ES2565327T3 - Sensibilizador de terapia del cáncer - Google Patents

Abstract

El uso de un polipéptido SPARC en la preparación de un medicamento para aumentar la sensibilidad o reducir la resistencia de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico para cáncer, en el que dicho mamífero presenta resistencia a dicho tratamiento terapéutico, en el que el polipéptido SPARC comprende SEC ID Nº: 1, en el que SEC ID Nº 1 es la siguiente secuencia de aminoácidos: Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn Met Tyr He Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp He Asp Lys Asp Leu Val Ile.

Description

Sensibilizador de terapia del cáncer

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones sensibilizadoras de terapia del cáncer y métodos.

Antecedentes

El motivo de los fracasos del tratamiento del cáncer tras la inducción con quimioterapia o radioterapia no está todavía claro. Se han descrito muchos factores que participan en la resistencia terapéutica, tales como la regulación por incremento de bombas de salida de la p-glicoproteína de la familia de resistencia multi-fármaco (MDR) y otras proteínas MDR no clásicas (proteína asociada a resistencia multi-fármaco, MRP; proteína de resistencia a pulmón, LRP) en una variedad de cánceres (Lehnert, M. Anticancer Res 1998; 18:2225-2226; Ringborg, U. y Platz, A. Acta Oncol 1996; 5:76-80; Shea, T.C., Kelley, S.L., y Henner, W.D. Cancer Res 1998; 48:527-533). Desafortunadamente, muchos tumores que son intrínsecamente resistentes a quimioterapia, tales como los tumores malignos gastrointestinales, tienen niveles de expresión relativamente bajos de los genes MDR. Por ejemplo, solo el 23 % de los tumores colorrectales primarios expresan MRP y el 65 % expresan p-glicoproteína (Filipits M, Suchomel RW, Dekan G, Stigilbauer W, Haider K, Depisch D, Pirker R. Br. J Cancer 1997; 75: 208-212). Por tanto, la resistencia a agentes terapéuticos no puede explicarse únicamente basándose en la activación y regulación por incremento de genes MDR conocidos. Estudios también han mostrado que las mutaciones genéticas responsables de la tumorigénesis también pueden contribuir a resistencia al fármaco. Por ejemplo, la pérdida de genes de reparación de desapareamientos de ADN (MMR) encontrada en cáncer colorrectal sin poliposis hereditario (HNPCC) se ha asociado a una emergencia más rápida de la resistencia al fármaco clínica (de las Alas MM, S Aebi, D Fink, SB Howell, G Los. J Natl Cane Inst 1997; 89:1537-41; Lin X, Howell SB (1999). Mol Pharmacol 56:390-5). Las mutaciones en el gen K-ras, detectadas en aproximadamente el 40 % de los pólipos adenomatosos y adenocarcinomas, están asociadas a una elevada tasa de recaída, mortalidad y una mala respuesta quimioterapéutica (Arber N, I. Shapira, J. Ratan et al. Gastroenterology 2000; 118:1045-1050). Se ha mostrado que los genes que participan en la regulación del ciclo celular, tales como p21 y p27, protegen a los tumores de experimentar apoptosis provocada por diversos agentes antineoplásicos (Waldman T, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Nature 1996, 381:713-716; St. Croix B, Florenes VA, Rak JW, Flanagan M, Bhattacharya N, slingerland JM, Kerbel RS. Nature Med 1996, 2:1204-1210). Además, las moléculas de adhesión a células, tales como E-cadherina, confieren resistencia a células cuando se exponen a agentes quimioterapéuticos (Skoudy A, Llosas MD, Garcia de Herreros A. Biochem J 1996).

Por tanto, parece que los mecanismos implicados en la resistencia terapéutica parecen ser muy complejos. Pruebas evidentes sugieren que la selectividad de la quimioterapia por los relativamente pocos tumores alguna vez curados por fármacos depende, en gran medida, de su fácil susceptibilidad a experimentar apoptosis, es decir, a destruirse a sí mismos (Makin G, Expert Opin Ther Targets. 2002 6(1):73-84; Johnstone RW, Ruefli AA, Lowe SW, Cell. 2002 108(2):153-64; Kamesaki H, Int J Hematol. 1998 68(1):29-43).

La proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) pertenece a una familia de proteínas extracelulares, llamada proteínas matricelulares. Desde su identificación y clonación, el papel funcional de SPARC sigue sin estar claro. Su alta conservación evolutiva sugiere una importante función fisiológica para esta proteína (Iruela-Arispe ML, Lane TF, Redmond D, Reilly M, Bolender RP, Kavanagh TJ, Sage EH. Mol Biol Cell. Mar 1995; 6(3):327-43). Estudios iniciales mostraron que SPARC es importante en la mineralización de hueso (Termine JD, Kleinman HK, Whitson SW, Conn KM, McGarvey ML, Martin GR. Cell. Oct 1981; 26(1 Pt 1):99-105). Aunque SPARC se expresa a altos niveles en tejido óseo, también está ampliamente distribuida en otros tejidos y tipos de células (Maillard, C., et al., Bone, 13:257-264 (1992)). Su función se ha expandido para incluir remodelación de tejido (Latvala T, Puolakkainen P, Vesaluoma M, Tervo T. Exp Eye Res. Nov 1996;63(5):579-84; Kehn RJ Jr, Swords NA, Orfeo T, Mann KG. J Biol Chem. 2 Dic 1994;269(48):30147-53); migración de células endoteliales (Hasselaar P, Sage EH. J Cell Biochem. Jul 1992;49(3):272-83), morfogénesis (Mason IJ, Murphy D, Munke M, Francke U, Elliott RW, Hogan BL. EMBO J. Ago 1986; 5(8):18831-7; Strandjord TP, Sage EH, Clark JG. Am J Respir Cell Mol Biol. Sep 1995; 13(3):279-87) y angiogénesis (Kupprion C, Motamed K, Sage EH. J Biol Chem. 6 Nov 1998; 273(45):29635-40; Lane TF, Iruela-Arispe ML, Johnson RS, Sage EH. J Cell Biol. May 1994; 125(4):929-43). También se ha mostrado que SPARC tiene un efecto antiproliferativo sobre células endoteliales, células mesangiales, fibroblastos y células de músculo liso (Sage EH. Biochem Cell Biol. Jul 1992; 70(7):579-92).

Experimentos in vitro también han identificado SPARC en tumores (Schulz, A., et al., Am. J. Pathol., 132:233-238 (1988); Porter, P.L., et al., J. Histochem. Cytochem., 43:791-800 (1995)). Hay evidencia contradictoria de que SPARC puede funcionar o bien como un oncogén, como se sugiere por estudios en melanoma (Ledda MF, Adris S, Bravo AT, Kairiyama C, Bover L, Chemajovsky Y, Mordoh J, Podhajcer OL. Nat Med. Feb 1997; 3(2):171-6) o bien como un supresor tumoral, como se demuestra por su fuerte inhibición del crecimiento en fibroblastos de embrión de pollo transformados por vJun-ml y v-Src (Vial E, Castellazzi M. Oncogene. 30 Mar 2000; 19(14):1772-82). Aunque las propiedades de inhibidor del crecimiento de SPARC se han mostrado principalmente en células primarias, tales

como células endoteliales, de fibroblasto, mesangiales y de músculo liso, esto también puede contribuir a la función de SPARC en la tumorigénesis. También se ha mostrado que SPARC tiene propiedades invasivas del tumor. Se ha observado expresión de SPARC variable en una variedad de cánceres. Se han detectado mayores niveles de expresión en cáncer de mama (Bellahcene A, Castronovo V. Am J Pathol. Ene 1995; 146(1):95-100), cáncer de esófago (Porte H, Triboulet JP, Kotelevets L, Carrat F, Prevot S, Nordlinger B, DiGioia Y, Wurtz A, Comoglio P, Gespach C, Chastre E. Clin Cancer Res. Jun 1998; 4(6):1375-82), carcinoma hepatocelular (Le Bail B, Faouzi S, Boussarie L, Guirouilh J, Blanc JF, Carles J, Bioulac-Sage P, Balabaud C, Rosenbaum J. J Pathol. Sep 1999; 189(1):46-52) y próstata (Thomas R, True LD, Bassuk JA, Lange PH, Vessella RL. Clin Cancer Res 2000; 6:11401149). Sin embargo, se han observado resultados contradictorios con cánceres de ovario (Brown TJ, Shaw PA, Karp X, Huynh MH, Begley, Ringuette MJ. Gynecol Oncol 1999; 75: 25-33; Paley PJ, Goff BA, Gown AM, Greer BE, Sage EH. Gynecol Oncol2000; 78: 336-341; Yiu GK, Chan WY, Ng SW, Chan PS, Cheung KK, Berkowitz RS, Mok SC. Am J Pathol2001; 159:609-622) y cánceres colorrectales (Porte H, Chastre E, Prevot 5, Nordlinger B, Empereur S, Basset P, Chambon P, Gespach C. Int J Cancer 1995; 64: 70-75;Lussier C, Sodek J, Beaulieu JF. J Cell Biochem. 2001;81(3):463-76).

Recientemente, se ha sugerido que SPARC participa en la inducción de apoptosis de células de cáncer de ovario (Yiu GK, Chan WY, Ng SW, Chan PS, Cheung KK, Berkowitz RS, Mok SC. Am J Pathol 2001; 159:609-622). Yiu et al. (2001, arriba) ha mostrado que hubo regulación por disminución de la expresión de SPARC tras la transformación maligna, y que hubo propiedades antiproliferativas de SPARC en tanto células de ovario normales como cancerosas. Yiu et al. (2001, arriba) proporcionaron además pruebas adicionales de que la exposición exógena a SPARC sola fue capaz de inducir la apoptosis en células de cáncer de ovario. Sin embargo, no se ha mostrado que especímenes patológicos humanos de tumores con altos niveles de expresión de SPARC tengan mayor número de células apoptósicas.

El documento WO0202771 desvela un polipéptido hSPARC-h1 novedoso y sus posibles aplicaciones en remodelación de tejido, reparación de tejido y modulación general de diversas actividades de factor de crecimiento.

La patente de EE.UU. N.º 6.387.664 proporciona una proteína de fusión de SPARC obtenible fusionando SPARC con tiorredoxina que puede usarse para investigación básica en neurobiología y/o para tratar diversas neuropatologías.

La patente de EE.UU. N.º 6.239.326 proporciona un modelo de ratón transgénico deficiente en SPARC para probar fármacos en la promoción o retraso de la cicatrización y tratar o prevenir cataratas, diabetes mellitus u osteoporosis.

Las estrategias de quimiosensibilización usan la administración de un fármaco o agente para hacer las células cancerosas más susceptibles a un segundo fármaco. La quimiosensibilización puede permitir una dosis más pequeña, menos tóxica, o restaurar la actividad de fármacos a los que las células cancerosas se han vuelto resistentes. Se han usado varios enfoques para quimiosensibilizar. El direccionamiento de mediadores endógenos de la apoptosis, tales como Bcl-2, usando agentes antisentido ha sido satisfactorio en el laboratorio. Se ha informado de la inhibición de receptores del factor de crecimiento con anticuerpos. Un ejemplo óptimo es el direccionamiento de Her2 por trastuzumab que está bien establecido por tener una función importante en el tratamiento de cáncer de mama. La quimiosensibilización se ha observado con fármacos que inhiben las vías de transducción de señales celulares. Se ha mostrado que moléculas pequeñas que interfieren con las vías PI3K/Akt, Ras/Raf o Jak/STAT tienen actividades quimiosensibilizantes. La inhibición de tirosina cinasas y proteína cinasa C también ha producido quimiosensibilización. Además, se han desarrollado virus quimiosensibilizadores, tales como los adenovirus transformados con p53 (véase, I.A. Cree et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 2002; 3(4):641-47.) A pesar de estos avances sigue existiendo la necesidad de nuevos agentes quimiosensibilizantes.

Resumen de la invención

La materia que no está englobada por el alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invención presentemente reivindicada.

La invención se basa en el descubrimiento de que SPARC sensibiliza a la terapia del cáncer.

La presente invención proporciona composiciones para su uso en sensibilizar al tratamiento terapéutico del cáncer.

La presente invención proporciona el uso de un polipéptido SPARC que comprende SEC ID Nº 1 en la preparación de un medicamento para aumentar la sensibilidad o reducir la resistencia de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico para el cáncer, en el que dicho mamífero presenta resistencia a dicho tratamiento terapéutico.

La presente invención proporciona además un polipéptido de la familia SPARC con la secuencia SEC ID Nº: 1 para su uso para aumentar la sensibilidad o reducir la resistencia de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico para el cáncer, en el que dicho mamífero presenta resistencia a dicho tratamiento terapéutico, en el que SEC ID Nº 1 es la siguiente secuencia de aminoácidos: Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu

Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn Met Tyr He Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile.

Se desvelan en el presente documento una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC y un agente de quimioterapia, una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC y una célula resistente a quimioterapia; una célula resistente a quimioterapia que comprende un polinucleótido de la familia SPARC recombinante; y una célula recombinante que comprende una región de control de la transcripción heteróloga operativamente asociada a un polinucleótido de la familia SPARC.

Se desvelan adicionalmente un método de sensibilización in vivo de un mamífero a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método administrar al mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer una cantidad eficaz de polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido SPARC; un método de sensibilización ex vivo de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método: administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC; en el que la célula produce una elevada cantidad del polipéptido SPARC; un método de sensibilización ex vivo de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método: (1) Obtener una muestra de cáncer del mamífero; (2) poner en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz de composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC de polinucleótido que codifica un polipéptido SPARC; y (3) devolver la muestra de cáncer después de la puesta en contacto de (2) con el mamífero; y un método de sensibilización de una muestra de cáncer a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método poner en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz de una composición que comprende poner en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz de composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC o un polipéptido que codifica un polipéptido SPARC.

La muestra de cáncer como se enseña en el presente documento puede ser una célula o muestra de tejido.

La muestra de cáncer puede transfectarse o infectarse con el polinucleótido SPARC.

Se enseña en el presente documento un método de evaluación de una primera célula cancerosa para su resistencia a un tratamiento terapéutico, que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o el nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC en la primera célula cancerosa; y (b) comparar el nivel de expresión o el nivel extracelular obtenido en (a) con el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o el nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en una segunda célula cancerosa que no presenta resistencia al tratamiento terapéutico; en el que un menor nivel de expresión o nivel extracelular en (a) es indicativo de que la primera célula cancerosa en resistente al tratamiento terapéutico.

Se desvela un método de evaluación de una primera célula cancerosa para su resistencia a un tratamiento terapéutico, que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC en la primera muestra de cáncer; (b) medir el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en una segunda muestra de cáncer que no presenta resistencia al tratamiento terapéutico; (c) comparar los niveles de expresión o los niveles extracelulares obtenidos en (a) y (b), en el que un menor nivel de expresión o nivel extracelular en (a) es indicativo de que la primera muestra de cáncer es resistente al tratamiento terapéutico.

Como se desvela en el presente documento, la primera muestra es de un primer mamífero y el menor nivel de expresión o nivel extracelular en (a) es adicionalmente indicativo de que el primer mamífero es resistente al tratamiento terapéutico.

Como se desvela en el presente documento, la segunda muestra de cáncer es de un primer mamífero que proporciona la primera muestra de cáncer.

Como se enseña en el presente documento, la segunda muestra de cáncer es de un segundo mamífero que es diferente del primer mamífero que proporciona la primera muestra de cáncer.

Preferentemente, el primer mamífero y el segundo mamífero están diagnosticados con el mismo cáncer.

Como se enseña en el presente documento, el nivel de expresión del ARNm de la familia SPARC se mide por reacción en cadena de la polimerasa, micromatriz de ADN o transferencia Northern.

Como se enseña en el presente documento, la expresión o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC se 5 mide por inmunotransferencia o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).

Se desvela en el presente documento un método de identificación de un agente que modula una expresión de ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o una secreción de polipéptido de la familia SPARC, que comprende: (a) medir el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la

10 familia SPARC en una muestra; (b) poner en contacto un agente candidato con la muestra; (c) después de la puesta en contacto de (b), medir la expresión o nivel extracelular del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en la muestra de (b); (d) comparar los niveles de expresión o los niveles extracelulares en (a) y (c), en el que un nivel diferencial de expresión o nivel extracelular en (a) y (c) indica que el agente candidato es un agente que modula la expresión de ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o la

15 secreción de polipéptido de la familia SPARC.

Un método de identificación de un agente que sensibiliza una muestra de cáncer a un tratamiento terapéutico, que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC en la muestra de cáncer; (b) poner en contacto un agente candidato con la muestra

20 de cáncer; (c) después de la puesta en contacto de (b), medir el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en la muestra de cáncer de (b); (d) comparar los niveles de expresión o los niveles extracelulares obtenidos en (a) y (c), en el que un elevado nivel de expresión o nivel extracelular en (c) indica que el agente candidato es un agente que sensibiliza una muestra de cáncer a un tratamiento terapéutico.

25 Como se enseña en el presente documento, la muestra de cáncer del método objeto es de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer, y el elevado nivel de expresión o nivel extracelular es adicionalmente indicativo de que el agente candidato es un agente que sensibiliza al mamífero a un tratamiento terapéutico.

30 Se desvela un método de determinación de un protocolo de tratamiento terapéutico para un primer mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer, que comprende: (a) determinar si la expresión de un ARNm o polipéptido de la familia SPARC o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC es menor en una primera muestra del primer mamífero que una segunda muestra que no presenta resistencia al tratamiento terapéutico; y (b) si (a) es positiva, aumentar la concentración del tratamiento terapéutico al primer mamífero para aumentar la respuesta al tratamiento.

35 Preferentemente, el polinucleótido SPARC de la composición objeto y método es un vector de expresión.

Más preferentemente, el vector de expresión es un plásmido o un vector viral.

40 Como se enseña en el presente documento, el vector plasmídico es pcDNA3.1.

El polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC, como se desvela en el presente documento, incluyen: (a) un polipéptido SPARC que está seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-17; (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos el 60 % de

45 homología con el polipéptido de la familia SPARC en (a); (c) un fragmento de polipéptido de (a)-(b) en el que el fragmento tiene al menos 50 aminoácidos de longitud; (d) un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de (a), (b) o (c); (e) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a), (b), (c) o el polipéptido de fusión de (d); o (f) un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido de (e) bajo una condición de hibridación rigurosa.

50 El polipéptido de la familia SPARC o polinucleótido enseñado en el presente documento puede seleccionarse de: SMOC-1, SPARC, hevina, SCI, QR-1, proteínas tipo folistatina (TSC-36), testican.

Preferentemente, el agente terapéutico de la composición objeto y método es un agente de quimioterapia o un agente de radioterapia.

55 Más preferentemente, el agente terapéutico está seleccionado del grupo que consiste en los agentes enumerados en la Tabla 1.

En una realización, el mamífero del método objeto presenta resistencia al tratamiento terapéutico.

60 En una realización, el tratamiento terapéutico es quimioterapia o radioterapia.

Se desvela en el presente documento que la muestra de cáncer del método objeto puede ser una célula o una muestra de tejido.

La célula o muestra de tejido puede lisarse antes de la medición de la expresión o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC o polinucleótido (por ejemplo, ARNm).

Puede obtenerse un extracto de polinucleótido o polipéptido de la célula o muestra de tejido antes de la medición de 5 la expresión o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC o polinucleótido (por ejemplo, ARNm).

Breve descripción de los dibujos

Las anteriores características de la invención serán más fácilmente entendidas por referencia a la siguiente 10 descripción detallada, tomada con referencia a los dibujos adjuntos:

La Figura 1 es una estructura modular de SPARC humana y la localización y funciones de péptidos sintéticos. Se muestran tres dominios y sus números de residuo como se describe en Yan y Sage, 1999, J. Histochem. & Cytochem. 47(12):1495-1505.

15 La Figura 2 es una organización de dominio de diversas proteínas de la familia SPARC. FS representa el dominio tipo folistatina, TY el dominio tipo tiroglobulina, EC el dominio de unión a calcio extracelular como se describe en Vannahme et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(41):37977-37986. Los dominios con no homología con otras proteínas se muestran como recuadros abiertos. No se muestran los péptidos señal.

20 La Figura 3 es una imagen que muestra el ensayo de formación de colonias de células sensibles y resistentes a quimioterapia según una realización de la invención.

La Figura 4 es una imagen que muestra ensayos TUNEL de células sensibles y resistentes a quimioterapia según 25 una realización de la invención.

La Figura 5 (A y B) es una imagen que muestra el reducido nivel de polipéptido SPARC en líneas celulares resistentes a quimioterapia según una realización de la invención.

30 La Figura 6 es un ensayo TUNEL que muestra la respuesta de células MIP101 resistentes a SPARC exógena en invertir el fenotipo resistente según una realización de la invención.

La Figura 7 es un ensayo de inmunotransferencia que muestra células recombinantes que expresan el polipéptido SPARC según una realización de la invención.

35 La Figura 8 es un análisis de FACS que muestra poblaciones de células inducidas a someterse a apoptosis tras la exposición a agentes quimioterapéuticos según una realización de la invención.

La Figura 9 es una gráfica que muestra el porcentaje de apoptosis de células tras la exposición a agentes 40 quimioterapéuticos según una realización de la invención.

La Figura 10 es una gráfica que muestra la respuesta de transfectantes de SPARC a agentes de quimioterapia según una realización de la invención.

45 La Figura 11 es una presentación gráfica que muestra la regresión tumoral completa en animales trasplantados con transfectantes de SPARC tras 6 ciclos de quimioterapia en dos animales según una realización de la invención.

La Figura 12 es una figura que contiene las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos de los miembros de la familia SPARC según una realización de la invención.

50 La Figura 13 es una figura que muestra el alineamiento de secuencias entre diferentes polipéptidos y polinucleótidos de la familia SPARC según una realización de la invención.

La Figura 14 muestra el efecto de la quimioterapia en xenoinjertos de tumor de células que expresan en exceso 55 SPARC según una realización de la invención.

La Figura 15 muestra el efecto de radioterapia en xenoinjertos de tumor de células que expresan en exceso SPARC según una realización de la invención.

60 La Figura 16 muestra el tratamiento de xenoinjertos de tumor MIP101 con terapia de combinación con SPARC(s) intraperitonealmente.

La Figura 17 muestra el tratamiento de xenoinjertos de tumor MIP101 con terapia de combinación con SPARC(s) subcutáneamente. 65

La Figura 18 muestra el tratamiento de xenoinjertos de tumor MTP/5FU con terapia de combinación con SPARC(s) según una realización de la invención. La Figura 19 muestra niveles de ARNm y proteína SPARC humana en líneas de células de cáncer colorrectal sensibles y resistentes a quimioterapia según una realización de la invención.

La Figura 20 muestra la expresión de proteínas SPARC en epitelio colónico humano según una realización de la invención.

La Figura 21 muestra la evaluación del efecto de SPARC en influir en la sensibilidad de células a quimioterapia según una realización de la invención.

