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JP6923292B2 - 抗ｃｄ３抗体、ｃｄ３及びｃｄ２０に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用 - Google Patents

抗ｃｄ３抗体、ｃｄ３及びｃｄ２０に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ＣＤ３に特異的な抗体、及びその抗原結合フラグメント、並びにそれらの使用方法に関する。本発明はまた、ＣＤ３、及びＣＤ２０のような標的分子に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにその使用方法に関する。
背景
ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と関連してＴ細胞上で発現されるホモダイマー又はヘテロダイマー抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされる。機能性ＣＤ３は、４つの異なる鎖のうちの２つのダイマー結合により形成される：エプシロン、ゼータ、デルタ、及びガンマ。ＣＤ３ダイマー配置としては、ガンマ／エプシロン、デルタ／エプシロン及びゼータ／ゼータが挙げられる。ＣＤ３に対する抗体は、Ｔ細胞上でＣＤ３をクラスター化し、それによりペプチド負荷（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ）ＭＨＣ分子によるＴＣＲの会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）と同様の様式でＴ細胞活性化を引き起こすことが示されている。従って、抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の活性化を含む治療目的のために提案されてきた。さらに、ＣＤ３及び標的抗原に結合することができる二重特異性抗体は、標的抗原を発現する組織及び細胞に対するＴ細胞免疫応答を標的とすることを含む治療上の使用のために提案されてきた。
ＣＤ２０は、成熟Ｂ細胞の細胞膜上で発現される非グリコシル化リン酸化タンパク質である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び他のＢ細胞性悪性腫瘍の９５％より多くで発現されるがＢ前駆細胞、樹状細胞及び形質細胞には存在しないので、Ｂ細胞性腫瘍関連抗原と考えられている。ＣＤ２０を標的とすることにより癌を処置する方法は当該分野で公知である。例えば、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブは、ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）のような癌を処置する際に使用されてきたかそれらの処置における使用について提案されてきた。ＣＤ２０は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）並びに／又はアポトーシス及び化学療法への感作を誘導することにより、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞を死滅させると考えられている。抗ＣＤ２０腫瘍標的化ストラテジーは臨床設定においておおいに有望であることを示したが、全ての患者が抗ＣＤ２０療法に応答したわけではなく、一部の患者は 抗ＣＤ２０療法に対する抵抗性を生じたか又は抗ＣＤ２０療法に対する不完全な応答を示した（例えばリツキシマブに対する抵抗性）。
ＣＤ３及び標的抗原（例えばＣＤ２０）の両方に結合する二重特異性抗原結合分子は、標的抗原を発現する細胞の特異的標的化及びＴ細胞媒介死滅が望ましい治療設定において有用だろう。
発明の要旨
第一の局面において、本発明は、ヒトＣＤ３に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。本発明のこの局面に従う抗体は、とりわけ、例えばＴ細胞媒介死滅が有益であるか又は望ましい状況下で、ＣＤ３を発現するＴ細胞の標的化、及びＴ細胞活性化の刺激のために有用である。本発明の抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合部分は、ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を腫瘍細胞又は感染因子のような特定の細胞型へと方向づける二重特異性抗体の一部として含まれ得る。
本発明の例となる抗ＣＤ３抗体を本明細書の表１及び２に列挙する。表１は、例となる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、さらには重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及びｄ 軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例となる抗ＣＤ３抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３をコードする核酸分子の配列識別子を示す。
本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対をなす表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様によれば、本発明は、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれか内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ１Ｈ２７１２Ｎ）；１１４／１２２（例えば、Ｈ２Ｍ２６０９Ｎ）；５１４／５２２（例えば、Ｈ２Ｍ３５６３Ｎ）；７７０／７７８（例えば、Ｈ１Ｈ５７７８Ｐ）；１０５０／１２３４（例えば、Ｈ１Ｈ７１９５Ｂ）；及び１０９０／１２３４（例えばＨ１Ｈ７２０８Ｂ）からなる群より選択される。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％，少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対をなした表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体、又は抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様によれば、本発明は、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれか内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／１６（例えば、Ｈ１Ｈ２７１２Ｎ）；１２０／１２８（例えば、Ｈ２Ｍ２６０９Ｎ）；５２０／５２８（例えば、Ｈ２Ｍ３５６３Ｎ）；７７６／７８４（例えば、Ｈ１Ｈ５７７８Ｐ）；１０５６／１２４０（例えば、Ｈ１Ｈ７１９５Ｂ）；及び１０９６／１２４０（例えば、Ｈ１Ｈ７２０８Ｂ）からなる群より選択される。
本発明はまた、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれか内に含有される６つのＣＤＲセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ１Ｈ２７１２Ｎ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（例えば、Ｈ２Ｍ２６０９Ｎ）；５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８（例えば、Ｈ２Ｍ３５６３Ｎ）；７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４（例えば、Ｈ１Ｈ５７７８Ｐ）；１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０（例えば、Ｈ１Ｈ７１９５Ｂ）；及び１０９２−１０９４−１０９６−１２３６−１２３８−１２４０（例えば、Ｈ１Ｈ７２０８Ｂ）からなる群より選択される。
関連実施態様において、本発明は、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ１Ｈ２７１２Ｎ）；１１４／１２２（例えば、Ｈ２Ｍ２６０９Ｎ）；５１４／５２２（例えば、Ｈ２Ｍ３５６３Ｎ）；７７０／７７８（例えば、Ｈ１Ｈ５７７８Ｐ）；１０５０／１２３４（例えば、Ｈ１Ｈ７１９５Ｂ）；及び１０９０／１２３４（例えば、Ｈ１Ｈ７２０８Ｂ）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は当該分野で周知であり、本明細書において開示される特定のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を同定するために使用され得る例となる定法としては、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。大まかに言えば、Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的ループ領域の位置に基づき、そしてＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２ （１９８９）を参照のこと。公開データベースもまた抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
本発明はまた、抗ＣＤ３抗体又はその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、又はそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、又はそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれか、又はそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれか、又はそれに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似する配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様では、この核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここでＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例となる抗ＣＤ３抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ここでＨＣＶＲは、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、そしてＬＣＶＲは表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列、及び表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、本発明のこの局面によれば、核酸分子はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方とも表１に列挙される同じ抗ＣＤ３抗体由来である。
本発明はまた、抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のいずれか、すなわち表１に示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。このようなベクターが導入されている宿主細胞、さらには抗体又は抗体フラグメントの産生を可能にする条件下でその宿主細胞を培養すること、並びにそのようにして産生された抗体及び抗体フラグメントを回収することにより抗体又はその部分を製造する方法もまた本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ３抗体を含む。いくつかの実施態様において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、又は例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠いた抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用において、ガラクトシル化の改変が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するために行われ得る。
別の局面において、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する組換えヒト抗体又はそのフラグメント、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。関連する局面において、本発明は、抗ＣＤ３抗体と第二の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施態様において、第二の治療剤は、抗ＣＤ３抗体と有利に組み合わせられるいずれかの薬剤である。抗ＣＤ３抗体と有利に組み合わせられ得る例となる薬剤としては、限定することなく、ＣＤ３シグナル伝達に結合しかつ／もしくは活性化する他の薬剤（他の抗体又はその抗原結合フラグメントなどを含む）及び／又はＣＤ３に直接結合しないにもかかわらず、免疫細胞活性化を活性化もしくは刺激する薬剤が挙げられる。本発明の抗ＣＤ３抗体を含むさらなる組み合わせ療法及び同時処方（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は本明細書の他所に開示される。
さらに別の局面において、本発明は、抗ＣＤ３抗体又は本発明の抗体の抗原結合部分を使用してＴ細胞活性化を刺激するための治療方法を提供し、ここで治療方法は、治療有効量の、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。処置される障害は、ＣＤ３活性又はシグナル伝達の刺激により改善、寛解、阻害又は予防されるいずれかの疾患又は状態である。
別の局面によれば、本発明は、ＣＤ３及び標的抗原に結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の例となる実施態様によれば、二重特異性抗原結合分子はＣＤ３及びＣＤ２０に結合し；このような二重特異性抗原結合分子は、本明細書において「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子」とも呼ばれる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子の抗ＣＤ２０部分は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞性腫瘍）を標的とするために有用であり、そして二重特異性分子の抗ＣＤ３部分はＴ細胞を活性化するために有用である。腫瘍細胞上のＣＤ２０及びＴ細胞上のＣＤ３の同時結合は、活性化Ｔ細胞による標的腫瘍細胞の方向付けされた死滅（細胞溶解）を促進する。従って、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子は、とりわけＣＤ２０発現腫瘍（例えば、リンパ腫）に関連するか、それにより引き起こされる疾患及び障害を処置するために有用である。
本発明のこの局面に従う二重特異性抗原結合分子は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン、及びＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む。本発明は、各抗原結合ドメインが軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と対をなした重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。本発明の特定の例となる実施態様において、抗ＣＤ３抗原結合ドメイン及び抗ＣＤ２０抗原結合ドメインはそれぞれ、共通のＬＣＶＲと対を成した異なる個別のＨＣＶＲを含む。例えば、本明細書の実施例７において説明されるように、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン（ここで第一の抗原結合ドメインは抗ＣＤ３由来のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む）；及びＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン（ここで第二の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来のＬＣＶＲ（例えば、抗ＣＤ３抗原結合ドメインに含まれる同じＬＣＶＲ）と対を成した抗ＣＤ２０抗体由来のＨＣＶＲを含む）を含む二重特異性抗体が構築された。換言すると、本明細書において開示される例となる分子において、抗ＣＤ２０抗体由来のＨＣＶＲと抗ＣＤ３抗体由来のＬＣＶＲとの対形成により、ＣＤ２０に特異的に結合する（がＣＤ３に結合しない）抗原結合ドメインが生じる。このような実施態様において、第一及び第二の抗原結合ドメインは、別個の抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２０ ＨＣＶＲを含むが共通の抗ＣＤ３ ＬＣＶＲを共有する。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが表１又は表１８に示されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインはまた、表１又は表１９に示されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。特定の実施態様によれば、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインは、表１又は表１７に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対のいずれかを含む。本発明はまた、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが表１もしくは表１８に示される重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、及び／又は表１もしくは表１９に示される軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
特定の実施態様によれば、本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが、配列番号１２５０、１２６６、１２８２、１２９８、１３１４及び１３２９からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが、配列番号１２５８、１２７４、１２９０、１３０６、１３２２及び１３３３からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが配列番号１２５０／１２５８、１２６６／１２７４、１２８２／１２９０、１２９８／１３０６、１３１４／１３２２、及び１３２９／１３３３からなる群より選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが、配列番号１２５６、１２７２、１２８８、１３０４、１３２０及び１３３２からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれと実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；並びに配列番号１２６４、１２８０、１２９６、１３１２、１３２８及び１３３６からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
特定の実施態様において、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインは、配列番号１２５６／１２６４、１２７２／１２８０、１２８８／１２９６、１３０４／１３１２、１３２０／１３２８及び１３３２／１３３６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインが、配列番号１２５２、１２６８、１２８４、１３００、１３１６及び１３３０からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号１２５４、１２７０、１２８６、１３０２、１３１８及び１３３１からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一異性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２６０、１２７６、１２９２、１３０８、１３２４及び１３３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；並びに配列番号１２６２、１２７８、１２９４、１３１０、１３２６及び１３３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明の特定の非限定的な例となる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子は、それぞれ：配列番号１２５２−１２５４−１２５６−１２６０−１２６２−１２６４（例えば、ＢＳ３／２０−００１）；１２６８−１２７０−１２７２−１２７６−１２７８−１２８０（例えば、ＢＳ３／２０−００２）；１２８４−１２８６−１２８８−１２９２−１２９４−１２９６（例えば、ＢＳ３／２０−００３）；１３００−１３０２−１３０４−１３０８−１３１０−１３１２（例えば、ＢＳ３／２０−００４）；１３１６−１３１８−１３２０−１３２４−１３２６−１３２８（例えば、ＢＳ３−２０−００５）；及び１３３０−１３３１−１３３２−１３３４−１３３５−１３３６（例えば、ＢＳ３／２０−００７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメインを含む。
本発明はまた、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２４２のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２５８、１２７４、１２９０、１３０６、１３２２及び１３３３からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２４２／１２５８、１２４２／１２７４、１２４２／１２９０、１２４２／１３０６、１２４２／１３２２及び１２４２／１３３３からなる群より選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
本発明はまた、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２４８のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれと実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；並びに配列番号１２６４、１２８０、１２９６、１３１２、１３２８及び１３３６からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性分子を提供する。
特定の実施態様において、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインは、配列番号１２４８／１２６４、１２４８／１２８０、１２４８／１２９６、１２４８／１３１２、１２４８／１３２８及び１２４８／１３３６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
本発明はまた、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２４４のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号１２４６のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２６０、１２７６、１２９２、１３０８、１３２４及び１３３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；並びに配列番号１２６２、１２７８、１２９４、１３１０、１３２６及び１３３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明の特定の非限定的な例となる抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子は、それぞれ：配列番号１２４４−１２４６−１２４８−１２６０−１２６２−１２６４（例えば、ＢＳ３／２０−００１）；１２４４−１２４６−１２４８−１２７６−１２７８−１２８０（例えば、ＢＳ３／２０−００２）；１２４４−１２４６−１２４８−１２９２−１２９４−１２９６（例えば、ＢＳ３／２０−００３）；１２４４−１２４６−１２４８−１３０８−１３１０−１３１２（例えば、ＢＳ３／２０−００４）；１２４４−１２４６−１２４８−１３２４−１３２６−１３２８（例えば、ＢＳ３−２０−００５）；及び１２４４−１２４６−１２４８−１３３４−１３３５−１３３６（例えば、ＢＳ３／２０−００７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む。
関連する実施態様において、本発明は、ＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインが、配列番号１２４２／１２５８、１２４２／１２７４、１２４２／１２９０、１２４２／１３０６、１２４２／１３２２及び１２４２／１３３３からなる群より選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。
別の局面において、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、これらとしては、本明細書の表２０及び２１に示されるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、さらにはいずれかのそれらの機能的な組み合わせ又配置で表２０及び２１に示されるポリヌクレオチド配列の２つ又はそれ以上を含む核酸分子が挙げられる。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた本発明に包含され、抗体の産生を可能にする条件下でこれらの宿主細胞を培養し、そして産生された抗体を回収することにより抗体を産生する方法もまた同様に包含される。
