DE3851153T2

DE3851153T2 - Genetische modifizierung von endothelialen zellen.

Info

Publication number: DE3851153T2
Application number: DE3851153T
Authority: DE
Inventors: Richard Mulligan; James Wilson
Original assignee: Howard Hughes Medical Institute; Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Howard Hughes Medical Institute; Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-12-08
Publication date: 1995-01-05
Anticipated expiration: 2008-12-09
Also published as: EP0391960A1; ATE110108T1; DE3851153D1; HK1008400A1; WO1989005345A1; EP0391960B1; CA1340427C; JPH03505036A; JP2914692B2

Description

Hintergrund

Das Endothel ist eine einzelne Schicht von flachen transparenten Zellen, die an ihren Rändern miteinander verbunden sind, so daß sie eine Membran aus Zellen ausbilden. Endothelzellen entstehen während der Entwicklung aus dem embryonalen Mesoblast oder Mesoderm. Sie kommen auf den freien Oberflächen von serösen Membranen, in der vorderen Kammer des Auges und auf der Oberfläche des Gehirns und des Rückenmarks vor. Außerdem bilden sie die Membran aus, die das Herz, die Blutgefäße und die Lymphgefäße bedeckt. Durch Verwendung von Methoden, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, ist es möglich, genetische Rekombination zwischen den Spezies zu erhalten. Gene, die von unterschiedlichen biologischen Klassen abstammen, können in einem ausgewählten Mikroorganismus replizieren und exprimiert werden. Es ist deshalb möglich, in einen Mikroorganismus Gene für Stoffwechsel- oder Synthesefunktionen (zum Beispiel Hormonsynthese, Proteinsynthese, Stickstoffixierung) einzuführen, die charakteristisch für andere Klassen von Organismen sind, indem die Gene mit einem besonderen viralen oder Plasmid-Replikon verbunden werden. Seit den späten 70er Jahren sind Fortschritte in der Entwicklung allgemeiner Methoden zur Einführung klonierter DNA-Sequenzen in Säugerzellen gemacht worden. Gegenwärtig jedoch braucht man eine effektive Methode, um ausgewähltes genetisches Material, für das man sich interessiert, stabil in Endothelzellen einzuführen und die Expression dieses Materials zu ermöglichen, damit auf diese Weise das kodierte Protein oder Polypeptid hergestellt wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Endothelzellen (zum Beispiel menschliche Endothelzellen) die in der Therapie verwendet werden sollen. Die Zellen enthalten stabil inkorporiertes genetisches Material, das für ein gewünschtes Produkt kodiert. Die Zellen sind in der Lage, das genetische Material zu exprimieren, um das kodierte Produkt herzustellen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Endothelzellen für die Herstellung eines Medikamentes, das in der Therapie verwendet werden soll.
Die Endothelzellen dieser Erfindung enthalten stabil eingeführtes, gewünschtes genetisches Material, das für ein Produkt kodiert (zum Beispiel ein Protein oder Polypeptid), dessen Herstellung in den Endothelzellen gewünscht ist. Das eingeführte genetische Material ist DNA oder RNA, die entweder allein oder in irgendeiner Kombination davon (a) normalerweise nicht in Endothelzellen vorkommt, (b) normalerweise in Endothelzellen vorkommt, jedoch in diesen nicht in biologisch signifikanten Mengen exprimiert wird, (c) normalerweise in Endothelzellen vorkommt und so modifiziert worden ist, daß sie in Endothelzellen exprimiert wird, oder (d) modifiziert werden kann, so daß sie von Endothelzellen exprimiert wird.
Die Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können auch genetisches Material exprimieren, das für einen selektionierbaren Marker kodiert, wobei so die Möglichkeit besteht, Zellen zu identifizieren und zu selektionieren, die das eingeführte genetische Material exprimieren. Endothelzellen, die das inkorporierte genetische Material enthalten, werden als transduzierte Endothelzellen bezeichnet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Endothelzellen, umfassend (a) Kontaktieren der kultivierten Endothelzellen mit Medien, die ein infektiöses rekombinantes Retrovirus enthalten, das das gewünschte genetische Material enthält und (b) das Inkubieren der kultivierten Endothelzellen und der Medien, die das infektiöse rekombinante Retrovirus enthalten, unter Bedingungen, die für die Infektion der Endothelzellen durch das rekombinante Retrovirus geeignet sind.
Transduzierte Endothelzellen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich für verbesserte prothetische Implantate (zum Beispiel Blutgefäße, die von einer Stelle zu einer anderen in einem Individuum transplantiert wurden; Gefäße die von einem anderen Tier, wie dem Schwein, in ein Individuum implantiert wurden; Gefäße, die aus synthetischen Materialien, wie Dacron oder Polytetrafluorethylen, hergestellt wurden, die in der rekonstruktiven Gefäßchirurgie verwendet werden) und für die Ermöglichung einer konstitutiven Applikation von Polypeptiden oder Proteinen, die in der Prävention und Therapie oder Behandlung nützlich sind und die derzeit parenteral angewendet werden. Die Erfindung betrifft auch ein mit einer Zellschicht ausgekleidetes prothetisches Gefäß, das die Endothelzellen der Erfindung umfaßt, zur Implantation in einen Säuger und Expression des genetischen Materials in dem Säuger. Die Endothelzellen der vorliegenden Erfindung besitzen viele Vorteile. Zum Beispiel können sie dazu bestimmt sein, die Charakteristika des mit Endothelzellen bedeckten prothetischen Implantates zu verbessern, indem man die Fähigkeit der Endothelzellen, die innere Oberfläche des Implantates zu besiedeln oder an diese zu binden, erhöht oder verbessert; indem man die Endothelzellen, die für die Bedeckung eines Implantates verwendet werden, modifiziert, so daß sie sich vermehren können; oder indem man das bei derzeitig verfügbaren Implantaten auftretende Problem löst, daß glatte Muskelzellen an den Enden des Implantates wachsen, was zu einer Verengung und schließlich zu einem Verschluß der Enden führt. Außerdem können die transduzierten Endothelzellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Applikationssystem für Arzneimittel, Hormone oder Enzyme bereitzustellen. Zum Beispiel werden prothetische arterielle Transplantate oft verwendet, um erkrankte Arterien auszutauschen, die lebenswichtige Organe oder Gliedmaßen versorgen. Jedoch sind die derzeit verfügbaren Transplantate gewöhnlich aus synthetischem Material hergestellt und verursachen viele Komplikationen. Die schlimmste Komplikation ist ein hohes Ausmaß von Wiederverschluß oder Abstoßung. Tierstudien deuten an, daß die Auskleidung des Transplantates mit autologen Endothelzellen vor der Implantation den Transplantat-Verschluß mit seinen begleitenden krankhaften Folgen verringern, aber nicht verhindern kann. Endothelzellen können nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung derart modifiziert werden, daß ihre Leistung im Zusammenhang mit einem implantierten Transplantat verbessert ist. Beispiele beinhalten die Sekretion oder Expression eines transmembranständigen thrombolytischen Agens, um die intraluminale Gerinnselbildung zu verhindern, die Sekretion eines Inhibitors der glatten Muskelproliferation, um einen luminalen Verschluß zu verhindern, der durch Hypertrophie glatter Muskelzellen verursacht wird, und die Expression und/oder Sekretion eines Endothelzell-Mitogens oder autokrinen Faktors, um die Endothelzell- Proliferation zu stimulieren und das Ausmaß oder die Rate oder die Dauer der Endothelzell-Bedeckung des Transplantat-Lumens zu verbessern.
Eine weitere Anwendung besteht darin, die Oberfläche von prothetischen Herzklappen mit transduzierten Endothelzellen zu bedecken, um die Leistung/Langlebigkeit der künstlichen Klappen zu verbessern.
Ein Gefäßimplantat, das mit Endothelzellen ausgekleidet ist, die inkorporiertes genetisches Material enthalten, das für ein gewünschtes Polypeptid codiert, synthetisiert das kodierte Polypeptid und dient so als kontinuierliches Applikationssystem für dieses Polypeptid. Auf diese Weise werden das Hormon oder andere Polypeptide direkt in den Blutstrom des Individuums abgegeben, das das Implantat erhält.
Ein bedeutender Vorteil besteht darin, daß die genetisch manipulierten Endothelzellen der vorliegenden Erfindung dafür verwendet werden können, therapeutische Proteine zu verabreichen (zum Beispiel Hormone, Enzyme, Gerinnungsfaktoren), die derzeit intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Außerdem ist eine ausgedehnte (und meist kostenintensive) Reinigung des Polypeptides vor der Verabreichung an ein Individuum, wie es für ein isoliertes Polypeptid (zum Beispiel Insulin) im allgemeinen notwendig ist, nicht mehr nötig. Endothelzellen, die nach der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden, produzieren das Polypeptidhormon auf die Weise, wie es normalerweise produziert würde.
Ein weiterer Vorteil in der Verwendung von genetisch manipulierten Endothelzellen, die prothetische arterielle Implantate auskleiden, besteht darin, daß therapeutische Mengen eines sezernierten Produkts gezielt an ein bestimmtes Organ oder Körperglied gebracht werden können. Das sezernierte Produkt wird in hohen Konzentrationen an das Gewebe abgegeben, das mittels der implantierten Arterie perfundiert wird. Dadurch wird ein gewünschter Effekt an einem gezielten anatomischen Ort erreicht. Das Produkt wird dann während seiner Rückkehr zum Herz im venösen Kreislauf auf nichttherapeutische Mengen verdünnt. Zum Beispiel können ein oder mehrere Gefäße, die transduzierte Endothelzellen der vorliegenden Erfindung enthalten, die einen Angiogenese-Faktor herstellen, in das Bein eines Individuums implantiert werden, dessen Zirkulation so beeinträchtigt ist (zum Beispiel als Folge von Diabetes meilitus), daß sie zu einer nicht ausreichenden Blutversorgung des Beines führt. Dies wird zu einer hohen Konzentration des kodierten Produkts (Angiogenese-Faktor) in der näheren Umgebung des implantierten Gefäßes führen, so daß auf diese Weise die therapeutische Verfügbarkeit des Produktes maximiert wird. Wenn das Blut von den Extremitäten zurückfließt, wird die Konzentration des Angiogenese-Faktors auf nichttherapeutische Mengen verringert. Ein weiterer bedeutender Vorteil des Applikationssystems dieser Erfindung als kontinuierliches Applikationssystem besteht darin, daß es für Polypeptidhormone mit einer sehr kurzen Halbwertszeit keine Einschränkung darstellt. Zum Beispiel beträgt die Halbwertszeit des menschlichen Wachstumshormons etwa 19 Minuten, die des Parathyroidhormons etwa 2,5 bis 5 Minuten und von natürlichem Insulin (reines Insulin) etwa 3 bis 4 Minuten. Da Gene in Endothelzellen unter Verwendung von retroviralen Vektoren eingeführt werden können, können sie unter der Kontrolle eines retroviralen Vektors stehen. In diesem Fall wird das gewünschte Gen von einem retroviralen Promotor transkribiert. Ein Promotor ist eine spezifische Nukleotidsequenz, die von RNA- Polymerasemolekülen erkannt wird, die die RNA-Synthese initiieren. Alternativ können retrovirale Vektoren verwendet werden, die zusätzliche Promotorelemente besitzen (zusätzlich zu dem Promotor, der in das rekombinante Retrovirus inkorporiert ist), welche für die Transkription des gewünschten genetischen Materials verantwortlich sind. Zum Beispiel kann ein Konstrukt verwendet werden, das einen zusätzlichen Promotor enthält, der durch einen externen Faktor oder ein Signal reguliert wird, so daß es möglich ist, die Menge des Polypeptides zu kontrollieren, das von den Endothelzellen hergestellt wird, indem man den externen Faktor oder das Signal aktiviert. Zum Beispiel handelt es sich bei Hitzeschockproteinen um Proteine, die von Genen kodiert werden, deren Promotor über die Temperatur reguliert wird. Der Promotor des Gens, das für das metallhaltige Protein Metallothionein kodiert, reagiert auf Cadmiumionen (Cd&spplus;&spplus;). Die Einführung dieses Promotors oder eines anderen Promotors, der durch externe Signale beeinflußt wird, macht es möglich, die Herstellung des Polypeptides der genetisch manipulierten Endothelzellen zu regulieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Wildtyp Maus- Leukämie-Virus-(Retrovirus) Genoms.
Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung von retroviralen Vektoren, wobei jeder ein rekombinantes Genom besitzt, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Abbildung 2a zeigt den pLJ- und Abbildung 2b den pEm-Vektor.
Abbildung 3 zeigt die schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombinanten retroviralen Vektors unter Verwendung des in Abbildung 2a dargestellten pLJ-Vektors und des menschlichen Parathyroidhormon-Gens.
Abbildung 4 zeigt Bilder von Endothelzellen von Rinderaorten, die mit einem Retrovirus infiziert wurden, der den Low Density Lipoprotein Rezeptor (LDLR) exprimiert und bezüglich der Aufnahme von fluoreszenz-markiertem LDL untersucht wurden. Tafel A - Nichtinfizierte Endothelzellen von Rinderaorten unter Phasenkontrast; Tafel B - Nichtinfizierte Endothelzellen von Rinderaorten unter Fluoreszenz-Beleuchtung; Tafel C - Infizierte Endothelzellen von Rinderaorten unter Phasenkontrast; Tafel D - Infizierte Endothelzellen von Rinderaorten unter Fluoreszenz-Beleuchtung.
Abbildung 5 zeigt Bilder von Endothelzellen von Rinderaorten, die mit einem Retrovirus infiziert wurden, das β-Galactosidase exprimiert, und die durch Verwendung einer histochemischen Färbung in situ auf ihre Expression hin untersucht wurden. Tafel A - Nichtinfizierte Endothelzellen von Rinderaorten, gefärbt bezüglich β-Galactosidase-Aktivität; Tafel B - Infizierte, nicht selektierte Endothelzellen von Rinderaorten, gefärbt bezüglich β-Galactosidase-Aktivität.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das gewünschte genetische Material wurde in Endothelzellen eingeführt und in den daraus resultierenden genetisch manipulierten Endothelzellen exprimiert. Das gewünschte genetische Material, das nach der beschriebenen Methode in Endothelzellen inkorporiert wurde, kann irgendeine ausgewählte, gewünschte DNA sein (zum Beispiel der gesamte Bereich oder ein Teil eines Gens, das für ein gewünschtes Produkt kodiert) oder irgendeine ausgewählte, gewünschte RNA. Zum Beispiel kann es sich um DNA oder RNA handeln, die in normalen Endothelzellen vorhanden ist und exprimiert wird oder DNA oder RNA, die normalerweise in Endothelzellen nicht vorkommt, oder DNA oder RNA, die normalerweise in Endothelzellen vorkommt, in diesen jedoch nicht in biologisch signifikanten Mengen exprimiert wird (Mengen, die ausreichend sind, um den normalen physiologischen Effekt des Proteins oder Polypeptids, für das sie kodiert, herzustellen), oder DNA oder RNA, die in Endothelzellen vorkommt und dergestalt modifiziert werden kann, daß sie in Endothelzellen exprimiert wird, alleine oder in irgendeiner Kombination davon. Das gewünschte genetische Material wird hier als inkorporiertes genetisches Material bezeichnet. Das inkorporierte genetische Material (das heißt DNA oder RNA), das von Endothelzellen der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, ist genetisches Material, das für ein gewünschtes Polypeptid oder Protein kodiert (gewünschtes genetisches Material). Die Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können auch ein Gen beinhalten und exprimieren, das für einen selektionierbaren Marker kodiert. Zum Beispiel kann gewünschtes genetisches Material, wobei es sich um DNA handelt, die normalerweise in menschlichen Endothelzellen vorhanden ist und exprimiert wird, in abnorme Endothelzellen (die zum Beispiel die DNA in einer abnormen Menge enthalten oder dieses Material enthalten, es aber nicht in geeigneter Weise exprimieren) inkorporiert werden, mit der Folge, daß sie das ausgewählte Protein oder Polypeptid herstellen können. In einem anderen ausgeführten Beispiel ist genetisches Material, das für ein Hormon kodiert, in Endothelzellen eingeführt worden, indem man sie einem Medium ausgesetzt hat, das ein Virus mit einem rekombinanten Genom enthält (das heißt, indem man sie infiziert hat). Das verwendete Medium wird durch Ernten des Mediums erhalten, in dem Erzeuger-Zellen (zum Beispiel ein Psi-am- oder ein amphotroper Erzeuger) vermehrt wurden. Erzeuger-Zellen sind also in Dujbecco's Modified Eagle's Medium (DME) mit 10% Kälberserum (CS) und Penicillin und Streptomycin in Gewebekultur bis zu konfluenter Dichte vermehrt worden. Frisches Medium wird hinzugefügt und das Medium nachfolgend (zum Beispiel etwa 12 Stunden später) geerntet. Ungefähr 10 ml Medium werden von einer 10 cm Platte von konfluenten Erzeuger-Zellen geerntet. Das verbrauchte Medium (oder der virale Stock) wird durch einen 0.45 Mikron Millipore-Filter filtriert, um losgelöste Erzeuger-Zellen zu entfernen und entweder sofort zur Infektion von Zellen verwendet oder bei -70ºC aufbewahrt. Das Medium wird von einer subkonfluenten Platte mit Endothelzellen entfernt (Empfänger-Endothelzellen) und schnell durch den viralen Stock ersetzt (zum Beispiel 5 ml/10 cm Platte), der 8 pg/ml Polybrene (Aldrich) enthält. Nachfolgend (zum Beispiel 12 Stunden später) wird dieses entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Das verwendete Medium ist also ein viraler Überstand. Das rekombinante Genom des infektiösen Virus beinhaltet das gewünschte genetische Material, das in Endothelzellen inkorporiert wird. Das rekombinante Genom kann auch genetisches Material besitzen, das für einen dominanten selektionierbaren Marker kodiert.
Als Ergebnis wurden Endothelzellen hergestellt, die ein Polypeptid, das normalerweise in diesen Zellen nicht in biologisch signifikanten Mengen exprimiert wird, und wahlweise einen dominanten selektierbaren Marker exprimieren.
Im Einzelnen: Endothelzellen werden einem Medium ausgesetzt, das infektiöse Viren enthält, die in Psi-am Zellen hergestellt werden. Das infektiöse Virus enthält ein rekombinantes Genom, das das gewünschte genetische Material besitzt. Das rekombinante Genom beinhaltet in einem Beispiel genetisches Material, das für das menschliche Parathyroidhormon (hPTH) kodiert. Wahlweise kann es auch ein Gen enthalten, das für einen dominanten selektionierbaren Marker kodiert (zum Beispiel, das neo-Gen, das für Neomycin-Resistenz in Bakterien und für G418-Resistenz in Säugerzellen kodiert). Als Ergebnis sind die Endothelzellen transduziert, das heißt, das gewünschte genetische Material (in diesem Fall DNA, die für hPTH kodiert und wahlweise das neo-Gen) ist stabil in die Endothelzellen eingeführt. Die transduzierten Endothelzellen exprimieren das kodierte hPTH und, falls das neo-Gen vorhanden ist, exprimieren sie auch dieses, was zu Zellen führt, die den selektierbaren Marker besitzen.
Alternativ werden Endothelzellen dadurch transduziert, daß man sie einem Medium aussetzt, das infektiöse Viren enthält, in denen das rekombinante Genom das gewünschte genetische Material beinhaltet (zum Beispiel, irgendein gewünschtes Gen oder ein Teil davon; gewünschte RNA). Wie nachstehend beschrieben, sind Endothelzellen mit einen Gen transduziert worden, das für ein sezerniertes Produkt kodiert (menschliches Parathyroidhormon oder hPTH), mit einem Gen, das für einen Membranrezeptor kodiert (Low Density Lipoprotein Rezeptor oder LDLR), und einem Gen, das für ein intrazelluläres Enzym kodiert (β-Galactosidase). Endothelzellen, die das inkorporierte genetische Material exprimieren, läßt man in Gewebekulturgefäßen bis zur Konfluenz wachsen. Sie werden sodann aus dem Kulturgefäß entfernt, in dem sie wuchsen, und in den Körper eingeführt oder implantiert. Sie können in den Empfänger nach verschiedenen Methoden eingeführt werden. Zum Beispiel können transduzierte Endothelzellen auf das Lumen eines prothetischen Gefäßes ausgesät werden. Die Endothelzellen werden dann bis zur Konfluenz vermehrt, bis sie das Lumen des Gefäßes bedecken. Sie bilden die Auskleidung, die als Neointima bezeichnet wird (eine gut organisierte Struktur, die der Intima und dem Medium eines natürlichen Gefäßes gleicht, das heißt, eine Beschichtung von Endothelzellen mit tiefer liegenden glatten Muskelzellen). Alternativ können sie in Blutgefäße in vivo mittels eines Katheters transplantiert werden. Es ist auch möglich, sie in Körperhöhlen einzuführen, die mit serösen Membranen bedeckt sind, wie die Peritonealhöhle, den Pleuralraum und den Pericardraum. In diesem Fall würden die Endothelzellen die seröse Auskleidung übersähen und das Produkt in den Hohlraum abgeben. Das Produkt würde dann über das lymphatische System aufgenommen werden.
Ein weiteres Beispiel, das ausgeführt wurde, ist die Implantation von Gefäßtransplantaten, die mit autologen retroviral transduzierten Endothelzellen besät wurden, in Hunde. Es wurden replikationsdefekte Retroviren mit amphotropem Wirtsbereich verwendet, um ein Transporter-Gen stabil in das Genom der Endothelzellen einzuführen. Das lac Z-Gen ist als Reporter-Gen verwendet worden, da sein Expressionsprodukt β-Galactosidase in situ mittels enzymatischer histochemischer Tests, die das zelluläre Cytoplasma blau färben, nachgewiesen werden kann.
Externe Drosselvenen erwachsener Mischlingshunde wurden als Quelle für Endothelzellen verwendet, die in vitro in einer 10-14tägigen Periode über zwei Reihenpassagen ausplattiert wurden. Die Zellen von jedem Tier wurden in zwei Aliquots geteilt und jedes wurde mit einem replikationsdefekten Retrovirus infiziert oder scheininfiziert. Dacron-Transplantate mit geringem Durchmesser wurden zu subkonfluenter Dichte mit Endothelzellen nach der autologen Pfropf-Methode besät und chirurgisch in Form des Interpositionstransplantates der Carotis-Arterie in die Hunde, von denen die Zellen geerntet wurden, implantiert. Jeder Hund erhielt ein Transplantat, das mit genetisch modifizierten Zellen besät war, und ein kontralaterales Transplantat mit scheininfizierten Zellen. Fünf Wochen nach der Implantation wurden die Transplantate geerntet und analysiert.
Die Zellen wurden von der Lumenoberfläche von einem Teil des Transplantates enzymatisch geerntet, was eine detailliertere Charakterisierung erlaubt. Primärkulturen der Zellen wurden erstellt und vor der Analyse in vitro ungefähr 2-3 Wochen vermehrt. Genetisch modifizierte Endothelzellen wurden in dieser Population über Southern-Analyse und über den cytochemischen Test auf viral exprimierte β-Galactosidase identifiziert. Die Mehrzahl der Zellen, die von dem Transplantat gesammelt und in vitro vermehrt wurden, behielt differenzierte Endothel- Funktion (weniger als 95%). Der Teil der Zellen, die viral gesteuerte β-Galactosidase exprimierten oder provirale Sequenzen enthielten, war jedoch im Vergleich mit Kulturen, die zum Zeitpunkt der Aussaat analysiert wurden, durchweg 2-10fach verringert. Dieser Unterschied ist zum Teil die Folge partieller Repopulation des Transplantates mit endogenen Zellen, die durch Zwischenräume oder von den Anastomosen her einwandern.
Das Ergebnis dieser Studie zeigt die Durchführbarkeit der Implantierung von Gefäßtransplantaten, die mit autologen genetisch modifizierten Endothelzellen besät wurden. Die transduzierten Endothelzellen persistieren auf dem Lumen des Transplantates für mindestes fünf Wochen und das transferierte Gen funktioniert weiter.

