redox Signaling, 5, 2003, pp. 597-607]; NAD(P)H 산화효소가 O₂ ^·-를 생성하고 동맥경화증과 같은 순환계 질환에 관여함을 개시하는 문헌 [Circ. Res., 86, 2000, pp. 494-501]; 신장 질환에 대한 O₂ ^·-의 관여를 개시하는 문헌 [Eur. J. Pharmacol., 450, 2002, pp. 67-76] 참조).

따라서, 상승적 초과산화물 억제제 효과에 의해, 본 발명의 카르보스티릴 유도체 (1)과 프로부콜의 조합물은 뇌경색, 동맥경화증, 신장 질환 (예를 들면, 당뇨병성 신장병, 신부전, 신증) 또는 당뇨병의 예방 및 치료에 대해 목적한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명을, 하기 본 발명 작용제의 제조예 및 초과산화물 억제 활성의 실험예를 통해서 설명하지만, 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 된다.

제조예 1

정제의 제조:

성분 양 (g)

6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴

100

프로부콜 250

락토오스 (일본 약전) 40

옥수수전분 (일본 약전) 40

결정질 셀룰로오스 (일본 약전) 20

히드록시프로필셀룰로오스 (일본 약전) 4

스테아르산 마그네슘 (일본 약전) 2

상기 본 발명의 활성 성분, 락토오스, 옥수수전분 및 결정질 셀룰로오스를 잘 혼합하고, 혼합물을 히드록시프로필셀룰로오스의 5％ 수용액과 함께 과립화하고, 과립화된 혼합물을 200 메쉬 스크린으로 체질하여 과립을 조심스럽게 건조시킨 다음, 과립을 통상적인 방법으로 정제화하여 정제 (1000 개)를 제조하였다.

약리학적 실험

실험예 1

인간 혈관 내피 세포로부터의 NAD(P)H 의존성 O₂ ^·- 생성에 대한 실로스타졸과 프로부콜의 조합에 의한 상승적 저해

(1) 재료 및 방법:

세포 배양: HCAEC (인간 관상 동맥 내피 세포)를 내피 세포 기본 배지-2 (EGM-2) 불릿 키트 (Bullet kit)에서 배양하였다. 세포를 5％ CO₂ 중 37 ℃에서 컨플루언시까지 성장시켜, 패시지 6 이하에서 실험에 사용하였다.

시험 물질은 (1) 실로스타졸 단독 (n=4), (2) 프로부콜 단독 (n=4), (3) 실로스타졸과 프로부콜의 혼합물 (n=4)이고, 실로스타졸에 대한 최종 농도는 0.3, 1.0 및 3.0 μM이고, 프로부콜은 0.01, 0.03 및 0.1 μM이며, 이는 분자량으로 3:1에서 300:1 사이의 실로스타졸 대 프로부콜 비율에 해당한다.

(2) 초과산화물의 측정:

실로스타졸 및 프로부콜을 디메틸 술폭시드에 10 mM 저장 용액으로서 용해시켰다. 배지에 각각 0, 0.3, 1.0, 3.0 μM 및 0, 0.01, 0.03, O.1 μM의 최종 농도로 실로스타졸 및/또는 프로부콜을 첨가한 직후, TNF-α (50 ng/ml)를 첨가하고, HCAEC를 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 TNF-α에 노출시킨 후, 내피 균질현탁액을 발광측정기 (Microlumat LB96P, EG ＆ G Berthold)에 넣었다. 화학발광을 기록하기 직전, NADH 및 NADPH (최종 농도 각각 100 μM)를 첨가하고, 오토디스펜서를 통해 암순응된 루시제닌 (질산 비스-N-메틸아크리디늄, 5 μM)을 첨가하였다. 화학발광 강도를 30 초마다 15 분 동안 기록하고, 각각의 배경값을 제하였다. 화학발광을 단백질의 mg당 초당 카운트로서 표현하였다.

하기 방식으로 통계적 분석을 행하였다.

