RU2228337C2

RU2228337C2 - Ванкорезмицин (варианты), его использование, штамм amycolatopsis вида hil-006734 для его получения

Info

Publication number: RU2228337C2
Application number: RU2001116104/13A
Authority: RU
Inventors: Нироги Венката Стайа РАМАКРИШНА (IN); Нироги Венката Стайа РАМАКРИШНА; Рави Гайанан БХАТ (IN); Рави Гайанан БХАТ; Йаммадичийил Санкаранарайанан СРИКУМАР (IN); Йаммадичийил Санкаранарайанан СРИКУМАР; Ерра Котесвара Стайа ВИЙАЯКУМАР (IN); Ерра Котесвара Стайа ВИЙАЯКУМАР; Шантилал Дайарам НАКЕР (IN); Шантилал Дайарам НАКЕР; Уттара Винайак ЭУК (IN); Уттара Винайак ЭУК; Райендра Пракаш ТАНПУР (IN); Райендра Пракаш ТАНПУР; Кордула ХОПМАНН (DE); Кордула ХОПМАНН; Михаэл КУРЦ (DE); Михаэл КУРЦ; Йоахим ВИНК (DE); Йоахим ВИНК
Original assignee: Авентис Фарма Дойчланд Гмбх
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2004-05-10
Also published as: IL142848A0; CA2351222A1; HK1041026A1; SI1129208T1; US20020183267A1; AU1378700A; ATE225854T1; DK1129208T3; KR100623405B1; WO2000028064A1; ZA200103191B; UA70974C2; HUP0104213A2; JP2002529477A; PL347658A1; DE69903465T2; CN1325453A; TR200101279T2; HUP0104213A3; US6387943B1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству антибиотиков. Данное изобретение относится к соединению, называемому ванкорезмицин, которое получают культивированием микроорганизма Amycolatopsis вида HIL-006734 (DSM 12216), и его фармацевтически приемлемым солям (брутто-формула и структурная формула приведены в тексте). Данное изобретение также относится к способу получения ванкорезмицина, к микроорганизму HIL-006734 (DSM 12216), к использованию ванкорезмицина и его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственных средств, в частности к их использованию в качестве антибиотиков, и к фармацевтическим композициям, содержащим ванкорезмицин или его фармацевтически приемлемую соль. Ванкорезмицин действует против резистентных к ванкомицину и тейкопланину штаммов Staphylococcus aureus, что повышает эффективность лечения инфекций, вызываемых MRSA (метициллинрезистентными стафилококками). 4 с.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.

Description

Изобретение относится к соединению, имеющему название ванкорезмицин, которое получают культивированием микроорганизма HIL-006734 (DSM 12216) и к его фармацевтически приемлемым солям и производным. Данное изобретение также относится к способу получения ванкорезмицина, к микроорганизму HIL-006734 (DSM 12216), к использованию ванкорезмицина и его фармацевтически приемлемых солей и производных в качестве лекарственных средств, в частности к их использованию в качестве антибиотиков, и к фармацевтическим композициям, содержащим ванкорезмицин или его фармацевтически приемлемые соли или производные.

Инфекции, вызываемые резистентными к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), известны как преобладающие в некоторых инфекционных состояниях, таких как раны и ожоги. Ванкомицин и тейкопланин, принадлежащие к классу гликопептидов, являются единственными двумя антибиотиками, клинически используемыми для лечения инфекций, вызываемых MRSA. Однако из-за недавно появившихся резистентных к ванкомицину и тейкопланину штаммов, эти инфекции считаются опасными и смертельными. Поэтому были предприняты интенсивные исследования для того, чтобы найти структурно отличный класс соединений, действующих против таких резистентных к ванкомицину и тейкопланину штаммов. Например, метилсульфомицин I, циклический тиопептид, описан в ранних источниках [публикация европейского патента № 0818539 с датой подачи 11 июля 1996] в качестве антибиотика, действующего против резистентных к ванкомицину и тейкопланину штаммов.

В настоящее время обнаружено, что новое соединение, называемое ванкорезмицином, имеет антибиотическое действие. Таким образом, данное изобретение относится к ванкорезмицину, соединению формулы

и к его фармацевтически приемлемым солям и производньм, таким как сложные эфиры, простые эфиры и очевидные химические эквиваленты, включая все стереоизомерные формы и все таутомерные формы.