Descripción detallada

La invención se basa en la familia SPARC y sensibilización a terapia del cáncer.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, un “polipéptido de la familia SPARC” se refiere a un polipéptido (incluyendo un fragmento o variante del mismo) de una familia de proteínas extracelulares. Esta familia de proteínas extracelulares incluye SPARC y otros miembros de la familia, tales como SMOC-1, hevina, SCI, QR-1, proteínas tipo folistatina (TSC-36) y testican (véanse por ejemplo, Vannahrne et al., (2002), J. Biol. Chern. 277(41): 37977-37986; Johnston, I.G., Paladino, T., Gurd, J. W., y Brown, I.R. (1990) Neuron 2, 165-176; Guermah, M., Crisanti, P., Laugier, D., Dezelee, P., Bidou, L., Pessac, B., y Calothy, G. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 88, 4503-4507; Shibanurna, M., Mashirno, J., Mita, A., Kuroki, T., y Nose, K. (1993) Eur. J. Biochem. 217, 13-19; Alliel, P.M., Perin, J. P., Jolles, P., y Bonnet, F. J. (1993) Eur. J. Biochem. 214, 347-350. Un polipéptido de la familia SPARC normalmente está compuesto por tres dominios independientemente plegados (Yan y Sage, 1999, J. Histochem. & Cytochem., 47(12):1495-1505, incorporado por este documento por referencia). El dominio del extremo N (por ejemplo, dos Glu3 y Glu4 del extremo N adyacentes en SPARC) está negativamente cargado, el segundo dominio (por ejemplo, residuos 53-137 en SPARC) es homólogo a folistatina (FS)1 con 10 cisteínas en un patrón típico, el dominio de unión a calcio extracelular (EC) del extremo C (por ejemplo, residuos 138-286 en SPARC) tiene dos motivos de unión al calcio de mano EF, cada uno con un calcio unido en la estructura de rayos X (Maurer, P., Hohenadl, C., Hohenester, E., Gohring, W., Timpl, R., y Engel, J. (1995) J. Mol. Biol. 253, 347-357; Hohenester, E., Maurer, P., Hohenadl, C., Timpl, R., Jansonius, J. N., y Engel, J. (1996) Nat. Struct. Biol. 3, 67-73).

El término “polipéptido de la familia SPARC”, como se enseña en el presente documento, incluye el polipéptido de longitud completa o un fragmento del mismo, un polipéptido no mutante o cualquier variante del mismo. Un “polinucleótido de la familia SPARC” es una molécula de polinucleótido (por ejemplo, ADN o ARNm) que codifica un polipéptido SPARC, o un fragmento del mismo. (a) Un polipéptido de la familia SPARC o gen seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-17; (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos el 60 % de homología con el polipéptido de la familia SPARC en (a) o un gen que codifica el polipéptido de al menos el 60 % homología; (c) un fragmento de polipéptido de (a)-(b) en el que el fragmento tiene al menos 50 aminoácidos de longitud; (d) un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de (a), (b), o (c); (e) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a), (b), (c) o el polipéptido de fusión of(d); o (f) un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido de (e) bajo una condición de hibridación rigurosa.

El término polipéptido “SPARC” se refiere a SEC ID Nº 1-17, y el término “gen SPARC” a SEC ID Nº 18-34, las secuencias de nucleótidos correspondientes de SEC ID Nº 1-17. Se contempla que variaciones de estas secuencias que retienen la actividad biológica de SPARC son equivalentes de estas secuencias. La actividad biológica del gen SPARC es que se regula por disminución en células resistentes a quimioterapia. El gen también puede expresarse en exceso en células que son sensibles a quimioterapia. La actividad biológica del polipéptido SPARC es que sensibiliza células resistentes a quimioterapia a la quimioterapia.

Con respecto a un miembro de polipéptido de la familia SPARC, se contempla que variaciones de sus secuencias que retienen la actividad biológica del miembro de familia son equivalentes de estas secuencias. La actividad biológica de un miembro de la familia del gen SPARC es que el gen se regula por disminución en células resistentes a quimioterapia, es decir, expresión disminuida al menos el 25 %, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 100 % (1 vez), 2 veces, 4 veces, o 5 veces o más, en comparación con células sensibles a quimioterapia. El gen también puede expresarse en exceso en células que son sensibles a quimioterapia. La actividad biológica del miembro de polipéptido de la familia SPARC es que sensibiliza células resistentes a quimioterapia a la quimioterapia, es decir, aumentan la respuesta a quimioterapia al menos el 25 %, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o más, a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más, en comparación con la sensibilidad al tratamiento en ausencia del polipéptido de la familia SPARC.

Como se define en el presente documento, un “tejido” es un agregado de células que realizan una función particular en un organismo. El término “tejido”, como se usa en el presente documento, se refiere a material celular de una región fisiológica particular. Las células en un tejido particular pueden comprender varios tipos diferentes de células.

Un ejemplo no limitante de éstas serían células de cerebro que comprenden además neuronas y células de la glía, además de células endoteliales capilares y glóbulos sanguíneos.

El término “tipo de célula” o “tipo de tejido” se refiere al tejido de origen, por ejemplo, a partir del cual se desarrolla un tumor. Tales tejidos (tipos de células) incluyen, por ejemplo, sin limitación, sangre, colorrectal, mama, esófago, hepatocelular, próstata, ovario, tiroides, páncreas, útero, testículo, pituitaria, riñón, estómago, esófago y recto.

Como se usa en el presente documento, el término “cáncer” se refiere a una enfermedad de trastorno proliferativo causada o caracterizada por la proliferación de células que han perdido susceptibilidad al control de crecimiento normal. El término “cáncer”, como se usa en la presente solicitud, incluye tumores y cualquier otro trastorno proliferativo. Los cánceres del mismo tipo de tejido se originan en el mismo tejido, y pueden dividirse en diferentes subtipos basándose en sus características biológicas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más del grupo que consiste en: melanoma, leucemia, astrocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkin, leucemia de linfocitos crónica y cáncer de páncreas, mama, tiroides, ovario, útero, testículo, pituitaria, riñón, estómago, esófago y recto.

Como se usa en el presente documento, el término “sensibilizar” se refiere a elevar la sensibilidad o reducir la resistencia de una muestra de cáncer o un mamífero que responde a un tratamiento terapéutico. Un aumento de la sensibilidad o una reducción de la sensibilidad a un tratamiento terapéutico se mide según un método conocido en la materia para el tratamiento particular y métodos descritos en el presente documento más adelante, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos proliferativos de células (Weisenthal LM, Shoemaker RH, Marsden JA, Dill PL, Baker JA, Moran EM, Cancer Res 1984; 94: 161-173; Weisenthal LM, Lippman ME, Cancer Treat Rep 1985; 69: 615632;Weisenthal LM, en: Kaspers GJL, Pieters R, Twentyman PR, Weisenthal LM, Veerman AJP, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, PA: Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432; Weisenthal LM, Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90). La sensibilidad o resistencia también puede medirse en animal midiendo la reducción del tamaño del tumor durante un periodo de tiempo, por ejemplo, 6 meses para ser humano y 4-6 semanas para ratón. Una composición o un método sensibiliza la respuesta a un tratamiento terapéutico si el aumento en la sensibilidad al tratamiento o la reducción en la resistencia es del 25 % o más, por ejemplo, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o más, a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más, en comparación con la sensibilidad al tratamiento o resistencia en ausencia de tal composición o método. La determinación de la sensibilidad o resistencia a un tratamiento terapéutico es rutinaria en la materia y está dentro de la experiencia de un profesional clínico habitual en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término “administrar” se refiere a introducir mediante cualquier medio una composición (por ejemplo, un agente terapéutico) en el cuerpo de un mamífero con el fin de prevenir o tratar una enfermedad o afección (por ejemplo, cáncer).

Como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento”, “terapia” y “tratamiento terapéutico”, como se usan en el presente documento, se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica o terapia preventiva. Un ejemplo de “terapia preventiva” es la prevención o reducción de una enfermedad diana (por ejemplo, cáncer) o afección relacionada con la misma. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad o afección, además de aquellos propensos a tener la enfermedad o afección que va a prevenirse. Los términos “tratar”, “tratamiento”, “terapia” y “tratamiento terapéutico”, como se usan en el presente documento, también describen la gestión y cuidado de un mamífero con el fin de combatir una enfermedad, o afección relacionada, e incluye la administración de una composición para aliviar los síntomas, efectos secundarios, u otras complicaciones de la enfermedad, afección. El tratamiento terapéutico para el cáncer incluye, pero no se limita a, cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia génica e inmunoterapia.

Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se indica una cantidad que alivia (de algún modo, como se determina por un médico general experto) uno o más síntomas de la enfermedad o afección en un mamífero. Adicionalmente, por “cantidad terapéuticamente eficaz” se indica una cantidad que devuelve a normales, tanto parcialmente como completamente, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados a o causantes de una enfermedad o afección. Un profesional clínico experto en la materia puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición con el fin de tratar o prevenir una patología particular, o trastorno cuando se administra, tal como intravenosamente, subcutáneamente, intraperitonealmente, por vía oral, o mediante inhalación. La cantidad precisa de la composición requerida para ser terapéuticamente eficaz dependerá de numerosos factores, por ejemplo, tales como la actividad específica del agente activo, el dispositivo de administración empleado, características físicas del agente, fin de la administración, además de muchas consideraciones específicas del paciente. La determinación de la cantidad de una composición que debe administrarse para ser terapéuticamente eficaz es rutinaria en la materia y está dentro de la experiencia de un profesional clínico generalmente experto.

Como se usa en el presente documento, el término “agente” o “fármaco” o “agente terapéutico” se refiere a un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células o tejidos de animal (particularmente de mamífero) que se sospecha que tienen propiedades terapéuticas. El agente o fármaco puede purificarse,

purificarse sustancialmente o purificarse parcialmente. Un “agente”, según la presente invención, también incluye un agente de radioterapia. Como se usa en el presente documento, “modulación” o “modular” significa que una respuesta deseada/seleccionada es más eficaz (por ejemplo, al menos el 10 %, 20 %, 40 %, 60 % o más), más rápida (por ejemplo, al menos el 10 %, 20 %, 40 %, 60 % o más), de mayor magnitud (por ejemplo, al menos el 10 %, 20 %, 40 %, 60 % o mayor) y/o se induce más fácilmente (por ejemplo, al menos el 10 %, 20 %, 40 %, 60 % o más) en presencia de un agente que en ausencia del agente.

Como se usa en el presente documento, el término “resistencia a un tratamiento terapéutico” se refiere a una resistencia adquirida o natural de una muestra de cáncer o un mamífero a una terapia, es decir, que es no sensible a

o que tiene respuesta reducida o limitada al tratamiento terapéutico, por ejemplo, que tiene una respuesta reducida a un tratamiento terapéutico el 25 % o más, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o más, a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más. La reducción en la respuesta se mide comparando con la misma muestra de cáncer o mamífero antes de adquirir la resistencia, o comparando con una muestra de cáncer diferente o un mamífero que es conocido por no tener resistencia al tratamiento terapéutico. Una resistencia a quimioterapia adquirida típica se llama “resistencia multi-fármaco”. La resistencia multi-fármaco puede mediarse por P-glicoproteína o puede mediarse por otros mecanismos, o puede producirse cuando un mamífero se infecta con un microorganismo resistente a múltiples fármacos o una combinación de microorganismos. La determinación de la resistencia a un tratamiento terapéutico es rutinaria en la materia y está dentro de la experiencia de un profesional clínico generalmente experto, por ejemplo, puede medirse por ensayos proliferativos de células y ensayos de muerte celular como se describen en el presente documento anteriormente bajo “sensibilizar”.

Como se usa en el presente documento, el término “quimioterapia” se refiere al uso de fármacos para destruir células cancerosas (incluyendo leucemias y linfomas). Hay más de 50 fármacos de quimioterapia diferentes y algunos se administran solos, pero frecuentemente pueden combinarse varios fármacos (conocido como quimioterapia de combinación). La quimioterapia puede usarse sola para tratar algunos tipos de cáncer. Algunas veces puede usarse junto con otros tipos de tratamiento tales como cirugía, radioterapia, inmunoterapia, o una combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, “radioterapia”, también llamada “terapia con radiación”, se refiere al tratamiento del cáncer y otras enfermedades con radiación ionizante. La radiación ionizante deposita energía que lesiona o destruye las células en el área que está tratándose (el “tejido diana”), dañando su material genético, haciendo imposible que estas células continúen creciendo. Aunque la radiación daña tanto a células cancerosas como a células normales, las últimas son capaces de repararse ellas mismas y funcionar apropiadamente. Puede usarse radioterapia para tratar tumores sólidos localizados, tales como cánceres de la piel, lengua, laringe, cerebro, mama o cuello uterino. También puede usarse para tratar leucemia y linfoma (cánceres de las células formadoras de la sangre y sistema linfático, respectivamente)

Como se usa en el presente documento, el término “protocolo de tratamiento” se refiere al proceso de informar de la decisión de conducir al tratamiento de una enfermedad. Como se usa en el presente documento, el protocolo de tratamiento se basa en los niveles comparativos de uno o más polipéptidos relacionados con el crecimiento celular en una muestra de tejido de paciente con respecto a los niveles del (de los) mismo(s) polipéptido(s) en una pluralidad de muestras de tejido normales y enfermas de mamíferos para los que está disponible información del paciente, que incluye enfoques y resultados del tratamiento.

Como se usa en el presente documento, el término “características biológicas” se refiere al fenotipo y/o genotipo de una o más células o tejidos, que pueden incluir tipo de célula y/o tipo de tejido del que se obtuvo la célula, características morfológicas de la(s) célula(s)/tejido(s), y la expresión de moléculas biológicas dentro de la(s) célula(s)/tejido(s).

Como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a material derivado del cuerpo de un mamífero, que incluye, pero no se limita a, sangre, suero, plasma, orina, aspirado de pezón, líquido cefalorraquídeo, hígado, riñón, mama, hueso, médula ósea, testículos u ovarios y cerebro, colon y pulmón. Una “muestra”, según la presente invención, también puede ser células cultivadas y tejidos.

Como se usa en el presente documento, una “muestra de cáncer” se refiere a una muestra que se origina a partir de un cáncer, es decir, de un nuevo crecimiento de tejido diferente o anormal. Una “muestra de cáncer” puede ser una muestra de células o de tejido. Las células cancerosas pueden existir como parte del tejido del cáncer, o pueden existir como células de flotación libres desprendidas del tejido de cáncer del que se originan. Una muestra de cáncer, según la presente invención, puede usarse para pruebas in vitro o ex vivo de cánceres.

Como se usa en el presente documento, el término “muestra no de cáncer” se refiere a muestra de células o de tejido obtenida de un tejido normal. Una muestra puede determinarse como una muestra no de tumor por un experto en la materia basándose en morfología y otras pruebas de diagnóstico.

Como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a un ser humano u otro animal, tal como animales de granja o animales de laboratorio (por ejemplo, cobaya o ratones).

Como se usa en el presente documento, “hibridación específica” o “hibridación selectiva” o “hibridación bajo una condición rigurosa” se refiere a la hibridación que se produce cuando dos secuencias de polinucleótidos son sustancialmente complementarias, es decir, hay al menos aproximadamente el 60 % y preferentemente al menos aproximadamente el 80 % o el 90 % de identidad entre las secuencias, en la que la región de identidad comprende al menos 10 nucleótidos. En una realización, las secuencias se hibridan bajo condiciones rigurosas tras la incubación de las secuencias durante la noche a 42 ºC, seguido de lavados rigurosos (0,2X SSC a 65 ºC). Normalmente, condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sales tenga concentración de ión Na de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea al menos aproximadamente 30 ºC para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 6 a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Generalmente, las condiciones rigurosas están seleccionadas para ser aproximadamente 5 ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos, como se calcula usando métodos rutinarios en la materia.

Como se usa en el presente documento, el término “homología” se refiere al alineamiento óptimo de secuencias (tanto nucleótidos como aminoácidos), que puede realizarse por implementaciones computerizadas de algoritmos. La “homología”, con respecto a polinucleótidos, por ejemplo, puede determinarse por análisis con BLASTN versión

2.0 usando los parámetros por defecto. La “homología”, con respecto a polipéptidos (es decir, aminoácidos), puede determinarse usando un programa, tal como BLASTP versión 2.2.2 con los parámetros por defecto, que alinea los polipéptidos o fragmentos que se comparan y determina el grado de identidad de aminoácidos o similitud entre ellos. Se apreciará que “homología” de aminoácidos incluye sustituciones conservativas, es decir, aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Normalmente se consideran como sustituciones conservativas las siguientes sustituciones: sustituciones de un aminoácido alifático tal como Ala, Val, Leu y Ile con otro aminoácido alifático; sustitución de una Ser con una Thr o viceversa; sustitución de un residuo ácido tal como Asp o Glu con otro residuo ácido; sustitución de un residuo que lleva un grupo amida, tal como Asn o Gln, con otro residuo que lleva un grupo amida; intercambio de un residuo básico tal como Lys o Arg con otro residuo básico; y sustitución de un residuo aromático tal como Phe o Tyr con otro residuo aromático. Una “homología del 60 % o superior” incluye una homología de, por ejemplo, el 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,95 % y hasta el 100 % (idéntica) entre dos o más secuencias de nucleótidos o de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” incluye ARN, ADNc, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, hebras tanto codificantes como no codificantes, y puede estar químicamente o bioquímicamente modificado o puede contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como será fácilmente apreciado por aquellos expertos en la materia. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que existen de forma natural con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos) y enlaces modificados (por ejemplo, polinucleótidos anoméricos alfa, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada mediante enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas.

Como se usa en el presente documento, el término “mutación” se refiere a un cambio en la secuencia de nucleótidos dentro de un gen, o fuera del gen, en una secuencia reguladora en comparación con no mutante. El cambio puede ser una deleción, sustitución, mutación puntual, mutación de múltiples nucleótidos, transposición, inversión, desplazamiento del marco, mutación terminadora u otras formas de aberración que diferencian la secuencia de polinucleótidos o de proteínas de la de un gen normalmente expresado en una célula funcional en la que la expresión y funcionalidad están dentro del intervalo que normalmente se produce.

“Polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término “proteína recombinante” se refiere a una proteína que se produce por la expresión de una molécula de ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína. Los polinucleótidos y polipéptido recombinantemente producido, y fragmentos o análogos de los mismos, pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica y descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., (1989), Cold Spring Harbor, N.Y., y Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

Como se usa en el presente documento, el término “fragmento”, cuando es en referencia a un polipéptido (como en “un fragmento de una proteína dada”), se refiere a una porción más corta del polipéptido. El fragmento puede oscilar en tamaño de cuatro residuos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos entera menos un aminoácido. En una realización, la presente invención contempla “fragmentos funcionales” de un polipéptido. Tales fragmentos, como se enseña en el presente documento, son “funcionales” porque retienen la capacidad para sensibilizar una muestra de cáncer o mamífero con cáncer a un tratamiento terapéutico, no obstante con quizás menor actividad sensibilizadora que la observada para el polipéptido de longitud completa. Tal “fragmento” de un polipéptido es preferentemente

superior a 10 aminoácidos de longitud, y más preferentemente superior a 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferentemente superior a 100 aminoácidos de longitud. Un “fragmento” de un polipéptido de la familia SPARC, según la presente invención, puede contener uno o más de los tres dominios conservados de los miembros de la familia SPARC, es decir, el dominio ácido del extremo N, el dominio tipo folistatina y el dominio EC de unión a calcio extracelular.

Como se usa en el presente documento, una “variante” de un polipéptido específico se refiere a un polipéptido sustancialmente similar a cualquiera del péptido específico entero o un fragmento del mismo. Por “sustancialmente similar” significa que la variante está hecha para llegar a una construcción final que posee la función deseada, es decir, sensibilizar una muestra de cáncer o un mamífero a un tratamiento terapéutico, sin embargo con quizás menos actividad sensibilizadora de la variante que la observada para el polipéptido no mutante. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico. Además, una “variante” también puede ser un polipéptido de fusión entre un polipéptido de la familia SPARC y un segundo polipéptido. También puede hacerse cualquier combinación de deleción, inserción, sustitución y fusión.

Como se usa en el presente documento, “aislado” o “purificado”, cuando se usa en referencia a un polinucleótido o un polipéptido, significa que una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que existe de forma natural se ha eliminado de su entorno celular normal o se sintetiza en un entorno no natural (por ejemplo, se sintetiza artificialmente). Así, una secuencia “aislada” o “purificada” puede estar en una disolución libre de células o dispuesta en un entorno celular diferente. El término “purificado” no implica que la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos sea el único polinucleótido o polipéptido presente, sino que está esencialmente libre (aproximadamente el 90-95 %, hasta el 99-100 % de pureza) de material de no polinucleótido o polipéptido naturalmente asociado a ella.

Como se usa en el presente documento, el término “que codifica” se refiere a la propiedad inherente de secuencias de nucleótidos específicas en un polinucleótido, tal como un gen en un cromosoma o un ARNm, de servir de moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt, otras moléculas de ARN) o aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de los mismos. Así, un gen codifica una proteína, si la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede denominarse que tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y se proporciona normalmente en los listados de secuencias, como la hebra no codificante, usada como el molde para la transcripción, de un gen o ADNc codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. Un polinucleótido que codifica una proteína incluye cualquier polinucleótido que tenga diferentes secuencias de nucleótidos, pero que codifica la misma secuencia de aminoácidos de la proteína debido a la degeneración del código genético. Los polinucleótidos y secuencias de nucleótidos que codifican proteínas pueden incluir intrones y pueden ser ADN genómico.

Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a un compuesto de polinucleótido usado para introducir polinucleótido exógeno o endógeno en células huésped. Un vector comprende una secuencia de nucleótidos que puede codificar una o más moléculas de polipéptido. Plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos, en un estado natural o que han experimentado ingeniería recombinante, son ejemplos no limitantes de vectores comúnmente usados para proporcionar vectores recombinantes que comprenden al menos una molécula de polinucleótido aislada deseada.

Como se usa en el presente documento, el término “transformación” o el término “transfección” se refiere a una variedad de técnicas reconocidas en la materia para introducir polinucleótido exógeno (por ejemplo, ADN) en una célula. Una célula se “transforma” o “transfecta” cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Los términos “transformación” y “transfección” y términos derivados de cada uno se usan indistintamente.

Como se usa en el presente documento, un “vector de expresión” se refiere a un casete de expresión recombinante que tiene un polinucleótido que codifica un polipéptido (es decir, una proteína) que puede transcribirse y traducirse por una célula. El vector de expresión puede ser un plásmido, virus, o fragmento de polinucleótido.

El término “expresión” se refiere a la producción de una proteína o secuencia de nucleótidos en una célula o en un sistema libre de células, e incluye la transcripción en un producto de ARN, modificación post-transcripcional y/o traducción en un producto de proteína o polipéptido a partir de un ADN que codifica ese producto, además de posibles modificaciones post-traduccionales.

Como se usa en el presente documento, el término “comparar el nivel de expresión” se refiere a comparar la expresión diferencial de un polinucleótido o un polipéptido en dos o más muestras.

Como se usa en el presente documento, el término “expresión diferencial” se refiere a diferencias tanto cuantitativas, además de cualitativas, en los patrones de expresión de polinucleótidos o polipéptidos entre dos o más muestras. Se dice que un polinucleótido o un polipéptido está “diferencialmente expresado” si su expresión es detectable en una muestra, pero no en otra muestra, por métodos conocidos para la detección de polinucleótidos o polipéptidos (por ejemplo, electroforesis). También se dice que un polinucleótido o un polipéptido está “diferencialmente expresado” si

la diferencia cuantitativa de su expresión (es decir, aumento o disminución, medido en µg, µmol o número de copias) entre dos muestras es de aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % (aproximadamente el doble) o más, hasta y que incluye aproximadamente 1,2 veces, 2,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o más. Un transcrito génico “diferencialmente expresado” significa un transcrito de ARNm que se encuentra en diferentes números de copias entre dos o más muestras.

Como se usa en el presente documento, una “cantidad elevada de un polipéptido o polinucleótido de la familia SPARC” se refiere a un nivel de expresión mayor de al menos el 20 %, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %, o 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más en una célula, en comparación con una célula de control. Se dice que una célula que expresa un polipéptido o polinucleótido de la familia SPARC tiene una cantidad elevada de tal polipéptido o polinucleótido si la expresión es como se define en el presente documento anteriormente cuando se compara con una célula resistente a quimioterapia.

El término “proteína secretada” se refiere a una proteína que tiene al menos una porción que es extracelular e incluye proteínas que son completamente extracelulares (es decir, no unidas a una célula). “Nivel de secreción” se refiere al nivel (es decir, cantidad) de una proteína secretada en el compartimento extracelular.

