JP7271465B2 - Ｍｈｃ多量体のバーコード標識による抗原認識の判定 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸で標識したＭＨＣ多量体による抗原認識に関する。
適応免疫系は、免疫細胞と抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージ）または標的細胞（例えば、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞または癌細胞）との間の特異的相互作用によって方向付けられる。免疫学の重要な分野では、免疫細胞と標的細胞との間の分子相互作用の理解に関する。
特にＴリンパ球（Ｔ細胞）では、この相互作用は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩとの間の結合によって仲介される。ＭＨＣ分子はペプチドカーゴを有し、このペプチドはＴ細胞認識に決定的な役割を果たす。１９９６年にＡｔｍａｎら（１）が、単一のペプチド－ＭＨＣ分子を四量体に多量体化することによりペプチド－ＭＨＣ分子とＴＣＲとの間に十分な結合の強さ（親和力）が得られ、ＭＨＣ－多量体と結合した蛍光標識によりこの相互作用を明らかすることが可能になることを発見したとき、Ｔ細胞認識の理解に劇的な技術的ブレークスルーをみた。このような蛍光標識ＭＨＣ多量体は（クラスＩおよびクラスＩＩ分子ともに）現在、Ｔ細胞特異性の判定に広く用いられている。例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡検査によってＭＨＣ多量体の蛍光を判定することが可能であり、あるいは、この蛍光標識に基づき、例えばフローサイトメトリーまたはビーズによる分取を用いてＴ細胞を選別することが可能である。しかし、この方法に課される制約として、利用可能な異なる蛍光標識の数に関するものがあり、それには、蛍光標識のそれぞれが問題のペプチド－ＭＨＣに特異的な符号としての役割を果たすという理由がある。
したがって、この戦略は、Ｔ細胞認識の莫大な多様性に十分に見合うものではない。Ｔ細胞のうち最も優勢なサブセット（αβＴＣＲ Ｔ細胞）では、個々のヒトの異なるＴＣＲの数はほぼ１０７であると推測されている（３）が、考え得る異なるαβＴＣＲの数は約１０１５であると推定されている（２）。このため、単一試料中に複数の異なるＴ細胞特異性を検出することを可能にするべく、Ｔ細胞判定の複雑度を拡大する試みに多大な努力が積み重ねられてきた。抗原特異的Ｔ細胞の多重検出に関する比較的最近の発明には、コードされたＭＨＣ多量体の組合せの使用がある。この技術は組合せ蛍光標識法を用いるものであり、最初に公開されたときには単一試料中に２８の異なるＴ細胞集団の検出することが可能であった（４、５）が、のちに新規な機器と重金属標識とを組み合わせることにより拡張され、単一試料中に約１００の異なるＴ細胞集団を検出することが可能になった（６）。
いくつかのグループが、いわゆるＭＨＣマイクロアレイを開発しようとしていることから、抗原特異的Ｔ細胞応答をより包括的に解析することが可能な新たな技術が必要とされていることが理解される。このようなシステムでは、Ｔ細胞特異性を蛍光色素によってコードするのではなく、空間的にコードする（７、８）。ＭＨＣマイクロアレイは有望なものではあるものの、広く採用されるには至っておらず、Ｔ細胞応答の多重測定、例えばエピトープ同定に価値があることを報告した例はない。
上記のことを考えれば、抗原特異的Ｔ細胞などの特異的抗原応答性細胞の検出、単離および／または同定の分野にはハイスループットな方法が必要である。
さらに、利用可能な試料の量が限られている場合が多いことを考えれば、当該技術分野には、単一試料中に複数種の特異的抗原応答性細胞、例えばＴ細胞などを検出、単離および／または同定することが可能な方法が必要である。
本発明は、免疫細胞の抗原特異性の判定および追跡に核酸バーコードを使用することである。
本発明の一態様では、核酸バーコードは、多量体化されてＭＨＣ多量体を形成する所与のペプチド－ＭＨＣ分子に特異的な標識としての役割を果たす。多量体は、ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ、ＣＤ１またはその他のＭＨＣ様分子からなるものであり得る。したがって、以降、ＭＨＣ多量体という用語を使用する場合、これにはあらゆるＭＨＣ様分子が含まれる。ＭＨＣ多量体は、異なる主鎖を介したペプチド－ＭＨＣ分子の多量体化により形成される。多量体には同時にバーコードが結合し、特定のペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的な標識としての役割を果たす。このようにして、最大１０００～１０，０００（または可能性としてさらに多数）の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体を混合し、血液をはじめとする生物学的標本のＴ細胞と特異的に相互作用させ、未結合のＭＨＣ－多量体を洗い流し、ＤＮＡバーコードの配列を決定することができる。目的とする細胞集団を選別する場合、バックグラウンドレベルを上回って存在するバーコードの配列により、所与の細胞集団中に存在する抗原応答性細胞を同定するためのフィンガープリントが得られる。各特異的バーコードの配列リード数は特異的Ｔ細胞の頻度と相関があり、その頻度は、リードの頻度とＴ細胞の投入頻度とを比較することによって推定することができる。この戦略により、Ｔ細胞認識の理解が広がり得る。
ＤＮＡバーコードは、抗原特異的Ｔ細胞に特異的な標識としての役割を果たし、例えば単一細胞分取、機能解析または表現型評価の後にＴ細胞の特異性を判定するのに用いることができる。このようにして、抗原特異性と、抗原特異的細胞のＴ細胞受容体配列（単一細胞シーケンシング法によって明らかにすることができる）ならびに機能および表現型の特徴の両方とを関連付けることができる。
さらに、この戦略は、複数の異なる（配列関連）ペプチド－ＭＨＣ多量体と、各ペプチド－ＭＨＣ多量体の細胞表面ＴＣＲとの結合への相対的寄与度を決定する所与のペプチド－ＭＨＣ多量体の結合親和力を有する所与のＴ細胞とを結合させることを可能にし得る。この特徴を適用することにより、オーバーラップするペプチドライブラリーまたはアラニン置換ペプチドライブラリーの使用によって所与のＴＣＲの精密な特異性／コンセンサス認識配列を決定することが可能である。現在用いられているＭＨＣ多量体ベースの技術では、このような決定は不可能である。
したがって、本発明の一態様は、
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
前記主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子とを含み、
前記核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する。
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
前記主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子とを含み、
前記核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する。
本発明の別の態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のサブセットを含み、ＭＨＣの各セットが、Ｔ細胞認識に決定的な役割を果たす異なるペプチドと、ＤＮＡ分子中の固有の「バーコード」領域と有する、組成物に関する。
本発明のまた別の態様は、
本発明による組成物と、
核酸分子を増幅させる１つまたは複数のセットのプライマーと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を提供することである。
本発明による組成物と、
核酸分子を増幅させる１つまたは複数のセットのプライマーと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を提供することである。
本発明のまた別の態様は、試料中の抗原応答性細胞を検出する方法であって、
本発明による１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または本発明による組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法を提供することである。
本発明による１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または本発明による組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法を提供することである。
さらなる態様は、様々な使用に関するものである。
（発明の詳細な説明）
これより、本発明を以下でさらに詳細に説明する。
これより、本発明を以下でさらに詳細に説明する。
定義
本発明をさらに詳細に記載する前に、最初に以下の用語および慣例を定義する。
本発明をさらに詳細に記載する前に、最初に以下の用語および慣例を定義する。
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ＭＨＣ：主要組織適合複合体
多量体ＭＨＣ：多量体主要組織適合複合体
ＭＨＣ：主要組織適合複合体
多量体ＭＨＣ：多量体主要組織適合複合体
核酸バーコード
この文脈では、核酸バーコードとは、１０～５０超のヌクレオチドの範囲の固有のオリゴヌクレオチド配列のことである。バーコードには、３’末端と５’末端の増幅配列および中央の固有の配列が共通して存在する。この配列は、シーケンシングによって明らかにすることが可能であるほか、所与の分子に特異的なバーコードとしての役割を果たし得る。
この文脈では、核酸バーコードとは、１０～５０超のヌクレオチドの範囲の固有のオリゴヌクレオチド配列のことである。バーコードには、３’末端と５’末端の増幅配列および中央の固有の配列が共通して存在する。この配列は、シーケンシングによって明らかにすることが可能であるほか、所与の分子に特異的なバーコードとしての役割を果たし得る。
シーケンシング
この態様では、シーケンシングは、例えば、増幅されたバーコード（ＰＣＲ産物）のシーケンシングを多数回反復（総リード数が例えば１００，０００リード）するディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングにも関連することが理解される。いずれのＤＮＡバーコードもほぼ同じ増幅特性を有するため、個々のバーコード配列のリード数はその増幅産物中の存在量と関係があり、それはさらに、増幅前の存在量を表す。したがって、総リード数に対する特定のバーコード配列のリード数は、被験試料中の抗原応答性細胞の存在と相関する。
この態様では、シーケンシングは、例えば、増幅されたバーコード（ＰＣＲ産物）のシーケンシングを多数回反復（総リード数が例えば１００，０００リード）するディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングにも関連することが理解される。いずれのＤＮＡバーコードもほぼ同じ増幅特性を有するため、個々のバーコード配列のリード数はその増幅産物中の存在量と関係があり、それはさらに、増幅前の存在量を表す。したがって、総リード数に対する特定のバーコード配列のリード数は、被験試料中の抗原応答性細胞の存在と相関する。
ここで、本発明についてさらに詳細に述べれば、ペプチド－ＭＨＣ分子、核酸（ＤＮＡ）バーコードおよび（任意選択の）蛍光標識を組み立てて、それぞれが含まれる所与のペプチド－ＭＨＣ分子に特異的なＤＮＡバーコードを有するＭＨＣ多量体のライブラリーを形成する方法を図１に記載する。図１Ａのバーコードは、ＤＮＡシーケンシングによって決定され得る固有の配列を有するよう設計されている。このほか、バーコードには、ＰＣＲ反応で全ＤＮＡバーコードを同時に増幅させることを可能にする増幅末端が共通で存在する。ＤＮＡバーコードは（例えば、多量体主鎖上のストレプトアビジンに結合するビオチンリンカーを介して）ＭＨＣ－多量体化主鎖と結合させる。図１Ｂは多量体主鎖を表す。これは、高分子の多量体化を可能にするものであればどのような主鎖であってもよい。主鎖は（任意選択で）、ペプチド－ＭＨＣ多量体の特異性とは無関係に細胞と結合するＭＨＣ多量体のプール全体を追跡する蛍光標識（アスタリスクによって示される）を有し得る。図１Ｃは、特異的ペプチドカーゴ（水平の線）を有する目的のペプチド－ＭＨＣ分子を表す。図１Ｄは、ＤＮＡバーコードを有する組み立てられたペプチド－ＭＨＣ多量体を表す。
多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）
本発明の一態様は、
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
前記主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子と
を含み、前記核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する。
本発明の一態様は、
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
前記主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子と
を含み、前記核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関する。
様々な種類の主鎖を用い得る。したがって、一実施形態では、主鎖分子は、多糖類、例えばデキストランなどのグルカンなど、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン多量体からなる群より選択される。当業者であれば、その他の代替的主鎖を見出し得る。
ＭＨＣは、様々な手段によって主鎖と結合させ得る。したがって、一実施形態では、ＭＨＣは、ストレプトアビジン－ビオチン結合またはストレプトアビジン－アビジン結合を介して主鎖と結合させ得る。同じく、その他の部分を用いてもよい。特異的結合は、特異的結合点を用いるものであり得る。別の実施形態では、ＭＨＣは、ＭＨＣ重鎖を介して主鎖と連結される。
ＭＨＣは様々な要素からなるものであり、その一部は細胞系で発現および精製され得るもの（例えば、ＭＨＣ重鎖およびβ－２－ミクログロブリン要素など）である。あるいは、諸要素を化学的に合成してもよい。特異的ペプチドは化学的に合成するのが好ましい。
ＭＨＣは様々な要素からなるものであり、その一部は細胞系で発現および精製され得るもの（例えば、ＭＨＣ重鎖およびβ－２－ミクログロブリン要素など）である。あるいは、諸要素を化学的に合成してもよい。特異的ペプチドは化学的に合成するのが好ましい。
安定なＭＨＣ（複合体）を作製するには３つの要素がいずれも必要である。したがって、一実施形態では、ＭＨＣを人為的に組み立てる。
多量体ＭＨＣは、様々な数のＭＨＣを含み得る。したがって、さらなる実施形態では、多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、少なくとも４個のＭＨＣ、例えば少なくとも８個、例えば少なくとも１０個、２～３０個、２～２０個、例えば２～１０個または例えば４～１０個などのＭＨＣからなる。
核酸成分（好ましくはＤＮＡ）は特殊な構造を有する。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも５’第一プライマー領域と、中央領域（バーコード領域）と、３’第二プライマー領域とからなる。このようにして、中央領域（バーコード領域）をプライマーセットにより増幅させることができる。核酸分子の長さも様々であり得る。したがって、別の実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、２０～１００ヌクレオチド、例えば３０～１００ヌクレオチド、例えば３０～８０ヌクレオチド、例えば３０～５０ヌクレオチドなどの範囲の長さを有する。核酸分子と主鎖との結合も様々なものであり得る。したがって、さらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、ストレプトアビジン－ビオチン結合および／またはストレプトアビジン－アビジン結合を介して前記主鎖と連結される。これ以外の結合部分を用いてもよい。
さらなる実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または人工ヌクレオチド、例えばＰＬＡもしくはＬＮＡなどを含むか、これよりなるものである。ＤＮＡが好ましいが、例えば安定性を増大させるため、ＤＮＡ以外のヌクレオチドを含んでもよい。
様々な種類のＭＨＣが多量体の一部を形成し得る。したがって、一実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ ＭＨＣ、クラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ１またはＭＨＣ様分子からなる群より選択される。ＭＨＣクラスＩでは、提示ペプチドは９～１１量体ペプチドであり；ＭＨＣクラスＩＩでは、提示ペプチドは１２～１８量体ペプチドである。代替的ＭＨＣ分子では、それは提示される脂質または糖分子のフラグメントであり得る。
このほか、（細胞の）試料とインキュベートする場合に結合多量体のプール全体を決定することが可能であれば有利であると思われる。したがって、好ましい実施形態では、主鎖は、１つまたは複数の連結された蛍光標識をさらに含む。このような結合を有することにより、より優れた定量化を実施することが可能となる。同様に、細胞分取に標識を用いてもよい。
組成物
図２に完全なバーコードライブラリーの作製を示す。図２Ａのこのライブラリーは、１０００を超える可能性のある多数の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体であって、それぞれが特異的ＤＮＡバーコードを有するペプチド－ＭＨＣ多量体からなる。したがって、それぞれが特異的バーコードを有する数千の異なる特異性の混合物が可能になるまで、バーコード番号１はペプチド－ＭＨＣ複合体番号１をコードし、バーコード番号２はペプチド－ＭＨＣ複合体番号２をコードし、バーコード番号３はペプチド－ＭＨＣ複合体番号３をコードするなどとなる。図２Ｂは最終試薬を表し、この試薬は、それぞれが各ペプチド－ＭＨＣ特異性の標識として特異的ＤＮＡバーコードを有する多数の異なるＭＨＣ－多量体の混合物である。
図２に完全なバーコードライブラリーの作製を示す。図２Ａのこのライブラリーは、１０００を超える可能性のある多数の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体であって、それぞれが特異的ＤＮＡバーコードを有するペプチド－ＭＨＣ多量体からなる。したがって、それぞれが特異的バーコードを有する数千の異なる特異性の混合物が可能になるまで、バーコード番号１はペプチド－ＭＨＣ複合体番号１をコードし、バーコード番号２はペプチド－ＭＨＣ複合体番号２をコードし、バーコード番号３はペプチド－ＭＨＣ複合体番号３をコードするなどとなる。図２Ｂは最終試薬を表し、この試薬は、それぞれが各ペプチド－ＭＨＣ特異性の標識として特異的ＤＮＡバーコードを有する多数の異なるＭＨＣ－多量体の混合物である。
既に述べたように、異なるセットの多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のプール（ライブラリー）を用いて、細胞集団全体のペプチドに対する特異性を解析し得る。したがって、本発明の別の態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のサブセットを含み、ＭＨＣの各セットが、Ｔ細胞認識に決定的な役割を果たす異なるペプチドと、ＤＮＡ分子中の固有の「バーコード」領域とを有する、組成物に関する。この文脈では、特異的多量体主要組織適合複合体がそれぞれ一定の数で組成物中に存在し、異なる多量体主要組織適合複合体のサブセットが組成物中に存在することを理解するべきである。
各多量体ＭＨＣに特異的な領域はいずれも、少数のプライマーセットのみ、好ましくは１つのプライマーセットのみで決定することができるのが好ましい。したがって、一実施形態では、ＤＮＡ分子中のプライマー領域はＭＨＣの各セットで同一のものである。このようにして、必要なプライマーセットは１つのみとなる。別の実施形態では、多量体ＭＨＣを異なるプライマーセットによってグループ分けして、異なる多量体ＭＨＣのセットの増殖を可能にする。このようにして、バックグランドノイズが制限されると同時に、特異的結合に関する情報も回収され得る。したがって、異なるＭＨＣのセットに対する異なるライマーセットを用い得る。
個々の多量体ＭＨＣのセットの数は様々なものであり得る。したがって、一実施形態では、組成物は、少なくとも１０の異なる多量体ＭＨＣのセット、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００など、例えば１０～５００００、例えば１０～１０００または例えば５０～５００の範囲などのＭＨＣのセットを含む。
キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）
本発明の組成物はキットの一部を形成し得る。したがって、本発明のさらなる態様は、
本発明による組成物と、
ＤＮＡ分子を増幅させるための１つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関する。
本発明の組成物はキットの一部を形成し得る。したがって、本発明のさらなる態様は、
本発明による組成物と、
ＤＮＡ分子を増幅させるための１つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関する。
試料中の抗原応答性細胞を検出する方法
図３には、このライブラリーを単一試料中の抗原応答性細胞の染色に用いることができる仕組みが示されている。図３Ａでは、単細胞懸濁液中の細胞（例えば、限定されるわけではないが、末梢血、組織生検をはじめとする体液に由来し得る）と、図２Ｂに示されるペプチドライブラリーとを混合する。図３Ｂでは、染色後、細胞を順次洗浄し、遠心分離して、細胞表面と結合していない残りのＭＨＣ多量体を除去する。フローサイトメトリーをはじめとする細胞分取／選別手段により、特定の細胞集団、例えばＴ細胞（ＣＤ８またはＣＤ４拘束性）、その他の免疫細胞またはＭＨＣ多量体特異的結合Ｔ細胞を分取し得る。図３Ｃでは、細胞集団から単離されたＤＮＡバーコードオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅させる。図２Ｄでは、この増幅産物にディープシーケンシング（１０～１００，０００のリードが得られる）によるシーケンシングを実施する。選別後、標本中の細胞と結合したＤＮＡバーコードはＭＨＣ多量体の非特異的結合のバックグランドによる配列よりも高い頻度で現れるため、シーケンシングによってその特異的バーコード配列が明らかになる。任意の非特異的ＭＨＣ多量体が１／１０００の異なるバーコード（ライブラリーの大きさに左右される）とランダムに結合することによって「シグナル対ノイズ」が相殺されるため、通常の多量体染色よりも感度がさらに高くなる。
図３には、このライブラリーを単一試料中の抗原応答性細胞の染色に用いることができる仕組みが示されている。図３Ａでは、単細胞懸濁液中の細胞（例えば、限定されるわけではないが、末梢血、組織生検をはじめとする体液に由来し得る）と、図２Ｂに示されるペプチドライブラリーとを混合する。図３Ｂでは、染色後、細胞を順次洗浄し、遠心分離して、細胞表面と結合していない残りのＭＨＣ多量体を除去する。フローサイトメトリーをはじめとする細胞分取／選別手段により、特定の細胞集団、例えばＴ細胞（ＣＤ８またはＣＤ４拘束性）、その他の免疫細胞またはＭＨＣ多量体特異的結合Ｔ細胞を分取し得る。図３Ｃでは、細胞集団から単離されたＤＮＡバーコードオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲによって増幅させる。図２Ｄでは、この増幅産物にディープシーケンシング（１０～１００，０００のリードが得られる）によるシーケンシングを実施する。選別後、標本中の細胞と結合したＤＮＡバーコードはＭＨＣ多量体の非特異的結合のバックグランドによる配列よりも高い頻度で現れるため、シーケンシングによってその特異的バーコード配列が明らかになる。任意の非特異的ＭＨＣ多量体が１／１０００の異なるバーコード（ライブラリーの大きさに左右される）とランダムに結合することによって「シグナル対ノイズ」が相殺されるため、通常の多量体染色よりも感度がさらに高くなる。
バーコード配列データの解析により、標本中の細胞の抗原特異性を判定することができる。ＤＮＡバーコード番号１がバックグランドレベルのリードを上回って検出された場合、それは、ペプチド－ＭＨＣ多量体番号１が選別された細胞型と優先的に結合したことを意味する。バーコード番号２、３、４、５など、最大で１０００を超える可能な組合せ（この特定の数値に限定されるわけではない）についても同じことが言える。投入細胞の数がわかっている場合、例えば、フローサイトメトリーベースの分取をはじめとする捕捉／分取の手段により、目的の細胞集団が同じく多量体と結合した蛍光シグナルを介して捕捉された場合、バーコードリードの頻度と分取されたＴ細胞の数とを比較して特異的Ｔ細胞の頻度を計算することができる。