1) 던넷 검정 (Dunnett's test)에 의해 실로스타졸 단독 또는 프로부콜 단독에서의 효과를 이들의 조합물의 효과와 비교하였다.

2) 이들의 조합물의 상승적 효과를 평가하기 위해, 대조군, 실로스타졸 단독, 프로부콜 단독 및 조합물 사이에서 이원 분산 분석 (이원 ANOVA)을 수행하였다.

모든 시험은 SAS 소프트웨어 (SAS Institute Japan, R8.1)에 의해 5％의 유의값으로 양측 검정에 의해 행하였다.

(3) 결과:

결과는 첨부한 도 1에 나타내었다. 도 1에서, 세로축은 NAD(P)H 의존성 O₂ ^·- 생성 (대조군에 대한 ％)을 의미하고, 가로축은 실로스타졸 농도 (μM)를 의미하며, 마름모형 표시가 있는 선은 실로스타졸 단독, 즉 프로부콜 없음 (P0)의 데이터를 의미하고, 사각형 표시가 있는 선은 실로스타졸과 0.01 μM 양의 프로부콜의 혼합물의 데이터를 의미하며, 삼각형 표시가 있는 선은 실로스타졸과 0.03 μM 양의 프로부콜의 혼합물의 데이터를 의미하고, "x" 표시가 있는 선은 실로스타졸과 0.1 μM 양의 프로부콜의 혼합물의 데이터를 의미한다.

도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 실로스타졸을 프로부콜과의 조합에 사용한 경우, 실로스타졸 단독과 비교하여 O₂ ^·- 생성이 유의적으로 저해되었다. 또한, 억제 효과는 3 μM 실로스타졸 및 0.1 μM 프로부콜의 조합에 의해 유의적으로 강 화되었다 (이원 ANOVA에 의한 p=0.0322).

실험예 2

고콜레스테롤을 공급한 저밀도 지단백질 수용체 녹아웃 마우스에서의 죽상 동맥경화증에 대한 실로스타졸 및 프로부콜 단독 및 이들의 조합물의 효과

(1) 재료 및 방법:

저밀도 지단백질 수용체 녹아웃 (LDLR-KO) 마우스 (J. Clin. Invest. 1993; 92: 883-893) (오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 (Otsuka Pharmaceutical Co, Ltd.)에서 제조하여 보유하고 있는 9 주령의 수컷)를 사용하였다. 동물을 하기 6가지 군으로 나누어 처리하였다.

1) 대조군 (n=13)

2) 0.3％ 실로스타졸 투여군 (n=14)

3) 0.1％ 프로부콜 투여군 (n=14)

4) 0.5％ 프로부콜 투여군 (n=14)

5) 0.3％ 실로스타졸 + 0.1％ 프로부콜 투여군 (n=14)

6) 0.3％ 실로스타졸 + 0.5％ 프로부콜 투여군 (n=14)

실험을 시작하기 전에, 동물의 체중 및 총 콜레스테롤을 측정하고, 양 데이터에 기초하여 동물을 계층화 무작위법 (SAS 소프트웨어, R8.1)에 의해 무작위로 6가지 군으로 나누었다. 프로부콜 및 실로스타졸의 투여량은 각각 보고서 (Horm. Metab. Res. 2001; 33: 472-479, and J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005; 313: 502-509)에 기초하여 정하였다. 대조군에서는, 마우스에 고지방식 [즉, 콜레스테롤 (1.25％), 콜산 나트륨 (0.5％) 및 카카오 버터 (15％)를 보충한 통상적인 사료 (CRF-1, 오리엔탈 이스트 인더스트리즈사 (Oriental Yeast Industries Co., LTD.) 제조)]을 투여하였고, 시험 물질 투여군에서는, 마우스에 실로스타졸 (0.3％) 및/또는 프로부콜 (0.1％ 또는 0.5％)을 배합한 고지방식을 투여하였다. 고지방식을 LDLR-KO 마우스 (9 주령 이후)에 투여하여 죽상 동맥경화증을 유도하였다 (대조군). 시험 물질 투여군에서는, 시험 물질과 혼합한 고지방식을 마우스 (9 주령 이후)에 투여하였다. 양 군의 마우스를 음식 투여 시작 후 8주째에 해부하였다. 에테르 마취 하에 대동맥 전체를 채취하여 대동맥의 안쪽 면을 노출시키고, 지방을 수단 (Sudan) IV로 염색함으로써 죽상 동맥경화증 병변을 평가하였다. 대동맥 전체 중 죽상 동맥경화증 병변의 영역 (지방/지질 함유)을 대동맥의 염색된 영역 및 전체 영역의 이미지 분석에 의해 카운팅하였다.