Como se usa en el presente documento, el término “proliferación” se refiere a la tasa de división celular y la capacidad de una célula para continuar dividiéndose. Un proceso de división celular completo se denomina un “ciclo”. Por un “aumento en la proliferación celular” se indica aumentar la tasa de división celular de manera que la célula tenga una mayor tasa de división celular en comparación con células normales de ese tipo de célula, o permitir que la división celular continúe durante más ciclos sin cambiar la tasa de cada división celular, por ejemplo, aumento del 10 % o mayor (por ejemplo, 20 %, 30 %, 40 % 50 %, hasta 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor). Por una “disminución en la proliferación celular” se indica reducir la tasa de división celular de manera que la célula tenga una menor tasa de división celular en comparación con células normales de ese tipo de célula, o reducir el número de ciclos de la división celular sin cambiar la tasa de cada división celular, por ejemplo, disminución del 10 %

o mayor (por ejemplo, 20 %, 30 %, 40 % 50 %, hasta 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor).

Composiciones para su uso en sensibilizar a tratamientos terapéuticos para el cáncer se desvelan en el presente documento. Tales composiciones sensibilizadoras son particularmente útiles en mejorar la respuesta de pacientes que son resistentes a un tratamiento. También son útiles en reducir los efectos secundarios de la terapia del cáncer, por ejemplo, mejorando la respuesta de un paciente a una concentración más pequeña (es decir, dosificación) del tratamiento. La composición para su uso en la presente invención puede reducir la dosificación de un agente de tratamiento terapéutico al menos el 20 %, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, y hasta el 60 %.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la familia SPARC

La presente divulgación enseña el uso de (a) un polipéptido de la familia SPARC seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-17; (b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos el 60 % de homología con dicho polipéptido de la familia SPARC en (a); (c) un fragmento de polipéptido de (a)-(b) en el que dicho fragmento tiene al menos 50 aminoácidos de longitud, y (d) un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de (a)-(c).

Un polipéptido de la familia SPARC puede ser un polipéptido no mutante o una variante del mismo, puede ser el polipéptido de longitud completa o un fragmento del mismo.

Basándose en la homología de secuencias se han identificado varios miembros de la familia SPARC, tales como SMOC-1 (Vannahme et al., 2002, J. Biol. Chern. 277(41):37977-37986), hevina (Bendik I, Schram!P, Ludwig CU, Cancer Res. 1998; 58(4):626-9), SCI (Johnston IG, Paladino T, Gurd JW, Brown IR, Neuron. 1990 4(1):165-76), QR1, proteínas tipo folistatina (TSC-36) (Shibanuma, M., Mashimo, J., Mita, A., Kuroki, T. y Nose, K, 1993, Eur. J. Biochem. 217 (1) 13-19) y testican (Alliel, P.M., Perin, J.P., Jolles, P. y Bonnet, F.J, 1993, Eur. J. Biochem. 214 (1), 347-350). Un polipéptido de la familia SPARC incluye, pero no se limita a, SPARC y cualquiera de sus miembros de familia identificados conocidos en la técnica o como se describen en el presente documento.

El alineamiento de las diversas secuencias de polinucleótidos permite a un experto en la materia seleccionar porciones conservadas de las proteínas (es decir, aquellas porciones en común entre dos o más secuencias), además de porciones no conservadas (es decir, aquellas porciones únicas para dos o más secuencias). El polipéptido de la familia SPARC de la presente invención contiene uno o dos o tres dominios (es decir, el dominio ácido del extremo N, el dominio tipo folistatina y/o el dominio EC), conservados entre los miembros de la familia SPARC.

El fragmentos sensibilizador a la terapia o una variante de una proteína de la familia SPARC no mutante puede delinearse por manipulaciones de secuencia rutinarias conocidas para aquellos expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, deleción, mutaciones, mutaciones puntuales, fusiones como se describen en el presente documento más adelante y como se describen en J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994.

Una mutación en el ADN que codifica el polipéptido de variante no debe alterar el marco de lectura y preferentemente no creará regiones complementarias que pudieran producir estructuras de ARNm secundarias. A nivel genético, estas variantes se preparan por mutagénesis dirigida al sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la molécula de péptido, produciendo así ADN que codifica la variante, y expresando a partir de aquí el ADN en cultivo celular recombinante.

Producción in vitro y purificación de un polipéptido de la familia SPARC

Puede producirse un polipéptido de la familia SPARC en una célula procariota o eucariota usando cualquier método conocido, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de recombinación pueden realizarse como se describe en el presente documento más adelante, o por ejemplo, por los métodos desvelados en T. Maniatis et al., “Molecular Cloning”, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989); Nippon Seikagaku Kai (Sociedad Bioquímica de Japón) ed., “Zoku-Seikagaku Jikken Kouza 1, Idenshi Kenkyuho II (Lecciones sobre Experimentos Bioquímicos (Segunda Serie; 1), Methods for Gene Study II)”, Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1986); Nippon Seikagaku Kai (Sociedad Bioquímica de Japón) ed., “Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2, Kakusan III (Kumikae DNA Gijutsu) (Nuevas Lecciones sobre Experimentos Bioquímicos 2, Ácidos Nucleicos III (Técnica de ADN recombinante))”, Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1992); R. Wu (ed.), “Methods in Enzymology”, Vol. 68, Academic Press, Nueva York (1980); R. Wu et al. (ed.), “Methods in Enzymology”, Vols. 100 & 101, Academic Press, Nueva York (1983); R. Wu et al. (ed.), “Methods in Enzymology”, Vols. 153, 154 & 155, Academic Press, Nueva York (1987), etc., además de por técnicas desveladas en las referencias citadas en su interior. Tales técnicas y medios también pueden ser aquellos que se modifican/mejoran individualmente a partir de técnicas convencionales dependiendo del objetivo de la presente invención.

Un polipéptido de la familia SPARC puede expresarse y purificarse de una célula huésped recombinante. Células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a, bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de insecto que incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares derivadas de Drosophila y gusano de seda, y células de mamífero y líneas celulares.

En ciertas realizaciones, cuando se expresa y purifica un polipéptido de la familia SPARC, se emplean técnicas para mejorar la solubilidad de las proteínas para prevenir la formación de cuerpos de inclusión (que son fracciones insolubles) y, por tanto, obtener grandes cantidades del polipéptido. SPARC acumulada en cuerpos de inclusión es una SPARC tipo inactiva que no retiene sus actividades fisiológicas.

La solubilidad de un polipéptido purificado de la familia SPARC puede mejorarse por métodos conocidos en la materia, y como se describen en el presente documento más adelante.

La solubilidad también puede mejorarse expresando un fragmento funcional, pero no el polipéptido de la familia SPARC de longitud completa. El fragmento expresado podría retener la actividad sensibilizadora como se describe en el presente documento, sin embargo, la actividad puede ser más baja que la de un polipéptido de longitud completa.

Se enseña en el presente documento que puede expresarse un fragmento que contiene uno o dos o los tres dominios de los tres dominios conservados de los miembros de la familia SPARC.

Además, para aumentar la solubilidad de una proteína expresada (por ejemplo, en E. coli), puede reducirse la tasa de síntesis de proteínas reduciendo la temperatura de crecimiento, usando un promotor más débil, usando un plásmido de menor número de copias, reduciendo la concentración de inductor, cambiando el medio de crecimiento como se describe en Georgiou, G. & Valax, P. (1996, Current Opinion Biotechnol. 7, 190-197). Esto disminuye la tasa de síntesis de proteínas y normalmente se obtiene proteína más soluble. También pueden añadirse grupos prostéticos o co-factores que son esenciales para el plegamiento apropiado o para la estabilidad de proteínas, o añadir tampón para controlar la fluctuación del pH en el medio durante el crecimiento, o añadir 1 % de glucosa para reprimir la inducción del promotor lac por lactosa, que está presente en la mayoría de los medios ricos (tales como LB, 2xYT). También pueden añadirse polioles (por ejemplo, sorbitol) y sacarosa a los medios debido a que el aumento en la presión osmótica producido por estas adiciones conduce a la acumulación de osmoprotectores en la célula, que estabilizan la estructura de la proteína nativa. Pueden añadirse etanol, tioles y disulfuros de bajo peso molecular, y NaCl. Además, pueden co-expresarse chaperonas y/o foldasas con el polipéptido deseado. Las chaperonas moleculares promueven la apropiada isomerización y el direccionamiento celular interaccionando transitoriamente con productos intermedios de plegamiento. Los sistemas de chaperonas de E. coli mejor caracterizados son: GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, ClpB. Las foldasas aceleran las etapas limitantes de la velocidad junto con la vía de plegamiento. Tres tipos de foldasas desempeñan una función importante: peptidil prolil cis/trans isomerasas (PPI), disulfuro oxidoreductasa (DsbA) y disulfuro isomerasa (DsbC), proteína disulfuro isomerasa (PDI) que es una proteína eucariota que cataliza tanto la oxidación de cisteína de proteína como la

isomerización de enlaces disulfuro. La co-expresión de una o más de estas proteínas con la proteína diana podría conducir a mayores niveles de proteína soluble.

Un polipéptido de la familia SPARC puede producirse como una proteína de fusión con el fin de mejorar su solubilidad y producción. La proteína de fusión comprende un polipéptido de la familia SPARC y un segundo polipéptido fusionados juntos en marco. El segundo polipéptido puede ser un componente de fusión conocido en la técnica para mejorar la solubilidad del polipéptido con el que está fusionado, por ejemplo, NusA, bacterioferritina (BFR), GrpE, tiorredoxina (TRX) y glutatión-S-transferasa (GST). Madison, Wis.-based Novagen Inc. proporciona la serie de vectores pET 43.1 que permite la formación de una fusión NusA-diana. DsbA y DsbC también han mostrado efectos positivos sobre los niveles de expresión cuando se usan como componentes de fusión, por tanto pueden usarse para fusionarse con un polipéptido SPARC para lograr mayor solubilidad.

En una realización, un polipéptido de la familia SPARC se produce como un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de la familia SPARC y un componente de fusión, tiorredoxina, como se describe en la patente de EE.UU. N.º 6.387.664. La fusión tiorredoxina-SPARC puede producirse en E. coli como proteína soluble fácil de formular en una gran cantidad sin perder las actividades fisiológicas de SPARC. Aunque la patente de EE.UU. N.º 6.387.664 proporciona una proteína de fusión de SPARC con SPARC fusionada al extremo C de tiorredoxina, se entiende, con el fin de la presente invención, que un polipéptido de la familia SPARC puede fusionarse tanto con el extremo N como el extremo C de un segundo polipéptido, mientras que se retiene su función sensibilizadora.

Además de aumentar la solubilidad, una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la familia SPARC puede construirse para la fácil detección de la expresión del polipéptido de la familia SPARC en una célula. En una realización, el segundo polipéptido que se fusiona con el polipéptido de la familia SPARC es un polipéptido indicador. El polipéptido indicador, cuando sirve para tal fin de detección, no tiene que fusionarse con el polipéptido de la familia SPARC. Puede codificarse por el mismo polinucleótido (por ejemplo, un vector) que también codifica el polipéptido de la familia SPARC y co-introducirse y co-expresarse en una célula diana.

Preferentemente, el polipéptido indicador usado en la invención es una proteína auto-fluorescente (por ejemplo, GFP, EGFP). Las proteínas auto-fluorescentes proporcionan un ensayo rápido para la identificación de la expresión de un polinucleótido (y el producto de polipéptido) de interés. Debido a la actividad del polipéptido indicador (y por inferencia su nivel de expresión), puede monitorizarse cuantitativamente usando un citómetro de flujo, es simple para ensayar muchos transfectantes independientes tanto secuencialmente como en población en masa. Las células con la mejor expresión pueden entonces cribarse o seleccionarse de la población. Esto es útil cuando se selecciona una célula recombinante que comprende un polipéptido o polinucleótido de la familia SPARC para tratamiento sensibilizador según la presente invención. Parámetros cuantitativos tales como la intensidad media de fluorescencia y la varianza pueden determinarse a partir del perfil de intensidad de fluorescencia de la población de células (Shapiro, H., 1995, Practical Flow Cytometry, 217-228). Ejemplos no limitantes de moléculas indicadoras útiles en la invención incluyen luciferasa (de luciérnaga u otras especies), cloranfenicol acetiltransferasa, β-galactosidasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína verde fluorescente potenciada (EGFP) y dsRed.

La expresión del polipéptido SPARC (bien por sí mismo o bien como una proteína de fusión) también puede determinarse directamente por un inmunoensayo tal como un ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción) (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 5.962.320; la patente de EE.UU. N.º 6.187.307; la patente de EE.UU. N.º 6.194.205), transferencia Western, o por otros métodos rutinarios en la materia. La expresión de un polipéptido de la familia SPARC puede detectarse indirectamente detectando el transcrito de la proteína (por ejemplo, por análisis de hibridación tal como transferencia Northern o micromatriz de ADN, o por PCR).

En una realización, un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido se fusiona con un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC mediante una secuencia conectora intermedia que codifica un polipéptido de conector.

En otra realización, el polipéptido de conector comprende un sitio de escisión por proteasa que comprende un enlace peptídico que es hidrolizable por una proteasa. Como resultado, el polipéptido de la familia SPARC puede separarse del segundo polipéptido después de la expresión por proteólisis. El conector puede comprender uno o más aminoácidos adicionales en cualquier lado del enlace al que también se une el sitio catalítico de la proteasa (véase, por ejemplo, Schecter y Berger, 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-62). Alternativamente, el sitio de escisión del conector puede estar separado del sitio de reconocimiento de la proteasa y los dos sitio de escisión y sitio de reconocimiento pueden separarse por uno o más (por ejemplo, dos a cuatro) aminoácidos. En un aspecto, el conector comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos. Más preferentemente, el conector tiene entre 5 y 25 aminoácidos de longitud, y lo más preferentemente, el conector tiene entre 8 y 15 aminoácidos de longitud.

Algunas proteasas útiles según la invención se tratan en las siguiente referencias: V.Y.H. Hook, Proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing, RG Landes Company, Austin, Texas, USA (1998);

N.M. Hooper et al., 1997, Biochem. J. 321:265-279; Werb, 1997, Cell 91: 439-442; Wolfsberg et al., 1995, J. Cell Biol. 131: 275-278; Murakami and Etlinger, 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1249-1259; Berg et al., 1995,

Biochem. J. 307: 313-326; Smyth and Trapani, 1995, Immunology Today 16: 202-206; Talanian et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9677-9682; y Thomberry et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 17907-17911. Proteasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas enumeradas en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1. Proteasas y sus señales de escisión

Proteasa

Señal de escisión (secuencia de polinucleótidos de conector a modo de ejemplo)

familia de subtilisina/kexina (furina, PC1, PC2, PC4, PACE4, PC5, PC)

RXKR (SEC ID Nº 49) (CGC NNN AAG CGC) (SEC ID Nº 50)

MMP-2

PLGLWA (SEC ID Nº 51) (CCC CTG GGC CTG TGG GCC) (SEC ID Nº 52)

MT1-MMP

PLGLWA (SEC ID Nº 51) (CCC CTG GGC CTG TGG GCC) (SEC ID Nº 52)

Proteasa

Secuencia de aminoácidos de la señal de escisión (secuencia de polinucleótidos de conector a modo de ejemplo)

caspasa-1

YEVDGW (SEC ID Nº 53) (TAC GAG GTG GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 54)

caspasa-2

VDVADGW (SEC ID Nº 55) (GTG GAC GTG GCC GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 56)

caspasa-3

VDQMDGW (SEC ID Nº 57) (GTG GAC CAG ATG GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 58)

caspasa-4

LEVDGW (SEC ID Nº 59) (CTG GAG GTG GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 60)

caspasa-6

VQVDGW (SEC ID Nº 61) (GTG CAG GTG GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 62)

caspasa-7

VDQVDGW (SEC ID Nº 63) (GTG GAC CAG GTG GAC GGC TGG) (SEC ID Nº 64)

caspasa-8

DXXD (SEC ID Nº 65) (GAC NNN NNN GAC) (SEC ID Nº 66)

caspasa-9

DXXD (SEC ID Nº 65) (GAC NNN NNN GAC)

alfa-secretasa

proteína precursora de amiloide (APP)

proproteína convertasa (subtilisina/kexina isozima SKI-1)

RGLT (SEC ID Nº 67) (CGC GGC CTG ACC) (SEC ID Nº 68)

proproteína convertasas

escisión en residuos hidrófobos (por ejemplo, Leu, Phe, Val, o Met) o en residuos de aminoácidos pequeños tales como Ala o Thr

virus de la enfermedad de pies y boca, proteasa 2A

NFDLLKLAGDVESNPGP (SEC ID Nº 69) (AAC TTC GAC CTG CTG AAG CTG GCC GGC GAC GTG GAG AGC AAC CCC GGC CCC) (SEC ID Nº 70)

peptidasa señal

A-X-A-X (SEC ID Nº 71) (GCC NNN GCC NNN) (SEC ID Nº 72)

aminopeptidasas (por ejemplo, arginina aminopeptidasa, lisina aminopeptidasa, aminopeptidasa B, tripsina)

LTK (SEC ID Nº 73) (CTG ACC AAG) (SEC ID Nº 74)

enzima degradadora de insulina

GGFLRKVGQ (SEC ID Nº 75) (GGC GGC TTC CTG CGC AAG GTG GGC CAG) (SEC ID Nº 76)

5 Polipéptidos de conector adicionales pueden obtenerse de los sustratos para enzima conversora de proopiomelanocortina (PCE); proteasa aspártica de gránulos de cromafín (CGAP); prohormona tiol proteasa; carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa E/H, carboxipeptidasa D y carboxipeptidasa Z); prolil endopeptidasa; y proteasa de alto peso molecular. 10 También pueden usarse proteasas de la superficie celular con conectores escindibles según la invención e incluyen, pero no se limitan a: aminopeptidasa N; aminopeptidasa sensible a puromicina; enzima conversora de angiotensina; piroglutamil peptidasa II; dipeptidil peptidasa IV; N-arginina dibásica convertasa; endopeptidasa 24.15; endopeptidasa 24.16; proteínas secretasas precursoras de amiloide alfa, beta y gamma; enzima secretasa 15 conversora de angiotensina; secretasa de TGF alfa; secretasa de TNF alfa; secretasa de ligando FAS; secretasas de receptor-I y -II de TNF; CD30 secretasa; KL1 y KL2 secretasas; secretasa de receptor de IL6; secretasa de CD43, CD44; secretasas de CD 16-I y CD16-II; secretasa de L-selectina; secretasa de receptor de folato; MMP 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; activador del plasminógeno de urocinasa; activador tisular del plasminógeno; plasmina;

trombina; BMP-1 (C-peptidasa de procolágeno); ADAM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11; y granzimas A, B, C, D, E, F, G y H.

Una alternativa a basarse en proteasas asociadas a células es usar un conector de auto-escisión. Por ejemplo, la

5 proteasa 2A del virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV) puede usarse como conector. Éste es un polipéptido corto de 17 aminoácidos que escinde la poliproteína de FMDV en la unión 2A/2B. La secuencia del propéptido 2A de FMDV es NFDLLKLAGDVESNPGP (SEC ID Nº 77). La escisión se produce en el extremo C del péptido en el par de aminoácidos glicina-prolina final y es independiente de la presencia de otras secuencias de FMDV y se escinde incluso en presencia de secuencias heterólogas.

10 La inserción de esta secuencia entre dos regiones codificantes de proteína (es decir, entre el polipéptido de la familia SPARC y el segundo polipéptido de una proteína de fusión según la invención) produce la formación de una quimera de auto-escisión que se escinde ella misma en un fragmento del extremo C que lleva la prolina del extremo C de la proteasa 2A en su extremo N, y un fragmento del extremo N que lleva el resto del péptido de proteasa 2A en su

15 extremo C (véase, por ejemplo, P. deFelipe et al., Gene Therapy 6: 198-208 (1999)). Los conectores de autoescisión y combinaciones de proteasa-conector adicionales se describen adicionalmente en el documento WO 0120989.

Los polinucleótidos que codifican las secuencias de conector descritas anteriormente pueden clonarse a partir de

20 secuencias que codifican los sustratos naturales de una proteasa apropiada o pueden sintetizarse químicamente usando métodos rutinarios en la materia.

Cuando se expresa un polipéptido de la familia SPARC en una célula humana, por ejemplo, in vitro o in vivo, los codones seleccionados para tal polinucleótido que codifica el polipéptido de la familia SPARC son preferentemente

25 aquellos que son los más frecuentemente usados en seres humanos, tales como aquellos enumerados en la Tabla 2 a continuación. Las secuencias de polinucleótidos a modo de ejemplo mostradas en la Tabla 4 se basan en codones que se usan lo más frecuentemente en seres humanos.

TABLA 2. Codones de ADN preferidos para uso humano

Aminoácidos

Código de 3 letras Código de 1 letra Codones preferidos en genes humanos

Alanina

Ala A GCC GCT GCC GCG

Cisteína

Cys C TGT TGT

Ácido aspártico

Asp D GAC GAT

Ácido glutámico

Glu E GAG GAA

Fenilalanina

Phe F TTC TTT

Glicina

Gly G GGC GGG GGA GGT

Histidina

His H CAC CAT

Isoleucina

Ile I ATC ATI ATA

Lisina

Lys K AAG AAA

Leucina

Leu L CTG

TTG CTT CTA TTA

Metionina

Met M ATG

Asparagina

Asn N AAC AAT

Prolina

Pro P CCC CCT CCA CCG

TABLA 2. Codones de ADN preferidos para uso humano

Aminoácidos

Código de 3 letras Código de 1 letra Codones preferidos en genes humanos

Glutamina

Gln Q CAG CAA

Arginina

Arg R CGC AGG CGG

AGA CGA CGT

Serina

Ser S AGC TCC TCT AGT TCA TCG

Treonina

Thr T ACC ACA ACT ACG

Valina

Val V GTG GTC GTT GTA

Triptófano

Trp W TGG

Tirosina

Tyr Y TAC TAT

Los codones de más arriba representan aquellos más preferidos para su uso en genes humanos. Los codones subrayados casi nunca se usan en genes humanos y, por tanto, no son preferidos.

5 Se desvela en el presente documento el uso de (a) un polinucleótido que codifica el polipéptido de un polipéptido de la familia SPARC o un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de la familia SPARC; y (b) un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido de (a) bajo una condición de hibridación rigurosa.

Técnicas para la manipulación de polinucleótidos para realizar las realizaciones anteriores de la invención son muy

10 conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Ausubel et al. 1987 y en Annual Reviews of Biochemistry, 1992, 61:131-156). Reactivos útiles en la aplicación de tales técnicas, tales como enzimas de restricción y similares, son ampliamente conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles de varios vendedores.

15 Las secuencias de polinucleótidos como se enseña en el presente documento también pueden producirse en parte o en total por síntesis química, por ejemplo, por el método de fosforamidito descrito por Beaucage, et al., 1981, Tetra. Letts., 22:1859-1862, o el método de triéster (Matteucci et al., 1981, J. Am. Chern. Soc., 103:3185), que puede realizarse en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comerciales. Puede obtenerse un fragmento bicatenario a partir del producto monocatenario de síntesis química tanto sintetizando la hebra complementaria como

20 hibridando las hebras juntas bajo condiciones apropiadas, o sintetizando la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Adecuadamente, el polinucleótido de la familia SPARC puede existir como vector, preferentemente, un vector de expresión.

25 Vectores de expresión

Un polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos de la familia SPARC puede incorporarse en vectores capaces de introducción dentro de y replicación en una célula procariota o eucariota para producir un polipéptido de

30 la familia SPARC de la presente invención para tratamiento sensibilizador, o puede usarse para transfectar o infectar una célula o tejido y lograr la función sensibilizadora expresando directamente el polipéptido de la familia SPARC. Los vectores pueden o pueden no integrarse dentro del genoma de la célula transfectada o infectada.

Moléculas de polinucleótidos útiles que codifican un polipéptido de la familia SPARC de la presente invención

35 pueden clonarse en un vector de expresión antes de introducirse dentro de una célula apropiada y pueden someterse a pases en células para generar cantidades útiles de estos polinucleótidos.