Isolierung von Endothelzellen

Die Isolierung und Haltung von Endothelzellen aus Kapillaren und großen Gefäßen (zum Beispiel Arterien oder Venen) von vielen Wirbeltierarten ist in der Literatur gut beschrieben worden. Zum Beispiel beschreiben McGuire und Orkin ein einfaches Verfahren für die Kultivierung und Übertragung von Endothelzellen aus großen Gefäßen von kleinen Tieren; McGuire, R.W and R.W. Orkin, Biotechnques, 5: 546-554 (1987). Häufig ist Kalbsaorta die Quelle von Endothelzellen, wie es in den ursprünglichen hier beschriebenen Arbeiten der Fall war. Ein typisches Protokoll für die Isolierung von Endothelzellen aus großen Arterien ist nachstehend beschrieben. Schnitte von Aorten, die frisch entnommen wurden, werden unter sterilen Bedingungen 15-20 Minuten bei 37ºC in eine Lösung gegeben, die Kollagenase enthält (zum Beispiel 0.5 mg/ml). Die Aorten werden dann zweimal mit Gewebekulturmedium ausgespült (zum Beispiel RPMI 1640), und der lumenständige Anteil der Endothelzellen wird durch sanftes Schütteln in Vollmedium (RPMI, das 15 mM Hepes, pH 7.4, Penicillin/Streptomycin und 20% fötales Kälber-Serum enthält) abgelöst; vgl. Booyse, F.M. et al., Thrombosis Diath. Haemorrh., 34: 825-839 (1975). Die zell-haltigen Gewebestücke (cell patches) werden in Gewebekulturflaschen in Vollmedium überführt. Die Zellen teilen sich und bedecken schließlich die Platte. Wenn die Platte konfluent ist, können die Zellen unter Verwendung von Standard Gewebekultur- Techniken passagiert werden. Die Reinheit der Kulturen wird durch die Aufnahme von fluoreszenz-markiertem acetyliertem LDL beurteilt, das speziell nur von Endothelzellen aufgenommen wird. Wenn die Kulturen nicht sauber sind (das heißt, kontaminiert sind mit anderen Zellen als Endothelzellen, wie Muskelzellen oder Fibroblasten), werden die Endothelzellen durch Endpunktsverdünnung (limiting dilution) kloniert und vermehrt, um saubere Kulturen zu erhalten. Die Lebenszeit der Endothelzellen ist in Kultur begrenzt, variiert aber sehr in Abhängigkeit von der anatomischen Quelle und dem Spender-Tier. Endothelzellen von Rinderaorten konnten in Kultur für mindestens 15-20 Passagen gehalten werden.

Retrovirale Vektoren

Retroviren sind RNA Viren, das heißt, das virale Genom ist RNA. Diese genomische RNA wird jedoch in eine DNA-Zwischenstufe revers transkribiert, die sehr effizient in die chromosomale DNA der infizierten Zelle integriert wird. Diese integrierte DNA-Zwischenstufe wird als Provirus bezeichnet. Wie in Abbildung 1 gezeigt, besitzt das retrovirale Genom und die provirale DNA drei Gene: Das gag-, das pol- und das env-Gen, die von zwei langen terminalen Wiederholungen (LTRs) flankiert werden. Das gag-Gen kodiert für die inneren Strukturproteine (Nukleokapsid); das env-Gen kodiert für die RNA-gesteuerte DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase); und das env- Gen kodiert für virale Hüllglykoproteine. Die 5,- und 3'- LTRs fördern die Transkription und die Polyadenylierung der viralen RNAs.
Benachbart zum 5'-LTR befinden sich Sequenzen, die für die reverse Transkription des Genoms (die tRNA-Primer-Bindungsstelle) und für die effiziente Einkapselung der viralen RNA in Partikel (die Psi-Stelle) notwendig sind: vgl. Mulligan, R.C., In: Exoerimental Manipulation of Gene Exnression, M. Inouye (ed), 155-173 1983); Mann, R., et al., Cell, 33: 153-159 (1983); Cone, R.D. und R.C. Mulligan, PNAS U.S.A., 81: 6349-6353 (1984)
Wenn die Sequenzen, die für die Einkapselung (oder zur Verpackung retroviraler RNA in infektiöse Virionen) notwendig sind, in dem viralen Genom fehlen, so ergibt sich daraus ein cis-Defekt, der die Einkapselung der genomischen RNA verhindert. Jedoch ist die resultierende Mutante noch in der Lage, die Synthese aller viralen Proteine zu steuern. Mulligan und Mitarbeiter haben retrovirale Genome beschrieben, aus denen diese Psi-Sequenzen entfernt worden sind, ebenso wie Zellinien, die die Mutante stabil ins Chromosom integriert hatten; vgl. Mulligan, R.C., In: Exnerimental Maninulation of Gene Exnression M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann, R., et al., Cell, 33 153-159 (1983); Cone, R.D. und R.C. Mulligan, PNAS U.S.A. 81 6349-6353 (1984). Auf den Inhalt dieser Veröffentlichungen wird hier Bezug genommen.
Wie von Mulligan und Mitarbeitern beschrieben, wurde die Psi 2-Zellinie auf folgende Art hergestellt: Es wurde ein mutiertes Maus-Leukämie-Virus-Genom (MuLV) hergestellt, in dem die Region des Genoms, das zur Einkapselung der viralen RNA in Virionen für notwendig erachtet wird, entfernt wurde (die Psi-Sequenz in Abbildung 1). Dieses Genom wurde stabil über DNA-Co-Transformation in NIH3T3-Zellen eingeführt und stabile Transformanten isoliert, die alle zur Einkapselung benötigten viralen Proteine herstellen, jedoch im Wege der Knospung nichtinfektiöse Partikel freisetzen. Die Mutante von MuLV wurde durch Entfernen von 351 Nukleotiden zwischen der mutmaßlichen env-mRNA 5'-Spleiß-Stelle und dem AUG, das die kodierende Sequenz für Pr65gag initiiert, aus einem infektiösen proviralen DNA-Klon hergestellt. Die Deletion wurde von der BaII- bis zur PstI-Stelle durchgeführt und eine HindIII-Stelle wurde am Punkt der Deletion erzeugt.
pMOV. (pMOV Psi&supmin;) wurde wie folgt hergestellt: Drei gereinigte DNA Fragmente wurden zusammenligiert, um pMOV Psi&supmin; zu konstruieren. Das erste Fragment wurde durch vollständige Spaltung von pMOV Psi&spplus; mit Xhol, gefolgt von einer partiellen Spaltung mit EcoRI erhalten; Chumakov, I. et al., Journal of Virology, 42: 1088-1098 (1982). Das Fragment, das von der Xhol Stelle bei 2.0 U in MuLV über den 3'- LTR, die von der Maus abgeleiteten 3'-flankierenden Sequenzen und den gesamten Bereich von pBR322 reicht und an der EcoRI-Stelle endet, wurde nach elektrophoretischer Auftrennung über ein Agarosegel gereinigt; vgl. Vogelstein, B. und D. Gillespie, PNAS USA, 761: 615-619 (1979). Das zweite Fragment wurde durch vollständige Spaltung von pMOV Psi&spplus; mit BaII erhalten, gefolgt von Reinigung des Fragmentes, das von der Ball-Stelle in pBR322 über 5'-flankierende Sequenzen der Maus und den 5'-LTR bis zur Ball-Stelle reicht, die bei 0.7 U von MuLV liegt. HindIII-Linker (Collaborative Research) wurden dann mit T4 DNA Ligase an dieses Fragment über Ligation der glatten Enden ligiert. Das Fragment wurde mit einem Überschuß an HindIII und EcoRI gespalten. Das LTR-enthaltende Fragment wurde nach elektrophoretischer Auftrennung aus einem Agarosegel gereinigt. Das dritte Fragment, das an der endgültigen Ligations-Reaktion beteiligt ist, wurde von pSV2- gag/pol erhalten, wobei die gag/pol-Region von MuLV in pSV2 subkloniert worden ist; vgl. Mulligan, R.C. und P. Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980). pSV2-gag/pol wurde vollständig mit XhoI und HindIII gespalten und das Fragment, das von der HindIII-Stelle (aus der PstI-Stelle bei 1.0 U von MuLV hervorgegangen) bis zur Xhol- Stelle bei 2.0 U von MuLV reicht, wurde aus einem Agarosegel nach elektrophoretischer Auftrennung gereinigt. Die drei DNA Fragmente wurden in äquimolaren Mengen zu einer Gesamt DNA-Konzentration von 50 ug/ml in Ligase- Puffer (50 mM Tris-HCl [pH 7.8], 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 ug/ml Rinder-Serumalbumin) vermischt und mit T4 Ligase für 18 Stunden bei 15ºC inkubiert. E. coli HBI 01 -Zellen wurden mit der ligierten DNA transfiziert und Ampicillin-resistente Transfektanten wurden erhalten. Die Plasmid-DNA, die von einer Anzahl von Transformanten erhalten wurde, wurde durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und elektrophoretische Auftrennung über ein Agarosegel nach der gewünschten Struktur abgesucht; vgl. Davis, R.W. et al., Methods in Enzymology, 65: 404-411 (1980). Zellinien, die die Psi-Mutante enthielten, die stabil ins Chromosom integriert wurde, wurden durch Co-Transfektion von pMOV-Psi und pSV2gpt, einem SV40-Hybridvektor, der in der Lage ist, XGPRT zu exprimieren, hergestellt; vgl. Mulligan, R.C. und P. Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980). Zellen aus gpt&spplus;-Kolonien, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden kloniert und in drei Linien etabliert: Psi-1, Psi-2 und Psi-3.
Die Psi-2 Zellinie, die von Mulligan und Mitarbeitern beschrieben wurde, wurde durch Transfektion von NIH3T3-Endothelzellen mit pMOV-Psi&supmin;, bei dem es sich um einen ecotropen Molony-Maus-Leukämie-Virus-Klon (Mo-MuLV) handelt, erstellt. pMOV-Psi exprimiert alle viralen Genprodukte, besitzt aber nicht die Psi-Sequenz, die für die Einkapselung des viralen Genoms notwendig ist. pMOV-Psi&supmin;-Zellen exprimieren ein ecotropes virales Hüllglykoprotein, das einen Rezeptor erkennt, der nur auf Maus- und nahe verwandten Nagerzellen vorkommt.
Eine weitere Zellinie ist die Psi-am-Linie, bei der es sich um eine Psi-2 ähnliche Verpackungszellinie handelt. Diese Psi-am-Zellinien enthalten ein modifiziertes pMOV-Psi-Genom, in dem das ecotrope Hüllglykoprotein gegen eine Hüllprotein-Sequenz ausgetauscht wurde, die von dem amphotropen Virus 4070A abstammt; vgl. Hartly, J.W. und W.P. Rowe, Journal of Viroloay, 19: 19-25 (1976). Deshalb sind sie für die Erzeugung von rekombinanten Viren mit amphotropem Wirtsbereich brauchbar. Das Retrovirus, das verwendet wurde, um die Psi-am-Zellinie zu erstellen, besitzt einen sehr breiten Säuger-Wirtsbereich (einen amphotropen Wirtsbereich) und kann zur Infektion von menschlichen Zellen verwendet werden.
Wenn das rekombinante Genom eine Psi-Verpackungsequenz besitzt, ist die Psi-am- Zellinie in der Lage, rekombinante retrovirale Genome in infektiöse retrovirale Partikel zu verpacken; vgl. Cone, R. und Mulligan, R., PNAS USA, 81: 6349-6353 (1984). Das retrovirale Genom ist von Cone und Mulligan modifiziert worden, damit man es als Vektor verwenden kann, der in der Lage ist, neue Gene in Zellen einzuführen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, sind das gag-, pol- und env-Gen entfernt worden und ein DNA-Segment, das für das neo-Gen kodiert, wurde an ihrer Stelle eingefügt. Das neo-Gen dient als dominanter selektionierbarer Marker. Die retroviralen Sequenzen, die Teil des rekombinanten Genoms bleiben, beinhalten die LTRs, die tRNA-Bindestelle und die Psi-Verpackungssequenz; vgl. Cepko, C. et al., Cell, 37 1053-1062 (1984). Weitere Vektor-Konstrukte, die für die Erzeugung von transduzierten Endothelzellen der vorliegenden Erfindung verwendet worden sind, werden in Abbildung 2 dargestellt und werden nachstehend genau beschrieben.
Der pLJ-Vektor. Die Charakteristika dieses Vektors sind von Korman, A.J. et al., PNAS USA, 84: 2150 (1987) beschrieben worden. Dieser Vektor ist in der Lage, zwei Gene zu exprimieren, nämlich das gewünschte Gen und einen dominanten selektionierbaren Marker, wie das neo-Gen. Das gewünschte Gen wird in richtiger Orientierung in die BamHI/SmaI/SaII/-Klonierungsstelle direkt distal zum 5'-LTR kloniert, während das neo-Gen distal zu einem internen Promotor (von SV40) plaziert wird, der weiter 3' von der Klonierungsstelle entfernt liegt (3' von der Klonierungsstelle lokalisiert ist). Die Transkription von pLJ wird an zwei Stellen initiiert: 1) an dem 5'-LTR, der für die Expression des gewünschten Gens verantwortlich ist und 2) an dem internen SV40 Promoter, der für die Expression des neo-Gens verantwortlich ist. Die Struktur des pLJ-Vektors ist in Abbildung 2a dargestellt. In pLJ ist das gewünschte genetische Material direkt hinter dem 5'-LTR eingefügt. Die Expression dieses genetischen Materials erfolgt durch Transkription vom LTR und die Expression des neo-Gens durch Transkription von einem internen SV40-Promotor.
Der Em-Vektor. In diesem einfachen Vektor ist die vollständige kodierende Sequenz für die gag-, pol- und env-Gene des Wildtyp Virus durch das gewünschte Gen ersetzt, welches als Einziges exprimiert wird. Die Bestandteile des pEm-Vektors sind nachstehend beschrieben. Die 5'-flankierende Sequenz, der 5'-LTR und die daran anschließenden 400 Basenpaare (bis zur BamHI-Stelle) stammen aus pZIP. Die 3'- flankierende Sequenz und der LTR stammen ebenfalls aus pZIP, die ClaI-Stelle 150 bp oberhalb des 3'-LTRs ist jedoch mit synthetischen BamHI-Linkern zusammenligiert worden und bildet die andere Hälfte der BamHI-Klonierungsstelle, die in diesem Vektor vorhanden ist. Das HindIII/EcoRl-Fragment aus pBR322 bildet das Plasmid- Rückrat. Dieser Vektor stammt von Sequenzen ab, die aus einem Stamm von Moloney-Maus-Leukämie-Virus kloniert wurden. Ein analoger Vektor wurde mit Sequenzen hergestellt, die vom myeloproliferativen Sarcom-Virus abstammen. Die Struktur des pEm-Vektors ist in Abbildung 2b dargestellt. Auch Vektoren ohne selektierbaren Marker können verwendet werden, um Endothelzellen mit dem gewünschten genetischen Material zu transduzieren. Solche Vektoren stellen Vereinfachungen der zuvor beschriebenen Vektoren dar, die solch einen Marker enthalten. Der pEm-Vektor ist in Abbildung 2b dargestellt. Die Hauptkomponenten des Vektors sind der 5,- und der 3'-LTR, und das gewünschte genetische Material, das zwischen die zwei LTRs inseriert wird.