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する上述の抗原結合ドメインのいずれかが、ＣＤ２０に特異的に結合する上述の抗原結合ドメインのいずれかと組み合わされるか、接続されるか、又はそうでなければそれらと会合して、ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二重特異性抗原結合分子を形成する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変が有用であり得るか、又は例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠いた抗体（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）が有用であり得る。他の適用において、ガラクトシル化の改変が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するために行われ得る。
別の局面において、本発明は、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。関連する局面において、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子及び第二の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施態様において、第二の治療剤は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせられるいずれかの薬剤である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子と有利に組み合わせられ得る例となる薬剤は、本明細書の他所において詳細に考察される。
さらに別の局面において、本発明は、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を使用してＣＤ２０を発現する腫瘍細胞を標的化／死滅するための治療方法を提供し、ここでこの治療方法は、治療有効量の、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
本発明はまた、ＣＤ２０発現に関連するかＣＤ２０発現により引き起こされる疾患又は障害の処置のための医薬の製造における、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子の使用を含む。
他の実施態様は、以下の詳細な説明の検討から明らかとなるだろう。
Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍移植及びヒトＦｃ（ｈＦｃ、実線）又はＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００７、点線）のいずれかを用いた処置後の腫瘍体積（ｍｍ3）を、腫瘍移植の日に始まり、経時的に示す。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞及びＰＢＭＣの混合物を皮下移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍移植及びヒトＦｃ（ｈＦｃ、実線）又はＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００７、点線）のいずれかを用いた処置後の腫瘍体積（ｍｍ3）を、腫瘍移植の７日後に始まり、経時的に示す。 ３つの異なる用量の二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００１（０．０１、０．１又は１．０ｍｇ／ｋｇ）；低用量抗ＣＤ２０対照抗体（対照Ｖ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）；又は高用量抗ＣＤ２０対照抗体（対照ＩＩＩ（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルからの血液サンプルにおけるＢ細胞数（ｘ１０００／μＬ）のプロットを経時的に示す。 ３つの異なる用量の二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００１（０．０１、０．１又は１．０ｍｇ／ｋｇ）；低用量抗ＣＤ２０対照抗体（対照Ｖ、０．０１ｍｇ／ｋｇ）；又は高用量抗ＣＤ２０対照抗体（対照ＩＩＩ（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルからの血液サンプルにおけるＴ細胞数（ｘ１０００／μＬ）のプロットを経時的に示す。 Ａ〜Ｄは、単回用量のＢＳ３／２０−００１（０．０１、０．１又は１．０ｍｇ／ｋｇ）、低用量抗ＣＤ２０対照抗体（０．０１ｍｇ／ｋｇ対照Ｖ）、又は高用量抗ＣＤ２０対照抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ対照ＩＩＩ）で処置されたカニクイザルについての、それぞれＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−アルファの投与前及び投与後のレベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 図５−３の続き。 ０．０１ｍｇ／ｋｇ対照Ｖ（抗ＣＤ２０抗体）；１．０ｍｇ／ｋｇ対照ＩＩＩ（抗ＣＤ２０抗体）；並びに０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ ＢＳ３／２０−００１（抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体）で処置されたカニクイザルから様々な時点で採取された血液サンプルから決定されたＣＤ２０発現プロファイル（発現のＬｏｇ２倍変化で表される）を示す。 １．０ｍｇ／ｋｇ（白三角）、０．１ｍｇ／ｋｇ（白四角）又は０．０１ｍｇ／ｋｇ（白菱型）のＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体で処置されたカニクイザルからの血液サンプルにおけるＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００１）の総血清濃度（μｇ／ｍＬ）を経時的に示す。
詳細な説明
本発明を説明する前に、当然のことながら、方法及び実験条件は変わり得るので、本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されない。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のためのみであり、限定であることを意図されない。
別の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「約」は、特定の記載される数値に関して使用される場合、その値が記載される値から１％以下だけ変わり得るということを意味する。例えば、本明細書で使用される表現「約１００」は、９９及び１０１並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書に記載されるものと類似又は等価ないずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料をここで記載する。
定義
本明細書で使用される表現「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞上で発現され、かつ４つの受容体鎖：ＣＤ３−エプシロン、ＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−ゼータ、及びＣＤ３−ガンマのうちの２つの結合により形成されるホモダイマー又はヘテロダイマーからなる抗原を指す。ヒトＣＤ３−エプシロンは、配列番号１３７０に示されるアミノ酸配列を含み；ヒトＣＤ３−デルタは配列番号１３７１に示されるアミノ酸配列を含む。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質フラグメントへの全ての言及は、非ヒト種由来であると明確に特定されていなければ、それぞれのタンパク質、ポリペプチド又はタンパク質フラグメントのヒトバージョンを指すことを意図される。従って、表現「ＣＤ３」は、例えば、「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」などのように非ヒト種由来であると特定されていなければヒトＣＤ３を意味する。
本明細書で使用される「ＣＤ３に結合する抗体」又は「抗ＣＤ３抗体」は、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、エプシロン、デルタ、ガンマ又はゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメント、さらには２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／エプシロン、デルタ／エプシロン、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ３及び／又は細胞表面に発現されたＣＤ３に結合し得る。可溶性ＣＤ３は、天然ＣＤ３タンパク質、さらには、例えば、単量体及び二量体ＣＤ３構築物のような、膜貫通ドメインを欠いているか又はそうでなければ細胞膜に結合していない組換えＣＤ３タンパク質変異体を含む。
本明細書で使用される表現「細胞表面で発現されるＣＤ３」は、インビトロ又はインビボで細胞の表面上で発現され、その結果、ＣＤ３タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の細胞外側に露出され、そして抗体の抗原結合部分に接近可能である１つ又はそれ以上のＣＤ３タンパク質を意味する。「細胞表面で発現されたＣＤ３」は、細胞の膜における機能性Ｔ細胞受容体の状況内に含まれるＣＤ３タンパク質を含む。表現「細胞表面で発現されるＣＤ３」は、細胞表面上でホモダイマー又はヘテロダイマー（例えば、ガンマ／エプシロン、デルタ／エプシロン、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）の一部として発現されるＣＤ３タンパク質を含む。表現「細胞表面で発現されるＣＤ３」はまた、細胞表面上で、他のＣＤ３鎖を伴わず、それ自体で発現されるＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３−エプシロン、ＣＤ３−デルタ又はＣＤ３−ガンマ）を含む。「細胞表面で発現されるＣＤ３」は、通常ＣＤ３タンパク質を発現する細胞の表面上で発現されたＣＤ３タンパク質を含んでいても、又はそれらからなるものであってもよい。あるいは、「細胞表面で発現されるＣＤ３」は、通常はその表面上にヒトＣＤ３を発現しないが、その表面上にＣＤ３を発現するように人工的に操作された細胞の表面上で発現されるＣＤ３タンパク質を含んでいても、又はそれらからなるものであってもよい。
本明細書で使用される表現「抗ＣＤ３抗体」は、単一の特異性を有する一価抗体、さらにはＣＤ３に結合する第一のアーム及び第二の（標的）抗原に結合する第二のアームを含む二重特異性抗体の両方を含み、ここで抗ＣＤ３アームは、本明細書の表１又は表１８／１９に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかを含む。抗ＣＤ３二重特異性抗体の例は、本明細書の他所に記載される。用語「抗原結合分子」は、例えば、二重特異性抗体を含む抗体及び抗原結合フラグメントを含む。
本明細書で使用される用語「抗体」は、特定の抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合するか又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むいずれかの抗原結合分子又は分子複合体を意味する。用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、さらにはその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶHと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶLと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH及びＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に組み入れられた超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶH及びＶLは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施態様において、抗ＣＤ３抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同じであり得、又は天然もしくは人工的に改変されたものであってもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの対照分析（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいて規定され得る。
本明細書で使用される用語「抗体」はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成する天然に存在するか、酵素により入手可能か、合成的又は遺伝的に操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、タンパク質分解消化、又は抗体の可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術のようないずれかの適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から誘導され得る。このようなＤＮＡは公知であり、かつ／又は例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つもしくはそれ以上の可変及び／もしくは定常ドメインを適切な構成へと配置するため、又はコドンを導入するか、システイン残基を生成するか、アミノ酸を改変、付加もしくは欠失させるなどのために、化学的に、又は分子生物学技術を使用して配列決定及び操作され得る。
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。他の操作された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた本明細書で使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、いずれのサイズ又はアミノ酸組成のものでもよく、一般的には、１つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接するかそれらとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインに付随してＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶH及びＶLドメインは、互いに対していずれかの適切な配置で位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり得、ＶH−ＶH、ＶH−ＶL又はＶL−ＶL二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶH又はＶLドメインを含有し得る。
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見られ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例となる構成としては、以下が挙げられる：（ｉ） ＶH−ＣH１；（ｉｉ） ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ） ＶH−ＣH３；（ｉｖ） ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ） ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ） ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ） ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ） ＶL−ＣH１；（ｉｘ） ＶL−ＣH２；（ｘ） ＶL−ＣH３；（ｘｉ） ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ） ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ） ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）
ＶL−ＣL。上に列挙した例となる構成のいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていても、完全又は部分的なヒンジ又はリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変及び／又は定常ドメイン間に可動性又は半可動性の連結を生じる少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いと、及び／又は１つもしくはそれ以上の単量体ＶHもしくはＶLドメインと非共有結合した（例えば、ジスルフィド結合により）、上に列挙された可変ドメイン及び定常ドメインの構成のいずれかのホモダイマー又はヘテロダイマー（又は他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子のように、抗原結合フラグメントは単一特異性でも多重特異性（例えば二重特異性）でもよい。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは別々の抗原に、又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例となる二重特異性抗体形式を含めて、いずれの多重特異性抗体形式も、当該分野で利用可能な通常の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの状況における使用のために適合され得る。
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）により機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性細胞傷害性細胞（例えば、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、そしてそれにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該分野で周知かつ利用可能なアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、並びにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６を参照のこと）。抗体の定常領域は、補体を固定し、そして細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。従って、抗体アイソタイプは、抗体が細胞傷害を媒介するために望ましいかどうかに基づいて選択され得る。
本発明の特定の実施態様において、本発明の抗ＣＤ３抗体（単一特異性又は二重特異性）はヒト抗体である。本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図される。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム又は部位特異的変異誘発により、又はインビボで体細胞変異により導入される変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフト化されている抗体を含むことを意図されない。
本発明の抗体は、いくつかの実施態様において、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により製造、発現、作製又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下でさらに記載される）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下でさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照のこと）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むいずれかの他の手段により製造、発現、作製もしくは単離された抗体を含むことを意図される。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。しかし、特定の実施態様において、このような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）を受け、それ故、組換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH及びＶL配列から誘導されかつヒト生殖系列ＶH及びＶL配列に関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しないかもしれない。
ヒト抗体は、ヒンジ異質性に関連する２つの形態で存在し得る。１つの形態において、免疫グロブリン分子は約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖の構築物を含み、ここで二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により結合される。第二の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、そして共有結合でカップリングされた軽鎖及び重鎖（半抗体）から構成される約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される。これらの形態は、アフィニティー精製後でさえ分離することが非常に困難であった。
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的差異に起因するがこれに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで、第二の形態の出現を有意に減少させ得る（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣH２、又はＣH３領域に１つ又はそれ上の変異を有する抗体を包含し、これは例えば、所望の抗体形態の収量を改善するために製造において望ましいかもしれない。
本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定され、そしてその天然環境の少なくとも１つの構成要素から分離されかつ／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの構成要素から、又は抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離又は除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製又は単離工程を受けた抗体である。特定の実施態様によれば、単離された抗体は他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。
本発明はまた、ＣＤ３に結合する１アーム抗体を含む。本明細書で使用される「１アーム（ｏｎｅ−ａｒｍ）抗体」は、単一の抗体重鎖及び単一の抗体軽鎖を含む抗原結合分子を意味する。本発明の１アーム抗体は、本明細書の表１又は表１８／１９に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
本明細書に開示される抗ＣＤ３抗体は、抗体が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域中に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれか由来の抗体及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つもしくはそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ上のアミノ酸は、その抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へと変異される（このような配列変化は本明細書で集合的に「生殖系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から始めて、１つ又はそれ以上の個々の生殖系列変異又はそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。特定の実施態様において、ＶH及び／又はＶLドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は全て、その抗体が由来した元の生殖系列配列において見られる残基へと逆変異される。他の実施態様において、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８つの残基内に見られる変異した残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異した残基のみが元の生殖系列配列へと逆変異される。他の実施態様において、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の１つ又はそれ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、その抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へと変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ又はそれ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含有し得、例えばここで特定の個々の残基は特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異されるが、元の生殖系列配列と異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異される。一旦得られれば、１つ又はそれ以上の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合フラグメントは、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善されたか又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニスト生物学的特性（場合によって）、減少した免疫原性などのような１つ又はそれ上の所望の特性について容易に試験され得る。この一般的なやり方で得られる抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明内に包含される。