Ванкорезмицин имеет молекулярную формулу C₇₁H₁₂₆N₂O₂₁ (MB 1343,80) и может быть охарактеризован с помощью одного или более физико-химических и спектральных свойств, представленных ниже, таких как данные ¹Н ЯМР спектроскопии и данные ¹³С ЯМР спектроскопии, оба спектра представлены в таблице 2.

Ванкорезмицин может быть описан как новый антибиотик, действующий против резистентных к ванкомицину и тейкопланину штаммов. Ванкорезмицин имеет не описанную до настоящего времени структуру, имеющую группу тетрамовой кислоты в положении 3 ацильного заместителя с высоко насыщенной кислородом длинной алкильной цепью, замещенной аминосахаром. Поиск, проведенный в химической литературе, показал, что ванкорезмицин является новым соединением. Никакие другие соединения не имеют структурных особенностей ванкорезмицина.

Ванкорезмицин получают культивированием микроорганизма, обозначенного как культура № HIL-006734 (далее обозначенная как HIL-006734). Этот микроорганизм, используемый для получения ванкорезмицина, выделен из образца почвы, собранного в Национальном парке, Боривли, Мумбай, Индия. Микроорганизм HIL-006734 принадлежит к отряду Actinomycetales, род Amycolatopsis, и помещен 4 июня 1998 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH), Braunschweig, Germany, и имеет входящий номер DSM № 12216.

Таким образом, данное изобретение далее относится к способу получения нового соединения под названием ванкорезмицин из amycolatopsis вида HIL-006734, его мутантов и вариантов, при аэробных условиях в питательной среде, содержащей один или более источников углерода и один или более источников азота и, необязательно, питательные неорганические соли и/или микроэлементы, с последующим выделением указанного соединения и очисткой обычными методами.

Мутанты и варианты микроорганизма ST101170 также могут быть способны синтезировать соединение в соответствии с данным изобретением. Такие мутанты могут быть получены известньми методами с помощью физических средств, например облучения, такого как облучение ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, или химических мутагенов, таких как этилметилансульфонат (ЭМС), 2-гидрокси-4-метокси-бензофенон (МОБ) или N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (МННГ).

Отбор подходящих мутантов и вариантов, которые могут образовывать соединение в соответствии с данным изобретением, может подтверждаться определением биологического действия соединений, аккумулированных в бульоне культуры, например, тестированием на антибактериальное действие.

Питательная среда предпочтительно содержит источники углерода, азота и питательные неорганические соли. Источниками углерода являются, например, крахмал, глюкоза, сахароза, декстрин, фруктоза, патоки, глицерин, лактоза или галактоза, предпочтительно крахмал. Источниками азота являются, например, соевая мука, ореховая мука, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, пептон, солодовый экстракт, жидкость, получаемая при вымачивании кукурузы, желатин или казамионовые кислоты, предпочтительно пептон и дрожжевой экстракт. Питательньми неорганическими солями являются, например, динатрийфосфат, дикалийфосфат, хлорид натрия, хлорид кальция, карбонат кальция, нитрат калия, сульфат аммония или сульфат магния, предпочтительно карбонат кальция, хлорид натрия и сульфат магния.

Культивацию HIL-006734 можно проводить при температуре от 25 до 35°С и рН от 6,0 до 8,0. Предпочтительно HIL-006734 культивируют при температуре 30°С (±1°С) и рН 7,0.

Культивацию HIL-006734 предпочтительно проводят в течение 60-96 часов, в этом случае получают оптимальный выход антибиотика в соответствии с данным изобретением. Особенно предпочтительно проводить культивацию ферментацией в течение 68-96 часов в условиях погружения, например во встряхиваемых колбах, а также в лабораторных ферментерах. Развитие ферментации и образование ванкорезмицина может быть определено с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) и определением биологической активности бульона культуры против видов Staphylicocci и Enterococci известным методом микробной диффузии на чашках с агаром. Предпочтительной культурой является Staphylococcus aureus 3066, который представляет собой штамм, резистентный к метициллину, β-лактамовому антибиотику, известному в литературе, и Enterococcus faecium (E. faecium VR-1), который резистентен к ванкомицину. Ванкорезмицин присутствует в фильтрате культуры и в мицелии и может быть выделен известными методами выделения. Таким образом, он может быть выделен из фильтрата культуры экстрагированием не смешиваемым с водой растворителем, таким как этилацетат, дихлорметан, хлороформ или бутанол при рН 5-8, или с помощью гидрофобной хроматографии с использованием полимерных смол, таких как “Diaion HP-20®” (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), “Amberlite XAD®” (Rohm and Haas Industries U.S.A.), активированного угля, или ионообменной хроматографии при рН 5-8. Предпочтительным методом является экстрагирование этилацетатом. Активный материал также может быть выделен из мицелия экстрагированием смешиваемьм с водой растворителем, таким как метанол, ацетон, ацетонитрил, н-пропанол или изопропанол, или не смешиваемьм с водой растворителем, таким как этилацетат, дихлорметан, хлороформ или бутанол при рН 5-8, и предпочтительным методом является экстрагирование этилацетатом. Концентрация и лиофилизация экстрактов дает активный неочищенный материал.