Vectores adecuados para la invención pueden ser vectores de plásmido o virales. Los vectores de expresión en plásmido incluyen, pero no se limitan a, plásmidos que incluyen pBR322, pUC, pcDNA3.1 o Bluescript™. Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, baculovirus, adenovirus, poxvirus, virus adenoasociados (AAV) y vectores de retrovirus (Price et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:156-160) tales como el vector incompetente en la replicación basado en MMLV pMV-7 (Kirschmeier et al., 1988, DNA, 7:219-225), además de cromosomas humanos y modificados con levadura (HAC y YAC). Los vectores de expresión pueden comprender uno o más elementos reguladores para conducir y/o potenciar la expresión de polinucleótidos en la dirección 5' o en la dirección 3'. Estas secuencias reguladoras se seleccionan basándose en las células que van a usarse para la introducción y/o expresión, y están operativamente ligadas a una secuencia de polinucleótidos que va a expresarse. El término “elementos reguladores” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales elementos reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel; 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA.

Elementos reguladores incluyen aquellos que dirigen la expresión de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células sujeto, además de aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células sujeto (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido).

Los elementos reguladores también incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de polinucleótidos operativamente enlazada y aquellos que dirigen la expresión inducible de la secuencia de polinucleótidos.

Preferentemente, pueden usarse promotores adecuados. Por ejemplo, tales promotores pueden incluir promotor de triptófano (trp), promotor de lactosa (lac), promotor de triptófano-lactosa (tac), promotor de lipoproteína (lpp), promotor PL del fago λ, etc., en el caso de plásmidos en los que se usa Escherichia coli como huésped; y promotores GAL1, GAL10, etc., en el caso de plásmidos en los que la levadura se usa como huésped.

Algunos promotores y potenciadores eucariotas tienen una amplia variedad de células en las que pueden activar y/o modular la transcripción, mientras que otros son solo funcionales en un subconjunto limitado de tipos de células (véanse, por ejemplo, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci., 11:287; y Maniatis et al., arriba, para revisiones). Por ejemplo, el potenciador del gen temprano SV40 es muy activo en una amplia variedad de tipos de células de muchas especies de mamífero y se ha usado ampliamente para la expresión de proteínas en células de mamífero (Dijkema et al., 1985, EMBO J. 4:761). Otros dos ejemplos de elementos promotores/potenciadores activos en una amplia variedad de tipos de células de mamífero son aquellos del gen del factor de alargamiento humano 1α (Uetsuki et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:5791; Kim et al., 1990, Gene, 91:217; y Mizushima, et al., 1990, Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322) y las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777) y el citomegalovirus humano (Boshart et al., 1985, Cell, 41:521).

Promotores adecuados para la expresión de células eucariotas incluyen, pero no se limitan a, promotores de TRAP, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; el promotor del citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneína, promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de la timidina cinasa viral, tales como el promotor de timidina cinasa del herpes simple; LTR retrovirales; ITR; el promotor de P-actina; y promotores de la hormona de crecimiento humana. Un promotor también puede ser el promotor nativo que controla el polinucleótido que codifica el polipéptido y las secuencias de promotores nativos pueden encontrarse en la materia (véanse Agrawal et al., 2000, J. Hematother. Stem Cell Res., 795-812; Cournoyer et al., 1993, Annu. Rev. Immunol., 11:297-329; van de Stolpe et al., 1996, J. Mol. Med., 74:1333; Herrmann, 1995, J. Mol. Med., 73:157-63)

Se enseñan una variedad de secuencias potenciadoras en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan

a: potenciador de la cadena pesada de la inmunoglobulina; potenciador de la cadena ligera de la inmunoglobulina; potenciador del receptor de linfocitos T; potenciadores DQ α y DQ β de HLA; potenciador de β-interferón; potenciador de interleucina-2; potenciador del receptor de interleucina-2; potenciador 5ak de MHC de clase II; potenciador de HLA-DRα de MHC de clase II; potenciador de β-actina; potenciador de creatina cinasa de músculo; potenciador de prealbúmina (transtiretina); potenciador de elastasa I; potenciador de metalotioneína; potenciador de colagenasa; potenciador del gen de albúmina; potenciador de α-fetoproteína; potenciador de β-globina; potenciador de c-fos; potenciador de c-HA-ras; potenciador de insulina; potenciador de la molécula de adhesión a células neurales (NCAM); potenciador de α1-antitripsina; potenciador de histona H2B (TH2B); potenciador de colágeno de ratón o tipo I; potenciador de proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78); potenciador de hormona de crecimiento de rata; potenciador de amiloide A de suero humano (SAA); potenciador de troponina I (TN 1); potenciador del factor de crecimiento derivado de plaquetas; potenciador de la distrofia muscular de Duchenne; potenciador del polioma de SV40; potenciador de retrovirus; potenciador del virus del papiloma; potenciador del virus de la hepatitis B; potenciador de la inmunodeficiencia humana; potenciador del citomegalovirus; y potenciador del virus de la leucemia del mono de gibón.

Secuencias de promotor / potenciador inducibles a modo de ejemplo y sus inductores se enumeran a continuación.

TABLA 3. Promotores/potenciadores inducibles útiles

Elemento

Inductor

MTII

Éster de forbol (TFA) Metales pesados

MMTV (virus del tumor mamario de ratón)

Glucocorticoides

β-Interferón

poli(rl) X poli(rc)

Adenovirus 5 E2

Ela

c-jun

Éster de forbol (TPA), H2O2

Colagenasa

Éster de forbol (TPA)

Estromelisina

Éster de forbol (TPA), IL-1

SV40

Éster de forbol (TFA)

Gen MX murino

Interferón, virus de la enfermedad de Newcastle

Gen GRP78

A23187

α-2-Macroglobulina

IL-6

Vimentina

Suero

Gen H-2kB de MHC de clase I

Interferón

HSP70

Ela, antígeno T grande del SV40

Proliferina

Éster de forbol (TPA)

Factor de necrosis tumoral

FMA

Gen a de la hormona estimulante de la tiroides

Hormona tiroidea

Secuencias reguladoras eucariotas adicionales que pueden obtenerse de Eukaryotic Promoter Data Base EPDB) también pueden usarse para conducir la expresión de un polinucleótido.

Como se enseña en el presente documento, la administración de un vector en una célula puede identificarse in vitro

o in vivo incluyendo un marcador de selección en la construcción de expresión, tal como se ha descrito en el presente documento anteriormente. El marcador produciría un cambio identificable a la célula modificada, permitiendo la fácil identificación de expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación y en la selección de transformantes. Genes que pueden usarse como marcadores de selección en células eucariotas se conocen en la técnica e incluyen, ejemplos de marcadores de selección dominantes incluyen el gen bacteriano aminoglucósido 3' fosfotransferasa (también denominado el gen neo) que confiere resistencia al fármaco G418 en células de mamífero, el gen bacteriano higromicina G fosfotransferasa (hyg) que confiere resistencia al antibiótico higromicina y el gen bacteriano xantina-guanina fosforibosil transferasa (también denominado el gen gpt) que confiere la capacidad de crecer en presencia de ácido micofenólico. Otros marcadores de selección no son dominantes porque su uso debe ser conjuntamente con una línea celular que carece de la actividad enzimática relevante. Ejemplos de marcadores de selección no dominantes incluyen el gen timidina cinasa (tk) que se usa conjuntamente con líneas celulares tk, el gen CAD que se usa conjuntamente con células deficientes en CAD y el gen de mamífero hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (hprt) que se usa conjuntamente con líneas celulares hprt. Una revisión del uso de marcadores de selección en líneas celulares de mamífero se proporciona en Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York pp. 16,9-16,15.

Alternativamente, pueden emplearse genes que codifican enzimas, tales como timidina cinasa (tk) (eucariotas) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (procariotas) del virus del herpes simple para proporcionar marcadores de selección. También pueden emplearse marcadores inmunológicos. No se cree que el tipo exacto de marcador de selección empleado sea importante, mientras que sea capaz de expresarse simultáneamente con el polinucleótido, que codifica un polipéptido de interés. Otros ejemplos de marcadores de selección son muy conocidos para un experto en la materia.

Si se emplea un inserto de ADNc para expresar un polipéptido de la familia SPARC de la invención, normalmente se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar la apropiada poliadenilación del transcrito de polinucleótido. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y puede emplearse cualquier secuencia tal. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensajero y para minimizar la ultralectura del casete de expresión en otras secuencias.

Producción de células recombinantes: -Introducción de un polinucleótido de la familia SPARC en una célula para la expresión y/o sensibilización

Como se ha descrito anteriormente, un polinucleótido de la familia SPARC puede introducirse en una célula con el fin de expresar el polipéptido de la familia SPARC para la purificación o para expresar y lograr el efecto sensibilizador de la invención según métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.), 1989, Greene Publishing Associates, Sección 9.1 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Varios métodos no virales para la transferencia de vectores en células de mamífero cultivadas se contemplan en el presente documento. Éstos incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham, et al., 1973; Chen, et al., 1987; Rippe, et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland, et al., 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau, et al., 1982; Fraley et al., 1979) y complejos de lipofectamina-ADN, sonicación de células (Fechheimer et al., 1987), bombardeo de genes usando microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990) y transfección mediada por receptor (Wu, et al., 1987; Wu, et al., 1988). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse satisfactoriamente para uso in vivo o ex vivo.

Una vez se ha administrado el vector en la célula, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede posicionarse y expresarse en diferentes sitios. Como se desvela en el presente documento, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede integrarse establemente en el genoma de la célula. Esta integración puede ser mediante recombinación homóloga (sustitución génica) o puede integrarse en una localización no específica aleatoria (aumento de genes), véase Holmes-Son et al., 2001, Adv. Genet. 43: 33-69. Como se enseña en el presente documento, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede mantenerse establemente en la célula como un segmento de ADN episómico separado. Tales segmentos de polinucleótido o “episomas” codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente de o en sincronización con el ciclo celular del sujeto. Cómo la construcción de expresión se administra a una célula y dónde en la célula permanece el polinucleótido es muy conocido en la técnica y depende del tipo de construcción de expresión empleada.

Líneas celulares derivadas de especies de mamífero que pueden ser adecuadas para la transfección e infección de un polinucleótido de la familia SPARC y para la expresión y purificación de un polipéptido recombinante pueden estar comercialmente disponibles. Estas líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, CV-1 (ATCC CCL 70), COS1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, HEK-293 (ATCC CRL1573), NSO (ECACC85110503) y HT1080.

Los cultivos celulares pueden prepararse de diversas formas para transferencia génica in vitro. Con el fin de mantener las células viable mientras que están in vitro y en contacto con la construcción de expresión es necesario garantizar que las células mantengan contacto con la relación correcta de oxígeno y dióxido de carbono y nutrientes, pero se protejan de la contaminación microbiana.

La transferencia de la construcción puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica y como se describe en el presente documento más adelante. Algunos métodos pueden ser particularmente aplicables para la transferencia in vitro, pero también pueden aplicarse a uso in vivo.

Transfección mediada por CaPO4

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede introducirse en células formando un precipitado que contiene el polinucleótido y fosfato de calcio. Por ejemplo, una solución salina tamponada con HEPES puede mezclarse con una disolución que contiene cloruro de calcio y polinucleótido para formar un precipitado y el precipitado se incuba entonces con células. Puede añadirse una etapa de choque con glicerol o sulfóxido de dimetilo para aumentar la cantidad de polinucleótido captado por ciertas células. La transfección mediada por CaPO4 puede usarse para transfectar establemente (o transitoriamente) células y solo es aplicable a la modificación in vitro de células. Los protocolos para la transfección mediada por CaPO4 pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.), 1989, Greene Publishing Associates, Sección 9.1 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Secciones 16.32-16.40 u otros manuales de laboratorio estándar.

Dubensky et al. (1984) inyectaron satisfactoriamente ADN del virus del polioma en forma de precipitados de CaPO4 en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando la replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO4 produce la expresión de los genes transfectados. Así, el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC también puede transferirse en una manera similar in vivo para expresar un polipéptido deseado de la familia SPARC como se ha descrito anteriormente.

Transfección mediada por DEAE-dextrano

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede introducirse en células formando una mezcla del polinucleótido y DEAE-dextrano e incubando la mezcla con las células. Puede añadirse una etapa de choque con sulfóxido de dimetilo o cloroquina para aumentar la cantidad de captación de polinucleótido. Protocolos para la transfección mediada por DEAE-dextrano pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.), 1989, Greene Publishing Associates, Sección 9.2 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Secciones 16.41-16.46 u otros manuales de laboratorio estándar.

Electroporación

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC también puede introducirse en células incubando las células y el polinucleótido juntos en un tampón apropiado y sometiendo las células a un pulso eléctrico de alto voltaje. La eficiencia con la que el polinucleótido se introduce en las células por electroporación está influida por la concentración del campo aplicado, la longitud del pulso eléctrico, la temperatura, la conformación y concentración del polinucleótido, y la composición iónica de los medios. La electroporación puede usarse para transfectar establemente (o transitoriamente) una amplia variedad de tipos de células. Protocolos para electroporar células pueden encontrarse en Ausubel, F.M. et al. (eds.), arriba, Sección 9.3 y en Sambrook et al., arriba, Secciones 16.54

16.55 u otros manuales de laboratorio estándar.

Transfección mediada por liposomas (“lipofección”)

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC también puede introducirse en células mezclando el polinucleótido con una suspensión de liposomas que contiene lípidos catiónicos. El complejo de polinucleótido/liposoma se incuba entonces con células. La transfección mediada por liposomas puede usarse para transfectar establemente (o transitoriamente) células en cultivo in vitro. Los protocolos pueden encontrarse en Ausubel, F.M. et al. (eds.), arriba, Sección 9.4 y otros manuales de laboratorio estándar. Adicionalmente, la administración génica in vivo se ha llevado a cabo usando liposomas. Véanse, por ejemplo Nicolau et al., 1987, Meth. Enz., 149:157-176; Wang, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7851-7855; Brigham et al., 1989, Am. J. Med. Sci., 298:278; y Gould-Fogerite et al., 1989, Gene, 84:429-438.

Inyección directa

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC puede introducirse en células inyectando directamente el polinucleótido en las células. Para un cultivo de células in vitro, el polinucleótido puede introducirse por microinyección. Como cada célula se microinyecta individualmente, este enfoque requiere mucho trabajo cuando se modifican grandes números de células. Sin embargo, una situación en la que la microinyección es un método de elección es en la producción de animales transgénicos (tratado en mayor detalle más adelante). En esta situación, el polinucleótido se introduce establemente en un ovocito fecundado que luego se deja desarrollar en un animal. El animal resultante contiene células que llevan el polinucleótido introducido en el ovocito. La inyección directa puede usarse para introducir el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC en células in vivo (véanse por ejemplo, Acsadi et al., 1991, Nature, 332: 815-818; Wolff et al., 1990, Science, 247:1465-1468). Puede usarse un aparato de administración (por ejemplo, una “pistola de genes”) para inyectar ADN en células in vivo. Un aparato tal está comercialmente disponible (por ejemplo, de BioRad).

Captación de ADN mediada por receptor

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC también puede introducirse en células complejando el polinucleótido con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando para un receptor de superficie celular (véanse, por ejemplo, Wu, et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:14621; Wilson et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:963-967; y la patente de EE.UU. N.º 5.166.320). La unión del complejo polinucleótido-ligando al receptor facilita la captación del polinucleótido por endocitosis mediada por receptor. Los receptores a los que se han dirigido un complejo de polinucleótido-ligando incluyen el receptor de transferrina y el receptor de asialoglicoproteína. Puede usarse un complejo de polinucleótido-ligando enlazado a cápsides de adenovirus que rompen naturalmente endosomas, liberando así material en el citoplasma, para evitar la degradación del complejo por lisosomas intracelulares (véanse, por ejemplo, Curiel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850; Cristiano et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2122-2126). La captación de polinucleótidos mediada por receptor puede usarse para introducir el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC en células tanto in vitro como in vivo y, adicionalmente, tiene la característica añadida de que el polinucleótido puede dirigirse selectivamente a un tipo de célula particular por uso de un ligando que se une a un receptor selectivamente expresado sobre una célula diana de interés.

Transferencia génica mediada por virus

Otro enfoque para introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC en una célula es por uso de un vector viral que contiene el polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que una gran proporción de células recibe el polinucleótido, que puede obviar la necesidad de selección de células que han recibido el polinucleótido. Adicionalmente, moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, por un ADNc contenido en el vector viral, se expresan eficazmente en células que han captado polinucleótido de vector viral y pueden usarse sistemas de vector viral tanto in vitro como in vivo.

Pueden producirse vectores virales no replicantes en líneas celulares de encapsidación que producen partículas de virus que son infecciosas, pero defectuosas en la replicación, haciéndolas vectores útiles para la introducción de polinucleótido en una célula que carece de información genética complementaria que permita la encapsidación

(Mann et al., 1983, Cell, 33:153; Miller y Buttimore, Mol. Cell. Biol., 1986, 6:2895 (PA317, ATCC CCL9078). Se prefieren líneas celulares de encapsidación que contienen genes de encapsidación anfotrófica capaces de transformar células de ser humano y otro origen de especie.

Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizado por una capacidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas por un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990, en Fields et al., Ceds, Virology, Raven Press, Nueva York, pp. 1437-1500). El ADN resultante se integra entonces establemente en cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración produce la retención de las secuencias de genes virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican proteínas de la cápside, enzima polimerasa y componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia encontrada en la dirección 5' del gen gag funciona como señal para la encapsidación del genoma en viriones. Están presentes dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Éstas contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también se requieren para la integración en el genoma de la célula del sujeto (Coffin, arriba).

Retrovirus defectuosos están bien caracterizados para su uso en transferencia génica para fines de terapia génica (para una revisión véase Miller, 1990, Blood 76:271).

Protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.), 1989, Greene Publishing Associates, Secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM, que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Ejemplos de líneas de virus de encapsidación adecuados incluyen Crip, Cre, 2 y Am. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, que incluyen células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de la médula ósea, in vitro y/o in vivo (véanse, por ejemplo Eglitis, et al., 1985, Science, 230:1395-1398; Danos, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6141-6145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science, 254:1802-1805; vanBeusechem et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:76407644; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy, 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1089210895; Hwu et al., 1993, J. Immunol., 150:4104-4115; patente de EE.UU. N.º 4.868.116; patente de EE.UU. N.º 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT WO 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales requieren la división de células diana con el fin de que el genoma retroviral (y polinucleótido extraño insertado en él) se integren en el genoma del sujeto para introducir establemente el polinucleótido en la célula. Así, puede ser necesario estimular la replicación de la célula diana.

Adenovirus

El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de 36 kB, lineal y de ADN bicatenario, permite la sustitución de un gran trozo de ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kB (Grunhaus, et al., 1992, Seminar in Virology, 3:237-252). A diferencia de los retrovirus, la infección de ADN adenoviral en células del sujeto no produce integración cromosómica debido a que el ADN adenoviral puede replicarse en un modo episómico sin posible genotoxicidad. Por tanto, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado reordenamiento del genoma después de una amplia amplificación. Los adenovirus pueden infectar prácticamente a todas las células epiteliales independientemente de su etapa del ciclo celular.

El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como un vector de transferencia génico debido a su genoma de tamaño medio, facilidad de manipulación, alto título, amplia variedad de células diana y alta infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), que son elementos en cis necesarios para la replicación y encapsidación de ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción que se dividen por la aparición de replicación de ADN viral. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) produce la síntesis de las proteínas para la replicación de ADN viral. Estas proteínas participan en la replicación de ADN, expresión génica tardía y corte de células huésped (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, que incluyen la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan solo después de un significativo procesamiento de un único transcrito primario emitido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP es particularmente eficaz durante la fase de infección tardía, y todos los ARNm emitidos de este promotor poseen una secuencia conductora tripartita en 5' (TL) que los hace ARNm preferidos para la traducción.

El genoma de un adenovirus puede manipularse de forma que codifique y exprese un producto génico de interés, pero se inactive en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véanse, por ejemplo, Berkner, et al., 1988, BioTechniques, 6:616; Rosenfeld, et al., 1991, Science, 252:431-434; y Rosenfeld, et al., 1992, Cell, 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 u

otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Los adenovirus recombinantes son ventajosos porque no requieren dividir células para ser vehículos de administración génica eficaces y pueden usarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, que incluyen epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld, et al., 1992, citado arriba), células endoteliales (Lemarchand, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486), hepatocitos (Herz, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2812-2816) y células de músculo (Quantin, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584). Adicionalmente, el polinucleótido adenoviral introducido (y ADN foráneo contenido en su interior) no se integra en el genoma de una célula del sujeto, pero sigue episómico, evitando así posibles problemas que pueden producirse como resultado de mutagénesis insercional en situaciones en las que el polinucleótido introducido se integra en el genoma del sujeto (por ejemplo, ADN retroviral). Además, la capacidad portadora del genoma adenoviral para ADN foráneo es grande (hasta 8 kilobases) con respecto a otros vectores de administración génica (Berkner, et al. citado arriba; Haj-Ahmand, et al., 1986, J. Virol., 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectuosos en la replicación actualmente en uso están delecionados para todos o partes de los genes virales E1 y E3, pero retienen nada menos que el 80 % del material genético adenoviral.

Pueden generarse adenovirus recombinantes por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describen en la patente de EE.UU. N.º 6.194.191.

La generación y propagación de los vectores de adenovirus, que son deficientes en la replicación, dependen de una única línea celular cooperadora, designada 293, que se transformó a partir de células de riñón embrionario humano por fragmentos de ADN de Ad5 y expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham, et al., 1977). Como la región E3 es dispensable del genoma de adenovirus (Jones, et al., 1978), los actuales vectores de adenovirus, con la ayuda de células 293, llevan ADN foráneo en tanto las regiones E1, E3, como ambas (Graham, et al., 1991). En la naturaleza, los adenovirus pueden encapsidar aproximadamente el 105 % del genoma no mutante (Ghosh-Choudhury, et al., 1987), proporcionando capacidad durante aproximadamente 2 kB extra de ADN. Combinado con los aproximadamente 5,5 kB de ADN que son sustituibles en las regiones E1 y E3, la capacidad máxima del actual vector de adenovirus es inferior a 7,5 kB, o aproximadamente el 15 % de la longitud total del vector. Más del 80 % del genoma viral de adenovirus sigue en el esqueleto de vector y es la fuente de citotoxicidad transmitida por vector. Por tanto, la deficiencia de replicación del virus delecionado en E1 es incompleta. Por ejemplo, se ha observado la fuga de expresión génica viral con los vectores de adenovirus actualmente disponibles a altas multiplicidades de infección (Mulligan, 1993).

Pueden derivarse líneas de células cooperadoras de células humanas tales como células de riñón embrionario humano, células de músculo, células hematopoyéticas u otras células mesenquimatosas o epiteliales embrionarias humanas. Alternativamente, las células cooperadoras pueden derivarse de las células de otras especies de mamífero que son permisivas para adenovirus humanos. Tales células incluyen, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimatosas o epiteliales embrionarias de mono. Como se ha establecido anteriormente, la línea de células cooperadoras preferida es 293.

Aparte del requisito de que el vector de adenovirus sea defectuoso en la replicación, o al menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de los 42 serotipos diferentes conocidos o subgrupos A-F. El adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido con el fin de obtener el vector de adenovirus defectuoso en la replicación condicional para su uso en el método de la presente invención. Esto es debido a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano sobre el cual se conoce muchísima información bioquímica y genética, y se ha usado históricamente para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como vector.

Como se ha establecido anteriormente, el vector típico como se enseña en el presente documento es defectuoso en la replicación y no tendrá una región E1 de adenovirus. Así, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifica un polipéptido de interés en la posición de la que se han eliminado las secuencias codificantes de E1. Sin embargo, la posición de inserción de la región codificante de un polinucleótido seleccionado dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica.