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異形を含む抗ＣＤ３抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば、１０又はそれ以下、８又はそれ以下、６又はそれ以下、４又はそれ以下などの保存的アミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３抗体を含む。
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有し得る。従って、異なる抗体は抗原の異なる領域に結合し得、そして異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）又は線状のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に近接したアミノ酸により生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接したアミノ酸残基により生じるものである。特定の状況において、エピトープは抗原上に糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的同一性」又は「実質的に同一」は、別の核酸（又はその相補鎖）と、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って最適に整列された場合に、以下に考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐのような配列同一性のいずれかの周知のアルゴリズムにより測定して、少なくとも約９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性があるということを示す。参照核酸分子に対して実質的同一性を有する核酸分子は、特定の場合において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じか又は実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ポリペプチドに適用される用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」は、例えばデフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する２つのペプチド配列を意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、類似した化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換で互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては以下が挙げられる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、そして（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有するいずれかの変化である。
ポリペプチドの配列類似性（配列同一性とも呼ばれる）は、典型的には配列解析ソフトウエアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似した配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウエアは、異なる生物種由来の相同ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するための、デフォルトパラメーターと共に使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、デフォルト又は推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間のベストオーバーラップの領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記参照）。異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと本発明の配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
二重特異性抗原結合分子
本発明の抗体は、単一特異性でも、二重特異性でも、多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的でも、１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有していてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照のこと。本発明の抗ＣＤ３抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質と連結されても、それらと同時発現されてもよい。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに機能的に連結されて（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他による）、第二の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を生じ得る。
本明細書における表現「抗ＣＤ３抗体」の使用は、単一特異性抗ＣＤ３抗体、さらにはＣＤ３結合アーム、及び標的抗原に結合する第二のアームを含む二重特異性抗体の両方を含むことを意図される。従って本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＣＤ３に結合し、かつ免疫グロブリンの他方のアームが標的抗原に対して特異的である二重特異性抗体を含む。ＣＤ３二重特異性抗体の他方のアームが結合する標的抗原は、細胞、組織、器官、微生物又はウイルス上又はそれらの付近に発現され、それらに対する標的免疫応答が望ましいいずれかの抗原であり得る。ＣＤ３結合アームは、本明細書の表１又は表１８／１９に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。特定の実施態様において、ＣＤ３結合アームはヒトＣＤ３に結合して、ヒトＴ細胞増殖を誘導する。
抗体の１つのアームがＣＤ３に結合し、そして他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異性抗体の状況において、標的抗原は腫瘍関連抗原であり得る。具体的な腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ−８、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ−１、−２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６、及び−１２）、ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ−１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、及びウロプラキン−３が挙げられる。
抗体の１つのアームがＣＤ３に結合し、そして他方のアームが標的抗原に結合する本発明の二重特異性抗体の状況において、標的抗原は感染性疾患関連抗原であり得る。感染性疾患関連抗原の非限定的な例としては、例えば、ウイルス粒子の表面上に発現されるか、又はウイルスに感染した細胞上で優先的に発現される抗原が挙げられ、ここでウイルスは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＨＡＶ−６、ＶＺＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、及びアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群より選択される。あるいは、標的抗原は、細菌表面上に発現されるか、又は細菌に感染した細胞上に優先的に発現される抗原であり得、ここで細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の菌からなる群より選択される。特定の実施態様において、標的抗原は、真菌の表面上で発現されるか、又は真菌に感染した細胞上で優先的に発現される抗原であり、ここで真菌は、カンジダ（アルビカンス、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ、トロピカリスなど）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コウジカビ（フミガーツス、クロコウジカビなど）、ケカビ目（ムコール属、アブシディア属、クモノスカビ属など）、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス、南アメリカ分芽菌、コクシジオイデス・イミチス、及びヒストプラズマ・カプスラーツムからなる群より選択される。特定の実施態様において、標的抗原は、寄生虫の表面上に発現されるか、寄生虫に感染した細胞上に優先的に発現される抗原であり、ここで寄生虫は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属種、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属種、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、トリパノソーマ・ブルセイ、トリパノソーマ・クルージ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンディ、ブラジル鉤虫、カブトウオ条虫（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、及びマレー糸状虫からなる群より選択される。特定の病原関連抗原の非限定的な例としては、例えばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎糖タンパク質（ｇｌｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｌ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎Ｅ１、Ｃ型肝炎Ｅ２、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、及びＨＴＬＶ外被タンパク質が挙げられる。
特定の例となる実施態様によれば、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ２０に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。このような分子は、本明細書において、例えば、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０」もしくは「抗ＣＤ３ｘＣＤ２０」もしくは「ＣＤ３ｘＣＤ２０」二重特異性分子、又は他の類似した用語で呼ばれ得る。
本明細書で使用される用語「ＣＤ２０」は、非ヒト種由来であると（例えば、「マウスＣＤ２０」、「サルＣＤ２０」など）特定されていなければ、ヒトＣＤ２０タンパク質を指す。ヒトＣＤ２０タンパク質は、配列番号１３６９に示されるアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される表現「抗原結合分子」は、単独で、又は１つもしくはそれ以上のさらなるＣＤＲ及び／もしくはフレームワーク領域（ＦＲ）と組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか又はそれらからなるタンパク質、ポリペプチド又は分子複合体を意味する。特定の実施態様において、抗原結合分子は抗体又は抗体フラグメントであり、それらの用語は本明細書の他所で定義される。
本明細書で使用される表現「二重特異性抗原結合分子」は、少なくとも第一の抗原結合ドメイン及び第二の抗原結合ドメインを含むタンパク質、ポリペプチド又は分子複合体を意味する。二重特異性抗原結合分子内の各抗原結合ドメインは、単独で、又は１つもしくはそれ以上のさらなるＣＤＲ及び／又はＦＲと組み合わせて、特定の抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明の状況において、第一の抗原結合ドメインは第一の抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合し、そして第二の抗原結合ドメインは、第二の異なる抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異的に結合する。
本発明の特定の例となる実施態様において、二重特異性抗原結合分子は二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第一及び第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）の状況において、第一の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」を付けて指定され得、そして第二の抗原結合ドメインのＣＤＲは接頭辞「Ａ２」を付けて指定される。従って、第一の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書中でＡ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、及びＡ１−ＨＣＤＲ３と呼ばれ；そして第二の抗原結合ドメインのＣＤＲは本明細書中でＡ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、及びＡ２−ＨＣＤＲ３と呼ばれる。
第一の抗原結合ドメイン及び第二の抗原結合ドメインは、互いに直接的又は間接的に接続されて、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第一の抗原結合ドメイン及び第二の抗原結合ドメインは、それぞれ別々の多量化ドメインに接続され得る。１つの多量体化ドメインの別の多量体化ドメインとの結合は、２つの抗原結合ドメイン間の結合を容易にし、それにより二重特異性抗原結合分子を形成する。本明細書で使用される「多量体化ドメイン」は、同じか又は類似した構造又は構成の第二の多量体化ドメインと結合する能力を有する、いずれかの高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はアミノ酸である。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリンＣH３ドメインを含むポリペプチドであり得る。多量体化成分の非限定的な例は、免疫グロブリン（ＣH２−ＣH３ドメインを含む）のＦｃ部分、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、さらには各アイソタイプグループ内のいずれかのアロタイプである。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、典型的には２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ個別の別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第一及び第二の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４のような同じＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。あるいは、第一及び第二の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などのような異なるＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。
特定の実施態様において、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメント又は少なくとも１つのシステイン残基を含有する１〜約２００アミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施態様において、多量体化ドメインは、システイン残基、又は短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化ドメインとしては、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、又はコイルドコイル・モチーフを含むか、又はそれらからなるペプチド又はポリペプチドが挙げられる。
本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するためにいずれかの二重特異性抗体形式又は形式が使用され得る。例えば、第一の抗原結合特異性を有する抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば第二の抗原結合特異性を有する別の抗体又は抗原フラグメントに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他の方法により）機能的に連結されて、二重特異性抗原結合分子を生じ得る。本発明の状況において使用され得る具体的な例となる二重特異性形式としては、限定することなく、例えば、ｓｃＦｖベースの、又は二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）二重特異性形式、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブと穴（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブと穴を有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ2二重特異性形式（前述の形式のレビューについては、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１−１１、及びそこに引用される参考文献を参照のこと）。
本発明の二重特異性抗原結合分子の状況において、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの野生型の天然に存在する型と比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み得る。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の改変された結合相互作用（例えば、増強されるか又は減少される）を有する改変されたＦｃドメインを生じる、Ｆｃドメインにおける１つ又はそれ以上の改変を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施態様において、二重特異性抗原結合分子はＣH２又はＣH３領域に改変を含み、ここでこの改変は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲に及ぶエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、Ｅ又はＱ）；２５０及び４２８（例えば、Ｌ又はＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４（例えば、Ｓ又はＴ）、並びに２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ又はＴ）における改変；又は位置４２８及び／若しくは４３３（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）及び／若しくは４３４（例えば、Ｈ／Ｆ又はＹ）；又は位置２５０及び／若しくは４２８における改変；又は位置３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４における改変が挙げられる。一実施態様において、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７及び／又は３０８の改変（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。
本発明はまた、第一のＣH３ドメイン及び第二のＩｇ ＣH３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで第一及び第二のＩｇ ＣH３ドメインは互いに少なくとも１つのアミノ酸が異なり、そしてここで少なくとも１つのアミノ酸の差異が、アミノ酸差異の無い二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のプロテインＡへの結合を減少させる。一実施態様において、第一のＩｇ ＣH３ドメインはプロテインＡに結合し、そして第二のＩｇ ＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）改変のようなプロテインＡ結合を減少させるか消失させる変異を含有する。第二のＣH３はＹ９６Ｆ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）改変をさらに含み得る。第二のＣH３内に見出され得るさらなる改変としては：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。
特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、１つより多くの免疫グロブリンアイソタイプ由来のＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ ＣH２領域由来のＣH２配列の一部又は全て、及びヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４由来のＣH３配列の一部又は全てを含み得る。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含有し得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「上部ヒンジ」配列を、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「下部ヒンジ」配列と組み合わせて含み得る。本明細書に示される抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端へ：［ＩｇＧ４ ＣH１］−［ＩｇＧ４上部ヒンジ］−［ＩｇＧ２下部ヒンジ］−［ＩｇＧ４ ＣＨ２］−［ＩｇＧ４ ＣＨ３］を含む。本明細書に示される抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端へ：［ＩｇＧ１ ＣH１］−［ＩｇＧ１上部ヒンジ］−［ＩｇＧ２下部ヒンジ］−［ＩｇＧ４ ＣＨ２］−［ＩｇＧ１ ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれら及び他の例は、米国仮出願第６１／７５９，５７８号（２０１３年２月１日出願）に記載される。これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメイン、及びその変異体は、変更されたＦｃ受容体結合を有し得、今度はそれがＦｃエフェクター機能に影響を及ぼす。
配列変異体
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、個々の抗原結合ドメインが由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域において１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより容易に確認され得る。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示される例となるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合ドメインを含み得、ここで、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異される（このような配列変化は、本明細書で集合的に「生殖系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から始めて、１つもしくはそれ以上の個々の生殖系列変異又はそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。特定の実施態様において、ＶH及び／又はＶLドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の全ては、抗原結合ドメインが元々由来する元の生殖系列配列中に見いだされる残基へと逆変異される（ｍｕｔａｔｅｄ ｂａｃｋ）。他の実施態様において、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見られる変異した残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異した残基のみが元の生殖系列配列へと逆変異される。他の実施態様において、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが元々由来する生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基へと変異される。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ又はそれ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含有し得、例えば、ここで特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異されるが、元の生殖系列配列と異なる特定の他の残基が維持されるか、又は元の生殖系列配列が維持されるか、もしくは異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異される。一旦得られれば、１つ又はそれ以上の生殖系列変異を含有する抗原結合ドメインは、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性（場合によって）、減少した免疫原性などのような１つ又はそれ以上の望ましい特性について容易に試験され得る。この一般的な方法で得られた１つ又はそれ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、本発明内に包含される。