하기 방식으로 통계적 분석을 행하였다.

1) 실로스타졸과 프로부콜의 조합물의 상승적 효과를 확인하기 위해, 대조군과 실로스타졸 투여군 사이뿐만 아니라 프로부콜 투여군과 2가지 작용제 투여군 사이에서 이원 ANOVA를 수행함으로써, 상호작용을 관찰하였다.

2) 실로스타졸 투여군 및 프로부콜 투여군에서의 효과를 던넷 검정에 의해 대조군에서의 효과와 비교하였다. 또한, 실로스타졸 투여군 및 프로부콜 투여군에서의 효과를 던넷 검정에 의해 실로스타졸 + 프로부콜 투여군에서의 효과와 비교하였다.

모든 시험은 SAS 소프트웨어 (SAS Institute Japan, R8.1)에 의해 5％의 유 의값으로 양측 검정에 의해 행하였다.

(2) 결과:

죽상 동맥경화증 병변의 영역을, 전체 대동맥의 영역에 대한 수단 IV에 의해 염색된 영역의 비율 (％)로서 계산하였다. 평균값 ± 표준 편차는 대조군에서 10.1 ± 4.7％, 실로스타졸 투여군에서 6.6 ± 2.6％, 0.1％ 프로부콜 투여군에서 6.2 ± 2.6％, 0.5％ 프로부콜 투여군에서 4.7 ± 1.2％, 실로스타졸 + 0.1％ 프로부콜 투여군에서 3.8 ± 1.2％, 실로스타졸 + 0.5％ 프로부콜 투여군에서 2.9 ± 1.5％였다.

첨부한 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 실로스타졸 (0.3％) 및 프로부콜 (0.1 및 0.5％)은 LDLR-KO 마우스에서 죽상 동맥경화증 병변을 유의적으로 저해하였다. 또한, 2가지 작용제의 조합물을 투여한 경우, 동맥경화증은 프로부콜 투여분과의 각 조합에서 보다 강력하게 저해되었다.

실험예 3

래트에서의 국소 대뇌 허혈 상해에 대한 프로부콜 및 실로스타졸 단독 및 이들의 조합물의 효과

(1) 재료 및 방법:

체중이 280 내지 320 g인 수컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트를 펜토바르비탈 나트륨 (20 mg/kg, i.p.)으로 마취시키고, 가열 패드 (Homeothermic Blanket System, Harvard Apparatus, South Natick, MA) 상에 두어 일정한 직장 온도 (37 ± 0.5 ℃)를 유지시켰다. 허혈 전, 허혈 동안 및 22 시간 재관류 후에 전 신 동맥혈압을 측정하였다.

국소 대뇌 허혈은 이미 기재되어 있는 바와 같이 좌측 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 일시적 폐색에 의해 유도하였다 (Stroke 1989; 20:84-91). 끝이 둥근 수술용 나일론 봉합사 (사이즈 3-0)를 MCA의 흐름이 차단될 때까지 외경동맥에서 내경동맥의 내강으로 전진시켰다. MCA 폐색 2 시간 후, 봉합사를 그 끝이 내경동맥을 통과할 때까지 회수함으로서 재관류를 허용하였다.