El adenovirus es fácil de cultivar y manipular y presenta un amplio intervalo de sujetos in vitro e in vivo. Este grupo de virus puede obtenerse en altos títulos, por ejemplo, 109 -1011 unidad formadoras de placa (UFP)/ml, y son altamente infecciosos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere integración en el genoma de células del sujeto.

Se han usado vectores de adenovirus en la expresión génica eucariota (Levrero, et al., 1991, Gene, 101:195-202; Gomez-Foix, et al., 1992, J. Biol. Chern., 267:25129-25134) y el desarrollo de vacunas (Grunhaus, et al., 1992, Seminar in Virology, 3:237-252; Graham, et al., 1992, Biotechnologya, 20:363-390). Estudios en animales sugirieron que los adenovirus recombinantes podrían usarse para terapia génica (Stratford-Perricaudet, et al., 1991, en: Human Gene Transfer, O. Cohen-Haguenauer, Ceds), John Libbey Eurotext, France; Stratford-Perricaudet, et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256; Rich, et al., 1993, Nature, 361:647-650). Experimentos en administrar adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación traqueal (Rosenfeld, et al., 1991, Science, 252:431-434; Rosenfeld, et al., 1992, Cell, 68:143-155), inyección muscular (Ragot, et al., 1993, Nature, 361:647-650), inyección

intravenosa periférica (Herz, et al., 1993, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993, Science, 259:988-990).

Otros vectores virales como vectores de expresión

Pueden emplearse otros vectores virales como construcciones de expresión. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como virus de la variolovacuna (Ridgeway, 1988, en: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. Stoneham: Butterworth, pp.467-492; Baichwal, et al., 1986 en: Kucherlapati R, ed. Gene Transfer. Nueva York: Plenum Press, pp. 117-148; Coupar, et al., 1988, Gene, 68:1-10), virus adeno-asociados (AAV) (Baichwal, et al., 1986, arriba; Hermonat, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470) y virus del herpes. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamífero (Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281; Baichwal, et al., 1986, arriba; Coupar, et al., 1988, arriba; Horwich, et al., 1990, J. Virol., 64:642-650).

Virus adeno-asociados: El virus adeno-asociados (AAV) es un virus defectuoso que se produce naturalmente que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como virus auxiliar para la eficaz replicación y un ciclo de vida productivo (para una revisión véase Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158:97129). También es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células que no se dividen, y presenta una alta frecuencia de integración estable (véanse, por ejemplo, Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Bioi., 7:349356; Samulski et al., 1989, J. Virol., 63:3822-3828; y McLaughlin et al., 1989, J. Virol., 62:1963-1973). Los vectores que contienen tan solo 300 pares de bases de AAV pueden encapsidarse y pueden integrarse. El espacio para el ácido nucleico exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Un vector de AAV tal como el descrito en Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 puede usarse para introducir polinucleótido en células. Se ha introducido una variedad de polinucleótidos en diferentes tipos de células usando vectores de AAV (véanse, por ejemplo, Hermonat, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; Tratschin, et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 4:20722081; Wondisford, et al., 1988, Mol. Endocrinol., 2:32-39; Tratschin, et al., 1984, J. Virol., 51:611-619; y Flotte, et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:3781-3790).

Después de la transferencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC en células, las células pueden seleccionarse y usarse para tratamiento sensibilizador según la presente invención. La eficacia de un sistema de vector de expresión particular y método de introducción de polinucleótido en una célula puede evaluarse por enfoques convencionales rutinariamente usados en la materia. Por ejemplo, el polinucleótido introducido en una célula puede detectarse por una técnica de hibridación con filtro (por ejemplo, transferencia Southern) y el ARN producido por transcripción del polinucleótido introducido puede detectarse, por ejemplo, por transferencia Northern, protección de RNasa o reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). El producto génico puede detectarse por un ensayo apropiado, por ejemplo, por detección inmunológica de una proteína producida, tal como con un anticuerpo específico, o por un ensayo funcional para detectar una actividad funcional del producto génico, tal como un ensayo enzimático. Alternativamente, un sistema de expresión puede primero optimizarse usando un gen indicador enlazado a los elementos reguladores y el vector que va a usarse como se ha descrito en el presente documento anteriormente. El gen indicador codifica un producto génico separado que es fácilmente detectable y, así puede usarse para evaluar la eficacia del sistema.

Como un polipéptido de la familia SPARC es una proteína secretada, su nivel extracelular también puede detectarse para determinar su expresión usando métodos conocidos en la técnica, tales como inmunotransferencia o ELISA.

Otra forma de aumentar la expresión de un polinucleótido o polipéptido SPARC en una célula es por activación de gen endógeno, es decir, insertando un promotor fuerte antes de la secuencia del gen de la familia SPARC natural en el genoma de la célula. La activación de gen endógeno es un método de introducción, por recombinación homóloga con ADN genómico, secuencias de ADN (por ejemplo, promotores fuertes) que normalmente no están funcionalmente enlazadas al gen endógeno y (1) que, cuando se insertan en el genoma del huésped en o cerca del gen endógeno, sirven para alterar (por ejemplo, activar) la expresión del gen endógeno, y adicionalmente (2) permiten la selección de células en las que se amplifica el gen endógeno activado. La expresión de proteínas por activación de gen endógeno es muy conocida en la técnica y se desvela, por ejemplo en las patentes de EE.UU. N.º 5.733.761, 5.641.670 y 5.733.746, y publicaciones de patente internacional N.º WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955.

Como se enseña en el presente documento, una expresión de genes endógenos de la familia SPARC puede activarse (por ejemplo, aumentarse) insertando un promotor/operador de tetraciclina inducible por tetraciclina para controlar su expresión.

Los métodos descritos anteriormente para transferir polinucleótido en células y para hacer las células recombinantes son simplemente para fines de ilustración y son típicos de aquellos que podrían usarse. Sin embargo, también pueden emplearse otros procedimientos para obtener la expresión de un polipéptido de la familia SPARC en células, como se entiende en la materia.

Terapia del cáncer

El cáncer se trata normalmente por cirugía, quimioterapia o radioterapia. También están siendo desarrolladas terapias biológicas tales como inmunoterapia y terapia génica. Otras terapias incluyen terapia hipertérmica, terapia fotodinámica, etc. (véase la página web del Instituto Nacional del Cáncer en la malla mundial nci.nih.gov).

Quimioterapia

La quimioterapia es el uso de fármacos antineoplásicos (citotóxicos) para destruir células cancerosas. Hay más de 50 fármacos de quimioterapia diferentes y algunos se administran solos, pero frecuentemente pueden combinarse varios fármacos (esto se conoce como quimioterapia de combinación). Una lista de ejemplo de agentes de quimioterapia, como se describe en la malla mundial cancerbacup.org.uk/info/actinomycin.htm, incluye: actinomicina D, adriamicina, altretamina, asparaginasa, bleomicina, busulfan, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, CPT-11, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarubicina, fosfamida, irinotecan, doxorubicina liposomal, lomustina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, procarbazina, esteroides, estreptozocina, taxol, taxotere, taxotere – el ensayo TACT, tamozolomida, tioguanina, tiotepa, tomudex, topotecan, treosulfan, UFT (Uracil-tegufur), vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina.

Debido a que las células cancerosas pueden crecer y dividirse más rápidamente que las células normales, muchos fármacos antineoplásicos están hechos para destruir las células en crecimiento. Pero ciertas células sanas normales también se multiplican rápidamente, y la quimioterapia puede afectar a estas células, también. Este daño a las células normales produce efectos secundarios. Las células normales que crecen rápidamente que van a afectarse lo más probablemente son glóbulos sanguíneos que se forman en la médula ósea y células en el tubo digestivo (boca, estómago, intestinos, esófago), aparato reproductor (órganos sexuales) y folículos pilosos. Algunos fármacos antineoplásicos pueden afectar las células de órganos vitales, tales como el corazón, riñón, vejiga, pulmones y sistema nervioso.

Los tipos de efectos secundarios que tienen y cómo de graves son dependen del tipo y la dosis de quimioterapia que se recibe y cómo reacciona su cuerpo. Los efectos secundarios de la quimioterapia incluyen fatiga, náuseas y vómitos, dolor, pérdida de pelo, anemia, problemas del sistema nervioso central, infección, problemas de la coagulación de la sangre, problemas de la boca, encías y garganta, diarrea, estreñimiento, efectos nerviosos y musculares, efectos sobre la piel y las uñas, efectos de recuerdo de la radiación, riñón y vejiga, síntomas tipo gripe y retención de líquidos.

Radioterapia

Un tipo de radioterapia comúnmente usada implica fotones, “paquetes” de energía. Los rayos X fueron la primera forma de radiación fotónica en usarse para tratar el cáncer. Dependiendo de la cantidad de energía que poseen, los rayos pueden usarse para destruir células cancerosas sobre la superficie de o más profundo en el cuerpo. Cuanto mayor sea la energía del haz de rayos X, más profundos pueden llegar los rayos X en el tejido diana. Los aceleradores lineales y betatrones son máquinas que producen rayos X de energía cada vez mayor. El uso de máquinas para concentrar la radiación (tal como rayos X) sobre un sitio de cáncer se llama radioterapia de haz externo.

Los rayos gamma son otra forma de fotones usada en radioterapia. Los rayos gamma se producen espontáneamente a medida que ciertos elementos (tales como radio, uranio y cobalto 60) liberan radiación a medida que se descomponen, o desintegran. Cada elemento se desintegra a una tasa específica y libera energía en forma de rayos gamma y otras partículas. Los rayos X y los rayos gamma tienen el mismo efecto sobre las células cancerosas.

Otra técnica para administrar radiación a las células cancerosas es poner implantes radiactivos directamente en un tumor o cavidad del cuerpo. Esto se llama radioterapia interna (braquiterapia, irradiación intersticial e irradiación intracavitaria son tipos de radioterapia interna). En este tratamiento, la dosis de radiación se concentra en un área pequeña, y el paciente permanece en el hospital algunos días. La radioterapia interna se usa frecuentemente para cánceres de la lengua, útero y cuello uterino.

Varios nuevos enfoques para la radioterapia están siendo evaluados para determinar su eficacia en el tratamiento de cáncer. Una técnica tal es la irradiación intraoperatoria, en la que una gran dosis de radiación externa se dirige al tumor y tejido de alrededor durante la cirugía.

Otro enfoque en investigación es la radioterapia con haces de partículas. Este tipo de terapia se diferencia de la radioterapia fotónica en que implica el uso de partículas subatómicas de movimiento rápido para tratar cánceres localizados. Se necesita una máquina sofisticada para producir y acelerar las partículas requeridas para este procedimiento. Algunas partículas (neutrones, piones e iones pesados) depositan más energía a lo largo de la trayectoria que toman a través del tejido que los rayos X o rayos gamma, causando así más daño a las células que golpean. Este tipo de radiación se denomina frecuentemente radiación de transferencia lineal de energía alta (LEt alta).

Están siendo estudiados dos tipos de fármacos en fase de investigación para su efecto sobre células que se someten a radiación. Los radiosensibilizadores hacen que las células tumorales sean más probables de ser dañadas, y los radioprotectores protegen los tejidos normales de los efectos de la radiación. La hipertermia, el uso de calor, también está siendo estudiada para su eficacia en sensibilizar tejido a la radiación.

Pueden usarse implantes de semillas radiactivas como la única modalidad de tratamiento para adenocarcinoma de la próstata para pacientes apropiados con enfermedad en estadio temprano. Las dos fuentes más comunes son yodo-125 y paladio-103 sin datos clínicos convincentes de que uno sea superior al otro. El implante de semillas radiactivas puede personalizarse individualmente a la próstata de un paciente para maximizar la dosis a la glándula mientras que se minimiza la dosis a las estructuras normales circundantes. La braquiterapia de la próstata ofrece el mayor nivel de radioterapia conformal para adenocarcinoma de la próstata. El equipo de braquiterapia de la próstata en la Universidad Thomas Jefferson tiene una amplia experiencia en la braquiterapia de la próstata y ha presentado trabajo en foros nacionales e internacionales.

La braquiterapia de la próstata o el implante de semillas radiactivas es un método altamente técnico dependiente del cirujano que administra la energía de radiación colocando muchas semillas radiactivas pequeñas directamente dentro de la próstata, administrando eficazmente el tratamiento “desde adentro hacia afuera”. Esto se hace en el quirófano con anestesia general, como un procedimiento de una vez. Estas semillas pueden administrar altas dosis de radiación directamente al tumor, con poco daño al tejido sano normal de alrededor de la próstata. Esto puede combinarse con radioterapia conformal tridimensional en algunos ámbitos.

Otra investigación de radioterapia reciente se ha centrado en el uso de anticuerpos radiomarcados para administrar dosis de radiación directamente al sitio del cáncer (radioinmunoterapia). Los anticuerpos son proteínas altamente específicas que son producidas por el cuerpo en respuesta a la presencia de antígenos (sustancias reconocidas como extrañas por el sistema inmunitario). Algunas células tumorales contienen antígenos específicos que desencadenan la producción de anticuerpos específicos del tumor. Pueden prepararse grandes cantidades de estos anticuerpos en el laboratorio y unirse a sustancias radiactivas (un proceso conocido como radiomarcado). Una vez inyectados en el cuerpo, los anticuerpos buscan activamente las células cancerosas, que son destruidas por la acción destructora de células (citotóxica) de la radiación. Este enfoque puede minimizar el riesgo de daño por radiación a células sanas. El éxito de esta técnica dependerá de tanto la identificación de sustancias radiactivas apropiadas como la determinación de la dosis segura y eficaz de radiación que puede administrarse de esta forma.

La radioterapia puede usarse sola o en combinación con quimioterapia o cirugía. Al igual que todas las formas de tratamiento del cáncer, la radioterapia puede tener efectos secundarios. Posibles efectos secundarios del tratamiento con radiación incluyen pérdida temporal o permanente de pelo en el área que está tratándose, irritación de la piel, cambio temporal en el color de la piel en el área tratada y cansancio. Otros efectos secundarios son ampliamente dependientes del área del cuerpo que se trata.

Terapia de hipertermia

La hipertermia, un procedimiento en el que tejido del cuerpo se expone a altas temperaturas (hasta 106ºF), está en investigación para evaluar su eficacia en el tratamiento de cáncer. El calor puede ayudar a encoger tumores dañando las células o privándolas de sustancias que necesitan para vivir. La terapia de hipertermia puede ser hipertermia local, regional y del cuerpo entero, usando dispositivos de calentamiento externos e internos. La hipertermia se usa casi siempre con otras formas de terapia (radioterapia, quimioterapia y terapia biológica) para intentar aumentar su eficacia.

Hipertermia local se refiere a calor que se aplica a un área muy pequeña, tal como un tumor. El área puede calentarse externamente con ondas de alta frecuencia que apuntan a un tumor desde un dispositivo fuera del cuerpo. Para lograr el calentamiento interno puede usarse uno de varios tipos de sondas estériles, que incluye hilos calentados finos o tubos huecos llenos de agua caliente; antenas de microondas implantadas; y electrodos de radiofrecuencia.

En la hipotermia regional se calienta un órgano o una extremidad. Imanes y dispositivos que producen alta energía se colocan sobre la región que va a calentarse. En otro enfoque, llamado perfusión, se extrae algo de la sangre del paciente, se calienta y luego se bombea (perfunde) en la región que va a calentarse internamente.

El calentamiento del cuerpo entero se usa para tratar cáncer metastásico que se ha extendido a través de todo el cuerpo. Puede llevarse a cabo usando mantas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductivas (como aquellas en las mantas eléctricas) o cámaras térmicas (similares a grandes estufas de incubación).

La hipertermina no produce ningún aumento sustancial en los efectos secundarios o complicaciones de la radiación. El calor aplicado directamente a la piel, sin embargo, puede producir molestia o incluso dolor local significativo en aproximadamente la mitad de los pacientes tratados. También puede producir ampollas, que generalmente se curan rápidamente. Menos comúnmente, puede producir quemaduras.

Terapia fotodinámica

La terapia fotodinámica (también llamada PDT, fotorradioterapia, fototerapia o fotoquimioterapia) es un tratamiento para algunos tipos de cáncer. Se basa en el descubrimiento de que ciertas sustancias químicas conocidas como agentes fotosensibilizadores pueden destruir organismos unicelulares cuando los organismos se exponen a un tipo particular de luz. La PDT destruye células cancerosas mediante el uso de una luz de láser de frecuencia fija en combinación con un agente fotosensibilizador.

En PDT, el agente fotosensibilizador se inyecta en la circulación sanguínea y es absorbido por células de todo el cuerpo. El agente permanece en las células cancerosas durante un tiempo más largo que en las células normales. Cuando las células cancerosas tratadas se exponen a luz de láser, el agente fotosensibilizador absorbe la luz y produce una forma activa de oxígeno que destruye las células cancerosas tratadas. La exposición a la luz debe cronometrarse cuidadosamente de manera que se produzca cuando la mayoría del agente fotosensibilizador ha dejado las células sanas, pero está todavía presente en las células cancerosas.

La luz de láser usada en PDT puede dirigirse mediante una fibra óptica (una hebra de vidrio muy fina). La fibra óptica se coloca próxima al cáncer para administrar la cantidad apropiada de luz. La fibra óptica puede dirigirse a través de un broncoscopio a los pulmones para el tratamiento de cáncer de pulmón o a través de un endoscopio al esófago para el tratamiento de cáncer de esófago.

Una ventaja de PDT es que produce daño mínimo al tejido sano. Sin embargo, debido a que la luz de láser actualmente en uso no puede pasar a través de más de aproximadamente 3 centímetros de tejido (un poco más de una pulgada y un octavo), la PDT se usa principalmente para tratar tumores sobre o justo debajo de la piel o sobre el revestimiento de órganos internos.

La terapia fotodinámica hace la piel y los ojos sensibles a la luz durante 6 semanas o más después del tratamiento. Los pacientes son informados para evitar la luz solar directa y luz interior brillante durante al menos 6 semanas. Si los pacientes deben salir fuera, necesitan vestir ropa protectora, que incluye gafas de sol. Otros efectos secundarios temporales de la PDT están relacionados con el tratamiento de áreas específicas y pueden incluir tos, problemas para tragar, dolor abdominal y respiración con dolor o disnea.

En diciembre de 1995, la Agencia Estadounidense del Medicamento (FDA) aprobó un agente fotosensibilizador llamado porfímero sódico, o Photofrin®, para aliviar los síntomas del cáncer de esófago que está causando una obstrucción y para cáncer de esófago que no puede tratarse satisfactoriamente con láseres solo. En enero de 1998, la FDA aprobó el porfímero sódico para el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas temprano en pacientes para los que los tratamientos usuales para el cáncer de pulmón no son apropiados. El Instituto Nacional del Cáncer y otras instituciones están respaldando ensayos clínicos (estudios de investigación) para evaluar el uso de terapia fotodinámica para varios tipos de cáncer, que incluyen cánceres de vejiga, cerebro, laringe y cavidad bucal.

Terapia con láser

La terapia con láser implica el uso de luz de alta intensidad para destruir células cancerosas. Esta técnica se usa frecuentemente para aliviar síntomas de cáncer tales como hemorragia u obstrucción, especialmente cuando el cáncer no puede curarse por otros tratamientos. También puede usarse para tratar cáncer por encogimiento o destrucción de tumores.

El término “láser” representa la amplificación de luz por emisión estimulada de radiación. La luz normal, tal como la de una bombilla, tiene muchas longitudes de onda y se extiende en todas las direcciones. La luz de láser, por otra parte, tiene una longitud de onda específica y se concentra en un haz estrecho. Este tipo de luz de alta intensidad contiene mucha energía. Los láseres son muy potentes y pueden usarse para cortar acero o para moldear diamantes. Los láseres también pueden usarse para trabajo quirúrgico muy preciso, tal como reparar una retina dañada en el ojo o cortar tejido (en lugar de un bisturí).

Aunque hay varios tipos diferentes de láseres, solo tres tipos han ganado un amplio uso en medicina:

Láser de dióxido de carbono (CO2) -Este tipo de láser pueden eliminar capas finas de la superficie de la piel sin penetrar en las capas más profundas. Esta técnica es particularmente útil en el tratamiento de tumores que no se han extendido profundos en la piel y ciertas condiciones precancerosas. Como una alternativa a la cirugía con bisturí tradicional, el láser de CO2 también es capaz de cortar la piel. El láser se usa de esta forma para eliminar cánceres de piel.

Láser de neodimio:itrio-aluminio-granate (Nd:YAG) – La luz de este láser puede penetrar más profunda en el tejido que la luz de otros tipos de láseres, y puede hacer que la sangre coagule rápidamente. Puede llevarse a través de fibras ópticas a partes del cuerpo menos accesibles. Este tipo de láser se usa algunas veces para tratar cánceres de garganta.

Láser de argón -Este láser puede pasar a través de solo capas de tejido superficiales y, por tanto, es útil en dermatología y en la cirugía ocular. También se usa con colorantes sensibles a la luz para tratar tumores en un procedimiento conocido como terapia fotodinámica (PDT).

5 Los láseres tienen varias ventajas con respecto a las herramientas quirúrgicas estándar, que incluyen:

Los láseres son más precisos que los bisturís. El tejido cerca de una incisión se protege, ya que hay poco contacto con la piel de alrededor u otro tejido.

10 El calor producido por los láseres esteriliza el sitio de cirugía, reduciendo así el riesgo de infección.

Puede necesitarse menos tiempo de operación debido a que la precisión del láser permite una incisión más pequeña.

15 El tiempo de curación es frecuentemente acortado; ya que el calor del láser sella los vasos sanguíneos, hay menos hemorragia, hinchazón o cicatrización.

La cirugía láser puede ser menos complicada. Por ejemplo, con fibra óptica, la luz de láser puede dirigirse a partes del cuerpo sin hacer una incisión grande.

20 Pueden hacerse más procedimientos ambulatoriamente.

También hay desventajas con la cirugía láser:

25 Relativamente pocos cirujanos están entrenados en el uso del láser.

El equipo de láser es caro y voluminoso en comparación con las herramientas quirúrgicas usuales, tales como bisturís.

30 Deben cumplirse las estrictas precauciones de seguridad en el quirófano (por ejemplo, el equipo quirúrgico y el paciente deben usar protección ocular).

Pueden usarse láseres de dos formas para tratar el cáncer; por encogimiento o destrucción de un tumor con calor, o por activación de un sustancia química – conocida como un agente fotosensibilizador – que destruye células

35 cancerosas. En PDT, un agente fotosensibilizador retienes retenido en las células cancerosas y puede estimularse por luz para producir una reacción que destruye las células cancerosas.

Los láseres de CO2 y ND:YAG se usan para encoger o destruir tumores. Pueden usarse con endoscopios, tubos que permiten que los médicos vean en ciertas áreas del cuerpo, tales como la vejiga. La luz de algunos láseres 40 puede transmitirse a través de un endoscopio flexible provisto de fibra óptica. Esto permite a los médicos ver y trabajar en partes del cuerpo a las que no podrían llegar otro modo, excepto por cirugía y, por tanto, permite dirigir de forma precisa el haz de láser. Los láseres también pueden usarse con microscopios de baja potencia, dando al doctor una visión clara del sitio que está tratándose. Usados con otros instrumentos, los sistemas de láser pueden producir un área de corte tan pequeña como 200 micrómetros de diámetro -inferior a la anchura de una rosca muy

45 fina.

Se usan láseres para tratar muchos tipos de cáncer. La cirugía con láser es tratamiento estándar para ciertos estadios de cáncer de glotis (cuerda vocal), de cuello uterino, piel, pulmón, vaginal, vulvar y de pene.

50 Además de su uso para destruir el cáncer, también se usa cirugía con láser para ayudar a aliviar síntomas producidos por el cáncer (cuidado paliativo). Por ejemplo, pueden usarse láseres para encoger o destruir un tumor que está bloqueando la tráquea de un paciente, haciéndole más fácil respirar. También se usa algunas veces para paliar cáncer colorrectal y anal.

