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KR100503701B1 - 아데노바이러스 벡터를 생산하고 정제하는 개선된 방법 - Google Patents

아데노바이러스 벡터를 생산하고 정제하는 개선된 방법 Download PDF

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KR100503701B1
KR100503701B1 KR10-1999-7004446A KR19997004446A KR100503701B1 KR 100503701 B1 KR100503701 B1 KR 100503701B1 KR 19997004446 A KR19997004446 A KR 19997004446A KR 100503701 B1 KR100503701 B1 KR 100503701B1
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Abstract

본 발명은 세포 배양 시스템에서 생장시켰을 때 바이러스 벡터 생산율을 개선시킬 필요에 따라 실시된 것이다. 특히, 아데노바이러스의 경우에 부착 세포 배양 시스템에서 배지 관주 속도를 낮게 하였을 때 생산율이 증가되었다는 것을 설명하고 있다. 다른 구체예에서, 발명자들은 무혈청 조건, 특히 무혈청 현탁 배양에서 생장된 세포로부터 Ad-p53 생산이 개선되었다는 것을 설명하고 있다. 본 발명은 이와 같은 특징을 복합하여, 한가지 크로마토그래피에 의해 바이러스를 정제함으로써 한외원심분리를 이용하여 이중 CsCl 밴드에서 준비한 것과 동일한 수준의 정제된 바이러스를 얻게 된다.

Description

아데노바이러스 벡터를 생산하고 정제하는 개선된 방법{An improved method for the production and purification of adenoviral vectors}
본 출원은 1997년 11월 20일자 출원된 미국 특허 출원 60/031,329의 연속출원이다. 상기 전문을 참고문헌으로 첨부한다.
본 발명은 세포 배양 및 바이러스 생산 분야에 관계한다. 좀 더 구체적으로는 포유류 세포를 배양하고, 이들 세포에 아데노바이러스를 감염시키고, 이들 세포 배양물로부터 감염성 아데노바이러스를 생산하는 개선된 방법에 관계한다.
치료에 이용되는 단백질을 발현시키는 아데노바이러스 벡터는 폐, 머리, 목에 발생된 암을 포함하는 다양한 암을 치료하는데 임상학적으로 평가받고 있다. 임상적으로 시험이 진행되고 있기 때문에, 임상학적으로 사용할 수 있는 아데노바이러스 벡터에 대한 요구가 급증하고 있다. 300명 환자의 임상실험에 예상되는 연간 필요량은 약 6 ×1014 PFU정도가 될 것이다.
통상적으로, 시판되는 조직 배양 플라스크 또는 "세포공장(cellfactories)"에서 아데노바이러스를 만든다. 바이러스 감염된 세포를 수득하여, 냉동-해동시켜, 정제 안된 세포 용해물질형태로 세포로부터 바이러스를 방출시킨다. 생산된 정제 안된 세포 용해물(CCL)은 이중 CsCl 경사 한외원심분리를 이용하여 정제시킨다. 100 단일 트레이 세포공장(cellfactories)에서 수득되는 바이러스는 대략 6 ×1012 PFU정도가 된다. 분명한 것은, 이와 같은 통상적인 공정을 이용하면 필요한 양의 바이러스를 만들 수 없다는 것이다. 바이러스 요구 량에 충족시키기 위해서는 생산 규모를 늘리고, 효과적인 새로운 생산 및 정제 공정을 개발해야 한다.
CsCl 경사 한외원심분리를 통한 정제는 지극히 제한적이어서, 유전자 치료방법에 필요한 아데노바이러스 벡터 요구 량에 맞출 수 없다. 따라서, 아데노바이러스 벡터를 대규모로 생산하기 위해서는 CsCl 경사 한외원심분리 방법이외의 다른 정제 방법을 개발해야 한다. 재조합 단백질을 생산하는데 크로마토그래피를 광범위하게 이용하고는 있지만, 바이러스를 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것은 지극히 제한적이다. 레트로바이러스, 진드기에서 나오는 뇌염 바이러스, 식물 바이러스를 정제하는데 크기 압출, 이온 교환, 친화력 크로마토그래피를 이용한다는 문헌은 있으나, 그 성공 여부는 각기 다르다(Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath et al., 1978, Smith and Lee, 1978; O'Neil and Balkovic, 1993). 또한 아데노바이러스를 크로마토그래피를 이용하여 정제에 대한 연구는 극히 적다. 이와 같이 연구 활동이 적은 이유는 아데노바이러스의 경우 효과적인 규모의 CsCl 경사 한외원심분리 정제가 되지 않기 때문이다.
최근에, Huyghe et al.,(1996)은 금속 킬레이트 친화력 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 복합하여 아데노바이러스 벡터를 정제하였다고 보고하고 있다. CsCl 경사 한외원심분리를 통하여 수득한 것과 비슷한 수준의 바이러스 순도를 얻었다고 보고하고 있다. 불행하게도, 이중 컬럼 정제 과정을 거친 후에는 단지 23% 정도 바이러스만을 회수하였다. 이와 같이 바이러스 회수 비율이 낮은 원인은 세포와 이중 컬럼 정제 과정으로부터 바이러스를 방출시키기 위해 세포를 용해시키는데 냉동/해동 단계를 이용하였기 때문이다.
분명한 것은 이와 같은 생성물에 대한 수요 증가에 맞추어 충족시킬 수 있을 정도의 높은 생산성을 제공할 수 있는 아데노바이러스 벡터를 생산하는 효과적이고, 대량 생산 방법이 필요하다는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 아데노바이러스를 생산하고 정제하는 새로운 공정을 제공하는 것이다. 이와 같은 새로운 생산 공정은 CsCl 경사 한외원심분리를 이용하였을 경우와 비교할 수 있을 정도의 바이러스 순도를 제공할 뿐만 아니라 생산 규모 및 유효성도 제공한다.
따라서, 본 발명은 아데노바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 낮은 관주 속도에서 숙주 세포를 생장시키고, 숙주 세포에 아데노바이러스를 감염시키고, 숙주 세포를 수득하여, 용혈 시켜 정제 안된 세포 용해물질을 얻고, 정제 안된 세포 용해물질을 농축시키고, 용해물질 완충액을 교환하고, 용해물질에 있는 불순물 핵산 농도를 줄이는 단계로 구성된다.
특정 구체예에서, 이 방법에는 크로마토그래피를 이용하여 용해물질로부터 아데노바이러스 입자를 분리하는 단계가 추가로 포함된다. 특정 구체예에서, 분리하는 과정은 기본적으로 일단계 크로마토그래피로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 이용한다. 특정 적절한 구체예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 pH 7.0 내지 10.0 범위를 이용하여 실행한다. 좀더 적절한 구체예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 특정 구체예에서 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE, TMAE, QAE, PEI를 이용한다. 다른 적절한 구체예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 Toyopearl Super Q 650M, MonoQ, Source Q, Fractogel TMAE를 이용한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 배지의 포도당 농도는 0.7 내지 1.7g/ℓ로 유지된다. 특정 다른 구체예에서, 완충액을 교환하는 단계에는 다이아필터레이션(diafiltration)을 이용하였다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스는 외생 유전자 구조물을 인코드하는 아데노바이러스 벡터로 구성된다. 특정 구체예에서, 유전자 구조물은 프로모터에 연결되어 있다. 구체예에서, 프로모터는 SV40 IE, RSV LTR, β-악틴, CMV IE, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 폴리오마 F9-1, 티로시나제 등이 된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 아데노바이러스는 복제-무반응성(incompetent) 아데노바이러스이다. 또 다른 구체예에서, 아데노바이러스는 E1-부분의 적어도 일부분이 부족하다. 또 다른 측면에서, 아데노바이러스는 E1A 또는 E1B 부분중 일부가 부족하다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 293세포이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 외생 유전자 구조물은 치료요법적으로 효과가 있는 유전자를 인코드한다. 예를 들면, 치료요법적 유전자는 안티센스ras, 안티센스 myc, 안티센스 raf, 안티센스 erb, 안티센스 src, 안티센스 fms, 안티센스 jun, 안티센스 trk, 안티센스 ret, 안티센스 gsp, 안티센스 hst, 안티센스 bcl, 안티센스 abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF G-CSF, 티미딘 또는 p53을 인코드한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포는 저정성 용액, 고장성 용액, 냉동-해동, 초음파분쇄, 충돌성 제트, 마이크로유동화 반응 또는 계면활성제를 이용하여, 수득하고, ex situ에서 용해시킨다. 또 다른 측면에서, 세포는 저장성 용액, 고장성 용액 또는 계면활성제를 이용하여, in situ에서 수득하여 용해시킨다. 여기에서 사용된 바와 같은 "in situ" 의미는 CcllCubeTM와 같은 조직 배양 장치내 위치한 세포를 말하고, "ex situ" 의미는 조직 배양 장치에서 빼낸 세포를 말한다.
특정 구체예에서, 계면활성제를 이용하여 세포를 용해시키고, 수득하였다. 적절한 구체예에서, 계면활성제는 ThesitR, NP-40R, Tween-20R, Brij-58 R, Triton XR-100 또는 옥틸 글루코시드가 된다. 본 발명의 또 다른 특징에서, 감염된 세포의 자가분해를 통하여 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 특징에서, 세포 용해물은 BenzonaseR, PulmozymeR로 처리한다.
특정 구체예에서, 막 여과를 이용한 농축 단계가 추가로 포함된다. 특정 구체예에서, 여과는 접선 방향으로 이동하는 여과를 이용한다. 적절한 구체예에서, 여과는 100 내지 300K NMWC, 재생 셀룰로오즈 또는 폴리에테르 설폰 막을 이용한다.
본 발명은 낮은 관주 속도에서 배지에 숙주 세포를 배양하고, 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시키고, 숙주세포를 수득하고 용해시켜 정제 안된 세포 용해질을 만들고, 이를 농축시키고, 용해물질의 완충액을 교환시키고, 용해물질에 있는 불순물 핵산 농도를 줄이는 것으로 구성된 공정에 따라 만들어진 아데노바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 특징은 아데노바이러스를 정제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 숙주 세포를 생장시키고, 숙주 세포를 수득하여, 계면활성제를 세포에 접촉시켜, 세포 용해물질을 얻고, 용해물질을 농축시켜, 용해물질의 완충액을 교환시키고, 세포 용해물질내에 있는 불순물 핵산 농도를 줄이는 것으로 구성된다.
특정 구체예에서, 계면활성제는 ThesitR, NP-40R, Tween-20R, Brij-58R, Triton X-100R 또는 옥틸 글루코시드가 될 수 있다. 좀더 적절하게는 계면활성제는 약 1%(w/v) 농도에서 용해 용액에 존재한다.
본 발명의 또 다른 특징에서, 본 발명은 숙주 세포를 생장시키고, 숙주 세포에 아데노바이러스를 감염시키고, 계면활성제를 접촉시켜 세포를 수득하고, 용해시켜 세포 용해물질을 얻고, 이를 농축시키고, 세포 용해물질의 완충액을 교환하여, 세포 용해물질에 있는 불순물 핵산의 농도를 감소시키는 단계로 구성된 공정에 의해 생산된 아데노바이러스를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 아데노바이러스를 정제하는 방법을 제공하는데, 이는 무혈청배지에 숙주 세포를 생장시키고, 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시키고, 숙주 세포를 수득하고 용해시켜, 세포 용해물질을 얻고, 이를 농축시키고, 세포 용해물질의 완충액을 교환시켜, 세포 용해물질에 존재하는 불순물 핵산의 농도를 감소시키는 단계로 구성된다. 적절한 구체예에서, 세포는 세포 현탁 배양 또는 고정-의존성 배양 등으로 생장시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 무혈청배지에 생장하기에 적합한 것이다. 좀더 적절한 구체예에서, 무혈청 배지에서 생장할 수 있도록 적응시키는 방법은 생장 배지에 태아 소 혈청 함량을 연속적으로 감속시키는 것이다. 좀더 구체적으로는 무혈청 배지는 태아 소혈청 함량이 0.03% v/v 미만으로 구성된다.
또 다른 구체예에서, 크로마토그래피를 이용하여 세포 용해물질로부터 아데노바이러스 입자를 분리하는 방법을 추가로 제공한다. 적절한 구체예에서, 분리하는 방법은 일단계 크로마토그래피로 구성된다. 좀더 구체적으로는 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피가 된다.
본 발명은 또한 무혈청배지에 숙주 세포를 생장시키고, 아데노바이러스를 숙주세포에 감염시키고, 숙주 세포를 수득하고 용해시켜, 세포 용해물질을 얻고, 이를 농축시키고, 세포 용해물질의 완충액을 교환시켜, 세포 용해물질에 존재하는 불순물 핵산의 농도를 감소시키는 공정에 따라 생산된 아데노바이러스에 관한 것이다.
본 발명은 또한 무혈청 배지에서 생장하는데 적합한 293 숙주 세포를 제공한다. 특정 측면에서, 무혈청 배지에서 생장하기에 적합하도록 하는 방법은 생장 배지에 태아 소 혈청 함량을 연속적으로 감속시키는 것이다. 특정 구체예에서, 세포는 현탁 배양에서 생장하는데 적합하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 세포는 IT293SF 세포로 지칭한다. 이들 세포는 특허를 목적으로 미생물을 국제 기탁기관에 기탁하도록 한 부다페스트 협정에 따라 American Tissue Culture Collection(ATCC)에 기탁되었다. 이들 세포는 1997년 Introgen Therapeutics, Inc(Houston, Tx)사를 대표하여, Dr. Shuyuan Zhang가 기탁하였다. IT293SF 세포주는 여기에서 설명한 것과 같이 무혈청 현탁 배양물에 293 세포 주가 적응한 것에서 유도한 것이다. 이들 세포는 100㎎/ℓ헤파린, 0.1% pluronic F-68이 보충된 IS 293 무혈청 배지(Irvine Scientific. Santa Ana, Ca)에서 생장하고, 사람 아데노바이러스에 감염될 수 있는 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 인지할 수 있을 것이다. 그러나, 상세한 설명, 특정 실시예는 설명을 위한 것이고, 본 발명의 범위내에서 다양한 변화 및 수정이 가능하다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 일부인 다음의 도면은 본 발명의 특징을 설명하기 위해 첨부한다. 본 발명은 여기에서 제공하는 상세한 설명과 함께 도면을 참고하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1A와 1B는 배지 관주 속도에 따른 바이러스 용액의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다. 도 1A는 고속, 도 1B는 저속.
도 2는 CellCubeTM (직선 A260; 점선 A280)의 정제안된 세포 용해물질(CCL)의 HPLC를 나타낸 것이다.
도 3A, 3B, 3C, 3D, 3E는 상이한 계면활성제를 이용하여 CellCubeTM로부터 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다. 도 3A; ThesitR. 도 3B; TritonR X-100; 도 3C; NP-40R. 도 3D; BrijR80. 도 3E; TweenR 20을 사용한 것이다. 계면활성제 농도는 1%(w/v), 용해 온도; 실온(직선 A260; 점선 A280)
도 4A와 4B는 벤조네이즈 처리 전(도 4A)과 처리 후(도 4B)의 바이러스 용액의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다(직선 A260; 점선 A280).
도 5는 1M NaCl 존재 하에 벤조네이즈 처리 후에 바이러스 용액의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다(직선 A260; 점선 A280).
도 6은 완충액 A[20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.2M NaCl, pH=7.5]에서 AdCMVp53 바이러스의 정제를 나타낸 것이다.
도 7은 완충액 A[20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.2M NaCl, pH=9.0]에서 AdCMVp53 바이러스 정제를 나타낸 것이다.
도 8A, 8B, 8C는 정제하는 동안에 수득한 분취물의 HPLC 분석을 한 것이다. 도 8A는 fraction 3이고, 도 8B는 fraction 4이고, 도 8C는 fraction 8이다. (직선 A260; 점선 A280)
도 9는 완충액 A[20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.3M NaCl, pH=9] 존재하에 AdCMVp53의 정제를 나타낸 것이다.
도 10A, 도 10B, 도 10C, 도 10D, 도 10E는 정제하는 동안에 수득한 바이러스 분취물과 CsCl 정제된 바이러스의 HPLC 분석을 한 것이다. 도 10A는 정제 안된 바이러스 용액; 도 10B는 관통액; 도 10C는 피크#1; 도 10D는 피크#2; 도 10E는 CsCl를 이용하여 정제된 바이러스(직선 A260; 점선 A280)
도 11은 5㎝ id 컬럼에서 얻은 HPLC 정제 프로파일을 나타낸 것이다.
도 12는 SDS-PAGE에서 감지된 주요 아데노바이러스 구조 단백질을 나타낸 것이다.
도 13은 웨스턴 블랏 검사로 감지된 것과 같이 정제된 바이러스에서 BSA 농도를 나타낸 것이다.
도 14는 CellCubeTM에서 만들어진 정제 안된 세포 용해물질의 크로마토그래피을 나타낸 것이다.
도 15는 Toyopearl SuperQ 수지를 이용하여 본 발명의 방법으로 정제된 처리된 바이러스 용액의 용출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 16A, 16B는 정제 과정으로부터 얻은 바이러스 분취물의 HPLC 분석을 한 것이다. 도 16A는 제 1 정제 단계에서 취한 바이러스 분취물의 HPLC 프로파일이다. 도 16B는 제 2 정제 단계에서 취한 바이러스 분취물의 HPLC 프로파일이다( 직선 A260; 점선 A280).
도 17은 저속 배지 관주상태에서 1% TweenR 로 정제하여 수득된 바이러스 용액을 나타낸 것이다.
도 18은 저속 배지 관주하에 바이러스 분취물의 HPLC를 나타낸 것이다.
도 19A, 19B, 19C는 정제된 바이러스의 컬럼 분석을 한 것이다. 도 19A는 SDS-PAGE 분석을 한 것이고, 도 19B는 BSA의 웨스턴 블랏을 나타낸 것이다. 도 19C는 오염된 핵산 농도를 결정하기 위한 핵산 슬롯 블랏을 나타낸 것이다.
도 20A, 20B, 20C, 20D, 20E, 20F는 Toyopearl SuperQ 650M 수지의 성능 연구를 한 것이다. 도 20A는 유동 및 적하 비율이 1:1이고, 도 20B는 정제된 바이러스의 적하 비율이 1:1이고, 도 20C는 유동 및 적하 비율이 2:1이다. 도 20D는 정제된 바이러스의 적하 비율이 2:1이고, 도 20E는 유동 및 적하 비율이 3:1이다. 도 20F는 정제된 바이러스의 적하 비율이 3:1이다(직선 A260; 점선 A280).
도 21은 등밀도 CsCl 한회원심분리 컬럼 정제된 바이러스.
도 22는 컬럼 정제된 바이러스A, 고유 바이러스 B, 결손 바이러스에 존재하는 고유 바이러스의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다(직선 A260; 점선 A280).
도 23은 AdCMVp53의 생산 및 정제 과정 순서도를 나타낸 것이다.
아데노바이러스 벡터는 진핵세포 유전자 발현 및 백신 개발에 성공적으로 이용되어 왔다. 최근에는, 동물 연구를 통하여 재조합 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용하고 있다. 여러 가지 다른 조직으로 재조합 아데노바이러스를 투여하여 치료에 아데노바이러스 벡터가 유용하다는 것을 증명하였다. 이와 같은 연구 성과를 통하여 사람의 임상 실험에 이들 벡터를 이용하게 되었다. 현재 다양한 치료에 아데노바이러스 벡터를 이용하기 때문에 그 수요가 증가되고 있다. 현재 이용할 수 있는 기술로는 이와 같은 수요에 부응하지를 못한다. 따라서 본 발명은 이와 같은 치료에 이용할 수 있는 다량의 아데노바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 복제 결함 재조합 아데노바이러스를 생산하고 정제하기 위해 개발된 공정이다. 생산 공정은 세포 생장 및 바이러스 생산을 위해 CellcubeTM 바이오리엑터를 이용한다. 세포 생장하는 동안에 이용된 주어진 관주 속도, 배양을 위한 바이러스 생산 상은 바이러스 추후 정제에 상당한 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 좀더 구체적으로는 배지 관주 속도를 낮추면 바이러스 생산이 개선된다. 또한, 바이러스 생산 상 말기에 CellcubeTM에서 세포를 용해시키는데 이용되는 완충된 계면활성제로 구성된 용해 용액을 이용하면 공정을 개선시킬 수 있다. 이와 같은 두 가지 장점과 함께, 수득된 정제 안된 바이러스 용액은 정제 안된 바이러스 용액에 있는 불순물 핵산 농도를 줄이기 위해 농축/다이아필터레이션 및 뉴클레아제 처리한 후에 단일 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다. 컬럼에 의해 정제된 바이러스는 이중 CsCl 경사를 이용하여 정제된 바이러스의 순도와 비슷하다. 바이러스 생성물의 전체 회수율은 70% ±10%이다. 이는 Huyghe et al.,(1996)이 보고한 결과에 비해 상당히 개선된 것이다. 이중 CsCl 경사 한외원심분리를 이용한 것과 비교하면, 컬럼 정제는 일관성 있고, 규모를 늘릴 수 있고, 유효하고, 더 신속하고, 비용이 적게드는 장점이 있다. 이와 같은 새로운 공정은 유전자 요법에 사용할 수 있는 아데노바이러스 벡터를 제조하는데 상당히 개선된 방법이 된다.
따라서, 본 발명은 아데노바이러스 벡터를 생산하고 정제하는 것을 목표로 대규모 배양계에서 이들 장점을 제공하도록 한 것이다. 이와 같은 시스템에서 다양한 성분, 이를 이용하여 아데노바이러스를 생산하는 방법은 하기에서 상술한다.
1. 숙주 세포
A) 세포
적절한 구체예에서, 독특한 헬퍼 세포주(293이라 칭함)에 따라 아데노바이러스 벡터의 발생 및 증식이 달라지는데, 293은 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5) DNA 단편으로 사람 배 신장 세포를 형질 변환시킨 것으로 구조적으로 E1 단백질을 발현하는 것이다(Graham et al., 1977). E3 부분은 Ab 게놈에서 없어도 되는 부분이기 때문에(Jones and Shenk, 1978), 293세포의 도움으로 현재 Ad 벡터는 E1 또는 E3 또는 E1, E3에 외부 DNA를 가진다(Graham and Prevec, 1991; Bett et al., 1994).
본 발명의 한 측면은 아데노바이러스 게놈의 일부를 발현시키는 재조합 세포주를 제공하는 것이다. 이들 세포주는 특정 아데노바이러스 유전자에 결함을 가지는 헬퍼 바이러스와 아데노바이러스 재조합 벡터가 복제하는 것을 지원할 수 있는데, 예를 들면, 이들 바이러스와 벡터의 생장을 "허용"한다는 것을 의미한다. 이와 같은 재조합 세포는 복제-부적응 아데노바이러스 벡터의 결함을 보완하거나 복제를 지원하는 능력 때문에 헬퍼 세포로 칭하기도 한다. 아데노바이러스 헬퍼 세포의 프로토타입(prototype)은 293 세포주이고, 여기에는 아데노바이러스 E1 부분을 포함한다. 293 세포는 복제에 필요한 E1-활성 요소를 in trans 에 제공하여 E1 기능이 부족한 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원한다.
본 발명에 따른 헬퍼 세포는 포유류 세포에서 유도할 수 있는데, 적절하게는 사람 배 신장 세포와 같은 영장류 세포에서 유도할 수 있다. 다양한 영장류 세포가 적절하나, 사람 또는 사람 배 신장 세포가 가장 적절하고, 바이러스 복제를 지원할 수 있는 세포 형도 본 발명에서 사용할 수 있다. 다른 세포 형에는 Vero 세포, CHO 세포 또는 세포가 아데노바이러스 허용성인 조직 배양 기술을 이용하여 만들 수 있는 임의 진핵 세포를 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. "아데노바이러스 허용성"이라는 의미는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 세포 환경 내에 전체 세포내 바이러스 생명 과정을 완료할 수 있는 것을 말한다.
헬퍼 세포는 293 세포와 같은 기존의 세포주에서 유도할 수도 있고 또는 de novo에서 만들 수도 있다. 이와 같은 세포주는 아데노바이러스 게놈에서 in trans 결손을 보완하는데 필수적인 아데노바이러스 유전자를 발현하거나 E1, E2, E4, E5 및 후기 기능과 같은 다른 결손 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원한다. 아데노바이러스 게놈의 특정 부분 즉, E1 부분을 이용하여 상보적인 세포주를 만들었다. 결합된 형 또는 에피좀 형이건 간에, 복제를 위한 바이러스 오리진이 부족한 아데노바이러스 게놈의 일부분이 세포주에 도입되면 세포가 야생형 아데노바이러스에 감염되더라도 복제를 할 수 없다. 또한, 주요 후기 단위(Major Late Unit) 전사가 바이러스 DNA 복제 후에 일어나기 때문에 아데노바이러스의 후기 기능은 세포주에서 충분히 발현되지 못한다. 따라서, 후기 기능(L-5)과 겹쳐지는 E2 부분이 세포주가 아닌 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 일반적으로 본 발명에 따른 세포주는 E1 또는 E4를 발현시킨다.
여기에서 사용된 바와 같이, "재조합" 세포는 아데노바이러스 게놈 또는 다른 세포의 게놈등에서 유도한 유전자를 세포로 도입시킨 세포를 말한다. 따라서, 재조합 세포는 재조합에 의해 도입된 유전자를 가지고 있지 않은 자연-발생 세포와는 구별된다. 재조합 세포는 "사람의 손"을 통하여 도입된 유전자를 가지는 세포를 말한다.
감염안된 세포 층 또는 세포를 하나 이상의 헬퍼 바이러스 또는 바이러스 입자에 접촉시키고, 세포를 배양하여 복제를 결정한다. 세포 층에 바이러스 플락 또는 세포가 없는 지역이 형성되는 것은 특정 바이러스 생성물이 발현됨으로써 세포가 용해되었기 때문이다. 세포 용해는 바이러스가 복제되었다는 것을 나타내는 것이다.
복제 컴피턴스 바이러스에 이용하거나 복제 결함 바이러스에 이용하기 위해 숙주 세포를 컴피턴스를 변환시키는데 이용되는 다른 유용한 포유류 세포주로는 Vero, HeLa 세포, Chinese hamster ovary 세포주, W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포등이 있다.
B) 선택 배지에서 생장
특정 구체예에서, 원하지 않는 세포 생장을 배제하는 선택 시스템을 이용하는 것이 유익하다. 선택성 표식을 이용하여 영구적으로 세포주를 형질변환시키거나 또는 선택성 표식을 인코드하는 바이러스 벡터로 세포주를 감염시키거나 형질도입시켜 만들 수 있다. 어떤 상황이건간에, 적절한 약물 또는 선택 화합물을 이용하여 형질 변환된 또는 형질 도입된 세포를 배양하면 표식만을 가지는 세포 집단만을 모으게 된다.
이와 같은 표식에는 tk-, hgprt-, aprt- 세포에 각각 HSV 티미딘 카이나제, 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제 유전자등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또한 메토트렉세이트에 저항성을 제공하는 dhfr, 미코페놀산에 저항성을 제공하는 gpt; 아미노글리코시드 G418에 저항성을 제공하는 neo; 하이그로마이신에 저항성을 제공하는 hygro;등과 같은 항-대사물질 저항성을 이용할 수 있다.
C) 혈청을 제거한 상태에서 생장
재조합 단백질(Berg, 1993) 및 바이러스 백신(Perrin, 1995)을 생산하는데, 고정 의존성 세포를 무혈청 현탁 배양에 적응하도록 혈청을 제거하는 방법을 이용하였다. 최근까지 무혈청 현탁 배양에 293A 세포를 적응시킨 것에 대해서는 보고된 것이 거의 없다. Gilbert는 아데노바이러스 및 재조합 단백질 생산을 위해 293A 세포를 무혈청 현탁 배양에 적응시켰다고 보고하고 있다(Gilbert, 1996). 유사한 적응 방법을 이용하여, 아데노바이러스 생산을 위해 A549 세포를 무혈청 현탁 배양에 적응시켰다(Morris et al., 1996). 적응된 현탁 세포에서 생산된 세포 특이적인 바이러스 생산량은 부착된 모세포에서 수득하는 것에 비해 약 5-10배 적었다.
유사한 혈청 제거 과정을 이용하여, 발명자들은 무혈청 현탁 배양물에 293A 세포를 성공적으로 적응시켰다(293SF 세포). 이와 같은 과정에서, 293 세포는 T-플라스크에 FBS 농도를 연속하여 낮추면서 시판되는 293 배지에 적응시켰다. 간략하면, 배지에서 초기 혈청의 농도는 T-75 플라스크에서 10% FBS DMEM 배지인데, 연속적으로 배지에 FBS 농도를 낮추어 T-플라스크에 무혈청-IS 293 배지에 세포를 적응시켰다. T-75 플라스크에 6회 계대한 후에, FBS%는 약 0.019%, 293 세포로 확인되었다. 이들을 스피너 플라스크에 옮기기 전에 T 플라스크에서 2회이상 계대한다. 하기에서 설명하는 결과를 보면, 세포는 무혈청 배지(IS293 배지, Irvine Scientific, Santa Ana, CA)에서 충분하게 생장한 것을 알 수 있다. 세포의 평균 배가(doubling) 시간은 18-24시간으로, 이는 배지 교환 없이 정체 세포 농도가 4-10 ×106 cells/㎖가 되는데 도달하는 시간을 말한다.
D) 현탁 배양에 세포의 적응
두 가지 방법을 이용하여, 293 세포를 현탁 배양에 적응시킨다. Graham은 누드 쥐에 3회 연속으로 계대하여 293A 세포를 현탁 배양에 적응시켰다(293N3S 세포)(Graham, 1987). 현탁 293N3S 세포는 E1 아데노바이러스 벡터를 지원할 수 있는 능력이 있다. 그러나, Garnier et al.,(1994)은 293N35 세포가 현탁액에서 상대적으로 긴 초기 로그(lag) 상을 가지고, 생장 속도가 느리고, 응집하는 경향이 강하다는 것을 알았다.
이용된 두 번째 방법은 현탁 생장에 293A 세포를 점진적으로 적응시키는 방법이다(Cold Spring Harbor Laboratories, 293S cells). Garnier et al.,(1994)은 아데노바이러스 벡터로부터 재조합 단백질을 생산하기 위해 293S 세포를 이용한다고 보고하고 있다. 저자는 293S 세포가 칼슘이 없는 배지에서 응집되는 경향이 적고, 바이러스 감염시점에 새로운 배지로 교환하면 단백질 생산이 상당히 증가된다는 것을 발견하였다. 배지 교환없이 배양물에서는 포도당이 제한 인자라는 것도 발견하였다.
본 발명에서, 무혈청 조건에서 생장하도록 적응된 293 세포는 현탁 배양물에도 적응된다. 초기 세포 밀도가 1.18E + 5 vc/㎖ 내지 5.22E + 5 vc/㎖ 사이에서 현탁 배양을 위해 혈청이 없는 250㎖ 스피너 현탁 배양기(100㎖ 작업 용적)로 세포를 옮긴다. 배지에는 헤파린을 첨가하여 세포가 응집되는 것을 방지한다. 이와 같은 세포 배양 시스템은 세포의 생존능은 유지시키면서 어느정도 세포 밀도를 증가시킨다. 일단 이들 세포가 배양에서 생장되면 스피너 플라스크에서 약 7회 이상 세포를 계대한다. 세포의 배가 시간이 점차 감소되어, 연속 계대가 끝날쯤에는 약 1.3일로 줄어드는데, 이는 부착된 세포 배양에서 10% FBS 배지에 있는 세포의 배가 시간이 1.2일과 비슷하다. 헤파린이 보충된 무혈청 IS 293 배지의 경우에 현탁 배양물에 존재하는 세포는 거의 응집되지 않고, 개별적으로 존재한다.
2. 세포 배양 시스템
제약 산업 특히 유전자 요법에서 감염성 바이러스 벡터를 생산하는 능력이 중요하게 부각되었다. 지난 10년간, 생명공학의 발전으로 인하여, 치료요법, 백신, 단백질 생산등에 이용할 수 있는 상당수의 중요한 바이러스 벡터를 생산하게 되었다. 포유류 배양에 이들 바이러스 벡터를 이용하면, 박테리아 또는 다른 하등 생명을 숙주로 하여 생산되는 단백질과 비교하였을 때 잇점이 있는데, 예를 들면, 이황화결합에 따른 접힘구조 및 글리코실화반응과 같은 해독 후에 일어나는 복잡한 단백질 구조를 만들 수 있다.
포유류 세포 배양물에 매우 효과적인 벡터 시스템의 구안 및 작제등의 분자 생물학 기술 개발, 유용한 선별 표식 밧데리, 유전자 증폭 과정, 최종 생물학적으로 활성이 있는 분자를 도입된 벡터에서 준비하는 것과 연관된 생화학 및 세포 기작을 좀더 잘 이해함으로써 바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포 배양이 발전되었다.
흔히, 발현 시스템용 숙주로 세포주를 선택하기 전에는 제조 규모를 증가시키는 하류 과정(이 경우에는 세포 용해 후에)에 영향을 주는 인자를 고려하지 않았다. 또한, 장시간동안 매우 높은 밀도로 배양물을 유지할 수 있는 바이오리엑터 시스템 개발은 적은 비용으로 생산을 증가시키려는 욕구에는 맞지 않았다.