Антибиотик ванкорезмицин в соответствии с данным изобретением, например, может быть выделен из неочищенного материала следующим образом.

Фракционированием с использованием любой из следующих методик: хроматография с нормальной фазой (с использованием окиси алюминия или двуокиси кремния в качестве неподвижной фазы и элюентов, таких как петролейный эфир, этилацетат, метиленхлорид, ацетон, хлороформ, метанол или их комбинации, с добавлением аминов, таких как NEt₃), хроматография с обращенной фазой (с использованием подобных силикагелю диметилоктадецилсилилсиликагеля, также называемого RP-18, или диметилоктилсилилсиликагеля, также называемого RP-8 с обратимой фазой в качестве неподвижной фазы, и элюентов, таких как вода, буферы, а именно фосфат, ацетат, цитрат (рН 2-8) и органические растворители, такие как метанол, ацетонитрил, ацетон, тетрагидрофуран или комбинации этих растворителей), гельпроникающая хроматография с использованием смол, таких как ®Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel ®Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) в растворителях, таких как метанол, хлороформ, ацетон, этилацетат или их комбинации, или ®Sephadex G1-0 и G-25 в воде; или противоточной хроматографии с использованием двухфазной системы элюентов, составленной из двух или более растворителей, таких как вода, метанол, этанол, изопропанол, н-пропанол, тетрагидрофуран, ацетон, ацетонитрил, метиленхлорид, хлороформ, этилацетат, петролейный эфир, бензол и толуол. Эти методики могут быть использованы неоднократно или может быть использовано сочетание различных методик. Предпочтительной методикой является хроматография на силикагеле с обращенной фазой (RP-18).

Соединение ванкорезмицин может быть превращено в фармацевтически приемлемые соли и производные, такие как сложные эфиры и простые эфиры, и другие очевидные химические эквиваленты, которые все включены в объем данного изобретения. Соли и производные могут быть получены стандартными методами, известными специалистам в данной области. Соли, такие как соли натрия и калия, например, могут быть получены обработкой ванкорезмицина подходящими натриевыми или калиевыми основаниями.

Сложные эфиры и простые эфиры могут быть получены по методам, представленным в литературе, например в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. March, John Wiley&Sons., 1992.

Аминогруппа сахарной части может быть алкилирована или ацетилирована, например, хлорангидридами по стандартным методикам, известным специалистам в данной области техники.

Химические эквиваленты могут представлять собой стабильные комплексы с ионами металлов, например металлов переходной группы, таких как La³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, которые являются типичньми для производных тетраминовой кислоты и могут быть получены по методам, описанным в литературе (К. Tanaka et al., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901. К. Matsuo, Chem, Pharm, Bull. 1980, 28, 2494).

Двойные связи алкильной боковой цепи могут быть восстановлены по методикам, представленным в литературе, например в P.N. Rylander, “Hydrogenation Methods”, Academic Press, New York (1985), глава 2, или могут быть гидрогалогенированы по методикам, описанньм И.О. House в “Modern Synthetic Reactions”, W.A. Benjymin, Inc., New York (1972), стр. 446-452. Гидроксилированные производные могут быть получены реакцией двойных связей с такими реагентами, как OsO₄, как описано в литературе, например, в Chem. Rev. 1980, 80,187.

Производные также могут быть образованы превращением двойных связей в эпоксиды посредством окисления, например, МСРВА, такими как описаны в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. March, John Wiley&Sons., 1992.

