KR101135179B1

KR101135179B1 - ＦａｂＩ 저해 물질 비나산손을 포함하는 항균용 조성물

Info

Publication number: KR101135179B1
Application number: KR1020090014523A
Authority: KR
Inventors: 김원곤; 정창길; 손미진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-02-20
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2012-04-16
Anticipated expiration: 2029-02-20
Also published as: KR20100095311A

Abstract

본 발명은 새로운 항생제 타겟인 FabI를 저해하여 항균활성을 갖는 화합물에 관한 것으로, 상세하게는 화학식 1 로 표기되는 항균용 조성물, 상기 화합물을 생산하는 페니실리움(Penicillium sp.) 균주, 및 (a) 페니실리움(Penicillium) 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 상기 본 발명의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.

비나산손, vinaxanthone, Fab I 저해제, MRSA, QRSA, 항균, 항생제 내성

Description

ＦａｂＩ 저해 물질 비나산손을 포함하는 항균용 조성물 {A ANTI-BACTERIAL COMPOSITION COMPRISING FabI-INHIBITORY VINAXANTHONE}

본 발명은 신규 항생제 타겟인 FabI를 저해하는 신개념 항균 화합물에 관한 것으로, 구체적으로는 화학식 1로 표기되는 항균용 조성물, 상기 화합물을 생산하는 페니실리움 (Penicillium sp.) 균주, 및 상기 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

병원성 미생물에 의한 직접 혹은 간접적인 피해는 경제, 환경, 의학적으로 많은 문제를 야기한다. 특히 식품산업에서의 식품 유통 과정 중의 부패로 인한 손실, 농산업에서의 농작물에 대한 과량의 화학 살충제의 사용으로 인한 인체의 유해성 및 환경오염, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성 균주의 출현 등으로 인하여 사회 전반에서 많은 문제들을 야기시키고 있다. 감염병의 치료에 있어 합리적인 항생제 요법은 환자의 예후를 결정하는 중요한 요인임에도 불구하고, 상기와 같은 항생제 내성 균주의 출현으로 인하여 과거와 달리 효과적인 항생제의 선택이 더욱 어려워지고 있다.

예를 들어, 인체 감염의 가장 흔한 원인균인 포도상구균의 마지막 치료제라고 하던 반코마이신(vancomycin)에 의해서만 치료가 되는 메치실린 내성 포도상구균(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)이 1970년대부터 문제시된 이후, 1988년에는 반코마이신에 내성을 보이는 장구균(vancomycin resistant Enterococcus, VRE)이 유럽에서 처음으로 발견되었고, 1990년 후반에는 일본, 미국, 프랑스, 한국에서 반코마이신에 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin intermediate-resistant S. aureus, VISA)이 발생하였다. 나아가 반코마이신(vancomycin)에 대하여 고도의 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA)이 2002년 미국 질병통제국(Centers for Disease Control)에서 세계 최초로 보고되면서, 소위 "슈퍼 박테리아"의 확산 가능성이 매우 높아지고 있다. 이에 따라, 항생제 내성 문제가 범세계적인 위기로 떠오르며 새로운 개념의 항생제 개발이 시급히 요구되고 있다.

한편, 1990년 중반부터 시작한 병원 미생물 유전체 연구 결과, 새로운 항생제 타겟이 발굴되어 신 개념의 항생제 개발 가능성이 열리기 시작하였다. 이와 같이 미생물 유전체 정보를 활용하여 발굴 및 검증된 새로운 항생제 타겟 중 에노일 리덕타제(enoyl-ACP reductase)는 지방산 합성 주기(cycle) 중 연장(elongation) 단계의 마지막을 담당하는, 미생물의 생장에 필수적인 효소로서, 그람 양성균 및 음성균에 모두 존재하며, 인간과 상동성(homolgy)이 매우 낮기 때문에 새로운 항생제 표적으로 주목받고 있다.