Einführung von genetischem Material in Endothelzellen und Nachweis der Expression des genetischen Materials

Eine Zellinie, die ein rekombinantes amphotropes Retrovirus mit einem rekombinanten Genom erzeugt, wird zur Infektion von Endothelzellen verwendet. Wie vorstehend beschrieben, kann das rekombinante Genom eine Vielzahl von Komponenten enthalten, umfaßt in der Regel aber zwei LTRs und an Stelle von gag-, pol- und env-Sequenzen eine zweite Promotorsequenz. In einigen Fällen enthält es auch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (z. B. neo).
Wie vorstehend beschrieben, wurden virale Stocks, die für die Einführung von gewünschtem genetischem Material in Endothelzellen verwendet werden, geerntet, mit 8 Mikrogramm pro ml (pg/ml) Polybrene (Aldrich) versehen und der Endothelzell-Kultur hinzugefügt. Wenn der Virustiter hoch ist, (das heißt ungefähr 106 cfu/ml), werden praktisch alle Endothelzellen infiziert und es ist keine Selektion nötig (z. B. auf Endothelzellen, in die der Vektor, der das rekombinante Genom beinhaltet, eingeführt worden ist). Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektionierbaren Marker besitzt, wie ein neo- oder his-Gen. Wenn ein selektionierbarer Marker verwendet wird, läßt man die Zellen, nachdem man sie dem Virus ausgesetzt hat, bis zu Konfluenz wachsen und teilt sie in Selektionsmedium auf (d. h., Medium, das G418 enthält, falls es sich bei dem selektionierbaren Marker um neo handelt, Medium, das Histidinol enthält und kein Histidin, wenn es sich bei dem selektionierbaren Marker um his handelt). Beim neo-Gen handelt es sich um ein bakterielles Gen, das von dem Transposon Tn5 abstammt, das für Neomycinresistenz in Bakterien und für Resistenz gegen das Antibiotikum G418 in Säugerzellen kodiert. Dieses neo-Gen wirkt als ein dominanter Selektionsmarker; seine Anwesenheit in Säugerzellen führt dazu, daß die Zelle in Anwesenheit von G418 wachsen kann; wenn es nicht vorhanden ist, sterben die Zellen in Anwesenheit von G418. Dies hat zur Folge, daß die Anwesenheit dieses Gens in Säugerzellen durch Kultivieren der Zellen in G418- haltigem Medium nachgewiesen werden kann. Das rekombinante Retrovirus, das dieses rekombinante Genom besitzt, wird als das neo-Virus bezeichnet. Die rekombinanten retroviralen Vektoren, die das neo-Gen enthalten, besitzen auch eine Klonierungsstelle. Daraus ergibt sich, daß das gewünschte genetische Material in den Vektor eingeführt, in die Endothelzellen inkorporiert und von den Endothelzellen, die mit dem rekombinanten Retrovirus transduziert wurden, exprimiert werden kann (bezeichnet als "Endothelzellen mit inkorporiertem genetischem Material"). Es sollte möglich sein, praktisch jedes beliebige gewünschte Gen in Endothelzellen mit Hilfe eines retroviralen Vektors zu exprimieren. Retrovirale Vektoren, die Gene exprimieren, die für drei verschiedene Klassen von Proteinen kodieren, sind konstruiert worden: ein sezerniertes Hormon-Polypeptid (menschliches PTH, oder hPTH), ein Membran-Rezeptor (Rezeptor für LDL, oder LDLR), und ein intrazelluläres Enzym (β-Galactosidase). Effiziente Expression der rekombinanten Viren nach Inkorporierung in Endothelzellen ist gezeigt worden und wird im Detail in den Beispielen beschrieben.

Einführung von genetischem Material, das für andere Proteine oder Polypeptide kodiert

Gene, die für andere Proteine oder Polypeptide kodieren, können ebenso mit Hilfe eines geeigneten retroviralen Vektors in Endothelzellen eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein Gen, das für das menschliche Wachstumshormon (Human Growth Hormone; HGH) oder ein Gen, das für Insulin kodiert, in Endothelzellen eingeführt werden. Solche Gene können alleine oder in Kombination mit einem Gen, das für einen selektionierbaren Marker kodiert, wie dem neo-Gen, eingeführt werden. HGH ist ein Polypeptid mit einer Größe von etwa 29.000 Dalton, das normalerweise nur vom Hypothalamus abgesondert wird. Insulin ist ein Polypeptid, das den Glucosespiegel im Blut reguliert.
Diese Gene, ebenso wie andere, können in Endothelzellen auf die gleiche Art wie vorstehend für hPTH beschrieben, eingeführt und die resultierenden Endothelzellen in eine geeignete Stelle im Körper implantiert oder bei einer solchen appliziert werden.

Verwendung von anderen dominant selektionierbaren Markern bei der Einführung von für Polypeptide kodierendem genetischen Material

Es ist auch möglich, andere dominant selektionierbare Marker als das neo- Gen zu verwenden, um genetisches Material in Endothelzellen einzuführen. Zum Beispiel kann das His D-Gen für diesen Zweck verwendet werden. Beim His D-Gen handelt es sich um ein bakterielles Gen von Salmonella, das für Histidinoldehydrogenase kodiert, ein Polypeptid, das Histidinol in Histidin überführt. Histidin ist eine essentielle Aminosäure; Histidinol ist ein Alkohol-Analog von Histidin und kann unter geeigneten Stoffwechselbedingungen in Histidin überführt werden. Wenn man Zellen in Medium wachsen läßt, das Histidinol, jedoch kein Histidin enthält, dann können die Zellen, die das His D-Gen enthalten, Histidinol in Histidin überführen. Da Histidin für ihre Funktion essentiell ist, werden die Zellen, die das His D-Gen enthalten (und somit Histidin herstellen), überleben und die, die das Gen nicht besitzen, nicht. Ein retroviraler Vektor, der das His D-Gen enthält, ist für die Infektion von Keratinozyten verwendet worden. Die Keratinozyten, die das His D-Gen enthalten, wurden selektioniert, indem man sie in Medium wachsen ließ, das kein Histidin aber Histidinol enthielt. Wie erwartet, bildeten die Keratinozyten, die das His D-Gen enthielten, Kolonien, und wuchsen bis zur Konfluenz; die, die das Gen nicht besaßen, taten dies nicht. Tatsächlich waren diese Zellen weit häufiger als solche, die das neo- Gen enthielten. Die gleichen Techniken sind bei der Selektion von Endothelzellen nützlich, die eine gewünschte DNA enthalten. Als Ergebnis dieser Arbeit ist es auch möglich, unabhängige dominant selektionierbare Marker zu verwenden (z. B. das neo-Gen und das His D-Gen), um neues genetisches Material in Endothelzellen zu inkorporieren. Im Falle von Polypeptiden, die zwei unterschiedliche Untereinheiten besitzen, können zum Beispiel getrennte dominante Selektionsmarker verwendet werden, um die genetische Information, die für zwei Untereinheiten kodiert, einzuführen. Außerdem können zwei oder mehrere dominante Selektionsmarker verwendet werden, falls Polypeptide spezifisch gespalten oder prozessiert werden müssen, um aktiv zu werden (z. B. Insulin oder Parathyroidhormon). Ein Gen, das für das notwendige Prozessierungs- Enzym kodiert, kann zusammen mit dem für das Polypeptidhormon kodierenden Gen eingeführt werden, das eine solche Prozessierung benötigt. Dies ermöglicht Endothelzellen, dieses Polypeptidhormon zu prozessieren.

Andere Vehikel für die Einführung von gewünschtem genetischem Material in Endothelzellen

Es ist auch möglich, andere Vehikel als Retroviren zu verwenden, um Endothelzellen genetisch zu manipulieren oder zu modifizieren. Die gewünschte genetische Information kann in Endothelzellen unter Verwendung von irgendeinem Virus eingeführt werden, das das gewünschte genetische Material in solchen Zellen exprimiert. Zum Beispiel können SV40, Herpesvirus, Adenovirus und menschliches Papillomavirus für diesen Zweck eingesetzt werden.
Es ist ebenso möglich, das gewünschte genetische Material in Endothelzellen derart einzuführen, daß es nicht stabil in die Empfängerzelle inkorporiert wird, sondern episomal exprimiert wird (distinkt oder getrennt vom Empfängerzellgenom bleibt).