Ванкорезмицин обладает антибактериальным действием. Минимальные ингибирующие концентрации ванкорезмицина против широкого спектра бактерий представлены в таблице 3. Ванкорезмицин и его фармацевтически приемлемые соли и производные могут вводиться животным, предпочтительно млекопитающим и, в частности, человеку, в виде лекарственных средств из них в чистом виде, в смесях друг с другом и в виде фармацевтических композиций, которые позволяют парентеральное введение. Следовательно, данное изобретение также относится к ванкорезмицину и его фармацевтически приемлемьм солям и производным для использования в качестве лекарственного средства и к использованию ванкорезмицина и его фармацевтически приемлемых солей и производных для получения лекарственных средств, обладающих антибактериальным действием. Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат эффективное количество ванкорезмицина и/или одну или более из его фармацевтически приемлемых солей и/или производных, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Ванкорезмицин может вводиться перорально, внутримышечно, внутривенно или в соответствии с другими способами введения. Фармацевтические композиции, которые содержат ванкорезмицин или его фармацевтически приемлемую соль или производное вместе с другими фармацевтически активными веществами, могут быть получены смешиванием активных соединений с одним или более фармакологически переносимыми вспомогательньми агентами и/или наполнителями, такими как, например, наполнители, эмульгаторы, смазывающие агенты, вкусовые добавки, красители или буферные вещества, и превращением смеси в подходящую фармацевтическую препаративную форму, такую как, например, таблетки, таблетки с оболочкой, капсулы, гранулы, порошки, эмульсии, суспензии или растворы, подходящие для парентерального введения.

Примеры вспомогательных агентов и/или наполнителей, которые могут быть упомянуты, включают трагант, лактозу, тальк, агар-агар, полигликоли, этанол и воду. Подходящими и предпочтительными для парентерального введения являются суспензии и растворы в воде. Также возможно вводить активные вещества как таковые, без носителей или разбавителей, в подходящей форме, например в капсулах.

Как это принято, галеновы препаративные формы и способ введения, а также дозировка, которые подходят для каждого конкретного случая, зависят от видов, подвергаемых лечению, и формы соответствующего заболевания или состояния, и могут быть оптимизированы по методам, известным в данной области техники. В среднем, суточная доза активного соединения для пациента весом приблизительно 75 кг составляет с, по крайней мере, 0,001 мг до, по крайней мере, 10 мг, предпочтительно вплоть до 1,0 мг.

Далее представлены иллюстративные примеры в соответствии с данным изобретением, которые не ограничивают его объем.

Пример 1

Выделение культуры № HIL-006734 из почвы

а) композиция питательной изоляционной среды, г:

Кукурузный крахмал 10,0

Казеин 1,0

Пептон 1,0

Мясной экстракт 1,0

К₂НРO₄ 0,5

Порошкообразный агар 13,0

Деминерализованная вода, л 1,0

рН 7,5

b) Культивирование почвы и выделение

10 г почвы, собранной из Национального парка, Боривли, Бомбей, Индия, добавляют к 90 мл стерилизованной воды в 250 мл колбе Эрленмейера, которую встряхивают в течение 2 часов на ротационном шейкере (220 об/мин). Полученную суспензию почвы последовательно разбавляют 10 раз вплоть до 10^-5. После последнего разбавления 1 мл суспензии помещают в центр стерильной стеклянной чашки Петри (диаметр 15 см), в которую вливают приблизительно 50 мл описанной выше изоляционной среды, к которой добавлено 25 мкг/мл амфотерицина В в качестве противогрибкового агента, и охлажденной до температуры 45°С, и чашку как следует вращают. Смеси суспензии почвы и среды дают осесть и инкубируют при температуре 28°С (±1°С) в течение 7 дней. Чашку Петри периодически наблюдают и HIL-006734 (культуру № Y-9439786) выделяют из растущих микроорганизмов.

Пример 2

Хранение культуры № HIL-006734

Композиция поддерживающей среды

HIL-006734 хранят в следующей среде, г:

Солодовый экстракт 10,0

Глюкоза 4,0

Дрожжевой экстракт 4,0

Актидиол 0,05

Порошковый агар 13,0

Деминерализованная вода, л 1

рН 7,0-7,5

После тщательного растворения ингредиентов при нагревании полученный раствор распределяют в пробирки и стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 минут. Пробирки охлаждают и позволяют застывать в положении скашивания. Скошенные агары засевают штрихом культивированной HIL-006734 посредством проволочной петли и инкубируют при температуре 28°С (±1°С) до тех пор, пока не будет виден хороший рост. Выросшие в лунках культуры хранят в холодильнике при температуре +8°С.