에노일 리덕타제는 펩 아이(Fab I), 펩 케이(Fab K), 펩 엘 (Fab L) 등 세가지의 아이소폼(isoform)이 존재하는데, 이중 펩 아이(Fab I)는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균 (E. coli) 등 대부분의 주요한 병원성 세균에 공통적으로 존재한다. 따라서 새로운 Fab I 저해 물질은 광범위한 항균 치료제로 개발될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 미생물, 식물 등 천연물로부터 Fab I 저해물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 국내 토양에서 분리한 곰팡이 페니실리움(Penicillium sp) F131 에서 분리된 비나산손 화합물이 Fab I를 강력하게 저해할 뿐만 아니라 항균 활성을 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 새로운 작용기전의 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 포함하는 Fab I 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 생산하는 페니실리움 (Penicillium sp.) F131 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 페니실리움 (Penicillium) 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 상기 본 발명의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서 본 발명은, 하기 화학식 1로 표기되는 화합물, 그의 이성질체, 유도체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1로 표기되는 화합물의 IUPAC명은 5,7-디아세틸-6-(5-카르복시-6,7-디하이드록시-4-옥소크로멘-3-일)-2,3-디하이드록시-9-옥소잔텐-1-카르복실 산(5,7-diacetyl-6-(5-carboxy-6,7-dihydroxy-4-oxochromen-3-yl)-2,3-dihydroxy-9-oxoxanthene-1-carboxylic acid)이고, 비나산손(vinaxanthone)으로 통칭되며, 분자량 576.418240 g/㎖, 분자식 C₂₈H₁₆O₁₄인 황색 분말 성상의 화합물이다. 상기 화합물, '비나산손(vinaxanthone)'은, 방향족 탄화수소 화합물의 일종인 바닐린 (vanillin)으로부터 합성될 수 있으며, 포스포리파아제 C 억제제(phospholipase C inhibitor)로 알려져 있으나, 상기 화합물의 항균 활성에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다.

바람직하게 본 발명의 화합물은 그의 이성질체, 유도체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명에서, '이성질체'란, 화학식은 같으나 동일하지는 않은 화합물의 관계를 의미하며, 이러한 이성질체의 종류에는 구조 이성질체, 기하 이성질체, 광학 이성질체 및 기하 이성질체가 있다. 입체이성질체란, 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간 중에서 원자 또는 기의 배열의 측면에서 상이한 화합물 의미하고, 광학 이성질체 (거울상이성질체)는 서로 겹치지 않는 거울상을 갖는 한 화합물의 두 입체이성질체를 의미하며, 부분입체이성질체는 둘 이상의 비대칭 중심을 가지고 그것의 분자들이 서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 의미한다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 상대적으로 무독성인 무기 및 유기 산 부가염을 의미한다.

본 발명에서, '항균'이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 항생물질 등이 세균의 발육을 저지하는 것을 말한다. 본 발명의 비나산손을 포함하는 항균용 조성물을 사용하는 경우, 세균의 성장 및 증식을 저지시킴으로써 개체 내에서 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

또한 본 발명의 화합물은 항생제 내성균에 대해서도 항균 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에서의 용어, '항생제 내성'이란, 임의의 질환 및 이의 합병증, 또는 임의의 박테리아성 장애 및 이의 합병증을 치료 또는 예방하기 위하여 약물을 지속적으로 사용한 결과, 해당 세균이 항생제에 대한 저항성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 항생제의 예로는, 세팔로스포린, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, 페니실린, 베타 락타마제 억제제, 카르베페넴, 모노박탐, 마크롤리드 및 린코사민, 글리코펩티드, 리팜핀, 옥사졸리디논, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 스트렙토그라민 및 술폰아미드 등이 있으며, 항생제 내성균은 상기 열거된 항생제를 처리하는 경우에도, 저항성을 나타내어 개체에서 지속적으로 질환이 유지된다.

바람직하게 본 발명의 조성물을 사용하는 경우, 일반적인 항균 활성 뿐만 아니라 항생제 내성균에 대해서도 우수한 항균 치료효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서의 용어 "치료"란, 약리학적 활성 물질에 의해 야기되는 동물, 특히 포유류, 및 더욱 특별히 인간에서의 국소적 또는 전신적인 효과를 가리키며, 질환의 진단, 치료, 완화, 처치 또는 예방 또는 동물 또는 인간의 원하는 육체적 또는 정신적 발달 및/또는 상태의 향상에 있어서 사용될 의도의 임의의 물질을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로부터, 본 발명의 화합물인 비나산손 (vinaxanthone)에 대한 시험관 내(in vitro)에서의 항균 실험을 한 결과, 본 발명의 비나산손 (vinaxanthone) 화합물은 황색포도상구균, MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 또는 QRSA(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus) 균주에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 5).

본 발명에서, '포도상구균'은 자연계에 널리 분포되어 있는 세균의 하나로서, 여러 종류가 존재하며, 식중독뿐만 아니라 피부의 화농, 중이염 및 방광염 등 화농성 질환을 일으키는 원인균이다. 우리나라의 경우, 살모넬라균 및 장염비브리오균 다음으로 식중독을 많이 일으키는 세균이며, 그 중에서도 황색포도상구균은 식중독을 일으키는 주요 세균으로 알려져 있다.