본 발명은 최근에 이용할 수 있는 바이오리엑터 기술의 장점을 제공한다. 본 발명에 따라 바이오리엑터에서 세포를 생장시켜, 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 감염될 수 있는 생물학적으로 완전한 활성을 가지는 세포를 대규모로 만들 수 있다. 저속 관주 속도에서 시스템을 작동시키고, 감염 입자 정제를 위해 다른 과정을 적용하여, 본 발명은 고순도 생성물을 용이하게 다량 생산할 수 있는 정제 방법을 제공한다.
바이오리엑터는 현탁 및 고정 의존성 동물 세포 배양물로부터 생물학적 생산물을 생산하는데 널리 이용되어 왔다. 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 가장 널리 이용된 세포는 고정 의존성 사람 배 신장 세포(293 세포)이다. 아데노바이러스 벡터 생산을 위해 개발된 바이오리엑터는 용적-특이적인 배양 표면적이 큰 특징이 있어, 고밀도 생산 세포 및 높은 바이러스 수득률을 얻을 수 있다. 교반되는 탱크 바이오리엑터에서 마이크로캐리어 세포 배양물은 용적 특이적인 배양 표면적을 많이 제공하여, 바이러스성 백신을 만드는데 이용되어왔다(Griffiths, 1986). 또한, 교반시킨 탱크 반응기는 산업적으로 생산 규모를 증가시킬 수 있다는 것이 증명되었다. Corning-Costar에서 제작된 다중 플레이트 CellcubeTM 세포 배양 시스템 또한 용적-특이적 배양 표면적을 매우 크게 한다. 배양 플레이트의 양면에 세포가 생장하여, 압착 입방체 모양으로 봉해진다. 교반을 하는 탱크 바이오리엑터와는 달리, CellcubeTM 배양 단위는 사용후 버릴 수 있다. 이는 임상 생성물의 초기 단계 생산에는 매우 바람직한데, 그 이유는 처리 가능한 시스템의 경우에 비용 절감, 양질의 제어, 품질 보장 비용이 줄어들기 때문이다. 다른 시스템에 의해 제공되는 정점을 고려하여, 아데노바이러스를 생산하는데, 교반 탱크 바이오리엑터와 CellcubeTM 시스템을 평가하였다.
A) 고정 의존성에 대한 고정 비-의존성 배양
두 가지 방식으로 동물 및 사람 세포를 증식시킬 수 있다; 대량 배양을 통하여 현탁액에서 비-고정 의존성 세포를 자유롭게 배양; 또는 이들의 증식을 위해 고형 서포트에서(단층 세포 생장의 경우) 고정 의존성 세포를 부착시킴.
세포 및 세포 생성물을 대량 생산하기 위한 수단으로 가장 흔히 이용되는 것이 연속 주화세포(株化細胞)에서 비-고정 의존성 또는 현탁 배양을 이용하는 것이다. 미생물(박테리아 및 이스트) 발효 기술을 이용한 대규모 현탁 배양은 포유류 세포 생성물을 만드는데에는 명백하게 유익하다. 이 공정은 작동 및 그 규모를 늘리는 것이 상대적으로 간단하다. 반응기에서 온도, 용존 산소, pH등을 정확하게 균질한 모니터하고 조절할 수 있도록 균질한 상태가 제공되고, 배양물의 대표적인 샘플을 취할 수 있다.
그러나, 현탁 배양된 세포를 생물학적 물질을 만드는데 항상 이용하는 것은 아니다. 현탁 배양물은 여전히 종양 발생 가능성이 있어, 생산에 있어서, 이들을 기질로 이용하는 경우는 사람 및 동물에 이용하는 것에 제한한다(Petricciani, 1985; Larsson, 1987). 고정-의존성 배양물과는 반대로 현탁 배양물에서 증식된 바이러스는 어떤 경우에는 바이러스 표식이 급격히 변화되어, 면역원성이 감소되기도 한다(Bahnemann, 1980). 최종적으로, 재조합 세포주는 동일한 세포가 현탁배양된 경우와 비교할 때 고정-의존성 배양물에서 증식되면 상당량의 생성물을 분비한다(Nilsson and Mosbach, 1987). 이와 같은 이유로, 다른 생물학적 산물을 생산하는데 여러 가지 형태의 고정-의존성 세포를 광범위하게 이용한다.
B) 현탁 반응기 및 공정
교반 탱크에 포유류 배양물을 대규모 현탁 배양하였다. 바이오리엑터 기구 및 제어는 관련 미생물 분야에서 이용된 발효기 고안을 채택하였다. 그러나, 포유류 배양물을 서서히 배양시키는데 있어서, 오염 제어에 대한 요구가 증가하기 때문에, 개선된 멸균 고안을 신속하게 이행하여, 반응기의 의존성을 개선시켰다. 기구 및 제어 방법은 다른 발효기와 근본적으로 동일한데, 교반, 온도, 용존산소 및 pH 조절 등이 포함된다. 온-라인 및 오프-라인에서 탁도(존재하는 입자에 대한 함수), 용량(존재하는 생존 세포에 대한 함수), 포도당/락테이트, 탄산염/중탄산염, 이산화탄소 등을 측정할 수 있는 좀더 개선된 프로브 및 분석기를 이용할 수 있다. 현탁 배양에서 수득할 수 있는 최대 세포 밀도는 약 2-3 ×106 세포/배지 ㎖로 미생물 발효에서 얻을 수 있는 수보다 상대적으로 낮다(이는 ㎖당 건조세포 중량이 1㎎보다 적은 것이다).
두 가지 현탁 배양 반응기 고안 즉, 교반 반응기 및 공수 반응기가 산업에서는 가장 널리 이용되는데, 그 이유는 간단하고, 튼튼하기 때문이다. 교반 반응기 고안은 인터페론을 생산하는데 용량을 8000ℓ까지 늘리는데 사용하여 성공하였다(Phillips et al., 1985; Mizrahi, 1983). 높이; 직경 비율이 1:1 내지 3:1인 스테인레스 강 탱크에서 세포를 생장시킨다. 배양물은 날로된 디스크 또는 프로펠라형으로 된 한 개 이상의 교반기를 이용하여 혼합한다. 교반기는 날을 사용하는 것보다는 전단력이 적다. 교반은 직접적으로 또는 자석을 결합시켜 구동하는 간접 방식으로 이루어진다. 간접 구동 방식은 교반기 축에 밀봉하여 미생물 오염 위험을 줄일 수 있다.
미생물 발효 초기에 그리고 포유류 배양에 이용된 공수 반응기는 배양물을 혼합하고, 산소를 제공하는데 기류를 이용한다. 기류가 반응기의 수직 부분으로 들어가 순환시킨다. 배양 표면에 있는 기체는 액체가 없는 조밀한 기포가 반응기 아래로 이동하도록 한다. 이 고안의 주요 장점은 간단하고, 기계적인 혼합이 필요하지 않다는 것이다. 일반적으로 높이에 대한 직경 비는 10:1이 된다. 공수 반응기의 규모를 늘리는 것은 상대적으로 용이하고, 기체에 의한 물질 전달이 양호하고, 상대적으로 전단력이 적게 발생한다.
대부분 대규모 현탁 배양물은 배치(batch) 또는 페드 배치(fed-batch) 공정으로 작동되는데, 그 이유는 작동 및 규모를 늘리는데 가장 간단하기 때문이다. 그러나, 물질 환경 조절 장치(chemostat) 또는 관주 원리를 이용한 연속 공정을 이용할 수 있다.
배치 공정은 전형적인 생장 프로파일을 볼 수 있는 닫힌 시스템이다. lag 상에 이어서, 지수기, 정체기 및 감소기로 이어진다. 이와 같은 시스템에서, 영양분은 고갈되고 대사물질이 축적되기 때문에 환경은 지속적으로 변화된다. 이는 세포 생장 및 생산성에 영향을 주는 인자를 분석할 수 있게 하여, 공정을 최적화시킨다. 주요 영양소를 조절하여 공급함으로써 생장 과정을 연장시켜 배치 공정의 생산성을 증가시킬 수 있다. 이와 같은 피드-배치(fed-batch) 공정은 세포, 생산물, 폐기물이 제거되지 않기 때문에 여전히 닫힌 시스템이 된다.
닫힌 시스템의 경우에, 다양한 장치(미세한 메쉬 스핀 필터, 다공성 필터, 편평한 플레이트 막 필터, 침강 튜브)에 세포를 유지시켜, 배양물에 새로운 배지를 관주시킨다. 스핀 필터 배양물은 약 5 ×107 세포/㎖ 밀도를 만든다. 실제 개방 시스템 및 간단한 관주 공정은 배지를 유입시키고, 세포 및 생성물은 유출시키는 물질 환경 조절 장치이다. 배양 배지를 반응기로 공급하는데, 이때 공급하는 속도는 세포의 특정 최대 생산 속도보다는 적은 값(그 이유는 반응기로부터 세포 물질이 씻겨나가는 것을 방지하기 위함)으로 배양물의 희석 비율을 유지시키는 예정된 일정한 속도로 공급한다. 세포, 세포 생성물, 부산물을 포함하는 배양 유체도 동일한 속도로 제거한다.
C) 관주안되는 부착 시스템
전통적으로, 고정-의존성 세포 배양물은 작은 유리 또는 플라스틱 용기의 바닥에서 증식한다. 전통적인 기술에 의해 실험실 규모에 적합한 표면에 대한 용적 비율이 제한되어 대량으로 세포 및 세포 생산물을 생산하는데 방해가 된다. 작은 배양 용적에서 세포 생장을 위해 넓은 표면적을 제공하는 시스템을 제공하려는 시도로 여러 가지 기술이 제안되었다; 롤러 병 시스템(roller bottle system), 적층 플레이트 증식기(stack plates propagator), 나선형 필름 병(spiral film bottles), 공동 섬유 시스템(hollow fiber system), 묶은 침상(packed bed), 플레이트 교환 시스템(plate exchanger system), 막 튜빙 겔(membrane tubing gel). 이들 시스템은 특징상 비-균질성이기 때문에, 일부 경우에는 다단계 공정을 기초하여, 여러가지 단점이 있는데, 규모를 증가시키는데 한계, 세포 표본을 얻은데 어려움, 주오 공정 변수 측정 및 제어에 한계, 배양동안에 균일한 환경 조건 유지에 어려움등이 있다.
이와 같은 단점에도 불구하고, 대규모로 고정-의존성 세포 생산을 위한 공정이 흔히 이용되는 공정이 롤러 병 시스템이다. 모양이 다른 큰 T-플라스크와 마찬가지로, 시스템의 단순함이 매우 신뢰성있고, 매력있다. 완전 자동화된 로보트가 하루에 수천개의 롤러 병을 조절할 수 있기 때문에, 오염 위험이 줄어들고, 상당히 많은 양의 인력을 줄일 수 있다. 자주 배지를 교환하면, 롤러 병 배양으로 0.5 ×106 세포/㎠에 근접한 세포 밀도를 얻을 수 있다(이는 병 하나에 109 세포 또는 배양 배지 ㎖당 거의 107 세포에 상응하는 양이다).
D) 마이크로캐리어에서 배양
전통적인 고정-의존성 배양 공정의 단점을 극복하려는 시도로, van Wczel(1967)은 마이크로 캐리어 배양 시스템 개념을 도입하였다. 이와 같은 시스템에서, 천천히 교반하여 생장 배지에 현탁된 작은 고체 입자 표면에 세포가 증식한다. 세포는 마이크로캐리어에 부착되고, 점진적으로 생장하여 마이크로캐리어 표면에 합류된다. 사실, 이와 같은 대규모 배양 시스템은 단일 디스크 공정에서 단위 공정으로 부착 의존성 배양을 개량한 것으로 단위 공정은 단층 및 현탁 배양을 함께 하는 것이다. 따라서, 균질한 현탁 배양의 장점을 가지도록 세포가 생장하는데 필수적인 표면적을 복합하여 생산을 증가시킨다.
대부분의 다른 고정-의존성 대규모 배양 방법에 비해 마이크로캐리어 배양의 장점은 몇 가지가 된다. 첫째, 마이크로캐리어 배양은 표면적에 대한 용적 비율이 높은데(캐리어 농도를 변화시켜 다양하게 한다), 이는 고밀도 세포 생산을 제공하고, 상당히 농축된 세포 생산물을 얻을 수 있는 가능성을 제공한다. 세포 생산성은 관주된 반응기에서 배양물이 증식되는 경우에 1-2 ×107 세포/㎖까지 증가된다. 둘째, 많은 작은 생산성이 낮은 용기(가령, 플라스크 또는 접시)를 사용하는 대신에 한개 단위 공정 용기에서 증식된다. 이 결과 영양소 이용성이 개선되고, 배양 배지를 상당히 절약할 수 있다. 또한, 한개 반응기에서 증식함으로써 설비 공간, 세포당 요구되는 조작 단계의 수를 줄일 수 있게 되어 노동비용 및 오염 가능성을 줄일 수 있다. 셋째, 잘 혼합된 균질한 마이크로캐리어 현탁 배양으로 환경 조건(pH, pO2 및 배지 성분 등의 농도)을 모니터하고, 조절하는 것이 가능하여, 좀더 세포 증식의 재생성 및 생성물 회수의 재생성을 유도할 수 있다. 네째, 현미경 관찰, 화학물질 테스트, 계산을 위한 대표 샘플을 취하는 것이 가능하다. 다섯째, 마이크로캐리어는 현탁액으로 부터 용이하게 침전하기 때문에, 피드-배치 공정을 이용하거나 세포를 회수하는 경우에 용이하게 실시할 수 있다. 여섯째, 마이크로캐리어에 고정-의존성 배양 증식 방식은 단백질분해 효소를 이용하지 않고 세포를 전달하는 것과 같은 세포 조작, 세포의 공배양, 동물에 이식, 마이크로캐리어를 보유할 수 있는 유리병, 컬럼, 유동화된 침상 또는 동공 섬유를 이용한 배양물의 관주에 이를 이용할 수 있다. 일곱째, 현탁액에서 미생물 및 동물 세포 배양에 이용되는 통상의 장비를 이용하여 마이크로캐리어 배양은 상대적으로 용이하게 그 배양 규모를 증가시킬 수 있다.
E) 포유류 세포의 마이크로포집화 반응
포유류 세포를 배양하는데 특히 유용한 방법중에 하나는 마이크로포집화반응이다. 포유류 세포는 반투성 하이드로겔 막내부에 보유되어있다. 다공성 막이 세포 주변에 형성되어, 영양소, 기체, 대사 생성물과 캡슐 주변의 대량 배지와 교환이 이루어진다. 부드럽고, 신속하고 독성이 없는 몇 가지 방법이 개발되었는데, 생성된 막은 배양하는 동안에 생장된 세포 물질을 유지할 수 있을 정도로 강하고 다공성이다. 이와 같은 방법은 칼슘을 포함하는 용액에 접촉하여 겔화된 가용성 알지네이트에 기초한 것이다. Lim (1982, US Patent 4,352,883)는 세포를 약 1% 알지네이트 나트륨에서 농축하여, 작은 구멍을 통하여 밀어내어, 방울을 형성하게 한후, 약 1% 염화칼슘 용액 속으로 자유롭게 부서지는 것에 대해 설명하고 있다. 그 다음 방울은 표면 알지네이트에 이온 결합을 하는 폴리아미노산 층에 들어간다. 최종적으로 알지네이트는 칼슘 이온을 제거하기 위한 킬레이트제로 방울을 처리하여 다시 액화된다. 다른 방법은 칼슘 용액에 있는 세포를 알지네이트 용액으로 한 방울씩 떨어뜨리고, 동공 알지네이트 구를 만드는 것이다. 유사한 방법은 키로산 용액에 있는 세포를 알지네이트로 한 방울씩 떨어뜨려 동공 구를 만드는 것과 관련된다.
마이크로포집된 세포는 교반되는 탱크 반응기에서 용이하게 증식되어, 150-1500㎛ 직경의 비드는 미세한 메쉬 스크린을 이용하여 관주되는 반응기에 용이하게 유지시킬 수 있다. 캡슐 용적에 대한 총 배지 용적은 1:2 내지 1:10으로 유지시킨다. 캡슐 내에 세포 밀도가 108 정도되면, 배양물에 효과적인 세포 밀도는 1-5 ×107가 된다.
다른 공정에 비해 마이크로포집 과정의 장점은 살포 및 교반에서 발생하는 전단 스트레스의 유해한 영향으로부터 보호할 수 있으며, 관주되는 시스템을 이용하기 위한 목적으로 비드를 용이하게 유지시킬 수 있고, 그 규모를 늘리는 것이 용이하고, 이식용 비드를 이용할 수도 있다.
본 발명에는 자연상태에서 고정-의존성인 세포를 포함하는데, 예로 들면, 293세포는 고정-의존성으로 현탁액에서 생장하는 경우에 세포는 서로 흡착되어 덩어리를 형성하면서 생장하고 종국에는 배양 조건에 의해 핵 세포를 유지할 수 없을 정도의 크기에 도달하면 각 덩어리의 내부 핵에 있는 세포는 질식하게 된다. 따라서, 이들 세포를 효과적으로 이용하여 다량의 아데노바이러스를 생산하려면 고정-의존성 세포를 대규모로 배양하는 효과적인 수단이 필요하다.
F) 관주된 부착 시스템
관주된 부착 시스템은 본 발명의 적절한 형태가 된다. 관주는 세포 또는 세포 집단에 일정한 속도로 지속적으로 흐르는 것을 말하는데, 이는 배양 단위 내에 세포가 보유된다는 것을 의미하는 것으로 회수된 배양 배지로 세포를 씻겨내는 연속-흐름 배양과는 반대되는 것이다. 20세기초에 관주 개념이 도입되었기 때문에, 광범위한 현미경 관찰을 위해 작은 조작 조직을 유지하는데 주로 이용되었다. 세포에 지속적으로 혈액, 임파 또는 다른 체액 등이 공급되는 in vivo 세포 환경을 모방하도록 하는 것이다. 관주를 하지 않으면 배양물에 있는 세포는 공급 및 기아과정을 겪어 이들의 생장 및 대사 능력을 충분히 발휘하지 못한다.
현재 이용되는 관주 배양은 고밀도(0.1-5 ×108 cells/㎖)에서 생장하는 세포의 도전에 대한 반응이다. 2-4 ×106 cells/㎖이상으로 밀도를 증가시키기 위해서는 배지에는 영양 결핍을 보충하고 독성 생성물을 제거하기 위해 지속적으로 새로운 배지를 공급해야 한다. 관주는 배양 환경(pH, pO2, 영양 수준등)을 더 잘 조절할 수 있게 하고, 세포 부착을 위해 배양물내에 표면적 이용을 상당히 증가시킨다.
비-편직 침상 매트릭스를 이용하여 관주된 포개진 침상 반응기를 개발하여 침상 용적이 108 cells/㎖을 초과하는 밀도에서 관주 배양물을 유지하는 수단을 제공한다(CelliGenTM, New Brunswick Scientific, Edison, NJ; Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et al., 1994). 간단하게 설명하면, 이와 같은 반응기는 고정-이존성 세포 및 비-고정 의존성 세포를 모두 배양하도록 개선된 반응기로 구성된다. 반응기는 내부 재순환 수단이 있는 겹쳐진 침상으로 만들어졌다. 적절하게는 섬유 매트릭스 담체를 반응 용기 내에 바스킷에 둔다. 바스킷의 바닥 및 윗 부분에 구멍을 내어 배지가 바스킷안으로 흐를 수 있도록 한다. 특별히 고안된 임펠러는 영양분을 균질하게 공급하고 폐기물은 제거할 수 있도록 섬유 매트릭스가 차지하는 공간에 배지가 재순환되도록 한다. 이는 동시에 적은 양의 총 세포 물질이 배지에 현탁되도록 한다. 바스킷과 재순환 수단을 복합하면 섬유 매트릭스를 통하여 산소가 제공된 배지에 기포 없는 흐름을 제공한다. 섬유 매트릭스는 10㎛ 내지 100㎛ 직경의 구멍을 가지는 비-편직 섬유로 개별 세포 용적의 1 내지 20 배에 상응하는 내부 구멍 용적을 제공한다.
다른 배양 시스템과 비교하였을 경우에, 이 방법은 몇 가지 중요한 장점을 제공한다. 섬유 매트릭스 담체의 경우에, 교반 및 기포 발생 등의 기계적인 스트레스로부터 세포를 보호한다. 바스킷을 통하여 자유롭게 이동하는 배지는 세포에 적절히 조절된 산소, pH, 영양소를 제공한다. 배양물로부터 생성물은 지속적으로 제거되고, 수득된 생성물에는 세포가 없고, 그 다음에 일어나는 정제 단계를 실행하기 위해 단백질 함량이 적은 배지에서 생산된다. 또한 이와 같은 반응 시스템의 독특한 디자인은 반응기 규모를 올리는데 용이한 방법을 제공한다. 현재 30ℓ까지 이용할 수 있다. 100ℓ와 300ℓ정도의 것을 개발중이고, 이론적으로 계산하면 1000ℓ 반응기 까지 그 규모를 올릴 수 있다. 이 기술은 WO 94/17178(August 4, 1994, Freedman et al.)에서 설명하고 있고, 이는 참고문헌으로 첨부한다.
CellcubeTM(Corning-Costar) 모듈은 기질 부착된 세포의 생장 및 고정을 위한 큰 스티렌 표면을 제공한다. 여러 개의 나란히 있는 배양 플레이트가 결합되어 인접한 플레이트사이에 얇게 봉해진 라미나 흐름 공간을 만드는 일체형으로 포집된 멸균 1회용 장치이다.
CellcubeTM 모듈은 서로 대각선 방향으로 마주하여 배지 흐름을 조절하는데 도움을 주는 유입 및 유출 포트를 가진다. 생장 처음 며칠은 배양물은 초기 접종한 후에 시스템내에 유지된 배지에 일반적으로 만족한다. 초기 접종과 배지 관주 시작 시간은 접종 배지에 있는 세포 밀도 및 세포 생장 속도에 따라 달라진다. 순환 배지에 있는 영양소 농도를 측정하면 배양 상태를 잘 알 수 있다. 과정을 정립할 때, 다양한 관주 속도에서 영양 조성물을 모니터하여 가장 경제적이고 생산성이 높은 작동 변수를 결정한다.
시스템내에 세포의 밀도와 통상적인 배양 시스템의 용액 밀도(cells/㎖)보다는 더 높다. 가장 흔히 이용되는 기초 배지는 1-2 ×106 cells/㎖/day를 지원하도록 되어 있다. 85,000㎠ 표면적을 가지는 전형적인 CellcubeTM는 모듈내에 약 6ℓ배지를 포함한다. 세포 밀도는 배양 용기에 107 세포/㎖을 초과한다. 합류시에, 하루에 2-4 반응기 용적의 배지가 필요하다.
배양물의 생산 상 시간 및 변수들은 특정 세포주 타입 및 이용에 따라 달라진다. 배양물의 성장 상에 요구되는 것 이상으로 생산을 위해서는 많은 배양에서 상이한 배지를 요구한다. 한 상에서 다른 상으로 전이하는 경우에도 통상적인 배양에서 다중 세척 단계를 요구한다. 그러나, CellcubeTM 시스템은 관주 시스템을 이용한다. 이와 같은 관주 시스템을 이용하는 장점 중에 하나는 다양한 작동 상간에 유연한 전이를 제공하는 것이다. 관주 시스템은 생장 배지에 혈청 성분을 제거하는데 통상적인 세척 단계를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 구체예에서, CellCubeTM 시스템을 이용하여, AdCMVp53이 트랜스펙트된 세포를 생장시켰다. 293 세포는 제조업자의 권유에 따라 CellcubeTM에 접종하였다. 접종 세포 밀도는 1-1.5 ×104/㎠ 범위가 된다. 세포는 pH=7.20, DO=60% 공기 포화 배양 조건하에 37℃에서 7일간 생장시켰다. 배지 관주 속도는 CellCubeTM에 있는 포도당 농도에 따라 조절된다. 바이러스 감염 하루전에, 관주용 배지는 10% FBS에서 2% FBS로 변화시킨다. 8일째에 세포에 바이러스를 감염시키는데, MOI는 5가 된다. 감염직후 1시간동안 배지 관주를 중단하고, 바이러스 생산 상동안에는 다시 시작한다. 배양물은 감염후 45-48시간에 수득한다. 물론 이와 같은 배양 조건은 예를 든 것이고, 특정 세포주에 필요한 영양소 및 생장 조건에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다. 이와 같은 변화는 실험 없이도 실시할 수 있는 것이고, 당업자에게 잘 알려진 범위의 것이다.
G) 무혈청 현탁 배양
특정 구체예에서, 유전자 요법을 위한 아데노바이러스 벡터를 상기에서 설명한 것과 같이 고정-의존성 293 세포 배양물(293A 세포)에서 만든다. 고정-의존성 293A 세포에 의해 아데노바이러스 벡터의 대규모 생산이 제한된다. 아데노바이러스 벡터 생산의 규모를 늘리고, 추가 요구 사항에 부응하도록 하기 위해, 규모를 늘릴 수 있는 또 다른 생산 공정을 개발하는데 상당한 노력을 기울였다. 그 방법에는 마이크로캐리어 배양물에서 293A세포를 생장시키는 것, 현탁 배양물에 293A 생산 세포를 적응시키는 것이 포함된다. 상기에서는 마이크로캐리어 배양 기술에대해 설명하였다. 이 기술은 기계적으로 교반하면서 배양 배지에 현탁된 마이크로캐리어 표면에서 생산 세포를 부착시키는 것이다. 세포 부착을 요구하기 때문에 마이크로캐리어 배양의 규모를 늘리는데 한계가 있다.
본 발명이전까지 유전자 치료법에 사용하기 위해 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 있어서, 293 현탁 세포를 이용한다는 보고는 없었다. 또한, 보고된 현탁 293 세포는 최적의 세포 생장 및 바이러스 생산을 위해 배양 배지에 5-10% FBS가 존재해야 한다. 세포 배양 배지에 소에서 기인된 단백질을 이용하는 것에 대해 상당히 관심이 집중되는데, 그 이유는 일부 국가에서 소 해면형 뇌질환[Bovine Spongiform Encephalopathy(BSE)]이 발생되었기 때문이다. 최종 생성물에 오염 단백질 및 임의 우발적인 바이러스를 제거하기 위해 정밀하고, 복합적인 하류 정제 공정이 개발되어야 한다. 무혈청 293 현탁 배양이 개발되어, 유전자 치료법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 주요 개선된 공정이 될 것이다.
스피너 플라스크 및 3ℓ교반 탱크 반응기에서 바이러스 생산으로 인하여 293SF 세포의 세포 특이적인 바이러스 생산성이 2.5 ×104 vp/cell정도 되는데, 이는 293A 세포의 약 60-90%에 준하는 것이다. 그러나, 정체 세포 농도가 높기 때문에, 293SF 배양물의 용적용적 측정에 의한 바이러스 생산성은 293A 세포 배양물의 경우에 근본적으로 동일하다. 발명자들은 바이러스 감염시기에 새로운 배지로 교환하면 바이러스 생산이 상당히 증가된다는 것을 관찰하였다. 발명자들은 배지에 제한 인자들을 평가하였다.
이와 같은 발견들을 이용하면, 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 그 규모를 올리고, 효과적이고, 용이하게 평가할 수 있는 공정을 얻을 수 있다. 이와 같은 적응 방법은 293A 세포에만 국한시키는 것이 아니고, 다른 아데노바이러스 벡터 생산 세포에도 동일하게 적용할 수 있다.
3. 세포 수득 및 용해 방법
아데노바이러스가 감염되면 감염된 세포는 용해된다. 아데노바이러스 감염으로 인한 용해 특징은 두 가지 다른 방법으로 바이러스를 생산하게 한다. 한 가지는 세포 용해전에 감염된 세포를 수득하는 것이다. 다른 한 가지는 생산된 바이러스에 의해 세포 용해를 완료한 후에 바이러스 상청액을 수득하는 것이다. 후자의 경우에, 완전하게 세포를 용해하기 위해 배양 시간을 더 많이 요구한다. 바이러스 감염 후에 배양 시간을 연장하면 복제 반응성 아데노바이러스(RCA)가 발생될 가능성이 증가되는데 대해 염려가 생기는데, 특히 처음 생성되는 아데노바이러스 벡터(E1-결손된 벡터)가 된다. 따라서, 세포를 용해하기 전에 감염된 세포를 수득하는 방법을 선택한다. 표 1에는 세포 수득 후에 세포를 용해하는데 이용한 가장 흔한 방법을 나열한 것이다.
세포 용해에 이용된 방법
방법 Procedures 비고
냉동-해동 드라이아이스와 37℃ 물 수조 반복 실험실에서 실행 용이세포 용해 효과가 큼대량생산 안됨대규모 제조에 부적합.
고체 전단 French PressHughes Press 자본 장비 투자바이러스 포함이 문제경험 부족
계면활성제 용해 Tween, 트리톤, NP-40과 같은 비-이온성 계면활성제 실험실 및 대량생산 용이다양한 계면활성제 선택최종 생성물에 잔류 계면활성제가 문제
저장성 용액 용해 물, 시트르산 완충액 용해 효과가 낮음
액체 전단 HomogenizerImpinging JetMicrofluidizer 자본 장비 투자바이러스 포함이 문제대량생산이 문제
초음파 분쇄 초음파 자본 장비 투자바이러스 포함이 문제소음 공해대량생산이 문제
A) 계면활성제
세포는 막에 결합되어 있다. 세포 성분을 방출시키기 위해서는 세포를 개방할 필요가 있다. 가장 흔히 이용되는 방법은 계면활성제를 이용하여 막을 용해시키는 것이다. 계면활성제는 지방 또는 방향족 특성을 가지는 비극성 말단과 전하를 띄는 또는 띄지 않는 극성 단부를 가지는 양쪽성 분자이다. 계면활성제는 지질보다는 친수성이기 때문에 지질보다는 물에 용해도가 더 크다. 이로 인하여 수용성 배지에 물에 녹지않는 화합물을 분산시킬 수 있고, 이는 자연형태로 단백질을 분리하고 정제하는데 이용된다.
계면활성제는 변성 또는 비-변성일 수 있다. 전자의 경우는 도데실 설페이트 나트륨과 같은 음이온 또는 에틸 트리메틸 암모니움 브로마이드와 같은 양이온성이 된다. 이들 계면활성제는 완전하게 막을 분해하고 단백질-단백질 상호작용을 파괴하여 단백질을 변성시킨다. 비-변성 계면활성제는 TritonR X-100과 같은 비-음이온성 계면활성제, 콜레이트와 같은 담즙염, CHAPS와 같은 양쪽성 계면활성제로 나눌 수 있다. 양쪽성이란 동일한 분자에 양이온 및 음이온 기를 모두 포함한다는 것으로 양성 전하는 동일 또는 인접한 분자에 있는 음성 전하에 의해 중화된다.
SDS와 같은 변성 계면활성제는 단량체 단백질에 결합하여 포화될 때까지 반응을 평형으로 유도한다. 따라서, 단량체 자유 농도를 알면 필요한 계면활성제 농도를 알 수 있다. SDS 결합은 공조방식을 띄는데, 예로 들면 SDS가 한 분자에 결합하게 되면 또 다른 분자가 단백질에 결합되는 가능성을 증가시키게 되고, 단백질을 막대형으로 변형시켜 길이가 분자량에 비례하게 된다.
TritonR X-100와 같은 비-변성 계면활성제는 고유 모양에 결합하거나 공조적인 결합 방식을 가지지도 않는다. 이와 같은 계면활성제는 견고하고, 큰 비극성 부분을 가지고 있고, 물에 용해되는 단백질에 침투할 수 없다. 이들은 단백질의 소수성 부분에 결합한다. TritonR X100 및 다른 폴리옥시에틸렌 비-음이온성 계면활성제는 단백질-단백질간에 상호작용을 파괴하는데 효과가 없고 단백질을 인공적으로 응집시킨다. 그러나, 이와 같은 계면활성제는 단백질-단백질 상호작용을 파괴하나, 흴씬 부드럽게 파괴하여 단백질의 고유 형태를 유지할 수 있고, 기능을 유지할 수 있도록 한다.
여러 가지 방법으로 계면활성제를 제거할 수 있다. 단량체로 존재하는 계면활성제는 투석을 이용한다. 계면활성제가 이미 응집되어 미셀을 형성한 경우에는 투석이 효과가 없는데, 그 이유는 미셀이 너무 커서 투석을 통과할 수 없기 때문이다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있다. 파괴된 단백질 용액을 이온 크로마토그래피 컬럼에 얹고 컬럼은 계면활성제가 없는 완충액으로 세척한다. 계면활성제 용액과 완충액간에 평형이 이루어지면 계면활성제는 제거된 것이다. 또는 단백질 용액을 밀도 차를 통과시킬 수 있다. 단백질이 밀도차를 통하여 침전되면 계면활성제는 화학 전위로 인하여 빠져나오게 된다.
세포에서 발견되는 단백질 환경을 분석하고 단백질을 용해하는데 있어서 한 가지 계면활성제로는 불충분하다. 단백질을 한가지 계면활성제에 용해시키고 단백질 분석용으로 적절한 또 다른 계면활성제에 둔다. 제 1 단계에서 형성된 단백질 계면활성제 미셀은 순수한 계면활성제 미셀로부터 분리된다. 분석용 계면활성제를 과량으로 첨가하면, 단백질은 이들 두 종류의 계면활성제에 미셀에서 발견된다. 계면활성제-단백질 미셀을 분리하는 과정은 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토그래피, 투석 또는 부력(보이언트(buoyant)) 밀도 분리를 이용한다.