したがって、本発明による多量体ＭＨＣおよび／または組成物は、様々な目的で使用し得る。したがって、本発明のまた別の態様は、試料中の抗原応答性細胞を検出する方法であって、
本発明による１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと（主鎖を介して）連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法に関する。
本発明による１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと（主鎖を介して）連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法に関する。
一実施形態では、この方法は、（生体）試料を準備することを含む。
当業者に公知の通り、未結合分子を除去するのが好ましい。したがって、一実施形態では、増幅前に、例えば洗浄および／または遠心分離の後、例えば上清を除去することにより、未結合（多量体）ＭＨＣを除去する。
試料の種類も様々なものであり得る。一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、末梢血試料などの血液試料、血液由来試料、組織生検または別の体液、例えば髄液もしくは唾液などである。試料の入手源も様々なものであり得る。したがって、さらなる実施形態では、前記試料は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ブタおよび／またはウマなどから採取されたものである。
このほか、細胞を分取することができると有利であり得る。したがって、一実施形態では、この方法は、例えばＦＡＣＳなどのフローサイトメトリーによる細胞分取をさらに含む。これは例えば、主鎖が蛍光マーカーを備えている場合に実施され得る。したがって、未結合細胞も除去／分取され得る。
当業者にも公知である通り、測定値と参照レベルとを比較するのが好ましい。したがって、一実施形態では、前記結合の検出は、測定値と参照レベル、例えば陰性対照および／または試料の総応答レベルとを比較することを含む。さらなる実施形態では、前記増幅はＱＰＣＲなどのＰＣＲである。
上にも述べた通り、バーコードの検出は、増幅されたバーコード領域のシーケンシングを含む。したがって、一実施形態では、バーコード領域の検出は、ディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングなどによる前記バーコード領域のシーケンシングを含む。
多量体主要組織適合複合体の使用
この技術を用いて様々な特性と細胞集団の抗原特異性とを関連付けることができる仕組みを図４に示す。図４Ａは、細胞とバーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーとを結合させた後に特定の刺激に曝露され得る仕組みを示している。この刺激に対する機能的応答（例えば、限定されるわけではないが、サイトカイン分泌、リン酸化、カルシウム放出をはじめとする多数の尺度）に基づいて細胞集団を選別することができる。（図２の諸段階の後に）応答性または非応答性集団を選別した後、ＤＮＡバーコードのシーケンシングを実施して抗原応答性を解読し、所与の応答に関与する抗原特異性を判定することができる。
この技術を用いて様々な特性と細胞集団の抗原特異性とを関連付けることができる仕組みを図４に示す。図４Ａは、細胞とバーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーとを結合させた後に特定の刺激に曝露され得る仕組みを示している。この刺激に対する機能的応答（例えば、限定されるわけではないが、サイトカイン分泌、リン酸化、カルシウム放出をはじめとする多数の尺度）に基づいて細胞集団を選別することができる。（図２の諸段階の後に）応答性または非応答性集団を選別した後、ＤＮＡバーコードのシーケンシングを実施して抗原応答性を解読し、所与の応答に関与する抗原特異性を判定することができる。
図４Ｂは、表現型に基づいて細胞を選別し、特定の表現型の特徴のセットと抗原応答性とを関連付けることができる仕組みを示している。
図４Ｃは、ＭＨＣ多量体に同時に結合させた蛍光標識に基づいて、ＭＨＣ多量体結合細胞の単一細胞分取が可能であることを示している。単一細胞分取により、所与の細胞の抗原特異性を付随するバーコード標識のシーケンシングにより単一細胞レベルで決定することができる。これを、最近記載されているように（１０）同じく単一細胞レベルでシーケンシングが可能なＴＣＲと関連付けることができる。これにより、本発明は、ＴＣＲ配列をはじめとする単一細胞の特性と抗原特異性との間の関連を提供し、バーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーの使用により数千の異なる特異性の混合物中にある抗原特異的ＴＣＲを明らかにすることを可能にし得る。
図４Ｄは、ＭＨＣ多量体と、所与のＴ細胞クローンまたはＴＣＲ形質導入／トランスフェクト細胞との結合の定量的評価へのバーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーの使用を示している。バーコード標識のシーケンシングにより、同じ細胞集団について複数の異なる標識を同時に判定することが可能であることから、この戦略を用いて、関連するペプチド－ＭＨＣ多量体のライブラリーに関して所与のＴＣＲの親和力を判定することができる。ライブラリー中の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体それぞれについて、ＴＣＲ結合の定量的寄与度に基づき、最終リードアウトにおける異なるＤＮＡバーコード配列の相対的寄与度を求める。漸増法に基づく解析により、ペプチド－ＭＨＣ多量体の大型のライブラリーに関するＴＣＲの定量的結合特性を明らかにすることが可能である。全体を単一試料にまとめる。この特定の目的のために、ＭＨＣ多量体ライブラリーは、関連するペプチド配列またはアラニン置換ペプチドライブラリーを特異的に有し得る。
図５は、ＤＮＡバーコードとＭＨＣ多量体とを結合させ、Ｔ細胞染色後に特異的配列を増幅させることの実現可能性に関する実験データを示している。図５Ａは、末梢血試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞の染色を示している。特異的なＣＭＶ由来ペプチド－ＭＨＣ多量体をバーコード（バーコード番号１）で標識し、バーコード（バーコード番号２）で標識した無関係な／非特異的なペプチド－ＭＨＣ多量体と混合し、９９８のバーコード標識していない他の非特異的ＭＨＣ多量体と混合した。このデータは、１０００の他のＭＨＣ多量体の混合物においてＣＭＶ特異的Ｔ細胞の染色が実現可能であることを示している。３つの異なる染色プロトコルのデータが示されている。図５Ｂは、定量的ＰＣＲによる特異的バーコード配列のリードアウトを示している。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を判定するバーコード番号１（Ｂ番号１）が３つの染色プロトコルのいずれでも検出されているのに対し、無関係の／非特異的なバーコードシグナルであるバーコード番号２（Ｂ番号２）は検出不可能である。
全体として、このようなＭＨＣのセットを含む多量体ＭＨＣまたは組成物には様々な用途が存在し得る。したがって、一態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物の試料中の抗原応答性細胞検出への使用に関する。
別の態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物の疾患または病態、好ましくは癌および／または感染症診断への使用に関する。
さらなる態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物の免疫治療剤開発への使用に関する。
さらなる態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物のワクチン開発への使用に関する。
別の態様は、本発明による多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または組成物のエピトープ同定への使用に関する。
まとめると、本発明の利点として、単一試料中に多数（可能性としては、限定されるわけではないが、１０００超）の異なる抗原応答性細胞を検出することが可能であることが挙げられる。この技術は、限定されるわけではないが、Ｔ細胞エピトープマッピング、免疫認識の発見、診断検査およびワクチン接種または免疫関連療法後の免疫反応性の測定に用いることができる。
複雑度がこのレベルになれば、モデル抗原から、生物体全体、ウイルスゲノム、癌ゲノム、全ワクチン成分などをカバーするエピトープ特異的免疫反応性の判定に移行することが可能となる。個々のＭＨＣ発現に応じて個別化して改変することが可能であるほか、糖尿病、関節リウマチなどの免疫関連疾患に用いることが可能である。
例えば、生物学的材料を分析して、天然の免疫応答、例えば感染症または癌に対して起こり得る免疫応答をモニターする。さらに、ワクチンを含めた免疫療法剤の免疫応答に対する効果について生物学的材料を分析する。ここで用いられる免疫療法剤は、免疫応答の増強、抑制または修正を目的とする医療介入に用いられるワクチン、非特異的免疫刺激剤、免疫抑制剤、細胞ベースの免疫療法剤およびそれらの組合せを含めた活性成分と定義される。
本発明は、限定されるわけではないが、診断キットの開発に用いることが可能であり、この場合、任意の生体標本において、所与の疾患に関連する免疫応答のフィンガープリントを明らかにすることができる。このような診断キットを用いて、例えば、限定されるわけではないが結核、インフルエンザおよび糖尿病に関連する細菌もしくはウイルス感染症または自己免疫疾患への曝露を判定することができる。免疫応答性が治療応答のバイオマーカーとしての役割を果たし得る免疫療法剤にも同様の方法を用いることができる。バーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーの解析により、単一試料中の多数の抗原応答性細胞のハイスループットな評価が可能である。
さらに、バーコード標識したＭＨＣ－多量体を単一細胞分取およびＴＣＲシーケンシングと組み合わせて用いることが可能であり、この場合、同時に結合させたバーコードによってＴＣＲの特異性を判定することができる。これにより、同じ試料から可能性として１０００超の異なる抗原応答性Ｔ細胞のＴＣＲ特異性を同時に同定し、ＴＣＲ配列と抗原特異性とを一致させることが可能になる。この技術の今後の可能性としては、ＴＣＲ配列に基づいて抗原応答性を予測する能力に関するものが考えられる。これまでＴＣＲの利用法の変化が免疫療法に結びつけられてきた（１１、１２）ことから、このことは極めて興味深いものであると思われる。
さらに、（例えば、限定されるわけではないが、癌認識と関連させて）標的細胞認識に関与するＴＣＲを特定する必要性が増大しつつある。癌治療へのＴＣＲの使用が成功を収めており（１３）、今後、この線に沿った臨床的構想がさらに拡大すると思われる。バーコード標識したＭＨＣ多量体ライブラリーの複雑性により、所与の個人の関連するＴＣＲを個別に選択することが可能になると思われる。
バーコード配列のリードアウトにより、バーコード標識ＭＨＣ多量体技術は、単一細胞表面上の複数の異なるペプチド－ＭＨＣ複合体の相互作用を可能にすると同時に、有効なリードアウトも依然として維持する。１つのＴ細胞がライブラリー内の多数の異なるペプチド－ＭＨＣ複合体と結合する場合、所与の配列のリード数によってそのＴ細胞結合に対する相対的寄与度を求めることができる。この特徴に基づけば、ＴＣＲの精密な特異性／コンセンサス配列を決定することが可能である。各ＴＣＲは、それぞれが異なる親和性を有する多数の異なるペプチド－ＭＨＣ複合体を認識できる可能性がある（１４）。このような定量的評価の重要性はＴＣＲの臨床使用に伴って増大しており、２例に配列関連ペプチドの交差認識による致命的な心不全が認められた最近の臨床試験の例（１５、１６）にみるように、知識の不足が致命的な結果を招くことがある。したがって、本発明に関連するペプチド－ＭＨＣ分子のＴＣＲ結合の定量的評価に関するこの特定の特徴は、臨床使用を目標とするＴＣＲの前臨床試験に有効な解決策をもたらし得る。
上記のものに関連してほかにも、オーバーラップするライブラリーまたは極めて類似したペプチドに対する抗原応答性の判定が可能になる。組合せコード化原理のような現在の多重化技術では不可能なもの。これにより、例えば、限定されるわけではないがＨＩＶなどのウイルスの変異型に対する免疫反応性のマッピングが可能になる。
概略的な実施形態では、本発明は、単一試料中の多数の抗原応答性細胞のハイスループットな評価、抗原応答性と機能および表現型の特徴、ＴＣＲ特異性との結びつけならびに大型のペプチド－ＭＨＣライブラリーの所与のＴＣＲに対する定量的結合の判定へのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用である。
概略的な実施形態では、本発明は、単一試料中の多数の抗原応答性細胞のハイスループットな評価、抗原応答性と機能および表現型の特徴、ＴＣＲ特異性との結びつけならびに大型のペプチド－ＭＨＣライブラリーの所与のＴＣＲに対する定量的結合の判定へのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用である。
上に記載した本発明に関する説明により、当業者は、現時点でその最良の形態であると考えられるものを作製し使用することが可能であるが、本明細書の具体的な実施形態、方法および実施例の変形物、組合せおよび同等物の存在が理解および認識されよう。したがって、本発明は、上記の実施形態、方法および実施例ではなく、本発明の範囲および趣旨に包含されるあらゆる実施形態および方法によって限定されるべきである。
本発明のほかの項目：
項目１：単一試料中の異なるＴ細胞特異性の多重検出へのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用であって、可能性として１０００超の異なるＴ細胞特異性の同時検出を可能にし、バーコード標識のシーケンシングによって特異性を明らかにする、使用。
項目１：単一試料中の異なるＴ細胞特異性の多重検出へのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用であって、可能性として１０００超の異なるＴ細胞特異性の同時検出を可能にし、バーコード標識のシーケンシングによって特異性を明らかにする、使用。
項目２：単一細胞分取およびＴＣＲシーケンシングと組み合わせたバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用であって、同時に結合させたバーコードによってＴＣＲの特異性を判定することができる、使用。これにより、多数（可能性としては、限定されるわけではないが、１０００超）の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体の混合物に特異的なＴＣＲを同定し、ＴＣＲ配列と抗原特異性とを一致させることが可能になる。
項目３：所与のＴＣＲの親和性および結合モチーフの決定へのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用。バーコード標識戦略により、複数の異なる（配列関連）ペプチド－ＭＨＣ多量体と、各ペプチド－ＭＨＣ多量体による相対的寄与度を決定づける結合親和性を有する所与のＴ細胞とを結合させることが可能になる。これにより、オーバーラップするペプチドライブラリーまたは例えばアラニン置換ライブラリーの使用によって、所与のＴＣＲの精密な特異性／コンセンサス認識配列をマッピングすることが可能である。
項目４：同じライブラリー内の配列関連／類似ペプチド、例えばＨＩＶ感染における変異による変化に対する抗原応答性のマッピングへのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用。これは、これまでのＭＨＣ多量体ベースの技術では不可能であった。
項目５：特異的Ｔ細胞または特異的Ｔ細胞のプールの任意の機能的特徴と抗原（ペプチド－ＭＨＣ）認識との結びつけへのバーコード標識したＭＨＣ多量体の使用。例えば、特定の刺激後に、大型のプールの中でどのＴ細胞特異性がサイトカインを分泌するか、カルシウムを放出するかをはじめとする機能的尺度を決定する。
本発明のある態様との関連で記載される実施形態および特徴は、本発明の別の態様にも適用されることに留意するべきである。
本願に引用されるあらゆる特許および特許以外の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願に引用されるあらゆる特許および特許以外の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
これより、以下の非限定的実施例および項目で本発明をさらに詳細に説明する。
項目
１．多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子と
を含み、
核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、
多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
１．多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、
主鎖分子によって連結された２つ以上のＭＨＣと、
主鎖と連結された少なくとも１つの核酸分子と
を含み、
核酸分子が、例えばＰＣＲによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ（バーコード領域）を含む、
多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
２．主鎖分子が、多糖類、例えばデキストランなどのグルカンなど、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン多量体からなる群より選択される、項目１に記載の多量体主要組織適合複合体。
３．ＭＨＣが、ストレプトアビジン－ビオチン結合、ストレプトアビジン－アビジンを介して主鎖と結合している、項目１または２に記載の多量体主要組織適合複合体。
４．ＭＨＣが、ＭＨＣ重鎖を介して主鎖と連結されている、項目１～３のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体。
５．ＭＨＣが、人為的に組み立てられたものである、項目１～４のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
６．少なくとも４個のＭＨＣ、例えば少なくとも８個、例えば少なくとも１０個、２～３０個、２～２０個、例えば２～１０個または例えば４～１０個などのＭＨＣからなる、項目１～５のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
７．少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも５’第一プライマー領域と、中央領域（バーコード領域）と、３’第二プライマー領域とからなる、項目１～６のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
８．少なくとも１つの核酸分子が、２０～１００ヌクレオチド、例えば３０～１００ヌクレオチド、例えば３０～８０ヌクレオチド、例えば３０～５０ヌクレオチドなどの範囲の長さを有する、項目１～７のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
９．少なくとも１つの核酸分子が、ストレプトアビジン－ビオチン結合および／またはストレプトアビジン－アビジン結合を介して前記主鎖と連結されている、項目１～８のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
１０．少なくとも１つの核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または人工ヌクレオチド、例えばＰＬＡもしくはＬＮＡなどを含むか、これよりなるものである、項目１～９のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
１１．ＭＨＣが、クラスＩ ＭＨＣ、クラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ１またはＭＨＣ様分子からなる群より選択される、項目１～１０のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
１２．主鎖が、１つまたは複数の連結された蛍光標識をさらに含む、項目１～１１のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）。
１３．項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のサブセットを含み、ＭＨＣの各セットが、Ｔ細胞認識に決定的な役割を果たす異なるペプチドと、ＤＮＡ分子中の固有の「バーコード」領域とを有する、組成物。
１４．ＤＮＡ分子中のプライマー領域が、ＭＨＣの各セットで同一である、項目１３に記載の組成物。
１５．少なくとも１０の異なるＭＨＣのセット、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、例えば１０～５００００、例えば１０～１０００または例えば５０～５００の範囲などのＭＨＣのセットを含む、項目１３または１４に記載の組成物。
１６．項目１３～１５のいずれかに記載の組成物と、
核酸分子を増幅させるための１つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）。
核酸分子を増幅させるための１つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）。
１７．試料中の抗原応答性細胞を検出する方法であって、
項目１～１２のいずれかに記載の１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１５のいずれかに記載の組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、
前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、
方法。
項目１～１２のいずれかに記載の１つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１５のいずれかに記載の組成物を準備することと、
前記多量体ＭＨＣと前記試料とを接触させることと、
多量体ＭＨＣと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、ＭＨＣのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、
前記結合が、１つまたは複数のＭＨＣと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、
方法。
１８．増幅前に、例えば洗浄および／または遠視分離によって、未結合ＭＨＣを除去する、項目１７に記載の方法。
１９．試料が、末梢血試料などの血液試料、血液由来試料、組織生検また別の体液、例えば髄液もしくは唾液などである、項目１７または１８に記載の方法。
２０．前記試料が、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ブタおよび／またはウマなどから採取されたものである、項目１７～１９のいずれかに記載の方法。
２１．例えばＦＡＣＳなどのフローサイトメトリーによる細胞分取をさらに含む、項目１７～２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記結合の検出が、測定値と参照レベル、例えば陰性対照および／または総応答レベルとを比較することを含む、項目１７～２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記増幅が、ＱＰＣＲなどのＰＣＲである、項目１７～２２のいずれかに記載の方法。
２４．バーコード領域の検出が、前記領域のシーケンシング、例えばディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングなどを含む、項目１７～１３のいずれかに記載の方法。
２５．試料中の抗原応答性細胞検出への項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１６のいずれかに記載の組成物の使用。
２６．疾患または病態、好ましくは癌および／または感染症の診断への項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１６のいずれかに記載の組成物の使用。
２７．免疫治療剤開発への項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１６のいずれかに記載の組成物の使用。
２８．ワクチン開発への項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１６のいずれかに記載の組成物の使用。