본 발명의, 'MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus)'란, 황색포도상구균의 일종으로 항생제(메티실린)에 대한 내성이 생긴 균을 말하며, 'QRSA(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus)'란, 퀴놀론에 내성을 보이는 균을 말한다.

본 발명의 화합물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 합성할 수 있으며, 바람직하게는 균주로부터 생산되는 천연 화합물을 수득할 수도 있다. 페니실리움 속(Penicllium sp.) 에서 얻을 수 있으나, 상기 균주들에 의해 본 발명의 화합물을 수득할 수 있는 균주의 종류가 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 페니실리움(Penicillium) F131로부터 생산할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 화합물은 기탁번호 KCTC 11462BP 균주로부터 수득할 수 있다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은, 화학식 1로 표기되는 화합물, 그의 이성질체, 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 Fab I 활성 억제용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 황색포도상구균 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 또는 QRSA(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus) 균에 존재하는 Fab I 효소 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서의 용어 'Fab I(enoyl-ACP[acyl-carrier protein] reductase)'란, 박테리아의 지방산 생합성의 각 주기에 포함된 네 개 반응의 마지막 단계에서 에노일-아실(enoyl-acyl) 담체 단백질 (ACP) 환원 효소로 기능하는 것으로 여겨지는 박테리아성 효소를 말한다. 상기 효소는 박테리아 및 식물에 널리 분포된 것으로, 박테리아 생체막을 구성하는 지질을 합성하는데 필요한 단백질 효소이다. Fab I 효소를 저해시키는 경우, 항생 및 항균효과를 낼 수 있어 내성균에 대한 치료용으로서 '표적 단백질'로 활용될 수 있으며, 상기 예로 비누, 세제 또는 치약에 항생 및 항균 효과를 내기위해 사용되는 '트리클로산'을 들 수 있다. 이러한 'Fab I'는 주요 항생제 내성균인 슈퍼박테리아 포도상구균(methicillin-resistant S. aureus, MRSA) 균주에 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 화합물이 Fab I에 대한 저해 활성이 있음을 확인하였다(실시예 4).

바람직한 일 양태로서 본 발명은, 본 발명의 화합물에 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테 아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투 여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 0.1 내지 50mg/kg으로 투여될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 내지 30 mg/kg으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 가장 바람직한 투여량은 약 30 mg/kg 이다. 상기 기술된 바와 같이 발명의 투여경로 또한 제한이 없으나, 바람직하게는 비경구로 투여될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피하 주사 방법으로 투여될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 바람직하게는 (a) 페니실리움(Penicillium sp) 균주를 배양하는 단계; (b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 본 발명의 화합물을 생산하기 위한 페니실리움 (Penicillium) 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양할 수 있다. 균주의 영양원으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 영양원을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용할 수 있다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산 암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라 식염, 칼륨, 마그네슘,코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20 내지 37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 바람직하게는 26 내지 30℃에서 배양할 수 있다. 또한, 배양기간 역시 당업계에서 사용되는 공지의 기간 동안 배양할 수 있으며, 필요에 따라 기간이 조정될 수 있다. 바람직하게 진탕배양, 정치배양의 경우 모두 4일 내지 7일간 배양할 수 있으며, 상기 배양 기간일 때 본 발명의 화합물의 수득량이 최고치에 이르는 것을 확인하였다.

바람직한 본 발명의 일 실시예로부터, 상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 균주를 배양하면 본 발명의 화합물을 수득할 수 있으며(실시예 1 및 2), 본 발명의 화합물은 배양액 내 뿐만 아니라 균체 내에도 존재할 수 있으므로, 효과적인 추출을 위하여 다음의 방법에 따라 효율적으로 분리, 정제할 수 있다.

화합물의 추출 및 정제 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 배지의 종류, 배양 조건, 추출 정제 방법 등을 변화시켜, 수득량 및 수득률을 조절할 수 있음은 자명하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아세톤 및 에틸아세테이트를 사용하여 추출을 수행하였는데, 구체적 인 방법은 다음과 같다.