Triton R X-계면활성제: 이와 같은 종류의 계면활성제(TritonR X-100, X114, NP-40)는 동일한 기본 특징을 가지지만 소수성-친수성 특징은 다르다. 이들 이형 계면활성제 모두는 방향족 고리에 분지형 8-탄소 사슬이 부착되어 있다. 이 부분은 계면활성제의 소수성 특징 대부분에 기여한다. TritonR X 계면활성제를 이용하여 비-변성 조건하에 막 단백질을 용해시킨다. 단백질을 용해시키기 위해 계면활성제는 선택하는 경우에는 용해할 단백질의 소수성 특징에 따라 달라진다. 소수성 단백질은 이들을 효과적으로 용해하기 위해 소수성 계면활성제를 요구한다.
TritonR X-100 및 NP-40은 구조 및 소수성에 있어서 매우 유사하고, 세포 용해, 지질제거된 단백질 분해, 막 단백질 및 지질 용해 등의 대부분 분야에서 상호 교환할 수 있다. 일반적으로 2㎎ 계면활성제를 이용하여 1㎎ 단백질을 용해하거나 또는 지질 막 1㎎에 10㎎ 계면활성제를 이용한다. TritonR X-114는 친수성 단백질에서 소수성 부분을 분리하는데 이용한다.
Brij R 계면활성제: 이는 TritonR X 계면활성제와 구조상으로 유사한데, 이들은 소수성 사슬에 부착된 폴리옥시에틸렌 길이가 다양하다. 그러나, TritonRX 계면활성제와는 달리, BrijR계면활성제는 방향족 고리를 가지지 않으며 탄소쇄 길이를 다양하게 할 수 있다. 투석을 이용하여 용액으로부터 BrijR 계면활성제를 제거하는 것은 어렵지만 계면활성제 제거 겔을 이용하면 제거할 수 있다. BrijR58은 소수성/친수성 특징에서 TritonRX100에 가장 근접하다. BrijR-35는 HPLC 과정에 가장 흔히 이용되는 계면활성제이다.
투석가능한 비이온성 계면활성제: η-옥틸-β-D-글루코시드(옥틸글루코피라노시드)와 η-옥틸-β-D-티오글루코시드(옥틸글루코피라노시드, OTG)는 용액으로부터 용이하게 투석되는 비변성 비이온성 계면활성제이다. 이들 계면활성제는 막 단백질을 용해하는데 이용되고, 280㎚에서 낮은 UV 흡수도를 가진다. 옥틸글루코시드는 23-25mM의 높은 CMC를 가지고, 이는 막 단백질을 용해하는 경우에 1.1-1.2% 농도로 이용된다.
옥틸글루코시드를 우선 합성하여 또 다른 옥틸글루코시드를 제공한다. 옥틸글루코시드는 제조 단가가 비싸고, β-글루코시다제에 의해 가수분해되기 때문에 생물학계에 일부 고유 문제점을 가진다.
Tween R 계면활성제: TweenR 계면활성제는 비변성, 비이온성 계면활성제이다. 이들은 지방산 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르이다. TweenR 20 및 TweenR 80 계면활성제를 생화학분야에서 차단제로 이용하고, 단백질 용액에 첨가되어 플라스틱 또는 니트로셀룰로오즈등과 같은 소수성 물질에 비특이적으로 결합하는 것을 방지한다. 이들은 ELISA 및 블랏팅에서 차단제로 이용된다. 일반적으로 이들 계면활성제는 소수성 물질에 비특이적인 결합을 방지하기 위해 0.01-1.0% 농도로 이용된다.
TweenR 20 및 다른 비이온성 계면활성제는 니트로셀룰로오즈 표면으로부터 일부 단백질을 제거하는 것으로 보인다. TweenR 80을 이용하여, 다중웰 플라스틱 조직 배양 플레이트에 단백질의 비특이적인 결합을 제공하는 막 단백질을 용해시키고, ELISA에서 폴리스테렌 플레이트에 혈청 단백질 및 바이오티닐화된 단백질 A의 비특이적인 결합을 감소시킨다.
계면활성제간에 차이는 지방산 쇄 길이에 있다. TweenR 80은 C18 사슬인 올레산에서 유도한 것이고, TweenR 20은 C12 사슬인 라우린산에서 유도된 것이다. 지방산 사슬을 길게 할수록 TweenR 20 계면활성제보다 친수성이 적은 TweenR 80 계면활성제를 만들게 된다. 이들 두가지 계면활성제는 물에 잘 용해된다.
TweenR 계면활성제는 투석을 이용하여 용액으로부터 제거하는 것이 어렵지만, TweenR 20은 계면활성제 제거 겔을 이용하여 제거할 수 있다. 이들 계면활성제에 있는 폴리옥시에틸렌 사슬이 이들을 산화되게 하고(과산화물 형성), 이는 TritonRX 및 BrijR 계면활성제에서 마찬가지이다.
쯔비터 계면활성제: 쯔비터 계면활성제, CHAPS는 콜린산의 설포베탄 유도체이다. 쯔비터 계면활성제는 단백질 활성이 중요할 경우에 막 단백질을 용해시키는데 유용하다. 이와 같은 계면활성제는 pH 범위가 2-12인 광역에서 유용하고, CMCs(8-10mM)이 높기 때문에 투석에 의해 용액으로부터 용이하게 제거된다. 이와 같은 계면활성제는 280㎚에서 흡수도가 낮기 때문에, 이는 이 파장에서 단백질 모니터가 필수적인 경우에 유용하다. CHAPS는 BCA 단백질 에세이와 필적할 수 있는 것으로, 이는 계면활성제 제거 겔을 이용하면 용액으로부터 제거할 수 있다. CHAPS 존재하에 단백질을 요오도화시킬 수 있다.
CHAPS를 이용하여 고유 막 단백질 및 수용체를 용해시키고, 단백질의 기능 성능을 유지시킬 수 있다. 사이토크롬 P-450을 TritonR X-100 또는 콜레이트 나트륨에서 용해시키면 응집이 형성된다.
B) 비-계면활성제 방법
적절하지는 않지만, 다양한 비-계면활성제 방법을 본 발명의 다른 장점과 함께 이용할 수 있다.
냉동-해동: 이는 부드럽고 효과적인 방법으로 세포를 용해하는데 널리 이용되는 기술이다. 세포는 완전하게 냉동될 때까지 드라이아이스/에탄올 조에서 일반적으로 신속하게 냉동시키고, 완전하게 해동될 때까지 37℃ 조에 옮긴다. 이와 같은 반복과정을 수차례 되풀이하여 완전하게 세포를 용해시킨다.
초음파분쇄: 세포를 파괴하는데에는 고진동수 초음파 진동기가 유용하다. 초음파에 의해 세포를 파괴하는 방법은 완전하게 밝혀지지는 않았지만, 현탁액에 초음파 진동을 제공하면, 높은 전이 압력이 발생된다. 이 기술의 주요 단점은 상당량의 열이 발생된다. 열 영향을 최소한으로 줄이기 위해서, 특별히 고안된 유리 용기를 사용하여 세포 현탁액을 보유한다. 이와 같은 고안은 현탁액이 초음파 프로브에서 용기 외부로 순환하게 하는데, 용기 밖에는 플라스크가 얼음 위에 부유되어 있다.
고압 압출: 미생물 세포를 파괴하는데 이 방법이 주로 이용된다. 프렌치 프레스는 세포를 파괴하기 위해 10.4 ×107 Pa(16,000 p.s.i) 압력을 이용한다. 이와 같은 장치는 바늘 벨브에 의해 외부로 개방되는 스테인레스 강 챔버로 구성된다. 바늘 벨브가 닫힌 상태에서 세포 현탁액을 쳄버에 넣는다. 챔버를 뒤집은 후에, 벨브를 열고, 쳄버내에 있는 공기를 빼내기 위해 피스톤을 누른다. 벨브가 닫힌 위치에 있는 경우에, 쳄버는 원래 위치로 되돌리고, 고체 베이스위에 얹고, 유압 프레스를 이용하여 피스톤에 필요한 압력을 가한다. 일정 압력에 도달하면, 바늘 벨브는 마찰에 의해 개방하여, 압력을 약간씩 방출시키고, 이에 따라 세포가 확장되어 파열된다. 압력을 유지하는 동안에는 벨브를 열린 상태로 유지시키고, 소량의 파열된 세포가 모이게 된다.
고체 전단 방법: 500㎚ 직경의 유리 비드 존재 하에 현탁액을 왕성하게 진동시키는(300-3000time/min) Mickle 쉐이크를 이용하여 마찰에 의해 기계적으로 전단시킬 수 있다. 이 방법을 이용하면 기관을 파괴할 수 있다. 좀더 제어된 방법은 Hughes 프레스를 이용하는 것인데, 이 프레스에서 피스톤은 마찰에 의해 대부분 세포에 힘을 가하거나 또는 압력 쳄버에 있는 0.25㎜ 직경 슬롯을 통하여 냉동된 세포에 힘을 가한다. 세균 준비물을 용해시키는데에는 최고 5.5 ×107 Pa(8000p.s.i.)를 이용한다.
액체 전단 방법: 이와 같은 방법은 고속 왕복 또는 회전 날을 이용하는 믹서, 상하로 움직이는 플랜져 및 볼을 이용하는 균질화기(호모지나이져), 마이크로유동화기 또는 작은 직경 튜브를 통하여 고속 통과시키는 또는 두 개 유체 흐름을 고속 충돌시키는 충돌 제트를 이용한다. 믹서의 날이 서로 다른 기울기를 가지고 있어 효과적으로 혼합을 하도록 한다. 균질화기는 통상 수초 내에 고속으로 작동시켜 국소적으로 열이 발생되는 것을 최소화시킨다. 이와 같은 기술은 미생물 세포에는 적합하지는 않지만, 매우 부드러운 액체 전단은 동물 세포를 파괴시키는데 적절하다.
저장성/고장성 용액 방법: 세포를 매우 낮은(저장성) 또는 매우 높은(고장성) 용질 농도를 가지는 용액에 노출시킨다. 용질 농도를 상이하게 하여 삼투압 농도차를 만든다. 저장성 환경에서 세포에 물이 유입됨으로써 세포가 팽창되고 파열된다. 고장성 환경에서 세포 밖으로 물이 흘러 나가 세포가 줄어들고, 결과적으로 파열된다.
4. 농축 및 여과 방법
본 발명의 한 가지 특징은 세포 용해물질로부터 아데노바이러스를 정제하는 방법을 이용한다. 이와 같은 방법에는 정화, 농축, 여과등을 포함한다. 정제 과정의 초기 단계는 세포 용해물질을 정화하여 큰 입자 특히 세포 성분을 세포 용해물질로부터 제거한다. 용해물질을 정화하기 위해 강한 필터를 이용하거나 접선 방향 이동 여과를 이용한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 세포 용해물질을 강한 필터로 통과시키는데 필터는 상대적으로 흡수성이 없는 물질(가령, 폴리에스테르 수지, 모래, diatomeceous 토양, 콜로이드, 겔등)이 채워진 컬럼으로 구성된다. 접선 방향 흐름 여과(TFF)의 경우에, 용해질 용액이 막 표면을 가로질러 막 표면으로부터 용액으로 용질의 역 확산을 실행한다. 개방된 채널 플레이트, 프레임, 동공 섬유, 튜브 등을 포함하는 다양한 형태의 필터 장치 내에 막이 배열되어 있다.
세포 용해물질의 정화 및 선여과후에, 생성된 바이러스 상청액을 우선 농축시키고, 완충액은 여과를 통하여 교환된다. 바이러스 현탁액은 100-300K 분자량 차단하는 한외여과 막을 통한 접선 이동 여과에 의해 농축된다. 한외여과는 분자량, 모양, 전하 등에 의해 종류를 분리하기 위해 반투막을 이용하는 압력-변형된 대류 공정이 된다. 이는 용질 분자량 크기와는 무관하게 다양한 크기의 용질로부터 용매를 분리한다. 한외여과는 온화하고, 효과적인데, 이를 이용하면 농축 및 용액에서 염을 제거할 수 있다. 한외여과 막은 일반적으로 두 가지 별개 층을 가지는데; 박층(0.1-1.5㎛), 구멍 크기가 10-400Å인 조밀한 스킨, 한외필터의 침투 측면에 상대적으로 크게 열린 것과 같은 점진적으로 개방된 구멍을 가지는 개방 하부구조로 구성된다. 스킨의 구멍을 통과할 수 있는 임의 종류는 막을 자유롭게 통과한다. 용질이 최대로 보유되도록 하기 위해, 막은 보유하고자하는 종의 분자량 이하의 분자량을 차단하는 막으로 선택한다. 거대분자를 농축하는 경우에, 막에는 원하는 생물학적 종이 많이 함유되고, 보유된 물질이 없는 여과물을 제공한다. 용매와 대류에 의해 미세한 용질을 제거한다. 보유된 용질의 농도가 증가될 때, 한외여과 속도가 감소된다.
한외필터를 이용하여, 디아필터레이션(diafiltration), 완충액 교환 등은 결합된 종류로부터 염, 당, 비-수용성 용매의 제거 및 교환, 저분자량 물질 제거, 이온 및 pH 환경의 신속한 변경을 하는데 이상적인 방법이 된다. 미세용질은 한외여과 속도와 동일한 속도에서 한외여과되는 용액에 용질을 첨가하여 대부분 효과적으로 제거할 수 있다. 일정한 용적에서 용액으로부터 미세한 종을 씻어내고, 보유된 종을 정제한다. 본 발명은 BenzonaseR 처리 전에 바이러스 상청액 완충액을 교환하기 위해 디아필터레이션을 이용한다.
5. 바이러스 감염
한 실시예로 본 발명은 치료요법적으로 중요한 벡터를 만들기 위해 세포에 아데노바이러스 감염을 이용한다. 일반적으로 바이러스를 생리적인 조건하에 적절한 숙주 세포에 간단히 노출시켜 바이러스가 숙주 세포로 들어가도록 한다. 아데노바이러스를 예를 든 것이지만, 본 발명은 하기에서 설명하는 다른 바이러스성 벡터를 이용할 수도 있다.
A) 아데노바이러스
아데노바이러스는 이의 DNA 게놈 크기가 중간정도이고, 조작이 용이하고, 역가가 높으며, 광범위한 표적 세포를 가지고, 감염성이 높기 때문에 유전자 전달 벡터에 특이 적절하게 이용된다. 대충 36 kB 바이러스 게놈에 100-200bp 역전된 말단 반복부(ITR)가 연결되어 있는데, 바이러스 DNA 복제 및 패키지를 실시하는데 필수적인 cis-acting 원소를 포함한다. DNA 복제 개시에 의해 상이한 전사 단위를 포함하는 게놈의 초기(E)부분 및 후기(L) 부분으로 나뉜다.
E1 부분(E1A과 E1B)은 바이러스 게놈의 전사 조절 및 몇 가지 세포 유전자에 해당되는 단백질을 인코드한다. E2 부분(E2A과 E2B)이 발현되면 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질이 합성된다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현, 숙주 세포 차단증에 관여한다(Renan, 1990). 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 방출된 한 개 일차 전사체가 프로세스된 후에 바이러스 캡시드(capsid) 단백질 대부분을 포함하는 후기 유전자(L1, L2, L3, L4, L5) 생성물이 발현된다. MLP(16.8 map 단위에 위치)는 감염 후기 상에 특히 효과적인데, 이 프로모터에 의해 방출된 모든 mRNA들은 5'삼중부분 리더(TL) 서열을 가지는데, 이는 해독에 적절한 mRNA를 만든다.
아데노바이러스가 유전자 요법에 적합하도록 하기 위해, 큰 DNA 단편을 포함할 수 있도록 운반 용량을 최대화해야한다. 또한 특정 아데노바이러스 생산물과 연관된 독성 및 면역학적 반응을 줄일 필요가 있다. 아데노바이러스 게놈의 상당 부분을 제거하고, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 세포를 이용하여 in trans 결손 유전자 생성물을 제공하면, 벡터내에 상당한 부분의 이형 DNA를 삽입할 수 있다. 이와 같은 방법으로 아데노바이러스 유전자 생성물의 독성 및 면역원성을 줄일 수 있다.
바이러스 DNA 복제에 요구되는 모든 cis 요소가 역전된 말단 반복부위(ITR)(100-200 bp)에 선형 바이러스 게놈 양단에 위치하고 있기 때문에 큰 DNA 치환이 가능하다. ITR's를 포함하는 플라스미드는 비-결손 아데노바이러스 존재 하에 복제될 수 있다(Hay et al., 1984). 따라서, 이들 원소들을 아데노바이러스 벡터에 포함시키면 복제를 할 수 있다.
또한, 바이러스 캡을 씌우기 위한 패키지 시그날이 바이러스 게놈의 좌측 단부 194-385 bp(0.5-1.1 map units)에 위치한다(Hearing et al., 1987). 이 시그날은 박테리오파아지 λDNA에 있는 단백질 인지 부위와 유사한데, 특정 서열은 죄측 말단에 근접하나 접착말단 서열의 외측은 머리 구조안으로 DNA를 삽입하는데 요구되는 단백질에 결합을 중재한다. 아데노바이러스의 E1 치환 벡터를 보면 바이러스 게놈의 좌측 말단에 450bp(0-1.25 map units)가 293 세포에서 패키지에 관계한다는 것을 설명한다(Levrero et al., 1991).
이미, 아데노바이러스 게놈의 특정 부분이 포유류 세포의 게놈에 결합되고, 이에 의해 인코드된 유전자가 발현된다는 것을 확인하였다. 이들 세포주는 세포주에 인코드된 아데노바이러스 기능이 결손된 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원할 수 있는 능력이 있다. 또한 "helping" 벡터(가령, 야생형 바이러스 또는 조건적으로 결손된 돌연변이체)를 이용하여 복제 결손된 아데노바이러스 벡터의 상보성에 대해 설명된 바 있다.
복제 결손 아데노바이러스 벡터는 헬퍼 바이러스에 의해 in trans에서 상보적일 수 있다. 이와 같은 관찰만으로 복제-결손 벡터를 분리할 수 있는 것은 아니지만, 복제 기능을 제공하기 위해 필요한 헬퍼 바이러스가 존재하여 임의 준비물을 오염시킬 수 있다. 따라서, 복제-결손 벡터의 복제 및 패키지에 특이성을 제공하기 위해 추가 원소가 필요하다. 본 발명에서 제공되는 바와 같이, 이와 같은 원소는 아데노바이러스의 패키지 기능에서 유도된다.
아데노바이러스의 패키지 시그날은 통상적인 아데노바이러스 지도의 좌측 말단에 존재하는 것으로 밝혀졌다(Tibbetts, 1977). 후속에 연구에 따르면, 게놈의 E1A(194-358 bp) 부분이 결손된 돌연변이는 세포주가 초기 기능(E1A)을 보완하더라도 생장이 나쁜 것으로 나타났다(Hearing and Shenk, 1983). 상보적인 아데노바이러스 DNA(0-353 bp)를 돌연변이의 우측 말단에 복합시키면, 바이러스는 정상적으로 패키지된다. 또한 돌연변이 분석에 따르면, Ad5 게놈의 좌측 말단에 짧은 반복된 위치에 의존성인 원소를 확인하였다. 이것이 게놈의 단부에 존재하는 경우에 반복체 1개 복사체만으로도 효과적인 패키지에 충분한 것으로 나타났는데, 이것이 Ad5 DNA 분자의 내부 쪽으로 이동하면, 이것만으로는 불충분하다(Hearing et al., 1987).
돌연변이된 패키징 시그날을 이용하면, 다양한 효과로 패키지되는 헬퍼 바이러스를 만들 수 있다. 일반적으로 돌연변이는 점 돌연변이 또는 결손 돌연변이가 된다. 패키지 효과가 낮은 헬퍼 바이러스를 헬퍼 세포에서 생장시키는 경우에, 야생형 바이러스와 비교할 때, 바이러스는 비록 패키지되기는 하지만 그 비율은 감소되어 바이러스가 증식된다. 이와 같은 헬퍼 바이러스를 야생형 패키지 시그날을 포함하는 바이러스와 함께 세포에서 생장을 시키면 야생형 패키지 시그날이 돌연변이된 시그날보다 우선적으로 인지된다. 한정된 양의 패키지 인자를 제공하는 경우에, 야생형 시그날을 포함하는 바이러스는 헬퍼 바이러스와 비교하였을 때 선택적으로 패키지된다. 선호정도가 상당히 큰 경우에는 거의 균질한 원액을 얻을 수 있다.
B) 레트로바이러스
본 발명에서는 치료요법적으로 중요한 벡터를 만드는데 세포에 아데노바이러스 감염을 이용하였지만, 본 발명에서 이와 같은 벡터를 만드는 목적으로 레트로바이러스를 이용하여 세포에 감염시킬 수도 있다. 레트로바이러스는 역전사 과정에의해 감염된 세포에서 이들 RNA를 이중 가닥 DNA로 전환시키는 능력을 가지는 단일 가닥 RNA 바이러스 군이다(Coffin, 1990). 생성된 DNA는 세포 염색체에 안정적으로 결합되어 프로바이러스가 되고, 바이러스 단백질을 직접 생산한다. 이와 같이 염색체에 결합함으로써 이를 수용한 세포 및 이들의 후손세포에 바이러스 게놈 서열이 유지되게 된다. 레트로바이러스 게놈에는 세 가지 유전자 즉 gag, pol, env -이 있는데, 이들은 각각 캡시드 단백질, 폴리메라제 효소, 외피 성분을 각각 코드한다. gag 유전자의 상류에서 발견되는 서열(Y라고 칭함)은 게놈이 비리온으로 패키지되는 시그날 역할을 한다. 두 개의 긴 말단 반복부위(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 와 3' 말단에 존재한다. 여기에는 강한 프로모터 및 인헨서 서열이 포함되고, 이는 숙주 세포 게놈에 결합되는데 필요하다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터를 만들기 위해서, 프로모터를 인코드하는 핵산을 바이러스 게놈의 특정 서열 부위에 삽입하여 복제-결함 바이러스를 만든다. 바리온을 만들기 위해, gag, pol, env 유전자를 포함하나, LTR 및 Y 성분이 없는 패키지 세포주를 만든다(Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 Y 서열과 함께 사람 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드를 이 세포주에 도입시키면(예를 들면 인산칼슘 침전법을 이용함), Y 서열이 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자로 패키지하고, 이를 배양 배지에 분비한다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수득하여, 선택적으로 농축시키고 이를 유전자 전달에 이용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포형에 감염될 수 있다. 그러나, 합체 및 안정적으로 발현을 하기 위해서는 숙주 세포의 분할을 요한다(Paskind et al., 1975).
레트로바이러스 벡터만을 특정하게 표적으로 하기 위한 새로운 방법이 최근에 개발되었는데, 이는 바이러스 외피에 칼락토즈 잔기를 화학적으로 첨가하여 레트로바이러스를 화학적으로 변형하는 것에 기초한다. 이와 같은 변형으로 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체를 통하여 간세포와 같은 세포에 특정하게 감염될 수 있다.
재조합 레트로바이러스를 표적화하는 다른 방법은 레트로바이러스 외피 단백질에 대한 바이오티닐화된 항체 및 특정 세포 수용체에 대한 항체를 이용하는 것이다. 항체는 스트렙타아비딘을 이용하여 바이오틴 성분에 결합시킨다(Roux et al., 1989). 조직적합성 복합체 I 및 II 항원에 대한 항체를 이용하여, 이들 표면 항원을 포함하고 있는 다양한 사람 세포에 외생 바이러스를 in vitro에서 감염시킨다고 설명하고 있다(Roux et al., 1989).
C) 다른 바이러스성 벡터
본 발명에서 설명하는 발현 구조에 다른 바이러스성 벡터를 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), 아데노-연합 바이러스(AAV)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984), 허피스바이러스등의 바이러스에서 유도된 벡터를 이용한다. 이들 바이러스는 다양한 포유류 세포내로 유전자를 전달하는데 이용할 수 있는 몇 가지 특징을 제공한다.
6. 바이러스 벡터의 조작
특정 구체예에서, 본 발명은 바이러스 벡터를 조작하는 것을 제공한다. 이와 같은 방법은 원하는 유전자를 인코드하는 이형 DNA 및 이를 발현시키고, 적절한 숙주 세포에서 벡터를 복제시키는 수단을 포함하는 벡터 구조를 이용하여 이로부터 생산된 바이러스 입자를 수득하고, 재조합 바이러스 입자를 세포에 감염시키는 것으로 구성된다. 유전자는 원하는 단백질을 다량 인코드하는 것으로 in vitro에서 대규모 생산을 하는 것이다. 또한, 유전자는 암 세포를 치료하는 치료요법 유전자가 될 수 있어, 면역조절 유전자를 발현시켜 바이러스 감염과 싸우거나 유전자 결함으로 인한 유전자 기능을 복귀시킨다. 유전자 치료법 벡터에서 유전자는 이형 DNA가 되는데, 이는 벡터의 기본구조를 제공하는 바이러스 게놈이외의 다른 소스로부터 유도된 DNA를 포함한다는 것이다. 마지막으로 바이러스는 살아있는 바이러스 백신으로 작용하여 원하는 항원에 대한 항체를 생산하기 위해 항원을 발현한다. 유전자는 박테리아, 바이러스, 이스트, 기생충, 식물 또는 동물과 같은 원핵 또는 진핵 세포 소스에서 유도할 수 있다. 이형 DNA는 한가지 이상의 소스로부터 유도할 수도 있는데, 예를 들면, 다중 유전자 구조 또는 융합 단백질이 될 수 있다. 이형 DNA에는 한 가지 소스로부터 유도된 조절 서열 및 또 다른 소스에서 유도된 유전자를 포함할 수 있다.
A) 치료요법적 유전자
p53은 종양 억제 유전자로 인지되고 있다(Montenarh, 1992). 화학적 종양 발생, 자외선 투과, SV40를 포함한 몇 가지 바이러스에 의해 형질변환된 많은 세포에서 상당 수준의 돌연변이 p53이 발견되었다. p53 유전자는 다양한 사람 종양에서 돌연변이 비활성화에 주로 사용되는 표적으로, 사람에서 흔한 암에서 가장 빈번하게 돌연변이된 유전자로 알려져있다(Mercer, 1992). 사람의 NSCLC(Hollestein et al., 1991)의 50% 이상, 다양한 범위의 다른 종양에서 돌연변이 되었다.
p53 유전자는 큰-T 항원 및 E1B와 같은 숙주 단백질과 복합체를 형성하는 393-아미노산 인산단백질을 인코드한다. 단백질은 정상 조직 및 세포에서도 발견되나 형질변환된 세포 또는 종양 조직에서 발견되는 것과 비교하면 그 농도가 일반적으로 낮다. 흥미로운 것은, 야생형 p53은 세포 생장 및 분열을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 일부 경우에 사람 종양 세포 주에서 야생형 p53이 과발현되어 항-증식성을 제공하기도 한다. 따라서, p53은 세포 생장의 음성 조절물질로 작용하고(Weinberg, 1991), 생장이 조절안되는 세포를 직접적으로 억제하거나 이와 같은 생장을 억제하는 유전자를 간접적으로 활성화시킨다. 따라서, 야생형 p53이 없거나 비활성화되면 형질변형이 될 수 있다. 그러나, 일부 연구에 따르면, 유전자의 형질변환 능력을 완전하게 발현하는데 돌연변이 p53이 필수적이라는 것이다.
야생형 p53은 많은 세포 형에서 중요한 생장 조절 물질로 인지되고 있다. p53 유전자의 경우에 미스센스 돌연변이가 가장 일반적인 것으로 이는 적어도 30개 별개 코돈에서 발생되는 것으로 알려져 있는데, 가끔씩은 동형접합성을 감소시키지 않으면서 세포 표현형을 변형시키는 우성 대립유전자를 만든다. 또한, 이들 많은 우성 네가티드 대립유전자의 대부분이 유기체에 내성이 있어, 생식세포계열에 전달된다. 다양한 돌연변이 대립유전자는 최소한 기능이상에서 강력한 침투성, 우성 네가티브 대립유전자 범위로 나타난다(Weinberg, 1991).
Casey 와 그의 동료들은 두 가지 사람 유방암 세포주안으로 야생형 p53을 인코드하는 DNA를 트랜스펙션시키면 이들 세포에서 생장 억제 조절이 복귀된다고 보고하고 있다(Casey et al., 1991). 사람 폐암 세포주에 돌연변이형이 아닌 야생형 p53을 트랜스펙션시킬 경우에도 유사한 결과가 나온다(Takahasi et al., 1992). p53은 돌연변이 유전자에 대해 우성이고, 돌연변이 유전자를 세포에 트랜스펙스시켰을 경우에 증식에 대해 선택할 수 있다. 트랜스펙트된 p53이 정상적으로 발현되는 것이 내생 야생형 p53을 가지는 정상 세포에 유해한 것은 아니다. 따라서, 이와 같은 구조는 다른 부작용 없이 정상 세포에 제공할 수도 있다. p53-관련된 암을 야생형 p53 발현 구조를 이용하여 치료하면 악성 종양 세포의 수가 감소되거나 이들의 생장 속도가 감소된다. 또한, 최근 연구에 따르면, 일부 p53 야생형 종양이 외생 p53 발현 효과에 감응성이 있다는 것이다.
사이클린 의존성 카이나제 또는 CDK에 의해 진핵 세포의 주요 전이가 자극을 받는다. 한 가지 CDK, 사이클린-의존성 카이나제 4(CDK4)는 G1 상을 통하여 진행을 조절한다. 이 효소의 활성은 후기 G1-에서 Rb를 포스포릴화시킨다. CDK4 활성은 서브유닛 D-사이클린 및 저해 서브유닛 p16INK4으로 조절되는데, 이 저해 서브유닛은 CDK4에 특이적으로 결합하여 이를 저해하는 단백질의 생화학적 특징으로 가지기 때문에 Rb 포스포릴화반응을 조절할 수 있다(Scrrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). p16INK4 단백질이 CDK4 저해물질이기 때문에(Serrano, 1993), 이 유전자가 결손되면 CDK4의 활성이 증가되어, Rb 단백질이 과다하게 포스포릴화된다. p16은 CDK6 기능을 조절하는 것으로 알려져있다.
p16INK4 은 새로 분류된 CDK-저해 단백질에 속하는데, 여기에는 p16B, p21WAF1.CIP1.SDII, p27KIP1이 포함된다. p16INK4 유전자는 많은 종양 형에서 주로 결손되는 염색체 부분인 9p21로 지도된다. 사람 종양 세포주에서는 p16INK4 유전자의 상동접합성 결손 및 돌연변이가 빈번하다. 이는 p16INK4 유전자가 종양 억제 유전자라는 것을 말하는 것이다. 그러나, p16INK4 유전자 변경의 빈도가 배양된 세포주보다는 부로 배양안된 종양에서 더 낮다는 것을 관찰한 후로는 이와 같은 해석이 변화되고 있다(Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994a; Kamb et al., 1994b; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). 플라스미드 발현 벡터로 트랜스펙션에 의해 야생형 p16INK4 기능이 복원되면 일부 사람 암 세포주에 의한 콜로니 형성이 감소된다(Okamoto, 1994; Arap, 1995).
C-CAM은 실제 모든 상피 세포에서 발현된다(Odin and Obrink, 1987). 105kD의 표면 분자량을 가지는 C-CAM은 세포 응집을 중화시키는 특정 항체와 반응을 시켜 쥐 간세포의 혈장 막에서 원래 분리한 것이다(Obrink, 1991). 최근 연구에 따르면, 구조적으로 C-CAM은 이뮤노글로블린(Ig) 슈퍼패밀리에 속하고, 이의 서열은 카르시노임브로이닌 항원(CEA)과 상동성이 매우 크다(Lin and Guidotti, 1989). 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여, Cheung et al.,(1993a; 1993b and 1993c)은 C-CAM의 처음 Ig 도메인이 세포 흡착 활성에 중요하다는 것을 설명하였다.
세포 흡착 분자 또는 CAM은 기관 발생 및 세포 분화를 조절하는 복합한 과정의 분자 상호작용에 관여하는 것으로 알려져 있다(Edelman, 1985). 최근 연구에 따르면, CAMs의 이상 발현은 몇 가지 신형성 종양 발생과 관련이 있는데 예를 들면, 주로 상피세포에서 발현되는 E-cadherin의 발현이 감소되어 몇 가지 종류의 신형성이 진행과 연관이 있다(Edelman and Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). 또한, Giancotti and Ruoslahti(1990)는 유전자 전달에 의해 α5β1 인테그린의 발현이 증가되면 in vivo에서 차이니즈 헴스터 오바리 세포의 종양형성능이 감소될 수 있다. C-CAM은 in vitro 및 in vivo에서 종양 생장을 억제하는 것으로 보인다.
본 발명에 따라 이용된 다른 종양 억제물질에는 RB, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, BRCA1, VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, C-CAM, p27, BRCA2을 포함한다. Bax, Bak, Bcl-X57 Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad, ICE-CED3 프로테아제와 같은 아포프토시스를 유도하는 것도 본 발명에 따라 이용할 수 있다.