뇌경색의 분석을 위해, 좌측 MCA 폐색 2 시간 후 재관류 22 시간째에 티오펜탈 나트륨의 과다투여량을 래트에 주고 참수한 다음, 뇌를 빠르게 제거하여 액체 질소 중에 매달아서 동결시켰다. 뇌를 2 mm 두께의 관상 블록으로 절단하였다. 뇌 절편을 30 분 동안 37 ℃에서 생리식염수 중 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)의 2％ 용액에 침지한 다음, 4 ℃에서 10％ 포스페이트 완충 포르말린 중에 고정하였다. TTC-염색 뇌 절편을 CCD 비디오 카메라를 사용하여 촬영하고, 경색부의 크기를 이미지 분석 시스템 (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, Maryland)으로 계산하여, 동측 반구에 대한 경색 조직의 백분율로서 표현하였다.

실로스타졸 및 프로부콜을 각각 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 30 mg/ml 저장 용액으로서 용해하고, 포스페이트 완충 식염수로 10 mg/ml까지 희석하였다. 일 군에서는, 래트에 20 mg/kg의 실로스타졸을 각각 MCA 폐색 완료 후 5 분 및 4 시간째에 2회 경구 투여하였다. 래트의 다른 군에는 30 mg/kg 프로부콜을 각각 MCA 폐색 완료 후 5 분 및 4 시간째에 2 회 경구 투여하였다. 조합군 래트에는 20 mg/kg 실로스타졸 + 30 mg/kg 프로부콜을 각각 2 회 경구 처리하였다. 비히클군에는 실로스 타졸/프로부콜 없이 30％ DMSO 용액 (300 ㎕)을 경구 투여하였다.

하기 방식으로 통계적 분석을 행하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로서 표현하였다. 군들 사이 반구 경색 영역의 결과 비교를 반복 측정 분산 분석에 이어 사후 비교로서 투키 다중 비교 검정 (Tukey's multiple comparison test)에 의해 분석하였다. 차이는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

(2) 결과:

대뇌 허혈 구역은 2 시간 허혈/22 시간 재관류시킨 래트에서 분명한 담염 영역으로서 좌측 대뇌 반구의 피질 및 선조에서 일관적으로 확인되었다. 첨부한 도 4에 나타낸 바와 같이, 경색 영역은 동물에 20 mg/kg 실로스타졸을 2 시간 허혈 완료 후 5 분 및 4 시간째에 2회 경구 투여한 경우 근소하게 감소한 반면, 30 mg/kg 프로부콜은 효과가 없었다. 실로스타졸 (20 mg/kg)과 프로부콜 (30 mg/kg)을 조합한 처리는 반구 뇌경색 영역을 비히클의 경우와 비교하여 유의적으로 감소시킴으로써, 조합 요법의 강력한 상승적 효과를 나타내었다.

실험예 4

래트에서의 글루코오스 뇨중 배설 및 인슐린 저항성에 대한 프로부콜 및 실로스타졸 단독 및 이들의 조합물의 효과

(1) 재료 및 방법:

오츠카 롱-에반스 도꾸시마 패티 (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) (OLETF) 수컷 래트 (6 주령)를 계층화 무작위법 (SAS 소프트웨어, R8.1 사용)에 의해 체중에 따라 하기 4가지 군으로 무작위로 나누었다.

i) 대조군: n=10

ii) 0.3％ 실로스타졸 투여군: n=10

iii) 0.5％ 프로부콜 투여군: n=10

iv) 0.3％ 실로스타졸 + 0.5％ 프로부콜 투여군: n=9

무작위 군화 직후, 각 군의 마우스에 고지방식 (콜레스테롤 (1.25％), 콜산 나트륨 (0.5％) 및 카카오 버터 (15％)를 보충한 시판중인 사료 (CRF-1, 오리엔탈 이스트 인더스트리즈사 제조))을 투여하여 신장 질환의 발병을 촉진시켰다. 시험 물질 투여군에서는, 군화 직후 각 마우스에 시험 물질을 배합한 고지방식을 투여하였다.