배양액 및 균사체에 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터 유효성분을 추출한 후, 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로로 용매추출을 수행한 후, 상기 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 아세토나이트릴:물을 4:6, 5:5, 6:4, 7:3인 용매를 사용한 오디에스(ODS) 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 얻어진 활성분획을 메탄올을 용매로 재차 sephadex LH-20 크로마토그래피를 실시하였고, 최종적으로 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 수득하였다 (실시예 3). 본 발명자들은 이와 같은 방법을 사용하면 페니실리움 F131 균주로부터 비나산손을 효과적으로 추출 및 정제할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 Fab I 효소를 강력하게 저해함으로써, 항생제 내성균에 대하여 강한 항균능을 가지며, 특히 MRSA에 대하여 항균활성을 나타냄으로써, 슈퍼박테리아의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 1. Penicillium F131 균주의 분리

본 발명자들은 Fab I 저해활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 전국 토양으로부터 세균, 곰팡이, 방선균을 분리한 후 강력한 Fab I 저해 항균활성을 갖는 곰팡이 F131 균주를 분리하였다. 상기 비나산손(vinaxanthone)을 생산하는 F131 균주는 ITS 시퀀스(sequence)를 NCI 시퀀스 데이타베이스(sequence database)와 비교한 결과, 페니실리움(Penicillium sp.)으로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 균주를 2009년 02월 03일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 11462BP).

실시예 2. Penicillium sp. F131 균주의 배양

상기 F131 균주를 배양하기 위하여 종 배지로는 효모 추출액(yeast extract) 0.3%, 맥아 추출액(malt extract) 0.3%, 트립톤(tryptone) 0.5%, 글루코오스(glucose) 1%을 함유한 배지를 멸균 전에 pH를 5.5로 조절한 후 사용하였다. 상기의 종배지 20 ㎖이 담긴 100 ㎖ 용량의 삼각 플라스크를 121℃ 에서 20분간 멸균한 후 F131 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금을 접종하여 28℃에서 3 일간 진탕 배양한 후, 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 효모 추출액(yeast extract) 0.3%, 맥아 추출액(malt extract) 0.3%, 트립톤(tryptone) 0.5%, 글루코오스(glucose) 1%을 함유한 멸균된 배지가 들어 있는 500 ㎖ 용량의 삼각플라스크 (48 개)에 종배양액를 접종하여 28℃에서 7일간 진탕 배양하였다.

실시예 3. 본 발명의 화합물의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 배양한 배양액 및 균사체의 아세톤 추출액를 에틸아세테이트로 3번 용매 추출하였다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압 농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후, 아세토나이트릴:물을 4:6, 5:5, 6:4, 7:3인 용매를 사용한 오디에스(ODS) 크로마토그래피를 수행하였다. 이와 같이 얻어진 활성분획을 재차 메탄올을 용매로 Sephadex LH-20 크로마토 그라피를 실시하였고, 최종적으로 HPLC를 하여 순수한 본 발명의 물질을 얻을 수 있었다. 활성 분획은 0.01% TFA를 함유한 25% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 이동상으로 하는 HPLC (YMC ODS 150×20 mm, Flow rate : 7 ㎖/min, UV 300 nm)를 실시하여 비나산손 화합물을 얻었다.

이상과 같이 정제된 본 발명인 화합물의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다(화학식 1).

1)물질의 성상 : 황색 분말

2) 질량분석스펙트럼(ESI-MS): 577.5 (M+H)⁺

3) 분자식 : C₂₈H₁₆O₁₄

5)핵자기 공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : DMSO-d6 을 용매로하고 테트라메칠실란 (TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명스펙트럼 데이타는 다음과 같다.

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ): 12.75 (2H, brs, 11,9’-OH), 11.45 (2H, brs, 2,6’-OH), 9.44 (2H, brs, 3,7’-OH), 8.53 (1H, s, H-8), 8.17 (1H, s, H-2’), 6.96 (1H, s, H-8’), 6.94 (1H, s, H-4), 2.55 (3H, s, H-13), 2.53 (3H, s, H-15)

¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d ₆ ): 201.1 (C-12), 199.2 (C-14), 172.9 (C-4’), 172.6 (C-9), 167.4 (C-11), 167.3 (C-9’), 154.2 (C-3), 152.6 (C-2’), 152.8 (C-7’), 152.1 (C-10_a), 150.7 (C-8’_a), 150.3 (C-4a), 141.7 (C-6’), 141.1 (C-2), 136.3 (C-7), 133.4 (C-5), 132.6 (C-6), 126.3 (C-8), 120.9 (C-3’), 120.5 (C-8a), 119.8 (C-5’), 119.6 (C-1), 112.4 (C-4a), 110.0 (C-9a), 102.3 (C-4), 102.4 (C-8’), 32.1 (C-13), 29.1 (C-15).