Verwendung von Endothelzellen mit inkornopiertem genetischen Material; Verbesserung der Leistung von Gefäßtransplantaten oder Implantaten

Viele bedeutende Erkrankungen beinhalten Verengung oder Verschluß von Arterien, die lebenswichtige Organe versorgen. Der am häufigsten bei diesen Krankheitszuständen involvierte pathologische Mechanismus ist Arteriosklerose. Beispiele sind Angina pectoris und Herzinfarkt, der durch Erkrankungen der Koronararterien verursacht wird, kurzzeitige Durchblutungsstörungen (TIA) und Schlaganfälle, verursacht durch Gehirngefäßerkrankungen; Nierengefäß-Hypertonie und schließlich Nierenversagen, verursacht durch Nierenarterien-Verschluß; Gefäßverschluß der unteren Gliedmaßen, der durch Gefäßerkrankungen der peripheren Arterien verursacht wird, und in der schwersten Form die Amputation zur Folge haben kann. Sofern die Ursachen, die ein Individuum für arteriosklerotische Läsionen empfänglich machen, nicht entfernt werden (z. B. Hypertonie, Zigarettenkonsum), ist der natürliche Verlauf dieser Krankheitszustände gewöhnlich Verschlechterung der arterioklerotischen Läsionen, was zu dauerhafter Schädigung oder zum Tod führt.
Ein akzeptierter und weitverbreiterter Therapieansatz bei fortgeschrittenen arteriosklerotischen Zuständen besteht darin, die Stelle der Hauptverengung oder des Verschlusses mit einem prothetischen Gefäß zu umgehen, das aus synthetischem Material, wie Dacron, hergestellt wird. Mehr als 350,000 Gefäßtransplantate werden jedes Jahr implantiert. Ein Hauptproblem bei dieser Methode besteht darin, daß das prothetische Gefäß sehr thrombogen ist (d. h. es ist in der Lage, Gerinnsel hervorzurufen), was zu einer hohen Wiederverschlußrate führt. Es ist möglich geworden, dieses Problem durch Besäen des prothetischen Gefäßlumens mit autologen Endothelzellen zu verringern; Transplantate, die mit Endothelzellen bedeckt sind, sind vermutlich weniger thrombogen. Unter diesen Umständen würden modifizierte Endothelzellen besonders nützlich sein. Endothelzellen können nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung genetisch modifiziert werden, um ihre Wirksamkeit bei einem mit Endothelzellen bedeckten prothetischen Transplantat zu verbessern. Bestehende Protokolle für die Verwendung von prothetischen Implantaten, die von Endothelzellen bedeckt sind, werden durch einige entscheidende technologische Schwierigkeiten erschwert; die meisten von ihnen können durch die Verwendung von genetisch manipulierten Endothelzellen überwunden werden. Erstens ist es unmöglich, eine konfluente Schicht von Endothelzellen zu erhalten, die das Transplantat auskleidet, wenn die Zellen zu subkonfluenter Dichte ausgesät werden. Dies beruht zum Teil auf der begrenzten proliferativen Kapazität der Endothelzellen in diesem Milieu. Weiterhin schließt die begrenzte Menge verfügbarer autologer Endothelzellen die Besäung der Transplantate zu konfluenter Dichte (unter Verwendung derzeit verfügbarer Technologien) bei besonders wichtigen klinischen Situationen aus. Jedoch können Endothelzellen genetisch modifiziert werden, um ihre Proliferationskapazität zu fördern, indem man sie mit einem Retrovirus infiziert, das ein Endothelzell-Mitogen exprimiert, wie den Endothelzell- Wachstumsfaktor. Es könnte möglich sein, ein Implantat zu Beginn mit transduzierten Endothelzellen zu subkonfluenter Dichte zu besäen und nachfolgend eine konfluente Bedeckung in vitro oder in vivo zu erhalten. Viele Anwendungen von mit Endothelzellen bedeckten Implantaten, die aufgrund der begrenzten Anzahl autologer Zellen unmöglich waren, können nun durchgeführt werden. Außerdem können die modifizierten Endothelzellen einen selektiven Vorteil gegenüber kompetierenden Zellen besitzen (wie glatten Muskelzellen oder endogenen Endothelzellen), wodurch ein Überwachsen der transduzierten Endothelzellen durch kompetierende Zellen verhindert wird. Ein weiteres Problem mit endothelisierten Implantaten besteht darin, daß das Lumen der prothetischen Gefäße eine fortschreitende Verengung erfährt, die durch die Proliferation der glatten Muskelzellen zwischen der Wand der Prothese und der luminalen Oberfläche verursacht wird. Ein Weg, wie dies verhindert werden kann, besteht darin, in die Endothelzellen ein Gen einzuführen, das für ein sezernierbares Produkt kodiert, das das Wachstum glatter Muskelzellen verhindert. Viele Typen von autokrinen/parakrinen Wachstumsfaktoren, die die Proliferation von mesenchymalen und/oder epithelialen Zellen kontrollieren, sind kürzlich identifiziert worden und ihre Gene wurden kloniert. Solche Gene können in Endothelzellen eingeführt werden, indem man das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Die resultierenden transduzierten Endothelzellen stellen den Zell-Wachstumsinhibitor her.
Eine weitere technische Schwierigkeit mit Protokollen für endothelisierte Implantate besteht darin, daß die Bindungs-(Plattierungs-) Effizienz der Endothelzellen an das prothetische Implantat relativ gering ist. Frühere Versuche, dies zu verbessern, zielten darauf ab, die Zusammensetzung der Implantatoberfläche zu modifizieren und waren von begrenztem Erfolg. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Gen in Endothelzellen einzuführen, das für einen Membranrezeptor kodiert. Das Lumen des prothetischen Gefäßes kann dann mit dem Ligand für den Rezeptor beschichtet werden, wodurch die Bindung der Endothelzellen an die Lumen-Oberfläche über die Membran-Rezeptor/Ligand Wechselwirkung erleichtert wird.
Genetisch modifizierte Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, um die Thrombogenizität von mit Endothelzellen bedeckten prothetischen Implantaten zu verringern. Der Mechanismus der Bildung von Gerinnseln beruht vermutlich auf einer Blutplättchenadhäsion gefolgt von der Ablagerung von Fibrin und der Ausbreitung des Gerinnsels. Dies könnte minimiert oder möglicherweise verhindert werden, indem man die Transplantate mit genetisch manipulierten Endothelzellen besät, die ein thrombolytisches Agens (z. B. ein Agens, das die Gerinnsel auflöst, wie Gewebe-Plasminogen Aktivator (TPA) oder Streptokinase) sezernieren. Eine effizientere Methode würde darin bestehen, eine modifizierte Form von TPA zu kreieren, die auf der Endothelzellmembran haften bleibt, anstatt ins Medium abgeben zu werden. In diesem Fall würden die thrombolytischen Agentien im Gefäß-Lumen konzentriert werden, wo sie den größten Effekt ausüben würden.

Verwendung von modifizierten Endothelzellen zur Abgabe eines Produktes an ein Körperglied oder Organ

Die Erfindung kann auch dazu verwendet werden, um in Endothelzellen Gene einzuführen, die Faktoren abgeben, die nützlich für ein Körperglied oder Organ sein würden, das über Arterien, die die Prothese enthalten, versorgt wird. Zum Beispiel besteht ein allgemeines klinisches Problem in der Anwesenheit von ausgedehnten Verengungen bei kleinen Gefäßen distal zur Stelle des prothetischen Gefäßes. Dies ist charakteristisch für Gefäßerkrankungen, die mit Diabetes mellitus einhergehen. Die Revaskularisation von größeren Gefäßen mit Implantaten führt zu einer unvollständigen Wiederherstellung der Perfusion zu dem betroffenen Körperglied oder Organ. Man könnte einen vermehrten Gefäßdurchfluß zu dem beeinträchtigten Gewebe bewirken, indem man die Entwicklung der kollateralen Zirkularisation des benachbarten nicht betroffenen Gewebes fördert. In begrenztem Ausmaß geschieht dies auf natürliche Weise. Jedoch könnte der gesamte Prozeß der Kollateralisierung beschleunigt und weit mehr erweitert werden, wenn die Endothelzellen in dem betroffenen Bereich einen oder mehrere Faktoren abgeben würden, die die Angiogenese fördern. Die Gene vieler dieser Angiogenese-Faktoren sind kloniert worden und können in Endothelzellen eingeführt werden (zum Beispiel unter Verwendung eines Retrovirus, dessen Genom das gewünschte Gen enthält). Die Applikation des/der Angiogenese-Faktors/en würde auf das Organ oder Körperglied gerichtet werden, das von der Arterie versorgt wird, die das Transplantat enthält. Die effektive Konzentration des Faktors würde in dem betroffenen Gewebe verhältnismäßig hoch sein, jedoch niedrig im gesamten Kreislauf, da er im venösen Kreislauf bei seiner Rückkehr zum Herz verdünnt werden würde. Auf diese Weise sollte es möglich sein, einen therapeutischen Effekt in dem erkrankten Organ oder Körperglied ohne systemische Nebeneffekte zu erhalten. Ein anderer Weg, um den Gefäßfluß zu einem beeinträchtigten Körperglied oder Organ weiter zu fördern, besteht in der maximalen Erweiterung aller afferenten Gefäße. Versuche, dies mit oral oder parenteral zu verabreichenden Arzneistoffen durchzuführen, hatten nur einen geringen therapeutischen Nutzen und waren begleitet von vielen systemischen Nebenwirkungen. Dies ist zum Teil durch die Tatsache begründet, daß der Vasodilator nicht gezielt zu dem geeigneten Gewebe gelangt. Endothelzellen, die so manipuliert werden, daß sie einen potenten Vasodilator wie den Atrialen-Natriuretischen-Faktor absondern, stellen einen alternativen Weg dar. Bei dieser Anwendung kann das betroffene Organ oder Körperglied mit arteriellem Blut perfundiert werden, das eine sehr hohe Konzentration eines Vasodilators enthält. Dies führt zu einem Ansteigen der gesamten Gefäßperfusion. Der Vasodilator wird jedoch bis zu seiner Rückkehr zum Herz auf nichtpharmakologische Konzentrationen verdünnt. Dadurch beugt man den vielen systemischen Nebenwirkungen von Vasodilatoren vor, wie sie bei nicht-selektiver Applikation auftreten.