本発明はまた、１つ又は両方の抗原結合ドメインが、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば、１０又はそれ以下、８又はそれ以下、６又はそれ以下、４又はそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては以下が挙げられる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、そして（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有するいずれかの変化である。
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一」は、アミノ酸配列に言及する場合、例えばデフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列された場合に、少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する２つのアミノ酸配列を意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換で互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。
ポリペプチドについての配列類似性（配列同一性とも呼ばれる）は、典型的には配列解析ソフトウエアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似した配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウエアは、異なる生物種由来の相同ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するための、デフォルトパラメーターと共に使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、デフォルト又は推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間のベストオーバーラップの領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記参照）。異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと本発明の配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照のこと。
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特徴を有する抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、本発明の抗ＣＤ３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおいてＣＤ３への減少した結合を示し得る。あるいは、本発明の抗ＣＤ３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおいてＣＤ３に対する増強された結合を示し得る。表現「酸性ｐＨ」は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５，９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０又はそれ以下のｐＨ値を含む。本明細書で使用される表現「中性ｐＨ」は約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び７．４のｐＨ値を含む。
場合によっては、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおいて．．．減少した結合」は、中性ｐＨでのその抗原への抗体の結合のＫD値に対する、酸性ｐＨでのその抗原への抗体の結合のＫD値の比で表される（又は逆も同様）。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントが約３．０又はそれ以上の酸性／中性ＫD比を示す場合に、本発明の目的のために「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおいてＣＤ３への減少した結合」を示すとみなされ得る。特定の例となる実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントについての酸性／中性ＫD比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０．２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０又はそれ以上であり得る。
ｐＨ依存性結合特徴を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて特定の抗原への減少した（又は増強された）結合について抗体集団をスクリーニングすることにより得られ得る。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの改変により、ｐＨ依存性特徴を有する抗体が得られ得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ又はそれ以上のアミノ酸をヒスチジン残基と置換することにより、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで減少した抗原結合を有する抗体が得られ得る。
Ｆｃ変異体を含む抗体
本発明の特定の実施態様によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体への抗体の結合を増強するか又は減少させる１つ又はそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣH２又はＣH３領域に変異を含む抗体を含み、ここで変異は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲に及ぶエンドソームにおいて）におけるＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。このような変異は、動物に投与された場合の抗体の血清半減期の増加を生じ得る。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、Ｅ又はＱ）；２５０及び４２８（例えば、Ｌ又はＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４（例えば、Ｓ又はＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ又はＴ）での改変；又は位置４２８及び／若しくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）及び／若しくは４３４（例えば、Ｈ／Ｆ又はＹ）での改変；又は位置２５０及び／若しくは４２８での改変；又は位置３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での改変が挙げられる。一実施態様において、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７及び／又は３０８の改変（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。
例えば、本発明は：２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される変異の１つ又はそれ上の対又はグループを含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。前述のＦｃドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせは、本発明の範囲内に考慮される。
抗体及び二重特異性抗原結合分子の生物学的特徴
本発明は、ヒトＣＤ３に結合してＴ細胞増殖を誘導する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例４において規定されるアッセイ形式（例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下でのＪｕｒｋａｔ細胞又はヒトＰＢＭＣの増殖を評価する）、又は実質的に同様のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞増殖アッセイにより測定して、約０．３３ｐＭ未満のＥＣ50値でヒトＴ細胞増殖を誘導する抗ＣＤ３抗体を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例４において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞増殖アッセイにより測定して、約０．３２ｐＭ未満、約０．３１ｐＭ未満、約０．３０ｐＭ未満、約０．２８ｐＭ未満、約０．２６ｐＭ未満、約０．２４ｐＭ未満、約０．２２ｐＭ未満、又は約０．２０ｐＭ未満のＥＣ50値でヒトＴ細胞増殖（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞増殖及び／又はＰＢＭＣ増殖）を誘導する。
本発明はまた、ヒトＣＤ３に結合して腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を誘導する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例６に規定されるアッセイ形式（例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトＰＢＭＣによるＵ９３７腫瘍細胞死滅の程度を評価する）、又は実質的に同様のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイにおいて測定して、約２．３ｐＭ未満のＥＣ50で腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を誘導する抗ＣＤ３抗体を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例６に規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して、インビトロＴ細胞媒介腫瘍細胞死滅アッセイにより測定して、約２．３ｐＭ未満、約２．２ｐＭ未満、約２．１ｐＭ未満、約２．０ｐＭ未満、約１．８ｐＭ未満、約１．６ｐＭ未満、約１．４ｐＭ未満、約１．２ｐＭ未満、約１．０ｐＭ未満、約０．８ｐＭ未満、約０．６ｐＭ未満、又は約０．５ｐＭ未満のＥＣ50値で、Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅（例えば、Ｕ９３７細胞のＰＢＭＣ媒介死滅）を誘導する。
本発明は、高い親和性でヒトＣＤ３に結合する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。本発明はまた、治療状況及び所望される特定の標的特性に依存して、中程度又は低い親和性でヒトＣＤ３に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。例えば、１つのアームがＣＤ３に結合し、別のアームが標的抗原（例えば、ＣＤ２０）に結合する二重特異性抗原結合分子の状況において、標的抗原結合アームが標的抗原に高親和性で結合しながら、抗ＣＤ３アームがＣＤ３に中程度又は低い親和性でしか結合しないことが望ましいかもしれない。この方法では、標的抗原を発言している細胞に対する抗原結合分子の優先的標的化は、全体的な／非標的ＣＤ３結合及びそれらに付随する結果として起こる有害な副作用を避けながら達成され得る。
特定の実施態様によれば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴により測定して約１５ｎＭ未満のＫDでヒトＣＤ３に結合する（例えば、２５℃で）抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ−捕捉又は抗原捕捉形式）、又は実質的に同様のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定して、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１８０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１４０ｐＭ未満、約１２０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、又は約１０ｐＭ未満のＫDでＣＤ３に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により２５℃又は３７℃にて測定して、約１０分より長い解離半減期（ｔ1／2）でＣＤ３に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ捕捉又は抗原捕捉形式）、又は実質的に同様のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により２５℃又は３７℃にて測定して、約２０分より長い、約３０分より長い、約４０分より長い、約５０分より長い、約６０分より長い、約７０分より長い、約８０分より長い、約９０分より長い、約１００分より長い、約２００分より長い、約３００分より長い、約４００分より長い、約５００分より長い、約６００分より長い、約７００分より長い、約８００分より長い、約９００分より長い、約１０００分より長い、又は約１２００分より長いｔ1／2でＣＤ３に結合する。
本発明は、ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ２０に同時に結合することができる二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）を含む。特定の実施態様によれば、本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３及び／又はＣＤ２０を発現する細胞と特異的に相互作用する。二重特異性抗原結合分子が、ＣＤ３及び／又はＣＤ２０を発現する細胞に結合する程度は、本明細書の実施例８において説明されるように、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により評価され得る。例えば、本発明は、ＣＤ３を発現するがＣＤ２０を発現しないヒトＴ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）、ＣＤ２０を発現するがＣＤ３を発現しないヒトＢ細胞株（例えば、Ｒａｊｉ）、及び／又は霊長類Ｔ細胞（例えば、カニクイザル末梢血単核細胞［ＰＢＭＣ］）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。本発明は、実施例８に示されるＦＡＣＳアッセイ又は実質的に類似のアッセイを使用して決定して、約９．０ｘ１０-6〜約２．０ｘ１０-9又はそれ以下のＥＣ50値で、前述の細胞及び細胞株のいずれかに結合する二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明はまた、ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）に１．０ｐＭと１０００ｎＭとの間のＥＣ50値で結合する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。特定の実施態様において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞に１ｎＭと６０ｎＭとの間のＥＣ５０値で結合する。例えば、本発明は、ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）に、約１ｐＭ、約１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約５００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ 約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約８００ｎＭ、約１０００ｎＭ又はそれ以上のＥＣ50値で結合する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。
本発明はまた、以下からなる群より選択される１つ又はそれ以上の特徴を示す抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む：（ａ）インビトロでＰＢＭＣ増殖を誘導する（例えば、本明細書の実施例９を参照のこと）；（ｂ）ヒト全血において、Ｔ細胞を活性化し、ＩＦＮ−ガンマ放出及びＣＤ２５上方調節を誘導する（例えば、本明細書の実施例１０を参照のこと）；（ｃ）抗ＣＤ２０−抵抗性細胞株に対するＴ細胞媒介細胞傷害を誘導する（例えば、本明細書の実施例１１を参照のこと）；（ｄ）ヒトＢ細胞に対する細胞傷害を誘導する（例えば、Ｒａｊｉ；例えば、本明細書の実施例１３を参照のこと）；（ｅ）ヒト免疫細胞を用いて再構成されたマウスにおいてＢ細胞（例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞）を枯渇させる（例えば、本明細書の実施例１４を参照のこと）；及び（ｆ）マウス異種移植片においてＢ細胞腫瘍体積（例えば、Ｒａｊｉ腫瘍体積）を減少させる（例えば、実施例１５を参照のこと）。
本発明は、被験体においてＢ細胞を枯渇させることができる（例えば、実施例１６を参照のこと）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む。例えば、特定の実施態様によれば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで二重特異性抗原結合分子の被験体への単回投与（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下の用量で）は、被験体における（例えば、被験体から採取された血液サンプルにおける）検出可能なレベルを下回るＢ細胞数の減少を引き起こす。特定の実施態様において、約０．１ｍｇ／ｋｇの用量での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子の単回投与は、被験体への二重特異性抗原結合分子の投与の約７日後、約６日後、約５日後、約４日後、約３日後、約２日後、又は約１日後までに、検出可能なレベルを下回る被験体におけるＢ細胞数の減少を引き起こす。特定の実施態様によれば、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子の約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量での単回投与は、投与の少なくとも約７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日又はそれ以上後まで、Ｂ細胞数を検出可能なレベルを下回ったままにする。本明細書で使用される表現「検出可能なレベルを下回る」は、本明細書の実施例１６に示されるように、標準的なＢ細胞検出アッセイ、例えば、Ｂ細胞マーカーについてのＦＡＣＳアッセイを使用して、被験体から採取された血液サンプルにおいて直接的にも間接的にもＢ細胞を検出できないということを意味する。
関連する実施態様において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで被験体への抗原結合分子の約０．０１ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与の約１日後から約２８日後に被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＢ細胞数は、投与前に被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＢ細胞数の２５％未満である。特定の他の実施態様において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子が提供され、ここで被験体への抗原結合分子の約０．０１ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与の約１日〜約５６日後に、被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＢ細胞の数が、投与前に被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＢ細胞の数の５０％未満である。
本発明はまた、被験体に投与された場合に、Ｔ細胞の一次的な減少しか引き起こさない抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を提供する。例えば、被験体に約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与された場合に、投与の１日後にＴ細胞数を低下させるが、血液１マイクロリットルあたりのＴ細胞数はその後の時点で（例えば、投与の約２日後、７日後、１４日後、２８日後、４２日後、５６日後又はそれ以降までに）回復する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子が提供される。例えば、本発明は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで被験体への抗原結合分子の約０．０１ｍｇ／ｋｇの用量での投与の約１４日〜約５６日後に、被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＴ細胞の数が、二重特異性抗原結合分子の投与前に被験体から採取された血液１マイクロリットルあたりのＴ細胞の数と等しいか又はそれ以上である。
エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗原結合分子が結合するＣＤ３上のエピトープは、ＣＤ３タンパク質の３つ又はそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは、複数のＣＤ３の不連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。本発明の抗体は、単一のＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３−エプシロン、ＣＤ３−デルタ又はＣＤ３−ガンマ）内に含有されるアミノ酸と相互作用し得るか、又は２つもしくはそれ以上の異なるＣＤ３鎖上のアミノ酸と相互作用し得る。本明細書で使用される用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有し得る。従って、異なる抗体は抗原の異なる領域に結合し得、そして異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）又は線状のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に近接したアミノ酸により生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接したアミノ酸残基により生じるものである。特定の状況において、エピトープは抗原上に糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。
当業者に公知の様々な技術が、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチド又はタンパク質の「１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために使用され得る。例となる技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．、ＮＹ）記載のような所定の交差ブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイ、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法が使用され得る（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。おおまかに言えば、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質の重水素標識、その後の重水素で標識されたタンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体を、水に移して、抗体により保護されている残基（これらは重水素標識されたままである）を除いて全ての残基において水素−重水素交換させる。抗体の解離後、標的タンパク質は、プロテアーゼ切断及び質量分析にかけられ、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識された残基が明らかとなる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ （１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （２００１） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。抗原／抗体複合体のＸ線結晶解析もまたエピトープマッピング目的で使用され得る。