55 La termoterapia intersticial inducida por láser (LITT) es uno de los desarrollos más recientes en la terapia con láser. LITT usa la misma idea que un tratamiento para el cáncer llamado hipertermia; ese calor puede ayudar a encoger tumores dañando células o privándolas de sustancias que necesitan para vivir. En este tratamiento, los láseres se dirigen a áreas intersticiales (áreas entre órganos) en el cuerpo. La luz de láser eleva entonces la temperatura del tumor, que daña o destruye las células cancerosas.

60 Terapia génica

La terapia génica es una intervención médica experimental que implica modificar el material genético de células vivas para combatir la enfermedad. La terapia génica está siendo estudiada en ensayos clínicos (estudios de

65 investigación con seres humanos) para muchos tipos diferentes de cáncer y para otras enfermedades.

Uno de los objetivos de la terapia génica es suministrar a las células copias sanas de genes ausentes o alterados. En lugar de dar a un paciente un fármaco, los médicos intentan corregir el problema alterando la constitución genética de algunas células del paciente. Ejemplos de enfermedades que podrían tratarse de esta forma incluyen fibrosis quística y hemofilia.

La terapia génica también está siendo estudiada como una forma para cambiar cómo funciona una célula; por ejemplo, estimulando células del sistema inmunitario para atacar a las células cancerosas.

En general, se administra un gen a la célula usando un “vector.” Los tipos más comunes de vectores usados en terapia génica son virus. Los virus usados como vectores en terapia génica están genéticamente incapacitados; son incapaces de reproducirse solos. La mayoría de los ensayos clínicos de terapia génica se basan en retrovirus de ratón para administrar el gen deseado. Otros virus usados como vectores incluyen adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus y el virus del herpes.

Un terapia génica puede hacerse tanto ex vivo como in vivo. En la mayoría de los ensayos clínicos de terapia génica ex vivo, se extraen células de la sangre o médula ósea del paciente y se cultivan en el laboratorio. Las células se exponen al virus que está llevando el gen deseado. El virus entra en las células, y el gen deseado se vuelve parte del ADN de las células. Las células se cultivan en el laboratorio y a continuación se devuelven al paciente mediante inyección en una vena. En terapia génica in vivo, los vectores o liposomas se usan para administrar el gen deseado a células dentro del cuerpo del paciente.

Inmunoterapia

El cáncer puede desarrollarse cuando el sistema inmunitario colapsa o no está funcionando adecuadamente. La inmunoterapia usa el sistema inmunitario del cuerpo, tanto directamente como indirectamente, para combatir el cáncer o para reducir los efectos secundarios que pueden producirse por algunos tratamientos para el cáncer. La inmunoterapia se diseña para reparar, estimular o potenciar las respuestas del sistema inmunitario.

Los citoblastos inmunitarios incluyen los siguientes: Los linfocitos son un tipo de glóbulos blancos encontrados en la sangre y muchas otras partes del cuerpo. Los tipos de linfocitos incluyen linfocitos B, linfocitos T y linfocitos citolíticos espontáneos. Las células B (linfocitos B) maduran en células plasmáticas que secretan anticuerpos (inmunoglobulinas), las proteínas que reconocen y se unen a sustancias extrañas conocidas como antígenos. Cada tipo de linfocito B hace un anticuerpo específico, que reconoce un antígeno específico. Las células T (linfocitos T) se unen directamente a células infectadas, extrañas o cancerosas. Los linfocitos T también regulan la respuesta inmunitaria por señalización de otros defensores del sistema inmunitario. Los linfocitos T funcionan principalmente produciendo proteínas llamadas linfocinas. Los linfocitos citolíticos espontáneos (células NK) producen poderosas sustancias químicas que se unen a y destruyen cualquier invasor extraño. Atacan sin tener primero que reconocer un antígeno específico. Los monocitos son glóbulos blancos que pueden tragar y digerir organismos microscópicos y partículas en un proceso conocido como fagocitosis. Los monocitos también pueden desplazarse en el tejido y convertirse en macrófagos.

Las células en el sistema inmunitario secretan dos tipos de proteínas: anticuerpos y citocinas. Los anticuerpos responden a los antígenos acoplándose, o uniéndose a, los antígenos. Los anticuerpos específicos se emparejan con los antígenos específicos, ajustándose juntos de la forma en la que una llave entra en una cerradura. Las citocinas son sustancias producidas por algunos citoblastos inmunitarios para comunicarse con otras células. Los tipos de citocinas incluyen linfocinas, interferones, interleucinas y factores estimulantes de colonias. Las citocinas citotóxicas son liberadas por un tipo de linfocito T llamado un linfocitos T citotóxico. Estas citocinas atacan células cancerosas directamente.

Los agentes inmunomoduladores no específicos son sustancias que estimulan o aumentan indirectamente el sistema inmunitario. Frecuentemente, estos agentes se dirigen a citoblastos inmunitarios clave y producen respuestas secundarias tales como la elevada producción de citocinas e inmunoglobulinas. Dos agentes inmunomoduladores no específicos usados en el tratamiento del cáncer son bacillus de Calmette-Guerin (BCG) y levamisol. BCG, que se ha usado ampliamente como vacuna contra la tuberculosis, se usa en el tratamiento de cáncer de vejiga superficial tras la cirugía. El BCG puede funcionar estimulando una respuesta inflamatoria, y posiblemente una inmunitaria. Se instila una disolución de BCG en la vejiga y permanece allí durante aproximadamente 2 horas antes de que se deje que el paciente vacíe la vejiga orinando. Este tratamiento se realiza normalmente una vez a la semana durante 6 semanas. El levamisol se usa junto con quimioterapia de fluorouracilo (5-FU) en el tratamiento de cáncer de colon de estadio III (C de Dukes) tras cirugía. El levamisol puede actuar restaurando la función inmunitaria baja.

Algunos anticuerpos, citocinas y otras sustancias del sistema inmunitario pueden producirse en el laboratorio para su uso en el tratamiento del cáncer. Estas sustancias se llaman frecuentemente modificadores de la respuesta biológica (BRM). Alteran la interacción entre las defensas inmunitarias del cuerpo y células cancerosas para reforzar, dirigir o restaurar la capacidad del cuerpo para combatir la enfermedad. Los BRM incluyen interferones, interleucinas, factores estimulantes de colonias, anticuerpos monoclonales y vacunas. La inmunoterapia puede usarse para

detener, controlar o suprimir los procesos que permiten el crecimiento del cáncer; hacer células cancerosas más reconocibles y, por tanto, más susceptibles, a la destrucción por el sistema inmunitario; reforzar la potencia de destrucción de los citoblastos inmunitarios, tales como linfocitos T, células NK y macrófagos; alterar los patrones de crecimiento de las células cancerosas para promover el comportamiento como el de células cancerosas; bloquear o invertir el proceso que cambia una célula normal o una célula precancerosa en una célula cancerosa; potenciar la capacidad del cuerpo para reparar o sustituir células normales dañadas o destruidas por otras formas de tratamiento del cáncer, tales como quimioterapia o radiación; y prevenir que células cancerosas se diseminen a otras partes del cuerpo.

Algunos BRM son una parte estándar del tratamiento para ciertos tipos de cáncer, mientras que otros están siendo estudiados en ensayos clínicos. Los BRM están siendo usados solos o en combinación entre sí. También están siendo usados con otros tratamientos, tales como radioterapia y quimioterapia.

Los interferones (IFN) son tipos de citocinas que se producen naturalmente en el cuerpo. Fueron las primeras citocinas producidas en el laboratorio para su uso como BRM. Hay tres tipos principales de interferones -interferón alfa, interferón beta e interferón gamma; el interferón alfa es el tipo más ampliamente usado en el tratamiento del cáncer. Los interferones pueden mejorar la forma en la que el sistema inmunitario de un paciente con cáncer actúa contra células cancerosas. Además, los interferones pueden actuar directamente sobre células cancerosas ralentizando su crecimiento o promoviendo su desarrollo en células con comportamiento más normal. Algunos interferones también pueden estimular células NK, linfocitos T y macrófagos, reforzando la función anticancerígena del sistema inmunitario. La Agencia Estadounidense del Medicamento (FDA) ha autorizado el uso de interferón alfa para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, que incluyen leucemia de células pilosas, melanoma, leucemia mieloide crónica y sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA. Los estudios han mostrado que el interferón alfa también puede ser eficaz en el tratamiento de otros cánceres tales como cáncer de riñón metastásico y linfoma no Hodgkin.

Al igual que los interferones, las interleucinas (IL) son citocinas que se producen naturalmente en el cuerpo y pueden prepararse en el laboratorio. Se han identificado muchas interleucinas; la interleucina-2 (IL-2 o aldesleucina) ha sido la más ampliamente estudiada en el tratamiento del cáncer. La IL-2 estimula el crecimiento y la actividad de muchas células inmunitarias, tales como linfocitos, que pueden destruir células cancerosas. La FDA ha autorizado IL-2 para el tratamiento de cáncer de riñón metastásico y melanoma metastásico.

Los factores estimulantes de colonias (CSF) (algunas veces llamados factores de crecimiento hematopoyéticos) normalmente no afectan directamente las células tumorales; más bien, estimulan a los citoblastos de la médula ósea para dividirse y desarrollarse en glóbulos blancos, plaquetas y glóbulos rojos. La médula ósea es crítica para el sistema inmunitario del cuerpo debido a que es la fuente de todos los glóbulos sanguíneos. La estimulación de CSF del sistema inmunitario puede beneficiar a pacientes que reciben tratamiento del cáncer. Debido a que los fármacos antineoplásicos pueden dañar la capacidad del cuerpo para producir glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas, los pacientes que reciben fármacos antineoplásicos tienen un elevado riesgo de desarrollar infecciones, volviéndose anémicos, y sangrando más fácilmente. Usando CSF para estimular la producción de células sanguíneas, los médicos pueden aumentar las dosis de fármacos antineoplásicos sin aumentar el riesgo de infección o la necesidad de transfusión con hemoderivados. Los CSF son particularmente útiles cuando se combinan con quimioterapia de dosis alta. Algunos ejemplos de CSF y su uso en la terapia del cáncer son los siguientes: G-CSF (filgrastim) y GM-CSF (sargramostim) pueden aumentar el número de glóbulos blancos, reduciendo así el riesgo de infección en pacientes que reciben quimioterapia. G-CSF y GM-CSF también pueden estimular la producción de citoblastos en la preparación para trasplante de citoblastos o de médula ósea; la eritropoyetina puede aumentar el número de glóbulos rojos y reducir la necesidad de transfusiones de glóbulos rojos en pacientes que reciben quimioterapia; y oprelvekin puede reducir la necesidad de transfusiones de plaquetas en pacientes que reciben quimioterapia.

Los CSF se usan en ensayos clínicos para tratar algunos tipos de leucemia, cáncer colorrectal metastásico, melanoma, cáncer de pulmón y otros tipos de cáncer.

También están siendo evaluados anticuerpos monoclonales (mAb) en la terapia del cáncer. Estos anticuerpos son producidos por un único tipo de célula y son específicos para un antígeno particular. Están siendo creados mAb específicos parar los antígenos encontrados sobre la superficie de la célula cancerosa que está tratándose.

Los mAb se preparan inyectando células cancerosas humanas en ratones de manera que sus sistemas inmunitarios produzcan anticuerpos contra estas células cancerosas. Las células de ratón que producen los anticuerpos se extraen entonces y se fusionan con células cultivadas en laboratorio para crear células “híbridas” llamadas hibridomas. Los hibridomas pueden producir indefinidamente grandes cantidades de estos anticuerpos puros, o mAb. Los mAb pueden usarse en el tratamiento del cáncer en varias formas: los mAb que reaccionan con tipos específicos de cáncer pueden potenciar la respuesta inmunitaria de un paciente al cáncer. Los mAb pueden programarse para actuar contra factores de crecimiento celular, interfiriendo así con el crecimiento de células cancerosas. Los mAb pueden ligarse a fármacos antineoplásicos, radioisótopos (sustancias radiactivas), otros BRM, u otras toxinas. Si los anticuerpos se acoplan sobre células cancerosas, administran estos venenos directamente al tumor, ayudando a destruirlo. Los mAb pueden ayudar a destruir células cancerosas en la médula ósea que se han

extraído de un paciente en preparación para un trasplante de médula ósea. Los mAb que llevan radioisótopos también pueden demostrar ser útiles en el diagnóstico de ciertos cánceres, tales como colorrectal, ovario y próstata.

Rituxan® (rituximab) y Herceptin® (trastuzumab) son ejemplos de anticuerpos monoclonales que han sido autorizados por la FDA. Rituxan se usa para el tratamiento de linfoma no Hodgkin de linfocitos B que ha regresado después de un periodo de mejora o no ha respondido a quimioterapia. Herceptin se usa para tratar cáncer de mama metastásico en pacientes con tumores que producen cantidades en exceso de una proteína llamada HER-2 (aproximadamente el 25 por ciento de los tumores de cáncer de mama producen cantidades en exceso de HER-2). Los mAb han empezado a probarse en ensayos clínicos para tratar linfomas, leucemias, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumores cerebrales, cáncer de próstata, y otros tipos de cáncer.

Las vacunas para el cáncer son otra forma de inmunoterapia actualmente en estudio. Las vacunas para enfermedades infecciosas, tales como sarampión, paperas y tétanos, son eficaces debido a que exponen las células inmunitarias del cuerpo a formas debilitadas de antígenos que están presentes sobre la superficie del agente infeccioso. Esta exposición hace que las células inmunitarias produzcan más células plasmáticas, que producen anticuerpos. Los linfocitos T que reconocen el agente infeccioso también se multiplican. Estos linfocitos T activados recuerdan después la exposición. La próxima vez que el agente entre en el cuerpo, las células en el sistema inmunitario ya están preparadas para responder y detener la infección.

Para el tratamiento del cáncer, los investigadores están desarrollando vacunas que pueden alentar al sistema inmunitario del paciente para reconocer células cancerosas. Estas vacunas pueden ayudar al cuerpo a rechazar tumores y prevenir la recidiva del cáncer. A diferencia de las vacunas contra enfermedades infecciosas, las vacunas contra el cáncer se diseñan para inyectarse después de diagnosticarse la enfermedad, en vez de antes de desarrollarse. Las vacunas para el cáncer administradas cuando el tumor es pequeño pueden ser capaces de erradicar el cáncer. Los ensayos clínicos de vacunas para el cáncer temprano (estudios de investigación con personas) implicaron principalmente a pacientes con melanoma. Actualmente, las vacunas para el cáncer también están siendo evaluadas en el tratamiento de muchos otros tipos de cáncer, que incluyen linfomas y cánceres de riñón, mama, ovario, próstata, colon y recto. Los investigadores también están investigando formas de que puedan usarse vacunas para el cáncer en combinación con otros BRM.

Al igual que otras formas del tratamiento del cáncer, las terapias biológicas pueden producir varios efectos secundarios, que pueden variar ampliamente de paciente a paciente. Puede desarrollarse erupción o hinchazón en el sitio en el que se inyectan los BRM. Varios BRM, que incluyen interferones e interleucinas, pueden producir síntomas tipo gripe que incluyen fiebre, escalofríos, náuseas, vómitos y pérdida de apetito. La fatiga es otro efecto secundario común de BRM. También puede afectarse la tensión arterial. Los efectos secundarios de IL-2 pueden frecuentemente ser graves, dependiendo de la dosificación administrada. Los pacientes necesitan ser estrechamente monitorizados durante el tratamiento. Efectos secundarios de CSF pueden incluir dolor de huesos, fatiga, fiebre y pérdida de apetito. Los efectos secundarios de los mAb varían, y pueden producirse reacciones alérgicas graves. Las vacunas para el cáncer pueden producir dolores musculares y fiebre.

Composiciones sensibilizadoras y métodos -Dosificación, modo de administración y formulaciones farmacéuticas

La presente invención proporciona el uso de una composición que comprende un polipéptido SPARC que comprende SEC ID Nº 1 y un agente terapéutico. El polipéptido o polinucleótido SPARC se proporciona como una cantidad terapéuticamente eficaz de manera que sensibilice una célula cancerosa o paciente al tratamiento por dicho agente terapéutico.

El agente terapéutico puede ser cualquier agente adecuado para una terapia específica como se describe en el presente documento y como se conoce en la técnica. Puede ser un agente de quimioterapia, es decir, un fármaco, por ejemplo, 5-fluorouracilo; puede ser un agente de radiación, tal como un anticuerpo radiomarcado, un radiosensibilizador, o un implante de semillas radiactivas. El agente terapéutico también puede ser un agente fotosensibilizador, tal como porfímero sódico; o un agente de terapia génica (por ejemplo, un vector), o puede ser un agente de inmunoterapia, tal como una célula inmunitaria, un anticuerpo, o citocina.

La presente invención proporciona el uso de una composición que comprende un polipéptido SPARC que comprende SEC ID Nº 1 y una célula resistente a quimioterapia.

Una célula recombinante que comprende una región de control de la transcripción heteróloga operativamente asociada a un polinucleótido de la familia SPARC.

Además de sensibilizar una muestra o un mamífero a terapia del cáncer, el uso del polipéptido SPARC de la presente invención puede reducir la dosificación de una terapia, reduciendo, por tanto, los efectos secundarios producidos por la terapia del cáncer.

Las composiciones anteriores pueden ser una composición farmacéutica que incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, un “vehículo” se refiere a cualquier sustancia adecuada como vehículo para administrar una APC a un sitio de acción adecuado in vitro o in vivo. Como tales, los vehículos pueden actuar como excipiente para la formulación de un reactivo terapéutico o experimental que contiene una APC. Vehículo preferidos son capaces de mantener una APC en una forma que es capaz de interaccionar con un linfocito T. Ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a agua, solución salina tamponada con fosfato, solución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, disoluciones que contienen suero, disolución de Hank y otras disoluciones acuosas fisiológicamente equilibradas o medio de cultivo celular. Los vehículos acuosos también pueden contener sustancias auxiliares adecuadas requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas del receptor, por ejemplo, mejora de la estabilidad química e isotonicidad. Sustancias auxiliares adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, y otras sustancias usadas para producir tampón fosfato, tampón Tris y tampón bicarbonato.

Una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC y un agente terapéutico puede usarse para sensibilizar un cáncer in vitro poniendo directamente en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz del polipéptido de la familia SPARC purificado. Un mamífero (por ejemplo, un paciente con cáncer) puede administrarse con una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC para lograr el efecto sensibilizador in vivo. Además, puede obtenerse una muestra de cáncer, tanto células como tejido, del mamífero y sensibilizarse usando el polipéptido de la familia SPARC ex vivo antes devolverse de nuevo al mamífero.

Un polinucleótido de la familia SPARC puede introducirse en una célula cancerosa in vitro para sensibilizar la respuesta de la célula cancerosa, o puede administrarse a un mamífero in vivo mediante un vector apropiado como se conoce en la técnica y como se describe en el presente documento anteriormente. Además, el polinucleótido puede introducirse ex vivo en células cancerosas o tejido obtenido de un mamífero en necesidad, y devolverse entonces las células o tejido al mamífero en necesidad. Siendo una proteína secretada, un polipéptido de la familia SPARC producido por tales células introducidas ex vivo puede funcionar en el entorno local para sensibilizar no solo a las células modificadas, sino también a las células cancerosas no modificadas vecinas.

Una composición que comprende una célula recombinante puede introducirse en un mamífero para tratamiento sensibilizador.

El tamaño de dosis del sujeto, número de dosis, frecuencia de administración de dosis y modo de administración pueden determinarse y optimizarse usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hardman et al., Ceds 1995, Goodman & Gitman's The Pharmacological-Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill).

Las dosificaciones de cada terapia en el tratamiento de diversos pacientes con cáncer se conocen en la técnica y pueden determinarse por un médico experto. Por ejemplo, una dosis de polipéptido SPARC adecuada puede estar en el intervalo de 0,01 a 100 mg de polipéptido SPARC por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferentemente en el intervalo de 0,2 a 10 mg por kilogramo de peso corporal por día. Un polinucleótido SPARC de la presente invención puede administrarse a una dosis adecuada en el intervalo de 0,01 a 100 mg de polinucleótido por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferentemente en el intervalo de 0,2 a 10 mg por kilogramo de peso corporal por día. Las células que comprenden un polinucleótido SPARC recombinante pueden administrarse a una dosificación en el intervalo de 104-1010 por kilogramo de peso corporal del receptor, preferentemente en el intervalo de 106-108 por kilogramo de peso corporal del receptor. La dosis deseada se presenta preferentemente una vez al día, pero puede dosificarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas a intervalos apropiados durante todo el día. Estas sub-dosis pueden administrarse en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, que contienen 10 a 1500 mg, preferentemente 20 a 1000 mg, y lo más preferentemente 50 a 700 mg del polipéptido de la familia SPARC por forma de dosificación unitaria. Las dosificaciones del polipéptido de la familia SPARC o el polinucleótido de la familia SPARC, o las células que comprenden un polinucleótido de la familia SPARC recombinante útiles según la invención, variarán dependiendo de la afección que va a tratarse o prevenirse y de la identidad del polipéptido de la familia SPARC o polinucleótido que se use. Estimaciones de dosificaciones eficaces y semividas in vivo para la composición individual englobadas por la invención pueden prepararse basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal, tal como el modelo de ratón descrito en el presente documento o una adaptación de tal método a mamíferos más grandes.

Aplicaciones in vitro / ex vivo

Las composiciones proporcionadas por la presente invención pueden usarse para sensibilizar una célula cancerosa in vitro usando métodos conocidos en la técnica, y como se describen en el presente documento antes. Así, un método de sensibilización de una célula cancerosa a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método poner en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC. También se desvela un método para sensibilizar ex vivo un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método: (1) Obtener una muestra de cáncer del mamífero; (2) poner en contacto la muestra de cáncer con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC; y (3) devolver la muestra de cáncer después de la puesta en contacto de (2) con el mamífero.

Terapia génica ex vivo se refiere al aislamiento de células de un animal, la administración de un polinucleótido en las células, in vitro, y entonces el regreso de las células modificadas de nuevo al animal. Esto puede implicar la extirpación quirúrgica de tejido/órganos de un animal o el cultivo de células primarias y tejidos. Anderson et al., patente de EE.UU. N.º 5.399.346 desvelan métodos terapéuticos ex vivo. Este método es aplicable debido a que un polipéptido de la familia SPARC es un polipéptido secretado. El regreso de las células modificadas de nuevo a un mamífero puede aumentar la concentración extracelular de un polipéptido de la familia SPARC localmente y, por tanto, sensibilizar las células cancerosas no modificadas que están en proximidad de las células modificadas.

Cuando necesita tomarse la muestra de tejido de un mamífero para la aplicación ex vivo, pueden prepararse extractos celulares a partir de biopsias de tejido de pacientes que incluyen, pero no se limitan a, cerebro, corazón, pulmón, ganglios linfáticos, ojos, articulaciones, piel y neoplasias asociadas a estos órganos. “Biopsia de tejido” también engloba la recogida de fluidos biológicos que incluyen, pero no se limitan a, muestras de sangre, plasma, esputo, orina, líquido cefalorraquídeo, lavados y leucoforesis. En una realización preferida, se toman “biopsias de tejido” según la invención de tumores de mama, ovario o próstata. Se obtienen “biopsias de tejido” usando técnicas muy conocidas en la técnica que incluyen aspiración con aguja y biopsia en sacabocados de la piel.

Generalmente, cuando un polinucleótido se introduce en células en cultivo (por ejemplo, por una de las técnicas de transfección descritas anteriormente), solo una pequeña fracción de células (aproximadamente 1 de las 105) integra normalmente el polinucleótido transfectado en sus genomas (es decir, el polinucleótido se mantiene en la célula episomalmente). Así, con el fin de identificar células que han captado polinucleótido exógeno, es ventajoso transfectar polinucleótido que codifica un marcador de selección en la célula junto con el (los) polinucleótido(s) de interés, es decir, un polinucleótido de la familia SPARC, como se describe en el presente documento antes.