Получение глицеринового рабочего посева

Композиция среды, г:

Дрожжевой экстракт 4,0

Растворимый крахмал 15,0

К₂НРO₄ 1,0

MgSO₄·7H₂O 0,5

Деминерализованная вода, л 1

рН 7,0

Описанную выше среду распределяют в количествах 100 мл в 300 мл колбы Эрленмейера и автоклавируют при температуре 121°С в течение 20 минут. Колбы охлаждают до комнатной температуры и засевают описанным выше скошенным агаром. Инкубирование проводят в течение пяти дней на ротационном шейкере со скоростью 180 об/мин и при температуре 28°С. 1,5 мл полученной культуры смешивают с 1,5 мл глицерина (99%) и хранят при температуре -20°С.

Пример 3

Ферментация культуры № HIL-006734 во встряхиваемых колбах

Композиция посевной среды, г:

Глюкоза 15,0

Соевая мука 15,0

Жидкость от вымачивания кукурузы 5,0

СаСО₃ 2,0

NaCl 5,0

Деминерализованная вода, л 1

рН 6,8-7,0

Среда может быть использована с или без жидкости, получаемой при вымачивании кукурузы.

Описанную выше среду распределяют в количествах 100 мл в 500 мл колбы Эрленмейера и автоклавируют в течение 20 мин. Колбы охлаждают до комнатной температуры и каждую колбу засевают полной петлей описанной выше выращенной культуры в лунках из примера 2 и встряхивают на ротационном шейкере в течение 72 часов со скоростью 240 об/мин при температуре 27°С (±1°С) с получением посевной культуры.

Композиция рабочей среды, г

Глюкоза 20,0

Соевая мука 10,0

СаСО₃ 0,2

СоСl₂·6Н₂О 0,001

Деминерализованная вода, л 1

рН 6,8

или

Крахмал 10,0

Глюкоза 10,0

Глицерин 99% 10,0

Жидкость от вымачивания кукурузы 2,5

Пептон 5,0

Дрожжевой экстракт 2,0

NaCl 1,0

СаСО₃ 3,0

Деминерализованная вода, л 1

рН 7,2 (до стерилизации)

Рабочую среду распределяют в количествах 100 мл в 500 мл колбы Эрленмейера и автоклавируют при температуре 121°С в течение 20 мин. Колбы охлаждают до комнатной температуры и засевают описанной выше посевной культурой (2% об/об). Ферментацию проводят на ротационном шейкере со скоростью 240 об/мин и при температуре 27°С (±1°С) в течение 48 часов. Получение антибиотика определяют тестированием биологической активности против S. aureus 3066 и Ent. faecium VR-1 с использованием метода диффузии в лунках по известной методике.

Пример 4

Культивирование культуры № HIL-006734 в ферментерах

Получение посевной культуры во встряхиваемых колбах.

Посевную среду из примера 3 распределяют в количествах 150 мл в 1000 мл колбы Эрленмейера и автоклавируют при температуре 121°С в течение 20 мин. Посевную культуру выращивают в данных колбах, как описано в примере 3.

Ферментация в промышленном масштабе

Композиция рабочей среды, г:

Глюкоза 20,0

Соевая мука 10,0

СаСО₃ 0,2

CoCl₂·6H₂O 0,001

Деминерализованная вода, л 1

рН 7,0

или

Крахмал 10,0

Глюкоза 10,0

Глицерин 99% 10,0

Жидкость от вымачивания кукурузы 2,5

Пептон 5,0

Дрожжевой экстракт 2,0

NaCl 1,0

СаСО₃ 3,0

Деминерализованная вода, л 1

рН 7,2 (до стерилизации)

20 литров рабочей среды в 22-литровом ферментере (в двух ферментерах) и 9 литров рабочей среды в 12-литровом ферментере (в двух ферментерах) вместе с 1 мл (/10-литровый ферментер) ®Desmophen в качестве противовспенивателя стерилизуют in situ в течение 40 мин при температуре 121°С, охлаждают до температуры 27°С (±1°С) и засевают 1,5 литрами (/22-литровый ферментер) или 0,75 литра (/12-литровый ферментер) посевной культурой, описанной выше.

Ферментацию проводят при следующих параметрах:

Температура 27°С (±1°С)

Перемешивание 200 об/мин

Аэрация 15 л/мин / 22 л ферментер

10 л/мин /12 л ферментер

Время сбора 64 часа

Получение антибиотика определяют тестированием биологической активности против S. aureus 3066 и Ent. faecium VR-1 и ВЭЖХ анализа. Конечный рН бульона с культурой 7,0-7,5. Бульон с культурой собирают и центрифугируют, и антибиотик выделяют и очищают из фильтрата культуры и мицелия по методике примеров 5 или 6.