Die Verwendung von modifizierten Endothelzellen als Applikationssystem

Die vorliegende Erfindung gestattet es, Endothelzellen genetisch so zu manipulieren, daß sie ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid erzeugen, z. B. ausgewählte Proteine oder Polypeptide, die normalerweise in Endothelzellen nicht in biologisch signifikanten Mengen erzeugt werden, und diese in den Blutstrom oder einen anderen Bereich des Körpers (z. B. das zentrale Nervensystem) abgeben. Die Endothelzellen, die auf diese Weise entstanden sind, können als kontinuierliches Medikamenten-Applikationssystem dienen, um derzeit verfügbare Therapien zu ersetzen, die eine periodische Verabreichung (durch Einnehmen, Injektion, etc.) der benötigten Substanz erfordern.
Zum Beispiel kann die Erfindung dazu verwendet werden, um eine kontinuierliche Applikation von Insulin zu ermöglichen, das gegenwärtig aus der Bauchspeicheldrüse isoliert, umfassend aufgereinigt und dann in den Körper des Patienten injiziert werden muß, dessen Insulinproduktion oder -verwertung beeinträchtigt ist. Auf diese Weise kann Insulin über ein kontinuierliches Medikamenten-Applikationssystem eingeführt werden. Somit kann die tägliche Injektion von Insulin entfallen.
Genetisch manipulierte Endothelzellen können auch für die Erzeugung von Gerinnungsfaktoren verwendet werden. Hämophilie-Patienten fehlt das Protein Faktor VIII, das an der Blutgerinnung beteiligt ist. Faktor VIII wird derzeit durch Injektion verabreicht. Endothelzellen, die ein Gen enthalten, das für Faktor VIII kodiert, können zur Herstellung eines Implantats verwendet werden, in dem sie Faktor VIII synthetisieren; in Form eines Implantats würde das Gewebe den Faktor in den Blutstrom abgeben. Die Einführung von gewünschtem genetischen Material in Endothelzellen kann bei der Behandlung von Erbkrankheiten und in der Behandlung von erworbenen Krankheiten besonders wertvoll sein. Im Fall von Erbkrankheiten wird dieser Weg verwendet, um genetisch modifizierte Endothelzellen oder andere Zellen bereitzustellen, die als Stoffwechsel-Halde verwendet werden. Das heißt, solche Endothelzellen würden dazu dienen, eine potentiell toxische Substanz abzubauen. Zum Beispiel werden transduzierte Endothelzellen bei der Behandlung von Harnstoff- Zyklus-Störungen verwendet. Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können auch bei der Behandlung von genetischen Krankheiten eingesetzt werden, bei denen ein Produkt (zum Beispiel ein Enzym oder Hormon), das normalerweise vom Körper hergestellt wird, nicht oder nur in unzureichender Menge hergestellt wird. Hier können Endothelzellen, die mit einem Gen transduziert wurden, das für das fehlende oder nur unzureichend hergestellte Produkt kodiert, dazu verwendet werden, dieses n ausreichenden Mengen zu produzieren. Dies kann zum Beispiel zur Erzeugung von alpha-1 Antitrypsin eingesetzt werden. Es kann auch zur Erzeugung von Faktor VIII und Faktor IX verwendet werden und würde auf diese Weise zur Behandlung von Hämophilie nützlich sein. Es gibt viele erworbene Krankheiten, die durch Verwendung von genetisch manipulierten Endothelzellen behandelt werden können (d. h., Endothelzellen, die mit dem gewünschten genetischen Material transduziert worden sind). Solche Zellen können zum Beispiel bei der Behandlung von Anämie eingesetzt werden, die häufig als chronische Krankheit existiert und oft mit chronischem Nierenversagen assoziiert ist (zum Beispiel bei Hämodialyse-Patienten). In diesem Fall würden Endothelzellen, die ein für Erythropoietin kodierendes Gen enthalten, die Anämie durch eine Stimulierung des Knochenmarks korrigieren, um die Erythropoesezu erhöhen (d. h. die Produktion der roten Blutzellen).
Die Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können auch dazu verwendet werden, um eine niedrige Dosis von Gewebeplasminogenaktivator zu verabreichen, um die Bildung von Thromben zu verhindern. In diesem Fall würden Endothelzellen, in die genetisches Material eingeführt wurde, das für TPA kodiert, in ein Individuum transplantiert werden, in dem die Thrombenbildung verhindert werden soll. Dies würde zum Beispiel als vorbeugende Maßnahme gegen allgemeine Krankheiten nützlich sein, wie Koronararterien-Erkrankungen, Gehirngefäß- Erkrankungen, periphere Gefäßverschluß-Erkrankungen, Venenthrombosen (z. B. bei oberflächlichen Venen), wie die bei Lungenembolien beobachteten, oder tiefe Venenthrombosen. Endothelzellen, die für Calcitonin kodierende DNA enthalten, können bei der Behandlung der Paget-Krankheit, einer fortschreitenden chronischen Krankheit des Knochenstoffwechsels, angewendet werden. Gegenwärtige Behandlungen beruhen auf der subkutanen Verabreichung von Calcitonin.
Endothelzellen, die dazu manipuliert wurden, um Interleukine herzustellen und zu sezernieren (zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-3), können in verschiedenem Zusammenhang verwendet werden. Zum Beispiel haben einige derzeit angewendete Therapien (z. B. Chemotherapien) die Induktion einer Neutropenie zu Folge (die Anwesenheit einer abnormal niedrigen Anzahl von Neutrophilen im Blut), die oft durch die direkte Suppression des Knochenmarks verursacht wird. So führt zum Beispiel die Verwendung praktisch aller Chemotherapeutika, sowie von AZT, das in der Behandlung von AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome; erworbenes immun-Schwäche-Syndrom) verwendet wird, zur Neutropenie. Dieser Zustand führt zu zahlreichen lebensbedrohenden Infektionen. In diesen Fällen kann die Verabreichung von z. B. IL-3 durch Implantation von Endothelzellen, die for IL-3 kodierendes genetisches Material enthalten, dazu verwendet werden, die Anzahl der Neutrophilen zu erhöhen. Außerdem kann die Verabreichung von Thrombopoietin, das die Blutplättchenproduktion stimuliert, bei der Behandlung von zahlreichen Zuständen, in denen die Blutplättchenanzahl erniedrigt ist, verwendet werden. In diesem Fall können Endothelzellen, die mit einem Gen für Thrombopoietin transduziert wurden, bei einem Individuum angewendet/implantiert werden; Produktion und Abgabe des kodierten Produktes wird zur Stimulation der Plättchenproduktion führen.
Eine andere verwandte Verwendung von Endothelzellen, in die genetisches Material eingefügt wurde, besteht in der Behandlung von AIDS. Interleukin 2 und Interleukin 3, die das Immunsystem stimulieren, sind potentiell wertvoll zur Behandlung von AIDS. Sie könnten über ein Gefäßimplantat appliziert werden, das Endothelzellen enthält, die zur Erzeugung dieser zwei Polypeptide, die derzeit über periodische Injektion verabreicht werden, genetisch manipuliert worden sind. Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in der Behandlung von Enzymdefekt-Erkrankungen. In diesem Fall wird das Produkt, das von einem in die Endothelzellen eingeführten Gen kodiert wird, nicht wie im Falle von Hormonen sezerniert. Vielmehr handelt es sich um ein Enzym, das in der Zelle verbleibt. Es gibt viele Fälle von genetisch bedingten Krankheiten, bei denen einem Individuum ein besonderes Enzym fehlt und es verschiedene Aminosäuren oder andere Stoffwechselprodukte nicht metabolisieren kann. Die intakten Gene für dieses Enzym könnten in ein Endothelzell-lmplantat eingeführt werden; das Implantat würde dann diese Stoffwechsel-Funktion übernehmen. Zum Beispiel gibt es eine genetisch bedingte Krankheit, bei der den Betroffenen das Enzym Adenosindesaminase fehlt. Dieses Enzym ist am Abbau von Purinen zu Harnsäure beteiligt. Es könnte unter Anwendung der vorliegenden Erfindung möglich sein, ein Implantat herzustellen, das in der Lage ist, das fehlende Enzym in ausreichend hohen Mengen zu erzeugen, um das Blut bei seinem Durchfluß durch den Teil des Körpers zu entgiften, in den das Implantat eingesetzt wurde. Die vorliegende Erfindung ist auch in der Tiermedizin anwendbar. Es kann zum Beispiel bei der Verabreichung von Substanzen, wie Medikamenten (z. B. Antibiotika) und Hormonen an Tiere angewendet werden, die sonst durch Zusatz zum Futter oder zum Trinkwasser oder durch periodische Injektion verabreicht würden (zum Beispiel täglich, oder auch weniger häufig). Die Verwendung der modifizierten Endothelzellen der vorliegenden Erfindung besitzt den Vorteil, daß das Gewebe, das aus den modifizierten Zellen gebildet wird, in das Tier eingesetzt werden kann und kontinuierliche Mengen des kodierten Proteins liefert, wodurch die Notwendigkeit einer täglichen/periodischen Verabreichung der Substanz entfällt. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch in keiner Weise beschränkend sein sollen.

Beispiel 1

Produktion von menschlichem Parathyroidhormon in transduzierten Endothelzellen

In die BamHI-Klonierungsstelle des pLJ-Plasmids kann gewünschtes genetisches Material inseriert werden. Das gewünschte genetische Material kann DNA wie die vorstehend beschriebene sein.
Insbesondere ist eine Kopie des Gens, das für das menschliche Parathyroidhormon kodiert (hPTH), in diese Stelle (zum Beispiel in pLJ) auf folgende Weise kloniert worden: Das pLJ-Plasmid wurde mit BamHI gespalten und nachfolgend mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestinal phosphatase; CIP) behandelt. Sodann wurde der linearisierte Vektor über ein Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung von Glaspartikeln gereinigt. Außerdem wurde das BamHI- Fragment mit dem menschlichen PTH-Gen aus dem Plasmid ausgeschnitten, das die gesamte cDNA des menschlichen PTH, kloniert in pBR322, enthält und das von Hendy, G.N. et al.,PNAS USA, 78: 7365-7369 (1981) beschrieben wurde.
Ein Subfragment der PTH-cDNA, das 1 7 bp der 5'-nichttranslatierten Sequenz, die gesamte kodierende Sequenz und 31 bp der 3'-nichttranslatierten Sequenz enthält, wurde durch Verdau des Ausgangs-Plasmids mit DdeI und HinfI und Isolierung des 600 bp Fragment gewonnen. Das Fragment wurde mit DNA- Polymerase in Anwesenheit von Desoxynukleosidtriphosphaten inkubiert, um die überhängenden Enden aufzufüllen. BamHI-Linker wurden an die glatten Enden mit T4- Ligase ligiert. Ein authentisches BamHI-Restriktionsfragment wurde durch Verdau dieser Ligationsmischung mit BamHI erzeugt. Dieses wurde dann in die BamHI Schnittstelle von pBR322 subkloniert, bei dem es sich um das Plasmid handelt, das als hPTH-Quelle für die Vektor-Konstruktion verwendet wurde.
Gleiche Mengen des linearisierten pLJ-Rückrats und des BamHI-PTH-Fragments wurden in Anwesenheit von T4 DNA-Ligase zusammengefügt. Das resultierende Gemisch wurde unter Bedingungen gehalten, die für die Ligation der beiden Fragmente geeignet sind. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von HB101-Bakterien verwendet, die dann auf Kanamycin-haltigem Agar ausplattiert wurden; vgl. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, 1. Edition, pp. 250-251, 504; Bolivar, F. und K. Backman, Methods in Enzymology, R. Wu (ed.), Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979). Die so erhaltenen Kolonien wurden auf das rekombinante Plasmid hin untersucht. Parathyroidhormon ist ein Polypeptid, das eine Rolle in der Calciumregulation des Körpers spielt. Obwohl das hPTH-Gen in menschlichen Endothelzellen vorkommt, wird es in diesen Zellen nicht in biologisch signifikanten Mengen exprimiert. Endothelzellen, die in der Lage sind, ein Polypeptidhormon, wie hPTH, oder eine andere Substanz zu erzeugen, die normalerweise von solchen Zellen nicht in biologisch signifikanten Mengen hergestellt werden, können auf ein Individuum transplantiert oder in dieses implantiert werden und als kontinuierliches Versorgungs- System für Hormone oder andere Substanzen dienen. Die Psi-am-Zellen, die das rekombinante Virus-Konstrukt erzeugen, das die hPTH-kodierende DNA enthält, sowie DNA, die für einen selektierbaren Marker (wie das neo-Gen) kodiert, wurden dazu verwendet, virale Stocks zu erzeugen, wie vorstehend beschrieben. Der Virusstock wurde geerntet. Endothelzellen, die mit dem Virus transduziert werden sollten, das das hPTH-Gen enthält, wurden mit dem Stock inkubiert. In diesem Fall wird ein selektionierbarer Marker zur Identifizierung und Selektionierung transduzierter Endothelzellen verwendet, indem die Zellen in G418- haltigem Medium kultiviert werden. Wenn der Virustiter ausreichend hoch ist, werden praktisch alle Endothelzellen infiziert, und eine Selektion unter Verwendung eines selektierbaren Markers und eines geeigneten Mediums ist nicht nötig. Die Fähigkeit von Endothelzellen, die mit dem rekombinanten Retrovirus transduziert wurden, das das hPTH Gen enthält, das hPTH-Gen zu exprimieren, ist in vitro wie folgt bestimmt worden: Die in vitro-Produktion von hPTH durch Endothelzellen, die aus Rinderaorta hergestellt und mit einem das hPTH-Gen enthaltenden Virus infiziert wurden, wurde bestimmt. Die Endothelzellen von Rinderaorta stammten von einem Explantat aus der Aorta eines Kalbs. Die Zellen besitzen eine begrenzte Lebenszeit und werden als Sekundärkulturen bezeichnet. Die Endothelzellen aus der Rinderaorta wurden mit Virus infiziert und nicht, wie vorstehend beschrieben, in Neomycin selektioniert. Die transduzierten Endothelzellen aus der Rinderaorta wurden auf 10 cm Gewebekulturschalen ausgesät und bis zur Konfluenz kultiviert. Frisches Kulturmedium (DME mit 10% CS und Penicillin und Streptomycin) wurde dann hinzugefügt. Dieser Punkt wird nachfolgend als Zeitpunkt Null bezeichnet. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt, und die Zellen in bezug auf die Produktion von menschlichem PTH hin untersucht.
Die Aliquots wurden auf Anwesenheit von hPTH unter Verwendung eines Radioimmuno-Assays (Nichols) untersucht, der intaktes hPTH mißt. Diese Technik ist in Allegro TM Intact PTH/Immunoassay System for the Quantitative Determination of Human Intact Parathyroid Hormon in Serum, Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA (36B-21 70, Effective 7/86 Revised) beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird. Der Test hat eine Empfindlichkeit von etwa einem Nanogramm/Milliliter Serum (ng/ml) und ist nachweislich spezifisch für menschliches PTH, da er nicht mit PTH vom Kalb kreuzreagiert. Die Ergebnisse der Experimente werden als hPTH-Produktion, gemessen im RIA, pro Zeit dargestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle

Produktion von hPTH in transduzierten BAE Zellen

Zelle PTH-Produktion
Kontrolle BAE* 10 pg/10&sup6;/24h
Transduzierte BAE 6.3 ng/10&sup6;/24h
*BAE = Rinderaorten-Endothelzellen Bovine Aortic Endothelial cells)
Endothelzellen von einer Rinderaorta, transduziert nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit für hPTH kodierender DNA, sind bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Hinterlegungsnummer CRL9601 entsprechend dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.