本発明はさらに、本明細書に記載される特定の例となる抗体のいずれか（例えば、本明細書の表１に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）と同じエピトープに結合する抗ＣＤ３抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例となる抗体のいずれか（例えば、本明細書の表１に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）と、ＣＤ３への結合について競合する抗ＣＤ３抗体を含む。
本発明はまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン、及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで第一の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例となるＣＤ３特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＣＤ３上のエピトープに結合し、かつ／又は第二の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例となるＣＤ２０特異的抗原結合ドメインのいずれかと同じＣＤ２０上のエピトープに結合する。
同様に、本発明はまた、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン、及びヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、ここで第一の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例となるＣＤ３特異的抗原結合ドメインのいずれかと、ＣＤ３への結合について競合し、かつ／又は第二の抗原結合ドメインは、本明細書に記載される特定の例となるＣＤ２０特異的抗原結合ドメインのいずれかと、ＣＤ２０への結合について競合する。
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）又はその抗原結合ドメインが、本発明の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合するか否か、又はそれらと結合について競合するか否かは、当該分野における通常の方法を使用することにより容易に決定することができる。例えば、本発明の参照二重特異性抗原結合分子と同じＣＤ３（又はＣＤ２０）上のエピトープに試験抗体が結合するかどうかを決定するために、参照二重特異性分子を最初にＣＤ３タンパク質（又はＣＤ２０タンパク質）に結合させる。次に、ＣＤ３（又はＣＤ２０）分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合の後に試験抗体がＣＤ３（又はＣＤ２０）に結合する事が出来る場合、試験抗体は参照二重特異性抗原結合分子と異なるＣＤ３（又はＣＤ２０）のエピトープに結合すると結論付けることができる。他方で、参照二重特異性抗原結合分子との飽和結合の後に試験抗体がＣＤ３（又はＣＤ２０）分子と結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照二重特異性分子により結合されるエピトープと同じＣＤ３（又はＣＤ２０）のエピトープに結合するかもしれない。次いで、さらなる通常の実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を行って、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照二重特異性抗原結合分子と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、又は立体的遮断（又は別の現象）が観察された結合の欠如の原因なのかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又は当該分野で利用可能ないずれかの他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行われ得る。本発明の特定の実施態様によれば、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０又は１００倍過剰の一方の抗原結合タンパク質が、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）において測定して、他方の結合を少なくとも５０％だけ、しかし好ましくは７５％、９０％又は９９％さえも阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質は同じ（又は重なった）エピトープに結合する。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を減少又は排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を減少又は排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同じエピトープに結合するとみなされる。一方の抗原結合タンパク質の結合を減少又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を減少又は排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重なった（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）エピトープ」を有するとみなされる。
抗体又はその抗原結合ドメインが参照抗原結合分子との結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論を２つの方向で行った：第一の方向では、参照抗原結合分子を、飽和条件下でＣＤ３タンパク質（又はＣＤ２０タンパク質）に結合させ、続いて試験抗体のＣＤ３（又はＣＤ２０）分子への結合を評価する。第二の方向では、試験抗体を飽和条件下でＣＤ３（又はＣＤ２０）分子に結合させ、続いて参照抗原結合分子のＣＤ３（又はＣＤ２０）分子への結合を評価する。両方の方向で、第一の（飽和している）抗原結合分子のみがＣＤ３（又はＣＤ２０）分子に結合する事が出来る場合、試験抗体及び参照抗原結合分子は、ＣＤ３（又はＣＤ２０）への結合について競合すると結論づけられる。当業者には当然のことながら、参照抗原結合分子と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しないかもしれないが、重なるか又は隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的にブロックし得る。
抗原結合ドメインの製造及び二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該分野で公知のいずれかの抗体生成技術により製造され得る。一旦得られれば、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ３及びＣＤ２０）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインは、通常の方法を使用して本発明の二重特異性抗原結合分子を製造するために、互いに対して適切に配置され得る。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用され得る例となる二重特異性抗体形式の考察は本明細書の他所に提供される）。特定の実施態様において、本発明の多重特異性抗原結合分子の個々の成分（例えば、重鎖及び軽鎖）の１つ又はそれ以上は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体由来である。このような抗体を作製する方法は当該分野で周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の重鎖及び／又は軽鎖の１つ又はそれ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥTM技術を使用して製造され得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥTM技術（又はいずれかの他のヒト抗体生成方法）を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、特定の抗原（例えば、ＣＤ３又はＣＤ２０）に対する高親和性抗体が最初に単離される。抗体を特徴付けし、そして親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置き換えて、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込まれ得る完全ヒト重鎖及び／又は軽鎖を生成する。
遺伝子操作された動物を使用して、ヒト二重特異性抗原結合分子を作成し得る。例えば、内在性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再配列及び発現することができない遺伝子改変されたマウスを使用することができ、ここでこのマウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座におけるマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン配列によりコードされる１つ又は２つのヒト軽鎖可変ドメインのみを発現する。このように遺伝子改変されたマウスを使用して、２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と関係する２つの異なる重鎖を含む完全ヒト二重特異性抗原結合分子を製造することができる。（このような操作されたマウス及び二重特異性抗原結合分子を製造するためのその使用の詳細な考察については、例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照のこと）。
生物学的同等性
本発明は、本明細書に開示される例となる分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するが、ＣＤ３及び／又はＣＤ２０に結合する能力は保持している抗原結合分子を包含する。このような変異体分子は、親配列と比較した場合に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含み得るが、記載される二重特異性抗原結合分子の生物学的活性と本質的に等価な生物学的活性を示す。
本発明は、本明細書に示される例となる抗原結合分子のいずれかと生物学的に同等な抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、それらが、それらの吸収の速度及び程度が同様の実験条件下で同じモル用量で単回用量又は複数回用量のいずれかで投与された場合に有意な差異を示さない薬学的等価体又は薬学的代替物である場合に、生物学的に同等とみなされる。いくつかの抗原結合タンパク質は、それらがそれらの吸収の程度において等価であるが、それらの吸収速度においては等価でない場合に等価物又は薬学的代替物とみなされ、吸収速度におけるこのような差異は意図的であり、かつラベルに示されており、例えば、慢性使用での効果的な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、そして研究されている特定の薬品に関して医学的に重要でないので、なお生物学に同等であるとみなされ得る。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力において臨床的に意味のある差異がない場合に生物学的に同等である。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、切り替えなしに継続された治療と比較して、免疫原性、又は減少した有効性における臨床的に有意な変化を含む、有害作用の危険性における期待される増加なく、参照製品と生物学的製品との間で患者が１回又はそれ以上切り替えられ得る場合に、生物学的に同等である。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、そのような機序が知られている程度まで、使用の条件（単数又は複数）の共通の作用機序（単数又は複数）によりそれらが両方とも作用する場合に生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボ及びインビトロの方法により実証され得る。生物学的同等性の尺度としては、例えば、（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が、血液、血漿、血清又は他の生物学的流体において時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関しており、かつ合理的に予測されるインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理作用が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、有効性もしくはバイオアベイラビリティ又は生物学的同等性を確立する十分に管理された臨床試験におけるものが挙げられる。
本明細書に示される例となる二重特異性抗原結合分子の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことにより、又は生物学的活性に必要ない末端もしくは内部の残基もしくは配列を除去することにより構築され得る。例えば、システイン残基は生物学的活性に必須ではなく、再生の際に不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために除去されるか又は他のアミノ酸と置き換えられ得る。他の状況において、生物学的に同等な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む本明細書に示される例となる二重特異性抗原結合分子の変異体を含み得る。
種選択性及び種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、ヒトＣＤ３に結合するが他の種由来のＣＤ３には結合しない抗原結合分子が提供される。ヒトＣＤ２０に結合するが他の種由来のＣＤ２０には結合しない抗原結合分子も提供される。本発明はまた、ヒトＣＤ３及び１つもしくはそれ以上の非ヒト種由来のＣＤ３に結合する抗原結合する抗原結合分子；並びに／又はヒトＣＤ２０及び１つもしくはそれ以上の非ヒト種由来のＣＤ２０に結合する抗原結合分子を含む。
本発明の特定の例となる実施態様によれば、ヒトＣＤ３及び／又はヒトＣＤ２０に結合し、かつ場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのＣＤ３及び／又はＣＤ２０の１つ又はそれ以上に結合してもしなくてもよい抗原結合分子が提供される。例えば、本発明の特定の例となる実施態様において、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する第一の抗原結合ドメイン、並びにヒトＣＤ２０に特異的に結合する第二の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
免疫複合体
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体のような治療部分に結合した抗原結合分子（「免疫複合体」）を包含する。細胞傷害性薬は、細胞に対して有害な薬剤を含む。免疫複合体を形成するために適切な細胞傷害性薬及び化学療法剤の例は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。
治療製剤及び投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、添加剤、及び改善された輸送、送達、耐性などをもたらすその他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な処方が、全ての薬剤師に公知の処方集に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、カーボワックス乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｃａｒｂｏｗａｘ）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びカーボワックスを含有する半固形混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ （１９９８） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照のこと。
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変化し得る。好ましい用量は、典型的には体重又は体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子が成人患者において治療目的で使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常は 約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／体重ｋｇの単回用量で静脈内投与することが有利かもしれない。状態の重症度に依存して、処置の頻度及び期間が調整され得る。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効な投薬量及びスケジュールは経験的に決定され得；例えば、患者の進行が定期的な評価によりモニタリングされ、それに従って用量が調整され得る。さらに、投薬量の種間スケーリングは、当該分野で周知の方法（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）を使用して行われ得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の医薬組成物を投与するために使用され得、例えば、リポソーム封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。組成物は、いずれかの都合の良い経路、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を通した吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身でも局所でもよい。
本発明の医薬組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下又は静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達において容易に有用性を有する。このようなペン型送達デバイスは再利用可能であるか又は使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般的には、医薬組成物を含む交換式カートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が全て投与されてカートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄され得、そして医薬組成物を含む新しいカートリジに置き換えられ得る。次いでペン型送達デバイスは再使用され得る。使い捨てペン型送達デバイスでは交換式カートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスはデバイス内のリザーバー中に保持される医薬組成物で予め充填されている状態である。リザーバから医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
多数の再利用可能なペン型自動注入送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する。例としては、限定されないが、少数を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮTM（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣTMペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５TMペン、ＨＵＭＡＬＯＧTMペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０TMペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮTM Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲTM（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤTMペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮTM、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯTM、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴTM、及びＯＰＴＩＣＬＩＫTM（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する使い捨てペン型送達デバイスの例としては、限定されないが、少数を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲTMペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮTM（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮTM（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫTM自動注入器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴTM（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡTM Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられる。
特定の状況において、医薬組成物は徐放（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）系で送達され得る。一実施態様において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施態様において、ポリマー材料が使用され得る；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ （ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照のこと。さらに別の実施態様において、徐放系が組成物の標的に近接して配置され得、それ故全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記参照、ｖｏｌ．２、ｐｐ．１１５−１３８を参照のこと）。他の徐放系はＬａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３による概説において考察される。
注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋内注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射用製剤は、公知の方法により製造され得る。例えば、注射用製剤は、例えば、上記の抗体又はその塩を、注射のために従来使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射のための水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤含有する等張液などがあり、これらはアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用され得る。従って注射剤は、好ましくは適切なアンプル中に充填される。
有利には、上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適している単位用量で投薬形態へと製造される。このような単位用量での投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般的には、単位用量で投薬形態あたり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、前述の抗体が約５〜約１００ｍｇで含有され、そして他の投薬形態については約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗原結合分子の治療上の使用
本発明は、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ３及び標的抗原（例えば、ＣＤ２０）に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含み得る。本明細書で使用される表現「それを必要とする被験体」は、癌の１つもしくはそれ以上の症状もしくは兆候を示すか（例えば、腫瘍を発現しているか又は本明細書以下で述べられる癌のいずれかに罹患している被験体）、又はそうでなければＣＤ２０活性の阻害もしくは減少、もしくはＣＤ２０＋Ｂ細胞の欠失から利益を受けるであろうヒト又は非ヒト動物を意味する。