Aplicaciones in vivo

Las composiciones desveladas en el presente documento pueden administrarse a un mamífero, por ejemplo, en un método de sensibilización de un tratamiento terapéutico. Así, se desvela un método para sensibilizar in vivo un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico, comprendiendo el método administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido de la familia SPARC o un polinucleótido que codifica un polipéptido de la familia SPARC.

El modo de administración de la composición puede depender del fin particular para la administración, la salud general y afección del paciente y el criterio del médico o técnico que administra el vehículo diana. La composición puede administrarse a un animal usando una variedad de métodos. Tales métodos de administración pueden incluir administración parenteral, tópica, oral o local, tal como intradérmicamente. Una composición puede administrarse en una variedad de formas de dosificación unitaria que dependen del método de administración. Métodos de administración preferidos para una composición de la presente invención incluyen administración intravenosa, administración local (por ejemplo, intra-tumoral) por, por ejemplo, inyección, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inhalación. Para modos de administración particulares, una composición para su uso en la presente invención puede formularse en un excipiente de la presente invención. Una composición para su uso en la presente invención puede administrarse a mamíferos, y más preferentemente a seres humanos.

Inyección: Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede provocarse por diversos agentes antifúngicos antibacterianos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que dan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Administración por vía oral: Las composiciones farmacéuticas para administración por vía oral se formulan usando vehículos farmacéuticamente aceptables muy conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración por vía oral. Tales vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, suspensiones y similares, para ingestión por el paciente.

Preparaciones farmacéuticas para uso oral se obtienen mediante una combinación de compuestos activos con excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Excipientes adecuados son cargas de hidrato de carbono o proteína tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata, u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas que incluyen arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Se proporcionan núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar con recubrimientos adecuados tales como disoluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse tintas o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimido recubierto de azúcar para la identificación de productos o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, dosificación.

Preparaciones farmacéuticas que se usan por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, además de cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un recubrimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con una carga o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.

Administración nasal: Para administración nasal, penetrantes apropiados para la barrera particular que va a permearse se usan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Uso subcutáneo e intravenoso: Para uso subcutáneo e intravenoso, la composición de la invención generalmente se proporcionará en disoluciones o suspensiones acuosas estériles, tamponadas a un pH e isotonicidad apropiados. Vehículos acuosos adecuados incluyen disolución de Ringer y cloruro sódico isotónico. Las suspensiones acuosas según la invención pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona y goma tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo.

El polipéptido SPARC útil según la invención también puede presentarse como formulaciones en liposoma.

La terapia génica usando las composiciones proporcionadas por la presente invención puede llevarse a cabo según métodos generalmente aceptados, por ejemplo, como se describe por Friedman en “Therapy for Genetic Disease”,

T. Friedman, ed., Oxford University Press (1991), pp. 105-121.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de un modo conocido en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de comprimidos recubiertos de azúcar, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Después de prepararse las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico de la invención formulado en un vehículo aceptable, se colocan en un recipiente apropiado y etiquetan para el tratamiento de una afección indicada con información que incluye cantidad, frecuencia y método de administración.

La dosificación exacta se elige por el médico individual en vista del paciente que va a tratarse. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad (por ejemplo, localización de la enfermedad, edad, peso y sexo del paciente, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación (combinaciones) de fármacos, sensibilidades a reacciones y tolerancia/respuesta a terapia). Composiciones farmacéuticas de acción prolongada podrían administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y tasa de eliminación de la formulación particular. Orientación general en cuanto a las dosificaciones particulares y métodos de administración para otras aplicaciones se proporcionan en la bibliografía (véanse las patentes de EE.UU. N.º 4.657.760; 5.206.344; y 5.225.212, incorporadas en el presente documento por referencia). Aquellos expertos en la materia normalmente emplearán formulaciones diferentes para oligonucleótidos y vectores de terapia génica que para proteínas o sus inhibidores. Similarmente, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células particulares, condiciones, localizaciones y similares.

La composición para su uso en la presente invención puede formularse como se describe en la patente de EE.UU. N.º 6187330 que proporciona una composición para la liberación controlada de un péptido o proteína que comprende un polímero bioerosionable biocompatible que tiene dispersado en su interior una fase de matriz vítrea que comprende el péptido o proteína y un termoprotector, teniendo dicha fase de matriz vítrea una temperatura de transición vítrea por encima del punto de fusión del polímero. Como el fármaco de péptido o proteína es estable dentro de la composición, puede formarse convenientemente, en su estado fundido, en dispositivos adecuadamente conformados que van a usarse como implantes de administración de fármaco, por ejemplo, en forma de varillas, películas, perlas u otras formas deseadas.

Determinación de la resistencia o sensibilidad a un tratamiento terapéutico

La determinación de una muestra de cáncer (por ejemplo, células o tejido) que responde a un tratamiento terapéutico puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, por una prueba de resistencia a fármaco en cultivo celular (CCDRT). La CCDRT se refiere a probar una muestra de cáncer (por ejemplo, tomada de un paciente mamífero) en el laboratorio a fármacos que pueden usarse para tratar el cáncer del paciente. La prueba puede identificar a qué fármacos la muestra de cáncer es sensible y a qué fármacos es resistente, que indica qué fármacos son más probablemente de funcionar y que fármacos son menos probables de funcionar en el paciente. La sensibilidad de la muestra de cáncer (por tanto, el paciente) puede sensibilizarse mediante el uso del polipéptido SPARC como se desvela en el presente documento. La CCDRT puede realizarse de nuevo con el tratamiento sensibilizador y determinar si una composición sensibilizadora proporcionada por la presente invención puede sensibilizar la respuesta de la muestra de cáncer a un tratamiento específico o no. Puede decirse que una composición sensibiliza al tratamiento terapéutico si la respuesta como se mide por CCDRT aumenta al menos el 20 %, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 % 80 %, 100 % (2 veces), o 3 veces, 4 veces, 5 veces, o más cuando se compara con la respuesta en ausencia de la composición sensibilizadora.

Las CCDRT normalmente incluyen los ensayos de proliferación celular y los ensayos de muerte celular.

El ensayo de proliferación celular mide la proliferación de células. Puede hacerse por el ensayo de incorporación de timidina radiactiva originalmente descrito por Tanigawa y Kern (arriba). En este ensayo, aplicado solo a tumores sólidos y no a neoplasias hematológicas, células tumorales suspensas en agarosa blanda se cultivan durante 4 -6 días en presencia continua de fármacos antineoplásicos. Al final del periodo de cultivo, la timidina radiactiva se introduce y las diferencias en la supuesta incorporación de timidina en ADN se comparan entre cultivos de control y tratados con fármaco. Kern y Weisenthal analizaron los datos de correlación clínica y definieron el concepto de “resistencia extrema al fármaco”, o EDR [Kern DH, Weisenthal LM. J Natl Cancer Inst 1990; 82: 582-588]. Esto se definió como un resultado de ensayo que era una desviación estándar más resistente que la mediana del resultado para ensayos de bases de datos de comparación. Los pacientes tratados con agentes individuales que muestran EDR en el ensayo prácticamente nunca disfrutaron de una respuesta parcial o completa. Kern y Weisenthal también definieron “resistencia baja al fármaco” (LDR) como un resultado menos resistente que la mediana y “resistencia intermedia al fármaco” (IDR) como un resultado más resistente que la mediana, pero menos resistente que EDR (en otras palabras, entre la mediana y una desviación estándar más resistente que la mediana).

Los principios y datos de correlación clínica con el ensayo de “EDR” de timidina se revisaron en 1992 (Weisenthal LM, Kern DH. Oncology (U S A) 1992; 5: 93-103]. Solo se han publicado algunos estudios de seguimiento desde esta vez. Un estudio tal mostró que EDR a uno o más de los agentes individuales usados en una combinación de dos fármacos no está evidentemente asociada a una menor probabilidad de respuesta a la combinación de dos fármacos en el entorno de quimioterapia intraperitoneal de cánceres de apéndice y de colon (Fernandez-Trigo V, Shamsa F, Vidal-Jove J, Kern DH, Sugarbaker PH. Am J Clin Oncol 1995; 18: 454-460). Es, sin embargo, posible que la respuesta a las altas concentraciones de fármaco alcanzables con quimioterapia intraperitoneal pueda estar más estrechamente asociada a la penetración de fármaco al tumor que a resistencia intrínseca al fármaco de las células tumorales. También se mostró que la EDR a paclitaxel no parece ser un factor pronóstico en pacientes con cáncer de ovario o en pacientes con carcinoma peritoneal primario tratado con paclitaxel más platino (Eltabbakh GH, Piver MS, Hempling RE, et al. Gynecol Oncol 1998; 70: 392-397; Eltabbakh GH. J Surg Oncol 2000; 73: 148-152). Sin embargo, se informó recientemente que la EDR al platino en cáncer de ovario puede tener implicaciones pronósticas (Fruehauf, J., et al. Proc ASCO, v.20; Abs 2529, 2001). También se informó que los pacientes con cáncer de mama sin tratar previamente con tumores que muestran LDR (definido anteriormente) tuvieron tiempos superiores hasta la progresión y supervivencias globales que los pacientes con tumores que muestran tanto IDR como EDR (Mehta, R.S., et al, Breast Cancer Res Treat 66:225-37, 2001).

El ensayo de “EDR” de timidina tiene una especificidad muy alta (>98 %) para la identificación de agentes individuales inactivos, pero una sensibilidad baja (< 40 %). En otras palabras, se predice que un fármaco con “EDR” definida en el ensayo es casi seguro tan inactivo como un agente individual (alta especificidad por identificar fármacos inactivos), pero muchos fármacos sin “EDR” también serán inactivos (baja sensibilidad por identificar fármacos inactivos).

Una segunda forma de ensayo de proliferación celular es el sistema en cultivo celular de tumor adhesivo, basado en comparar el crecimiento en monocapa de células sobre una “matriz adhesiva de células” patentada (Ajani JA, Baker FL, Spitzer G, et al. J Clin Oncol 1987). También se describieron correlaciones clínicas positivas en esta publicación. Como se enseña en el presente documento, los ensayos de formación de colonias se usan para medir la proliferación celular. En esta prueba, las células se cultivan in vitro en agar blando (medio de cultivo de tejido que contiene agar como gelificante; también denominado agar semi-sólido) u otro medio altamente viscoso, que contiene, por ejemplo, metilcelulosa, gel de plasma o coágulos de fibrina. Estos medios semi-sólidos reducen el movimiento de células y permiten que las células individuales se desarrollen en clones de células que se identifican como colonias individuales. Estos ensayos también se denominan generalmente ensayos clonogénicos. Los ensayos de formación de colonias son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, véase Rizzino, A Soft agar growth assays for transforming growth factors and mitogenic peptides. Methods in Enzymology 146: 341-53 (1987) y, en algunas realizaciones, la apoptosis se mide por un ensayo de marcado de extremos cortados por dUTP mediado por desoxinucleótido transferasa terminal (TUNEL) que es muy conocido en la técnica y Materiales y Métodos disponibles como material en línea de apoyo en Science Online.

A diferencia de medir la proliferación celular, hay una familia de ensayos estrechamente relacionada basada en el concepto de destrucción de células totales, o, en otras palabras, muerte celular que se produce en la población de células tumorales (Weisenthal LM, Shoemaker RH, Marsden JA, Dill PL, Baker JA, Moran EM. Recent Results Cancer Res 1984; 94: 161-173; Weisenthal LM, Lippman ME. Cancer Treat Rep 1985; 69: 615-632; Weisenthal LM. Cell culture assays for hematologic neoplasms based on the concept of total tumor cell kill. En: Kaspers GJL, Pieters R, Twentyman PR, Weisenthal LM, Veerman AJP, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, PA: Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432; Weisenthal LM. Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90). Los conceptos subyacentes a los ensayos de muerte celular son relativamente simples, aún cuando las características técnicas e interpretación de datos puedan ser muy complejas.

Los conceptos de tecnología básica son directos. Por ejemplo, se obtiene un espécimen fresco de una neoplasia viable. El espécimen es casi siempre un espécimen quirúrgico de un tumor sólido viable. Menos frecuentemente, es un espécimen de efusión maligna, médula ósea o sangre periférica que contiene células de “tumor” (una palabra usada para describir células de tanto una neoplasia sólida como hematológica). Estas células se aíslan y a continuación se cultivan en presencia o ausencia continua de fármacos, casi siempre durante 3 a 7 días. Al final del periodo de cultivo, se hace una medición de la lesión de células, que se correlaciona directamente con la muerte celular. Hay evidencia de que la mayoría de los fármacos antineoplásicos disponibles pueden funcionar mediante un mecanismo de causar daño suficiente para desencadenar la llamada muerte celular programada, o apoptosis (Hickman JA. Cancer Metastasis Rev 1992; 11: 121-139; Zunino F, Perego P, Pilotti S, Pratesi G, Supino R, Arcamone F. Pharmacol Ther 1997; 76: 177-185).

Aunque hay métodos para medir específicamente la apoptosis que puede aplicarse a células cultivadas, hay dificultades prácticas en aplicar estos métodos a poblaciones mixtas (y grumosas) de células tumorales y células normales. Así, se han aplicado mediciones más generales de muerte celular. Éstas incluyen: (1) pérdida retardada de la integridad de la membrana celular (que se ha encontrado que es un sustituto útil para la apoptosis), como se mide por tinción diferencial en el método de ensayo DISC, que permite efectos selectivos del fármaco contra células tumorales que van a reconocerse en una población mixta de células tumorales y normales (Weisenthal LM, Kern DH. Oncology (USA) 1992; 5: 93-103; Weisenthal LM, Marsden JA, Dill PL, Macaluso CK. Cancer Res 1983; 43: 749757), (2) pérdida de actividad del ciclo de Krebs mitocondrial, como se mide en el ensayo MTT (Carmichael J, DeGraffWG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Cancer Res 1987; 47: 936-942), (3) pérdida de ATP celular, como se mide en el ensayo de ATP (Kangas L, Gronroos M, Nieminen AL. Med Biol 1984; 62: 338-343;Garewal HS, Ahmann FR, Schifman RB, Celniker A. J Natl Cancer Inst 1986; 77: 1039-1045; Sevin B-U, Peng ZL, Perras JP, Ganjei P, Penalver M, Averette HE. Gynecol Oncol1988; 31: 191-204), y (4) pérdida de la actividad de esterasa de la membrana celular e integridad de la membrana celular, como se mide por el ensayo de diacetato de fluoresceína (Rotman B, Teplitz C, Dickinson K, Cozzolino JP. In vitro Cell Dev Biol1988; 24: 1137-1138; Larsson R, Nygren P, Ekberg M, Slater L. Leukemia 1990; 4: 567-571; Nygren P, Kristensen J, Jonsson B, et al. Leukemia 1992; 6: 11211128).

Como se desvela en el presente documento, la apoptosis se mide por un ensayo de marcado de extremos cortados por dUTP mediado por desoxinucleótido transferasa terminal (TUNEL) que es muy conocido en la técnica y, por ejemplo, como se describe en Materiales y Métodos disponible como material en línea de apoyo en Science Online.

Además, la sensibilidad o resistencia de un animal a un tratamiento puede determinarse directamente midiendo el tamaño del tumor antes y después del tratamiento y/o durante un periodo de tiempo de tratamiento. Si el tamaño del tumor disminuye el 50 %, preferentemente el 75 %, más preferentemente el 85 %, lo más preferentemente el 100 %, con un tratamiento, entonces se dice que el animal es sensible (no resistente) al tratamiento. De otro modo, el animal se considera que es resistente al tratamiento. Si el tamaño del tumor se reduce al menos el 25 %, preferentemente el 50 %, más preferentemente el 75 %, lo más preferentemente el 100 %, después de administrar una composición sensibilizadora del tratamiento de la presente invención en comparación con el tumor después del tratamiento, pero en ausencia de una composición de la presente invención, entonces se dice que la composición es eficaz en sensibilizar al tratamiento en el animal. En ser humano, el tamaño del tumor puede compararse sobre una

ventana de periodo de tratamiento de 6 meses, en otros animales, esta ventana varía, por ejemplo, puede usarse una ventana de 4-6 semanas para ratón. Se entiende que la ventana de tiempo actual para comparar el tamaño del tumor puede determinarse según el conocimiento en la materia y el tumor particular que va a tratarse. Además, se desvela si una célula es resistente a un tratamiento también puede determinarse midiendo la expresión de un polipéptido o polinucleótido de la familia SPARC como se describe en el presente documento antes. Así, un método de evaluación de una primera muestra de cáncer para su resistencia a un tratamiento terapéutico, que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular de un polipéptido de la familia SPARC en la primera muestra de cáncer; (b) medir el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en una segunda muestra de cáncer que no presenta resistencia al tratamiento terapéutico; (c) comparar los niveles de expresión o los niveles extracelulares obtenidos en (a) y (b), en el que un menor nivel de expresión o nivel extracelular en (a) es indicativo de que la primera muestra de cáncer es resistente al tratamiento terapéutico.

Además, se desvela un método de identificación de un agente que modula una expresión de ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o una secreción de polipéptido de la familia SPARC, que comprende: (a) medir el nivel de expresión del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en una muestra; (b) poner en contacto un agente candidato con la muestra; (c) después de la puesta en contacto de (b), medir la expresión o nivel extracelular del ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o nivel extracelular del polipéptido de la familia SPARC en la muestra de (b); (d) comparar los niveles de expresión o los niveles extracelulares en (a) y (c), en el que un nivel diferencial de expresión o nivel extracelular en (a) y (c) indica que el agente candidato es un agente que modula la expresión de ARNm o polipéptido de la familia SPARC, o la secreción de polipéptido de la familia SPARC.

Pueden medirse niveles de expresión de un polipéptido SPARC o un polinucleótido y los niveles de secreción de un polipéptido SPARC como se describe en el presente documento antes y por cualquier método conocido en la técnica.

Un agente, que potencia la expresión o secreción de un miembro de la familia SPARC, puede él mismo usarse como agente sensibilizador de la terapia como se describe en la presente invención. El agente puede ser una molécula química, o una biológica (por ejemplo, una proteína, o un polinucleótido, etc.)

Modelos animales

Los efectos terapéuticos de las composiciones proporcionadas pueden probarse en diversos modelos animales. Esto puede hacerse in vitro, ex vivo, o in vivo como se describe en el presente documento antes.

Modelos de ratón para trastornos proliferativos se conocen en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos de ratón de Jackson Laboratory en la malla mundial www.jax.org y el catálogo de The Jackson Laboratory -Jax-Mice -Junio de 2001-Mayo de 2003, o Jackson-Grusby L. 2002, Oncogene. 12;21(35):5504-14; Ghebranious N, Donehower LA., 1998, Oncogene. 24;17(25):3385-400; Palapattu GS, Bao S, Kumar TR, Matzuk MM. 1998, Cancer Detect Prev. 22(1):75-86). Por ejemplo, los modelos de ratón de tumor incluyen aquellos usados para el estudio de leucemia mielógena crónica (CML), defectos en las moléculas de adhesión celular, genes que regulan el crecimiento y proliferación, factores de crecimiento/receptores/citocinas, elevada incidencia tumoral, oncogenes, toxicología y genes supresores de tumor.

Ejemplos

La invención se basa en la observación de que se encontró que SPARC se expresa significativamente por disminución en células resistentes a quimioterapia, que el polipéptido SPARC sensibiliza células resistentes a terapia del cáncer al tratamiento del cáncer, que SPARC que codifica ADN sensibiliza células a terapia del cáncer, y que los animales injertados con células transfectantes de SPARC muestran una espectacular reducción en el crecimiento tumoral en comparación con animales injertados con un control.

Ejemplo 1. Materiales and métodos

Cultivo celular -La línea de células colorrectales MIP-101 se mantuvo en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen), 1 % de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) a 37 ºC y 5 % de CO2. Se desarrollaron células MIP101 resistentes siguiendo incubación a largo plazo con concentraciones incrementales de 5-fluorouracilo (5-FU), irinotecan (CPT-11), cisplatino (CIS) y etopósido (ETO). Células MIP101 estables transducidas con SPARC (MIP/SP) se mantuvieron en DMEM complementado con 10 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina y 0,1 % de zeocina a 37 ºC y 5 % de CO2.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa analítica -Se extrajo ARN total de células cultivadas (2 x 106 células, 75 % de confluencia) usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se realizó RT-PCR usando un kit comercialmente disponible (BD Biosciences) siguiendo el protocolo del fabricante usando 1 ug de ARN total. Cebadores específicos usados para amplificar SPARC: 5'CGA AGA GGA GGT GGT

GGC GGA AA-3' (sentido) (SEC ID Nº 78) y 5'GGT TGT TGT CCT CAT CCC TCT CAT AC-3' (antisentido) (SEC ID Nº 79). GAPDH: 5'-CTC TCT GCT CCT CCT GTT CGA CAG-3' (sentido) (SEC ID Nº 80) y 5'-AGG GGT CTT ACT CCT TGG AGG CCA-3' (antisentido) (SEC ID Nº 81) se usaron como control interno y para normalizar los niveles de expresión génica. Se usaron los siguientes parámetros para la reacción: 50 ºC x 1 h, seguido de 37 ciclos de 94 ºC x 1 min, 65 ºC x 1 min, 72 ºC x 2 min, seguido de 72 ºC x 10 min e incubación a 4 ºC. Los productos de PCR se separaron sobre 1 % de gel de agarosa en tampón TAE (teñido con bromuro de etidio 0,5 ug/ml) por electroforesis durante 1 h a 100 V y posteriormente se fotografiaron.

Cuantificación de la apoptosis – Para el ensayo TUNEL, las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos a 250.000 células/placa durante la noche antes de cualquier estudio de inducción 24 horas después. Para la evaluación de la apoptosis tras SPARC exógena (Haematologic Technologies Inc), las células se incubaron con SPARC 5 µg/ml durante 24 h, seguido de una exposición de 12 h a 5-FU 1000 µM. A continuación, las células se procesaron para marcar por el kit de detección de la apoptosis (Promega) según las instrucciones del fabricante. Para la cuantificación de la apoptosis, las células se sembraron a 250.000 células/placa en placas de 6 pocillos durante la noche, seguido de incubación de 12 h con los siguientes agentes de quimioterapia: 5-FU 1000 µM, CPT-11 200 µM, cisplatino 100 µM y etopósido 10 µM. Las células se recogieron usando un medio de disociación de células no enzimático (Sigma), se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y posteriormente se tiñeron con anexina V y yoduro de propidio usando un kit de detección de la apoptosis (R & D Research) según el protocolo del fabricante. La proporción de células marcada con anexina V y yoduro de propidio se analizó por el analizador de citometría de flujo XL. Los datos se recogieron de 100.000 eventos.

Transfección y selección de clon -Se clonó el ADNc de SPARC en el vector de expresión pcDNA3.1. Las transfecciones se realizaron con 2,0 µg de la construcción de gen/vector de expresión usando el método de polietilenimina de Boussiff et al. (1995) con modificaciones menores (Tai et al., 2002). Después de la transfección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se mantuvieron en medio de cultivo durante 24 horas, seguido de un cambio a un medio de selección apropiado que contenía 1 % de zeocina. Las células se seleccionaron basándose en resistencia a zeocina y colonias y clones individuales de estas colonias se propagaron entonces para verificación adicional. Se cribaron clones establemente transducidos (MIP/SP) para la expresión de ARNm de SPARC por análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se seleccionaron los clones MIP/SP con la mayor expresión de ARNm de SPARC (por RT-PCR) y proteína (por transferencia Western) para estudios in vitro e in vivo posteriores. Las líneas celulares de control usadas para este estudio incluyeron células MIP101 establemente transducidas con vector de pcDNA3.1 vacío solo (MIP/Zeo) y se seleccionaron basándose en la resistencia a zeocina.