본 발명에 따르면 다양한 효소 유전자가 관심을 끈다. 이와 같은 효소에는 시토신 디아미네이즈, 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 갈락토즈-1-포스페이트 우리딜트란스퍼라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, α-L-이두로니다제, 글로코오즈-6-포스페이트 디하이드로게나제, HSV 티미딘 카이나제, 사람 티미딘 카이나제등을 포함한다.
여기에서 설명하는 벡터에 이용될 수 있는 또 다른 유전자 군으로는 호르몬이 있다. 호르몬에는 생장 호르몬, 프로악틴, 태반 락토겐, 황체 호르몬 낭포-자극 호르몬, 만성 고나도트로핀, 흉선-자극 호르몬, 렙틴, 아데노크로티코트로핀(ACTH), 앙지오텐신 I, II, β-엔드로핀, β흑색종 자극 호르몬(β-MSH), 콜레사이토킨, 엔도테린 I, 갈라닌, 위장 저해 펩티드(GIP), 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀, 뉴로피신, 소마토스태틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), β-칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 악성 종양 인자의 과칼슘혈증(1-40), 부갑상선 호르몬-관련 단백질(107-139)(PTH-rP), 부갑상선 호르몬 관련 단백질(107-111)(PTH-rP), 글루카곤-유사 펩티드(GLP-1), 판크레아스틴, 췌장 펩티드, 펩티드YY, PHM, 시크리틴, 혈관 활성 내장 펩티드(VIP), 옥시토신, 바소프레신(AVP), 바소토신, 엔케팔린아미드, 메트로피나미드, 알파 흑색구 자극 호르몬(alpha-MSH), 실 나트륨이뇨성 인자(5-28)(ANF), 아밀린, 아밀로이드 P 성분(SAP-I), 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH), 생장 호르몬 방출 인자(GHRH), 황체화 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 뉴로펩티드 Y, 물질 K(neurokinin A), 물질 P, 티로트로핀 방출 호르몬(TRH)등이 포함된다.
본 발명의 벡터에 삽입할 수 있는 다른 종류의 유전자에는 인터루킨 및 사이토킨을 포함한다. 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF.
현재 바이러스 벡터를 이용할 수 있는 질병으로는 아데노신 디아미네이즈 결손, 혈우병 B에서 사람 혈액 응고 인자 IX 결손, 방광 섬유증(이는 방광 섬유증 막통과 수용체 유전자의 치환과 관련됨)등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 본 발명에서 구체화된 벡터는 류마티스 관절염과 같은 과증식성 질환 또는 재협착증은 맥관형성 저해물질 또는 세포 과정 저해물질을 인코드하는 유전자를 전달하여 치료할 수 있다. HSV-TK 유전자와 같은 프로드럭(prodrug) 활성물질을 전달하여 암을 포함하는 과증식성 질환을 치료한다.
B) 안티센스 구조물
ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl 와 같은 온코진이 적절한 표적이 된다. 그러나, 치료요법적 장점을 위해, 이와 같은 온코진은 안티센스 핵산으로 발현되어 온코진의 발현을 저해한다. "안티센스 핵산"은 온코진을 인코드하는 DNA 및 RNA 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 말한다. 표적 세포로 도입시켰을 때 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 이들의 표적 핵산에 결합하여 전사, RNA 프로세싱, 수송 또는 해독을 방해한다. 올리고뉴클레오티드를 이중 가닥(ds) DNA에 제공하면 삼중 나선이 형성되고, RNA를 표적으로 하면 이중 나선이 형성된다.
안티센스 구조는 프로모터, 다른 기준 부분, 엑손, 인트론 또는 유전자의 엑손-인트론 경계에 결합되도록 한다. 안티센스 RNA 구조 또는 이와 같은 안티센스 RNA를 인코드하는 DNA를 이용하면 in vitro 또는 in vivo 상태에서 사람을 포함하는 숙주 세포내에서 유전자 전사 또는 해독 또는 둘 다를 저해할 수 있다. "상보적인 뉴클레오티드"로 구성된 핵산 서열은 표준 Watson-Crick 상보 규칙에 따라 염기쌍을 이룰 수 있다. 즉, 큰 퓨린은 적은 피리미딘과 염기쌍을 형성하여 구아닌은 시토신과 복합하고(G:C), 아데닌은 DNA의 경우에 티민과 염기쌍을 이루고(A:T), RNA의 경우에는 우라실과 염기쌍을 이룬다(A:U).
여기에서 사용된 바와 같이, "상보적인" 또는 "안티센스 서열"이란 전체 길이를 통하여 실제 상보적인 핵산 서열로 잘못 짝지어진 것이 거의 없는 것을 말한다. 예를 들면, 길이가 15개인 핵산 서열은 한 개 또는 두 개가 잘못짝지어진(mismatch) 13 또는 14개 위치에서 상보적인 서열을 가지는 것을 말한다. 원래, "완전히 상보적인" 핵산 서열은 전체 길이를 통하여 완전하게 상보적인 핵산 서열로 잘못 짝지어진 것이 없는 서열이다.
유전자 서열 전부 또는 일부를 안티센스 구조물에 이용하면, 통계학적으로 17개 염기를 가지는 임의 서열만이 사람 게놈에서 발생되는데, 이는 독특한 표적 서열을 지정하는데에는 충분하다. 더 짧은 올리고머는 만들기에도 용이하고, in vivo에서 접근성이 좋지만, 하이브리드반응 특이성을 결정하는데에는 상당수 다른 인자가 관련된다. 올리고뉴클레오티드가 이의 상보적인 표적에 결합하는 결합 친화력 및 서열 특이성은 길이가 증가함에 따라 증가된다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 염기쌍을 가지는 올리고뉴클레오티드를 이용할 수도 있다. 내생 유전자의 기능이 영향을 받는지 또는 상보적인 서열을 가지는 관련 유전자의 발현이 영향을 받는지를 결정하기 위해 in vitro에서 구조물을 검사함으로써, 이에 상응하는 숙주 세포 유전자에 표적화되는데 주어진 안티센스 핵산이 효과적인지를 결정할 수 있다.
특정 구체예에서, 안티센스 구조물에 다른 원소를 포함시킬 수 있는데, 예를 들면, C-5 프로핀 피리미딘을 포함할 수 있다. 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 RNA에 높은 친화성으로 결합되고, 유전자 발현의 강력한 안티센스 저해물질인 것으로 나타난다(Wagner et al., 1993).
표적화된 안티센스 수송의 또 다른 예로는 표적화된 리보자임을 이용할 수 있다. "리보자임"은 온코진 DNA 및 RNA에 표적화시키고, 특정 염기 서열을 절단할 수 있는 RNA계 효소를 말한다. 리보자임은 RNA 올리고-핵산이 결합된 리보자임 서열의 형태로 세포에 직접 표적화시키거나 원하는 리보자임 RNA를 인코드하는 발현 구조로 세포에 도입시킬 수 있다. 안티센스 핵산에서 설명하는 것과 동일한 방법으로 리보자임을 이용하고, 적용시킬 수 있다.
C) 백신에 대한 항원
다른 치료요법 유전자에는 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 곰팡이 항원 또는 기생충 항원과 같은 항원을 인코드하는 유전자가 포함된다. 바이러스에는 피코르나바이러스(picornavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 토가바이러스(togavirus), 플라비르비루(flaviviru), 라브도바이러스(rhabdovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 부니아바이러스(bunyavirus), 아렌바이러스(arenvirus), 레오바이러스(reovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 파포바바이러스(papovavirus), 파르보바이러스(parvovirus), 허피스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헵파다나바이러스(hepadnavirus), 스폰지폼바이러스(spongiform virus)등이 포함된다. 적절한 바이러스 표적에는 인플루엔자, 허피스 심플렉스 바이러스 1, 2, 홍역, 천연두, 소아미비, HIV등이 포함된다. 병인에는 트리파노조마, 촌충, 회충, 기생충 등이 포함된다. 또한, 태아 항원 또는 전립선 특이적인 항원과 같은 종양 표식을 이와 같은 방법으로 표적화할 수 있다. 적절한 예로는 HIV env 단백질 및 간염 B 표면 항원등이 포함된다. 본 발명에 따라 백신화를 목적으로 벡터를 투여하기 위해서는 비-면역원성인 벡터-관련 항원이 필요한데, 이는 강한 면역 반응을 원하는 경우에 이동유전자를 장시간 발현시킬 수 있기 때문이다. 적절하게는 개인의 백신주사는 일년에 1회 또는 2년에 1회정도만 하면 되고, 감염성 물질에 대해 면역학적으로 장시간 보호할 수 있다.
D) 조절 부분
바이러스 벡터가 치료요법적 유전자를 인코드하는 전사체를 효과적으로 발현시키도록 하기 위해, 치료 유전자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포르모터 및 폴리아데닐화 시그날 전사 조절 하에 준다. "프로모터"는 숙주 세포의 합성 기작에 의해 인지되는 DNA 서열이거나 유전자의 특정 전사를 개시하는데 필요한 합성 기작에 도입된 DNA 서열이다. 폴리아데닐화 시그날은 숙주 세포의 합성 기작에 의해 인지되는 또는 도입된 합성 기작에 있는 DNA 서열을 말하는데, 이는 적절한 프로세싱을 위해 mRNA 전사체의 말단에 일련의 뉴클레오티드를 직접 첨가하는데 필요하고, 해독을 위해 세포질로 핵밖으로 전사를 하는데 필요하다. "전사 조절 하에"라는 의미는 프로모터가 폴리뉴클레오티드에 대해 정확한 위치에 있어 RNA 폴리메라제 개시 및 폴리뉴클레오티드 발현을 조절한다는 것을 의미한다.
여기에서 프로모터란 RNA 중합효소 II의 개시부위주변에 모여있는 전사 조절 모듈을 의미하는 것이다. 어떻게 프로모터가 조직화되는지에 대한 대부분은 HSV 티미딘 카이나제(tk), SV40 초기 전사 유닛을 포함하는 몇 가지 바이러스 프로모터를 분석하여 유래된 것이다. 최근 연구에 의해 보강된 이와 같은 연구에서 볼 수 있는 것과 같이 프로모너는 별개의 기능을 하는 모듈로 구성되는데, 이들 각각은 약 7-20 bp DNA로 구성되고, 전사 활성 물질 또는 단백질 억제물질에 대한 한 가지 이상의 인지 부위를 포함한다.
각 프로모터에서 적어도 한 가지 모듈은 RNA 합성에 대해 시작 부위에 기능을 한다. 이에 대해 가장 잘 알려진 것은 TATA 박스이고, 일부 TATA가 없는 프로모터 가령, 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자와 SV40 후기 유전자의 프로모터등은 자체 시작 부위에 겹치는 별도의 원소가 개시 부위에 고정되는 것을 돕는다.
추가 프로모터 원소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이들은 시작 부위에서 30-110bp 상류에 위치하는데, 최근에 사당수의 프로모터는 시작 부위 하류에도 기능 원소를 포함하고 있는 것으로 나타났다. 프로모터 원소간에 공간은 유동적이기 때문에 요소가 서로 역으로 되었거나 이동할 수 있으면 프로모터의 기능은 보존된다. tk 프로모터의 경우에, 프로모터 원소간에 공간은 50bp까지 늘릴 수 있으나, 이를 벗어나면 활성이 감소된다. 프로모터에 따라, 개별 원소는 공조하거나 또는 독립적으로 기능을 하여 전사를 활성화시킨다.
표적 세포에서 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다면, 치료요법적 유전자의 발현을 조절하는데 이용되는 특정 프로모터가 반드시 사용되어야 하는 것은 아니다. 따라서, 사람 세포를 표적으로 하는 경우에, 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 이에 인접하게 폴리뉴클레오티드 코딩 부분을 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 이와 같은 프로모터에는 사람 또는 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 표 2에 제공된다.
프로모터
이뮤노글로블린 중쇄
이뮤노글로블린 경쇄
T-세포 수용체
HLA DQ αDQ β
β-인터페론
인터루킨-2
인터루킨-2 수용체
MHC Class II 5
MHC Class II HLA-DRα
β-악틴
근육 크레아틴 카이나제
프레알부민(트란스트레틴)
엘라스타제 I
메탈로티오닌
콜라게나제
알부민 유전자
α-철단백질
ι-글로빈
β-글로빈
c-fos
c-HA-ras
인슐린
신경세포 흡착분자(NCAM)
αI-Antitrypsin
H2B (TH2B) 히스톤
쥐 또는 타입 I 콜라겐
포도당 조절 단백질(GRP94 GRP78)
쥐 생장 호르몬
사람 혈청 아밀로이드 A(SAA)
트로포닌(TNI)
혈소판-유도된 생장인자
Duchenne 근육이상
SV40
폴리오마
레트로바이러스
파필로마 바이러스
B 간염 바이러스
사람 면역결핍 바이러스
사이토메갈로 바이러스
Gibbon Ape 백혈병 바이러스
유도성 프로모터로 프로모터 특징화할 수 있다. 유도성 프로모터는 인듀서 물질 존재하는 경우를 제외하고는 비활성이거나 활성이 매우 낮은 프로모터이다. 본 발명에 포함되는 프로모터의 예로는 MT II, MMTV, 콜라게나제, 스트로멜리신, SV40, 뮤린 MX 유전자, α-2-마크로글로블린, MHC I 유전자 h-2kb, HSP70, 프로리페린, 종양 괴사 인자, 흉선 자극 호르몬 α유전자등을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 관련된 인듀서는 표 3에 나타내었다. 본 발명에서는 임의 유도성 프로모터를 이용할 수 있고, 이와 같은 프로모터는 모두 청구하는 발명의 범위에 속한다.
원소 인듀서
MT II 프로볼 에스테르(TPA) 중금속
MMTV (쥐 유방 종양 바이러스) 글로코코르티코이드
β-인터페론 poly(rI)Xpoly(rc)
아데노바이러스 5 E2 Ela
c-jun 프로볼 에스테르(TPA), H2O2
콜라게나제 프로볼 에스테르(TPA)
스트로미엘신 프로볼 에스테르(TPA), IL-1
SV40 프로볼 에스테르(TPA)
쥐 MX 유전자 인터페론, 뉴캐슬 질병 바이러스
GRP78 유전자 A23187
α-2-마크로글로블린 IL-6
비멘틴 혈청
MHC Class I Gene H-2kB 인터페론
HSP70 Ela, SV40 Large T 항원
프로리페린 프로볼 에스테르-TPA
종양괴사인자 FMA
흉선자극 호르몬 α유전자 흉선 호르몬
다양한 구체예에서, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 라우스 살코마 바이러스 긴 말단 반복부위를 이용하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 상당 수준 발현시킨다. 폴리뉴클레오티드를 발현시키기위해 당분야에 공지된 다른 바이러스 또는 포유류 세포 또는 세균 상 프로모터를 이용할 수 있는데, 단 조건은 발현 수준이 생장 저해 효과를 만드는데 충분해야 한다.
공지의 성질을 가지는 프로모터를 이용하여, 트랜스펙션후에 폴리뉴클레오티드의 발현 수준 및 패턴을 최적화시킬 수 있다. 예를 들면, 특정 세포에서 활성을 가지는 프로모터 예로들면, 티로시나제(흑색종), 알파-청단백질 및 알부민(간 종양), CC10(폐 종양), 전립선 특이적 항원(전립선 종양)은 치료요법적 유전자의 조직 특이적인 발현을 허용한다.
인헨서는 동일한 DNA 분자에서 별도의 위치에 있는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 물질로 감지되었다. 상당한 거리에서도 활동을 하는 이 능력은 원핵세포 전사 조절 연구에서는 거의 전례가 없었다. 후속 연구에서 인헨서 활성을 가지는 DNA 부분은 프로모터와 유사하게 조직화되었다. 즉, 많은 개별적인 원소로 구성되어있고, 이들 각각은 하나이상의 전사 단백질에 결합된다.
인헨서와 프로모터의 근본적인 차이는 작동에 있다. 인헨서 부분은 일정거리에서 전사를 자극하는 것이나, 반드시 프로모터 부분 또는 이의 구성 요소일 필요는 없다. 한편, 프로모터는 특정 부위 및 특정 방향에서 RNA 합성을 개시하는 하나 이상의 요소를 가지는데, 인헨서는 이와 같은 특징이 없다. 프로모터와 인헨서는 종종 겹쳐지거나 인접하여 매우 유사한 모듈 조직을 가지는 것으로 보인다.
따라서, 임의 프로모터/인헨서 복합(as per the Eukaryotic Promoter Data Base (EPDB))하여, 특정 구조의 발현을 유도한다. T3, T7, SP6 세포질 발현 시스템을 이용하는 것고 또 다른 구체예가 될 수 있다. 적절한 박테리오파아지 폴리메라제가 운반 복합체의 일부로써 또는 추가 유전가 발현 벡터로써 제공된다면, 특정 박테리오파아지 프로모터로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.
cDNA 삽입체를 이용한다면, 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화에 영향을 줄 수 있는 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 시그날의 특징은 본 발명의 실행에서 그다지 중요하지는 않으며, 임의 서열을 이용할 수 있다. SV40, 소 생장 호르몬, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제 유전자로부터 얻은 이와 같은 폴리아데닐화 시그날은 여러 가지 표적 세포에서 기능을 하는 것으로 나타났다.
7. 유전자 전달 방법
본 발명의 헬퍼 세포주를 만들고, 이와 함께 이용하기 위해 재조합 아데노바이러스 벡터를 만들기 위해 다양한 유전자 구조(가령 DNA)를 세포로 운반한다. 이를 이루는 한 가지 방법은 감염성 바이러스 입자를 이용하여 예를 들면, 본 발명의 아데노바이러스 벡터로 형질변형시켜 바이러스성 형질도입을 통하는 것이다. 또는, 레트로바이러스 또는 소 파필로마 바이러스를 이용할 수 있는데, 이들 모두다 원하는 유전자로 숙주 세포를 영구적으로 형질변환시킨다. 다른 상황에서는, 전달하고자 하는 핵산은 비감염성 즉 감염성 바이러스 입자에 포함된다. 이와 같은 유전자 물질을 전달하는 것은 비-바이러스성 방법으로 해야 한다.
배양된 포유류 세포로 발현 구조를 전달하는데 이용되는 몇 가지 비-바이러스성 방법을 이용할 수 있다. 여기에는 인산 칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 전기천공(Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), 직접 마이크로인젝션(Harland and Weintraub, 1985), DNA 적하된 리포좀(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979), 세포초음파분쇄(Fechheimer et al., 1987), 고속 마이크로인젝션을 이용하여 유전자 폭격(Yang et al., 1990), 수용체 중개된 트렌스펙션(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)등이 포함된다.
일단 구조물이 세포로 전달되면, 치료요법적 유전자를 인코드하는 핵산이 정치하고, 다른 부위에서 발현된다. 특정 구체예에서, 치료요법적 유전자를 인코드하는 핵산은 세포의 게놈으로 안정적으로 결합된다. 이와 같은 결합은 상동 재조합(유전자 치환)을 통하여 동일한 위치 및 방향에서 이루어지거나 또는 무작위 비특정 위치(유전자 증식)에서 결합된다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 별도로 에피좀 DNA 단편으로 세포 내에 안정적으로 유지될 수 있다. 이와 같은 핵산 단편 또는 "에피좀"은 숙주 세포 과정과 독립적으로 또는 동일하게 복제 및 유지할 수 있을 정도의 서열을 인코드한다. 발현 구조물을 세포로 전달하고 세포내에서 핵산이 유지되는 방법은 이용되는 발현 구조 형태에 따라 달라진다.
본 발명의 한 구체예에서, 발현 구조물은 간단하게 네이키드(naked) 재조합 DNA 또는 플라스미드로 구성된다. 물리적으로 또는 화학적으로 세포 막을 통과할 수 있는 상기에서 언급하고 있는 임의 방법을 이용하여 구조물을 전달할 수 있다. 이는 특히 in vitro에서 실행하는데 적합하나, in vivo 에서도 사용할 수 있다. Dubensky et al.,(1984)는 어른 쥐 및 새로 태어난 쥐의 간 및 지라내로 CaPO4 침전물의 형태로 폴리마바이러스 DNA를 주사하는데 성공하였는데, 이는 활성 바이러스 복제 및 급성 감염을 설명하는 것이다. Benvenisty and Neshif(1986)는 또한 CaPO4 침전된 플라스미드를 직접 복막으로 주사하여 트랜스펙트된 유전자를 발현시킨다. CAM을 인코드하는 DNA는 유사한 방법으로 in vivo로 전달하여, CAM를 발현시킨다.
세포로 네이키드(naked) DNA를 전달하는 또 다른 방법은 입자를 살포하는 것이다. 이 방법은 고속으로 DNA 피복된 마이크로프로젝틸(microprojectile)은 능력에 따라 달라지는데, 이로써 세포 막을 뚫고 세포를 죽이지 않고 세포 안으로 들어간다(Klein et al., 1987). 작은 입자를 가속화하는 몇 가지 장치가 개발되었다. 이와 같은 장치중 하나는 높은 전압으로 방출하여 전류를 발생시키는데, 이것이 구동력이 된다(Yang et al., 1990). 이용된 마이크로프로젝틸은 텅스텐 또는 금 비드와 같은 생물학적으로 비활성 물질로 구성된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 발현 구조는 리포좀내에 포집시킬 수 있다. 리포좀은 인지질 이중 층 및 내부 수용성 매체를 가지는 소포 구조를 가진다. 다층라멜라 리포좀은 수용성 매체에 의해 분리된 여러 지질 층을 가진다. 수용성 용액에 인지질을 현탁시키면 자발적으로 다층라멜라가 형성된다. 지질 성분은 자체적으로 배열되어, 닫힌 구조를 형성하고, 물을 포집하고, 지질 이중층간에 용질을 용해시킨다(Ghosh and Bachhawat, 1991).
in vitro에서 리포좀-중개된 핵산 운반 및 외부 DNA의 발현시키는 것은 매우 성공적이다. β-락타메이즈 유전자를 이용하여, Wong et al.,(1980)은 리포좀-중개된 운반 및 배양된 병아리 배, HeLa, 간종양 세포에서 외부 DNA 발현을 실행할 수 있다. Nicolau et al.,(1987)는 정맥으로 주사한 후에 리포좀-중개된 유전자 전달을 성공적으로 실행하였다. "리포펙틴" 기술을 이용한 다양한 방법도 포함된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 리포좀은 헤마토글루티닌 바이러스(HVJ)와 복합될 수 있다. 이는 세포 막을 융합하고, 리포좀내에 포집된 DNA를 세포로 들어가는 것을 촉진시키는 것으로 나타났다(Kaneda et al., 1989). 또 다른 구체예에서, 리포좀은 핵 비히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합되거나 또는 이와 함께 이용된다(Kato et al., 1991). 또 다른 구체예에서 리포좀은 HVJ 및 HMG-1와 복합되거나 이와 함께 이용된다. 이와 같은 발현 구조는 in vitro 및 in vivo에서 핵산의 전달 및 발현을 성공적으로 이용되었기 때문에, 이들을 본 발명에 이용할 수 있다.
세포 안으로 치료요법 유전자를 인코드하는 핵산을 운반하는데 이용되는 다른 발현 구조는 수용체-중개된 수송매체이다. 이들은 거의 대부분 진핵 세포에서 수용체-중개된 식작용으로 거대분자를 선택적으로 수용할 수 있는 장점이 있다. 다양한 수용체가 세포 형태에 따라 분포되기 때문에, 운반은 매우 특이적으로 이루어진다(Wu and Wu, 1993).
수용체-중개된 유전자 표적 매개체는 일반적으로 두 가지 성분으로 구성된다; 세포 수용체-특이적인 리간드 및 DNA 결합 물질. 몇 가지 리간드를 이용하여 수용체-매개된 유전자를 전달한다. 가장 많이 알려진 리간드는 아시알로오로소뮤코이드(ASOR) (Wu and Wu, 1987) 및 트란스페링(Wagner et al., 1990)이다. 최근에, ASOR와 동일한 수용체를 인지하는 합성 네오글리코프로테인을 유전자 전달 운반체로 이용하였고(Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), 상피 생장 인자(EGF)를 측부 암 세포에 유전자를 전달하는데 이용하였다(Myers, EPO 0273085).
다른 구체예에서, 운반 수송체는 리간드 및 리포좀으로 구성된다. 예를 들면, Nicolau et al.(1987)는 리포좀에 결합된 락토실-세라미드, 갈락토즈-말단 아시알강글리오시드를 이용하여, 간세포에 의해 인슐린 유전자 수용이 증가된다는 것을 알았다. 따라서, 리포좀 유무에 관계없이 여러 가지 수용체-리간드 시스템을 이용하면 치료제 유전자를 인코드하는 핵산은 전립선, 상피 또는 종양 세포 등의 세포로 특이적으로 운반할 수 있다. 예를 들면, 사람 전립선-특이적인 항원(Watt et al., 1986)을 전립선 조직에 핵산을 운반하는 수용체로 이용할 수 있다.
8. 핵산 오염물질의 제거
본 발명은 불순물 핵산을 제거하기 위해 뉴클레아제를 이용하였다. 뉴클레아제로는 Benzonaser, PulmozymeR, 또는 당분야에서 통상적으로 이용되는 다른 DNase 또는 RNase가 포함된다.
BenzonaseR와 같은 효소는 핵산을 분해하나 단백질 분해 활성은 없다. 핵산을 신속하게 가수분해하여 BenzonaseR는 세포 용해 속도를 줄이는 이상적인 효소가 된다. 응집, 입자 크기 변화 또는 입자의 하전 변화로 인하여 흡착이 분리를 방해하여, 주어진 정제 과정으로 회수된 생성물이 거의 없다. BenzonaseR은 정제하는 동안에 핵산 적하를 줄이고, 따라서 간섭을 줄여 수득율을 개선시킨다.
모든 엔도뉴클레아제와 같이, BenzonaseR는 특정 뉴클레오티드사이에 포스포디에스테르 결합을 가수분해한다. 완전히 분해한 경우에 용액에 존재하는 모든 자유 핵산은 길이가 2 내지 4개 염기의 올리고뉴클레오티드로 된다.
9. 정제 기술
본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 정제하기 위해 여러 가지 다른 정제 방법을 이용한다. 이와 같은 기술에는 하기에서 설명하는 침전 및 크로마토그래피등을 기초로 하는 것이 포함된다.
A) 밀도 차 원심분리
밀도 차 원심분리에는 두 가지 방법이 있는데, 속도 구역 기술(rate zonal technique) 및 등밀도(isopycnic) 기술이 있는데, 둘다 입자 혼합물에 있는 모든 성분을 정량적으로 분리하는 것이다. 또한 보이언트 밀도를 측정하거나 침강 상수를 측정할 경우에 이용될 수도 있다.
속도 구역 기술에 의한 입자 분리는 크기 및 침전 속도에 따라 분리하는 것이다. 이 기술은 실행된 액체 밀도 차의 위에 샘플 용액을 조심스레 얹으면 조밀한 입자의 밀도를 초과하는 최대 밀도 입자를 분리할 수 있다. 그 다음 샘플은 원하는 수준으로 분리될 때까지 원심분리하는데, 예를 들면, 입자가 농도차를 이동하여 입자의 상대적인 속도에 따라 떨어져있는 별도 구역 또는 밴드를 형성할 수 있을 정도의 시간동안 원심분리한다. 기술은 시간 의존성이기 때문에, 원심분리는 임의 분리된 지역이 튜브의 바닥에 펠렛을 형성하기 전에 중단해야 한다. 이 방법을 이용하여 효소, 호르몬, RNA-DNA 하이브리드, 리보좀 서브유닛, 세포부 기관을 분리하고, 폴리좀 샘플의 크기 분포를 분석하고, 리포프로테인 분취를 한다.
샘플은 분리될 입자 전체 밀도 범위로 이어진 연속적인 밀도 차를 이룬 상부에 얹는다. 따라서, 경사도의 최대 밀도는 항상 가장 조밀한 입자의 밀도보다는 커야 한다. 원심분리하는 동안에, 입자의 보이언트(buoyant) 밀도와 경사도의 밀도가 같아질때(식 2.12에서 Pp = Pm 일때) 까지 입자가 침전된다. 원심분리를 얼마나 지속하였는가와는 무관하게, 이 시점에서 더 이상의 침전이 발생되지 않는데 그 이유는 입자가 이들이 보유한 밀도보다 더 큰 밀도를 가지는 물질 완충물에 부유하고 있기 때문이다.
속도 구역 기술과는 대조적으로 등밀도 원심분리는 균형 방법으로 이들 고유 부유 밀도에서 각각 입자는 밴드를 형성한다. 입자 혼합물에 있는 모든 성분이 필요한 물질이 아닌 경우에, 혼합물에 있는 원하지 않는 성분들은 원심분리 튜브 바닥으로 침전시키고, 반면에 원하는 입자는 이들 각각의 등밀도 위치에 침강시키기 위해 경사도 범위를 선택할 수 있다. 이와 같은 기술은 속도 구역 및 등밀도 방법을 복합한 것이다.
등밀도 원심분리는 입자의 부유 밀도에 따라 달라지고, 입자의 크기 및 모양, 시간과는 무관하다. 매우 유사한 밀도(가령 당용액에서 p = 1.3g ㎝-3인) 가용성 단백질은 이와 같은 방법으로 분리할 수 없는 반면에, 부세포 기관( 슈크로즈 용액에서 골지체는 p = 1.11g ㎝-3 이고, 미토콘드리아는 p = 1.19g ㎝-3 이고, 퍼옥시좀은 p = 1.23g ㎝-3 이고)은 효과적으로 분리할 수 있다.
미리 형성된 경사도에서 분리할 입자 혼합물을 적하하는 또 다른 방법으로 샘플을 우선 균질한 용액 밀도를 제공하기 위해 경사도 매체와 혼합하고, 침전 균형에 의해 원심분리하는 동안에 경사도는 자체적으로 형성된다. 이 방법에서(흔히 평형 등밀도 방법이라고 칭함), 중금속(가령, 카제니움 또는 루비디움), 슈크로즈, 콜로이드성 실리카 또는 메트리자아미드 염을 이용한다.
샘플(DNA)을 염화세슘 농축액으로 균질하게 혼합한다. 농축된 염화세슘 용액을 원심분리하면 CsCl 분자가 침전되어 농도 경사를 만들게 되고, 밀도차가 형성된다. 튜브에 초기에 균질하게 분포된 샘플 분자(DNA)는 이들의 부유 밀도와 용액 밀도가 동일한 부위(가령, 등밀도 부위)에 도달하여, 구역을 형성할 때까지 상승하거나 침전한다. 이와 같은 기술은 평형을 이루기 위해 매우 긴 시간동안 원심분리를 하는 단점이 있다(예를 들면 36 내지 48시간). 그러나, 입자의 부유 밀도를 측정하거나 이중 가닥 DNA의 염기 조성물 결정하거나, 원형 DNA에서 선형 DNA를 분리하기 위해 분석용 원심분리에 흔히 이용된다.
Leselson과 Stahl이 이용한 기술은 대장균에서 DNA 복제 기작을 밝히는데 이용한 기술로 생합성동안에 동위원소(15N)등을 첨가하여 상이한 형태의 DNA간에 밀도차를 증가시켜 또는 중금속 이온 또는 브롬화에티디움등의 염료를 결합시켜 분리하는 방법을 개선할 수 있다. 등밀도 경사도를 이용하여 바이러스를 분리 및 정제하고, 사람 혈장 리포프로테인을 분석한다.
B) 크로마토그래피
본 발명의 특정 구체예에서, 정제된 아데노바이러스를 만드는 것이 바람직하다. 정제 기술은 당분야에 공지된 것들이다. 이들 기술은 혼합물에 있는 다른 성분으로부터 아데노바이러스를 분리하기 위해 세포 환경을 분취하는 것이다. 다른 성분으로부터 아데노바이러스 입자를 분리하면, 아데노바이러스는 완전하게 순수분리하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 정제한다. 본 발명의 순수한 아데노바이러스 입자를 준비하는데 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 등이 된다. 본 발명에 이용할 수 있는 특히 효과적인 정제 방법은 HPLC이다.
본 발명의 한 특징에는 아데노바이러스 입자를 정제하는 것에 관계한다. 여기에서 이용된 "정제"라는 의미는 다른 성분으로부터 분리할 수 있는 조성물을 말하는데, 이때 아데노바이러스 입자는 자연상태에서 구할 수 있는 것과 비교할 수 있는 정도로 정제된 것을 말한다. 따라서, 정제된 아데노바이러스 입자는 자연적으로 발생되는 환경이 없는 아데노바이러스 성분만을 말하는 것이다.
일반적으로, "정제된"이란 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분취된 아데노바이러스 입자를 말하는데, 이때 조성물에는 실제 발현된 생물학적 활성을 보유하고 있다. "실제 정제된"이란 의미는 조성물의 입자, 단백질, 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하고, 이는 조성물 구성의 약 50% 또는 그 이상으로 구성된다는 것을 말한다.
본 발명의 설명을 기초하여 당업자는 단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법을 인지할 것이다. 이들 방법에는 SDS/PAGE 분석을 이용하여 활성 분취물의 특이 활성을 결정하거나 분취물내에 폴리펩티드의 양을 측정하는 것을 포함한다. 분취물의 순도를 평가하는 적절한 방법은 분취물의 특이 활성을 계산하고, 고유 추출물의 특이 활성과 계산된 활성을 비교하고, 순도를 계산하는데, 이는 "몇배 순도"로 나타낸다. 활성 양을 나타내는데 이용되는 실제 단위는 정제따라 선택된 특정 검사방법 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 감지가능한 활성을 가지는지에 따라 달라진다.