사육 개시 후 11 주째에, 마우스의 꼬리 정맥으로부터 마취 없이 채혈하여 혈장 글루코오스 및 혈장 내 인슐린 수치를 측정하였다. 별도로, 소변을 채취하여 뇨중 글루코오스를 측정하였다. 글루코오스는 시판중인 글루코오스 측정용 키트를 사용하여 효소법으로 측정하였고, 인슐린은 시판중인 ELISA 키트로 측정하였다.

하기 방식으로 통계적 분석을 행하였다.

1) 실로스타졸과 프로부콜의 조합물의 상승적 효과를 확인하기 위해, 대조군과 실로스타졸 투여군 사이뿐만 아니라 프로부콜 투여군과 2가지 작용제 투여군 사이에서 이원 ANOVA를 수행함으로써, 상호작용을 관찰하였다.

2) 실로스타졸 투여군 및 프로부콜 투여군에서의 효과를 던넷 검정에 의해 대조군에서의 효과와 비교하였다. 또한, 실로스타졸 투여군 및 프로부콜 투여군에서의 효과를 던넷 검정에 의해 실로스타졸 + 프로부콜 투여군에서의 효과와 비교하 였다.

모든 시험은 SAS 소프트웨어 (SAS Institute Japan, R8.1)에 의해 5％의 유의값으로 양측 검정에 의해 행하였다. 데이터는 평균 ± SD (n)로 나타내었다.

(2) 결과:

1) 뇨중 글루코오스에 대한 2가지 작용제의 조합의 효과:

대조군은 정상 래트에서의 데이터 (10 mg/dl 미만)보다 훨씬 높은 186 ± 171 mg/dl (n=10)의 뇨중 글루코오스 수치를 나타내었다. 실로스타졸 및 프로부콜을 각각 단독 투여한 군에서는, 각 데이터가 11 ± 2 mg/dl (n=10) 및 11 ± 3 mg/dl (n=10)로서, 뇨중 글루코오스가 유의적으로 저해되었지만, 2가지 작용제의 조합물을 투여한 군에서는, 8 ± 1 mg/dl (n=9)로서, 뇨중 글루코오스가 훨씬 유의적으로 저해되었다. 이들 결과는 첨부한 도 5에 나타내었다.

2) 인슐린 저항성에 대한 2가지 작용제의 조합의 효과:

대조군은 정상 래트에서의 데이터와 비교하여, 162 ± 16 mg/dl의 정상 혈장 글루코오스 수치 및 9.9 ± 5.0 ng/ml (n=10)의 보다 높은 혈장 인슐린 수치를 나타내었다. 실로스타졸이나 프로부콜은 혈장 글루코오스에 대해 어떠한 효과도 나타내지 못한 반면, 실로스타졸과 프로부콜의 조합물은 실로스타졸 또는 프로부콜 단독 투여와 비교하여 혈장 인슐린 수치에 대해 유의적인 저해 효과를 나타내었다. 결과는 첨부한 도 6에 나타내었다.

따라서, 실로스타졸과 프로부콜의 조합 약물은 인슐린 저항성에 대해 우수한 개선 효과를 나타내었다.

Claims (30)

1. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 뇌경색의 예방 및 치료제.
2. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 동맥경화증의 예방 및 치료제.
3. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 신장 질환의 예방 및 치료제.
4. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료제.
5. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 초과산화물 억제제를 포함하는 뇌경색의 예방 및 치료제.
6. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 초과산화물 억제제를 포함하는 동맥경화증의 예방 및 치료제.
7. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 초과산화물 억제제를 포함하는 신장 질환의 예방 및 치료제.
8. 6-[4-(1-시클로헥실-1H-테트라졸-5-일)부톡시]-3,4-디히드로카르보스티릴 또는 그의 염과 프로부콜의 조합물을 포함하는 초과산화물 억제제를 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료제.
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