Beispiel 2

Produktion von menschlichem LDL-Rezentor in transduzierten Endothelzellen

Die cDNA für den menschlichen LDL-Rezeptor (LDLR) wurde in den pEm-Vektor inseriert. Die cDNA für den LDLR wurde wie folgt für die Insertion in pEm hergestellt. LDLR-cDNA wurde aus dem Vektor pTZ1 (erhalten von Dr. Goldstein, University of Texas Health Science Center) durch Spaltung mit HindIII ausgeschnitten. Das 2.6 kb HindIII-Fragment, das die gesamte für LDLR kodierende Sequenz enthält, wurde mit Klenow-Fragment gebluntet und BcII-Oligonukleotid-Linker (von NEB) wurden an die cDNA mit T4 DNA Ligase ligiert. Schließlich wurde dieses Ligationsgemisch mit einem Überschuß an BcII-Enzym verdaut und das Fragment über ein Agarosegel aufgetrennt und gereinigt. Dieses wurde in die BamHI-Klonierungsstelle von pEm wie folgt inseriert. pEm wurde mit BamHI gespalten und das linearisierte Plasmid mit alkalischer Phosphatase (CIP) verdaut. Gleiche Mengen von mit Linkern versehenem LDLR-Insert und pEm-Rückrat wurden gemischt und mit T4 Ligase ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um HB101 zu transformieren und Ampicillinresistente Kolonien wurden auf den geeigneten retroviralen Vektor hin analysiert. Der pEm-LDLR-Vektor wurde in die Psi-am-Zellinie transfiziert und Klone, die ein hohes Maß an rekombinanten Viren erzeugten, wurden identifiziert. Virale Stocks wurden verwendet, um Kulturen von Endothelzellen von Rinderaorten zu identifizieren, wie für PTH beschrieben. Die Analyse der LDLR Expression in vitro wurde wie folgt durchgeführt: konfluente Platten von transduzierten oder Kontroll-Endothelzellen von Rinderaorten wurden mit LDL, das mit einem fluoreszierenden Marker konjugiert worden war (erhalten von Biomedical Tech Inc., Stoughton, MA) mit einer Konzentration von 10 ug/ml für ungefähr 8 Stunden inkubiert. Sodann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 0.5% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Sie wurden dann bezüglich der Aufnahme von fluoreszenz-markiertem LDL (*LDL) unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Das Ergebnis dieses Experiments ist in Abbildung 4 dargestellt. Wie das relative Fehlen der *DL-Aufnahme in nichtinfizierten Zellen beweist, ist die Menge des endogenen LDLR dort niedrig (siehe 4B). Jedoch nehmen in Kulturen, die mit LDLR-Virus infiziert wurden, ungefähr 30% aller Zellen nachweisbare Mengen an *LDL auf, was die effiziente Expression des exogenen LDLR dokumentiert (siehe 4D).

Beispiel 3

Produktion von β-Galactosidase in transduzierten Endothelzellen

Das Gen, das für die β-Galactosidase von E. coli kodiert, wurde in pLJ inseriert. Dieser Vektor wurde in die Psi-am-Zellinie transfiziert, was zur Produktion von retroviralen Stocks mit hohen Titern führte. Die Konstruktion dieses Vektors und die Isolierung der Erzeuger-Zellinie ist von Price, J. et al., PNAS USA, 84: 156-160 (1987) beschrieben worden. Virusstocks, die für das β-Galactosidase-Gen kodieren, wurden verwendet, um Endothelzellen von Rinderaorten, wie bereits beschrieben, zu infizieren. Die infizierten Kulturen wurden auf β-Galactosidase-Expression untersucht durch Verwendung einer histochemischen Färbung in situ; siehe Price et al. a.a.0. Die Kulturen wurden vor und nach Selektion mit G418 untersucht. Der in diesem Experiment verwendete retrovirale Vektor exprimiert sowohl β-Galactosidase, als auch das neo-Gen, das Resistenz gegen G418 verleiht. Die histochemische Färbung wurde, wie bei Price et al. beschrieben, durchgeführt. Die Zellkulturen wurden in 0.5% Glutaraldehyd in PBS für 5 Minuten fixiert, mit PBS gewaschen und der Reaktionsmischung für mindestens 12 Stunden ausgesetzt. Das Reaktionsgemisch enthält ein Substrat für β-Galactosidase, das nach Hydrolyse, blau wird und in den Zellen präzipitiert. Infolgedessen färbt sich jede Zelle blau, die die viral kodierte β- Galactosidase exprimiert. Das Ergebnis dieses Experiments ist in Abbildung 5 dargestellt. In Kulturen, die nicht dem Virus ausgesetzt wurden, wird keine β- Galactosidase-Aktivität nachgewiesen (Abbildung 5A); infizierte Kulturen zeigen β- Galactosidase-Aktivität in ungefähr 30% der Zellen (Abbildung 5B). Diese transduzierten Zellen werden ausselektioniert, indem sie in Anwesenheit von G418 inkubiert werden.

Beispiel 4

Produktion von β-Galactosidase in transduzierten Endothelzellen auf der Oberfläche von Gefäßtransplantaten, die in Hunde eingesetzt wurden

Endothelzellen wurden enzymatisch von den externen Drosselvenen von erwachsenen 20-25 kg schweren Mischlingshunden geerntet. Die Zellen eines jeden Tieres wurden in zwei Aliquots geteilt; eines zur Infektion mit replikationsdefekten Retroviren (siehe nachstehend) und das andere zur Scheininfektion. Die enzymatisch geernteten Zellen wurden verwendet, um Primärkulturen herzustellen. Die Endothelzellen wurden auf mit Fibronektin beschichteten Flaschen ausplattiert und über zwei Reihenpassagen über einen Zeitraum von 10-14 Tagen in M199 Medium gehalten, das mit 5% Plasma, Penicillin, Streptomycin, Heparin und ECGF ergänzt worden war. Während dieses Zeitraums wurden die Zellen alle drei Tage (18 Stunden/Exposition) frischen Virusstocks ausgesetzt, denen Polybrene zugefügt worden war (8 pg/ml). Am Ende der zweiten Passage wurden die Zellen geerntet und Aliquots entweder direkt untersucht, tiefgefroren oder dazu verwendet, um 6 cm·4 mm Dacron TM Feingewebe-Transplantate (CR BARD, Billerica, MA) nach einer Modifikation der 4-Stufen Methode von Yates zu besäen (während des zweiten und dritten Schrittes wurden dem autologen Blut 0.75·10&sup6; Zellen zugefügt). Die Tiere wurden betäubt und 6 cm Segmente von beiden Carotisarterien, wie beschrieben, durch besäte Transplantate ersetzt. Jedes Tier erhielt ein Implantat, das mit infizierten Endothelzellen besät war, und ein kontralaterales Transplantat, das mit scheininfizierten Zellen besät war. Fünf Wochen nach der Implantation wurden die Tiere betäubt und die Transplantate explantiert und untersucht. Replikationsdefekte Retroviren mit amphotropem Wirtsbereich wurden für die stabile Einführung eines Reportergens in die genomische DNA der Endothelzellen verwendet. Das lac Z-Gen wurde als Reportergen verwendet, da sein Expresssionsprodukt, β-Galactosidase, in situ durch die Verwendung von Enzymhistochemischen Untersuchungen nachgewiesen werden kann, die das zelluläre Cytoplasma blau färben (Beispiel 3). Die Effizienz der retroviralen Infektion wurde über Southern-Analyse abgeschätzt, die provirale Sequenzen nachweist, sowie durch die cytochemische Färbung bezüglich viral exprimierter β-Galactosidase, die infizierte Zellen in situ nachweist.
In diesen Studien wurden zwei rekombinante Retroviren verwendet. Der BAG- Vektor ist zuvor von Price et al., PNAS USA, 84: 156-160 (1987) beschrieben worden. Das BAG-Virus, das das lac Z-Gen enthält, exprimiert β-Galactosidase vom 5'-LTR (Long Terminal Repeat) und von einem von SV40 abgeleiteten Promotor einen selektionierbaren Marker (Neo), der Prokaryonten Neomycin-Resistenz und Eukaryonten Resistenz gegen G418 verleiht. Annähernd 5-15% der Endothelzellen, die dem BAG-Virus ausgesetzt wurden, waren infiziert (zusammengefaßt in Tabelle II); die Kultivierung dieser Kulturen in einem Medium, dem das Aminoglykosid G418 zugefügt wurde, führte zur wirkungsvollen Selektion der transduzierten Zellen.
Der BAL-Vektor stammt von dem zuvor beschriebenen BAL-LDLR-Vektor ab, jedoch wurden die LDLR-cDNA-Sequenzen gegen die kodierende Sequenz des E. coli-β-Galactosidase-Gens ausgetauscht. Das BAL-Virus, das einen höheren Titer besitzt und das lac Z-Gen enthält, exprimiert die β-Galactosidase von einem Promotor, der vom β-Actin-Gen des Huhns abstammt. Annähernd 50% der Zellen, die dem BAL-Virus ausgesetzt wurden, wurden transduziert, was über Southern- Analyse und histochemische Färbung bezüglich β-Galactosidase in situ gemessen wurde.
In der Southern-Analyse wurde hochmolekulare DNA isoliert und ein Aliquot (10 ug) mit KpnI gespalten, dann auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, auf Zetabind übertragen und mit einem 1200 bp ClaI/EcoRI-Fragment hybridisiert, das nach der Methode von Feinberg und Volt so markiert worden war, daß es eine hohe spezifische Aktivität hatte.
Die cytochemische Charakterisierung von kultivierten Endothelzellen wurde sowohl durch Phasenkontrast- als auch Fluoreszensmikroskopie gezeigt. Mit Retrovirus infizierte Endothelzellen wurden zur Zeit des Aussäens und nach der Entfernung des implantierten Transplantates bezüglich der Aufnahme von DIL-AC-LDL und der Expression viral gesteuerter β-Galactosidase untersucht. Zellen vor der Aussaat und nach der Implantation, die mit DIL-AC-LDL beimpft worden waren, wurden durch Verwendung von Phasenkontrast und Fluoreszensmikroskopie untersucht. Zellen vor der Aussaat und nach der Implantation wurden ebenfalls bezüglich der Expression der viral gesteuerten β-Galactosidase hin untersucht. Zum Zeitpunkt der Aussaat wurden die Kulturen auf endothelzell-spezifische Funktion hin untersucht (zum Beispiel Aufnahme von acetyliertem LDL und Anwesenheit des von Willebrand-Faktors) und auf die Anwesenheit von Antigenen, die für glatte Muskelzellen spezifisch sind. Diese Untersuchung zeigte, das mehr als 98% der Zellen eines jeden Isolates aus funktionstüchtigen Endothelzellen bestand. Bei dem Untersuchungssystem handelte es sich um eine Abwandlung des zuvor beschrieben Hunde-Modells, das dafür verwendet wurde, um die Transplantatrepopulation zu studieren. Die Hunde 1-3 erhielten Implantate, die mit BAG-infizierten, nichtselektionierten Endothelzellen besät worden waren, während die Hunde 4-7 anfänglich Implantate erhielten, die mit BAL-infizierten nichtselektionierten Endothelzellen besät wurden. Während diese Experimente im Gange waren, wurden die Endothelzellen der Hunde 4-7 auch mit dem BAG-Virus infiziert und in Kultur in Anwesenheit oder Abwesenheit von G418, einem Aminoglykosid, das BAG- transduzierte Zellen ausselektioniert, vermehrt. Nach 5 Wochen wurden die Transplantate für die Untersuchung explantiert und neue Transplantate wurden in die Hunde 4-7 implantiert (bezeichnet als Hund 4'-7'). Jeder dieser Hunde erhielt ein Transplantat, besät mit Endothelzellen, die mit dem BAG-Virus infiziert und in G418 selektioniert wurden, und ein kontralaterales Transplantat, besät mit BAG infizierten, nicht-selektionierte Endothelzellen. Die zweite Reihe der Transplantate wurde nach 5 Wochen wieder explantiert. Tabelle II faßt die Ergebnisse dieser Experimente zusammen. Die Tiere 4' bis 7' stellen das zweite Experiment dar, das an den Tieren 4 bis 7 durchgeführt wurde (siehe Text) BAG-U stellt BAG infizierte Endothelzellen dar, die nicht mit G418 auf transduzierte Zellen selektioniert wurden. BAG-S stellt BAG infizierte Endothelzellen dar, die mit G418 auf transduzierte Zellen selektioniert wurden. BAL stellt BAL- infizierte Endothelzellen dar, MOCK stellt scheininfizierte Zellen dar. E ist ein Indikator für die Effizienz der Infektion, wie sie über β-Galactosidase-Färbung bestimmt wurde. Der Durchfluß des Transplantates nach 5 Wochen wird mit einem (J) für ja oder einem (N) für nein bezeichnet. Die Bedeckung des Transplantates ist ein Anzeichen für die prozentuale Oberflächenrepopulation, die über Raster-Elektronenmikroskopie gemessen wurde. Tabelle II. Zusammenfassung der Implantationsexperimente Tier + Experimentelles Transplantat + Kontroll-Transplantat Infektion Explantat Infektion Explantat Virus E Offen Bedeckung Virus E Offen Bedeckung
Die Untersuchung der explantierten Transplantate ergab, daß nach 5 Wochen 1 8 von 22 durchgängig blieben. Raster-Elektronenmikroskopie zeigte eine Bedeckung der Zellen mit endothel-ähnlicher Morphologie auf der luminalen Oberfläche bei 14 von 18 durchgängigen Transplantaten. Falls vorhanden, war die Auskleidung mit Endothelzellen unvollständig (50-90% der gesamten Oberfläche) und ihre Verteilung flickenartig mit einer geringen Anzahl von Zellen entlang den Spitzen des gekräuselten Dacron-Transplantats. Ein Teil von jedem Transplantat wurde fixiert, gefärbt zum Nachweis von Zellen, die viral-gesteuerte β-Galactosidase exprimieren, und über ein hochauflösendes Präparationsmikroskop mit einer 750fachen Vergrößerung sichtbar gemacht. Jedes Transplantat, das mit infizierten Endothelzellen besät worden war, das offen geblieben war und luminale Zellen behalten hatte, enthielt β-Galactosidase-positive Zellen auf dem Lumen des Gefäßes. Kontralaterale Transplantate, die mit scheininfizierten Endothelzellen besät worden waren, zeigten nie positive gefärbte Zellen. Die in situ-Analyse der Transplantate wurde für viral-transduzierte Zellen durchgeführt. Längsschnitte der genetisch manipulierten Implantate wurden auf Zellen hin untersucht, die die viral-gesteuerte β-Galactosidase exprimiert. Die Transplantate wurden der Länge nach aufgeschnitten und ein Teil in 0.5% Glutaraldehyd für 5 Minuten fixiert, dreimal in PBS gewaschen und für 2 Stunden in X-Gal-Lösung inkubiert. Die luminale Oberfläche wurde mit einem Leitz Präparationsmikroskop fotografiert. Das Transplantat wurde in der Aufsicht sichtbar gemacht und einige interessante Aspekte des Besiedlungsmusters konnten beobachtet werden. Die Dichte der transduzierten Zellen war in den Vertiefungen des gekräuselten Transplantationsmaterials am größten. Dies wurde bei geringer Vergrößerung in Form von Ringen blau gefärbter Zellen beobachtet, die die Spalten der gezackten Oberfläche bedeckten und mit den Schwankungen der Repopulation der Oberfläche durch Endothelzellen übereinstimmten, wie sie mittels Raster- Elektonenmikroskopie sichtbargemacht wurden. Darüber hinaus bestanden keine regionalen Schwankungen in der Dichte oder dem Verteilungsmuster der transduzierten Zellen in bezug auf die Nähe zur distalen oder proximalen Anastomose. Schließlich erschien in allen Fällen der Anteil an luminalen Zellen, die β-Galactosidase positiv waren, qualitativ geringer zu sein, als in der Präparation von β-Galactosidase positiven Zellen, die ausgesät worden war. Zellen wurden von der luminalen Oberfläche von Teilen der Transplantate enzymatisch geerntet, um eine genauere Charakterisierung zu erlauben. Primäre Zellkulturen wurden etabliert und in vitro vor der Untersuchung für etwa 2-3 Wochen vermehrt. Genetisch modifizierte Endothelzellen wurden in dieser Population über Southern-Analyse und durch die cytochemische Untersuchung bezüglich viral exprimierter β-Galactosidase identifiziert. Die Mehrzahl der Zellen, die von dem Transplantat geerntet und in vitro vermehrt wurden, behielt eine differenzierte Endothelfunktion (weniger als 95%). Der Anteil der Zellen, die viral gesteuerte β-Galactosidase exprimierten oder provirale Sequenzen enthielten, war jedoch durchweg verringert im Vergleich zu Kulturen, die zum Zeitpunkt des Besäens untersucht wurden. Dieser Unterschied wird zum Teil durch die teilweise Repopulation des Transplantates mit endogenen Zellen verursacht, die durch die Zwischenräume oder von Anastomosen her einwachsen.