아데노바이러스가 가장 순수한 형태로 제공되어야 한다는 일반적인 규정은 없다. 또한, 특정 구체예에서는 실제 순도가 약간 떨어지는 생성물을 사용하여도 무방하다. 더 적은 정제 단계를 이용하거나 동일한 정제 과정에서 다른 형태를 이용하여 부분적으로 정제를 할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 이용하여 실행한 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피를 하면 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술보다 몇 배 순도가 크다는 것을 인지할 것이다. 상대적으로 순도가 낮은 방법은 총 단백질을 회수하거나 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데에는 유익하다.
물론, 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 발현되는 단백질을 정제하는데 당분야에 공지된 크로마토그래피 기술 및 정제 방법을 이용하여도 된다. 아데노바이러스 입자를 정제하는데 이용되는 예시적인 정제 기술로는 이온 교환 크로마토그래피 및 고 실행능 약체 크로마토그래피등이 있고, 이는 하기에서 더욱 상세하게 설명한다.
이온-교환 크로마토그래피: 이온-교환 크로마토그래피의 기본 원리는 교환 물질의 친화력이 물질의 전기적인 성질 및 용매에 있는 다른 하전을 띈 기질의 상대적인 친화력에 따라 달라진다는 것이다. 결합된 물질은 pH를 변경하여, 물질의 하전을 변경하여 또는 염과 같은 경쟁 물질을 첨가하여 용출할 수 있다. 다른 물질은 다른 전기적인 성질을 가지기 때문에, 각 결합된 분자 종을 방출하는 조건은 다양하다. 일반적으로, 분리를 잘 하기 위해서, 선택할 수 있는 방법은 연속 이온 강도 경사 용출 또는 단계적인 용출이다(pH 경사만을 사용하지는 않는데, 그 이유는 이온 강도를 증가시키지 않고 pH 차이를 만드는 것이 어렵기 때문이다). 음이온 교환기의 경우에, pH 또는 이온 강도를 점진적으로 증가시키거나 이온 강도만을 증가시킨다. 양이온 교환기의 경우에, pH 및 이온 강도가 증가된다. 시행착오를 통하여 그리고 안정성을 고려하여 용출 과정을 선택하는 것이 좋다. 예를 들면, 불안정한 물질의 경우에는 pH를 항상 일정하게 유지하는 것이 중요하다.
이온 교환기는 이온이 전기적으로 결합된 화학적으로 결합된 하전기를 가지는 고체로써, 수용액에 있는 이온과 이들 이온을 교환할 수 있다. 이온 교환을 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 하전에 따라 분자를 분리하고; 실제 다른 분자 특징도 중요한데, 그 이유는 크로마토그래피 거동은 하전 밀도, 하전 분포 및 분자의 크기에 민감하기 때문이다.
이온 교환 크로마토그래피의 원하는 전하를 가진 분자가 이온 교환기에 가역적으로 결합시키고, 이온 환경을 변화시켜 분자를 결합시키거나 용출시키는 것이다. 이온 교환기에서 분리는 통산 두 단계로 이루어지는데; 첫째는 분리할 물질을 안정적이고, 견고한 결합을 제공할 수 있는 조건하에서 교환기에 결합시키고; 그 다음 상이한 pH, 이온 강도가 다른 완충액 또는 결합 부위에 결합된 물질과 경쟁할 수 있는 완충액의 성분 및 조성물을 이용하여 컬럼을 용출시킨다.
이온 교환기는 통상 공유결합으로 부착된 하전 기를 포함하는 3차원 매트릭스 또는 네트워크가 된다. 기가 음전하를 가지는 경우에, 양이온을 교환하고, 이는 양이온 교환기가 된다. 양이온 교환기에 이용되는 일반적인 기는 SO3 -이다. H + 이온이 기에 결합되는 경우에, 교환기는 산 형태라고 하고, 이는 H+에 한 개 Na+ 또는 H+에 두 개 Ca2+를 교환할 수 있다. 설폰산기는 강력한 산성 양이온 교환기라고 한다. 다른 통상적으로 이용되는 기는 하이드록시 페놀 및 카르복시 페놀인데, 이들은 모두 약산 양이온 교환기가 된다. 하전된 기가 양성 예를 들면, 사가 아미노기인 경우에 이는 강염기 음이온 교환기가 된다. 가장 흔히 이용되는 역염기 음이온 교환기는 방향족 또는 지방족 아미노기가 된다.
매트릭스는 다양한 물질로 만든다. 가장 흔히 이용되는 물질은 덱스트란, 셀룰로오즈, 아가로즈, 스티렌 및 폴리비닐벤젠 혼성중합체인데, 이때 디비닐벤젠은 폴리스테렌 가닥에 모두 교차 결합되어 있고 하전 기를 가지고 있다. 표 4에는 많은 이온 교환기 조성물을 제공한다.
이온 교환기의 총 용량은 건조 분자량 1㎎에 교환가능한 기를 수용하는 능력으로 평가한다. 이 수는 제조업자가 제공하는 것으로, 용량이 초과하는 경우에는 이온은 결합하지 않고 컬럼을 통과하기 때문에 이수는 상당히 중요하다.
매트릭스 교환 기능기 상표명
덱스트란 강한 양이온약한 양이온강한 음이온 약한 음이온 설포프로필카르복시메틸디에틸-(2-하이드록시프로필)-아미노에틸디에틸아미노에틸 SP-SephadexCM-SephadexQAE-Sephadex DEAE-Sephadex
셀룰로오즈 양이온양이온음이온음이온음이온 음이온 카르복시메틸포스포디에틸아미노에틸폴리에틸렌이민벤조일레이트-나프톨일레이트, 디에틸아미노에틸p-아미노벤질 CM-CelluloseP-celDEAE-cellulosePEI-CelluloseDEAE(BND)-cellulose PAB-cellulose
스티렌-디비닐-벤젠 강한 양이온강한 음이온강한 양이온 +강한 음이온 설폰산 설폰산 +테트라메틸아모니움 AG 50AG 1AG 501
아크릴페놀엑스폭시아민 약한 양이온강한 양이온약한 음이온 카르복실설폰산4가 아미노 Bio-Rex 70Bio-Rex 40AG-3
이용할 수 있는 용량은 특정 실험 조건(가령, pH, 이온 강도)하에 용량을 말한다. 예를 들면, 이온 교환기가 하전되는 정도는 pH에 따라 달라진다(pH의 효과는 강한 이온 교환기에서는 그 정도가 적다). 또 다른 인자는 이온 강도로써 전하를 띈 기 주변에 작은 이온은 이들 기에 대해 동일한 분자와 경쟁을 하기 때문이다. 분자가 거대 분자인 경우에 이와 같은 경쟁은 상당히 효과적인데, 그 이유는 작은 이온의 확산 상수가 더 큰 경우에는 마주치는 수가 더 많다는 것을 의미한다. 분명한 것은 완충액의 농도가 증가되면 경쟁이 더 심해진다.
매트릭스의 다공성도 중요한 인자인데, 그 이유는 전하를 띈 기는 매트릭스의 내외에 있고, 매트릭스 또한 분자를 거르는 채의 역할을 하기 때문이다. 큰 분자는 구멍을 통과할 수 없고, 분자 크기가 증가되면 용량이 감소된다. 폴리스테렌계 수지의 다공성은 디비닐벤젠의 교차 결합 양으로 결정되는데, 디비닐벤젠의 양이 증가되면 다공성은 감소된다. Dowex 및 AG 시리즈의 경우에, X 다음의 수가 디비닐벤젠 비율을 나타내는데 예를 들면, Dowex 50-X8은 디비닐벤젠이 8%라는 것을 말한다.
이온 교환기는 입자 크기, 즉 메쉬 크기가 다양하다. 미세한 메쉬는 표면적에 대한 용적 비율이 크다는 것을 말하고, 따라서 주어진 교환기 용적에서 용량을 증가시키고, 교환시간을 줄일 수 있다. 한편, 미세한 메쉬는 이동 속도가 느리고, 이는 확산 퍼짐을 증가시킨다. 직경이 10㎛인 매우 가는 입자를 이용하고, 적절한 흐름을 유지하기 위해 고압을 이용하는 것을 고-실행 또는 고압 액체 크로마토그래피 또는 간단하게 HPLC라고 한다.
다른 성질 가령, 전하, 용량, 다공성, 메쉬등이 상이한 교환기를 수집하여 특히 분리하기가 어려운 것에 적합한 것을 선택할 수 있다. 다음의 실시예에서는 컬럼 물질의 형태를 결정하는 방법 및 결합 및 용출 조건을 선택하는 방법에 대해 설명하고 있다.
이온 교환 크로마토그래피를 이용할 때 여러가지 선택해야 할 것이 있다. 우선 교환기를 음이온 또는 양이온으로 할 것인지를 선택하는 것이다. 컬럼에 결합할 물질이 한개 전하(+ 또는 -)인 경우에는 선택은 간단하다. 그러나, 대부분 물질(가령, 단백질, 바이러스)은 음전하 및 양전하를 모두 가지기 때문에, 전체 전하는 pH에 따라 달라진다. 이와 같은 경우에, 주요 인자는 다양한 pH값에서 물질의 안정성이 된다. 대부분 단백질은 안정된 pH 범위(가령 변성되지 않는 pH범위)를 가지는데, 이때 이들은 양전하 또는 음전하를 띄게된다)를 가진다. 단백질이 등전점이상의 pH값에서 안정적이면, 음이온 교환기를 이용하고, 등전점이하에서 안정적이면 양이온 교환기를 이용한다.
전하 및 안정성에서 pH영향을 고려하여 강한 교환기 또는 약한 교환기를 선택한다. 예를 들면, 이온화를 위해 매우 낮은 또는 매우 높은 pH를 요구하는 약하게 이온화되는 물질을 크로마토그래피하는 경우에는 강한 이온 교환기를 이용하는데, 이는 전체 pH 범위에서 기능을 하기 때문이다. 물질이 불안정한 경우에는 약한 이온 교환기가 적합한데 그 이유는 강한 이온 교환기는 가끔 분자를 변형시켜 분자를 변성시키기 때문이다. 물질이 안정한 pH는 특정 약한 교환기가 전하를 가지는 매우 좁은 범위의 pH와 일치한다. 또한 작은 하전을 띈 것에서 큰 하전을 가지는 분자를 분리하는데에는 약한 이온 교환기가 적합한데, 그 이유는 약하게 전하를 띄는 이온은 결합하지 못하기 때문이다. 약한 교환기는 또한 하전 차이가 매우 적을 때 물질을 더 잘 분리하는 것으로 나타났다. 거대분자가 매우 강한 하전을 띄는 경우에, 강한 교환기로부터 용출하는 것은 불가능하고, 약한 교환기가 적절하다. 일반적으로 약한 교환기가 강한 교환기보다 더 유용하다.
Sephadex 및 Bio-gel 교환기는 낮은 이온 강도에서 불안정한 거대분자에 특히 유익하다. 매트릭스가 극성이 클 경우에도, 이들 물질에서 교차 결합으로 인하여 매트릭스의 불용성을 유지하기 때문에 이온가능한 기의 밀도는 셀룰로오즈 이온 교환기보다 몇배 크게 할 수 있다. 하전 밀도가 증가되었다는 것은 친화력이 증가되어 더 높은 이온 강도에서도 흡착이 일어날 수 있다. 한편 이와 같은 교환기에는 분자 거름 성질을 일부 가지고 있어서, 가끔 분자량 차이가 전하 차이로 인한 분포를 제거하는데, 분자 거름 효과로 인하여 분리가 더 잘된다.
작은 구멍(교차 결합 정도가 높음)을 가지는 매트릭스상에서 작은 분자가 가장 잘 분리되는데 그 이유는 이용할 수 있는 용량이 크고 반면에 거대 분자의 경우에는 구멍 크기가 커야 한다. 그러나, Sephadex 형태를 제외하고는 대부분 이온 교환기는 분자량과 다공성을 일치시키는 기회를 제공하지는 않는다.
셀룰로오즈 이온 교환기는 단백질 및 폴리뉴클레오티드와 같은 거대 분자를 정제하는데 가장 효과적인 것으로 증명되었다. 이는 매트릭스가 섬유성이고, 모든 기능기가 표면에 있어 가장 큰 분자에도 이용할 수 있기 때문이다. 그러나, 대부분의 경우에 DEAE-Sephacel 및 DEAE-Biogel P와 같은 비드 형이 더욱 유용한데, 그 이유는 유동 속도가 더 우수하고 분자 거름 효과가 분리에 도움이 되기 때문이다.
메쉬 크기를 선택하는 것은 항상 어려운 문제이다. 작은 메쉬 크기는 해산도를 개선시키기는 하지만, 흐름 속도를 감소시키고, 이는 구역 퍼짐성을 증가시켜 해상도를 낮추게 된다. 따라서 적절한 메쉬 크기를 실험에 의해 결정하여야 한다.
완충액 자체가 이온으로 구성되기 때문에, 이들 또한 교환될 수 있고 pH 평형이 영향을 받게 된다. 이와 같은 문제점을 피하기 위해, 완충액의 역할을 이용해야 한다. 음이온 교환기와 양이온 완충액, 음이온 완충액과 양이온 교환기를 이용한다. 이온 강도가 결합에 인자가 되기 때문에, 완충액은 완충 능력이 큰 완충액을 선택해야 하는데, 이온 강도가 너무 크기 않아야 한다. 또한, 최상의 해상도를 얻기 위해서는 컬럼에 샘플을 제공하는데 이용되는 이온 조건(소위 시작 조건이라고 함)은 컬럼을 용출하는데 이용되는 것에 근접한 것이다.
고 실행능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 상당한 해상 피크를 가지고 신속하게 분리할 수 있는 것을 특징으로 한다. 적절한 유동 속도를 유지하기 위해 매우 미세한 입자 및 고압을 이용하여 실행한다. 몇분 또는 최대 한 시간내에 분리할 수 있다. 또한 입자가 매우 작고, 상당히 밀착되어 있어, 빈 공간은 베드 용적의 매우 작은 부분이 되어, 소량의 샘플로도 가능하다. 또한 샘플의 농도가 높지 않아도 되는데 그 이유는 밴드가 매우 좁기 때문에 샘플을 거의 희석하지 않는다.
10. 제약학적 조성물 및 제제화
상기에서 제시하는 방법을 이용하여 정제하였을 경우에, 본 발명의 바이러스 입자는 in vitro, ex vivo, in vivo 등으로 투여할 수 있다. 따라서, 원하는 용도에 적절한 제약학적 조성물의 형태로 복합체를 준비하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 기본적으로 발열물질이 없고, 사람 또는 동물에 유해할 수 있는 다른 불순물이 없는 제약학적 조성물을 마드는 것이다. 또한 복합체를 안정화시키고, 표적 세포가 복합체를 수용할 수 있도록 적절한 염 및 완충액을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 수용성 조성물은 발현 구조 효과량과 핵산으로 구성되는데, 이들은 제약학적 수용가능한 담체 또는 수용성 매체에 용해 또는 분산된다. 이와 같은 조성물을 접종물이라고 한다. "제약학적 또는 약리학적으로 수용가능한"이란 의미는 동물 또는 사람에게 투여하였을 경우에 부작용, 알레르기 또는 다른 원하지 않는 반응을 만들지 않는 분자 전체 및 조성물을 말한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "제약학적 수용가능한 담체"에는 임의 모든 용매, 분산 매체, 피복제, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연제등이 포함된다. 제약학적으로 활성 물질에 대한 이와 같은 매체 및 물질은 공지되어 있다. 임의 통상적인 매체 또는 물질이 활성 성분과 적응하지 못하는 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이들을 사용할 수 있다. 조성물에 보조 활성 성문을 결합시킬 수 있다.
자유 염기 또는 약리학적으로 수용 가능한 염으로 활성 화합물 용액은 하이드록시프로필셀룰로오즈와 같은 계면활성제와 물을 적절하게 혼합하여 이용한다. 그릴세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이의 혼합물 및 오일로 분산액을 만들 수 있다. 저장 및 이용을 위한 보통의 조건하에, 이들 조제물에는 미생물 생장을 억제하기 위해 보존제를 포함한다.
본 발명의 바이러스 입자는 사람에 투여하는 것을 포함하는 치료요법적인 처방에 이용할 수 있는 전통적인 제약학적 조제물을 포함한다. 본 발명에 따른 치료요법적 조성물은 이용된 투여 경로를 통하여 표적 세포를 이용할 수 있는 한 임의 통상적인 경로를 통하여 투여된다. 이와 같은 통상적인 투여 경로에는 구강, 비강, 볼, 직장, 질 또는 국소 경로가 포함된다. 또한, 안구, 진피, 피하, 근육, 복막, 정맥 주사를 통하여 투여할 수 있다. 이와 같은 조성물은 주로 생리학적으로 수용 가능한 담체, 완충액, 다른 부형제를 포함하는 제약학적으로 수용 가능한 조성물과 함께 투여된다. 종양에 이용하기 위해서는 종양내에 직접 주사, 잘라낸 종양 배드에 주사, 부위(예를 들면 임파를 통한) 또는 전신 투여를 고려할 수 있다. 종양 또는 종양 부위등의 질병 부위에 카테테르를 이용하여 몇 시간 또는 며칠간 연속 관주를 실행하는 것도 바람직하다.
본 발명의 치료요법적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사용 조성물의 형태로 투여하는 것이 바람직하고, 주사하기전에 용액, 현탁액 또는 액체로 만들 수 있는 고체로도 준비할 수 있다. 이와 같은 준비물은 에멸젼화할 수도 있다. 이와 같은 목적에 맞는 일반적인 조성물에는 인산완충염 ㎖당 약 100㎎ 사람 혈청 알부빈으로 구성된다. 다른 제약학적 수용 가능한 담체에는 염, 보존제, 완충액등을 포함하는 수용성 용액, 비-독성 부형제등이 이용될 수 있다. 비-수용성 용매로는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르등이 있다. 수용성 담체에는 물, 알코올/수용액, 염 용액, 염화나트륨, 링거 덱스트로즈등과 같은 장관외 담체등이 포함된다. 정맥 운반체에는 유체 및 영양 재공급물질등이 포함된다. 보존제에는 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 기체등이 포함된다. 제약학적 조성물에 있는 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 공지된 변수를 이용하여 조절한다.
구강 투여를 위한 추가 조제물이 있다. 경구 조제물에는 제약학적으로 이용될 수 있는 수준의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오즈, 탄산 마그네슘등과 같은 전형적인 부형제를 포함한다. 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방형 조제물, 분말 등의 형태가 될 수 있다. 경로가 국소인 경우에는 크림, 연고, 고약, 스프레이 등의 형태가 될 수 있다.
(i) 종양 세포 증식 억제; (ii) 종양 세포를 죽이거나 제거; (iii) 백신화; (vi) 치료요법적 유전자를 장시간동안 발현시키기 위한 유전자 전달등의 원하는 목적에 따라 치료제 물질의 효과량을 결정한다. "단위 약량"이란 개체에 사용하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하는 것으로 각 단위에는 투여하여 원하는 반응을 일으키기 위해 계산된 치요 조성물 예정양을 포함한다. 치요 횟수 및 약량 단위, 치료를 받을 개체, 개체의 상태, 원하는 결과에 따라 투여할 량이 달라진다. 아데노바이러스의 경우에 다중 유전자 치료 섭생을 기대할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 종양 억제 유전자를 인코드하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 암 환자를 치료한다. 암 유전자 치료에 이용되는 아데노바이러스 벡터의 일반적인 양은 103-1015 PFU/약량으로(103, 104, 10 5, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015), 이때 약량은 충진성 종양내에 다른 부위에 몇회 주사로 나눌 수 있다. 치료 섭생은 3-10주간 유전자 전달 벡터를 투여하는 수차례 과정이 관계한다. 몇 달 내지 몇 년간의 상다 시간동안 투여하면 유익할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 치료 유전자를 인코드하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 사람 또는 다른 포유류에 백신접종시킬 수 있다. 일반적으로, 백신 접종의 경우에 원하는 효과를 얻는데 필요한 바이러스의 양을 사람 또는 동물에 투여하여 전달유전자를 장시간동안 발현시키고, 강력한 숙주 면역 반응을 얻는다. 1차 주사후에 두 차례 추가 부스터 주사를 하면 장기간 면역 반응을 유도할 수 있다. 일반적인 약량은 원하는 결과에 따라 106 내지 1015 PFU가 된다. 적은 양의 항원으로는 강력한 세포-중개된 면역 반응을 유도할 수 있고, 반면에 많은 양의 항원은 항체-중개된 면역 반응을 유도한다. 치료 조성물의 정확한 양은 각 실행자의 판단에 따라 달라지는데, 각 개인마다 차이가 있다.
11. 실시예
다음의 실시예에는 본 발명의 적절한 구체예를 설명한다. 당업자는 실시예에서 설명하는 기술이 발명자가 본 발명을 실행하는데 있어서 최적의 기능을 하는 것으로 발견한 대표적인 기술이 된다. 그러나, 당업자는 본 발명의 내용을 기준으로 설명하고 있는 특정 구체예에 많은 변화를 만들 수 있고, 이는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
A) 세포
293 세포(사람 상피 배 신장 세포)는 연구용으로 Master Cell Bank에서 구하였다.
B) 배지
Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM,4.5g/L glucose) + 10% 태아 송아지 혈청(FBS)을 세포 생장을 위해 이용하였다. 바이러스 생장 상에서는 DMEM에서 FBS의 농도응 2%로 낮추었다.
C) 바이러스
사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 즉시 프로모터(immediate early promoter)의 조절하에 사람 야생형 p53 단백질을 발현하는 복제-무반응 사람 타입 5 아데노바이러스, AdCMVp53를 만들었다.
D) Celligen 바이오리엑터
5ℓ용량(3.5ℓ작업용적)의 Celligen 바이오리엑터(New Brunswick Scientific, Co. Inc.)를 이용하여 마이크로캐리어 배양법으로 바이러스 상청액을 만들었다. 바이오리엑터에 세포를 배양하기 위해 13g/ℓ유리에 피복된 마이크로캐리어(SoloHill)를 이용하였다.
E) Celligen 바이오리엑터에서 바이러스 상청액을 생산
Master Cell Bank(MCB)에서 구한 293 세포는 해동하고, Cellfactories (Nunc)로 연장하였다. 세포는 약 85-90% 수준으로 합류된다. 세포를 1×105 세포/㎖농도로 바이오리엑터에 접종하였다. 세포를 간헐적으로 교반하여 마이크로캐리어에 부착하도록 한다. 세포 접종 후 6-8시간쯤에 30rpm의 속도로 지속적으로 교반을 시작하였다. pH=7.20, 용존 산소(DO)=60%, 공기 포화, 온도 37℃로 고정시켜 7일간 세포를 배양하였다. 8일째에, 세포에 AdCMVp53를 감염시키는데, MOI 값은 5이다. 바이러스 감염 후 50시간째에, 교반 속도를 30rpm에서 150rpm으로 증가시켜, 세포 용해를 시키고, 상청액으로 바이러스를 방출시키도록 한다. 바이러스 상청액은 감염 후 74시간에 수득하였다. 바이러스 상청액은 추가 농축 및 여과를 위해 여과시킨다.
F) Cellcube TM 바이오리엑터 시스템
CellcubeTM 바이오리엑터 시스템(Corning-Costar)을 이용하여 AdCMVp53 바이러스를 생산하였다. 이는 일회용 세포 배양 모듈, 산소발생기, 배지 순환 펌프, 관주용 배지 펌프로 구성된다. 이용된 세포 배양 모듈은 21,550㎠(1mer) 배양 표면적을 가진다.
G) Cellcube TM 에서 바이러스 생산
Master cell Bank(MCB)에서 구한 293 세포를 해동시키고, Cellfactories (Nunc)에서 연장시킨다. 세포는 약 85-90% 수준으로 합류된다. 세포는 제조업자가 권장하는 바에 따라 CellcubeTM에 접종시켰다. 접종 세포 밀도는 1-1.5 ×104/㎠이다. pH=7.20, DO-60% 공기 포화, 37℃에서 7일간 세포를 생장시켰다. CellcubeTM에서 포도당 농도에 따라 배지 관주 속도를 조절하였다. 바이러스 감염 하루 전에, 관주 배지는 DMEM + 10% FBS에서 DMEM + 2% FBS로 바꾸었다. 8일째에, 세포에 AdCMVp53를 감염시키는데, 이때 MOI 값은 5가 된다. 감염 후에 1시간동안 배지 관주를 중단시키고, 그 다음 나머지 바이러스 생산 단계동안에 다시 관주시킨다. 감염 후 45-48시간경에 세포를 수득하였다.
H) 용해 용액
20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2, pH=7.50 온충액에 1%(v/v) Tween-20(Fisher Chemicals)를 이용하여, CellcubeTM에서 바이러스 생산 상이 종료되는 시점에 세포를 용해시킨다.
I) 정제 및 여과
Celligen 바이오리엑터에서 구한 바이러스 상청액 및 CellcubeTM에서 구한 바이러스 용액은 우선 강한 필터(Preflow, GelmanSciences)를 이용하여 정화시키고, 그 다음 0.8/0.22㎛ 필터(SuporCap 100, GelmanSciences)를 통하여 여과시킨다.
J) 농축/다이아필터레이션
접선 흐름 필터(TFF)를 이용하여, Celligen 바이오리엑터에서 구한 바이러스 상청액 및 CellcubeTM에서 얻은 바이러스 용액을 농축시키고, 완충액을 교환한다. 300K 분자량을 차단하는(NMWC) PelliconII 미니 카세트(Millipore)를 이용하여 농축 및 다이아필터레이션을 한다. 바이러스 용액은 처음 10배 농축시킨다. 그 다음 일정한 용적 다이아필터레이션 방법을 이용하여 20mM Tris + 1.0 M NaCl + 1mM MgCl2, pH=9.00 완충액에 대해 샘플 용적의 4배 완충액을 교환한다.
컬럼 정제된 바이러스의 경우에도 비슷한 농축 및 다이아필터레이션을 실행하였다. 300K NMWC 대신에 Pellicon II 미니 카세트(100K NMWC)를 이용한다. 다이아필터레이션은 20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2, pH=9.00 완충액 또는 Dulbecco's 인산완충 염(DPBS)을 이용하여 실시한다.
K) 벤조네이즈 처리
농축/다이라필터레이션된 바이러스 용액은 실온에서 100u/㎖ 농도의 BenzonaseTM(American International Chemicals)로 처리하여, 바이러스 용액에 있는 불순물 핵산의 농도를 줄인다.
L) CsCl 경사 한외원심분리
Beckman 한외원심분리기(XL-90) SW40 로터를 이용하여 이중 CsCl 경사 안회원심분리 방법으로 정제 안된 바이러스 용액을 정제한다. 우선, 7㎖ 원액 바이러스 용액을 동량의 CsCl 경사물질(이는 2.5㎖ 1.25 g/㎖와 2.5㎖ 1.40g/㎖ CsCl 용액으로 구성됨)의 상부에 얹는다. CsCl 경사는 실온에서 1시간동안 35,000rpm에서 원심분리한다. 경사도 사이면에서 바이러스 밴드를 회수할 수 있다. 회수된 바이러스는 등밀도 CsCl 경사도를 통하여 추가 정제하였다. 적어도 1.5배 용적의 1.33g/㎖ CsCl 용액과 바이러스 용액을 혼합한다. CsCl 용액은 실온에서 적어도 18시간동안 35,000rpm에서 원심분리하였다. 고유 바이러스로 구성된 아래쪽 밴드를 회수하였다. 바이러스는 20mM Tris + 1mM MgCl2, pH=7.50 완충액에 대해 바로 투석하여 CsCl을 제거하였다. 투석된 바이러스는 나중에 사용하기 위해 -70℃에서 보관한다.
M) 이온 교환 크로마토그래피(IEC) 정제
벤조네이즈 처리된 바이러스 용액은 IEC를 이용하여 정제하였다. 정제에는 강한 음이온 수지 Toyopearl SuperQ 650M(Tosohaas)를 이용하였다. 처음 개발된 방법에는 XK16 컬럼(Pharmacia)을 사용한 FPLC 시스템(Pharmacia)이 이용되었다. 추가 대용량 연구에서는 XK16 컬럼(Pharmacia)을 사용하는 BioPilot 시스템(Pharmacia)을 이용하였다. 간단하게 설명하면, 컬럼에 수지를 채우고, 1N NaOH로 소독하고, 그 다음 완충액 B로 충전하고, 이어서 완충액 A로 조건화시킨다. 완충액 A와 B는 각각 20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2, pH=9.00 및 20mM Tris + 2M NaCl + 1mM MgCl2, pH=9.00로 구성된다. 바이러스 용액 샘플은 조건화된 컬럼에 얹고, UV 흡수가 기저수준에 도달할 때 까지 완충액 A로 컬럼을 세척하였다. 선형 NaCl 경사를 가지는 10배 컬럼 용적을 이용하여 컬럼으로부터 정제된 바이러스를 용출시킨다.
N) HPLC 분석
바이러스 생산 및 정제 효율을 평가하기 위해 HPLC 분석 과정이 개발되었다. FisherBiotech(Cat# BP154-1; Fair Lawn, New Jersey, U.S.A.)에서 구한 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)를 이용하였고; 염화나트륨(NaCl)은 Sigma(Cat# S-7653, St. Louis, MO, U.S.A.)의 것을 이용하였는데, 이들은 추가 정제어뵤이 바로 이용하였다. 음이온 교환 컬럼인 TosoHaas(7.5㎝ ×7.5㎜ ID, 10㎛ particle size, Cat# 18257)이 갖추어진 Beckman사의 분석용 경사 시스템에서 Gold Workstation Software(126 binary pump and 168 diode array detector)를 이용하여 HPLC 분석하였다. HEPES 완충액 시스템을 이용하여 Huyghe et al.,가 개발한 방법을 평가하는데 1㎖ Resouce Q(Pharmacia) 음이온-교환 컬럼을 이용하였다. 이 방법은 바이오리엑터 시스템에서만 이용되었다.
현재 HPLC 시스템에 이용되는 완충액은 다음과 같다: Buffer A는 10mM 트리스 완충액, pH 9.0. Buffer B는 1.5M NaCl + 완충액 A, pH 9.0. 완충액은 Corning(Cat# 25970-33)사의 0.22㎛ bottle top 필터를 이용하여 여과시킨다. 모주입하기 전에 모든 샘플은 0.8/0.22㎛ Aerodise PF(Gelman Sciences(Cat# 4187))를 통하여 여과시킨다.
샘플은 HPLC 컬럼에 60-100㎕ 용적으로 주입된다. 주입 후에, 컬럼(TosoHaas)은 3분간 0.75㎖/min 속도로 20% B로 세척한다. 6분 후에 농도차 나타나기 시작하는데, 즉 B는 20%에서 50%로 증가된다. 이와 같은 경사는 3분이 지나면 50%에서 100%, 그 다음 6분간은 100%가 된다. 염 농도는 4분이 지나면 다시 20%로 단계적으로 되돌아오고, 그 다음 6분간은 20% B를 유지한다. Adp53의 보지시간은 9.5 ±0.3이고, A260/A280 = 1.26 ±0.03이다. 각 크로마토그래피가 종료된 후에 컬럼은 100㎕ 0.15M NaOH를 주입하여 세척하고, 그 다음 경사도를 실시한다.
실시예 2
바이러스 생산 및 정제에서 Cellcube TM 상에 배지 관주의 영향
CellcubeTM과 같은 관주 세포 배양물 시스템의 경우에, 배지 관주 속도는 생성물의 생산량 및 품질에 중요한 역할을 한다. 두 가지 상이한 배지 관주 전략을 이용하였다. 한 가지는 CellcubeTM에 포도당 농도가 ≥2g/ℓ(고속 관주)로 유지시킨다. 다른 하나는 포도당 농도는 ≥1g/ℓ(저속 배지 관주)로 유지시킨다.
두 가지 다른 관주 속도를 이용하였을 경우에 pH, DO등과 같은 배양 변수에는 큰 변화가 없는 것으로 관측되었다. 표 5에서 볼 수 있는 것과 같이 1% Tween-20 용해 용액을 이용하여 수득한 후에 등가의 정제 안된 바이러스(정제 전에)를 생산하였다. 그러나, 고속 및 저속 관주를 하였을 경우에 바이러스 용액의 HPLC 프로파일에 상당한 차이가 있음을 볼 수 있다.
바이러스 생산량에서 배지의 포도당 농도의 영향
포도당 농도(g/L) ≥2.0 ≥1.0
바이러스 생산량(PFU) 4 ×1012 4.9 ×1012
도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 저속 배지 관주를 이용하여 바이러스 용액으로부터 매우 잘 분리된 바이러스 피크(보지시간 9.39분)을 얻었다. 저속 배지 관주 하에 생산된 바이러스 용액의 1단계 이온 교환 크로마토그래피 정제후에 최적의 순도 및 생물학적 활성을 가지는 바이러스를 얻을 수 있다는 것을 알았다. 한편, 고속 관주하에서 얻어진 바이러스 용액으로부터 보지시간이 9.39분에 바이러스 피크가 분리되지 않았다. 이는 고속 배지 관주하에서는 바이러스와 동일한 용출액을 가지는 오염물질이 만들어진다는 것을 의미한다. 오염물질의 특징은 분명하게 밝혀지지는 않았지만, 오염물질은 생산 세포로부터 고속 배지 관주하에 세포외 매트릭스 단백질 생산이 증가되는 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 다음의 실시예에서 볼 수 있는 것과 같이, HPLC에서 볼 수 있는 분리 특징이 약하여 IEC 정제 공정도 어렵게 한다. 결과적으로, CellcubeTM상에서 세포 생장 및 바이러스 생산 상동안에 이용된 배지 관주 속도는 바이러스의 IEC 정제에 상당한 영향을 준다는 것이다. 저속 배지 관주가 적절하다. 저속 배지 관주를 이용하면, 원 생성물의 정제가 용이할 뿐만 아니라 배지 소비가 줄어들어 비용측면에서도 효과적이다.