本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子（及びそれらを含む治療用組成物）は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化及び／又は標的化が有益であろういずれかの疾患又は障害を処置するために有用である。特に、本発明の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ２０発現もしくは活性又はＣＤ２０＋ Ｂ細胞の増殖に関連するか、又はこれらにより媒介されるいずれかの疾患又は障害の処置、予防、及び／又は寛解のために使用され得る。本発明の治療方法が達成される作用機序は、例えば、ＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用により、又はこれらの機序の２つもしくはそれ以上の組み合わせによる、エフェクター細胞の存在下でのＣＤ２０を発現する細胞の死滅を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して阻害又は死滅され得るＣＤ２０を発現する細胞としては、例えば、腫瘍原性Ｂ細胞が挙げられる。
本発明の抗原結合分子は、例えば、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、胃腸管、雄性及び雌性生殖系、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼のような専門感覚器官において生じる原発性及び／又は転移性腫瘍を処置するために使用され得る。特定の実施態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して、以下の癌の１つ又はそれ以上を処置する：腎細胞癌、膵癌、乳癌、頭頸部癌、前立腺癌、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌（例えば、ＭＥＴ増幅を伴う胃癌）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉腫、甲状腺癌、又は黒色腫。特定の例となる実施態様によれば、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｂ細胞性癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫［ＮＨＬ］、前駆Ｂ細胞性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞性新生物、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚性濾胞中心リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｎｔｅｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、及び未分化大細胞リンパ腫を処置するために使用される。
本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合分子は、抗ＣＤ２０療法単独に対して抵抗性であるか、又は不完全に応答性である（例えば、リツキシマブ療法に抵抗性）Ｂ細胞性リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）に罹患した患者を処置するために有用である。本発明の他の関連する実施態様によれば、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を、抗ＣＤ２０療法に不応性であるＢ細胞性リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）に罹患した患者（例えば、リツキシマブ不応性腫瘍又は再発したかもしくは不応性のＢ細胞性リンパ腫を有する患者）に投与することを含む方法が提供される。腫瘍スキャニングなどのような当該分野で公知の分析／診断方法を使用して、抗ＣＤ２０療法単独に対して抵抗性であるか、不完全に応答性であるか、又は不応性である腫瘍として患者が有するかどうかを確認し得る。
本発明はまた、被験体において残存する癌を処置するための方法を含む。本明細書で使用される用語「残存する癌（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃａｎｃｅｒ）」は、抗癌治療での処置後に被験体において１つ又はそれ以上のがん細胞の存在又は残留を意味する。
特定の局面によれば、本発明は、ＣＤ２０発現に関連する疾患又は障害（例えば、Ｂ細胞性リンパ腫）を処置するための方法を提供し、この方法は、被験体が抗ＣＤ２０単独療法を受けた後に（例えば、リツキシマブのような抗ＣＤ２０抗体を含む医薬組成物の投与後に）、本明細書の他所に記載される二重特異性抗原結合分子の１つ又はそれ以上を被験体に投与することを含む。例えば、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫を処置するための方法を含み、この方法は、被験体が抗ＣＤ２０単独療法（例えば、リツキシマブ処置又はその等価な処置）を受けた１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週後、２週後、３週後又は４週後、２ヶ月後、４ヶ月後、６ヶ月後、８ヶ月後、１年後、又はそれ以上後に、患者に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０抗原結合分子を投与することを含む。他の局面において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子）が、（例えば、Ｂ細胞の着実な初期枯渇をもたらすために）１つ又はそれ以上の時点で被験体に最初に投与され、続いてＩｇＧ１ Ｆｃドメインのような異なるＩｇＧドメインを含む等価な二重特異性抗原結合分子が、その後の時点で投与される。
組み合わせ療法及び製剤
本発明は、本明細書に記載される例となる抗体及び二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を、１つ又はそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。本発明の抗原結合分子と組み合わせられ得るか、又は組み合わせて投与され得る例となるさらなる治療剤としては、例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブ又はパニツムマブ］又はＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブ又はエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のような別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、又はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアナゴニスト（ａｎａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ ７，０８７，４１１を参照のこと（本明細書では「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１のような、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示される抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐのような、ＵＳ２０１１／００２７２８６に開示される抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体）、ＳＴＥＡＰ１又はＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体又は抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブのような一価抗ＣＤ２０抗体）などが挙げられる。本発明の抗原結合分子と組み合わせて有利に投与され得る他の薬剤としては、小分子サイトカイン阻害剤を含むサイトカイン阻害剤、及びＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８のようなサイトカイン又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物）はまた、「ＩＣＥ」：イホスファミド（例えば、Ｉｆｅｘ(R)）、カルボプラチン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ(R)）、エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ(R)、Ｔｏｐｏｓａｒ(R)、ＶｅＰｅｓｉｄ(R)、ＶＰ−１６）；「ＤＨＡＰ」：デキサメタゾン（例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ(R)）、シタラビン（例えば、Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(R)、シトシンアラビノシド、ａｒａ−Ｃ）、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(R)−ＡＱ）；及び「ＥＳＨＡＰ」：エトポシド（例えば、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ(R)、Ｔｏｐｏｓａｒ(R)、ＶｅＰｅｓｉｄ(R)、ＶＰ−１６）、メチルプレドニゾロン（例えば、Ｍｅｄｒｏｌ(R)）、高用量シタラビン、シスプラチン（例えば、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(R)−ＡＱ）から選択される１つ又はそれ以上の治療的組み合わせを含む治療計画の一部として投与され得る。
本発明はまた、本明細書において言及される抗原結合分子のいずれか、及びＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＦＯＬＨ１、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキン、又は上述のサイトカインのいずれかの１つ又はそれ以上の阻害剤を含む治療用組み合わせを含み、ここで阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）もしくは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；又は他の操作された分子、例えば二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四特異性骨愛（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）及び最小認識単位）である。本発明の抗原結合分子はまた、抗ウイルス薬（ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ）、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド及び／又はＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／又は同時処方（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）され得る。本発明の抗原結合分子はまた、放射線処置及び／又は従来の化学療法も含む処置計画の一部として投与され得る。
さらなる治療活性成分は、本発明の抗原結合分子の投与の直前に、同時に、又は直後に投与され得る；（本開示の目的のために、このような投与計画は、さらなる治療活性成分と「組み合わせた」抗原結合分子の投与とみなされる）。
本発明は、本明細書の他所に記載されるように、本発明の抗原結合分子が１つ又はそれ以上のさらなる治療活性成分と同時処方された医薬組成物を含む。
投与計画
本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）の複数回用量は、規定された時間経過にわたって被験体に投与され得る。本発明のこの局面に従う方法は、本発明の抗原結合分子の複数回用量を被験体に逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される「逐次的に投与すること」は、抗原結合分子の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週又は月）だけ離れた異なる日に被験体に投与されるということを意味する。本発明は、抗原結合分子の単回初期用量、続いて抗原結合分子の１つ又はそれ以上の二次用量、そして場合により続いて抗原結合分子の１つ又はそれ以上の三次用量を、逐次的に投与することを含む方法を含む。
用語「初期用量」、「二次用量」、及び「三次用量」は、本発明の抗原結合分子の投与の時系列を指す。従って、「初期用量」は処置計画の初めに投与される用量であり（「ベースライン用量」とも呼ばれる）；「二次用量」は初期用量の後に投与される用量であり；そして「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、及び三次用量は全て、同じ量の抗原結合分子を含有していてもよいが、一般的には投与頻度の点から互いに異なり得る。しかし、特定の実施態様において、初期、二次及び／又は三次用量に含有される抗原結合分子の量は、処置の過程で互いに変わる（例えば、適宜上方又は下方に調整される）。特定の実施態様において、２つ又はそれ以上（例えば、２、３、４、又は５）の用量が、処置計画の初めに「負荷投与量」として投与され、続いてより低い頻度で投与される後続用量（例えば、維持量）が投与される。
本発明の１つの例となる実施態様において、二次用量及び／又は三次用量はそれぞれ、直前の投薬の１〜２６週間後（例えば、１、１1／2、２、２1／2、３、３1／2、４、４1／2、５、５1／2、６、６1／2、７、７1／2、８、８1／2、９、９1／2、１０、１０1／2、１１、１１1／2、１２、１２1／2、１３、１３1／2、１４、１４1／2、１５、１５1／2、１６、１６1／2、１７、１７1／2、１８、１８1／2、１９、１９1／2、２０、２０1／2、２１、２１1／2、２２、２２1／2、２３、２３1／2、２４、２４1／2、２５、２５1／2、２６、２６1／2、週間又はそれ以上後）に投与される。本明細書で使用される句「直前の投薬」は、一連の複数回投与で、投薬を介在させずに、その順番で次の用量の投与の前に患者に投与される抗原結合分子の投薬を意味する。
本発明のこの局面に従う方法は、抗原結合分子（例えば、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ２０及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗原結合分子）の任意の数の二次用量及び／又は三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施態様において、単回二次用量のみが患者に投与される。他の実施態様において、２つ又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施態様において、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施態様において、２つ又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
複数回二次用量を含む実施態様において、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の投薬の１〜２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数回三次用量を含む実施態様において、各三次用量は他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の投薬の２〜４週後に患者に投与され得る。あるいは、二次用量及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、処置計画の間に変化し得る。投与頻度はまた、臨床検査後に個々の患者の必要性に依存して医師による処置の過程の間に調整され得る。
抗体の診断上の使用
本発明の抗ＣＤ３抗体はまた、例えば診断目的のために、サンプル中のＣＤ３、又はＣＤ３を発現する細胞を検出及び／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ＣＤ３抗体、又はそのフラグメントは、ＣＤ３の異常な発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如など）により特徴づけられる状態又は疾患を診断するために使用され得る。ＣＤ３についての例となる診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、本発明の抗ＣＤ３抗体と接触させることを含み得、ここで抗ＣＤ３抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識される。あるいは、非標識抗ＣＤ３抗体を、それ自体検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、もしくは125Ｉ；蛍光性もしくは化学発光性の部分、例えばフルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミン；又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼであり得る。サンプル中のＣＤ３を検出又は測定するために使用され得る具体的な例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明に従うＣＤ３診断アッセイにおいて使用され得るサンプルは、患者から入手可能ないずれかの組織又は流体のサンプルを含み、正常又は病理的状態下で検出可能な量のＣＤ３タンパク質又はそのフラグメントを含有する。一般に、健常患者（例えば、異常なＣＤ３レベル又は活性に関連する疾患又は状態に罹患していない患者）から得られた特定のサンプル中のＣＤ３のレベルは、最初にＣＤ３のベースライン、又は標準的なレベルを確立するために測定される。次いでＣＤ３のこのベースラインレベルを、ＣＤ３関連疾患又は状態を有することが疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたＣＤ３レベルと比較し得る。
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造及び使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするために努力がなされてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差が占めるはずである。そうではないと示されていなければ、部数は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧又は大気圧付近である。
実施例１．抗ＣＤ３抗体の生成
抗ＣＤ３抗体を、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(R)マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を、ＣＤ３を発現する細胞又はＣＤ３をコードするＤＮＡで免疫することにより得た。抗体免疫応答を、ＣＤ３特異的イムノアッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が達成された場合、脾細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能を保存してハイブリドーマ細胞株を形成した。このハイブリドーマ細胞株を、ＣＤ３特異的抗体を産生する細胞株を同定するためにスクリーニングし、そして選択した。この技術を使用して、いくつかの抗ＣＤ３キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。さらに、いくつかの完全ヒト抗ＣＤ３抗体を、ＵＳ ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、骨髄腫細胞への融合なしに抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
この実施例の方法に従って生成された例となる抗ＣＤ３抗体の特定の生物学的特性を、以下に示される実施例において詳細に記載する。
実施例２．重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列及び核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子は表２に示される。
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抗体は、典型的には、本明細書において以下の命名に従って言及される：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」など）、続いて数値識別子（例えば、表１に示されるような「２７１２」、「２６９２」など）、続いて「Ｐ」、「Ｎ」又は「Ｂ」の接尾辞。従って、この命名法によれば、抗体は本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｈ２７１２Ｎ」、「Ｈ１Ｍ２６９２Ｎ」、「Ｈ２Ｍ２６８９Ｎ」などと呼ばれ得る。本明細書で使用される抗体名称でのＨ１Ｈ、Ｈ１Ｍ及びＨ２Ｍの接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有し、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１ Ｆｃを有し、そして「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２ Ｆｃを有する（全ての可変領域は、抗体名称において最初の「Ｈ」により示されるように完全にヒトである）。当業者には当然のことながら、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換され得るが（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体へと変換され得るなど）、いずれにしても、可変ドメイン（ＣＤＲを含む） −表１に示される数値識別子により示される− は同じままであり、そしてＦｃドメインの性質にかかわらず結合特性は同一であるか実質的に同様であると期待される。
以下の実施例において使用される対照構築物
様々な対照構築物（抗ＣＤ３抗体）が、比較目的のために以下の実験に含まれた：「ＯＫＴ−３」、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）からカタログ番号ＣＲＬ−８００１で入手可能なヒトＴ細胞表面抗原に対するマウスモノクローナル抗体；及び「ＳＰ３４」、ヒトＴリンパ球上のＴ３複合体のエプシロン鎖に対して反応性の、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （Ｃａｔ．Ｎｏ．３０２９１４）から得られる市販のマウスモノクローナル抗体。
実施例３．表面プラズモン共鳴により導かれたヒトモノクローナル抗ＣＤ３抗体の結合親和性及び速度定数
ヒトモノクローナル抗ＣＤ３抗体の結合親和性及び速度定数を、抗体捕捉形式（表３、５及び７）又は抗原捕捉形式（表４、６及び８）のいずれかを使用して２５℃で表面プラズモン共鳴により決定した。測定はＴ２００ Ｂｉａｃｏｒｅ機器で行った。
抗体捕捉形式において、Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、ハイブリドーマ捕捉のためにウサギ抗マウスＦｃ（抗体接頭辞Ｈ１Ｍ又はＨ２Ｍ）又はヒトＩｇＧ形式の抗体（抗体接頭辞Ｈ１Ｈ）のためにマウス抗ヒトＦｃ表面で誘導体化した。ヒトＦｃタグ（ｈＦｃΔＡｄｐ／ｈＦｃ；配列番号１３７２／１３７３）又はマウスＦｃタグ（ｍＦｃΔＡｄｐ／ｍＦｃ；配列番号１３７４／１３７５）のいずれかを有する可溶性ヘテロダイマーＣＤ３タンパク質（ｈＣＤ３−エプシロン／ｈＣＤ３−デルタ；配列番号１３７０／１３７１）を、抗体が捕捉された表面上に注入し、そして結合応答を記録した。ヘテロダイマーＣＤ３タンパク質を、Ｄａｖｉｓら（ＵＳ２０１０／０３３１５２７）に記載される方法を使用して精製した。
抗原捕捉形式において、ヘテロダイマーＣＤ３タンパク質を、ウサギ抗マウスＦｃ又はマウス抗ヒトＦｃを使用して補足し、そしてそれぞれの抗体を捕捉された抗原上に注入した。
抗体を、それらの従来の二価形式（表３〜６）、又は第二のＦａｂが抗体から除去され、Ｆｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３）のみが発現される一価１アーム構成（表７又は８）で分析した。
動力学的結合（ｋa）及び解離（ｋd）速度定数を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０カーブフィッティングソフトウエアを使用してデータを処理して１：１結合モデルにフィッティングすることにより決定した。結合解離平衡定数（ＫD）及び解離半減期（ｔ1/2）を動力学的速度定数から以下のように計算した：ＫD（Ｍ）＝ｋd／ｋa；及びｔ1/2（分）＝（ｌｎ２／（６０＊ｋd）。ＮＴ＝未試験；ＮＢ＝結合が観察されない。
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表３〜８に示されるように、本発明のいくつかの抗ＣＤ３抗体は、抗体捕捉形式又は抗原捕捉形式のいずれかで、高親和性でＣＤ３に結合する。
実施例４．抗ＣＤ３抗体はヒトＴ細胞に結合して増殖させる
本発明の抗ＣＤ３抗体を、ヒトＴ細胞に結合してそれらの増殖を誘導するそれらの能力について試験した。結合をＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋ヒトＴ細胞株）を使用して評価し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖はＡＴＰ触媒定量（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)）を使用して評価した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３はポジティブコントロールとして作用し、そして無関係なアイソタイプの対応する抗体はネガティブコントロールとして作用した。