２９．エピトープ同定への項目１～１２のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または項目１３～１６のいずれかに記載の組成物の使用。
実施例
実施例１
特許請求される本発明の原理証明としての役割を果たす結果を図５に示す。図５Ａは、健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリーのデータである。
実施例１
特許請求される本発明の原理証明としての役割を果たす結果を図５に示す。図５Ａは、健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリーのデータである。
材料および方法
特異的ヌクレオチド－バーコードと結合したＣＭＶ特異的ペプチド－ＭＨＣ多量体でＰＢＭＣを染色した。ＣＭＶペプチド－ＭＨＣ試薬に加え、陰性対照試薬、すなわち、別の特異的バーコード標識と結合したＨＩＶ－ペプチドＭＨＣ多量体およびバーコードのない追加の陰性対照ペプチド－ＭＨＣ試薬（ｐ＊）の存在下で細胞を染色した（多量体はいずれもＰＥ蛍光標識でさらに標識した）。バックグランド染色が真陽性シグナルに干渉するかどうかの痕跡を得るため、ＰＢＭＣの染色に用いたＭＨＣ多量体の量を１０００の異なるペプチド－ＭＨＣ特異性、すなわち、１×オリゴ標識ＣＭＶ特異的ＭＨＣ多量体、１×オリゴ標識ＨＩＶ特異的ＭＨＣ多量体および９９８×非標識ｐ＊ＭＨＣ多量体の染色に必要な量と同じにした。ＭＨＣ多量体を除去した後、追加の洗浄段階を実施し（０分（Ａ）、３０分（Ｂ）または６０分（Ｃ）のいずれか）、全実験のデータを示す。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によりＰＥ－ＭＨＣ－多量体陽性細胞を分取した。
特異的ヌクレオチド－バーコードと結合したＣＭＶ特異的ペプチド－ＭＨＣ多量体でＰＢＭＣを染色した。ＣＭＶペプチド－ＭＨＣ試薬に加え、陰性対照試薬、すなわち、別の特異的バーコード標識と結合したＨＩＶ－ペプチドＭＨＣ多量体およびバーコードのない追加の陰性対照ペプチド－ＭＨＣ試薬（ｐ＊）の存在下で細胞を染色した（多量体はいずれもＰＥ蛍光標識でさらに標識した）。バックグランド染色が真陽性シグナルに干渉するかどうかの痕跡を得るため、ＰＢＭＣの染色に用いたＭＨＣ多量体の量を１０００の異なるペプチド－ＭＨＣ特異性、すなわち、１×オリゴ標識ＣＭＶ特異的ＭＨＣ多量体、１×オリゴ標識ＨＩＶ特異的ＭＨＣ多量体および９９８×非標識ｐ＊ＭＨＣ多量体の染色に必要な量と同じにした。ＭＨＣ多量体を除去した後、追加の洗浄段階を実施し（０分（Ａ）、３０分（Ｂ）または６０分（Ｃ）のいずれか）、全実験のデータを示す。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によりＰＥ－ＭＨＣ－多量体陽性細胞を分取した。
図５Ｂは、分取されたＰＥ－ＭＨＣ－多量体陽性細胞のマルチプレックス多重ｑＰＣＲから得られた交差閾値（Ｃｔ）である。ＱＰＣＲを用いて、バーコード標識したペプチド－ＭＨＣ－多量体により特定の細胞特異性を検出することが実現可能であるかどうかを評価した。染色時、陽性対照（ＣＭＶ）バーコードと結合した試薬および陰性対照（ＨＩＶ）バーコードは存在したが、陰性対照（ＨＩＶ）バーコード－ペプチド－ＭＨＣ多量体は洗い流すべきである。
核酸配列の例は以下の通りである：
ＣＭＶ ＭＨＣ多量体結合用のＤＮＡバーコードオリゴ：
５ＧＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴ
ＨＩＶ ＭＨＣ多量体結合用のＤＮＡバーコードオリゴ：
５ＧＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴ
５＝ビオチン－ＴＥＧ。
ＣＭＶ ＭＨＣ多量体結合用のＤＮＡバーコードオリゴ：
５ＧＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴ
ＨＩＶ ＭＨＣ多量体結合用のＤＮＡバーコードオリゴ：
５ＧＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴ
５＝ビオチン－ＴＥＧ。
結果
結果は、ＣＭＶペプチド－ＭＨＣ多量体と結合したバーコードのみに検出可能なＣｔ値のみを示しており、ＨＩＶ－ペプチドＭＨＣ多量体と結合したバーコードは検出されなかった。
結果は、ＣＭＶペプチド－ＭＨＣ多量体と結合したバーコードのみに検出可能なＣｔ値のみを示しており、ＨＩＶ－ペプチドＭＨＣ多量体と結合したバーコードは検出されなかった。
結論
この実験は、他の抗原特異性に関して実施した複数の同様の実験の代表的例である。これらのデータ全体から、以下のことが実現可能であることがわかる：
１）単一試料中の１０００の異なるＭＨＣ－多量体で染色すると同時に、依然として特異的シグナルを維持すること、
２）ＤＮＡバーコードをＭＨＣ多量体に結合させること、
３）細胞選別段階の後にＤＮＡバーコードを増幅させること、
４）ＱＰＣＲにバーコード特異的プローブを用いてバーコードを読み取ること、
５）非特異的ＭＨＣ多量体のバーコードは検出されないと同時に、試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞集団に対応する特異的シグナルを得ること。
この実験は、他の抗原特異性に関して実施した複数の同様の実験の代表的例である。これらのデータ全体から、以下のことが実現可能であることがわかる：
１）単一試料中の１０００の異なるＭＨＣ－多量体で染色すると同時に、依然として特異的シグナルを維持すること、
２）ＤＮＡバーコードをＭＨＣ多量体に結合させること、
３）細胞選別段階の後にＤＮＡバーコードを増幅させること、
４）ＱＰＣＲにバーコード特異的プローブを用いてバーコードを読み取ること、
５）非特異的ＭＨＣ多量体のバーコードは検出されないと同時に、試料中に存在する抗原特異的Ｔ細胞集団に対応する特異的シグナルを得ること。
以上のデータ（および入手可能な同様のデータ）を考え合わせると、図１、２および３に記載される段階が実現可能であることが証明される。
実施例２
この実施例は以下のことに関するものである：
ｉ）本発明の一実施形態で使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドの血液標本中での安定性ならびに
ｉｉ）特定のタグ化デキストラマー（結合分子がいくつかのペプチド－ＭＨＣ複合体であり、標識がＤＮＡオリゴヌクレオチドである検出分子）を増加させる本発明の実施形態。被験細胞試料中の特定の細胞（細胞のサブ集団）に対する結合特異性を有するデキストラマーの特定を可能にすること。
この実施例は以下のことに関するものである：
ｉ）本発明の一実施形態で使用するＤＮＡオリゴヌクレオチドの血液標本中での安定性ならびに
ｉｉ）特定のタグ化デキストラマー（結合分子がいくつかのペプチド－ＭＨＣ複合体であり、標識がＤＮＡオリゴヌクレオチドである検出分子）を増加させる本発明の実施形態。被験細胞試料中の特定の細胞（細胞のサブ集団）に対する結合特異性を有するデキストラマーの特定を可能にすること。
ｉ）では、Ｔ細胞を染色し、洗浄し、単離した後、ＤＮＡタグを増幅する時間の間、ＤＮＡオリゴがＰＢＭＣおよび血液中で操作しても安定であることが示される。
ｉｉ）は、ＣＭＶ、インフルエンザおよび陰性対照ペプチドに対するＭＨＣ特異性を有するＤＮＡタグ化デキストラマーからなるモデルシステムが、関連するＴ細胞特異性に局在し、これにより捕捉／分取され得るほか、ＰＣＲ増幅および／またはシーケンシングによって特定され得ることを示すものである。
Ａ．一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドの血液標本中での安定性
ＤＮＡタグオリゴの設計。５’プライマー領域（２２ｎｔ、黄色）－ランダムバーコード領域（６×Ｎ－ｎｔ）－コドン領域（２１ｎｔ、緑色／下線部）－３’プライマー領域（２０ｎｔ、青色）からなる６９ヌクレオチド長のビオチン化被験オリゴを調製した：
ＤＮＡタグオリゴの設計。５’プライマー領域（２２ｎｔ、黄色）－ランダムバーコード領域（６×Ｎ－ｎｔ）－コドン領域（２１ｎｔ、緑色／下線部）－３’プライマー領域（２０ｎｔ、青色）からなる６９ヌクレオチド長のビオチン化被験オリゴを調製した：
Ｔ細胞単離に適した条件下でオリゴタグの安定性をＱ－ＰＣＲにより分析した：
被験オリゴ１～６を抗凝固処理ＥＤＴＡ血液中でインキュベートし、インキュベーション後、Ｑ－ＰＣＲに上記のプライマーおよびプローブを用いて各被験オリゴの量を求めた。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）を製造業者のプロトコルに従い任意のキャピラリーＱＰＣＲ機器（例えば Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ）と組み合わせたＱＰＣＲによりオリゴタグを定量化した。
被験オリゴ１～６は末端が異なるため、これは、非修飾ＤＮＡオリゴタグと、ＨＥＧ修飾５’ならびにＨＥＧ修飾５’および３’（それぞれ被験オリゴ－０１、－０２および－０３）とで安定性を比較する試験にもなった。
結果を図６に示す。被験オリゴの安定性はいずれの変異体でも、本発明を実施するのに十分なものであると結論付けられる。
Ｂ．リンパ系細胞試料中の抗原特異的Ｔ細胞をスクリーニングするための３メンバーＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーライブラリーの作製およびスクリーニング。
この実験では、それぞれが固有の特異性を有する以下の３つのＤＮＡタグ化デキストラマー：
デキストラマー１：インフルエンザ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａ）
デキストラマー２：ＣＭＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶ）
デキストラマー３：陰性（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ）
を作製する。
この実験では、それぞれが固有の特異性を有する以下の３つのＤＮＡタグ化デキストラマー：
デキストラマー１：インフルエンザ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａ）
デキストラマー２：ＣＭＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶ）
デキストラマー３：陰性（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ）
を作製する。
したがって、上記のデキストラマーはそれぞれ固有のｐＭＨＣ特異性を有し（すなわち、３つのデキストラマーは異なる結合分子を有し）、各デキストラマーは、その１つのｐＭＨＣ特異性に特異的な固有の標識（ＤＮＡオリゴヌクレオチド）を有する。
抗凝固処理ＥＤＴＡ血液などのリンパ系細胞の標本または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の標本でＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーをスクリーニングする。細胞試料の細胞と結合するデキストラマーは、細胞と結合しないものよりも相対的に増加する。
最後に、ＤＮＡタグ特異的プローブを用いるＱ－ＰＣＲまたはＤＮＡタグのシーケンシングによってＤＮＡタグを同定することにより、増加したデキストラマーのＭＨＣ／抗原特異性を明らかにする。
１．ＨＬＡ－Ａ
＊
０２０１－ペプチド（ｐＭＨＣ）複合体を有する３つの異なるＤＮＡタグ化デキストラマーの作製。
ａ．以下のようにｐＭＨＣ複合体を作製し、個々のｐＭＨＣ複合体を同定するための固有のＤＮＡタグとともにデキストランと結合させる。
ｉ．インフルエンザ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａ）、ＣＭＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶ）および陰性（ＨＬＡ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ）を有するＤＮＡタグ化デキストラマーの作製。
１．デキストラマーストックを１６０ナノモル（ｎＭ）とし、被験オリゴストックを５００ｎＭに希釈する。１６０ｎＭデキストラマーストック１０マイクロリットル（μＬ）と５００ｎＭ被験オリゴストック１０μＬとを混合する。室温で１０分間インキュベートする。所望の特異性のｐＭＨＣ複合体１．５μｇと混合する。ＰＢＳまたはトリス（ｐＨ７．４）などの中性ｐＨ緩衝液で体積を５０μＬに調整し、４℃で保管する。これにより、デキストラマー１個当たり約３個のオリゴタグと１２個のｐＭＨＣ複合体とをそれぞれ有するＤＮＡタグ化デキストラマーが得られる。
ａ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３＝被験オリゴ－０３とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶとを有するデキストラマー。
ｂ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４＝被験オリゴ－０４とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａとを有するデキストラマー。
ｃ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５＝被験オリゴ－０５とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌとを有するデキストラマー。
ａ．以下のようにｐＭＨＣ複合体を作製し、個々のｐＭＨＣ複合体を同定するための固有のＤＮＡタグとともにデキストランと結合させる。
ｉ．インフルエンザ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａ）、ＣＭＶ（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶ）および陰性（ＨＬＡ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌ）を有するＤＮＡタグ化デキストラマーの作製。
１．デキストラマーストックを１６０ナノモル（ｎＭ）とし、被験オリゴストックを５００ｎＭに希釈する。１６０ｎＭデキストラマーストック１０マイクロリットル（μＬ）と５００ｎＭ被験オリゴストック１０μＬとを混合する。室温で１０分間インキュベートする。所望の特異性のｐＭＨＣ複合体１．５μｇと混合する。ＰＢＳまたはトリス（ｐＨ７．４）などの中性ｐＨ緩衝液で体積を５０μＬに調整し、４℃で保管する。これにより、デキストラマー１個当たり約３個のオリゴタグと１２個のｐＭＨＣ複合体とをそれぞれ有するＤＮＡタグ化デキストラマーが得られる。
ａ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３＝被験オリゴ－０３とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶとを有するデキストラマー。
ｂ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４＝被験オリゴ－０４とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａとを有するデキストラマー。
ｃ．Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５＝被験オリゴ－０５とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌとを有するデキストラマー。
２．抗原特異的Ｔ細胞のスクリーニングのための細胞試料の調製。
ａ．抗原特異的Ｔ細胞の特定に適した細胞試料は、リンパ系細胞の標本、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または抗凝固処理血液の標本などである。このような細胞試料の標本は、当業者に公知の標準的技術によって調製される。
ｂ．１Ｅ７の範囲のリンパ系細胞（ＰＢＭＣまたはＥＤＴＡ抗凝固処理血液由来）を１２×７５ｍｍのポリスチレン試験管に入れる。
ｃ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２ｍｌを加える。３００×ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、総体積２．５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）に細胞を再懸濁させる。
ａ．抗原特異的Ｔ細胞の特定に適した細胞試料は、リンパ系細胞の標本、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または抗凝固処理血液の標本などである。このような細胞試料の標本は、当業者に公知の標準的技術によって調製される。
ｂ．１Ｅ７の範囲のリンパ系細胞（ＰＢＭＣまたはＥＤＴＡ抗凝固処理血液由来）を１２×７５ｍｍのポリスチレン試験管に入れる。
ｃ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２ｍｌを加える。３００×ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、総体積２．５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）に細胞を再懸濁させる。
３．３つのＭＨＣ／ペプチド特異性を有するＤＮＡタグ化デキストラマー（１で得られたもの）のライブラリーの調製および修飾。
ａ．１０μＭビオチン５μｌと、Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３、Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４およびＤｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５それぞれ１０μｌとを混合する。
ａ．１０μＭビオチン５μｌと、Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３、Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４およびＤｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５それぞれ１０μｌとを混合する。
４．リンパ系細胞の標本とＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーのライブラリーとの混合。
ａ．１Ｅ７のリンパ系細胞（２ｂで得られたもの）２．５ｍｌとＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリー（３ａで得られたもの）３０μＬとを混合する。
ｂ．室温で３０分間インキュベートする。
ｃ．３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。
ｄ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２．５ｍｌにペレットを再懸濁させる。３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。
ｅ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２．５ｍｌにペレットを再懸濁させる。
ａ．１Ｅ７のリンパ系細胞（２ｂで得られたもの）２．５ｍｌとＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリー（３ａで得られたもの）３０μＬとを混合する。
ｂ．室温で３０分間インキュベートする。
ｃ．３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。
ｄ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２．５ｍｌにペレットを再懸濁させる。３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。
ｅ．５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２．５ｍｌにペレットを再懸濁させる。
５．Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のカタログ番号１３０－０９０．８７８のＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄプロトコルに従って実施する磁気式細胞分取による全ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞の捕捉。
ａ．４ｅで再懸濁させたリンパ系細胞にＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、カタログ番号１３０－０９０．８７８）１００μＬを加える。室温で１５分間かき混ぜてＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉させる。
ｂ．適切なＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場にＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを置く。詳細はＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｋｉｔのデータシートを参照されたい。
ｃ．分離緩衝液（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））３ｍｌですすぐことによりカラムを調製する。
ｄ．調製したＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎに磁気標識した細胞懸濁液（４ｅ）を加える。未標識細胞を含有する通過画分を収集する。
ｅ．分離緩衝液（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））３×３ｍｌでＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを洗浄する。
ｆ．分離器からＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを取り出し、そこに新たな収集チューブを置く。
ｇ．Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＣｏｌｕｍｎにＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍＬをピペットで加えることによりＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉する。直ちにプランジャーをカラムの中に強く押し込むことにより、磁気標識された細胞を洗い流す。
ｈ．３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。収集したＣＤ８＋細胞を５０μＬで再懸濁させ、のちの解析まで－２０℃で保管する。
ａ．４ｅで再懸濁させたリンパ系細胞にＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、カタログ番号１３０－０９０．８７８）１００μＬを加える。室温で１５分間かき混ぜてＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉させる。
ｂ．適切なＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場にＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを置く。詳細はＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｋｉｔのデータシートを参照されたい。
ｃ．分離緩衝液（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））３ｍｌですすぐことによりカラムを調製する。
ｄ．調製したＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎに磁気標識した細胞懸濁液（４ｅ）を加える。未標識細胞を含有する通過画分を収集する。
ｅ．分離緩衝液（ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））３×３ｍｌでＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを洗浄する。
ｆ．分離器からＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎを取り出し、そこに新たな収集チューブを置く。