실시예 3
세포 수득 및 용해 방법
기존 실험을 바탕으로, 발명자들은 우선 냉동-해동 방법을 평가하였다. 세포를 감염후 45-48시간후에 CellcubeTM로부터 수득하였다. 우선, CellcubeTM를 배양 시스템으로부터 분리하고, 사용된 배지는 배출한다. 그 다음 50mM EDTA 용액을 Cube에 펌프하여, 배양 표면으로부터 세포를 분리시킨다. 그 다음 수득된 세포 현탁액은 10분간 1,500rpm(Beckman GS-6KR)으로 원심분리하였다. 생성된 세포 펠렛은 Dulbecco's 인산 완충염(DPBS)에 재현탁시킨다. 세포 현탁액은 37℃ 수조와 드라이아이스 용기에서 냉동/해동 과정을 5회 반복하여 세포로부터 바이러스를 방출시킨다. 수득된 정제안된 세포 용해물질(CCL)을 HPLC 분석하였다.
도 2에서는 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다. 9.32분에 바이러스 피크가 관찰되지는 않았다. 대신, 9.11분과 9.78분에 두 개 피크가 생성되었다. 이 프로파일은 바이러스와 유사한 용출 시간을 가지는 다른 오염물질이 CCL에 존재하여, 바이러스 정제를 방해한다는 것을 의미한다. 그 결과 FPLC를 이용하여 CCL을 IEC에 의해 정제하였을 경우에 정제 효율이 매우 낮다는 것을 알 수 있다.
정제 효율에 낮은 것에 추가하여, 표 6에서 볼 수 있는 것과 같이 세포 수득 과정 동안에 생성물 손실 양이 상당하다. 버려지는 EDTA 용액에서 생성물의 20% 정도를 상실한다. 또한, 버리게 되는 사용된 배지에도 정제 안된 바이러스 생성물이 약 24%가 존재하였다. 따라서, CCI에 정제 안된 바이러스 생성물이 56% 정도만 존재한다. 또한, 냉동-해동 과정이 가장 변화가 있는 과정으로 규모를 증가시키는데 제한 요소가 된다. 생성물의 손실이 적으면서 좀더 효과적인 세포 용해 과정을 개발할 필요가 있다.
CellcubeTM로부터 세포를 EDTA 수득하는 동안에 바이러스 손실량
폐기물 정제안된 생성물 총 생성물(PFU)
사용한 배지 EDTA 수득용액 세포 용해물
용적(㎖) 2800 2000 82 -
역가(PFU/㎖) 2.6 ×108 3 ×108 2 ×1010 -
총바이러스(PFU) 7.2 ×1011 6 ×1011 1.64 ×1012 3 ×1012
비율 24% 20% 56%
1 mer Cellcube에서 얻은 데이타
세포 용해를 위한 비-이온성 계면활성제 평가
계면활성제 농도(w/v) 화학물질 비고
Thesit 1%0.5%0.1% 도데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n n=9-10 많은 침전
NP-40 1%0.5%0.1% 에틸페놀폴리(에틸렌-글리코에테르)n n=9-11 많은 침전
Tween-20 1%0.5%0.1% 폴리(옥시에틸렌)n-솔비탄-모노라우레이트n=20 적은 침전
Brij-58 1%0.5%0.1% 세틸폴리(에틸렌글리코에테르)n n=20 흐린 용액
Triton X-100 1%0.5%0.1% 옥실페놀폴리(에틸렌글리코에테르)n n=10 많은 침전
세포내 기관을 방출하기 위한 세포 용해를 시키는데 계면활성제를 이용하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 아데노바이러스를 방출하기 위한 계면활성제 용해 방법을 평가하였다. 표 7에서는 세포 용해 과정에서 5가지 다른 비-이온계 계면활성제를 나열한 것이다. 50mM EDTA를 이용하여, 감염 후 48시간에 세포를 CellcubeTM로부터 수득하였다. 세포 펠렛은 표 7에 나타낸 상이한 계면활성제를 다른 농도에서 현탁하였다.
세포 용해는 30분간 실온 또는 얼음에서 실행하였다. 침전물 및 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 원심분리하면 맑은 용해 용액을 얻을 수 있다. 용해 용액은 벤조네이즈로 처리하고, 그 다음 HPLC로 분석하였다. 도 3에서는 상이한 계면활성제를 이용한 용해 용액의 HPLC 프로파일을 나타내었다. Thesit와 NP-40는 Triton X-100과 비슷하게 작용되었다. 1% Tween-20을 이용한 경우에 용해 용액은 최상의 바이러스 해상도를 가지고, Brij-58을 이용하여 관찰되는 최저 바이러스 해상도를 가진다. 1%(w/v) 계면활성제 농도에서 가장 효과적인 세포 용해가 일어난다는 것이다. 용해 온도는 검사한 계면활성제 농도하에 바이러스 해상도에 중요한 인자는 아니다. 공정을 간단하게 하기위해서는 실온에서 용해하는 것을 권장한다. 20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2 pH=7.50 용액에 1% Tween-20로 구성된 용해 용액을 이용하여, CellcubeTM에서 수득한 바이러스 수득 및 세포 용해하였다.
실시예 4
바이러스 회수상에 농축 및 다이아필터레이션의 효과
용해 단계의 바이러스 용액을 정화하고, 농축/다이아필터레이션하기 전에 여과되었다. 100K, 300K, 500K, 1000K을 포함하는 상이한 NMWCs를 가지는 TFF 막에 대해 농축/다이아필터레이션의 효과를 평가하였다. 300K NMWC 막을 이용하는 경우에, 여과물에서 바이러스 손실량을 최소로 하면서 최대 배지 유동을 얻을 수 있다. 더 큰 NMWC 막을 이용하면 더 높은 배지 유동을 얻을 수 있지만, 여과물에 바이러스 손실량이 증가되고, 반면에 더 적은 NMWC 막을 이용하면 배지 유동이 불충분하다. 바이러스 용액은 우선 10배 농축시키고, 그 다음 일정한 용적 방법을 이용하여, 20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2, pH=9.00 완충액에 대해 4배 샘플 용적의 다이아필터레이션을 실시한다. 농축/다이아필터레이션 공정동안에 막을 통한 압력 차이는 ≤5 psi으로 유지한다. 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이 농축/다이아필터레이션 동안에 바이러스 회수 수준이 일정하게 높은 수준이 된다는 것을 알 수 있다.
정제 안된 바이러스 용액의 농축/다이아필터레이션
역가(PFU/㎖) 용적(㎖) 총바이러스(PFU) 회수
Run #1 Run #2 Run #1 Run #2 Run #1 Run #2 Run #1 Run #2
전 conc./diafl. 2.6×109 2×109 1900 2000 4.9×1012 4×1012
후 conc./diafl. 2.5×1010 1.7×1010 200 200 5×1012 3.4×1012 102% 85%
농도 9.5 10
인자
여과물 5×105 1×106 3000 3000 1.5×109 3×109
실시예 5
벤조네이즈 처리 시에 염을 추가하는 경우의 효과
농축/다이아필터레이션후에 바이러스 용액은 벤조네이즈(뉴클레아제)로 처리하여 바이러스 용액내에 불순물 핵산 농도를 줄인다. 50, 100, 200, 300 units/㎖등의 여러 가지 다른 농도에서 핵산 농도를 감소시키는데 영향을 평가하였다. 공정을 간단하게 하기 위해, 실온에서 하룻밤동안 처리하였다. 벤조네이즈 처리 후에 사람 게놈 DNA에 하이브리드할 수 있는 오염 핵산이 상당히 감소했다는 것을 알 수 있다.
표 9에서 볼 수 있는 것과 같이 벤조네이즈 처리전후의 농도가 상당히 감소되었음을 알 수 있다. 벤조네이즈 처리 전후에 HPLC를 통하여 바이러스 용액을 분석하였다. 도 4A 및 4B에서 볼 수 있는 것과 같이, 벤조네이즈 처리 후에 오염물질 핵산의 피크가 급격히 감소되었다는 것을 알 수 있다. 이는 핵산 하이브리드 검사 결과와 일치한다. 효과 때문에, 정제안된 바이러스 용액은 100u/㎖ 농도의 벤조네이즈로 처리한다.
바이러스 용액에서 오염물질 핵산 농도의 감소(처리 조건: 벤조네이즈 농도는 100u/㎖, 온도는 실온, 시간은 하룻밤)
처리전 처리후 감소
오염물질 핵산 농도 200㎍/㎖ 10ng/㎖ 2 ×104-fold
벤조네이즈 처리 전후에 HPLC 프로파일에 상당한 변화가 있었다. 벤조네이즈 처리후에 9.33 시간에 분리된 바이러스 피크가 감지되지 않았다. 동일한 시간대에, 9.54분에 260㎚ 높은 흡수를 가지는 주요 피크가 관찰되었다. 역가 검사 결과에 따르면, 벤조네이즈 처리는 바이러스 역가에 나쁜 효과를 주지 않으며 바이러스는 벤조네이즈 처리 후에도 고유 상태를 유지하고, 감염성도 유지된다. 세포 용해 단계동안에 방출되는 세포 핵산은 바이러스와 상호작용하여, 바이러스와 응집되거나 또는 벤조네이즈 처리동안에 바이러스 표면에 흡착되기 때문이다.
벤조네이즈 처리 동안에 핵산과 바이러스의 상호작용을 가능한 최소화시키기 위해, 벤조네이즈 처리 전에 바이러스 용액안에 다른 농도의 NaCl을 첨가한다. 바이러스 용액에 1M NaCL 존재하는 상태에서 벤조네이즈를 처리하여 얻은 HPLC 프로파일에 심한 변화는 없었다. 도 5에서는 1M NaCl 존재 하에 벤조네이즈 처리후 바이러스 용액의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다. 도 4에서 볼 수 있는 것과는 달이, 벤조네이즈 처리 후에도 9.35분에 바이러스 피크가 여전히 존재하엿다. 이 결과는 1M NaCl이 벤조네이즈 처리하는 동안에 핵산과 바이러스의 상호작용을 방해하고, 오염 핵산으로부터 바이러스를 추가 정제하도록 한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6
이온 교환 크로마토그래피 정제
생리적 pH에서 아데노바이러스 표면에 음전하가 있는 경우에 아데노바이러스 정제에 음이온 교환기를 평가하였다. 정제 방법을 개발하기 위해 강한 음이온 교환기 Toyoperal Super Q 650M을 이용하였다. 바이러스 정제시에 NaCl 농도 및 적하 완충액(완충액 A)의 pH 효과는 FPLC 시스템을 이용하여 평가하였다.
A) 방법 개발
이온 교환 크로마토그래피의 경우에, 완충액의 pH가 가장 중요한 변수이고, 정제 효과에 상당한 영향을 준다. 바이러스를 생산하는 동안 배지 pH, 전도성에 관계하여, 발명자는 완충액 A를 20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.2M NaCl, pH=7.50로 하였다. 5㎝ 높이로 Toyopearl SuperQ 650M가 채워진 XK16 컬럼을 완충액 A로 조건화하였다.
Celligen 바이오리엑터에서 바이러스 상청액을 벤조네이즈로 처리하고, 농축/다이아필터레이션한 샘플 5㎖을 컬럼에 적하시킨다. 컬럼을 세척한 후에 선형 경사도를 가지는 Tris + 1mM MgCl2 + 2M NaCl, pH=7.50의 완충액 B를 10배 이상의 용적으로 용출을 실행하였다.
도 6에서는 용출 프로파일을 나타낸다. 만족스러운 분리가 없어도 용출하는 동안에 세 개 피크를 관찰할 수 있다. 293 세포 조건화 배지(바이러스는 없음)로 실행한 기준 연구에 따르면 처음 두 개 피크가 바이러스와 관련이 있다. 분리 효과를 개선시키기 위해, 완충액 pH의 영향을 평가하였다. 완충액 pH를 9.00으로 증가시키면서 다른 조건은 일정하게 유지시킨다. 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이, pH 7.50의 완충액의 경우와 비교하였을 때 상당히 개선되었음을 볼 수 있다. 분취물 #3, #4, #8를 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 대부분의 바이러스는 #4에서 발견되고, #3과 #8에서는 바이러스가 감지되지 않았다. #8는 오염 핵산이 주로 포함되어있다. 그러나, 정제가 아직 덜 된 것 같다. #3과 #4사이가 겹쳐지는 것은 여전히 #4에 오염물질이 있다는 것을 말한다.
도 7의 크로마토그래피를 기초로 하여, 완충액 A에 염의 농도를 증가시키면 바이러스 정제를 개선시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. 그 결과 바이러스 피크 바로 앞의 것인 #3에 존재하는 오염물질은 마찰을 통하여 흐름이 이동된다. 완충액 A에 NaCl 농도는 0.3M로 증가되지만, 다른 조건은 일정하게 유지시킨다. 도 9에서는 완충액 A에 염 농도를 0.3M NaCl로 하여 용출 프로파일을 나타낸 것이다.
정제 효과가 급격하게 개선되었다. 예상한 것과 같이 도 7에서 볼 수 있었던 오염 피크는 염의 농도를 증가시킬 경우에 사라진다. 정제 안된 바이러스 상청액으로부터 샘플을 취하고, 통과시켜, 피크 #1과 #2를 HPLC를 통하여 분석하였다. 마찰을 통한 흐름에서 바이러스는 감지되지 않았다. 피크 #1을 HPLC 분석하면 한 개 바이러스 피크를 볼 수 있다. 이와 같은 HPLC 피크는 이중 CsCl 경사도 정제된 바이러스에서 수득한 것과 등가이다. CsCl 경사도에 의해 정제된 피크에서 보유 시간이 3.14분 및 3.61부에서 관찰된 피크는 글리세롤 관련 피크이다. 정제된 바이러스의 A260/A280 비율은 1.27 ±0.03이다. 이는 이중 CsCl 정제된 바이러스의 값가 유사할 뿐만 아니라 Huyghe et al.,(1996)가 보고한 결과와도 비슷하다. 피크 #2는 오염 핵산으로 주로 구성된다. 정제 결과를 기초하여 볼 때, 발명자는 바이오리엑터에서 취한 아데노바이러스 상청액을 IEC 정제하기 위해서 다음의 방법을 제시하였다.
완충액 A: 20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.3M NaCl, pH=9.00
완충액 B: 20mM Tris + 1mM MgCl2 + 2M NaCl, pH=9.00
용출: 10배 컬럼 용적, 선형 경사도
B) 용량을 늘리는 방법
방법을 개발한 후에, 동일한 정제 방법을 이용하여, XK16 컬럼(1.6㎝ I.D.)대신에 XK50 컬럼(5㎝ I.D., 10배 규모 상향)를 사용하는 정제 방법의 규모를 상향시켰다. 도 11에서 볼 수 있는 것과 같이 XK50 컬럼에서 유사한 용출 프로파일을 얻었다. 바이러스 분취물은 HPLC상에서 분석하였는데, 이는 XK16 컬럼에서 수득한 것과 등가의 바이러스 순도를 나타내었다.
규모를 상향시키는 연구를 하는 동안에, 완충액 A의 염 농도를 정량화시키기 위해 전도성을 이용하는 것이 편리하다. 완충액 A의 적절한 전도성 범위는 실론(21℃) 25 ±2 mS/㎝이다. 정제과정 동안에 생성된 샘플과 이중 CsCl 정제된 바이러스를 함께 SDS-PAGE상에서 분석하였다.
도 12에서 볼 수 있는 것과 같이, 대부분 주요 아데노바이러스 구조 단백질은 SDS-PAGE상에서 감지되었다. IEC 정제된 바이러스에서는 이중 CsCl 정제된 바이러스의 것과 유사한 착색이 나타났다. 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 정제하는 동안에 상당히 감소되었다. 정제된 바이러스에서 BSA 농도는 도 13의 웨스턴 블랏 검사에서 감지되는 수준보다 낮았다.
정제 과정동안에 오염 핵산 농도가 감소되는 정도는 핵산 슬롯 블랏을 이용하여 측정한다. 하이브리드 프로브로 32P 라벨된 사람 게놈 DNA를 이용하였는데 그 이유는 293 세포가 사람 배아 신장 세포이기 때문이다. 표 10에서는 여러 다른 정제 과정 단계에서 핵산 농도를 나타낸 것이다. 최종 정제된 바이러스 용액에서 핵산 농도는 60pg/㎖이었는데, 이는 초기 바이러스 상청액의 농도와 비교할 때 3.6 ×106 배 감소된 것이다. 정제된 바이러스로부터 총 입자에 대한 바이러스 역가 및 감염성을 평가하였고, 그 결과는 표 9에 있는 이중 CsCl 정제과정의 것과 비교하였다. 두 정제 방법에서 바이러스 회수 및 입자/PFU 비율이 매우 유사하였다. 컬럼 정제된 바이러스 용액의 역가는 농축을 실행하면 추가로 더 증가시킬 수 있다.
정제하는 동안에 오염 핵산의 제거
정제 단계 오염물질 핵산 농도
바이오리엑터의 바이러스 상청액 220㎍/㎖
농축/여과 상청액 190㎍/㎖
벤조나제 처리후 상청액(O/N,RT,100u/㎖) 10ng/㎖
컬럼정제된 바이러스 210pg/㎖
농축/여과후 정제된 바이러스 60pg/㎖
CsCl 정제된 바이러스 800pg/㎖
실시예 7
다른 정제 방법
강한 음이온 교환 크로마토그래피 방법 이외에도, 다른 방식의 크로마토그래피(가령, 크기 압출 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 금속 이온 친화력 크로마토그래피)를 이용하여 AdCMVp53 바이러스의 순도를 평가하였다. Toyopearl Super Q의 것과 비교하였을 경우에, 모든 정제 방법이 다소 효과적이지 못하고, 생성물 회수율도 낮았다. 따라서, AdCMVp53를 정제하는 경우에는 Toyopearl Super Q 수지를 권한다. 그러나, 일부 공정을 변형시킨 경우에, AdCMVp53를 정제하고자 할 때, 강한 음이온 교환을 이용한 다른 4가 암모니아 화학물질이 적합할 수도 있다.
실시예 8
Cellcube TM 에서 얻은 정제 안된 AdCMVp53 바이러스의 정제
AdCMVp53 바이러스를 만들기 위해 두 가지 다른 생산 방법이 개발되었다. 한 가지는 교반 탱크 반응기내에 마이크로캐리어를 이용하는 것이다. 다른 하나는 CellcubeTM 바이오리엑터를 이용하는 것이다. 상기에서 설명한 것과 같이, 정제 방법은 교반 탱크 바이오리엑터에서 발생된 정제 안된 바이러스 성청액을 이용하여 개발하였다. 바이오리엑터 및 CellcubeTM에서 바이러스를 생산하기 위해 동일한 배지, 세포, 바이러스가 이용되었지만, 세포가 흡착하는 표면적은 다르다.
바이오리엑터의 경우에, 세포는 유리가 피복된 마이크로캐리어에서 생장시키고, CellcubeTM의 경우에는 독점적으로 처리된 폴리스테렌 배양 표면에서 생장시켰다. 한편 CellcubeTM에서는 일정하게 배지를 관주시키고, 바이오리엑터에서는 배지 관주를 실행하지 않았다. CellcubeTM의 경우에, 정제 안된 바이러스 생성물을 바이러스 감염된 세포 형으로 수득하는 반면에 이와는 달리 바이오리엑터에서는 바이러스 상청액 형으로 수득한다.
바이러스 감염된 세포를 5회 냉동-해동과정을 거친 후에 생산된 정제 안된 세포 용해물질(CCL)를 상기에서 설명하는 방법을 이용하여 IEC로 정제하였다. 바이오리엑터에서 수득한 바이러스 상청액과는 달리, CellcubeTM에서 얻은 CCL 물질의 경우에는 정제가 만족스럽지 못하였다. 도 14에서는 크로마토그램을 나타낸 것이다. 이 결과에 따르면, 냉동-해동을 반복하여 CellcubeTM에서 얻은 바이러스 용액은 IEC 방법으로는 정제되지 않는다는 것을 의미한다.
CCL에서 바이러스 정제에 대해 소수성 상호작용, 금속 킬레이트 크로마토그래피를 포함하는 다른 정제 방법도 검사하였다. 불행하게도, 이들 방법에서 정제가 개선된 것은 없었다. CCL에서 바이러스 정제가 어렵고, 생산 과정에서 냉동-해동 과정과 연관된 단점을 감안하여, 발명자는 다른 용해 방법을 조사하기로 하였다.
A) 용해 완충액에서 정제 안된 바이러스 용액의 정제
실시예 1과 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 상이한 계면활성제 용해 방법을 스크린하는데 HPLC 분석을 이용하였다. HPLC 결과에 기초하여, 용해 완충액으로 1% Tween-20 20mM Tris + 0.25M NaCl + 1mM MgCl2, pH=7.50 용액을 이용하였다. 바이러스 생산 상이 종료될 즈음에 감염된 세포를 수득하는 대신에, 사용된 배지를 빼내고, 용해 완충액을 CellcubeTM에 공급하였다. 30분간 배양하면, 세포를 용해되고, 용해 완충액으로 바이러스가 방출된다.
정화 및 여과 후에, 바이러스 농액은 농축/다이아필러테리션하고, 벤조네이즈로 처리하여 오염 핵산 농도를 줄인다. 처리된 바이러스 용액은 Toyopearl SuperQ 수지를 이용하여 상기 설명한 방법으로 정제하였다. 바이오리엑터에서 수득한 바이러스 상청액에서 얻은 것과 비슷한 분리 결과를 얻었다. 도 15에서는 용출 프로파일을 나타낸다. 그러나, 바이러스 분취물을 HPLC 상에서 분석하면, 바이러스 피크이외에 다른 피크가 감지된다. 그 결과는 도 16A에 나타내었다.
바이러스를 추가 정제하기 위해, 수집된 바이러스 분취물은 동일한 방법으로 다시 정제하였다. 도 16B에서 볼 수 있는 것과 같이, 2차 정제후에 바이러스 분취물의 순도는 상당히 개선되었다. 금속 킬레이트 크로마토그래피를 제 2 정제 방법으로 적합한지를 평가하였다. 제 2 IEC에서 볼 수 있는 것과 같이 바이러스 순도가 비슷하게 개선되었다. 그러나, IEC가 간단하기 때문에 제 2 정제 방법으로 선택하였다.
실시예 2에서 설명하는 것과 같이, 세포 생장 및 바이러스 생산동안에 이용된 배지 관주는 Tween-20 정제 안된 바이러스 수득을 HPLC 분리 프로파일에 상당한 충격을 준다. 고속 관주하에 생성된 정제 안된 바이러스 용액의 경우에, 요구하는 바이러스 순도를 얻기 위해서는 두 개 이온 교환 컬럼이 필요하다.
저속 배지 관주하에 생성된 바이러스 용액의 경우에 HPLC에서 분리가 상당히 개선되었다는 것을 기초로하여, 한 개 이온 교환 컬럼을 통하여 정제하면 요구하는 바이러스 순도를 얻을 수 있을 것이다. 도 17에서는 저속 배지 관주하에 생성된 정제 안된 바이러스 용액의 용출 프로파일을 나타냈다. 용출하는 동안에 높은 바이러스 피크를 얻었다. 바이러스 분취물을 HPLC 분석하면, 한 개 이온 교환 크로마토그래피를 실행한 후에 바이러스 순도는 CsCl 경사도의 것과 유사하다는 것을 알 수 있다. 도 18은 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
정제된 바이러스는 SDS-PAGE와 BSA의 경우 웨스턴 블랏으로 분석하였고 오염 핵산 농도를 결정하기 위해 핵산 슬롯 블랏을 시행하였다. 분석 결과는 각각 도 19A, 19B, 19C에 나타내었다. 모든 분석 결과에서 컬럼 정제된 바이러스는 이중 CsCl 경사도에 의해 정제된 바이러스와 필적할 정도의 순도를 가지는 것으로 나타났다. 표 11에서는 컬럼 정제전후에 바이러스 역가 및 회수율을 나타내었다. 비교를 위해, 이중 CsCl 경사도 정제에 의해 수득된 일반적인 바이러스 회수율을 포함시켰다. 두 가지 방법모두 바이러스 회수율이 비슷하였다.
CellcubeTM로부터 AdCMVp53의 ICE 및 이중 CsCl 경사도 한외원심분리 정제 비교
역가(PFU/㎖) A260/A280 입자/PFU 회수
IEC 1 ×1010 1.27 36 63%
한외원심분리 2 ×1010 1.26 38 60%
A) 수지 용량 연구
저속 관주 하에 생산된 Tween 20으로 수득된 바이러스 용액을 정제하기 위해 Toyopearl Super Q 수지의 용량을 평가하였다. XK50 컬럼에 100㎖ 수지를 채운다. 여기에서 설명하는 방법을 이용하여 컬럼을 통하여 상이한 양의 정제 안된 바이러스 용액을 정제하였다.
HPLC 상에서 바이러스 파괴 및 정제 효과를 검사하였다. 도 20에서는 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 샘플/컬럼 용적 비가 2:1보다 큰 경우에 바이러스 분취물의 순도는 감소된다. 오염물질은 바이러스와 함께 용출된다. 적하 인자가 3:1이상의 경우에 유동과정에서 바이러스의 파괴를 관찰할 수 있다. 따라서, 수지의 작업 적하 용량은 샘플/컬럼 용적 비가 1:1가 되도록 한다.
B) 정제 후 농축/다이아필터레이션
컬럼 정제후에 농축/다이아필터레이션을 하는 이유는 바이러스 역가를 증가시키기 위함인데, 필요한 경우에 바이러스 생산물에 특정한 바이러스 완충액으로 교환할 수 있다. 정제 단계에는 300K NMWC TFF 막을 이용한다. 정제된 바이러스에 단백질유사물질, 핵산 오염물질이 존재하지 않기 때문에, 막을 통한 압력의 급격한 하강 없이도 매우 큰 완충액 유동을 얻을 수 있다.
완충액을 20mM Tris + 1mM MgCl2 + 0.15M NaCl, pH=7.50으로 바꾸면 이 단계 동안에 거의 100% 바이러스가 회수된다. 정제된 바이러스는 농축/다이아필터에리션 단계 동안에 DPBS로 바뀔 수 있다. 최종 생성물에 바람직한 바이러스 역가와 컬럼으로부터 용출되는 바이러스 용액의 역가로 농축 인자를 결정한다. 이와 같은 유동성은 최종 정제된 바이러스 생성물의 농도를 유지하는데 도움이 된다.
C) IEC 정제된 AdCMVp53에 결손 바이러스의 평가
생산 세포에서 아데노바이러스의 패키지 효율은 100%가 되지 않기 때문에, 정제안된 바이러스 용액에는 일부 결손 아데노바이러스가 존재한다. 결손 바이러스는 바이러스 캡시드안에 DNA를 포집하지 못하기 때문에, 밀도 차이를 이용하여 CsCl 경사도 한외원심분리를 이용하여 고유 바이러스와 분리할 수 있다. 두 바이러스가 모두 비슷한 표면 화학성질을 가지기 때문에 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 고유 바이러스에서 결손 바이러스를 분리하는 것은 어려울 것으로 보인다. 과량의 결손 바이러스가 존재하면 정제된 생성물의 순도에 영향을 줄 것이다.
존재하는 결손 바이러스 입자의 비율을 평가하기 위해, 정제 농축된 바이러스는 등밀도 CsCl 한외원심분리를 한다. 도 21에서 볼 수 있는 것과 같이, 원심분리후에 고유 바이러스 밴드위에 희미한 밴드를 관찰할 수 있다. 두 개 밴드를 회수하여, 20mM Tris + 1mM MgCl2, pH=7.50 완충액에 대해 투석하여 CsCl를 제거한다. 투석된 바이러스는 HPLC에서 분석하고 그 결과는 도 22에 나타내었다. 두 가지 바이러스 모두 비슷한 보지시간을 가진다. 그러나, 결손 바이러스는 고유 바이러스의 것보다는 A260/A280 비율이 더 적다. 이는 결손 바이러스에 바이러스 DNA가 더 적다는 것을 의미한다.
-70℃로 냉동시키기전에 바이러스(10% v/v)에 글리세롤를 첨가하면 3.02분 내지 3.48분 사이에 피크를 볼 수 있다. 결손 바이러스 비율은 전체 바이러스에 1% 미만이다. 이와 같이 결손 바이러스 비율이 정제된 바이러스 생성물에 총 입자에 대해 감염성 바이러스(PFU)에 영향을 준다. SDS-PAGE(도 19A)에 의해 두 가지 바이러스를 분석하였다. 고유 바이러스와 비교하였을 경우에, 결손 바이러스에는 24 및 48.5 KD에 DNA 연합된 코어 단백질이 부족하였다. 이 결과는 결손 바이러스에 DNA가 존재한다는 것과 일치한다.
D) AdCMVp53 바이러스의 생산 및 정제 과정
상기 개발 결과에 기초하여, 발명자는 도 23에서 볼 수 있는 것과 같이, 발명자는 AdCMVp53의 생산 및 정제 순서를 제공하였다. 1 mer CellcubeTM에 기초하여, 이에 상응하는 바이러스 생산량과 함께 바이러스 회수 단계등이 포함된다. 최종 바이러스 회수비율은 70 ±10%이다. 이는 DEAE 이온 교환기 및 아데노바이러스를 인코드하는 p53 단백질을 정제하기 위해 금속 킬레이트 크로마토그래피 정제를 이용하여, Huyghe et al.,(1996)가 보고한 바이러스 회수율보다 약 3배 이상이 된다. 1 mer CellcubeTM에서 최종 정제된 바이러스 생성물 3 ×1012 PFU정도가 된다. 정제를 위해 이중 CsCl 경사도 한외원심분리를 이용하여 현재 생산 방법과 비교하였을 경우에 최종 생산율은 비슷하였다.
E) 규모 상향
4mer CellcubeTM 시스템으로 규모 상향 연구를 성공적으로 실행하였고, 현재 16 mer CellcubeTM 시스템에서 바이러스 생산을 평가하였다. 생산된 정제 안된 바이러스 용액을 정제하고, 농축시키고, Pellicon 카세트를 이용하여 다이아필터시킨다. 바이러스의 품질 및 회수를 결정한다. 벤조네이즈 처리 후에, 정제안된 바이러스 용액은 각각 4mer 및 16mer인 20㎝ 및 30㎝ BioProcess 컬럼을 이용하여 정제한다.
실시예 9
무혈청 현탁 배양물에서 Ad-p53 생산이 개선
293 세포의 적응화
T-플라스크에 FBS 농도를 연속하여 낮추면 293 세포는 시판되는 IS293 무혈청 배지(Irvine Scientific; Santa Ana, CA)에 적응시킨다. 한 개 바이알 PDWB에서 냉동된 세포를 해동시키고, T-플라스크에 10% FBS DMEM 배지에 두고, 세포는 배지에 연속적으로 FBS 농도를 낮춤으로써 T-플라스크에 무혈청 IS 293 배지에 적응시킨다. T-75 플라스크에 6회 계대후에, FBS%가 약 0.019%정도인 것으로 평가되었다. 세포는 스피너 플라스크로 옮기기 전에 T 플라스크에 2회 이상 추가 계대한다.
T 플라스크에 무혈청 적응된 293 세포를 현탁 배양에 적응시킨다.
T 플라스크에 있는 상기 무혈청 적응 세포는 현탁 배양을 위해 무혈청 250㎖ 스피너 현탁 배양물(100㎖ 작업 용적)로 이동시킨다. 세포 배양하는 동안에 생존능은 감소되고, 큰 세포 덩어리가 관찰된다. T-플라스크에서 2회 이상 계대한 후에, 현탁 배양물에 다시 적응시킨다. 두 번째 시도에서는 배지에 헤파린을 100㎎/ℓ 농도로 첨가하여 세포 응집을 방지하고, 초기 세포 밀도는 1.18E+5 vc/㎖로 증가된다. 세포 배양 동안에, 세포 밀도는 약간 증가되고, 세포 생존능은 유지된다. 세포를 7회 이상 스피너 플라스크에서 계대한 후 그리고 계대하는 동안에 세포의 배가 시간은 상당히 감소되어, 7회 계대 종료시점에서는 배가 시간이 약 1.3일이 되어 이는 부착 세포 배양에서 10%FBS 하에 세포의 배가 시간(1.2일)과 필적할만한 수준이다. 헤파린이 추가된 무혈청 IS293 배지에서, 현탁 배양에서 세포 군집을 형성하지 않고 거의 모든 세포는 개별적으로 존재한다(표 12).