ＦＡＣＳデータを以下のプロトコルを使用して得た：１ウェルあたり２ｘ１０5個の細胞を、段階希釈した抗体と共に３０分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を洗浄し、そして二次抗体を加え、そしてさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を洗浄し、１％ ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳに再懸濁し、そして生存Ｊｕｒｋａｔ細胞を側方及び前方散乱によりゲーティングしてフローサイトメトリーにより分析した。細胞結合タイトレーションのためのＥＣ50を、４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算された値を用いてＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して決定した。
増殖データを以下のプロトコルを使用して得た：ヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０4／ウェル）を、抗ＣＤ３の３倍段階希釈及び固定濃度の市販の抗ＣＤ２８抗体（２００ｎｇ／ｍｌ）と共に９６ウェルプレートで７２時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)を加え、そして発光をＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。細胞生存のＥＣ50（ＡＴＰ触媒定量）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
結合及び増殖実験の結果を表９〜１１にまとめる。
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表７〜９に示されるように、本発明の抗ＣＤ３抗体の大部分は、ヒトＴ細胞に結合し、そしてＴ細胞増殖を誘導した。
実施例５．抗ＣＤ３抗体はサルＴ細胞に結合し増殖させる
本発明の抗ＣＤ３抗体のサブセットを、サルＴ細胞に結合して増殖を誘導する能力について試験した。
ＦＡＣＳデータを以下のプロトコルを使用して得た：１ウェルあたり２ｘ１０5個の細胞を、段階希釈した抗体と共に３０分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして二次抗体を加え、さらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳに再懸濁し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４＋サルＴ細胞を側方及び前方散乱により、そしてＣＤ２＋ＣＤ４＋ＣＤ２０−集団でゲーティングした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでの４パラメータ非線形回帰分析を使用して、細胞結合タイトレーションのためにＥＣ50を計算した。
増殖データを以下のプロトコルを使用して得た：単離したばかりのカニクイザル由来ＰＢＭＣ（５ｘ１０4／ウェル）を、抗ＣＤ３抗体の３倍段階希釈及び固定濃度の市販の抗ＣＤ２８抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）抗体とともに９６ウェルプレートにて７２時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)を加え、そして発光をＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。細胞生存のＥＣ50（ＡＴＰ触媒定量）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
結合及び増殖実験の結果を表１２及び１３にまとめる。
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表１２及び１３に示されるように、本発明のいくつかの抗ＣＤ３は、ＣＤ２＋ＣＤ４＋サルＴ細胞に結合し、そしてそれらの増殖を誘導した。ＯＫＴ３はサルＰＢＭＣ増殖を駆動しなかったが、ＳＰ３４はサルＰＢＭＣに対して活性であった。
実施例６．抗ＣＤ３ ｍＡｂは腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を支持する
Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用を介するＴ細胞媒介死滅をリダイレクトする（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）抗ＣＤ３抗体の能力を、カルセインベースのＵ９３７死滅アッセイを使用して試験した。手短には、ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅで単離し、そしてヒトＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）及びＴ細胞活性化ビーズ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する媒体を用いて数日間かけて活性化した。Ｕ９３７細胞をカルセインで標識し、次いで活性化Ｔ細胞と共に１０：１エフェクター：標的比で３倍段階希釈の抗体を使用して３時間かけて３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを遠心分離し、そして上清を蛍光分析のために半透明黒色透明底プレートに移した。５０％細胞傷害を誘導するＣＤ３抗体のモル濃度として定義されるＥＣ50値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。ハイブリドーマ抗体、ヒトＦｃ抗体、及び一価１アーム抗体を使用した結果を表１４、１５及び１６にそれぞれ示す。
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表１４〜１６に示されるように、大部分の抗ＣＤ３抗体に加えてＯＫＴ３も、リダイレクトされたＴ細胞媒介死滅をこのアッセイ系において支持した。隣接するＴ細胞上のＣＤ３のクラスター形成をもたらすＵ９３７細胞上のＦｃ受容体との抗体のＦｃ会合に依存すると考えられている観察された死滅は、非特異的ヒトＩｇＧの添加により抑えられた（データは示していない）。
実施例７．ＣＤ３及びＣＤ２０に結合する二重特異性抗体の生成
抗ＣＤ３特異的結合ドメイン及び抗ＣＤ２０特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的方法論を使用して構築した。ここでは、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖及び軽鎖を抗ＣＤ２０抗体由来の重鎖と組み合わせた。本実施例の二重特異性抗体を構築するために使用された抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３を発現する細胞もしくはＣＤ３をコードするＤＮＡを用いてＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ(R)マウスを免疫することにより、又はＢＳ３／２０−００７及び−００９の場合には公知の抗ＣＤ３抗体（すなわち、ＷＯ２００４／１０６３８０に示される抗ＣＤ３抗体「Ｌ２Ｋ」）から得られた。この実施例の二重特異性抗体を構築するために使用された抗ＣＤ２０抗体は、ＵＳ７，８７９，９８４に示されている。
本実施例に従って作製された二重特異性抗体は、２つの別々の抗原結合ドメイン（すなわち、結合アーム）を含む。第一の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＬ」）と対をなした、抗ＣＤ２０抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ２０−ＶＨ」）を含む。ＣＤ２０−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対形成は、ＣＤ２０を特異的に認識する抗原結合ドメインを生じる。第二の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＬ」）と対をなした抗ＣＤ３抗体由来の重鎖可変領域（「ＣＤ３−ＶＨ」）を含む。ＣＤ３−ＶＨ／ＣＤ３−ＶＬ対形成は、ＣＤ３を特異的に認識する抗原結合ドメインを生じる。同じＣＤ２０−ＶＨを、この実施例において生成された全ての二重特異性抗体において使用し、そして「ＣＤ２０−ＶＨ−Ａ」と称する（異なるＣＤ２０−ＶＨを使用した「ＣＤ２０−ＶＨ−Ｂ」と呼ばれるＢＳ３／２０−００９を除く）。しかし、いくつかの異なるＣＤ３−ＶＨ及びＣＤ３−ＶＬ成分（ＣＤ３−ＶＨ−Ａ、ＣＤ３−ＶＨ−Ｂなど、及びＣＤ３−ＶＬ−Ａ、ＣＤ３−ＶＬ−Ｂなどと呼ばれ、異なる 抗ＣＤ３抗体由来である）を、以下の実施例の異なる二重特異性抗体において使用した。
この実施例に従って作製された様々な二重特異性抗体の抗原結合ドメインの構成部分の要約を表１７に示す。
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表１８及び１９は、この実施例の二重特異性抗体の様々な重鎖可変領域（表１８）及び軽鎖可変領域（表１９）並びにそれらの対応するＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 0006923292
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さらに、表２０及び２１は、この実施例の二重特異性抗体の重鎖可変領域（表２０）及び軽鎖可変領域（表２１）、並びにそれらの対応するＣＤＲをコードするヌクレオチド配列についての配列識別子を示す。
Figure 0006923292
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上記の二重特異性抗体に加えて、以下の対照抗体も以下の実施例において示されるいくつかの実験において使用した：
対照Ｉ：ＵＳ４，３６１，５４９において示され、そしてハイブリドーマＣＲＬ−８００１（アメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能な、ヒトＴ細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体「ＯＫＴ−３」。
対照ＩＩ：ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、カタログ番号５５０５２から入手可能な、ヒトＴリンパ細胞上のＴ３複合体のエプシロン鎖に対して反応性の抗体「ＳＰ３４」。
対照ＩＩＩ：ＵＳ５，７３６，１３７に開示されるリツキサン（リツキシマブ）の重鎖及び軽鎖配列を有する抗ＣＤ２０治療用抗体。
対照ＩＶ：ＵＳ７，８７９，９８４に開示され、そして配列番号１２４２／１３４６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対及び配列番号１２４４−１２４６−１２４８−１３４８−１３５０−１３５２のＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体として本明細書において示される、「３Ｂ９−１０」と称されるモノクローナル抗ＣＤ２０抗体。
対照Ｖ：ＵＳ ７，８７９，９８４に開示され、そして配列番号１３５４／１３６２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対及び配列番号１３５６−１３５８−１３６０−１３６４−１３６６−１３６８のＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体として本明細書に示される、「１０Ｆ２−１３」と称されるモノクローナル抗ＣＤ２０抗体。
実施例８．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体はＪｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ及びサルＴ細胞に選択的に結合する
実施例１に示される、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体及び対照構築物を、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ３＋、ＣＤ２０−ヒトＴ細胞株）、Ｒａｊｉ（ＣＤ３−、ＣＤ２０＋ヒトＢ細胞株）、又はカニクイザルＰＢＭＣ（「ｍｋＴ細胞」）に結合するそれらの能力についてＦＡＣＳにより試験した。
ＦＡＣＳデータを以下のプロトコルを使用して得た：細胞を１ウェルあたり２ｘ１０5で、段階希釈した抗体と共に３０分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして適切な二次（Ｊｕｒｋａｔ、ＲＡＪＩ細胞）又は二次抗体のカクテル（カニクイザルＰＢＭＣのため）を加え、さらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、１％ ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳに再懸濁し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーにより分析した。Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞を側方及び前方散乱によりゲーティングし、カニクイザルＴ細胞はＣＤ２＋ＣＤ４＋集団でもゲーティングした。細胞結合タイトレーションのためのＥＣ50を、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算された数値を用いて決定した。結果を表２２に示す。
Figure 0006923292
表２２に示されるように、試験した抗体のパネルは、それらの特異性に依存して、様々な細胞株に関する様々な結合親和性を示す。二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００１、−００２、−００３、−００４及び−００５）は、両方のヒト標的系統に結合する能力を示した。抗体のサブセットはまた、カニクイザル細胞（対照ＩＩ、ＢＳ３／２０−００１及びＢＳ３／２０−００３）に結合する能力を示した。抗ＣＤ３対照Ｉ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ３対照ＩＩ（ＳＰ３４）、及び抗ＣＤ２０対照ＩＶは、Ｊｕｒｋａｔ、カニクイザルＴ細胞、及びＲＡＪＩにそれぞれ結合した。
実施例９．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体はインビトロでＰＢＭＣ増殖を誘導する
選択されたＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体及び対照構築物の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激して増殖を誘導する能力を、ＡＴＰ触媒定量（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)）を使用して評価した。ＰＢＭＣの活性化はサイトカインの放出を生じ、これが細胞増殖を駆動する。
増殖データは以下のプロトコルを使用して得られた：ヒト又はカニクイザル由来のＰＢＭＣ（５ｘ１０5／ウェル）を、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０又は対照抗体の３倍段階希釈とともに９６ウェルプレートで７２時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)を加え、そして発光をＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。細胞生存のＥＣ50（ＡＴＰ触媒定量）をＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して決定した。値を４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算し、表２３に示す。
Figure 0006923292
表２３に示されるように、本発明の全てのＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、ヒト又はカニクイザルＰＢＭＣの活性化因子であった。一般に、抗ＣＤ３単一特異的二価親抗体（対照（Ｃｏｎｔｒｏｓ）Ｉ及びＩＩ）は、二重特異性の同等物より２〜１０倍強力であった。対照Ｉ（ＯＫＴ３）はサルＰＢＭＣ増殖を駆動しなかったが、対照ＩＩ（ＳＰ３４）はヒト及びサルＰＢＭＣの両方に対して活性であった。
実施例１０．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、ヒト全血においてＴ細胞を活性化し、ＩＦＮ−ガンマ放出及びＣＤ２５上方調節を誘導する
選択されたＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト全血においてＴ細胞を活性化するそれらの能力について試験した。Ｔ細胞活性化の程度を、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）分泌、さらにはＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２５の上方調節を測定することにより決定した。
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）分泌を、ヘパリン化された全血を５倍段階希釈の二重特異性抗体と９６ウェルプレートで混合することにより定量した。２０時間後、プレートを５分間遠心分離し、そして血漿をＥＬＩＳＡ分析のために取り出してＩＦＮγレベルを決定した。推定ＩＦＮγ濃度を抗体濃度に対してプロットし、そしてＥＣ50値をＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ２５発現の分析のために、抗体とのインキュベーション及び血漿の除去の後に、血液１５０μｌをディープウェルプレートに移し、そして１．５ｍＬ ＲＢＣ溶解緩衝液を用いて１５分間溶解した。細胞を２回洗浄し、室温でｈＦｃＲブロッキング試薬を用いて１０分間ブロックし、次いで３０分間４℃でＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５に直接結合された抗体と共にインキュベートした。次に、細胞を２回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ血球計算器及びＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。
活性化マーカーＣＤ２５を発現しているＣＤ２＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを抗体濃度に対してプロットし、そしてＥＣ50値を４パラメータ非線形回帰分析を使用してＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して計算した。結果を表２４に示す。
Figure 0006923292
表２４に示されるように、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、１３０〜２９０ｐＭの範囲に及ぶＥＣ50値で、全血においてＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方調節を媒介し、ＩＦＮγについての対応するＥＣ50値はわずかに高い３９０ｐＭ〜２ｎＭの範囲であった。ＢＳ３／２０−００４は、ＥＣ50により決定してＣＤ２５上方調節及びＩＦＮγ産生の媒介において次いで（ｔｈｅｎ）わずかに低い効力のＢＳ３／２０−００１及びＢＳ３／２０−００３であったが、ＢＳ３／２０−００４は全血培養においてより高いレベルのＩＦＮγを誘導することができた。
実施例１１．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、リツキシマブ抵抗性細胞株でＴ細胞媒介細胞傷害を誘導する
選択されたＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体及び対照構築物の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及びＴ細胞媒介細胞傷害を媒介する能力を、親Ｒａｊｉ細胞及びＲａｊｉ ＳＣＩＤ系統を使用して評価した。後者（Ｒａｊｉ ＳＣＩＤ系統）は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブでの処置の後にＲａｊｉ細胞を皮下注射された免疫不全マウスから単離された個々の抗ＣＤ２０抵抗性腫瘍由来であった。４つの系統（Ｒａｊｉ ＳＣＩＤ １〜４）をこの実施例において使用した。
Ｒａｊｉ細胞株でのＣＤ２０並びに補体阻害性分子ＣＤ５５及びＣＤ５９の発現をＦＡＣＳにより決定した。手短には、１ｘ１０6個の細胞を、個々のチューブで３０分間、ＣＤ２０、ＣＤ５５及びＣＤ５９に直接結合された抗体と共にインキュベートした。細胞を２回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ血球計算器によりＦＡＣＳを得、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析した。
抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３ｘＣＤ２０抗体のＲａｊｉ細胞株のＴ細胞指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）死滅を媒介する能力を決定するために、カルセイン標識Ｒａｊｉ細胞を、予め活性化した（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞（ｒｈＩＬ−２（３０Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズで活性化されたフィコール単離ヒトＰＢＭＣ）及び２ｎＭから始めた抗体の３倍段階希釈と共に２時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、そして上清を４８５ｎｍ発光での５３０ｎｍ蛍光検出のために半透明黒色透明底プレートに移した。細胞傷害パーセントを、自発的（標的細胞のみ）及び最大の放出（界面活性剤で溶解された標的細胞）値に基づいて決定した。ＥＣ50値を４パラメータ非線形回帰分析を使用してＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して計算した。
抗体のＣＤＣを媒介する活性を決定するために、Ｒａｊｉ細胞株を５％正常ヒト血清補体及び抗体の１００ｎＭから始める３倍段階希釈と共にインキュベートした。４．５時間３７℃でのインキュベーション後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ(R)を使用して細胞死を決定した。細胞傷害パーセントを、自発的（標的細胞のみ）及び最大放出（界面活性剤で溶解した標的細胞）値に基づいて決定した。ＥＣ50値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用してＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して計算した。
結果を表２５に示す。
Figure 0006923292
親Ｒａｊｉ細胞と比較して、４つのＲａｊｉ ＳＣＩＤ系統のうち２つがＣＤ２０の減少した発現を示し（表２５；系統Ｒａｊｉ ＳＣＩＤ １及び３）、有意に高いパーセンテージの細胞が補体阻害性分子ＣＤ５５及びＣＤ５９を発現した。抗ＣＤ２０又は抗ＣＤ２０ｘＣＤ３抗体のいずれかにより媒介されるＣＤＣに対するＲａｊｉ ＳＣＩＤ細胞の感受性は、ＣＤ５５／ＣＤ５９発現細胞のパーセンテージに依存したが、ＣＤ２０のレベルではなく、その結果、標的細胞上のＣＤ５５／ＣＤ５９の増加した発現がＣＤＣを阻害した。
抗ＣＤ２０抗体（対照ＩＶ及び対照ＩＩＩ［リツキシマブ］）は、二重特異性はＣＤ２０について一価であるので、ＣＤＣの媒介において抗ＣＤ２０ｘＣＤ３（ＢＳ３／２０−００７）より強力であった。しかし、全ての細胞株は、抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体の存在下での活性化Ｔ細胞による細胞死に対して等しく感受性であったので、ＣＤＣと対照的に、Ｔ細胞媒介細胞傷害は、ＣＤ２０レベルにもＣＤ５５／ＣＤ５９にも依存しなかった。さらに、二重特異性抗体は、ＣＤＣアッセイにおいて抗ＣＤ２０抗体よりもＲａｊｉ細胞のＴ細胞依存死滅の媒介において１００〜１０００倍強力であった。
実施例１２．ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２５上方調節は、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体の存在下の場合、ＣＤ２０濃度に依存する
より高い濃度の標的細胞（ＣＤ２０＋リンパ腫）がＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体の増加した効力をもたらすかどうかを評価するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バーキットリンパ腫由来細胞株、すなわちＲａｊｉの存在下で共培養した。
ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２５上方調節を以下のプロトコルを使用して決定した：Ｆｉｃｏｌｌでの単核細胞濃縮白血球除去由来血液の遠心分離により単離されたヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０5／ｍＬ）を、Ｒａｊｉ細胞の存在下（１ｘ１０5／ｍＬ）又は存在しない場合に、３７℃で９６ウェル平底プレートにて二重特異性抗体の５倍段階希釈と共にインキュベートした。４８時間後、細胞を２回洗浄し、室温にてｈＦｃＲブロッキング試薬を用いて１０分間ブロックし、次いでＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２５に直接結合された抗体と共に３０分間４℃でインキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ血球計算器によりＦＡＣＳを得、そしてＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより分析した。ＣＤ２５を発現する活性化ＣＤ２＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージを抗体濃度に対してプロットし、そしてＥＣ50値を、４パラメータ非線形回帰分析を使用してＰｒｉｓｍソフトウエアを使用して計算した。結果を表２６に示す。