ｇ．Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＣｏｌｕｍｎにＷｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒまたは５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍＬをピペットで加えることによりＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉する。直ちにプランジャーをカラムの中に強く押し込むことにより、磁気標識された細胞を洗い流す。
ｈ．３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。収集したＣＤ８＋細胞を５０μＬで再懸濁させ、のちの解析まで－２０℃で保管する。
６．リンパ系細胞試料の抗原特異的Ｔ細胞と有意に結合したデキストラマーの特定。
ａ．シーケンシングあるいはＤＮＡタグ特異的プローブであるＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４およびＬＮＡ－５を用いるＱＰＣＲによって、入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比を定量化することにより、リンパ系細胞試料中の抗原特異的Ｔ細胞の相対存在量が明らかになる。
ｉ．ＤＮＡタグ特異的プローブであるＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４およびＬＮＡ－５を用いるＱＰＣＲによる入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比の定量化。
１．ａ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）
ｂ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）
ｃ．１０～１Ｅ８の被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれの標準曲線
のＱＰＣＲ反応物２５μＬを作製する。
２．ＪｕｍｐＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、番号Ｄ７４４０）１２．５μｌと、順方向－０１および逆方向－０１それぞれの１００μＭプライマー０．１２５μＬ、１０μＭのプローブＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４またはＬＮＡ－５のいずれか０．６２５μｌ、参照色素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、番号Ｒ４５２６）０．０２５μｌならびにＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）または１０～１Ｅ８の被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれの標準曲線のいずれかの入力物１２．５μＬとを混合する。
３．２段階のＱＰＣＲ温度プロファイルのサイクル１＝９５℃で５分間、サイクル２～４０＝９５℃で３０秒間および６０℃で１分間を実施する。
４．被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれのＱＰＣＲ標準曲線のＱＰＣサイクル時間（Ｃｔ）値のプロットにＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のＣｔ値をプロットすることにより、３つのＭＨＣデキストラマーのうちの１つに対する抗原特異性を有するＴ細胞の相対存在量を推定する。
ｉｉ．ウルトラディープシーケンシングによる入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比の定量化。
１．ａ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）
ｂ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）
のＰＣＲ反応物２５μＬを作製する。
２．任意の標準的なＰＣＲマスターミックスを用いて、ＰＣＲ反応物と、順方向－０１および逆方向－０１それぞれの１０μＭプライマー１．２５μＬおよびＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）またはＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のいずれか１２．５μＬとを混合する。純水で２５μＬまで満たす。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２および反応緩衝液を含有するＰｒｏｍｅｇａ社の２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いる。
３．上記のＰＣＲ産物のウルトラディープシーケンシングは、十分に確立された次世代シーケンシング技術、例えばＲｏｃｈｅ ４５４、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術をはじめとするＰＣＲアンプリコンシーケンシングのハイスループットシーケンシング技術などを用いて、例えばＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ社またはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社などの多数の供給業者によって提供され得る。
４．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）の相対存在量のＰＣＲアンプリコン解析により、３つのＭＨＣデキストラマーのうちの１つに対する抗原特異性を有するＴ細胞の相対存在量が明らかになる。
ａ．シーケンシングあるいはＤＮＡタグ特異的プローブであるＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４およびＬＮＡ－５を用いるＱＰＣＲによって、入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比を定量化することにより、リンパ系細胞試料中の抗原特異的Ｔ細胞の相対存在量が明らかになる。
ｉ．ＤＮＡタグ特異的プローブであるＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４およびＬＮＡ－５を用いるＱＰＣＲによる入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比の定量化。
１．ａ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）
ｂ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）
ｃ．１０～１Ｅ８の被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれの標準曲線
のＱＰＣＲ反応物２５μＬを作製する。
２．ＪｕｍｐＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、番号Ｄ７４４０）１２．５μｌと、順方向－０１および逆方向－０１それぞれの１００μＭプライマー０．１２５μＬ、１０μＭのプローブＬＮＡ－３、ＬＮＡ－４またはＬＮＡ－５のいずれか０．６２５μｌ、参照色素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、番号Ｒ４５２６）０．０２５μｌならびにＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）または１０～１Ｅ８の被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれの標準曲線のいずれかの入力物１２．５μＬとを混合する。
３．２段階のＱＰＣＲ温度プロファイルのサイクル１＝９５℃で５分間、サイクル２～４０＝９５℃で３０秒間および６０℃で１分間を実施する。
４．被験オリゴ－０３、被験オリゴ－０４および被験オリゴ－０５それぞれのＱＰＣＲ標準曲線のＱＰＣサイクル時間（Ｃｔ）値のプロットにＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のＣｔ値をプロットすることにより、３つのＭＨＣデキストラマーのうちの１つに対する抗原特異性を有するＴ細胞の相対存在量を推定する。
ｉｉ．ウルトラディープシーケンシングによる入力物（３ａ）と捕捉された画分（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの比の定量化。
１．ａ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）
ｂ．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）
のＰＣＲ反応物２５μＬを作製する。
２．任意の標準的なＰＣＲマスターミックスを用いて、ＰＣＲ反応物と、順方向－０１および逆方向－０１それぞれの１０μＭプライマー１．２５μＬおよびＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）またはＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のいずれか１２．５μＬとを混合する。純水で２５μＬまで満たす。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ２および反応緩衝液を含有するＰｒｏｍｅｇａ社の２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いる。
３．上記のＰＣＲ産物のウルトラディープシーケンシングは、十分に確立された次世代シーケンシング技術、例えばＲｏｃｈｅ ４５４、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術をはじめとするＰＣＲアンプリコンシーケンシングのハイスループットシーケンシング技術などを用いて、例えばＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ社またはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社などの多数の供給業者によって提供され得る。
４．ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）の相対存在量のＰＣＲアンプリコン解析により、３つのＭＨＣデキストラマーのうちの１つに対する抗原特異性を有するＴ細胞の相対存在量が明らかになる。
７．予測される結果およびコメント
ａ．ＱＰＣＲまたはシーケンシングによって推定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対存在量および比は、主として３つのパラメータ、すなわち、ｉ）ＤＮＡタグ化デキストラマーの作製時（１．ａ．ｉ．１）にＤＮＡオリゴタグが供給された比、ｉｉ）ライブラリー入力物を混合する方法（３ａ）、およびｉｉｉ）ＰＣＲ反応で個々のＤＮＡオリゴタグが増幅される効率による影響を受けることが予想される。
ｉ．１つの例では、３ａで作製されＱＰＣＲまたはシーケンシングにより測定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対比は、互いに１～１０倍になるものと考えられる。
ｂ．ＱＰＣＲまたはシーケンシングによって推定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対存在量および比は、７ａに挙げた３つのパラメータに加え、主として３つのほかのパラメータ、すなわち、ｉ）３つのＭＨＣ－ペプチドの組合せのうちの１つに対する特異性を有する抗原特異的Ｔ細胞の数、ｉｉ）所与のＭＨＣ－ペプチド複合体に対する所与のＴ細胞のＴ細胞受容体の親和性および最後にｉｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞およびそれに結合したＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーを洗浄および細胞捕捉によって未結合のＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーから分離する効率による影響を受けることが予想される。
ｉ．１つの例では、５ｈで作製されＱＰＣＲまたはシーケンシングにより測定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対比は、リンパ系細胞試料中に抗原特異的Ｔ細胞が存在するＭＨＣ－ペプチド複合体を有するＭＨＣデキストラマーと結合したＤＮＡオリゴタグが１０倍超高くなるものと考えられる。
１．ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａに対する抗原特異的Ｔ細胞を有し、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌに対する抗原特異的Ｔ細胞を有さないインフルエンザ陽性、ＣＭＶ陽性のＨＬＡ－Ａ０２０１ドナーのリンパ系細胞試料では、被験オリゴ－０３（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３＝被験オリゴ－０３とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶとを有するデキストラマー）、被験オリゴ－０４（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４＝被験オリゴ－０４とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａとを有するデキストラマー）および被験オリゴ－０５（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５＝被験オリゴ－０５とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌとを有するデキストラマー）の相対比は、被験オリゴ－０３および被験オリゴ－０４が被験オリゴ－０５の１０倍超になると予想される。つまり、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）に等量供給した場合、被験オリゴ－０３および被験オリゴ－０４は、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のシーケンシングまたはＱＰＣＲによる測定で被験オリゴ－０５の１０倍超の量または頻度でみられると予想される。
ａ．ＱＰＣＲまたはシーケンシングによって推定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対存在量および比は、主として３つのパラメータ、すなわち、ｉ）ＤＮＡタグ化デキストラマーの作製時（１．ａ．ｉ．１）にＤＮＡオリゴタグが供給された比、ｉｉ）ライブラリー入力物を混合する方法（３ａ）、およびｉｉｉ）ＰＣＲ反応で個々のＤＮＡオリゴタグが増幅される効率による影響を受けることが予想される。
ｉ．１つの例では、３ａで作製されＱＰＣＲまたはシーケンシングにより測定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対比は、互いに１～１０倍になるものと考えられる。
ｂ．ＱＰＣＲまたはシーケンシングによって推定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対存在量および比は、７ａに挙げた３つのパラメータに加え、主として３つのほかのパラメータ、すなわち、ｉ）３つのＭＨＣ－ペプチドの組合せのうちの１つに対する特異性を有する抗原特異的Ｔ細胞の数、ｉｉ）所与のＭＨＣ－ペプチド複合体に対する所与のＴ細胞のＴ細胞受容体の親和性および最後にｉｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞およびそれに結合したＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーを洗浄および細胞捕捉によって未結合のＤＮＡタグ化ＭＨＣデキストラマーから分離する効率による影響を受けることが予想される。
ｉ．１つの例では、５ｈで作製されＱＰＣＲまたはシーケンシングにより測定されるＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物に含まれるＤＮＡオリゴタグの相対比は、リンパ系細胞試料中に抗原特異的Ｔ細胞が存在するＭＨＣ－ペプチド複合体を有するＭＨＣデキストラマーと結合したＤＮＡオリゴタグが１０倍超高くなるものと考えられる。
１．ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａに対する抗原特異的Ｔ細胞を有し、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌに対する抗原特異的Ｔ細胞を有さないインフルエンザ陽性、ＣＭＶ陽性のＨＬＡ－Ａ０２０１ドナーのリンパ系細胞試料では、被験オリゴ－０３（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０３＝被験オリゴ－０３とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ／ｐｐ６５／ＣＭＶとを有するデキストラマー）、被験オリゴ－０４（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０４＝被験オリゴ－０４とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ／ＭＰ／ｌｎｆｌｕｅｎｚａとを有するデキストラマー）および被験オリゴ－０５（Ｄｅｘ－Ｏｌｉｇｏ－０５＝被験オリゴ－０５とＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＡＬＩＡＰＶＨＡＶ／Ｎｅｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌとを有するデキストラマー）の相対比は、被験オリゴ－０３および被験オリゴ－０４が被験オリゴ－０５の１０倍超になると予想される。つまり、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物（３ａ）に等量供給した場合、被験オリゴ－０３および被験オリゴ－０４は、ＤＮＡタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物（５ｈ）のシーケンシングまたはＱＰＣＲによる測定で被験オリゴ－０５の１０倍超の量または頻度でみられると予想される。
実施例３
これは、あるＣＭＶ陽性ＨＩＶ陰性ドナーの血液を改変して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料とした実施例である。主鎖は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素を有するデキストランコンジュゲート（Ｉｍｍｕｄｅｘ社のデキストラマー主鎖）とした。
これは、あるＣＭＶ陽性ＨＩＶ陰性ドナーの血液を改変して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料とした実施例である。主鎖は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素を有するデキストランコンジュゲート（Ｉｍｍｕｄｅｘ社のデキストラマー主鎖）とした。
ＭＨＣ分子は、ＣＭＶ（陽性抗原）由来ペプチド抗原のまたはＨＩＶ（陰性抗原）由来ペプチド抗原のいずれかを提示するペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体とした。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ分子上にビオチン捕捉タグが生じるようビオチン化により修飾した。ＭＨＣ分子をＨＰＬＣによって精製し、対照Ｔ細胞集団を染色する機能的ｐＭＨＣ多量体の形成に関して品質を管理した。
オリゴヌクレオチド標識はＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ社（デンマーク）が合成したものである。標識を末端ビオチン捕捉タグで合成的に修飾した。標識は、Ａオリゴヌクレオチド（ビオチンで修飾）と部分的に相補的なＢオリゴヌクレオチド標識とをアニールさせた後、オリゴＡおよびオリゴＢをＤＮＡポリメラーゼにより酵素的に伸長させて完全な二本鎖標識を作製することによって得られる組合せオリゴヌクレオチド標識とした。ビオチン化ｐＭＨＣの形態のＭＨＣ分子およびビオチン修飾オリゴヌクレオチドの形態の標識をストレプトアビジン修飾デキストラン主鎖上に結合させることによって、ＭＨＣ分子を合成した。ＭＨＣ分子にはさらに、蛍光色素の形態の修飾（５ｂ）を含ませた。異なるｐＭＨＣを含む２つの個々のＭＨＣ分子が、対応する個々のオリゴヌクレオチド標識によってコードされる、２つの異なるＭＨＣ分子を作製した。
ＭＨＣ分子と試料中のＴ細胞とを結合させる条件下（６ｃ）で、一定量の試料ＰＢＭＣ（１ｂ）を一定量の混合ＭＨＣ分子（５）とインキュベートした。
最初に遠心分離による細胞沈降および洗浄緩衝液での再懸濁によりＰＢＭＣの洗浄を数ラウンド実施した後、蛍光色素で標識された細胞の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を実施することにより、細胞と結合したＭＨＣ分子を非細胞結合ＭＨＣ分子（７）から分離した。ＭＨＣ分子と効率的に結合することができるＴ細胞は、ＭＨＣ分子内に含まれる蛍光色素によって蛍光を発し、ＭＨＣ分子と結合することができないＴ細胞は蛍光を発しない。ＦＡＣＳ分取によって蛍光細胞が濃縮され、したがって、ＰＢＭＣ試料のＴ細胞と結合するＭＨＣ分子が濃縮される。
ＦＡＣＳで単離された細胞を、単離された細胞と結合しているＭＨＣ分子に付随するオリゴヌクレオチド標識の定量的ＰＣＲ解析に供して、試料中に存在するＴ細胞と結合したＭＨＣ分子のアイデンティティーを明らかにした。
このように、この実験は、ペプチド－ＭＨＣ多量体ライブラリー中に含まれるペプチド－ＭＨＣ分子を認識して結合するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞が血液中に存在するかどうかを明らかにするものである。
１．試料の調製。この実験に用いた細胞試料は、従来のＭＨＣ多量体染色による判定でＣＭＶ陽性かつＨＩＶ陰性のドナーから採血した血液からＰＢＭＣを調製することによって得られたものである。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。密度勾配媒体であるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社）は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に慎重に重層した。４９０ｇで３０分間遠心分離した後、細胞の中間層からＰＢＭＣを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート（ＢＣ）をＲＰＭＩで２回洗浄し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するウシ胎児血清（ＦＣＳ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、－１５０℃で凍結保存した。この実施例に用いたＢＣをそれぞれのウイルス特異性とともに表６に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のＭＨＣ多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。密度勾配媒体であるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社）は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に慎重に重層した。４９０ｇで３０分間遠心分離した後、細胞の中間層からＰＢＭＣを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート（ＢＣ）をＲＰＭＩで２回洗浄し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するウシ胎児血清（ＦＣＳ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、－１５０℃で凍結保存した。この実施例に用いたＢＣをそれぞれのウイルス特異性とともに表６に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のＭＨＣ多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