무혈청 현탁 배양 : 현탁액에 적응
계대수 플라스크 No. 평균배가시간(days)
11 생존능 감소
13 3.4
14 3.2
15헤파린 첨가 1234 생존능 감소4.75.03.1
16 1234 5.54.84.34.3
17 1234 2.93.52.41.7
18 1234 3.513.16.13.8
19 1234 2.52.62.32.5
20 1234 1.3 (97% 생존능)1.5 (99% 생존능)1.8 (92% 생존능)1.3 (96% 생존능)
스피너 플라스크에서 무혈청 현탁배양을 이용한 경우에 바이러스 생산 및 세포 생장
무혈청 현탁 배양에서 Ad5-CMVp53 벡터 생산을 테스트하기 위해, 250㎖ 스피너 플라스크에 0.1% Pluronic F-68 및 헤파린이 보충된 100㎖ 무혈청 IS293 배지에서 무혈청 현탁 배양물에 적응된 상기 세포를 생장시킨다. 세포가 3일째에 1.36E+06 살아있는 세포/㎖가 되면 세포에 감염시킨다(MOI는 5). 상청액은 매일 HPLC 분석하여, 감염 후 바이러스 입자/㎖를 계산한다. 3일이전 샘플에서는 바이러스가 감지되지 않는다. 3일 째에 2.2E+09 vps/㎖이고, 6일째에 2.6+/-0.6E+07 pfu/㎖이다. 세포당 pfu는 19인 것으로 나타났는데, 이는 혈청이 보충된 배지에서 흡착 배양을 한 경우보다 약 46배 적은 것이다. 기준으로는 감염을 시키지 않은 상태에서 세포 생장을 점검하였다.
무혈청 현탁 배양: 바이러스 생산 및 세포 생장
바이러스 감염없는 기준 배지교환없이 바이러스 감염 배지교환과 바이러스 감염
초기 밀도(vc/mL) 2.1 ×105 2.1 ×105 2.1 ×105
감염시 세포밀도(vc/mL) 9.1 ×105 1.4 ×106 1.5 ×106
용적당 바이러스 생산(pfu/mL) 6 days P.I. NA 2.7 ×107 2.8 ×108
용적당 바이러스 생산(HPLC vps/mL) 6 days P.I. NA NA 1.3 ×1010
세포당 바이러스 생산(HPLC vps/cell) NA NA 1.3 ×104
무혈청 현탁액에 적응된 293 세포 뱅크 준비
상기에서 설명한 것과 같이, 세포는 Ad-p53 벡터를 생산하고, 스피너 플라스크에 0.1%F-68 및 100mg/ℓ헤파린이 보충된 무혈청 IS293 배지에서 증식되어 1.0E+07(살아있는 세포/㎖/바이알)을 포함하는 무혈청 현탁액에 적응된 세포 뱅크를 만들었다. 세포를 수집하기 위해, 세포가 중간 정도의 로그상태에 있을 때 원심분리하고, 생존능은 90%이상인 것으로 나타났고, IS293이 보충된 무혈청 배지에 재현탁시키고, 다시 원심분리하여 세포를 씻어낸다. 세포는 다시 0.1%F-68, 100mg/ℓ헤파린, 10% DMSO, 0.1% 메틸셀룰로오즈가 있는 차가운 IS293에 다시 현탁하면 1E+07 생존세포/㎖가 된다. 세포 현탁액은 멸균 저온 바이알에 옮기고, 이를 봉하여 -70℃에서 하룻밤동안 냉동시킨다. 바이알은 액체 질소 저장소로 옮긴다. 미코플라즘 테스트는 음성으로 나타났다.
냉동된 세포를 다시 되살리기 위해, 한 개 바이알을 T-150에 0.1% F-68, 100mg/ℓ헤파린이 보충된 50㎖ IS293 배지에서 해동시킨다. 그 다음 배양물은 250㎖ 스피너 플라스크에서 2회 계대한다. 다른 연구에서 한 개 바이알은 250㎖ 스피너 플라스크에서 100㎖ 무혈청 보충 IS293 배지로 해동시킨다. 무혈청 스피너 플라스크에서 이를 2회 계대한다. 두 연구에서 세포는 모두 잘 생장하였다.
스피너 플라스크에서 무혈청 현탁 배양물의 배지 교환 및 바이러스 생산
스피너 플라스크에서 현탁 배양의 경우 기존 무혈청 바이러스 생산의 경우에, 세포당 바이러스 생산성이 너무 낮아 무혈청 현탁 배양을 실행하지 못하였다. 이는 영양소 고갈 및 저해성 부산물의 생산으로 인한 것으로 보인다. 사용된 배지를 새로운 무혈청 보충 IS293 배지로 교환하기 위해서, 세포는 3일째에 원심분리하고, F-68과 헤파린(100㎎/ℓ) 보충된 새로운 IS-293 배지로 재현탁시키면 생성 세포 밀도는 1.20E+06 vc/㎖가 되고, 세포는 Ad5-DMVp53 벡터로 5 MOI에서 감염시킨다. 3일째에 세포외 HPLC vps/㎖는 7.7E+09 vps/㎖이고, 4일째에 1.18E+10vps/㎖이고, 5일째에 1.2E+10 vps/㎖이고, 6일째에 1.3E+10 vpa/㎖이고, 6일째에 pfu는 2.75+/-0.86E+08 tvps/㎖이다. HPLC 바이러스 입자에 대한 pfu 비율은 약 47이다. 또한, 세포를 원심분리하여 가라앉히고, CellCube 수득에서 이용된 것과 동일한 형태의 계면활성제 용해 완충액을 이용하여 세포를 용해시킨다. 세포 HPLC vps/㎖는 2일째에 1.6E+10 vps/㎖이고, 3일째에 6.8E+09 vps/㎖이고, 4일째에 2.2E+09 vpa/㎖이고, 5일째에 2.24E+09 vps/㎖이고, 6일째에 2.24E+09 vps/㎖이다.
사용된 배지를 새로운 무혈청 보충 IS 293 배지로 바꾸어주면 Ad-p53 벡터 생산이 상당히 증가된다. 배지를 대체시키면 3일째에 기존에 수준과 비교할 때 약 3.6배 이상 세포외 HPLC 바이러스 입자 생산이 증가되었고, 6일째에는 기존 수준에 비해 세포외 pfu 역가 생산이 10배 증가 높았다. 세포당 Ad-p53 벡터 생산은 약 1.33E+04 HPLC vps인 것으로 나타났다.
감염 후 2일째에 세포내 HPLC 바이러스 입자 피크가 나타났고, 입자수는 감소되었다. 다시 세포외 바이러스 입자는 수득 6일까지 점진적으로 증가된다. 거의 모든 Ad-p53 벡터는 감염후 2일간 생산되고, 세포내에 국소화되고, 그 다음 바이러스는 세포 밖으로 방출된다. 감염 후 2일 내지 3일간 거의 절반의 바이러스가 세포 밖 완충액으로 방출되고, 시간이 지남에 따라 방출 속도가 감소된다.
Ad-p53 벡터 감염된 모든 세포는 감염 후 6일 경에 생존능을 상실하고, 반면에 감염안된 세포는 97% 정도 생존한다. 감염 존재 하에, 배지 교환을 하지 않는 경우 pH 및 배지를 교환한 경우에 pH는 각 6.04, 5.97이다. 감염이 없는 경우는 pH가 7.00이 된다(표 12).
배지 교환 및 기체를 제공하는 경우에 교반 탱크에서 바이러스 생산 및 세포 배양
Ad-p53 벡터 생산성을 증가시키기 위해, 5ℓ CelliGen 바이오리엑터를 이용하여 환경을 더 조절하였다. 5ℓCelliGen 바이오리엑터의 경우에, pH, 용존산소 및 온도가 조절된다. 산소 및 이산화탄소는 산소 공급용 솔레노이드 벨브에 연결되고, pH를 조절한다. 전단 환경을 적게 하면서 혼합을 더 잘하기 위해 바다에 사용하는 프로펠라를 이용한다. 작동하는 동안에 계속 공기를 공급하여 바이오리엑터 내부에 양력은 양성으로 유지시킨다.
바이오리엑터에 접종시키기 위해, 세포 바이알은 250㎖ 스피너 플라스크에 100㎖ 무혈청 배지에서 해동시키고, 세포는 250 또는 500㎖ 스피너 플라스크에서 연장시킨다. 500㎖ 플라스크에서 생장된 800㎖ 세포 접종물은 10ℓ상자에서 2700㎖ 새로 준비한 배지와 혼합하고, 기체 압력으로 CelliGen 바이오리엑터로 옮긴다.
CelliGen 바이오리엑터의 초기 작업 용적은 약 3.5ℓ배양물이다. 프로펠라의 초기 교반 속도는 80rpm이고, 온도는 37℃, pH는 7.1에서 시작하고, 감염 후에 pH는 7.0이 되고 DO는 내내 40% 정도가 된다.
초기 세포 밀도는 4.3E+5 vc/㎖(97% 생존능), 4일 후에, 세포 밀도가 2.7E+6 vc/㎖(93% 생존능)에 도달하면, 세포는 새로운 배지에 재현타기키고, CelliGen 바이오리엑터에 옮긴다. 배지 교환 후에, 세포 밀도는 2.1E+6vc/㎖이 되고 세포는 10 MOI에서 감염시킨다. DO를 40%이하로 떨어뜨린다. DO를 40% 이상으로 유지시키기 위해, 약 500㎖ 배양물을 CelliGen으로부터 빼내어, 세포 배양에 의한 산소 요구량을 낮추고, 위쪽 프로펠라 날은 기체 및 액체사이면에 근접하게 위치하도록 하여, 표면 재생율을 증가시켜 산소 전달을 개선한다. 그 다음 작동이 종료될 때 까지 40%이상으로 유지시킨다.
pH 조절의 경우에, CO2 기체를 이용하여 세포 배양물을 산성화시키고, 1N NaHCO3을 이용하여 세포 배양물을 알칼리로 만든다. 초기 pH는 7.10으로 설정한다. 배양물의 초기 pH는 7.41이다. 약 280㎖ 1N NaHCO3 용액을 소비하면 세포 배양물의 pH는 7.1정도로 안정화된다. 세포 배양물에 바이러스를 감염시킨 후에, pH를 7.0 으로 낮추고, CO2 기체 공급 라인을 차단하여 NaHCO3 소비를 줄인다. pH 조절을 위해 너무 많은 양의 NaHCO3 용액을 사용하게 되면 세포 배양물의 용적이 필요이상으로 증가하게 된다. 70㎖ 1N NaHCO3 용액을 소비하고, pH는 대부분 7.0 내지 7.1이 된다. 온도는 35℃ 내지 37℃로 유지된다.
감염 후에, 세포 생존능은 감염후 수득 6일째 까지 서서히 감소된다. 수득하는 날에, 생존 세포는 없다. CelliGen 바이오리엑터의 바이러스 생산 용적은 스피너 플라스크의 경우(1.3E+10 vps/㎖)와 비교하였을 때, 5.1E+10 HPLC vps/㎖이 된다. CelliGen 바이오리엑터의 환경을 조절하면 배지를 교환하면서 스피너 플라스크에서 생산된 것과 비교하였을 때 Ad-p53 벡터 생산이 약 4배 증가된다. 이는 감염 시점에 세포 밀도가 1.2E+6에서 2.1E+6 vc/㎖로 증가되고, 세포당 바이러스 생산양이 1.3E+4에서 2.5E+4 vps/㎖로 증가되기 때문이다. 2.5E4 vps/㎖은 혈청 보충된 흡착 세포 배양의 경우의 3..5E+4 vps/cell와 비교할만하다.
교반 살포 바이오리엑터에서 바이러스 생산 및 세포 배양
첫 번 연구에서 세포는 바이러스 생산을 위해 교반된 바이러스에서 성공적으로 생장되었고, 산소, CO2는 바이오리엑터의 윗부분으로 공급하였다. 그러나, 이 방법은 기체 수송이 효과적이지 못하기 때문에 규모를 상향시키는데 있어서 제한을 받는다. 따라서, 두 번째 연구에서 무혈청 현탁 배양의 규모 상향을 실현하기 위해 분무 바이오리엑터에서 세포 생장 및 Ad-p53 생산을 조사하기 위해, 순수 산소 및 CO2 기체 기포로 무혈청 IS293 배지(F-68(0.1%) 및 헤파린(100㎎/ℓ보충)에 공급하였다.
액체 배지를 통하여 순수 산소 기포를 제공하여 세포에 용존 산소를 공급하고, 순수 산소 공급은 솔레노이드 벨브를 통하여 조절함으로써 용존 산소를 40%이상으로 유지시킨다. 순수 산소를 공급하기 위하여, 세포에 손상을 최소로 하면서 효과적으로 산소 공급을 하기 위해서 0.22㎛ 구멍이 있는 스테인레스 강 소결 산소 확산기를 이용한다. CO2 기체는 산소 공급을 한 동일한 확산기 및 튜브를 이용하여 액체 배지에 기포로 공급하여, pH는 7.0정도로 유지시킨다. pH 조절을 위하여, Na2CO3 용액(106g/ℓ)을 바이오리엑터에 공급한다. 공기는 바이오리엑터의 윗 부분으로 공급하여 바이오리엑터의 내부 압력을 유지시킨다. 다른 바이오리엑터 모양은 제 1 연구에 사용된 것과 동일하다.
냉동 바이알로부터 접종 세포를 얻는다. 한 개 냉동 세포(1.0E+7vc)를 T-150 플라스크에서 50㎖ 배지에 해동시키고, 500㎖ 스피너 플라스크에서 200㎖ 배지로 3회 계대한다. 2개 500㎖ 스피너 플라스크에서 생장된 400㎖ 접종 세포는 10ℓ 용기에 F-68 및 헤파린이 보충된 IS293 배지와 혼합시켜, 3.5ℓ세포 현탁액을 만들고, 이는 5ℓCelliGen 바이오리엑터로 옮긴다.
바이오리엑터의 초기 밀도는 3.0E+4 vc/㎖이다. 초기 세포 밀도는 제 1 연구의 경우보다는 적다. 제 1 연구에서 접종을 위해 500㎖ 스피너 플라스크 4개를 이용하였다. 초기 세포 밀도가 낮지만, 분무 환경에서 7일 경에 세포 밀도는 1.8E+6 vc/㎖정도로 생장되고, 생존은 98%정도가 된다. 7일 생존하는 동안에, 포도당 농도는 5.4g/ℓ에서 3.0g/ℓ로 감소되고, 락테이트 농도는 0.3g/ℓ에서 1.8g/ℓ로 증가된다.
7일 째에, 세포 밀도가 1.8E+6 vc/㎖되면, 바이오리엑터에 있는 세포는 원심분리로 가라앉히고, 10ℓ용기에서 3.5ℓ새로운 무혈청 IS293 배지(F-68 및 헤파린이 보충됨)로 재현탁시킨다. 293세포는 1.25E+11 pfu Ad-p53로 감염시키고, CelliGen 바이오리엑터에 옮긴다. 바이오리엑터에서, 세포 생존능은 100%이나, 세포 밀도는 불과 7.2E+5 vc/㎖가 된다. 배지 교환 작업동안에 세포 손실이 있었다. 배지에서 바이러스 역가는 수득 2일에는 2.5E+10HPLC vps/㎖; 3일에는 2.0E+10HPLC vps/㎖; 4일에는 2.8E+10HPLC vps/㎖; 5일에는 3.5E+10HPLC vps/㎖; 6일에는 3.9E+10 HPLC vpa/㎖이다. 기체를 제공한 처음 바이오리엑터 연구에서는 5.1E+10 HPLC vps/㎖가 되었다. 제 2회 실시할 때 바이러스 농도를 낮추면 감염시에 세포 밀도가 낮아진다. 제2회 시도에서 7.2E+5 vc/㎖의 것과 비교하였을 때, 제 1회 시도에서는 2.1E+6 vc/㎖를 이용하였다. 실제 제 2 분무 CelliGenqkdldhfldprxjdptj 세포당 Ad-p53 생산이 5.4E+4 vps/cell으로 나타났는데, 이는 이제까지 얻은 것보다 많은 최대 생산이다. 분무없이 제 1 무-혈청 CelliGen 바이오리엑터에서 세포당 생산과 혈청 보충된 T-플라스크에서의 생산성은 각각 2.5E+4 vps/cell 및 3.5E+4 vps/cell이다.
바이러스 감염 후에, 세포의 생존능은 수득 6일째에 100%에서 13%로 감소된다. 감염 후 6일 동안에 포도당 농도는 5.0g/ℓ내지 2.1g/ℓ로 감소되고, 락테이트는 0.3g/ℓ에서 2.9g/ℓ로 증가되었다. 전제 작업동안에 20㎖ Na2CO3(106g/ℓ) 용액이 이용되었다.
실험 결과에서는 분무 교반 반응기에서 Ad-p53를 기술적으로 그리고 경제적으로 생산할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 분무, 교반 반응기를 규모 상향 및 그 단위 작업도 가능하였다.
여기에서 설명하는 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 내용을 바탕으로 실험없이 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예를 통하여 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 요지를 벗어나지 않고 여기에서 설명한 조성물, 방법, 단계등에 변화를 줄 수 있다. 좀더 구체적으로는 화학적 생리학적으로 관련된 특정 물질은 여기에서 설명된 물질에 대체할 수 하여도 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 모든 치환 및 변경은 본 발명의 범위에 속한다.
참고문헌
다음의 참고문헌은 예시적인 과정을 제공하거나 또는 여기에서 제시한 것에 보충하는 것들이다.
Abound et a., Arch. Virol., 71:185-195, 1982.
Arap et al., Cancer Res., 55:1351-1354, 1995.
Bahnemann et al., Abs. Pap.ACS, 180:5. 1980
Baichwal and Sugden, In: Gene Transfer, Kucherlapati R, ed., New York: Plenum Press, pp. 117-148, 1986
Benvenisty and Neshif, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83:9551-9555, 1986.
Berg et al., Biotechniques, 14(6):972-978, 1993
Bett, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(19):8802-8806, 1994
Bussemakers et al., Cancer Res., 52:2916-2922, 1992.
Caldas et al., Nat. Genet., 8:27-32, 1994.
Casey et al, Oncogene, 6:1791-1797, 1991.
Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, 1987.
Cheng et al., Cancer Res., 54:5547-5551, 1994.
Cheung et al., Biochem J. 295:427-435, 1993c.
Cheung et al., J. Biol. Chem., 268:24303-24310, 193a.
Cheung et al., J. Biol. Chem., 268:6139-6146, 1993b.
Coffin, In Virology, Fields BN, Knipe DM. ed., New York: Raven Press,pp. 1437-1500, 1990.
Coupar et al., Gene, 68:1-10, 1988.
Crooks et al., J. Chrom., 502:59-68, 1990.
Dubensky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7529-7533, 1984.
Edelman and Crossin, Annu. Rev. Biochem., 60:155-190, 1991.
Edelman, Annu. Rev. Biochem., 54:135-169, 1985.
Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987.
Ferkol et al., FASEB J. 7:1081-1091, 1993.
Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979.
Freedman et al., WO 94/17178(August 4, 1994).
Frixen et al., J. Cell Biol., 113:173-185, 1991.
Garnier et al., Cytotechnol., 15:145-155, 1994.
Ghosh and Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, pp. 87-104, 1991.
Giancotti and Ruoslahti, Cell, 60:849-859, 1990.
Gilbert. "Adaptation of cells to serum free culture for production of adenovirus vectors and recombinant proteins," Williamsburg BioProcessing Conference. Nov. 18-21, 1996.
Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985.
Graham and Prevec, In: Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, Murray, E.J.,(Eds.), Clifton, NJ: Humana Press, 109-128 and 205-225, 1991.
Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973.
Graham et al, J. Gen. Virol., 36:59-74, 1977.
Graham, J. Gen. Virol., 68:937-940, 1987.
Griffiths, In: Animal Cell Biotechnology, vol. 3, p179-220,(Eds., Spier, R.E. and Griffiths, J.B.), Academic Press, London., 1986.
Herland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985.
Hay et al., Journal of Molecular Biology, 175:493-510, 1984.
Hearing and Shenk, Journal of Molecular Biology, 167:809-822, 1983.
Hearing et al., Journal of Virology, 67:2555-2558, 1987.
Hermonat and Muzycska, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470, 1984.
Hollestein et al., Science, 253:49-53, 1991.
Hussussian et al., Nature Genetics, 15-21, 1994.
Huyghe et al., Human Gene Therapy, 6:1403-1416, 1996.
Jones and Shenk, Cell, 13:181-188, 1978.
Kamb et al., Nature Genetics, 8:22-26, 1994.
Kamb et al., Science, 2674:436-440, 1994.
Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989.
Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991.
Klein et al., Nature, 327:70-73, 1987.
Larsson and Litwin, Dev, Biol. Standard., 66:385-390, 1987.
Levrero et al., Gene, 101:195-202, 1991.
Lim, US Patent 4,352,883, October 5, 1982.
Lin and Guidotti, J. Biol. Chem., 264:14408-14414, 1989.
Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983.
Matsura et al., Brit. J. Cancer, 66:1122-1130, 1992.
McGrath et al., J. Virol., 25:923-927, 1978.
Mercer, Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2:251-263, 1992.
Mizrahi, Process Biochem., (August):9-12, 1983.
Montena고, Crit. Rev. Oncogen, 3:233-256, 1992.
Mori et al., Cancer Res., 54:3396-3397, 1994.
Morris et al., "serum-free production of adenoviral vectors for gene therapy," Williamsburg BioProcesign Conference, Nov. 18:21, 1996.
Myers, EPO 0273085
Nicolas and Rubenstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez RL, Denhardt DT, ed., Stoneham: Butterworth, pp. 493-513, 1988.
Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982.
Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987.
Nilsson and Mosbach. Dev. Biol. Standard., 66:183-193, 1987.
Nobri et al., Nature(London), 368:753-756, 1995.
O'Neil and Balkovic, Bio/Technol., 11:173-178, 1993.
Obrink, BioEssays., 13:227-233, 1991.
Odin and Obrink, Exp. Cell Res., 171:1-15, 1987.
Okamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11045-11049, 1994.
Orlow et al., Cancer Res., 54:2848-2851, 1994.
Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975.
Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086-4090, 1994.
Perrin et al., Vaccine, 13(13):1244-1250, 1995.
Petricciani, Dev. Biol. Standard., 66:3-12, 1985.
Phillips et al., In: Large Scale Mammalian Cell Culture(Feder, J. and Tolbert. W.R., eds.), AcademiPress, Orlando, FL, U.S.A., 1985.
Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984.
Renan, Radiother. Oncol., 19:197-218, 1990.
Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez RL, Denhardt DT, ed., Stoneham: Butterworth, pp. 467-492, 1988.
Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990.
Roux et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:9079-9083, 1989.
Serrano et al., Nature, 366:704-707, 1993.
Serrano et al., Science. 267:249-252, 1995.
Smith and Lee, Analytical Biochem., 86:252-263, 1978.
Takahashi et al, Cancer Res., 52:2340-2342, 1992.
Temin, In: Gene transfer, Kucherlapati R, ed., New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986.
Tibbetts, Cell, 12:243-249, 1977.
Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986.
Umbas et al., Cancer Res., 52:5104-5109, 1992.
van Wezel, Nature, 216:64-65, 1967.
Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87(9):3410-3414, 1990.
Wagner et al., Science, 260:1510-1513, 1993.
Wang et al, In: Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, S. Kaminogawa et al.,(eds), vol. 5, pp463-469, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1993.
Wange et a., Cytotechnology, 9:41-49, 1992.
Wanget al., Procceding of the Japanese Society for Animal Cell Technology, 1994.
Watt et al., Proc. Natl Acad. Sci., 83(2):3166-3170, 1986.
Weinberg, Science, 254:1138-1146, 1991.
Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980.
wu and Wu, J. Biol Chem., 262:4429-4432, 1987.
Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993.
Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988.
Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 87:9568-9572, 1990.

Claims (69)

  1. 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물을 제조하는 방법에 있어서
    a) 글루코오스 및 숙수 세포 생장에 요구되는 영양물질을 함유하는 배지에 숙주 세포를 배양하고, 이때 숙주 세포는 아데노바이러스의 복제를 지원하며;
    b) 숙주 세포가 아데노바이러스를 취할 수 있도록 충분한 시간동안 숙주세포에 아데노바이러스를 노출시켜, 아데노바이러스를 상기 숙주 세포에 감염시키고;
    c) 동결-해동이외의 세포용해 방법으로 숙주 세포를 용해시켜 상기 아데노바이러스 조성물을 함유하는 용해물질을 얻고, 이때 숙주 세포를 파괴하여 아데노바이러스가 방출될 수 있도록 하고;
    d) 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물을 제공하기 위해, 상기 용해물질로부터 아데노바이러스를 정제하는데, 정제는 약학적으로 사용할 수 있도록 순수한 아데노바이러스를 얻기위해 1회이상의 침강 또는 크로마토그래피 과정을 거치는 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 관류, 페드-배치(fed-batch) 과정, 자동 롤러 용기 또는 생물반응용기로 숙주 세포에 영양분을 제공하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 2.0 g/ℓ미만의 글루코오스 농도를 제공하는 속도로 관류 또는 페드-배치(fed-batch) 과정으로 숙주 세포에 영양분을 제공하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 용해 방법은 아데노바이러스를 함유하는 정제되지 않은 용해물질 조성물을 만들기 위한 저장성 용해, 고장성 용해, 충돌 제트, 마이크로유동화, 고형 전단, 계면활성제, 액형 전단, 고압 압출, 자가분해 또는 초음파분쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 염화세슘 밀도구배 원심분리 방법을 배제하고 1회 이상 크로마토그래피 단계를 포함하는 과정으로 용해물질로부터 아데노바이러스 조성물을 정제하여 정제된 아데노바이러스 조성물을 제공하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 크로마토그래피 단계에는 정제된 아데노바이러스 조성물을 제공하기 위한 단일 크로마토그래피 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 크로마토그래피 단계후 정제된 아데노바이러스 조성물은 출발 PFU의 70% ±10%인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 무-혈청(serum-free) 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 정제된 아데노바이러스 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물에서 아데노바이러스 핵산이 아닌 기타 핵산은 오염 물질로 간주하며, 오염물질의 농도는 ㎖당 0.8 ng이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물에서 아데노바이러스 핵산이 아닌 기타 핵산을 불순물로 간주하며, 불순물의 농도는 ㎖당 0.2 ng이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 A260:A280 비율이 1:1.2~1.3인 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 A260:A280 비율이 1:1.27±0.03인 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물에서 아데노바이러스 핵산이 아닌 기타 핵산을 불순물로 간주하며, 불순물의 농도는 ㎖당 0.8 ng이하이고, A260:A280 비율이 1:1.2~1.3인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포는 마이크로담체(microcarriers)에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 외부 유전자를 인코드하는 아데노바이러스 벡터 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 외부 유전자는 프로모터에 작동할 수 있도록 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 프로모터는 SV40 IE, RSV LTR, 베타-액틴, CMV IE, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 폴리오마 F9-1 또는 티로시나제인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 외부 유전자는 치료 유전자를 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 치료 유전자는 안티센스 ras, 안티센스 myc, 안티센스 raf, 안티센스 src, 안티센스 fms, 안티센스 jun, 안티센스 trk, 안티센스 ret, 안티센스 gsp, 안티센스 hst, 안티센스 bel, 안티센스 abl, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나아제 또는 p53을 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 구조체는 복제-불능 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 구조체는 E1-영역의 일부, 특히 E1A 또는 E1B 영역이 결핍되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포는 복제를 보충할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포는 293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 용해물질을 뉴클레아제로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 약학적으로 수용가능한 완충액을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 103 내지 1015 PFU/용량의 단위 약량을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 1010 내지 1014 PFU/용량의 단위 약량을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 BSA(Bovine Serum Albumin)가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 치료 용도의 정제된 아데노바이러스 조성물은 프로모터의 조절하에 위치한 치료 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 치료 유전자에는 종양 억제유전자, 아폽토시스 유도유전자, 인터루킨이나 사이토킨, 효소 또는 안티센스 핵산이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 종양 억제유전자는 Rb, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, ZAC-1, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2 또는 p53으로 한정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 아폽토시스의 유도유전자는 Bax, Bak, BCl-Xs, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad 또는 ICE-CED3 프로테아제로 한정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 인터루킨이나 사이토킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF 또는 G-CSF로 한정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 31 항에 있어서, 효소는 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 갈락토즈-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, 알파-L-이두로니다제 또는 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제로 한정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 30 항에 있어서, 치료 유전자는 안티센스 핵산으로 한정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 30 항에 있어서, 프로모터는 SV40 IE, RSV LTR, 베타-액틴, CMV IE, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 또는 티로시나제인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 5 항에 있어서, 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 DEAE, TMAE, QAE 또는 PEI에서 선택되는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 여기에 Toyopearl Super Q 650 M, Mono Q, Source Q 또는 Fractogel TMAE를 선택적으로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 7.0 내지 10.0의 pH에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 3 항에 있어서, 글루코오스 농도를 제공하는 속도는 0.7 내지 1.7 g/ℓ인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 1 항에 있어서, 접선 이동 여과, 또는 100 내지 300K NMWC, 재생된 셀룰로오스 또는 폴리에테르 설폰 막의 이용이 선택적으로 포함되는 다이아필트레이션(diafilteration) 막 여과를 선택적으로 포함하는 여과 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 4 항에 있어서, 계면활성제 용해에는 ThesitTM, NP-40TM, Tween-20TM, Brij-58TM, Triton XTM-100 또는 옥틸 글루코시드중에서 한가지이상 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 1 항에 있어서, 오염 핵산의 농도를 줄이는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 용해물질은 BenzonaseTM또는 PulmozymeTM가 선택적으로 포함되는 뉴클레아제로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 1 항에 있어서, 세포 용해물질 및 상기 세포 용해물질의 교환 완충액을 농축하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 암을 치료하고, 바이러스 감염에 대항하는 면역조절 유전자를 발현시키거나 유전자 기능을 대체하는데 치료유전자를 이용되는 정제된 아데노바이러스 조성물에서 아데노바이러스 핵산 이외의 핵산을 오염 핵산으로 간주하고, 조성물에서 이와 같은 오염핵산의 농도가 1010 pfu 바이러스당 60 pg 이상 내지 400 pg 이하가 되는 것을 특징으로 하는 정제된 아데노바이러스 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, BSA(Bovine Serum Albumin)가 웨스턴 블랏 분석에서 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  49. 제 47 항에 있어서, 오염 핵산의 함량은 1010 pfu 바이러스당 60 pg 내지 140 pg 이하인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  50. 제 48 항에 있어서, BSA(Bovine Serum Albumin)가 없는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  51. 제 48 항에 있어서, 입자당 36 내지 38 pfu을 갖는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  52. 제 48 항에 있어서, 아데노바이러스 조성물은 아데노바이러스 벡터 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 구조체는 프로모터의 조절하에 위치한 치료 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서, 치료 유전자에는 종양 억제유전자, 아폽토시스 유도유전자, 인터루킨이나 사이토킨, 효소 또는 안티센스 핵산이 포함되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 종양 억제유전자는 Rb, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, ZAC-1, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2 또는 p53로 한정되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  56. 제 54 항에 있어서, 아폽토시스의 유도유전자는 Bax, Bak, BCl-Xs, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad 또는 ICE-CED3 프로테아제로 한정되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  57. 제 54 항에 있어서, 인터루킨이나 사이토킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF 또는 G-CSF로 한정되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  58. 제 54 항에 있어서, 효소는 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나제, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 갈락토즈-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, 알파-L-이두로니다제 또는 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제로 한정되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  59. 제 53 항에 있어서, 치료 유전자는 안티센스 핵산인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  60. 제 53 항에 있어서, 프로모터는 SV40 IE, RSV LTR, 베타-액틴, CMV IE, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 또는 티로시나제인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  61. 제 52 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 구조체는 복제-결함 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 구조체는 아데노바이러스 E1-영역의 일부 특히 E1A 또는 E1B 영역이 결핍되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  63. 제 48 항에 있어서, 약학적으로 사용가능하며, 조성물은 개체에 치료 유전자를 전달하는데 이용되고, 상기 치료 유전자는 암을 치료하거나, 바이러스 감염에 대항하는 면역조절 유전자를 발현시키거나 유전자 기능을 대체하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  64. 제 47 항에 있어서, 조성물은 개체에 치료 유전자를 전달하는데 이용되고, 상기 치료 유전자는 암을 치료하거나, 바이러스 감염에 대항하는 면역조절 유전자를 발현시키거나 유전자 기능을 대체하는데 이용하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 개체는 암에 걸린 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 조성물.