Industrielle Anwendbarkeit

Diese Erfindung besitzt industrielle Anwendbarkeit zur Verbesserung der Leistung (zum Beispiel Haltbarkeit, Öffnungsquerschnitt, Thrombogenizität) von Gefäßtransplantaten aus synthetischem Material, die oft zur Behandlung von fortgeschrittenen arteriosklerotischen Krankheiten verwendet werden. Sie ist ferner nützlich zur Verabreichung von Hormonen, Enzymen und Medikamenten an Säuger, einschließlich Menschen, die solche Substanzen benötigen. Zum Beispiel kann die Erfindung verwendet werden, um eine kontinuierliche Applikation eines Hormons zu ermöglichen, das andernfalls intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht würde. Die Erfindung ist besonders wertvoll zur Verabreichung von Substanzen, die über einen längeren Zeitraum benötigt werden.

Äquivalente

Der Fachmann wird zu den hier im speziellen beschriebenen Ausführungsformen viele Äquivalente erkennen, oder diese, ohne mehr als Routineexperimente durchführen zu müssen, auffinden können. Solche Äquivalente sollen durch den Umfang der folgenden Patentansprüche mit abgedeckt werden.

Claims

1. Endothelzellen (z. B. menschliche Endothelzellen) zur Verwendung in der Therapie, wobei die Zellen stabil eingeführtes genetisches Material enthalten,

das für ein gewünschtes Produkt kodiert, und wobei die Zellen in der Lage sind,

das genetische Material zur Herstellung des kodierten Produkts zu exprimieren.

2. Verwendung von Endothelzellen (z. B. menschlichen Endothelzellen) zur Herstellung eines Arzneistoffs zur Verwendung in der Therapie, wobei die Zellen stabil eingeführtes genetisches Material enthalten, das für ein gewünschtes Produkt kodiert, und wobei sie in der Lage sind, das genetische Material zur Herstellung des kodierten Produkts zu exprimieren.

3. Endothelzellen nach Anspruch 1 oder deren Verwendung nach Anspruch 2, bei denen das eingeführte genetische Material DNA oder RNA ist, die jeweils allein oder in irgendeiner Kombination davon

(a) normalerweise nicht in Endothelzellen vorkommt,

(b) normalerweise in Endothelzellen vorkommt, jedoch in diesen nicht in biologisch signifikanten Mengen exprimiert wird,

(c) normalerweise in Endothelzellen vorkommt und so modifiziert worden ist, daß sie in Endothelzellen exprimiert wird oder

(d) modifiziert werden kann, so daß sie von Endothelzellen exprimiert wird.

4. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei denen das eingeführte genetische Material kodiert für

(a) ein Hormon, z. B. menschliches Parathyroidhormon,

(b) ein Enzym, z. B. ein intrazelluläres Enzym, z. B. β-Galactosidase,

(c) einen Arzneistoff,

(d) einen (dominanten) Selektionsmarker, der z. B. für Antibiotikaresistenz kodiert, z. B. ein neo-Gen,

(e) ein Protein oder Polypeptid, das von den Zellen sekretiert wird, oder

(f) einen Membranrezeptor, z. B. den Low-density-Lipoproteinrezeptor. Endothelzellen oder deren Verwendung nach Anspruch 4 zur Bereitstellung des Hormons, Enzyms oder Arzneistoffs für den Körper durch

(a) Einführen der Endothelzellen in den Körper oder

(b) Applikation der Endothelzellen auf eine Oberfläche des Körpers.

5. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei denen das genetische Material, das für das gewünschte Produkt kodiert, durch Transduktion stabil inkorporiert wurde.

6. Endothelzellen oder deren Verwendung nach Anspruch 6, bei denen die Transduktion mittels eines Retrovirus erfolgt, der ein rekombinantes Genom besitzt, umfassend

(a) genetisches Material, das für das gewünschte Produkt kodiert,

(b) die Long-terminal-repeat-Sequenzen, die tRNA-Bindungssequenz und die Psi-Verpackungssequenz, abgeleitet von einem amphotropen Retrovirus

und

(c) mindestens einen Promotor eukaryontischen Ursprungs, der z. B. durch ein externes Signal reguliert werden kann.

8. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei denen das genetische Material für ein thrombolytisches Protein oder einen Teil davon kodiert, z. B. Gewebe-Plasminogenaktivator oder Streptokinase, zur Applikation auf ein synthetisches prothetisches Gefäß zur Verminderung seiner Thrombogenizität.

9. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei denen das genetische Material für ein Mitogen oder einen Wachstumsfaktor für Endothelzellen kodiert, zur Applikation auf die innere Oberfläche eines prothetischen Gefäßes unter Bedingungen, die für die Proliferation von Endothelzellen geeignet sind, um eine konfluente Schicht von Endothelzellen herzustellen, die die innere Oberfläche bedeckt.

10. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Aussäen auf die innere Oberfläche eines prothetischen Gefäßes bei subkonfluenter Zellzahl, zur Herstellung einer bedeckenden Schicht auf der inneren Oberfläche dieses Gefäßes, die Endothelzellen aufweist, die das für ein gewünschtes Produkt kodierende eingeführte genetische Material exprimieren.

11. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei denen das genetische Material für einen Membranrezeptor kodiert, der in der Lage ist, einen Liganden zu binden, wobei die Zellen zum Aussäen auf eine Oberfläche eines den Liganden tragenden Gefäßes geeignet sind, und wobei (unter Bedingungen, die für die Bindung des Liganden und des Membranrezeptors geeignet sind) die Bindung der Endothelzellen an die Oberfläche des prothetischen Gefäßes verstärkt wird.

12. Endothelzellen oder deren Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das genetische Material für ein Produkt kodiert, das das Wachstum glatter Muskelzellen inhibiert, zur Inhibition des Wachstums glatter Muskelzellen in einem synthetischen Gefäßimplantat.

13. Verfahren zur Herstellung der Endothelzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend

(a) Kontaktieren der kultivierten Endothelzellen mit Medien, die ein infektiöses Retrovirus mit einem rekombinanten Genom enthalten, das das gewünschte genetische Material umfaßt, und

(b) das Inkubieren der kultivierten Endothelzellen und der Medien, die das infektiöse rekombinante Retrovirus enthalten, unter Bedingungen, die für die Infektion der Endothelzellen durch das rekombinante Retrovirus geeignet sind.

14. Verfahren zur Herstellung der Endothelzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend

(a) das Transduzieren der kultivierten Endothelzellen mit genetischem Material, das für ein gewünschtes Produkt kodiert, und

(b) das Kultivieren der transduzierten Endothelzellen unter Bedingungen, die für ihr Wachstum geeignet sind.

15. Ein mit einer Schicht bedecktes prothetisches Gefäß, umfassend die Endothelzellen von Anspruch 1 0 zur Implantierung in einen Säuger, und Expression des inkorporierten genetischen Materials in dem Säuger.