Пример 5

Выделение и очистка ванкорезмицина

Бульон с культурой (60 литров) собирают и центрифугируют для отделения мицелия (2,5 кг) и фильтрата культуры (50 литров, рН 7,3). Мицелий экстрагируют метанолом (2×20 литров) и активные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении с получением 70 г неочищенного материала. Фильтрат культуры (50 литров, рН 7,3) доводят до рН 5,5 добавлением 2 н. соляной кислоты и пропускают через колонку ®Diaion HP-20 (2,5 литра). Колонку промывают водой (10 литров) с последующим промыванием 15 литрами метанола:воды (1:1). Обнаружено, что активное соединение присутствует в 15 литрах метанола:воды (3:1) и 30 литрах метаноловых элюатов. Проверка степени очистки проводится в виде биологического тестирования против S. aureus 3066 и Ent. faecium VR-1. Активные элюаты объединяют и концентрируют с получением 15 г неочищенного материала. Объединенный неочищенный материал неоднократно хроматографируют на колонке ®Sephadex LH-20 (2,5 см × 90 см) в метаноле и активные фракции объединяют и концентрируют. Полученный концентрат хроматографируют на колонке ®Toyopearl TSK HW. 40F (6 см × 35 см) в метаноле. Активные фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении с получением 3 г полуочищенного материала. Конечную очистку проводят с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием следующих условий.

Полуочищенный материал подвергают конечной очистке с помощью препаративной ВЭЖХ на 25 мм × 250 мм Hibar-Lichrospher RP-18 (10 мкм с использованием 67,5:32,5 метанол: фосфатный буфер (0,01 М, рН 6,5) в качестве элюента со скоростью потока 23 мл/мин и определением при 220 нм).

Активные элюаты объединяют и концентрируют при пониженном давлении для удаления растворителя и затем обессоливают на колонке ®Diaion HP-20 (50 мл), элюированной ацетонитрилом: водой (80:20), и концентрируют при пониженном давлении, и лиофилизируют с получением 70 мг очищенного соединения.

Пример 6

Выделение и очистка ванкорезмицина

Бульон с культурой (200 литров) собирают и центрифугируют для отделения мицелия и фильтрата культуры. Мицелий полностью экстрагируют метанолом (30-40 л) и экстракт концентрируют 1:10 с получением бесцветного осадка, который фильтруют с получением 30-50 г неочищенного материала. Полученный материал очищают ВЭЖХ:

1) Колонка: Fractogel TSK-HW 40 (4 л, 500 × 100 мм)

Элюент: метанол

Поток: 20 мл/мин

Определение: 204 и 236 нм

Активные фракции элюируют через 125 мин. Объединенные фракции концентрируют при пониженном давлении и сушат вымораживанием.

2) Колонка: Silica Gel 60 (Merck); Erimatech (300 × 20 мм, 100 мл)

Элюент: А) дихлорметан: метанол 9:1

B) дихлорметан: метанол 3:1 + 1% триэтиламин

C) метанол (таблица А)

Фракции, содержащие ванкорезмицин, элюируют через 32 мин. Объединенные фракции концентрируют при пониженном давлении и сушат вымораживанием. Выход двух очищающих колонок составляет 50%.

Физико-химические и спектральные свойства ванкорезмицина даны в таблицах 1 и 2 и минимальные ингибирующие концентрации (МИК) против различных бактерий перечислены в таблице 3.

Фиг.1 и 2 относятся к таблице 1. На фиг.1 показано определение ванкорезмицина с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, и на фиг.2 показан спектр абсорбции ультрафиолета ванкорезмицином в метаноле

Claims

1. Ванкорезмицин формулы

его фармацевтически приемлемые соли и производные во всех стереоизомерных и таутомерных формах.

2. Ванкорезмицин, имеющий молекулярную формулу С₇₁Н₁₂₆N₂О₂₁, полученный культивированием микроорганизма Amycolatopsis вида HIL-006734, DSM 12216 или его мутанта в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением и очисткой целевого продукта, и его фармацевтически приемлемые соли и производные во всех стереоизомерных и таутомерных формах.

3. Штамм Amycolatopsis вида HIL-006734, DSM 12216 - продуцент ванкорезмицина.

4. Фармацевтическая композиция, обладающая антибиотической активностью, содержащая эффективное количество ванкорезмицина, или его фармацевтически приемлемой соли, или производного по п.1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.