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Families Citing this family (288)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997008298A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
US20020088014A1 (en) * 1996-05-31 2002-07-04 Xiangming Fang Minimal adenovirus mediated recombinant vaccine
JP2000514290A (ja) 1996-07-01 2000-10-31 ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー 組換えアデノウイルスの製造方法
US7732129B1 (en) * 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
JP4492826B2 (ja) * 1996-11-20 2010-06-30 イントロジェン セラピューティクス，インコーポレイテッド アデノウイルスベクターの産生および精製のための改良された方法
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
US6544769B1 (en) 1996-12-13 2003-04-08 Schering Corporation Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US6995006B2 (en) * 1997-09-05 2006-02-07 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
NZ504214A (en) * 1997-10-24 2003-06-30 Invitrogen Corp Recombination cloning using nucleic acids having recombination sites
US7705602B2 (en) * 1997-11-03 2010-04-27 Midtronics, Inc. Automotive vehicle electrical system diagnostic device
US20040204381A1 (en) * 1997-11-12 2004-10-14 Moskal Joseph R Detection and treatment of glyco-enzyme-related disease
US6899870B1 (en) * 1998-03-11 2005-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Induction of apoptic or cytotoxic gene expression by adenoviral mediated gene codelivery
EP1073721B1 (en) * 1998-04-22 2005-08-31 Genvec, Inc. Efficient purification of adenovirus
US6416992B1 (en) * 1998-10-13 2002-07-09 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
US7691370B2 (en) * 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
EP1977764A1 (en) * 1998-11-16 2008-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US7148035B1 (en) * 1998-11-18 2006-12-12 Oxford Biomedica (Uk) Limited Polypeptide
US6210922B1 (en) * 1998-11-30 2001-04-03 National Research Council Of Canada Serum free production of recombinant proteins and adenoviral vectors
CZ20012428A3 (cs) * 1998-12-31 2001-11-14 Aventis Pharma S. A. Způsob separace virových částic
FR2788064B1 (fr) * 1998-12-31 2003-01-31 Aventis Pharma Sa Methode de separation de particules virales
DE60029195T2 (de) 1999-02-22 2007-06-28 Transgene S.A. Verfahren zur Gewinnung von purifizierter Virenzusammensetzung
US6795585B1 (en) 1999-07-16 2004-09-21 Eastman Kodak Company Representing digital images in a plurality of image processing states
US20010043916A1 (en) * 1999-12-29 2001-11-22 Mcneilly David S. Method using filtration aids for the separation of virus vectors from nucleic acids and other cellular contaminants
US6168941B1 (en) * 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
WO2001082699A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Zengen, Inc. A gene therapy system and method using alpha-msh and its derivatives
US6783939B2 (en) * 2000-07-07 2004-08-31 Alphavax, Inc. Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines
TWI289158B (en) * 2000-08-10 2007-11-01 Oncolytics Biotech Inc Method of producing infectious reovirus
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20020064860A1 (en) * 2000-11-29 2002-05-30 Schering Corporation Method for purifying adenoviruses
DK2253701T3 (da) * 2001-03-16 2014-10-20 Oncolytics Biotech Inc Fremgangsmåde til ekstraktion af en virus fra en cellekultur
US20040146590A1 (en) * 2001-03-22 2004-07-29 Iadarola Michael J Molecular neurochirurgie for pain control administering locally capsaicin or resinferatoxin
EP1381673B1 (en) * 2001-03-27 2009-05-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods useful for hcv infection
ES2564553T3 (es) 2001-08-08 2016-03-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Procedimiento para purificar vectores víricos que tienen proteínas que se unen a ácido siálico
US20040253210A1 (en) * 2001-08-30 2004-12-16 Marjorie Robert-Guroff Adenovirus type7 vectors
EP1432791B2 (en) * 2001-09-06 2013-10-23 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
WO2003039459A2 (en) * 2001-11-05 2003-05-15 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
DK1407006T3 (da) * 2001-12-20 2005-12-12 Bavarian Nordic As Fremgangsmåde til indvinding og oprensning af poxvirus fra inficerede celler
KR100451308B1 (ko) * 2001-12-28 2004-10-06 선바이오(주) 단백질 의약품 정제 방법에서의 바이러스 제거 방법
AU2003217413A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Novavax, Inc. Method for isolation and purification of expressed gene products in vitro
DE60304836T2 (de) * 2002-02-20 2006-11-30 Merck & Co., Inc. Verfahren zur konzentrationsbestimmung von adenoviruspartikeln
US20030186832A1 (en) * 2002-03-15 2003-10-02 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Isotropic liquid detergents with improved anti-redeposition
US20030175688A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Rukmini Pennathur-Das Method for the purification and production of oncolytic adenoviruses
US20030180936A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
US20050118701A1 (en) * 2002-03-29 2005-06-02 Weichang Zhou Large scale methods of producing adenovirus and adenovirus seed stocks
NZ535944A (en) 2002-04-30 2007-11-30 Oncolytics Biotech Inc Viral purification method comprising a simple extraction step in which a detergent is directly added to the cell culture, thereafter, cell debris is removed from the extraction mixture by filtration or centrifugation
US7326555B2 (en) * 2002-05-14 2008-02-05 Merck & Co., Inc. Methods of adenovirus purification
US20030224354A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-04 Introgen Therapeutics Inc. Quantifying viral particles with intrinsic fluorescence
EP1371723A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-17 Procorde GmbH Process for preparing an adenovirus-containing preparation
AU2003253992A1 (en) * 2002-07-18 2004-02-09 Robert P. Bennett Viral vectors containing recombination sites
US20040106184A1 (en) * 2002-08-28 2004-06-03 Introgen Therapeutics Inc. Chromatographic methods for adenovirus purification
US20050282814A1 (en) * 2002-10-03 2005-12-22 Targegen, Inc. Vasculostatic agents and methods of use thereof
JP4560483B2 (ja) * 2002-10-03 2010-10-13 ターゲジェン インコーポレーティッド 血管静態化物質およびそれらの使用法
US7319021B2 (en) * 2002-11-01 2008-01-15 Promega Corporation Cell lysis composition, methods of use, apparatus and kit
EP1585812B1 (en) * 2002-12-13 2017-01-18 Alphavax, Inc. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
EP2290054B1 (en) * 2002-12-13 2017-03-29 Alphavax, Inc. Alphavirus particles and methods for preparation
JP2006516548A (ja) 2002-12-30 2006-07-06 アンジオテック インターナショナル アクツィエン ゲゼルシャフト 迅速ゲル化ポリマー組成物からの薬物送達法
ES2565327T3 (es) 2003-01-14 2016-04-04 Dana Farber Cancer Institute Sensibilizador de terapia del cáncer
JP5016305B2 (ja) * 2003-03-20 2012-09-05 アルファヴァックス，インコーポレイテッド 改良されたアルファウイルスレプリコンおよびヘルパー構築物
DK1620549T3 (da) * 2003-05-01 2007-11-05 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til fremstilling af biologiske stoffer ved perfusionsdyrkning af suspenderede dyreceller
US20040229335A1 (en) 2003-05-15 2004-11-18 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the production of adenoviral vectors
AU2004249199B2 (en) * 2003-06-18 2008-07-24 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Method for purifying virus
ATE432285T1 (de) * 2003-07-11 2009-06-15 Alphavax Inc Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren
ES2356154T3 (es) 2003-07-21 2011-04-05 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
US8304189B2 (en) * 2003-12-01 2012-11-06 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
MXPA06007207A (es) * 2003-12-23 2006-08-18 Schering Corp Metodos para la produccion de lineas de celulas a549 estables en cultivo en suspension de medio libre de suero.
JP2007522814A (ja) * 2004-02-23 2007-08-16 クルセル ホランド ベー ヴェー ウイルスの精製方法
CN100333797C (zh) * 2005-01-26 2007-08-29 彭朝晖 重组腺病毒p53制品在肿瘤治疗中的新用途
US7456176B2 (en) * 2004-04-08 2008-11-25 Targegen, Inc. Benzotriazine inhibitors of kinases
CA2567254C (en) 2004-05-18 2012-03-13 Alphavax, Inc. Tc-83-derived alphavirus vectors, particles and methods
HUE060433T2 (hu) * 2004-06-01 2023-03-28 Genzyme Corp Készítmények és eljárások AAV vektor aggregációjának megelõzésére
US20050287616A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Gross Adam F Method of assaying denaturation of proteins
US7652051B2 (en) 2004-08-25 2010-01-26 Targegen, Inc. Heterocyclic compounds and methods of use
DE202004014949U1 (de) * 2004-09-25 2004-11-18 Techno-Grafica Gmbh Vorrichtung zum Wärmebehandeln einer Beschichtung von Flachoffset-Druckplatten
DE102004049290A1 (de) * 2004-10-09 2006-04-20 Bayer Healthcare Ag Verfahren zur Herstellung von Virusmaterial
US7901921B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-08 Oncolytics Biotech Inc. Viral purification methods
AU2005305347A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying of adenoviral vectors
CN100497640C (zh) * 2004-11-26 2009-06-10 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种高效生产重组腺病毒载体的方法
US20060166364A1 (en) * 2004-12-22 2006-07-27 Introgen, Inc. Use of flexible bag containers for viral production
DK2368975T3 (en) 2004-12-23 2015-01-05 Medimmune Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for the propagation of viruses
US20060205080A1 (en) * 2005-03-01 2006-09-14 David Frey Formulations for therapeutic viruses having enhanced storage stability
SG10201912554TA (en) 2005-03-23 2020-02-27 Genmab As Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
DK1869171T4 (en) * 2005-04-11 2016-01-18 Crucell Holland Bv Virus cleaning using ultrafiltration
MX2007013725A (es) * 2005-05-05 2008-04-09 Sensient Flavors Inc Produccion de beta-glucanos y mananos.
BRPI0606172A2 (pt) * 2005-06-08 2009-06-02 Targegen Inc métodos e composições para o tratamento de distúrbios oculares
US20090216452A1 (en) * 2005-07-05 2009-08-27 Develop Tech Resources Energy recovery within a fluid distribution network using geographic information
NZ592990A (en) * 2005-11-01 2013-01-25 Targegen Inc Bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
US8133900B2 (en) * 2005-11-01 2012-03-13 Targegen, Inc. Use of bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
US8604042B2 (en) * 2005-11-01 2013-12-10 Targegen, Inc. Bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
US8293500B2 (en) * 2006-03-22 2012-10-23 Viral Logic Systems Technology Corp. Methods for identifying polypeptide targets and uses thereof for treating immunological diseases
WO2007127366A2 (en) * 2006-04-25 2007-11-08 Targegen, Inc. Kinase inhibitors and methods of use thereof
CN101627113B (zh) 2006-09-15 2013-04-24 米迪缪尼有限公司 支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法
CA2675355C (en) 2007-01-30 2015-04-28 Transgene S.A. Papillomavirus vaccine
US20080299624A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Edward Heslop Continuous fermentation apparatus and method
PL2947149T3 (pl) * 2007-06-21 2018-09-28 Alphavax, Inc. Kasety bez promotora do ekspresji alfawirusowych białek strukturalnych
JP2010539993A (ja) * 2007-10-08 2010-12-24 イントレキソン コーポレーション 遺伝子操作した樹状細胞および癌の治療のための使用
EP2612867A1 (en) 2007-11-01 2013-07-10 Perseid Therapeutics LLC Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US20090253184A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line
AU2009246363B2 (en) * 2008-05-13 2013-10-24 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
WO2009153563A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Oxford Biomedica (Uk) Limited Virus purification
MX2011003180A (es) 2008-09-24 2011-07-29 Medimmune Llc Metodo para cultivar celulas, propagar y purificar virus.
BRPI0919250A2 (pt) 2008-09-24 2015-12-15 Medimmune Llc métodos para a purificação de vírus
WO2010062757A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Improved methods for isolating enveloped virus-based vlps free of infectious agents
CN102203242B (zh) 2008-11-03 2013-06-12 克鲁塞尔荷兰公司 产生腺病毒载体的方法
WO2010136979A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 Leviathan Energy Hydroelectric Ltd. Hydroelectric in-pipe turbine uses
CN103335945A (zh) * 2009-07-07 2013-10-02 索尼公司 微流体装置
MX2012001592A (es) 2009-08-07 2012-05-22 Transgene Sa Composicion para el tratamiento de la infección del virus de la hepatitis b.
ES2472429T3 (es) 2009-10-15 2014-07-01 Crucell Holland B.V. Método para la purificación de partículas de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular
KR101805938B1 (ko) 2009-10-15 2018-01-10 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
SG10201500013SA (en) 2010-01-05 2015-03-30 Vascular Biogenics Ltd Methods for use of a specific anti-angiogenic adenoviral agent
NZ601325A (en) 2010-01-05 2014-09-26 Vascular Biogenics Ltd Compositions and methods for treating glioblastoma gbm
SG10201500015TA (en) * 2010-01-12 2015-02-27 Vascular Biogenics Ltd Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby
EP2536829B1 (en) 2010-02-15 2016-04-06 Crucell Holland B.V. Method for the production of Ad26 adenoviral vectors
JP2013523175A (ja) 2010-04-14 2013-06-17 イーエムディー・ミリポア・コーポレーション 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法
SG188947A1 (en) 2010-08-12 2013-06-28 Yisheng Biopharma Holdings Ltd Method for reducing dna impurities in viral compositions
EA201390424A1 (ru) 2010-09-20 2013-07-30 Круселл Холланд Б.В. Терапевтическая вакцинация против активного туберкулеза
CA2809463C (en) 2010-09-27 2021-05-25 Crucell Holland B.V. Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
WO2012060847A1 (en) 2010-11-07 2012-05-10 Targegen, Inc. Compositions and methods for treating myelofibrosis
EP2461162A1 (en) 2010-12-03 2012-06-06 Texcell, . Method for determining the titre of viruses by using infectious standards
EP3202897B1 (en) 2010-12-09 2020-04-15 Institut Pasteur Diagnostic use of a fusion polypeptide comprising a viral protein and a mgmt enzyme
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
TW201318637A (zh) 2011-09-29 2013-05-16 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（一）
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
EP2780034A1 (en) 2011-11-14 2014-09-24 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
DK2825640T3 (en) 2012-03-12 2016-08-01 Crucell Holland Bv BATCHES OF RECOMBINANT ADENOVIRUS WITH CHANGED TERMINAL END
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
WO2013139911A1 (en) 2012-03-22 2013-09-26 Crucell Holland B.V. Vaccine against rsv
WO2014016690A2 (en) * 2012-07-26 2014-01-30 Vectalys Method for detecting or measuring the impact of a viral vector composition on eukaryotic cells and biomarkers used thereof
WO2014066443A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
ME03442B (me) 2013-04-25 2020-01-20 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilizovani rastvorljivi pre-fuzioni rsv f polipeptidi
WO2014179108A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 Honeywell International Inc. Lead frame construct for lead-free solder connections
CN105408348B (zh) 2013-06-17 2021-07-06 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
US9956166B2 (en) 2013-09-18 2018-05-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Methods for administration and methods for treating cardiovascular diseases with resiniferatoxin
WO2015062699A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Merck Patent Gmbh Method for isolating microorganisms from a complex sample
JP2017509489A (ja) 2014-02-20 2017-04-06 ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド 鉛フリーはんだ組成物
CN106232800B (zh) 2014-03-25 2020-07-03 泰尔茂比司特公司 介质的被动替代
SG11201608725YA (en) 2014-04-25 2016-11-29 Shire Human Genetic Therapies Methods for purification of messenger rna
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN105316296A (zh) * 2014-06-13 2016-02-10 亚宝药业太原制药有限公司 一种纯化腺病毒颗粒的方法
MX2017003062A (es) 2014-09-09 2017-12-14 Unum Therapeutics Receptores quimericos y usos de los mismos en terapia inmune.
GB201417042D0 (en) * 2014-09-29 2014-11-12 Fkd Therapies Oy Method
KR20170096998A (ko) 2014-11-05 2017-08-25 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 aadc 폴리뉴클레오티드
WO2016077689A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016114992A2 (en) * 2015-01-13 2016-07-21 Alfa Wassermann, Inc. Methods of purifying adeno-associated virus (aav) and/or recombinant adeno-associated virus (raav) and gradients and flow-through buffers therefore
EP3054007A1 (en) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step
CN107949397A (zh) 2015-02-13 2018-04-20 特兰斯吉恩股份有限公司 免疫治疗疫苗和抗体组合治疗
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
US10570417B2 (en) 2015-04-14 2020-02-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
EP3319633B1 (en) 2015-07-07 2020-11-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
EP3319634B1 (en) 2015-07-07 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
US9663766B2 (en) 2015-07-24 2017-05-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for purifying adenovirus vectors
IL300420B2 (en) 2015-10-16 2024-09-01 Univ Columbia Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
EP3439672B1 (en) 2016-04-05 2020-11-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f protein for use in the prophylaxis of rsv infection
IL262109B2 (en) 2016-04-05 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V vaccine against rsv
LT3722436T (lt) * 2016-04-14 2025-11-10 Fiksuoto lovio bioreaktorius su nuolatinio srauto siurbliu / vamzdžių sistema
KR102535013B1 (ko) * 2016-04-14 2023-05-22 트리젤 엘티디. 정유량 펌프/튜빙 시스템이 있는 고정층 바이오 리액터
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US20190134190A1 (en) 2016-05-04 2019-05-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
CA3024448C (en) 2016-05-18 2025-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
CN109415696A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
IL264119B2 (en) 2016-05-30 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V f proteins of rsv are stabilized before fusion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
AU2017283118B2 (en) 2016-06-20 2019-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
WO2018011196A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hpv vaccines
JP2019531787A (ja) 2016-08-30 2019-11-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物医学的ターゲティング及びデリバリーの方法並びにそれを実行するための装置及びシステム
EP3522920A2 (en) 2016-10-10 2019-08-14 Transgene SA Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
US20180119141A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
US10294452B2 (en) 2016-11-22 2019-05-21 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
CN108085301B (zh) * 2016-11-22 2021-10-26 贺道耀 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒
WO2018106888A1 (en) * 2016-12-08 2018-06-14 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Small animal models for in vivo testing of polyomavirus therapeutics
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
EP3656841A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
CN107384873A (zh) * 2017-09-05 2017-11-24 成都汇宇生物技术有限公司 重组腺病毒的纯化方法
WO2019053109A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHOD FOR SAFE INDUCTION OF IMMUNITY AGAINST RSV
CA3075656A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Voyager Therapeutics, Inc. Rescue of central and peripheral neurological phenotype of friedreich's ataxia by intravenous delivery
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP4454654A3 (en) 2017-10-16 2025-02-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
ES2991988T3 (es) 2017-10-30 2024-12-05 Takeda Pharmaceuticals Co Detergentes compatibles con el medio ambiente para la inactivación de virus con envoltura lipídica
CN111527202B (zh) * 2017-11-08 2024-03-29 蓝天免疫疗法有限责任公司 So3色谱在病毒纯化方法中的应用
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
CN112313331A (zh) 2018-04-27 2021-02-02 沃雅戈治疗公司 用于测量aadc病毒载体效力的方法
JP2021523914A (ja) 2018-05-15 2021-09-09 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． パーキンソン病を治療するための組成物および方法
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
EP3793686A1 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
JP7565218B2 (ja) 2018-07-02 2024-10-10 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
CN112638402A (zh) 2018-07-03 2021-04-09 Sotio有限责任公司 与增强葡萄糖输入的反式代谢分子组合的嵌合受体及其治疗用途
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
IL280322B2 (en) 2018-08-14 2025-06-01 Sotio Llc Chimeric antigen receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules modulating krebs cycle and therapeutic uses thereof
WO2020036869A1 (en) 2018-08-16 2020-02-20 Emd Millipore Corporation Closed bioprocessing device
MX2021002415A (es) 2018-08-28 2021-09-21 Vor Biopharma Inc Celulas madre hematopoyeticas modificadas geneticamente y usos de las mismas.
AU2019344006B2 (en) 2018-09-21 2025-11-27 University Of Connecticut Compositions and methods to restore paternal UBE3A gene expression in human Angelman Syndrome
JP7528066B2 (ja) 2018-09-28 2024-08-05 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたプロモータを有するフラタキシン発現コンストラクトおよびその使用方法
EP3861010A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
MX2021005607A (es) 2018-11-13 2021-06-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas.
US20220049204A1 (en) * 2018-12-11 2022-02-17 Erbi Biosystems, Inc. Methods of manufacturing cell based products using small volume perfusion processes
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
EP3927833A4 (en) 2019-02-21 2022-11-30 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. ONCOLYTIC ADENOVIRAL VECTOR AND METHODS OF USE
CN110093455B (zh) * 2019-04-27 2020-03-17 中国医学科学院病原生物学研究所 一种呼吸道病毒的检测方法
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
US20240124889A1 (en) 2019-05-07 2024-04-18 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN112175996A (zh) * 2019-07-05 2021-01-05 杭州荣泽生物科技有限公司 一种基因治疗载体的制备方法和用途
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021097366A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 City Of Hope System, device and method for production of bioproduct including high density cell respirator for intensified production of adeno-associated viruses
CN110894494B (zh) * 2019-11-22 2022-09-27 广西梧州制药（集团）股份有限公司 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法
US20230131352A1 (en) 2020-04-01 2023-04-27 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
WO2021211753A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
GB202005732D0 (en) 2020-04-20 2020-06-03 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
PE20230767A1 (es) 2020-05-13 2023-05-09 Voyager Therapeutics Inc Redireccion del tropismo de las capsides de aav
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
CN112226418B (zh) * 2020-09-25 2022-07-08 阜外华中心血管病医院 重组腺相关病毒纯化方法
IL301955A (en) 2020-10-07 2023-06-01 Asklepios Biopharmaceutical Inc Therapeutic delivery of an adeno-related protein-related protein (FKRP) virus for the treatment of dystroglycanopathy disorders, including limb girdle 21
CN112293394B (zh) * 2020-10-30 2022-11-25 海南德安欣有害生物防治科技有限公司 一种捕鼠装置及捕鼠方法
JP7733110B2 (ja) 2020-11-02 2025-09-02 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス
GB202019454D0 (en) * 2020-12-10 2021-01-27 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Method for purifying virus
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CA3216491A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Rational polyploid aav virions that cross the blood brain barrier and elicit reduced humoral response
EP4396199A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 BioMarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034994A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034990A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
US20250122530A1 (en) 2021-09-03 2025-04-17 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034980A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Bomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034996A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
US20250223376A1 (en) 2021-09-20 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
KR20240069799A (ko) 2021-09-27 2024-05-20 소티오 바이오테크 인크. 해당과정 경로 밖으로 포도당 대사산물을 재지향시키는 트랜스 대사 분자와 조합되는 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 이의 치료적 용도
MX2024004936A (es) 2021-11-02 2024-05-08 Voyager Therapeutics Inc Variantes de capsides de aav y sus usos.
JP2024545363A (ja) 2021-11-16 2024-12-05 ソティオ・バイオテック・インコーポレイテッド 粘液型／円形細胞型脂肪肉腫患者の治療
EP4433169A1 (en) 2021-11-17 2024-09-25 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
CA3240342A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Gopal SAPKOTA Targeted degradation of alpha-synuclein
EP4469585A2 (en) 2022-01-25 2024-12-04 Voyager Therapeutics, Inc. Baculovirus expression system
WO2023154693A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
GB202201713D0 (en) 2022-02-10 2022-03-30 Univ Dundee An affinity directed phosphatase system for targeted protein dephosphorylation
CN115354033A (zh) * 2022-03-25 2022-11-18 上海碧博生物医药科技有限公司 一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获aav的应用
CA3257081A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Voyager Therapeutics, Inc. VAA CAPSIDE VARIANTS AND THEIR USES
CA3259902A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. AAV Capsid Variants and Their Uses
TW202424201A (zh) 2022-07-06 2024-06-16 美商航海家醫療公司 Ａａｖ殼體變異體及其用途
WO2024040207A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Sotio Biotech Inc. Genetically engineered natural killer (nk) cells with chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof
EP4572787A1 (en) 2022-08-19 2025-06-25 SOTIO Biotech Inc. Genetically engineered immune cells with chimeric receptor polypeptides in combination with multiple trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN120019071A (zh) 2022-09-15 2025-05-16 沃雅戈治疗公司 Tau结合化合物
UY40442A (es) 2022-09-22 2024-02-15 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la miocardiopatía arritmogénica con vectores de genoterapia con aav
CA3267804A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Dinaqor Ag TREATMENT OF CARDIOMYOPATHY USING AAV GENE THERAPY VECTORS
WO2024215989A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS
WO2024215987A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES
WO2024226790A1 (en) 2023-04-26 2024-10-31 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
CN121127597A (zh) 2023-05-03 2025-12-12 沃雅戈治疗公司 用于治疗与葡糖苷酰鞘氨醇酶β1缺陷相关的病症的组合物及方法
WO2024229164A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2024229173A2 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
CN121079310A (zh) 2023-05-03 2025-12-05 沃雅戈治疗公司 用于治疗与cdkl5缺乏相关的病症的组合物及方法
WO2024229425A1 (en) 2023-05-04 2024-11-07 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025030010A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Vor Biopharma Inc. Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof
WO2025038430A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2025038796A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to cdkl5 deficiency
AR133562A1 (es) 2023-08-16 2025-10-08 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos relacionados con la deficiencia de frataxina
WO2025038795A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025038805A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to glucosylceramidase beta 1 deficiency
WO2025038802A1 (en) 2023-08-16 2025-02-20 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
WO2025122530A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to glucosylceramidase beta 1 deficiency
WO2025122532A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to ataxin-2
WO2025122543A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to syntaxin-binding protein 1 deficiency
WO2025122531A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to frataxin deficiency
WO2025122536A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025122548A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to cdkl5 deficiency
WO2025137219A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to dystrophia myotonica protein kinase
WO2025147436A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
CN117551624A (zh) * 2024-01-11 2024-02-13 深圳源兴基因技术有限公司 一种基于无血清悬浮扩增的高效回收腺病毒的方法
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789244A (en) * 1902-10-01 1905-05-09 Hans Thormeyer Steam-turbine.
US824544A (en) * 1905-12-04 1906-06-26 George Hossege Pipe-hanger.
US4222743A (en) * 1978-07-20 1980-09-16 Wang Wei Kung Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4539020A (en) * 1983-07-10 1985-09-03 Kawasaki Steel Corporation Methods for obtaining high-purity carbon monoxide
JPS6147187A (ja) 1984-08-10 1986-03-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst 狂犬病ウイルスの精製方法
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5173418A (en) * 1985-05-10 1992-12-22 Benzon Pharma, A/S Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5106841A (en) * 1986-05-13 1992-04-21 Chai-Tech Corporation Antiviral compositions and method for their use
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5591624A (en) * 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
JPH0761955B2 (ja) 1988-04-28 1995-07-05 国立予防衛生研究所長 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン
US5219752A (en) * 1988-05-25 1993-06-15 Teijin, Limited Process for continuously culturing adherent animal cells
ATE107113T1 (de) 1989-01-16 1994-06-15 Telefunken Fernseh & Rundfunk Kompatibles frequenzmultiplex-fernsehsystem.
WO1990013808A1 (de) 1989-05-01 1990-11-15 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Reflexionsfluorimeter
WO1991009310A1 (en) 1989-12-12 1991-06-27 Lidak Pharmaceuticals Free fatty acid determination
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
NO312681B1 (no) 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
IT1248075B (it) 1991-06-18 1995-01-05 Sclavo Spa Processo per la purificazione del virus dell'epatite a (hav), virus cosi` purificato e composizioni vaccinali che lo contengono.
DE69326967T2 (de) * 1992-01-17 2000-06-15 Lakowicz, Joseph R. Phasenmodulationsenergieübertragungsfluoroimmunassay
US5323008A (en) * 1992-03-23 1994-06-21 Diatron Corporation Fluorometer detection system
AU673827B2 (en) 1992-03-24 1996-11-28 United Cancer Research Institute Vaccine containing live virus for therapy of viral diseases and malignancies
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
US5733720A (en) 1992-06-18 1998-03-31 Washington University Genetically engineered cell lines for detecting infectious herpesvirus and methods therefor
WO1994002638A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Aprogenex, Inc. Free radical scavengers useful for reducing autofluorescence in fixed cells
EP0672137A1 (en) 1992-09-18 1995-09-20 CANJI, Inc. Gene therapy by retroviral vector with tumor suppressive gene
US5733721A (en) * 1992-11-20 1998-03-31 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Cell analysis method using quantitative fluorescence image analysis
WO1994017178A1 (en) 1993-01-29 1994-08-04 New Brunswick Scientific Co., Inc. Method and apparatus for anchorage and suspension cell culture
US5604096A (en) 1993-03-04 1997-02-18 Schaeffer; Warren I. Fluorometric quantitation of mycoplasmas
US5994314A (en) 1993-04-07 1999-11-30 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung
WO1994026934A2 (en) 1993-05-06 1994-11-24 Baxter Diagnostics Inc. Human papillomavirus detection assay
US5421339A (en) 1993-05-12 1995-06-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnosis of dysplasia using laser induced fluoroescence
US6686200B1 (en) * 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
JPH09504429A (ja) 1993-10-12 1997-05-06 チロン ビアジーン，インコーポレイティド 組換えウイルスの保存方法
TW442569B (en) * 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
JPH09508017A (ja) 1994-01-12 1997-08-19 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド レトロウイルスベクターの精製
HRP950097A2 (en) 1994-03-08 1997-06-30 Merck & Co Inc Hepatitis a virus culture process
US5498537A (en) * 1994-03-09 1996-03-12 Cellco, Inc. Serum-free production of packaged viral vector
PT751988E (pt) 1994-03-22 2000-05-31 Immune Response Corp Inc Producao e isolamento altamente eficientes de particulas virais
US5521083A (en) * 1994-05-13 1996-05-28 The Research Foundation Of State University Of New York Et Al. Large granular lymphocyte leukemia associated virus
WO1996009399A2 (en) * 1994-09-23 1996-03-28 Somatix Therapy Corporation Chimeric adenovirus for gene delivery
US5552309A (en) * 1994-09-30 1996-09-03 Indiana University Foundation Use of polyols for improving the introduction of genetic material into cells
US6348343B2 (en) * 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US5837520A (en) * 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5744304A (en) * 1995-05-30 1998-04-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inflammation-induced expression of a recombinant gene
US5772888A (en) * 1995-07-27 1998-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Separation and/or concentration of an analyte from a mixture using a two-phase aqueous micellar system
US6149917A (en) * 1995-08-01 2000-11-21 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Industrial production process for a vaccine against Japanese encephalitis virus and vaccine produced
WO1997008298A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
DK0863984T3 (da) 1995-11-30 2006-08-28 Univ Texas Fremgangsmåder og præparater til behandling af cancer
US5910434A (en) * 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US5789244A (en) 1996-01-08 1998-08-04 Canji, Inc. Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems
AR006240A1 (es) * 1996-03-14 1999-08-11 Fuller H B Licensing Financ Adhesivo de fusion caliente que comprende interpolimeros, articulo no tejido que lo comprende, procedimiento de polimerizacion para preparlo y caja, envase, bandeja y libro unidos con dicho adhesivo
JPH09262099A (ja) 1996-03-28 1997-10-07 Aisin Seiki Co Ltd フルオレセイン誘導体リン酸エステルによる核酸等の検出方法
JP2000514290A (ja) 1996-07-01 2000-10-31 ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー 組換えアデノウイルスの製造方法
JP4492826B2 (ja) 1996-11-20 2010-06-30 イントロジェン セラピューティクス，インコーポレイテッド アデノウイルスベクターの産生および精製のための改良された方法
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US6261823B1 (en) * 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
DE69739961D1 (de) 1996-12-13 2010-09-23 Schering Corp Methoden zur Virus-Reinigung
US6168944B1 (en) 1997-01-31 2001-01-02 Schering Corporation Methods for cultivating cells and propagating viruses
AU737621B2 (en) 1997-02-18 2001-08-23 Canji, Inc. Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US6210683B1 (en) 1997-09-05 2001-04-03 Merck & Co., Inc. Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines
US6130313A (en) 1997-10-02 2000-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Rapidly degrading GFP-fusion proteins
JP4358434B2 (ja) 1998-02-17 2009-11-04 シェーリング コーポレイション ウイルスを含む組成物、およびウイルス調製物を濃縮するための方法
US5922576A (en) 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
AU754999B2 (en) 1998-03-10 2002-11-28 Large Scale Proteomics Corporation Detection and characterization of microorganisms
US6265151B1 (en) * 1998-03-27 2001-07-24 Seroptix, Inc. Apparatus and method for infectious disease detection
EP1073721B1 (en) * 1998-04-22 2005-08-31 Genvec, Inc. Efficient purification of adenovirus
US6171790B1 (en) 1998-05-01 2001-01-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human protease associated proteins
AU4188599A (en) 1998-05-15 1999-12-06 Geron Corporation Method and apparatus for detecting hazardous agents
WO2000000813A1 (en) * 1998-06-30 2000-01-06 Lamina, Inc. Cytological and histological fixative composition and methods of use
JP2002522040A (ja) 1998-08-08 2002-07-23 インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド 改変されたグリーン蛍光タンパク質
US5965358A (en) 1998-08-26 1999-10-12 Genvec, Inc. Method for assessing the relative purity of viral gene transfer vector stocks
US6689600B1 (en) * 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US6225289B1 (en) 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
CZ20012428A3 (cs) 1998-12-31 2001-11-14 Aventis Pharma S. A. Způsob separace virových částic
US6316185B1 (en) * 1999-09-29 2001-11-13 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Quantitation of viruses by light scattering
JP2002054561A (ja) * 2000-08-08 2002-02-20 Toyota Industries Corp 容量可変型圧縮機の制御弁及び容量可変型圧縮機
US6447995B1 (en) 2000-10-04 2002-09-10 Genvec, Inc. Utilizing intrinsic fluorescence to detect adenovirus
DE10050114A1 (de) * 2000-10-09 2002-04-25 Wolf Gmbh Richard Verwendung einer Gelmasse
US20040106184A1 (en) 2002-08-28 2004-06-03 Introgen Therapeutics Inc. Chromatographic methods for adenovirus purification
US20040229335A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-18 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the production of adenoviral vectors

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