２．主鎖の調製：主鎖は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素を結合させたデキストラン分子とする。ストレプトアビジンは、ビオチン化オリゴヌクレオチドおよびビオチン化ｐＭＨＣ複合体（ＭＨＣ分子）の結合部位としての役割を果たす。蛍光色素は、ＭＨＣ分子と結合した細胞と、ＭＨＣ分子と結合していない細胞とを分離することを可能にするものである。
ａ．この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン（主鎖１つ当たり５～１０個）およびＰＥ形態の蛍光色素（主鎖１つ当たり２～２０個）が共有結合した１０００～２０００ＫＤａの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Ｉｍｍｕｄｅｘ社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をＳＡコンジュゲートとも呼ぶ。
ａ．この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン（主鎖１つ当たり５～１０個）およびＰＥ形態の蛍光色素（主鎖１つ当たり２～２０個）が共有結合した１０００～２０００ＫＤａの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Ｉｍｍｕｄｅｘ社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をＳＡコンジュゲートとも呼ぶ。
３．ＭＨＣ分子の調製：この実施例に用いたＭＨＣ分子は、２つの異なるクラスＩ ＭＨＣ－ペプチド複合体であった。ＭＨＣ重鎖（ＨＬＡ－Ａ０２０１およびＨＬＡ－Ｂ０７０２）およびＢ２Ｍを既に記載されている通りに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）、それぞれ２つのペプチド抗原とともにリフォールディングさせた。個々の特異性（ペプチド－ＭＨＣ分子、対立遺伝子およびペプチドの組合せ）を以下の方法で生じさせた。
ａ．合成：この実施例のＭＨＣ分子は、ＵＶ条件的９残基ペプチドリガンド（ｐ＊）を有する選択されたＨＬＡ－Ｉ単量体のＵＶ交換により生成した特異的ｐＭＨＣ単量体とした。条件的リガンドをＵＶ光（３６６ｎｍ）に曝露すると、切断されて結合溝が空になる。空になったＭＨＣ－Ｉ分子は不安定であるため、そのＨＬＡタイプに適合する別のペプチドに置き換わってレスキューされなければ、その複合体は迅速に分解する。このように、過剰の所望のＨＬＡリガンドとｐ＊ＭＨＣ単量体とを混合することによって特異的ｐＭＨＣ単量体を生成した。ｐ＊ＭＨＣ単量体は、既に記載されている通りにリフォールディングさせ、ビオチン化し、精製した（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｉ．抗原ＨＩＶポリメラーゼ由来のＨＩＶ由来ペプチドであるＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよび抗原ｐｐ６５ＴＰＲに由来するＣＭＶ由来ペプチドであるＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ社、オランダ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）で希釈し、最終濃度１００μｇ／ｍｌ：２００μＭ（ＨＬＡ－Ａ０２：ＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよびＨＬＡ－Ｂ０７：ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ）になるまで混合した。混合物を３６６ｎｍのＵＶ光（ＵＶキャビネット；ＣＡＭＡＧ社）に１時間曝露し、任意選択で４℃で最大２４時間保管した。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
ａ．合成：この実施例のＭＨＣ分子は、ＵＶ条件的９残基ペプチドリガンド（ｐ＊）を有する選択されたＨＬＡ－Ｉ単量体のＵＶ交換により生成した特異的ｐＭＨＣ単量体とした。条件的リガンドをＵＶ光（３６６ｎｍ）に曝露すると、切断されて結合溝が空になる。空になったＭＨＣ－Ｉ分子は不安定であるため、そのＨＬＡタイプに適合する別のペプチドに置き換わってレスキューされなければ、その複合体は迅速に分解する。このように、過剰の所望のＨＬＡリガンドとｐ＊ＭＨＣ単量体とを混合することによって特異的ｐＭＨＣ単量体を生成した。ｐ＊ＭＨＣ単量体は、既に記載されている通りにリフォールディングさせ、ビオチン化し、精製した（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｉ．抗原ＨＩＶポリメラーゼ由来のＨＩＶ由来ペプチドであるＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよび抗原ｐｐ６５ＴＰＲに由来するＣＭＶ由来ペプチドであるＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ社、オランダ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）で希釈し、最終濃度１００μｇ／ｍｌ：２００μＭ（ＨＬＡ－Ａ０２：ＩＬＫＥＰＶＨＧＶおよびＨＬＡ－Ｂ０７：ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ）になるまで混合した。混合物を３６６ｎｍのＵＶ光（ＵＶキャビネット；ＣＡＭＡＧ社）に１時間曝露し、任意選択で４℃で最大２４時間保管した。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
４．標識の調製：この実施例では、長さは同じであるが配列が一部異なる２つの異なるオリゴヌクレオチドを作製した。各オリゴヌクレオチドは特異的ｐＭＨＣと結合し、ひいてはこの特異的ｐＭＨＣをコードした。オリゴヌクレオチドをビオチン化して、デキストラン－ストレプトアビジンコンジュゲート主鎖と容易に結合するようにした。
ａ．合成：標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。
ｉ．使用した標識は２ＯＳ標識システムと命名され、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑度を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。２ＯＳと呼ばれるこの戦略では、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列（ＡオリゴおよびＢオリゴ）のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをＤＮＡオリゴヌクレオチド標識として用いた。例えば、２２のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列（Ａ標識前駆体）と、５５の別の固有のオリゴヌクレオチド配列（Ｂ標識前駆体）とを組み合わせることにより、（例えば、表９の１００個を有する）１，２１０の異なる（Ａｘ＋Ｂｙ）標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
１．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を２つ得た（Ａ１＋Ｂ１からＡ１Ｂ１が得られ、Ａ２＋Ｂ２からＡ２Ｂ２が得られた）。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃に２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。
ｃ．精製：標識の精製はそれ以上実施しなかった。
ａ．合成：標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。
ｉ．使用した標識は２ＯＳ標識システムと命名され、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑度を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。２ＯＳと呼ばれるこの戦略では、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列（ＡオリゴおよびＢオリゴ）のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをＤＮＡオリゴヌクレオチド標識として用いた。例えば、２２のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列（Ａ標識前駆体）と、５５の別の固有のオリゴヌクレオチド配列（Ｂ標識前駆体）とを組み合わせることにより、（例えば、表９の１００個を有する）１，２１０の異なる（Ａｘ＋Ｂｙ）標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
１．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を２つ得た（Ａ１＋Ｂ１からＡ１Ｂ１が得られ、Ａ２＋Ｂ２からＡ２Ｂ２が得られた）。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃に２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。
ｃ．精製：標識の精製はそれ以上実施しなかった。
５．ＭＨＣ分子の調製：必ず所与のｐＭＨＣと所与のオリゴヌクレオチドとが結合するように、ＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）および標識（オリゴヌクレオチド）と主鎖（主鎖、デキストラン－ストレプトアビジン－蛍光色素コンジュゲート）とを結合させてＭＨＣ分子を形成した。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化ＡｘＢｘオリゴの形態の標識で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによりＭＨＣ分子の作製を実施し、４℃で少なくとも３０分間インキュベートした。標識を結合させた後、任意選択で主鎖を４℃で最大２４時間保管した。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。表１に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をプレートに等分した。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）を表１に記載されるｐＭＨＣ単量体の最終濃度になるまでＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で少なくとも３０分間または最大２４時間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。２つのＭＨＣ分子を２組作製した。２つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように２つの組の間で逆転させた。
１．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させた。
２．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させた。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子を試料に加える前に３３００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化ＡｘＢｘオリゴの形態の標識で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによりＭＨＣ分子の作製を実施し、４℃で少なくとも３０分間インキュベートした。標識を結合させた後、任意選択で主鎖を４℃で最大２４時間保管した。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。表１に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をプレートに等分した。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）を表１に記載されるｐＭＨＣ単量体の最終濃度になるまでＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で少なくとも３０分間または最大２４時間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。２つのＭＨＣ分子を２組作製した。２つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように２つの組の間で逆転させた。
１．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させた。
２．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させた。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子を試料に加える前に３３００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
６．試料とＭＨＣ分子のインキュベーション：細胞試料とＭＨＣ分子とを１つの容器内で混合して、ＭＨＣ分子とそれが認識するＴ細胞とを結合させた。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞を用いた。
ｂ．ＭＨＣ分子の量：表１に従った。インキュベーション１回当たり、ＭＨＣ分子（ペプチド－ＭＨＣ分子）それぞれについて算出された１μｇ／ｍｌが必要であった。
ｃ．条件：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む３７℃のＲＰＭＩ １０ｍｌ中でＢＣを融解させ、４９０ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １０ｍｌで２回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。２×１０Ｅ６の細胞をバーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）２００μｌで洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をＭＨＣ分子とインキュベートする前に、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした（Ｌｉｓｓｉｎａら，２００９）。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、５つのＭＨＣ分子がそれぞれ（ｐＭＨＣ当たり）１μｇ／ｍｌ必要であった。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をバーコード緩衝液２００μｌで２回洗浄し、パラホルムアルデヒドの１％リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）溶液２００μｌ中、４℃で一晩インキュベートした。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞を用いた。
ｂ．ＭＨＣ分子の量：表１に従った。インキュベーション１回当たり、ＭＨＣ分子（ペプチド－ＭＨＣ分子）それぞれについて算出された１μｇ／ｍｌが必要であった。
ｃ．条件：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む３７℃のＲＰＭＩ １０ｍｌ中でＢＣを融解させ、４９０ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １０ｍｌで２回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。２×１０Ｅ６の細胞をバーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）２００μｌで洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をＭＨＣ分子とインキュベートする前に、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした（Ｌｉｓｓｉｎａら，２００９）。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、５つのＭＨＣ分子がそれぞれ（ｐＭＨＣ当たり）１μｇ／ｍｌ必要であった。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をバーコード緩衝液２００μｌで２回洗浄し、パラホルムアルデヒドの１％リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）溶液２００μｌ中、４℃で一晩インキュベートした。
７．所望の特徴を有するＭＨＣ分子の濃縮：この実施例では、フローサイトメトリー、より具体的には蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いることによってＭＨＣ分子を濃縮した。ＭＨＣ分子は蛍光色素を有する。したがって、ＭＨＣ分子と結合する細胞は蛍光を発し、ＦＡＣＳ分取器を適用することにより、ＭＨＣ分子と結合しないため蛍光を発しない細胞から分離することができる。その結果、細胞と結合したＭＨＣ分子が濃縮される。
ａ．適用：３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａで細胞を分取した。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いてフローサイトメトリーデータの解析を実施した。以下のゲーティング戦略を適用した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４０陰性（ＦＩＴＣ）／ＣＤ８陽性細胞（ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した（表２）。ＭＨＣ分子と結合した細胞は、ＰｅｒＣＰ陽性集団内にあると定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、バーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大で１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を７ａに記載される通りにＦＡＣＳによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために２％ＢＳＡ溶液で２時間～一晩予め飽和させバーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素（ＰＥ）陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
ａ．適用：３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａで細胞を分取した。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いてフローサイトメトリーデータの解析を実施した。以下のゲーティング戦略を適用した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４０陰性（ＦＩＴＣ）／ＣＤ８陽性細胞（ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した（表２）。ＭＨＣ分子と結合した細胞は、ＰｅｒＣＰ陽性集団内にあると定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、バーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大で１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を７ａに記載される通りにＦＡＣＳによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために２％ＢＳＡ溶液で２時間～一晩予め飽和させバーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素（ＰＥ）陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
８．濃縮されたＭＨＣ分子の同定：標識（この実施例では、オリゴヌクレオチド標識）を同定することにより、細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができた。したがって、標識特異的Ｑ－ＰＣＲプローブを用いた定量的ＰＣＲにより、細胞とともに回収されたＭＨＣ分子内に含まれていたオリゴヌクレオチドを解析した。これにより、細胞試料の細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができた。
ａ．分取された細胞に由来する標識を表４に記載のＱＰＣＲによって解析した。ＱＰＣＲは以下のキット：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＱＲＴ＿ＰＣＲ Ｌｏｗ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、番号６００８３７）を用いて実施した。温度プロファイルを表５に記載する。ＰＣＲはサーマルサイクラー：Ｍｘ３０００Ｐ ｑＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で実施した。
ａ．分取された細胞に由来する標識を表４に記載のＱＰＣＲによって解析した。ＱＰＣＲは以下のキット：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＱＲＴ＿ＰＣＲ Ｌｏｗ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、番号６００８３７）を用いて実施した。温度プロファイルを表５に記載する。ＰＣＲはサーマルサイクラー：Ｍｘ３０００Ｐ ｑＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で実施した。
実施例３の結果および結論
分取およびｑＰＣＲの後、得られたＣｔ値から、ＣＭＶエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、ＨＩＶエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された（図７）。
分取およびｑＰＣＲの後、得られたＣｔ値から、ＣＭＶエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、ＨＩＶエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された（図７）。
このように、試料中に所与のｐＭＨＣ分子を認識するＴ細胞が存在する場合にのみ、細胞との相互作用、分取およびｑＰＣＲの後に２ＯＳ標識が回収されることが確認された。
図７：
陰性対照バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーにおけるＢ７ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲ特異性の検出。１では固有の２ＯＳバーコードを陽性対照試薬と結合させ、２では別の固有の２ＯＳバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをＨＩＶ陰性対照試薬と結合させた。Ａは、別個の２ＯＳバーコードを有するＣＭＶ ｐＭＨＣ多量体およびＨＩＶ ｐＭＨＣ多量体で染色した後のＰＥ陽性集団を示す代表的なドットプロットである。Ｂは、分取されたＰＥ－ｐＭＨＣ－デキストラマー陽性細胞のマルチプレックスｑＰＣＲから得られたＣｔ値である。細胞を１および２でそれぞれ染色した。染色時、陽性対照（ＣＭＶ）２ＯＳバーコードを結合させた試薬および陰性対照（ＨＩＶ）２ＯＳバーコードを結合させた試薬は存在したが、陰性対照（ＨＩＶ）バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーは明らかに洗い流された。２つの個々の実験から得られた結果は別個のバーで示されている。別個のＰＣＲにそれぞれ約２００個の細胞を供した。ＱＰＣＲは二重反復で実施したものであり、Ｃｔ値は二重反復の平均±範囲で示されている。