실시예 4. 본 발명의 화합물의 Fab I 저해활성

본 발명에 따른 화합물의 Fab I 저해활성을 확인하기 위하여, 다음과 같이 효소 역가 측정 실험을 수행하였다. Fab I 역가 측정을 위해서 Ward 등의 방법 (참조: Biochemistry 38, 12514(1999))을 변형하여 이용하였다. 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) Fab I를 사용하였다. 역가 측정은 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5) 중에서 수행하였으며, 기질로는 트랜스-2-옥테노일 N-아세틸시스테아민 티오에스터(trans-2-octenoyl N-acetylcysteamine thioester) 400μM, NADPH 200μM을 사용하였고, Fab I를 150 nM 사용하였다. 효소를 첨가하고 상온에서 60분간 반응시킨 후, UV-분광계(spectrometer)를 이용하여 340nm에서 NADPH의 흡광도 감소를 측정하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.

실시예 5. 본 발명의 화합물의 시험관 내(in vitro) 항균 활성

시험주를 배양할 때에는 MHB (Mueller Hinton broth) 에서 배양을 하였으며 액체 배지 희석법(broth microdilution)으로 항균활성을 측정하였다. 하룻밤 배양한 시험균을 2 x 100,000/㎖ 이 되도록 희석한 후 96 웰 플레이트(well plate)에 웰(well) 당 100㎕ 씩 분주한 다음, 화합물을 최고 128 ㎍/㎖의 농도부터 점차 2- fold 희석하여 처리하였다. 화합물은 DMSO (dimethylsulxoside)에 희석하였고 DMSO의 농도는 1/100정도로 맞추어서 실험을 실시하였다. 20시간 배양 후 650 nm에서 OD 값을 측정하여 세균의 생육을 조사하였다. 세균의 생육을 완전히 저해한 화합물의 최소농도를 MIC로 결정하였다.

비나산손(vinaxanthone)의 항균활성

	균주	vinaxanthone	Oxacillin	Norfloxacin
1	S.aureus 503	32	0.25	1
2	S. aureus KCTC 1916(209)	32	0.25	0.25
3	S.aureus RN 4220	32	0.25	1
4	S.aureus MRSA CCARM 3167	32	500	8
5	S.aureus MRSA CCARM 3506	32	500	1
6	S.aureus QRSA CCARM 3505	32	0.5	250
7	S.aureus QRSA CCARM 3519	32	0.5	125
8	Bacillus subtilis KCTC 1021	32	0.25	0.25
9	Bacillus cereus KCTC 1661	4	0.125	0.25

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 비나산손(vinaxanthone) 화합물은 황색포도상구균에 대하여 항균활성을 나타내었고, MIC는 32 ㎍/㎖이었다. 특히, 슈퍼박테리아 MRSA 균주 및 퀴놀론 내성 포도상구균(QRSA) 균주 대하여 옥사실린(oxacillin) 이나 노플록사신(norfloxacin)은 항균 활성이 없는 반면, 비나산손은 동일한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 따른 비나산손(vinaxanthone) 화합물은 우수한 Fab I 저해활성을 냄으로써, MRSA에 대하여 항균활성을 나타냄으로써, 슈퍼박테리아 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 비나산손(vinaxanthone)의 화학식을 나타낸 도이다.

도 2는 비나산손(vinaxanthone)의 Fab I에 대한 저해활성을 나타낸 그래프이다.

Claims

하기 화학식 1로 표기되는 화합물, 그의 이성질체, 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항균용 조성물.

[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물은 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 및 QRSA(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균에 대해 항균 활성을 갖는 항균용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 항균용 조성물.
하기 화학식 1로 표기되는 화합물을 포함하는 Fab I (enoyl-ACP[acyl-carrier protein] reductase) 활성 억제용 조성물.

[화학식 1]
제4항에 있어서, 상기 Fab I는 MRSA(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 및 QRSA(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균의 Fab I 효소 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 Fab I 활성 억제용 조성물.
(a) 기탁번호 KCTC 11462 BP인 페니실리움(Penicillium sp.) F131 균주를 배양하는 단계;

(b) 상기 (a)단계로부터 수득한 배양액을 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계로부터 수득한 추출물에 크로마토그래피를 수행하여 하기 화학식 1로 표기되는 화합물을 수득하는 단계;

를 포함하는 제1항의 항균용 조성물을 제조하는 방법.

[화학식 1]
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