Análisis de transferencia Western -Se extrajo proteína total de líneas celulares cultivadas en placas de 10 cm usando tampón de lisis CHAPS. Se sometieron 10-30 ug de proteína total a electroforesis usando SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de PVDF. Después de bloquear con 5 % de disolución de leche desnatada, las membranas se incubaron con anticuerpo anti-SPARC (1:1000, Haematologic Technologies Inc) durante la noche a 4 ºC. La membrana se incubó posteriormente con anticuerpo secundario de conejo anti-ratón conjugado con HRP (1:2000) durante 1 h a temperatura ambiente y se detectó por el kit de quimioluminiscencia Extendi-Dura (Pierce). La misma membrana se separó usando el tampón Western Blot Restore Stripping (Pierce) y posteriormente volvió a sondarse para tubulina con un anticuerpo de ratón primario anti-tubulina (Sigma) y anticuerpo secundario de conejo anti-ratón conjugado con HRP (1:2000) como control interno.

Inmunohistoquímica -Secciones de parafina de cánceres colorrectales humanos o epitelio colónico normal fueron amablemente proporcionadas por Dr. Maximo Loda (Dana Farber Cancer Institute, Boston). Antes de la tinción, las secciones se lavaron con 0,1 % de solución salina tamponada Tris (TBS) que contenía 0,1 % de Triton X-100 (Sigma), se trataron con 1 % de H2O2 durante 30 min, se lavaron en TBS/0,1 % de Triton durante 30 min (x 3) a temperatura ambiente, se bloquearon con 3 % de BSA en TBS/0,1 % de Triton durante 1 h. Las secciones se incubaron entonces con anticuerpo anti-SPARC de ratón (1:50) durante la noche a 4 ºC (Haematologic Technologies Inc.), se lavaron varias veces con TBS/Triton y se contratiñeron con disolución de complejo de avidina-biotinaperoxidasa (ABC) (kits ABC de Vecstain, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) durante 1 h, seguido de incubación en disolución DAB. Las secciones se montaron usando Permount.

Ensayo de formación de colonias – Para los estudios de supervivencia celular clonogénicos, células parentales MIP101 y células MIP/SP se sembraron a 1.000 células/placa en placas de 48 pocillos y se incubaron con concentraciones crecientes de 5-FU (0, 10 µM, 100 µM, 1000 µM), CPT-11 (0,1 µM, 10 µM, 100 µM) o etopósido (0, 10 µM, 100 µM, 1000 µM) durante 4 días. A continuación, las células se lavaron con PBS y se incubaron en medio fresco que contenía las concentraciones apropiadas de quimioterapia durante 7 días adicionales. Cada pocillo se tiñó con cristal violeta y se contaron las colonias con más de 50 células. El número de colonias formado en el grupo tratado se calculó basándose en las colonias formadas a partir de las células sin tratar de control.

Sobrenadante que contiene SPARC concentrado [SPARC(s)] -Se sembraron células MIP/SP a 1 x 106 células en matraces de 100 cm en DMEM (10 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina, 0,1 % de zeocina) durante 24 h. Las células se lavaron posteriormente con PBS dos veces y se incubaron en medio VP-SFM libre de suero complementado con glutamina 4 mM (Invitrogen) durante 72 h. Este medio se concentró de 500 ml a 2 ml usando

unidades de filtro Centricon (Millipore) a 4 ºC. Todos los medios recogidos y procesados por este método se usaron para estudios en animales posteriores.

Estudios en animales -Se usaron modelos animales de xenoinjerto tumoral para evaluar el efecto de SPARC sobre la progresión del tumor in vivo. Ratones NIH sin pelo (6 semanas de edad, Taconic Laboratories) se injertaron tras la inyección subcutánea de 2 x 106 células en el flanco izquierdo. Las pautas de tratamiento se iniciaron una vez el tamaño del tumor promedio fue 50-75 mm3 de tamaño. Las mediciones de tumor se realizaron usando un compás calibrador manual (Fisher) dos veces a la semana y simultáneamente se hicieron mediciones de peso hasta la completitud del estudio. Se proporcionó quimioterapia usando un pauta de ciclos de 3 semanas durante un total de 6 ciclos: inyecciones intraperitoneales de 5-FU 25 mg/kg o CPT-11 25 mg/kg tres veces en la semana 1 de cada ciclo, seguido de 2 semanas de periodos libres de tratamiento. El programa de dosificación para SPARC(s) fue 100 µl de SPARC(s) tres veces por semana hasta la completitud del ciclo de quimioterapia.

Ejemplo 2. Expresión de SPARC en células resistentes a quimioterapia

Se usaron dos clones resistentes a quimioterapia (MIP-5FUR y MIP-ETOR), como se soporta por el ensayo de formación de colonias (Fig. 3) y ensayo TUNEL (Fig. 4), para la detección de SPARC en células resistentes a quimioterapia. El análisis de micromatrices identifica varios genes expresados por disminución en las células resistentes, que incluyen SPARC.

La expresión por disminución al nivel de expresión génica también se tradujo en menores niveles de niveles de proteína SPARC en las líneas celulares resistentes a quimioterapia (Fig. 5A). Esta característica no fue única para las líneas celulares resistentes desarrolladas únicamente para los fines del presente estudio, ya que otra línea celular de sarcoma uterino bien establecida, MES-SA, también mostró disminución de la expresión de SPARC cuando es resistente a un agente quimioterapéutico diferente, doxorubicina (Fig. 5B). Además, en muestras patológicas humanas normales, la expresión de proteínas SPARC parece ser la mayor en los vellos, con un gradiente decreciente hacia criptas colónicas. Esta expresión variable se pierde en tumor maligno, con una disminución general en la expresión de SPARC en adenocarcinoma colorrectal de diversas etapas.

La Figura 19 muestra niveles de ARNm y de proteína SPARC humana en líneas celulares de cáncer colorrectal sensibles y resistentes a quimioterapia. (A) El diagrama de análisis de agrupaciones de micromatrices de oligonucleótidos (panel izquierdo) revela que la expresión del gen SPARC es significativamente menor en líneas celulares resistentes a quimioterapia, que se confirmó por RT-PCR semi-cuantitativa (panel derecho). (B) La detección de niveles de expresión de SPARC en una línea celular de sarcoma uterino emparejada sensible a quimioterapia (MES-SA) y resistente a doxorubicina (MES-SA/DX5) muestra una disminución similar en la expresión en la línea celular resistente. En líneas celulares de cáncer de mama, MDA435 tuvo niveles ligeramente mayores de expresión de SPARC que MCF-7. Se detectaron bajos niveles de expresión en la línea de células de cáncer pancreático (CRL 1420), línea de células de cáncer de pulmón (JMN 1B), líneas de cáncer colorrectal (RKO, CCL 227, HT 29). Se detectaron altos niveles de expresión de SPARC en la línea celular de colon normal (CRL 1541) y una línea de células de cáncer de colon (HCT 116). (C) La expresión de proteínas SPARC verifica que hay una disminución significativa en esta proteína en los clones resistentes a MIP101 (líneas celulares resistentes: MIP/5FU, MIP/CPT, MIP/ETO, MIPT/CIS) en comparación con la línea celular parental normal (carril 5, MIP101). Similarmente, otro conjunto de líneas de células resistentes de origen de sarcoma uterino (MES-SA/DX5, sarcoma uterino resistente a doxorubicina) muestra disminución de la expresión de SPARC en comparación con las líneas celulares sensibles parentales (MES-SA, sarcoma uterino parental).

La Figura 20 muestra la expresión de proteínas SPARC en epitelio colónico humano. (A) El colon normal muestra un patrón diferencial de expresión de proteínas SPARC con mayores niveles de la proteína dentro de las células superficiales proximales de la luz y un gradiente de expresión decreciente hacia las criptas. Los niveles de proteína SPARC en (B) adenocarcinoma del colon, (C) adenocarcinoma mucinoso y (D) adenocarcinoma del colon metastásico al hígado muestran bajo nivel de proteína SPARC difusamente dentro del epitelio maligno. Secciones 6 µm de secciones transversales, aumento x20.

Ejemplo 3. El polipéptido SPARC sensibiliza células resistentes al tratamiento con 5-FU

Con el fin de delinear adicionalmente esta posible función, los presentes inventores evaluaron la respuesta de las células MIP101 resistentes (Fig 6) a SPARC exógena en invertir el fenotipo resistente. Como se indica por experimentos iniciales, células MIP101 resistentes a 5-FU (MIP-5FUR) no pudieron ser activadas para experimentar apoptosis con 5-FU a una concentración de 500 uM, mientras que un número significativo de células de la línea celular sensible parental experimentaron apoptosis tras la exposición a una concentración similar de 5-FU. Se observó un hallazgo significativo con la exposición exógena de células resistentes a SPARC: la incubación de los clones resistentes con SPARC durante un periodo de 24 h, seguido de una exposición de 12 h a un agente quimioterapéutico, fue suficiente en invertir el fenotipo resistente, ya que las células apoptósicas fueron una vez más detectadas por ensayo TUNEL en células expuestas a concentraciones de quimioterapia que no estimularon previamente muerte celular. La incubación con SPARC exógena sola sin posterior exposición a quimioterapia no indujo apoptosis ni en las células MIP 101 parentales ni en las resistentes.

La Figura 21 muestra la evaluación del efecto de SPARC en influir en la sensibilidad de células a quimioterapia. (A) Efecto de la exposición de células MIP/5FU a SPARC exógena en combinación con 5-FU in vitro. La evaluación de la apoptosis por ensayo TUNEL muestra células positivamente teñidas en células MIP101 sensibles expuestas a 5-FU 1000 uM (a, tinción TUNEL; b, tinción DAPI), pero carecen de apoptosis en el fenotipo resistente (c, tinción TUNEL; d, tinción DAPI) tras la exposición a una concentración similar de 5-FU. Sin embargo, tras una exposición de 24 h a SPARC (5 ug/ml), las células resistentes a 5-FU se volvieron una vez más sensibles a 5-FU 1000 uM como se muestra por las células teñidas positivas para TUNEL (e; f, tinción DAPI), que indica la presencia de células apoptósicas. Esta es la primera indicación de que la exposición exógena a SPARC invierte el fenotipo resistente de las células resistentes a 5-FU y sugiriendo así que SPARC puede funcionar como sensibilizador a la quimioterapia.

(B) Líneas celulares MIP101 establemente transducidas que expresan en exceso SPARC (MIP/SP) y control (MIP/Zeo) expuestas a concentraciones crecientes de quimioterapia (5-FU, CPT-11 y etopósido) mostraron menos colonias de células de células MIP/SP cuando se expusieron a menores concentraciones de fármaco que células MIP/Zeo, indicando así elevada sensibilidad de los clones que expresan en exceso SPARC a quimioterapia, ya que menos células sobrevivieron a concentraciones de quimioterapia relativamente menores. (B) Mayor número de MIP101 que expresan en exceso SPARC (MIP/SP) experimentan apoptosis tras una exposición de 12 h a diversos agentes quimioterapéuticos (ETO=etopósido, CIS=cisplatino, 5-FU=5-fluorouracilo, CPT=CPT-11) en comparación con células de control (MIP/Zeo) (p<0,05). El análisis de apoptosis tras el marcado con anexina V por citometría de flujo representa resultados de tres estudios independientes realizados por triplicado. Los resultados del ensayo clonogénico (B) es un experimento representativo que se repitió tres veces con resultados similares.

Ejemplo 4. El polinucleótido SPARC sensibiliza células recombinantes a diversos tratamientos de quimioterapia

Con el fin de probar esta hipótesis, células MIP101 se transfectaron con SPARC para los fines de generación de sistemas de expresión en exceso para estudios adicionales in vitro. Se usaron dos clones que expresan en exceso SPARC (clones 4, 5; Fig. 7) para estudios posteriores.

La sensibilidad de los transfectantes de SPARC a diversos agentes quimioterapéuticos se evaluó por ensayo de formación de colonias, que mostró que los clones que expresan en exceso SPARC fueron incapaces de formar colonias tumorigénicas a mayores concentraciones de quimioterapia cuando se comparó con las líneas celulares parentales. Similarmente, el análisis de FACS de poblaciones de células inducido para experimentar apoptosis tras la exposición a agentes quimioterapéuticos mostró un desplazamiento espectacular hacia la apoptosis temprana en transfectantes de SPARC (Fig. 8D) tras una exposición de 12 h a quimioterapia. Una población más pequeña de células de la línea celular parental experimentó apoptosis tras la inducción con quimioterapia sola (Fig. 8C). En general, pareció haber al menos un aumento de 2 veces en la población de células que expresan en exceso SPARC que experimentan apoptosis en comparación con la línea celular MIP101 parental tras la exposición a diversos agentes quimioterapéuticos (Fig. 9). La Figura 10 muestra la respuesta de transfectantes de SPARC a agentes de quimioterapia.

Ejemplo 5. La sensibilización de SPARC se observa in vivo

El aumento de la sensibilidad a la quimioterapia in vitro se tradujo al sistema de modelo in vivo, dos de cuatro animales que muestran regresión tumoral completa en animales trasplantados con transfectantes de SPARC tras 6 ciclos de quimioterapia (Fig. 11). Los restantes animales injertados con transfectantes de SPARC tuvieron una reducción espectacular en la tasa de crecimiento tumoral en comparación con animales injertados con MIP101 parental. Todos los animales de control (xenoinjertos de MIP10 tratados con quimioterapia) tuvieron tumores >400 mm 2 50 días después del inicio del tratamiento quimioterapéutico, mientras que los animales injertados con transfectante de SPARC que no experimentaron regresión tumoral completa tuvieron tumores que permanecieron <300 mm2 140 días después del inicio de la quimioterapia (resultado no mostrado).

Ejemplo 6: Método de cribado para un agente que modula una expresión de polipéptidos SPARC

El cribado de un modulador de la expresión de polipéptidos SPARC puede realizarse como un cribado simple basándose en células de mamífero. Se preincuba una línea celular de cultivo de tejido de mamífero, por ejemplo, células Hela primero con moléculas pequeñas candidatas aleatorias. A continuación, los clones de células se criban usando transferencias Western anti-SPARC o ELISA. Alternativamente, se lleva a cabo una reacción de RT-PCR para examinar la modulación en la expresión de ARNm de SPARC.

Ejemplo 7: Terapia de modelo animal adicional

Se llevaron a cabo diversas terapias de modelo animal y los resultados se muestran en las Figuras 14-.

En la Figura 14, animales de xenoinjerto con tumores injertados con tanto MIP101 como MIP/SP tratados con diferentes agentes quimioterapéuticos (5-FU o CPT-11) muestran una tasa más rápida de regresión de xenoinjertos de tumor de tumor de MIP/SP en comparación con xenoinjertos de tumor de la línea celular MIP101 (MIP) parental. Dos de cuatro animales que llevan xenoinjertos MIP/SP tuvieron regresión del tumor completa, mientras que los dos restantes tuvieron una tasa mucho más lenta de crecimiento tumoral en comparación con los animales de control

que llevan MIP101 expuesto a pauta de tratamiento similar. Animales representativos con xenoinjertos de tumor de MIP-SPARC tratados con 2 ciclos de 5-FU tuvieron remisión completa 23 días después del trasplante o tumores significativamente más pequeños tras solo 2 ciclos de CPT-11 en comparación con un animal trasplantado con un xenoinjerto de MIP101 parental.

5 En la Figura 15, más animales con xenoinjertos de células MIP/SP mostraron evidencia de regresión del tumor completa más temprana en el periodo de tratamiento post-radiación que los animales con xenoinjertos de células MIP/Zeo de control. 15 semanas después de la radioterapia, ninguno de los animales de xenoinjerto MIP/SP tuvo evidencia de tumor, mientras que el 30 % de los xenoinjertos MIP/Zeo continuaron albergando tumores (n=10

10 animales/grupo; dosis de radiación total: 100 Gy).

En la Figura 16, el tratamiento de combinación con SPARC(s) (IP, intraperitoneal) y 5-FU produjo regresión del tumor que fue significativamente superior al tratamiento con 5-FU solo 51 días después del inicio del tratamiento. (B) Este tratamiento de combinación de SPARC(s) (IP) y 5-FU produjo regresión del tumor completa en varios animales

15 84 días después del tratamiento, mientras que esto no se observó en animales tratados con 5-FU solo (media ± EE, n=6 animales/grupo).

En la Figura 17, el tratamiento de combinación con SPARC(s) (SC, subcutánea) y 5-FU produjo regresión del tumor que fue significativamente superior al tratamiento con 5-FU solo durante todo el periodo de tratamiento. Este

20 tratamiento de combinación de SPARC(s) (SC) y 5-FU produjo regresión del tumor completa en varios animales 42 días después del tratamiento, mientras que esto no se observó en animales tratados con 5-FU solo (media + EE, n=6 animales/grupo).

En la Figura 18, los animales injertados con células resistentes a MIP/5FU se trataron con tanto 5FU solo como la

25 combinación SPARC(s) y 5-FU mostró que el rápido crecimiento tumoral continuó en animales tratados con 5-FU solo, mientras que se observó una espectacular regresión del tumor en animales tratados con la terapia de combinación empezando 28 días después del tratamiento. Varios animales que recibieron terapia de combinación de SPARC(s) y 5FU mostraron regresión de tumor completa 117 días después del tratamiento (media + EE, n=6 animales/grupo).

30 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Dana Farber Cancer Center

35 <120> Sensibilizador de terapia del cáncer

<130> 7032/2078

<140> PCT/US 99/999999 40 <141>

<150> US 60/440.009

<151>

45 <160> 81

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 50 <211> 303

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 55

<210> 2

<211> 2133

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 302

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

<210> 4

<211> 2079

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6 5 <211> 265

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 10

<210> 7 5 <211> 14468

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7 10

<210> 8

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 3021

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 359

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 1080

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 4651

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 359

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14 <210> 15

<211> 5522

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400>

16 10

<210> 17

<211> 2797

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 17

<210> 18

<211> 650

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

<210> 19

<211> 2734

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 19

<210> 20

<211> 355

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 1542

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 664

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 2808

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

24 10

<210> 25

<211> 2645

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 664

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 2808

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

<212> PRT

<213> Coturnix coturnix

<400>

28 10

<210> 29

<211> 676

<212> PRT

<213> Coturnix coturnix

<400> 29

<210> 30

<211> 2678

<212> ADN

<213> Coturnix coturnix

<400> 30

<210> 31

<211> 306

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 31

<210> 32

<211> 3610

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

33 10

<210> 34

<211> 3484

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>

35 10

<210> 36

<211> 3669

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 263

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400>

38 10

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>

39 10

<210> 40

<211> 2678

<212> ADN

<213> Coturnix coturnix

<400> 40

<210> 41

<211> 2808

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41 <210> 42

<211> 4804

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 1370

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 43

<210> 44

<211> 303

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44 <210> 45

<211> 439

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 664

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 306

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 47

<210> 48

<211> 676

<212> PRT

<213> Coturnix coturnix

<400> 48

<212> PRT

<213> Desconocido

<220> 10 <223> Dominio conservado

<220> <221> DOMINIO

<222> (1)..(4)

<223> Dominio conservado. X en la posición 2 puede ser cualquier aminoácido.

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 49

<210> 50

<211> 12

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado. en 4-6 es cualquiera de a, t, g y c.

<400> 50 cgcnnnaagc gc 12

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(6)

<223> Dominio conservado

<400> 51

<210> 52

<211> 18

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<400> 52 cccctgggcc tgtgggcc 18

<210> 53

<211> 6

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(6)

<223> Dominio conservado

<400> 53

<210> 54

<211> 18

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<400> 54 tacgaggtgg acggctgg 18

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(7)

<223> Dominio conservado

<400> 55

<210> 56

<211> 21

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<400> 56 gtggacgtgg ccgacggctg g 21

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(7)

<223> Dominio conservado

<400> 57

<210> 58

<211> 21

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 58 gtggaccaga tggacggctg g 21

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia conservada

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(6)

<223> Dominio conservado

<400> 59

<210> 60

<211> 18

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 60 ctggaggtgg acggctgg 18

<210> 61

<211> 6

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(6)

<223> Dominio conservado

<400> 61

<210> 62

<211> 18

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 62 gtgcaggtgg acggctgg 18

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(7)

<223> Dominio conservado

<400> 63

<210> 64

<211> 21

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 64 gtggaccagg tggacggctg g 21

<210> 65

<211> 4

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(4)

<223> Dominio conservado. X en las posiciones 2-3 puede ser cualquier aminoácido.

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 65

<210> 66

<211> 12

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado. n en las posiciones 4-9 puede ser cualquiera de a, t, g y c.

<400> 66 gacnnnnnng ac 12

<210> 67

<211> 4'

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado.

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(4)

<223> Dominio conservado.

<400> 67

<210> 68

<211> 12

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado. 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 68 cgcggcctga cc 12

<210> 69 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado.

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(17) 25 <223> Dominio conservado.

<400> 69 <220>

<210> 70 <211> 51 <212> ADN <213> Desconocido

35

<220> <223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 70 aacttcgacc tgctgaagct ggccggcgac gtggagagca accccggccc c

51

45

<210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Desconocido

<220> <223> Dominio conservado

55

<220> <221> DOMINIO <222> (1)..(4) <223> Dominio conservado. X en las posiciones 2 y 4 puede ser cualquier aminoácido.

<220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 71

<210> 72

<211> 12

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado. n en las posiciones 4-6, 10-12 puede ser cualquiera de a, t, g y c.

<400> 72 gccnnngccn nn 12

<210> 73

<211> 3

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Dominio conservado.

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(3)

<223> Dominio conservado.

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(9)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<400> 74 ctgaccaag 9

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia conservada

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(9)

<223> Dominio conservado.

<400> 75

<210> 76

<211> 27 15 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> Secuencia de nucleótido para dominio conservado. 25

<400> 76 ggcggcttcc tgcgcaaggt gggccag 27

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> Desconocido

<220> 35 <223> Dominio conservado

<220>

<221> DOMINIO

<222> (1)..(17)

<223> Dominio conservado.

<400> 77

45

<210> 78 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador sintético

55

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Cebador sintético

<400> 78 cgaagaggag gtggtggcgg aaa

23

<210> 79 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> Cebador sintético

<400> 79 ggttgttgtc ctcatccctc tcatac

26

<210> 80 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Cebador sintético

<400> 80 ctctctgctc ctcctgttcg acag

24

<210> 81 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> Cebador sintético

<400> 81 aggggtctta ctccttggag gcca

24

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   El uso de un polipéptido SPARC en la preparación de un medicamento para aumentar la sensibilidad o reducir la resistencia de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico para cáncer, en el que dicho mamífero presenta resistencia a dicho tratamiento terapéutico, en el que el polipéptido SPARC comprende SEC ID Nº: 1, en el que SEC ID Nº 1 es la siguiente secuencia de aminoácidos: Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn Met Tyr He Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp He Asp Lys Asp Leu Val Ile.

2. 2.

   El uso de la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento terapéutico es quimioterapia.

3. 3.

   El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el cáncer es cáncer colorrectal.

4. 4.

   El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el agente quimioterapéutico es fluorouracilo.

5. 5.

   Un polipéptido de la familia SPARC con la secuencia de SEC ID Nº: 1 para su uso para aumentar la sensibilidad o reducir la resistencia de un mamífero al que se le ha diagnosticado cáncer a un tratamiento terapéutico para el cáncer, en el que dicho mamífero presenta resistencia a dicho tratamiento terapéutico, en el que SEC ID Nº 1 es la siguiente secuencia de aminoácidos: Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr He Gly Pro Cys Lys Tyr He Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys Leu Arg Val Lys Lys He His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr He Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile.

6. 6.

   Un polipéptido de la familia SPARC para su uso según la reivindicación 5, en el que dicho tratamiento terapéutico es quimioterapia.

7. 7.

   Un polipéptido de la familia SPARC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que el cáncer es cáncer colorrectal.

8. 8.

   Un polipéptido de la familia SPARC para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que el agente de quimioterapia es fluorouracilo.