陰性対照バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーにおけるＢ７ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲ特異性の検出。１では固有の２ＯＳバーコードを陽性対照試薬と結合させ、２では別の固有の２ＯＳバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをＨＩＶ陰性対照試薬と結合させた。Ａは、別個の２ＯＳバーコードを有するＣＭＶ ｐＭＨＣ多量体およびＨＩＶ ｐＭＨＣ多量体で染色した後のＰＥ陽性集団を示す代表的なドットプロットである。Ｂは、分取されたＰＥ－ｐＭＨＣ－デキストラマー陽性細胞のマルチプレックスｑＰＣＲから得られたＣｔ値である。細胞を１および２でそれぞれ染色した。染色時、陽性対照（ＣＭＶ）２ＯＳバーコードを結合させた試薬および陰性対照（ＨＩＶ）２ＯＳバーコードを結合させた試薬は存在したが、陰性対照（ＨＩＶ）バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーは明らかに洗い流された。２つの個々の実験から得られた結果は別個のバーで示されている。別個のＰＣＲにそれぞれ約２００個の細胞を供した。ＱＰＣＲは二重反復で実施したものであり、Ｃｔ値は二重反復の平均±範囲で示されている。
実施例４
これは、あるＣＭＶ陽性ＨＩＶ陰性ドナーの血液を改変して（１ｂ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料（１）とした実施例である。
これは、あるＣＭＶ陽性ＨＩＶ陰性ドナーの血液を改変して（１ｂ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料（１）とした実施例である。
主鎖（２）は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素（Ｉｍｍｕｄｅｘ社のデキストラマー主鎖）を有するデキストランコンジュゲートとした。
この実施例は実施例１とほぼ同じものであるが、無関係のＭＨＣ分子を有するが標識のない１０００倍過剰のＭＨＣ分子を用いた点が異なっている。使用したＭＨＣ分子（３）は、ＣＭＶ（陽性抗原）由来ペプチド抗原もしくはＨＩＶ（陰性抗原）由来ペプチド抗原のいずれかを提示するペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体または無関係のペプチド抗原を提示するｐＭＨＣ複合体である。ＭＨＣ分子上にビオチン捕捉タグが生じるようにＭＨＣ分子をビオチン化により修飾した（３ｂ）。ＭＨＣ分子をＨＰＬＣにより精製した（２ｃ）。標識（４）はオリゴヌクレオチドとした。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ社（デンマーク）が合成したものである（４ａ）。標識を末端ビオチン捕捉タグで合成的に修飾した（４ｂ）。
ビオチン化ｐＭＨＣの形態のＭＨＣ分子およびビオチン修飾オリゴヌクレオチドの形態の標識をストレプトアビジン修飾デキストラン主鎖上に結合させることによって、ＭＨＣ分子（５）を合成した（５ａ）。ＭＨＣ分子にはさらに、蛍光色素の形態の修飾（５ｂ）を含ませた。３つの異なるＭＨＣ分子を作製し、ここでは、これらの個々のＭＨＣ分子のうちＣＭＶに対するｐＭＨＣおよびＨＩＶに対するｐＭＨＣを含む２つのＭＨＣ分子が、対応する個々のオリゴヌクレオチド標識によってコードされていた。無関係のＭＨＣ分子を有するＭＨＣ分子はオリゴヌクレオチド標識でコードされていなかった。ＭＨＣ分子と試料中のＴ細胞とを結合させる条件下（６ｃ）で、一定量の試料ＰＢＭＣ（１ｂ）を一定量の混合ＭＨＣ分子（５）と１：１の比でインキュベートし、さらには１０００倍の未標識ｐ＊ＭＨＣ標識主鎖を含めた。
最初に遠心分離による細胞沈降および洗浄緩衝液での再懸濁によりＰＢＭＣの洗浄を数ラウンド実施した後、蛍光色素で標識された細胞の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を実施することにより、細胞と結合したＭＨＣ分子を非細胞結合ＭＨＣ分子から分離した（７）。ＭＨＣ分子と効率的に結合することができるＴ細胞は、ＭＨＣ分子内に含まれる蛍光色素によって蛍光を発し、ＭＨＣ分子と結合することができないＴ細胞は蛍光を発しない。ＦＡＣＳ分取によって蛍光細胞が濃縮され、したがって、ＰＢＭＣ試料のＴ細胞と結合するＭＨＣ分子が濃縮される。
ＦＡＣＳで単離された細胞を、単離された細胞と結合しているＭＨＣ分子に付随するオリゴヌクレオチド標識の定量的ＰＣＲ解析に供して、試料中に存在するＴ細胞と結合したＭＨＣ分子のアイデンティティーを明らかにした。
このように、この実験から、血液試料中に存在するＴ細胞のＴ細胞受容体のペプチド－ＭＨＣ特異性が明らかになった。さらに、ＣＭＶ抗原（陽性）に特異的なＴ細胞をＨＩＶ抗原（陰性）に特異的なＴ細胞および無関係のペプチド抗原を提示する過剰のＭＨＣ分子に特異的なＴ細胞よりも濃縮することが実現可能であることが明らかになった。
１．試料の調製。この実験に用いた細胞試料は、従来のＭＨＣ多量体染色による判定でＣＭＶ陽性かつＨＩＶ陰性のドナーから採血した血液からＰＢＭＣを調製することによって得られたものである。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。密度勾配媒体であるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社）は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に慎重に重層した。４９０ｇで３０分間遠心分離した後、細胞の中間層からＰＢＭＣを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート（ＢＣ）をＲＰＭＩで２回洗浄し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するウシ胎児血清（ＦＣＳ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、－１５０℃で凍結保存した。この実施例に用いたＢＣをそれぞれのウイルス特異性とともに表６に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のＭＨＣ多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。密度勾配媒体であるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社）は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１：１に希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に慎重に重層した。４９０ｇで３０分間遠心分離した後、細胞の中間層からＰＢＭＣを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート（ＢＣ）をＲＰＭＩで２回洗浄し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するウシ胎児血清（ＦＣＳ；ｇｉｂｃｏ－Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、－１５０℃で凍結保存した。この実施例に用いたＢＣをそれぞれのウイルス特異性とともに表６に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のＭＨＣ多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
２．主鎖の調製：この実施例に用いる主鎖は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素を結合させたデキストラン分子とする。ストレプトアビジンは、ビオチン化オリゴヌクレオチド（標識）およびビオチン化ｐＭＨＣ複合体（ＭＨＣ分子）の結合部位としての役割を果たす。蛍光色素は、ＭＨＣ分子と結合した細胞と、ＭＨＣ分子と結合していない細胞とを分離することを可能にするものである。
ａ．この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン（主鎖１つ当たり５～１０個）およびＰＥ形態の蛍光色素（主鎖１つ当たり２～２０個）が共有結合した１０００～２０００ＫＤａの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Ｉｍｍｕｄｅｘ社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をＳＡコンジュゲートとも呼ぶ。
ａ．この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン（主鎖１つ当たり５～１０個）およびＰＥ形態の蛍光色素（主鎖１つ当たり２～２０個）が共有結合した１０００～２０００ＫＤａの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Ｉｍｍｕｄｅｘ社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をＳＡコンジュゲートとも呼ぶ。
３．ＭＨＣ分子の調製：この実施例に用いたＭＨＣ分子は、２つの異なるクラスＩ ＭＨＣ－ペプチド複合体であった。ＭＨＣ重鎖（ＨＬＡ－Ａ０２およびＨＬＡ－Ｂ０７）およびＢ２Ｍを既に記載されている通りに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）、それぞれ２つのペプチド抗原とともにリフォールディングさせた。個々の特異性（対立遺伝子とエピトープの組合せ）を以下の方法で生じさせた。
ａ．合成：実験１のＡ。
ｉ．実験１と同じ。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：実験１と同じ。
ａ．合成：実験１のＡ。
ｉ．実験１と同じ。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：実験１と同じ。
４．標識の調製：この実施例では、長さは同じであるが配列が一部異なる２つの異なるオリゴヌクレオチドを作製した。各オリゴヌクレオチドは特異的ｐＭＨＣと結合し、ひいてはこの特異的ｐＭＨＣをコードする。オリゴヌクレオチドをビオチン化して、デキストラン－ストレプトアビジンコンジュゲート主鎖と容易に結合するようにした。
ａ．合成：この実施例では、標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。
ｉ．実験１と同じ。
ｉｉ．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を２つ得た（Ａ１＋Ｂ１からＡ１Ｂ１が得られ、Ａ２＋Ｂ２からＡ２Ｂ２が得られた）。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃で２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。
ｃ．精製：標識の精製はそれ以上実施しなかった。
５．ＭＨＣ分子の調製：必ず所与のｐＭＨＣと所与のオリゴヌクレオチドとが結合するように、ＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）および標識（オリゴヌクレオチド）と主鎖（主鎖、デキストラン－ストレプトアビジン－蛍光色素コンジュゲート）とを結合させてＭＨＣ分子を形成した。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化ＡｘＢｘオリゴの形態の標識で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによりＭＨＣ分子の作製を実施し、４℃で３０分間インキュベートした。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。表１に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をチューブに等分して入れた。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）を表１に記載されるｐＭＨＣ単量体の最終濃度になるまでＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。２つのＭＨＣ分子を２組作製した。２つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように２つの組の間で逆転させた。
１．ｉｖ．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させた。
２．ｖ．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させた。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子を試料に加える前に５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
ａ．合成：この実施例では、標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。
ｉ．実験１と同じ。
ｉｉ．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を２つ得た（Ａ１＋Ｂ１からＡ１Ｂ１が得られ、Ａ２＋Ｂ２からＡ２Ｂ２が得られた）。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃で２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。
ｃ．精製：標識の精製はそれ以上実施しなかった。
５．ＭＨＣ分子の調製：必ず所与のｐＭＨＣと所与のオリゴヌクレオチドとが結合するように、ＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）および標識（オリゴヌクレオチド）と主鎖（主鎖、デキストラン－ストレプトアビジン－蛍光色素コンジュゲート）とを結合させてＭＨＣ分子を形成した。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化ＡｘＢｘオリゴの形態の標識で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによりＭＨＣ分子の作製を実施し、４℃で３０分間インキュベートした。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。表１に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をチューブに等分して入れた。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）を表１に記載されるｐＭＨＣ単量体の最終濃度になるまでＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。２つのＭＨＣ分子を２組作製した。２つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように２つの組の間で逆転させた。
１．ｉｖ．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させた。
２．ｖ．１×ＣＭＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ２Ｂ２とを結合させ、１×ＨＩＶ特異的ｐＭＨＣと２ＯＳ－Ａ１Ｂ１とを結合させた。
ｂ．改変：それ以上改変は実施しなかった。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子を試料に加える前に５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
６．試料とＭＨＣ分子のインキュベーション：細胞試料とＭＨＣ分子とを１つの容器内で混合して、ＭＨＣ分子とそれが認識するＴ細胞とを結合させた。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞を用いた。
ｂ．ＭＨＣ分子の量：表１に従った。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子が５μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。
ｃ．条件：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む３７℃のＲＰＭＩ １０ｍｌ中でＢＣを融解させ、１５００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １０ｍｌで２回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞をバーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）で洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をＭＨＣ分子とインキュベートする前に、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子がそれぞれ（ｐＭＨＣ当たり）５μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞を用いた。
ｂ．ＭＨＣ分子の量：表１に従った。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子が５μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。
ｃ．条件：１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む３７℃のＲＰＭＩ １０ｍｌ中でＢＣを融解させ、１５００ｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １０ｍｌで２回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。１×１０Ｅ６～２×１０Ｅ６の細胞をバーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）で洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をＭＨＣ分子とインキュベートする前に、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子がそれぞれ（ｐＭＨＣ当たり）５μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。
７．所望の特徴を有するＭＨＣ分子の濃縮：この実施例では、フローサイトメトリー、より具体的には蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いることによってＭＨＣ分子を濃縮した。ＭＨＣ分子は蛍光色素を有する。したがって、ＭＨＣ分子と結合する細胞は蛍光を発し、ＦＡＣＳ分取器により、ＭＨＣ分子と結合しないため蛍光を発しない細胞と分離することができる。その結果、細胞と結合したＭＨＣ分子が濃縮される。
ａ．適用：取得に２つの異なるフローサイトメータを用いた。３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩおよび５つのレーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩサイトメータである。ＬＳＲ ＩＩのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは４つのみである（４８８ｎｍ青色レーザー、６４０ｎｍ赤色レーザー、３５５ｎｍ ＵＶレーザーおよび４０５ｎｍ紫色レーザー）。さらに、３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いた。以下のゲーティング戦略を適用した。ＣＤ８陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびダンプチャネル陰性／ＣＤ８陽性細胞（ＦＩＴＣ／ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、ＦＡＣＳ緩衝液またはバーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を７ａに記載される通りにＦＡＣＳによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、２％ＢＳＡ溶液で２時間～一晩予め飽和させ、バーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素（ＰＥ）陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
ａ．適用：取得に２つの異なるフローサイトメータを用いた。３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩおよび５つのレーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩサイトメータである。ＬＳＲ ＩＩのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは４つのみである（４８８ｎｍ青色レーザー、６４０ｎｍ赤色レーザー、３５５ｎｍ ＵＶレーザーおよび４０５ｎｍ紫色レーザー）。さらに、３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いた。以下のゲーティング戦略を適用した。ＣＤ８陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびダンプチャネル陰性／ＣＤ８陽性細胞（ＦＩＴＣ／ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、ＦＡＣＳ緩衝液またはバーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を７ａに記載される通りにＦＡＣＳによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、２％ＢＳＡ溶液で２時間～一晩予め飽和させ、バーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素（ＰＥ）陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
８．濃縮されたＭＨＣ分子の同定：標識（この実施例では、オリゴヌクレオチド標識）を同定することにより、細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができる。したがって、標識特異的Ｑ－ＰＣＲプローブを用いた定量的ＰＣＲにより、細胞とともに回収されたＭＨＣ分子内に含まれていたオリゴヌクレオチドを解析した。これにより、細胞試料の細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができた。
ａ．分取された細胞に由来する標識を実験１と同様にＱＰＣＲにより解析した。
ａ．分取された細胞に由来する標識を実験１と同様にＱＰＣＲにより解析した。
実施例４の結果および結論
分取およびｑＰＣＲの後、得られたＣｔ値から、ＣＭＶエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、ＨＩＶエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された（図８）。
分取およびｑＰＣＲの後、得られたＣｔ値から、ＣＭＶエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、ＨＩＶエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された（図８）。
陽性対照試薬と結合させた場合にのみ、細胞との相互作用、分取およびｑＰＣＲの後に２ＯＳ標識が回収されることが確認された。
図８
陰性対照バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーにおけるＣＭＶ特異性の検出。１では固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させ、２では別の固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをＨＩＶ陰性対照試薬と結合させた。さらに、１、２ともに９９８×未標識陰性対照試薬が存在する。
陰性対照バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーにおけるＣＭＶ特異性の検出。１では固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させ、２では別の固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをＨＩＶ陰性対照試薬と結合させた。さらに、１、２ともに９９８×未標識陰性対照試薬が存在する。
Ａは、分取されたＰＥ－ｐＭＨＣ－デキストラマー陽性細胞のマルチプレックスｑＰＣＲから得られたＣｔ値である。細胞を１および２でそれぞれ染色した。染色時、陽性対照（ＣＭＶ）バーコードを結合させた試薬および陰性対照（ＨＩＶ）バーコードを結合させた試薬は存在したが、陰性対照（ＨＩＶ）バーコード標識ｐＭＨＣデキストラマーは明らかに洗い流された。別個のｑＰＣＲでそれぞれ約５７５個の細胞を解析した。Ｂは、得られたＣｔ値に対して推定される細胞１個当たりに結合したバーコードの数である。ｑＰＣＲに存在する細胞の数はいずれも同じであったが、Ｂに示されるＣｔ値にいくらか差が認められるのは明らかである。しかし、これらの値をその特異的プローブに対して正規化すると、同じレベルになる。ＱＰＣＲは二重反復で実施したものであり、ここでは、二重反復の平均±範囲が示されている。
実施例５
これは、血液を改変して（１ｂ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料（１）とした実施例である。
これは、血液を改変して（１ｂ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得たものを試料（１）とした実施例である。
主鎖（２）は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素（Ｉｍｍｕｄｅｘ社のデキストラマー主鎖）を有するデキストランコンジュゲートとした。
ＭＨＣ分子（３）は、８～１０アミノ酸のペプチド抗原を提示するペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体である。ＭＨＣ分子上にビオチン捕捉タグが生じるようにＭＨＣ分子をビオチン化により修飾した（３ｂ）。ＭＨＣ分子をＨＰＬＣにより精製した（２ｃ）。標識（４）はオリゴヌクレオチドとした。オリゴヌクレオチド標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓ社（デンマーク）が合成し（４ａ）、末端ビオチン捕捉タグで合成的に修飾した（４ｂ）ものである。実施例の一部では、オリゴヌクレオチド標識を部分的に相補的なオリゴヌクレオチド標識とアニールさせることによってさらに修飾し、組み合わさったオリゴヌクレオチド標識にした。
ビオチン化ｐＭＨＣの形態のＭＨＣ分子およびビオチン修飾オリゴヌクレオチドの形態の標識をストレプトアビジン修飾デキストラン主鎖（デンマークのＩｍｍｕｄｅｘ社のデキストラマー主鎖）上に結合させることによって、ＭＨＣ分子（５）を合成した（５ａ）。ＭＨＣ分子にはさらに、蛍光色素の形態の修飾（５ｂ）が含まれている。１１０の異なるＭＨＣ分子からなり、異なるｐＭＨＣを含む個々のＭＨＣ分子が対応する個々のオリゴヌクレオチド標識によってコードされているライブラリーを作製した。
ＭＨＣ分子と試料中のＴ細胞とを結合させる条件（例えば、インキュベーション時間、緩衝液、ｐＨおよび温度）下（６ｃ）で、一定量の試料ＰＢＭＣ（１ｂ）を一定量のＭＨＣ分子のライブラリー（５）とインキュベートした。
最初に遠心分離による細胞沈降および洗浄緩衝液での再懸濁によりＰＢＭＣの洗浄を数ラウンド実施した後、蛍光色素で標識された細胞の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を実施することにより、細胞と結合したＭＨＣ分子を非細胞結合ＭＨＣ分子から分離した（７）。ＭＨＣ分子と効率的に結合することができるＴ細胞は、ＭＨＣ分子内に含まれる蛍光色素によって蛍光を発し、ＭＨＣ分子と結合することができないＴ細胞は蛍光を発しない。ＦＡＣＳ分取によって蛍光細胞が濃縮され、したがって、ＰＢＭＣ試料のＴ細胞と結合するＭＨＣ分子が濃縮される。
ＦＡＣＳで単離された細胞を、細胞と結合しているＭＨＣ分子に付随するオリゴヌクレオチド標識のＰＣＲ増幅に供した。次いで、ＰＣＲ反応によって得られた個々のＤＮＡフラグメントのシーケンシングを実施することにより、試料中に存在するＴ細胞と結合したＭＨＣ分子のアイデンティティーを明らかにした。
このように、この実験から、血液試料中に存在するＴ細胞のＴ細胞受容体のペプチド－ＭＨＣ特異性が明らかになった。
１．試料の調製。この実験に用いた細胞試料は、２例の異なるドナーＢＣ２６０および１７１から採血した血液を混合することによって得られたものである（表６）。Ｂ０７０２陰性ドナー試料にＢ０７０２ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲ応答の漸増が得られるように、１７１でのＢＣ２６０の５倍希釈、すなわち、５％、１％、０．２％、０．０４％、０．００８％、０．００１６％および０．０００３２％のＢ０７０２ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲの特異的細胞の理論的頻度に対応する１００％、２０％、５％、１％、０．２％、０．０４％、０．０１２５％、０．００２５％のＢＣ２６０を実施した。したがって、この方法の感度およびこの実験で得られた結果の妥当性は、実験終了時、同じ細胞での別の方法を用いて同時に得られたデータと比較することにより評価することができた。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：
ｉ．実験１と同じ。
ｉｉ．上記の２つの血液試料を混合した。
ａ．試料の取得：Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋから血液を入手した。
ｂ．試料の改変：
ｉ．実験１と同じ。
ｉｉ．上記の２つの血液試料を混合した。
２．主鎖の調製：実験１と同じ。
３．ＭＨＣ分子の調製：この実施例に用いたＭＨＣ分子はクラスＩ ＭＨＣ－ペプチド複合体であった。個々の特異性（対立遺伝子とエピトープの組合せ）を実験１に記載される通りに生じさせた。ここでは、表１０に対応する１１０の異なるペプチドＭＨＣ分子からなるライブラリーを用いた。
ａ．合成：実験１に記載される通り。
ｉ．ＭＨＣ重鎖およびＢ２Ｍの両方を既に記載されている通りに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｉｉ．ｐ＊ＭＨＣ単量体を既に記載されている通りにリフォールディングさせ精製した（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｂ．修飾：ｐ＊ＵＶ条件的ペプチドリガンドを検討対象のペプチド抗原に交換して、特異的ペプチドＭＨＣ単量体を得た。
ｉ．ペプチド（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ社）をリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）で希釈し、３８４ウェルプレートの個々のウェルで最終濃度１００μｇ／ｍｌ：２００μＭ（単量体：ペプチド）になるまで混合した。各ウェルフォーマットで最大体積７０μｌを調製した。混合物を３６６ｎｍのＵＶ光（ＵＶキャビネット；ＣＡＭＡＧ）に１時間曝露し、任意選択で４℃で最大２４時間保管した。
ｃ．精製：実験２と同じ。
ａ．合成：実験１に記載される通り。
ｉ．ＭＨＣ重鎖およびＢ２Ｍの両方を既に記載されている通りに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｉｉ．ｐ＊ＭＨＣ単量体を既に記載されている通りにリフォールディングさせ精製した（Ｈａｄｒｕｐら，２００９）。
ｂ．修飾：ｐ＊ＵＶ条件的ペプチドリガンドを検討対象のペプチド抗原に交換して、特異的ペプチドＭＨＣ単量体を得た。
ｉ．ペプチド（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ社）をリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ社）で希釈し、３８４ウェルプレートの個々のウェルで最終濃度１００μｇ／ｍｌ：２００μＭ（単量体：ペプチド）になるまで混合した。各ウェルフォーマットで最大体積７０μｌを調製した。混合物を３６６ｎｍのＵＶ光（ＵＶキャビネット；ＣＡＭＡＧ）に１時間曝露し、任意選択で４℃で最大２４時間保管した。
ｃ．精製：実験２と同じ。
４．標識の調製：この実施例では、長さは同じであるが配列が異なる１１０の異なるオリゴヌクレオチドを作製した。各オリゴヌクレオチドは特異的ｐＭＨＣと結合し、ひいてはこの特異的ｐＭＨＣをコードした。オリゴヌクレオチドをビオチン化して、デキストラン－ストレプトアビジンコンジュゲート主鎖と容易に結合するようにした。
ａ．合成：この実施例では、標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。２種類のＤＮＡオリゴヌクレオチド標識を使用し、それぞれ１ＯＳおよび２ＯＳと命名した。
ｉ．１２０ １ＯＳ標識は、５’ビオチン化修飾を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に注文したものである。標識を０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。１ＯＳ標識の配列については表９および１０を参照されたい。
ｉｉ．２ＯＳ標識システムは、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑性を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。２ＯＳと呼ばれるこの戦略では、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをＤＮＡオリゴヌクレオチド標識として用いた（表９および１０）。例えば、２０のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列（Ａ標識前駆体）と、６０の別の固有のオリゴヌクレオチド配列（Ｂ標識前駆体）とを組み合わせることにより、１，２００の異なる（Ａｘ＋Ｂｙ）標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
１．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を得た。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃で２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３．４に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。次いで、伸長したオリゴヌクレオチド配列２ＯＳ標識を１ＯＳ標識と同様に処理した。
ａ．合成：この実施例では、標識は、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（デンマーク）から購入し凍結乾燥粉末として送付されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で１００μＭの標識ストック希釈液を作製し、－２０℃で保管した。２種類のＤＮＡオリゴヌクレオチド標識を使用し、それぞれ１ＯＳおよび２ＯＳと命名した。
ｉ．１２０ １ＯＳ標識は、５’ビオチン化修飾を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社に注文したものである。標識を０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。１ＯＳ標識の配列については表９および１０を参照されたい。
ｉｉ．２ＯＳ標識システムは、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑性を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。２ＯＳと呼ばれるこの戦略では、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをＤＮＡオリゴヌクレオチド標識として用いた（表９および１０）。例えば、２０のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列（Ａ標識前駆体）と、６０の別の固有のオリゴヌクレオチド配列（Ｂ標識前駆体）とを組み合わせることにより、１，２００の異なる（Ａｘ＋Ｂｙ）標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
１．部分的に相補的なＡオリゴヌクレオチドとＢオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったＡ＋Ｂオリゴヌクレオチド標識を得た。ＡオリゴとＢオリゴを表３に記載される通りに混合し、６５℃で２分間加熱し、１５～３０分で３５℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたＡオリゴとＢオリゴを表３．４に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で５分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング（左）および伸長（右）に用いた試薬を表３に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、番号７０７７０）のものである。
ｂ．改変：いずれの標識も、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度（６４０ｎＭ）に希釈した。次いで、伸長したオリゴヌクレオチド配列２ＯＳ標識を１ＯＳ標識と同様に処理した。
５．ＭＨＣ分子の調製：ｐＭＨＣとオリゴヌクレオチドとの間に１：１の関係を維持しながら、必ず所与のｐＭＨＣと所与のオリゴヌクレオチドとが結合するように、ＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）および標識（オリゴヌクレオチド）と主鎖（主鎖、デキストラン－ストレプトアビジン－蛍光色素コンジュゲート）とを結合させてＭＨＣ分子を形成した。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化オリゴヌクレオチドの形態で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．ＭＨＣ分子の作製は、別途記載されない限り、主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによって実施し、４℃で３０分間インキュベートした。新たなバッチの主鎖および／または標識を用いた場合、漸増法を実施した後に必ず標識と主鎖（主鎖）との結合を判定した。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をペプチド交換反応の設定に適合する新たな９６ウェルプレートに等分した。ＰＥを組み立てる方法の違い。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）をＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。
ｂ．改変：組み合わせたＭＨＣ分子のパネルの総体積が試料とのインキュベーション１回当たり１００μｌを上回った場合、体積を減らした。
ｉ．カットオフが３００ｋＤａのサイズ排除スピンカラムＶｉｖａｓｐｉｎ ５００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に２％ＢＳＡ／ＰＢＳ ５００μｌを加えることにより飽和させ、その分量が通過するまで５０００ｇで遠心分離した。次いで、ＰＢＳ ５００μｌを加えることによりカラムを２回洗浄し、カラムに分量がほとんどの残らなくなるまで５０００ｇで遠心分離した。組み合わせたＭＨＣ分子のパネルをスピンカラムに加え、カラムに所望の分量が存在するまで４℃、５０００ｇで遠心分離した（試料とのインキュベーション１回当たり約８０μｌ）。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
ａ．合成：ＭＨＣ分子の調製には、主鎖をビオチン化オリゴヌクレオチドの形態で標識した後、ｐＭＨＣを加えた。
ｉ．ＭＨＣ分子の作製は、別途記載されない限り、主鎖の２倍過剰の標識（標識：主鎖＝２：１）を加えることによって実施し、４℃で３０分間インキュベートした。新たなバッチの主鎖および／または標識を用いた場合、漸増法を実施した後に必ず標識と主鎖（主鎖）との結合を判定した。ＭＨＣ分子、ｐＭＨＣ単量体を結合させる前に、これらを３３００ｇで５分間遠心分離した。コンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ）および蛍光色素（ＰＥ）を有するＳＡコンジュゲート（デキストラマー主鎖、Ｉｍｍｕｄｅｘ社）をペプチド交換反応の設定に適合する新たな９６ウェルプレートに等分した。ＰＥを組み立てる方法の違い。等分したＳＡコンジュゲートに沈殿を避けながらＭＨＣ分子を加え、室温で３０分間インキュベートした。複合体が形成された後、Ｄ－ビオチン（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｂｉｏ２００）をＮａＮ２の０．０２％ＰＢＳ溶液とともに加え、４℃で３０分間インキュベートした。組み立てたＭＨＣ分子を４℃で最大４週間保管した。
ｂ．改変：組み合わせたＭＨＣ分子のパネルの総体積が試料とのインキュベーション１回当たり１００μｌを上回った場合、体積を減らした。
ｉ．カットオフが３００ｋＤａのサイズ排除スピンカラムＶｉｖａｓｐｉｎ ５００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に２％ＢＳＡ／ＰＢＳ ５００μｌを加えることにより飽和させ、その分量が通過するまで５０００ｇで遠心分離した。次いで、ＰＢＳ ５００μｌを加えることによりカラムを２回洗浄し、カラムに分量がほとんどの残らなくなるまで５０００ｇで遠心分離した。組み合わせたＭＨＣ分子のパネルをスピンカラムに加え、カラムに所望の分量が存在するまで４℃、５０００ｇで遠心分離した（試料とのインキュベーション１回当たり約８０μｌ）。
ｃ．精製：ＭＨＣ分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、５０００ｇで５分間遠心分離して、溶液中にＭＨＣ分子が残らないように沈降させた。
６．試料とＭＨＣ分子のインキュベーション：細胞試料とＭＨＣ分子とを１つの容器内で混合して、ＭＨＣ分子とそれが認識するＴ細胞とを結合させた。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の細胞２×１０Ｅ６。
ｂ．ＭＨＣ分子の量
ｃ．条件：細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。２×１０Ｅ６の細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、バーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）で洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。試料をＭＨＣ分子とインキュベートする際、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした（Ｌｉｓｓｉｎａら，２００９）。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子が３μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、細胞と結合していないＭＨＣ分子または抗体を洗浄した。次いで、１％パラホルムアルデヒド５０μｌを加えることにより細胞を固定した。
ａ．試料の量：ＢＣ形態の細胞２×１０Ｅ６。
ｂ．ＭＨＣ分子の量
ｃ．条件：細胞の洗浄はいずれも、４９０ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。２×１０Ｅ６の細胞を９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、バーコード緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μｇ／ｍｌニシンＤＮＡ）で洗浄し、染色１回当たり約２０μｌになるようこの緩衝液に再懸濁させた。試料をＭＨＣ分子とインキュベートする際、細胞を５０ｎＭダサチニブと３７℃で３０分間インキュベートした（Ｌｉｓｓｉｎａら，２００９）。ＭＨＣ分子を細胞に加える前に、３３００ｇで５分間遠心分離した。インキュベーション１回当たり、各ＭＨＣ分子が３μｌ必要であった（ｐＭＨＣに関しては１μｇ／ｍｌ）。ＭＨＣ分子を加えた後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。表２に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近ＩＲ生存能色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｌ１０１１９）０．１μｌとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のＭＨＣ多量体染色と同じであった。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、細胞と結合していないＭＨＣ分子または抗体を洗浄した。次いで、１％パラホルムアルデヒド５０μｌを加えることにより細胞を固定した。
７．所望の特徴を有するＭＨＣ分子の濃縮：この実施例では、フローサイトメトリー、より具体的には蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いることによってＭＨＣ分子を濃縮した。ＭＨＣ分子は蛍光色素を有する。したがって、ＭＨＣ分子と結合する細胞は蛍光を発し、ＦＡＣＳ分取器により、ＭＨＣ分子と結合しないため蛍光を発しない細胞と分離することができる。その結果、細胞と結合したＭＨＣ分子が濃縮される。
ａ．適用：この実験全体を通じて、取得に２つの異なるフローサイトメータを使用した。３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩおよび５つのレーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩサイトメータである。ＬＳＲ ＩＩのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは４つのみである（４８８ｎｍ青色レーザー、６４０ｎｍ赤色レーザー、３５５ｎｍ ＵＶレーザーおよび４０５ｎｍ紫色レーザー）。さらに、３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いた。
ｉ．以下のゲーティング戦略を用いた。ＣＤ８陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびダンプチャネル陰性／ＣＤ８陽性細胞（ＦＩＴＣ／ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、ＦＡＣＳ緩衝液またはバーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、２％ＢＳＡで２時間～一晩予め飽和させバーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに分取した。分取された多量体陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
ｉ．単一のコンジュゲート蛍光色素、すなわちＰＥまたはＡＰＣによる陽性事象を明確にするべくゲートをかけた。
ｉｉ．平均蛍光強度（ＭＦＩ）または染色指数（ＳＩ）に基づきｐＭＨＣデキストラマーの能力を評価した。ＳＩとは、陰性集団（バックグラウンド）に対する影響の可能性およびバックグラウンドの幅も考慮に入れた集団分離の尺度のことである。
ａ．適用：この実験全体を通じて、取得に２つの異なるフローサイトメータを使用した。３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩおよび５つのレーザーを備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩサイトメータである。ＬＳＲ ＩＩのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは４つのみである（４８８ｎｍ青色レーザー、６４０ｎｍ赤色レーザー、３５５ｎｍ ＵＶレーザーおよび４０５ｎｍ紫色レーザー）。さらに、３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３３ｎｍ赤および４０５紫）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．２を用いた。
ｉ．以下のゲーティング戦略を用いた。ＣＤ８陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。ＦＳＣ／ＳＳＣプロットでリンパ球を同定した。単一細胞（ＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（近ＩＲ生存能色素陰性）およびダンプチャネル陰性／ＣＤ８陽性細胞（ＦＩＴＣ／ＰｅｒＣＰ）に対する追加のゲーティングを用いてＣＤ８Ｔ細胞集団を定義した。
ｂ．洗浄：フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で２回洗浄した。任意選択で、細胞を１％パラホルムアルデヒドで４℃にて一晩固定し、ＦＡＣＳ緩衝液またはバーコード緩衝液で２回洗浄した。固定した細胞を４℃で最大１週間保管した。
ｃ．分離：任意選択で、１％パラホルムアルデヒドで固定してから最大１週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、２％ＢＳＡで２時間～一晩予め飽和させバーコード緩衝液２００μｌを入れたチューブに分取した。分取された多量体陽性細胞を５０００ｇで５分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を－８０℃で保管した。
ｉ．単一のコンジュゲート蛍光色素、すなわちＰＥまたはＡＰＣによる陽性事象を明確にするべくゲートをかけた。
ｉｉ．平均蛍光強度（ＭＦＩ）または染色指数（ＳＩ）に基づきｐＭＨＣデキストラマーの能力を評価した。ＳＩとは、陰性集団（バックグラウンド）に対する影響の可能性およびバックグラウンドの幅も考慮に入れた集団分離の尺度のことである。
８．濃縮されたＭＨＣ分子の同定：標識（この実施例では、オリゴヌクレオチド標識）を同定することにより、細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができる。したがって、細胞とともに回収されたＭＨＣ分子内に含まれていたオリゴヌクレオチドのシーケンシングを実施した。これにより、細胞試料の細胞と結合したｐＭＨＣを同定することができた。
ａ．シーケンシングを実施する前に、分取された細胞に由来する標識をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲの組成については表４を参照されたい。ＰＣＲはキット：Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、番号２０１４４３）を用いて実施した。温度プロファイルを表５に記載する。ＰＣＲはサーマルサイクラー：ＧｅｎｅＡｍｐ、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で実施した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒでゲル電気泳動を実施した後、ＰＣＲ産物を可視化した。
ｉ．順方向プライマーおよび逆方向プライマーにはシーケンシング反応のためのアダプター（それぞれＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎシーケンシング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に適合したＡキーおよびＰ１キー）を含めた。
ｉｉ．さらに、順方向プライマーは試料識別バーコードを有していた（表８）。特異的な試料識別配列を有するプライマーを用いて、個々の試料に由来する分取細胞上の標識およびそれに付随するＭＨＣ分子を増幅させた（表８）。これにより、単一試料ごとに由来する配列リードの分布が容易になった。さらに、濃縮されたＭＨＣ分子のパネルの入力物（細胞と混合する前）にＰＣＲにより試料識別バーコードを割り付けた（パネル入力物と呼ぶ）。パネル入力物のシーケンシングにより、解析した配列出力物の正規化が可能になるものと思われた。
ｉｉｉ．陽性配列リードをｐＭＨＣバーコードアイデンティティの初めから終わりまで、５’末端の試料バーコードアイデンティティから読み取った配列と比較した。リード数を同じ試料バーコードアイデンティティにマッピングされた総リード数およびパネル入力物のリード数によって正規化した。
ＭＨＣ分子へのデコンボリューション
ｂ．３１４ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔチップ（ＧｅｎｅＤｘ社）でＤＮＡオリゴヌクレオチド標識のシーケンシングを実施した。ＰＣＲの際にプライマーを介してアダプターを導入した（アダプター配列については表８を参照されたい）。
ｉ．１５個の試料識別バーコードおよび３５８個のｐＭＨＣバーコード（１ＯＳ １１８個＋２ＯＳ ２４０個）の可能な組合せのほか、１ＯＳシステムおよび２ＯＳシステムの両方のプライマー配列およびアニーリング配列からなる配列データベースを作製した。これを集積すると、１回のシーケンシングから予想され得る５３７０の配列が得られた。次いで、各シーケンシングリードを用いて、マッチリワード１、ミスマッチリワード－２およびギャップ開始、ギャップ伸長ともにギャップコスト２としたヌクレオチドＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、データベースでアライメントを検索した。このようにして、シーケンシングリードに実際の配列と比較して塩基がミスコールされていても、挿入／削除されていても、シーケンシングエラーに等しくペナルティを加えた。
ｉｉ．以下の基準によりアライメントを破棄した：
１．Ｅ値＞１ｅ－１２；アライメントの長さが不十分である（１ＯＳシステムおよび２ＯＳシステムは、それぞれ６０塩基または１０２塩基を超えなければならない）。
２．対象配列の開始位置が２個以上である、すなわち、試料識別バーコードの固有の部分の６塩基のうちアライメントに含まれる塩基が４個以下である。
３．任意のシーケンシングリードに対して依然として複数のアライメントがみられた場合、パーセント同一性が最も高いアライメントのみを残した。最後に、データベース内の各バーコードにマッピングされたリード数をカウントした。
ｉｉｉ．大きな比率を占めるバーコードの特定：各リードを同じ試料アイデンティティバーコードにマッピングされた総リードカウントに正規化することにより、相対リードカウントを計算した。次いで、相対リードカウントを用いて、対照試料バーコード入力物（細胞と混合しなかったバーコード標識検出分子パネル）と比較した１バーコード当たりの変化倍数を計算した。未処理のリードカウントの割合の同等性を試料と対照バーコード入力物とで比較する２試料検定を用いて、有意に大きな比率を占めるバーコードを特定し、ベンジャミーニ＝ホッホベルクＦＤＲ法を用いて多重検定のｐ値を補正した。
ａ．シーケンシングを実施する前に、分取された細胞に由来する標識をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲの組成については表４を参照されたい。ＰＣＲはキット：Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、番号２０１４４３）を用いて実施した。温度プロファイルを表５に記載する。ＰＣＲはサーマルサイクラー：ＧｅｎｅＡｍｐ、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）で実施した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＥＺ Ｉｍａｇｅｒでゲル電気泳動を実施した後、ＰＣＲ産物を可視化した。
ｉ．順方向プライマーおよび逆方向プライマーにはシーケンシング反応のためのアダプター（それぞれＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎシーケンシング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に適合したＡキーおよびＰ１キー）を含めた。
ｉｉ．さらに、順方向プライマーは試料識別バーコードを有していた（表８）。特異的な試料識別配列を有するプライマーを用いて、個々の試料に由来する分取細胞上の標識およびそれに付随するＭＨＣ分子を増幅させた（表８）。これにより、単一試料ごとに由来する配列リードの分布が容易になった。さらに、濃縮されたＭＨＣ分子のパネルの入力物（細胞と混合する前）にＰＣＲにより試料識別バーコードを割り付けた（パネル入力物と呼ぶ）。パネル入力物のシーケンシングにより、解析した配列出力物の正規化が可能になるものと思われた。
ｉｉｉ．陽性配列リードをｐＭＨＣバーコードアイデンティティの初めから終わりまで、５’末端の試料バーコードアイデンティティから読み取った配列と比較した。リード数を同じ試料バーコードアイデンティティにマッピングされた総リード数およびパネル入力物のリード数によって正規化した。
ＭＨＣ分子へのデコンボリューション
ｂ．３１４ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔチップ（ＧｅｎｅＤｘ社）でＤＮＡオリゴヌクレオチド標識のシーケンシングを実施した。ＰＣＲの際にプライマーを介してアダプターを導入した（アダプター配列については表８を参照されたい）。
ｉ．１５個の試料識別バーコードおよび３５８個のｐＭＨＣバーコード（１ＯＳ １１８個＋２ＯＳ ２４０個）の可能な組合せのほか、１ＯＳシステムおよび２ＯＳシステムの両方のプライマー配列およびアニーリング配列からなる配列データベースを作製した。これを集積すると、１回のシーケンシングから予想され得る５３７０の配列が得られた。次いで、各シーケンシングリードを用いて、マッチリワード１、ミスマッチリワード－２およびギャップ開始、ギャップ伸長ともにギャップコスト２としたヌクレオチドＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、データベースでアライメントを検索した。このようにして、シーケンシングリードに実際の配列と比較して塩基がミスコールされていても、挿入／削除されていても、シーケンシングエラーに等しくペナルティを加えた。
ｉｉ．以下の基準によりアライメントを破棄した：
１．Ｅ値＞１ｅ－１２；アライメントの長さが不十分である（１ＯＳシステムおよび２ＯＳシステムは、それぞれ６０塩基または１０２塩基を超えなければならない）。
２．対象配列の開始位置が２個以上である、すなわち、試料識別バーコードの固有の部分の６塩基のうちアライメントに含まれる塩基が４個以下である。
３．任意のシーケンシングリードに対して依然として複数のアライメントがみられた場合、パーセント同一性が最も高いアライメントのみを残した。最後に、データベース内の各バーコードにマッピングされたリード数をカウントした。
ｉｉｉ．大きな比率を占めるバーコードの特定：各リードを同じ試料アイデンティティバーコードにマッピングされた総リードカウントに正規化することにより、相対リードカウントを計算した。次いで、相対リードカウントを用いて、対照試料バーコード入力物（細胞と混合しなかったバーコード標識検出分子パネル）と比較した１バーコード当たりの変化倍数を計算した。未処理のリードカウントの割合の同等性を試料と対照バーコード入力物とで比較する２試料検定を用いて、有意に大きな比率を占めるバーコードを特定し、ベンジャミーニ＝ホッホベルクＦＤＲ法を用いて多重検定のｐ値を補正した。
実施例５の結果：
この実施例は、異なるｐＭＨＣ多量体（ＭＨＣ分子）からなる大きい混合物中に抗原応答性Ｔ細胞を検出することが実現可能であることを示している。本発明者らは、バーコード標識ＭＨＣ多量体の感度が少なくともＣＤ８Ｔ細胞の中から０．０００３２％の特異的Ｔ細胞を検出することが可能なものであることを示す。既に記載されている（ロースループットな）方法と正確な相関があることがわかる。
この実施例は、異なるｐＭＨＣ多量体（ＭＨＣ分子）からなる大きい混合物中に抗原応答性Ｔ細胞を検出することが実現可能であることを示している。本発明者らは、バーコード標識ＭＨＣ多量体の感度が少なくともＣＤ８Ｔ細胞の中から０．０００３２％の特異的Ｔ細胞を検出することが可能なものであることを示す。既に記載されている（ロースループットな）方法と正確な相関があることがわかる。
図９は、７種類の異なる試料にマッピングされた特異的１ＯＳバーコードリードの数を模式的に示したものである。ＨＬＡ－Ｂ７陰性ＢＣに５％のＢ７ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲ応答（バーコード８８）を５倍希釈で加えて７種類の試料（５％、１％、０．２％、０．０４％、０．００８％、０．００１６％および０．０００３２％）を作製した。このＢＣはＡ１１ ＥＢＶ－ＥＢＮＡ４特異的Ｔ細胞（バーコード４に対応する）の集団を有する。１ＯＳで様々にバーコード標識された１１０のｐＭＨＣ－デキストラマーを含む同じパネルで試料を染色した。バーは、各試料中の入力物パネルに対して正規化した総リード数を示している。実験は二重反復で実施した。ここでは平均が示されている。
図１０は、７種類の異なる試料にマッピングされた特異的２ＯＳバーコードリードの数を模式的に示したものである。ＨＬＡ－Ｂ７陰性ＢＣに５％のＢ７ ＣＭＶ ｐｐ６５ ＴＰＲ応答（バーコードＡ３Ｂ１８）を５倍希釈で加えて７種類の試料（５％、１％、０．２％、０．０４％、０．００８％、０．００１６％および０．０００３２％）を作製した。このＢＣはＡ１１ ＥＢＶ－ＥＢＮＡ４特異的Ｔ細胞（バーコードＡ１Ｂ４に対応する）の集団を有する。２ＯＳで様々にバーコード標識された１１０のｐＭＨＣ－デキストラマーを含む同じパネルで試料を染色した。バーは、各試料中の入力物パネルに対して正規化した総リード数を示している。実験は二重反復で実施した。ここでは平均が示されている。
実施例６：
実施例６は、用いた試料が異なる点を除いては実施例５と全く同じように実施される。ここでは、５種類の異なるドナー血液試料中に抗原応答性Ｔ細胞を検出する。
実施例６は、用いた試料が異なる点を除いては実施例５と全く同じように実施される。ここでは、５種類の異なるドナー血液試料中に抗原応答性Ｔ細胞を検出する。
実施例６の結果：
この実施例は、ＤＮＡバーコードで標識したＭＨＣ多量体を用いて異なるドナー試料の多数の異なる特異性を検出することが実現可能であることを示している。得られたデータは、多数のドナーのＴ細胞反応性をハイスループットにスクリーニングして、疾患発現、ワクチン接種、感染などに関連する免疫反応性を評価することが実現可能であることを示している。
この実施例は、ＤＮＡバーコードで標識したＭＨＣ多量体を用いて異なるドナー試料の多数の異なる特異性を検出することが実現可能であることを示している。得られたデータは、多数のドナーのＴ細胞反応性をハイスループットにスクリーニングして、疾患発現、ワクチン接種、感染などに関連する免疫反応性を評価することが実現可能であることを示している。
図１１は、６種類の異なる試料にマッピングされた特異的１ＯＳバーコードリードの数を模式的に示したものである。１ＯＳで様々にバーコード標識された１１０のｐＭＨＣデキストラマーを含む同じパネルで６種類のＢＣを染色した。棒グラフは、各試料中の入力物パネルに対して正規化した総リード数を示している（ｐ＜０．０５）。各円グラフは、その試料にマッピングされた有意な（ｐ＜０．０１）リード数を示している。
図１２は、６種類の異なる試料にマッピングされた特異的２ＯＳバーコードリードの数を模式的に示したものである。２ＯＳで様々にバーコード標識された１１０のｐＭＨＣ－デキストラマーを含む同じパネルで６種類のＢＣを染色した。棒グラフは、各試料中の入力物パネルに対して正規化した総リード数を示している（ｐ＜０．０５）。
表：
（参考文献）
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１０．Ｄｏｓｓｉｎｇｅｒ Ｇ，Ｂｕｎｓｅ Ｍ，Ｂｅｔ Ｊ，Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｊ，Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ ＰＪ，ＷｅｉＢｂｒｉｃｈ Ｂ，ｅｔ ａｌ．ＭＨＣ ｍｕｌｔｉｍｅｒ－ｇｕｉｄｅｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ＴＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８：ｅ６１３８４．
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１３．Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ＪＲ，Ｈｕｇｈｅｓ ＭＳ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｓｈｅｒｒｙ ＲＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６．
１４．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ Ｃ，Ｅｖｅｎ Ｊ，Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ Ｐ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ．１９９５；１６：１７６－８１．
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１６．Ｌｉｎｅｔｔｅ ＧＰ，Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ Ｅａ，Ｍａｕｓ Ｍ Ｖ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＡＰ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｅｍｅｒｙ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｔｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２：８６３－７１．
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１３．Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ＪＲ，Ｈｕｇｈｅｓ ＭＳ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｓｈｅｒｒｙ ＲＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６．
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Claims (24)
- 多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の異なるサブセットのプールを含む組成物であって、前記多量体ＭＨＣの各サブセットが、
主鎖分子と連結された２つ以上の所与のペプチド－ＭＨＣ分子と、
前記主鎖分子と連結された核酸分子と
を含み、
前記核酸分子が、５’第一プライマー領域と、１０～５０超のヌクレオチドの範囲の中央領域（バーコード領域）と、３’第二プライマー領域とを含み、前記バーコードが、前記２つ以上の所与のペプチド－ＭＨＣ分子に特異的な標識として機能し、
前記主鎖が、１つまたは複数の選択可能な標識をさらに含み、
前記多量体ＭＨＣの各サブセットが、Ｔ細胞認識に決定的な役割を果たす異なるペプチドと、所与のペプチド－ＭＨＣ分子に特異的なバーコード領域を含む固有の核酸分子とを含み、
前記核酸分子のプライマー領域は、前記多量体ＭＨＣの各サブセットで同一であり、１つのプライマーセットを使用するＰＣＲ反応で、多量体ＭＨＣのすべてのサブセットにおけるバーコードを同時に増幅させることを可能にし、
前記バーコード領域をＰＣＲにより増幅させ、増幅させたバーコード領域のシーケンシングにより試料中の抗原応答性細胞を検出するための、
組成物。 - 前記主鎖分子が、グルカンを含む多糖類、ストレプトアビジンおよびストレプタマー多量体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
- 前記２つ以上のＭＨＣ分子が、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して、ならびに／あるいは前記ＭＨＣ重鎖および／または軽鎖（Ｂ２Ｍ）を介して前記主鎖と結合している；および／または前記核酸分子が、ストレプトアビジン－ビオチン結合を介して前記主鎖と連結している、請求項１または２に記載の組成物。
- 前記多量体ＭＨＣが、少なくとも４個のＭＨＣ分子を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記主鎖分子がデキストランであり、前記多量体ＭＨＣが少なくとも８個の所与のＭＨＣ－ペプチド分子を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記核酸分子が、２０～２００ヌクレオチドを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または人工ヌクレオチドを含むか、これよりなるものである、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＨＣが、クラスＩ ＭＨＣ、クラスＩＩ ＭＨＣ、およびＣＤ１を含む群より選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記１つまたは複数の選択可能な標識が、蛍光標識、Ｈｉｓタグ、および金属イオンタグからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記選択可能な標識が、蛍光標識である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
- 少なくとも１０の異なる多量体ＭＨＣのサブセットを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
- 試料中の１つまたは複数の抗原応答性細胞を検出する方法であって、
ｉ）請求項１～１１のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の異なるサブセットのプールを含む組成物を準備することと、
ｉｉ）前記組成物と前記試料とを接触させることと、
ｉｉｉ）抗原応答性細胞の１つもしくは複数の集団を細胞選別または選択する、１つまたは複数のステップと、
ｉｖ）前記多量体ＭＨＣのそれぞれの前記抗原応答性細胞との結合を検出して、前記多量体ＭＨＣの各サブセットに存在する抗原応答性細胞を検出することと
を含み、
前記結合が、
ａ）前記１つまたは複数の多量体ＭＨＣと連結された前記核酸分子のバーコード領域をＰＣＲにより増幅させることと、
ｂ）増幅させた前記バーコード領域のシーケンシングと
によって検出される、方法。 - 前記試料が、血液試料、末梢血試料、血液由来試料、組織試料、および体液からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
- 増幅の前に単一細胞選別の１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記細胞選別または選択が、フローサイトメトリー、磁気ビーズによる選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム吸着およびゲルろ過からなる群より選択される方法を含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 抗原応答性細胞の結合の前記検出が、測定値を、参照レベルと比較することを含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
- 特異的Ｔ細胞の頻度が、バーコード配列のリードの頻度と分取されたＴ細胞の数とを比較することによって計算される、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 単一のＴ細胞に結合する複数の異なるペプチド－ＭＨＣ複合体の相対的寄与度が、所与の配列のバーコードリード数によって決定される、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記増幅されるバーコード領域のシーケンシングが、ディープシーケンシング、ハイスループットシーケンシングまたは次世代シーケンシングを含む、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 所与の選別された単一細胞の抗原特異性が、単一細胞ＴＣＲシーケンシングによる１つまたは複数の追加の単一細胞特性と組み合わせて決定される、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記増幅されるバーコード標識のシーケンシングにより、所定のＴＣＲの親和性および結合モチーフがさらに決定される、請求項１２～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 洗浄および／または遠心分離によって増幅の前に前記組成物と接触した前記試料中の未結合のＭＨＣ多量体を除去する、１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 単一試料などの試料中の複数の異なる抗原応答性細胞を検出するための、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗原応答性細胞がＴ細胞である、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
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