Figure 0006923292
表２６に示されるように、Ｒａｊｉ（標的）細胞の存在下で培養された場合の活性化Ｔ細胞はＣＤ２５の上方調節、及びの後それらのＥＣ50値の１００倍の減少を示した。
実施例１３．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、活性化Ｔ細胞の存在下にてＲａｊｉ細胞に対する細胞傷害を誘導する
Ｔ細胞媒介死滅をＣＤ２０発現Ｒａｊｉ細胞へリダイレクトするＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体の能力を、インビトロ細胞傷害アッセイにおいて試験した。さらに、Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用によりＵ９３７細胞を死滅させる二重特異性及び親抗ＣＤ３抗体の両方の能力も調べた。
カルセイン死滅アッセイを以下のプロトコルを使用して行った：ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣを、それぞれｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅで又はＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ Ｍａｍｍａｌ細胞分離媒体により単離した。単離されたＰＢＭＣを、組換えヒトＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣに抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣには抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する媒体を用いて数日の間に活性化した。
標的細胞（ＣＤ２０媒介死滅のためにＲａｊｉ、及びＦｃＲ媒介死滅のためにＵ９３７）をカルセインで標識し、そして活性化Ｔ細胞と共に１０：１エフェクター：標的比で抗体の３倍段階希釈を使用して３時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを遠心分離し、そして蛍光分析のために上清を半透明黒色透明底プレートに移した。５０％の細胞傷害を誘導する二重特異性抗体のモル濃度として定義されるＥＣ50をＰｒｉｓｍを使用して決定した。値を４パラメータ非線形回帰分析を使用して計算した。結果を表２７にまとめる。
Figure 0006923292
表２７に示されるように、ヒト特異性又はヒト／カニクイザル交差反応性抗ＣＤ３アームを含有する二重特異性ＣＤ２０ｘＣＤ３抗体は、ヒト活性化Ｔ細胞の存在下で細胞傷害性をＲａｊｉ細胞に特異的にリダイレクトすることができた。カニクイザル活性化Ｔ細胞の存在下で、サルＴ細胞を活性化する抗ＣＤ３アームを有する二重特異性抗体であるＢＳ３／２０−００１又はＢＳ３／２０−００３と共にインキュベートした場合に、Ｒａｊｉは死滅した。全ての二重特異性抗体に加えて対照Ｉ、抗ＣＤ３ ｍＡｂも、Ｕ９３７ Ｆｃ／ＦｃＲ依存性死滅アッセイにおいて活性を示した。ブロッキング非特異的ヒトＩｇＧを反応に加えることによりこの活性をブロックすることができた（データは示していない）。
実施例１４．ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体は、ヒト免疫細胞で再構成されたマウスにおいてＣＤ１９＋ Ｂ細胞を枯渇させ得る
ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体投与のインビボ有効性を決定するために、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞及びＣＤ２＋ Ｔ細胞レベルの変化を、ヒト免疫細胞で再構成されたマウスに抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体１０μｇ又は０．１μｇを投与した後、ＦＡＣＳにより調べた。
手短には、新生仔ＢＡＬＢ／Ｒａｇ２null／(c nullマウスを、２ｘ１５０ラドで照射し、そして４ｘ１０5 ヒトＣＤ３４+造血前駆細胞を用いて肝臓内注射により再構成した。１２週後に、末梢血において再構成したヒト免疫系の組成をフローサイトメトリーにより決定した。典型的には再構成の３ヶ月後までに、１０％〜６０％パーセントの間の抹消白血球がヒトＣＤ４５＋であり、その４０％〜７０％がＢ細胞であり、１５％〜４０％はＴ細胞であり、そして残りはナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の小集団であった。
再構成の５ヶ月後に、マウスに、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００７を１０μｇもしくは０．１μｇ、一価１アームＣＤ３抗体（ＢＳ３／２０−００９、表１を参照のこと）を１０μｇ、又は無関係のｈＩｇＧアイソタイプコントロールを１０μｇ腹腔内注射した。注射の１、８、及び２５日後に、後眼窩出血させ、そして末梢血中の免疫細胞個数をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により決定した。
ＦＡＣＳ分析のために、血液１００μｌを１．５ｍｌ ＲＢＣ溶解緩衝液と共にＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で３分間インキュベートした。細胞を５分間０．４ｘｇで遠心分離し、２回ＦＡＣＳ洗浄液（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）で洗浄し、そして室温でマウスＦｃブロッキング試薬を用いて１０分間ブロックした。次いで細胞を３０分間４℃で、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、ｈＣＤ４５、ｈＨＬＡ−ＤＲ、及びｍＣＤ４５に直接結合した抗体と共にインキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ血球計算器によりＦＡＣＳを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで解析した。結果を表２８に示す。
Figure 0006923292
表２８に示されるように、抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００７の１０μｇ単回用量は、２匹の処置されたマウスのうち２匹において循環ｈＣＤ４５＋細胞の消失を生じ、これらは実験全体にわたって回復しなかった。ＢＳ３／２０−００７の０．１μｇ単回用量は、循環ｈＣＤ４５＋細胞（ＣＤ１９＋ Ｂ細胞及びＣＤ２＋ Ｔ細胞を含む）を３匹の処置されたマウスのうち２匹において注射の２４時間後に減少させた。一旦枯渇すると、ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは、０．１μｇ ＢＳ３／２０−００７で処置された応答するマウスにおいて有意に回復しなかった。しかし、これらのマウスにおいて残った細胞は主にｈＣＤ２＋ Ｔ細胞であり、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞は処置後２５日目でさえ応答マウスにおいて存在しなかった。単回１０μｇ用量の一価１アームＣＤ３抗体（ＢＳ３／２０−００９）はまた、２匹の処置されたマウスのうち２匹において、ＣＤ４５＋細胞、特にＣＤ２＋ Ｔ細胞において持続性であるが穏やかな減少を生じた。単回１０μｇ用量の無関連ｈＩｇＧ１対照は、循環ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ１９＋、又はｈＣＤ２＋細胞のパーセンテージに対して有意な効果を有していなかった。
実施例１５．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体での処置は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍体積を減少させる
選択された抗ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体のＲａｊｉ腫瘍増殖の減少における有効性を評価するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に２ｘ１０6個のＲａｊｉ腫瘍細胞及び８ｘ１０6個のヒトＰＢＭＣの混合物を皮下移植した。ヒトＦｃ（ｈＦｃ）又はＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００７）のいずれかでマウスあたり１μｇの用量で腫瘍移植の日から開始して週に３回マウスを処置した（処置群あたりＮ＝２０マウス）。試薬は腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により送達した。腫瘍サイズをノギスを使用して週あたり３回測定し、そして腫瘍体積を体積＝（長さｘ幅2）／２として計算した。結果を図１に示す。
第二の実験において、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、２ｘ１０6個のＲａｊｉ腫瘍細胞及び４ｘ１０6個のヒトＰＢＭＣの混合物を皮下移植した。ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体（ＢＳ３／２０−００７）又は対照試薬（ｈＦｃ）での処置は、腫瘍が触知可能になるように腫瘍移植の７日後に開始した。マウスを、週に２回マウスあたり１μｇの用量で処置した（処置群あたりＮ＝６マウス）。試薬を腫瘍移植部位から離して皮下注射した。腫瘍サイズを週に２回ノギスを使用して測定し、そして腫瘍体積を体積＝（長さｘ幅2）／２として計算した。結果を図２に示す。
この実施例は、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００７での処置が、腫瘍移植及び一旦腫瘍が樹立された両方の時点で腫瘍増殖の阻害において有効であったことを実証する。マウスにおける腫瘍体積は、両方の研究において対照と比較して移植２５日後に減少した。
実施例１６．ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体は、カニクイザルにおいてＢ細胞数を枯渇させ、モノクローナル抗体に典型的な薬物動態プロフィールを有する
パイロット非ＧＬＰ毒性学及び薬理学研究をカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において行い、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体のこれらの動物においてＢ細胞数を枯渇させる能力を決定した。雄性動物で３つのコホートを編成した。コホート１には二重特異性抗体ＢＳ３／２０−００１を投与し、３つの異なる用量群（０．０１、０．１０及び１．００ｍｇ／ｋｇ）を含み、用量群あたり３〜４匹の動物であった。コホート２は２匹の動物のコホートであり、低用量の抗ＣＤ２０対照抗体（対照Ｖ；０．０１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。コホート３は４匹の動物のコホートであり、高用量の抗ＣＤ２０対照抗体（対照ＩＩＩ；１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。これらの動物におけるＢ細胞及びＴ細胞についてのベースラインレベルを確立するために−７日目及び投薬直前に採血した。０．０１、０．１０、又は１．００ｍｇ／ｋｇでの薬物用量を静脈内（ｉ．ｖ．）注入により投与し、投薬の５分後、５時間後、並びに１、４、７、及び１４日後に採血した。投薬後１４日目の後、研究の終わりまで２週ごとに採血した。血液サンプルをＦＡＣＳによりＢ細胞及びＴ細胞マーカーについて分析し、そしてこれらの細胞型の絶対数を決定した。血清サンプルもまた、標準的な分析方法を使用してサイトカインレベル（ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＴＮＦα）について分析した。結果を図３（Ｂ細胞）、図４（Ｔ細胞）、及び図５Ａ〜５Ｄ（サイトカイン）に示す。
この実施例に示されるように、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体の投与は、測定した最初の時点（１日目）までに循環Ｂ細胞のベースラインレベルまでの枯渇を生じた。この枯渇は、対照動物コホートでは見られなかった。二重特異性コホートにおけるＢ細胞枯渇は、投与の２週後まで維持され、そして０．０１及び０．１０ｍｇ／ｋｇ用量コホートでは、その後、投与後約１１週に実験が終了するまでＢ細胞レベルが徐々に回復した。しかし、１．０ｍｇ／ｋｇコホートにおいて、実験期間の間（１１週）、Ｂ細胞レベルの回復は見られなかった。Ｔ細胞レベルもまたこの実験においてモニタリングした。循環Ｔ細胞の一次的な減少が二重特異性コホートにおいて投薬後１日目に観察された。Ｔ細胞レベルは、これらのコホートにおいて４日目の時点でベースラインレベルに戻り、そして実験の終わりまでそれらのベースラインレベルで維持された。さらに、５時間でのＢＳ３／２０−００１についての血清サイトカインレベルは、Ｔ細胞活性化と一致する用量依存性かつ時間依存性の応答を示した（図５Ａ〜５Ｄを参照のこと）。
末梢血における遺伝子発現レベルもまたこの実験の間に分析した。血液サンプルを、２回の投薬前の（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）時点（投薬７日前及び投薬直前）並びに投薬の５、２４、７２、９６、及び１６８時間後に動物から得た。これらのサンプルからＲＮＡを単離し、マイクロアレイで分析した。投薬前レベル及び対照群からの遺伝子発現レベルと比較した場合、二重特異性抗体で処置された動物におけるＢ細胞マーカーの遺伝子発現の顕著な減少が観察された；この効果は１．０ｍｇ／ｋｇ対照ＩＩＩ（リツキシマブに対応する抗ＣＤ２０抗体）で処置された動物から得られたサンプルにおいて観察された効果に類似していた。Ｂ細胞マーカー発現の観察された変化は、処置された動物の血液において検出されたＢ細胞の減少に対応する。ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体で処置された動物由来のサンプルにおけるＴ細胞マーカー遺伝子の発現は、初期減少を示し、その後、２４時間の時点までに正常レベルへの回復を示した。さらに、炎症応答に関連する遺伝子は、二重特異性コホートの動物において初期上方調節を示したが、２４時間後には正常又は正常を下回るレベルまで戻った。最後に、ＣＤ２０遺伝子発現シグナルの未加工強度の調査は、Ｂ細胞のより大きな枯渇が、対照抗ＣＤ２０抗体よりもＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体での動物の処置から生じるということを示唆する（図６及び表２９を参照のこと）。
Figure 0006923292
表２９に示されるように、投薬の７日後に、ＣＤ２０シグナルの未加工強度はＣＤ３ｘＣＤ２０動物の１つを除く全てにおいてバックグラウンドレベルのままであったが、１ｍｇ／ｋｇの対照ＩＩＩで処置された４匹の動物のうち３匹がわずかな、又は検出可能ないずれかのＣＤ２０シグナルレベルを示した。
同じ実験において、二重特異性抗体の薬物動態プロフィール（図７）を、投薬前並びに０．０８３、５、２４、４８、７２、１６８、３３６、５０４及び８４０時間の時点で血液サンプルを得ることにより評価した。結果として得られた血清サンプルを、直接酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により分析して、総二重特異性抗体の濃度を決定した。血清総二重特異性（ＢＳ３／２０−００１）濃度データを、非コンパートメント解析（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ）により解析して、薬物動態パラメータを決定した。結果を表３０に示す（ＡＵＣ＝曲線下面積 対 時間；Ｃmax＝目的のマトリックス中に
観察された化合物の最大濃度）。
Figure 0006923292
カニクイザルにおける０．０１、０．１０又は１．０ｍｇ／ｋｇのＢＳ３／２０−００１の単回静脈内用量の後、それぞれ０．２６１、２．３２及び３３．４μｇ／ｍＬの平均ピーク濃度（Ｃmax）が、最初のサンプリングの時点（０．０８３時間）に観察された。４．４２、２８９及び４９４０μｇ＊時間／ｍＬの平均ＡＵＣall値が、０．０１、０．１及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。１ｍｇ／ｋｇあたり４４２、２８９０及び４９４０μｇ＊時間／ｍＬの用量正規化ＡＵＣ値（ＡＵＣall／用量）は、血漿曝露（ＡＵＣall）が、用量の増加とともに非線形様式で増加するということを示す。血漿薬物曝露の比例よりも高い増加が、抗体用量の増加に伴って観察され、ＢＳ３／２０−００１が標的媒介クリアランスを受けているかもしれないということを示唆した。ＢＳ３／２０−００１の全体の薬物動態プロフィールは、カニクイザルに投薬されるモノクローナル抗体に典型的なものである。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な改変は、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (11)

  1. 表面プラズモン共鳴アッセイで抗原捕捉形式で２５℃にて測定して、２ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）でヒトＣＤ３に結合する、ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで該抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−２８−３０−３２、３６−３８−４０−４４−４６−４８、５２−５４−５６−６０−６２−６４、６８−７０−７２−７６−７８−８０、８４−８６−８８−９２−９４−９６、１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４、１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０、１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６、１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２、１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８、２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４、２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６、２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２、２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８、２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４、３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０、３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６、３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２、３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８、３８８−３９０−３９２−３９６−３９８−４００、４０４−４０６−４０８−４１２−４１４−４１６、４２０−４２２−４２４−４２８−４３０−４３２、４３６−４３８−４４０−４４４−４４６−４４８、４６８−４７０−４７２−４７６−４７８−４８０、４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６、５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８、５９６−５９８−６００−６０４−６０６−６０８、６１２−６１４−６１６−６２０−６２２−６２４、６２８−６３０−６３２−６３６−６３８−６４０、７２４−７２６−７２８−７３２−７３４−７３６、７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４、７８８−７９０−７９２−７９６−７９８−８００、８０４−８０６−８０８−８１２−８１４−８１６、８５２−８５４−８５６−８６０−８６２−８６４、８８４−８８６−８８８−８９２−８９４−８９６、９００−９０２−９０４−９０８−９１０−９１２、９３２−９３４−９３６−９４０−９４２−９４４、９４８−９５０−９５２−９５６−９５８−９６０、１０４４−１０４６−１０４８−１２３６−１２３８−１
    ２４０、１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０、１０６８−１０７０−１０７２−１２３６−１２３８−１２４０、１０７６−１０７８−１０８０−１２３６−１２３８−１２４０、１１００−１１０２−１１０４−１２３６−１２３８−１２４０、１１０８−１１１０−１１１２−１２３６−１２３８−１２４０、１１１６−１１１８−１１２０−１２３６−１２３８−１２４０、１１２４−１１２６−１１２８−１２３６−１２３８−１２４０、１１４０−１１４２−１１４４−１２３６−１２３８−１２４０、１１４８−１１５０−１１５２−１２３６−１２３８−１２４０、１１６４−１１６６−１１６８−１２３６−１２３８−１２４０、及び１１８０−１１８２−１１８４−１２３６−１２３８−１２４０からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、上記ヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４６６／４７４、４８２／４９０、５１４／５２２、５９４／６０２、６１０／６１８、６２６／６３４、７２２／７３０、７７０／７７８、７８６／７９４、８０２／８１０、８５０／８５８、８８２／８９０、８９８／９０６、９３０／９３８、９４６／９５４、１０４２／１２３４、１０５０／１２３４、１０６６／１２３４、１０７４／１２３４、１０９８／１２３４、１１０６／１２３４、１１１４／１２３４、１１２２／１２３４、１１３８／１２３４、１１４６／１２３４、１１６２／１２３４、及び１１７８／１２３４からなる群より選択される重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列対を含む、請求項１記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  3. 表面プラズモン共鳴アッセイで抗原捕捉形式で２５℃にて測定して、５００ｐＭ未満のＫDでヒトＣＤ３に結合し、配列番号２０−２２−２４−２８−３０−３２、３６−３８−４０−４４−４６−４８、８４−８６−８８−９２−９４−９６、１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４、１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０、１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６、２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４、２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６、２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２、２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８、２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４、３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０、３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２、３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８、４０４−４０６−４０８−４１２−４１４−４１６、４２０−４２２−４２４−４２８−４３０−４３２、４３６−４３８−４４０−４４４−４４６−４４８、４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６、５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８、７２４−７２６−７２８−７３２−７３４−７３６、７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４、７８８−７９０−７９２−７９６−７９８−８００、８５２−８５４−８５６−８６０−８６２−８６４、８８４−８８６−８８８−８９２−８９４−８９６、９００−９０２−９０４−９０８−９１０−９１２、９３２−９３４−９３６−９４０−９４２−９４４、９４８−９５０−９５２−９５６−９５８−９６０、１０４４−１０４６−１０４８−１２３６−１２３８−１２４０、１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０、１０６８−１０７０−１０７２−１２３６−１２３８−１２４０、１０７６−１０７８−１０８０−１２３６−１２３８−１２４０、及び１１００−１１０２−１１０４−１２３６−１２３８−１２４０からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載の
    ヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  4. 表面プラズモン共鳴アッセイで抗原捕捉形式で２５℃にて測定して、１００ｐＭ未満のＫDでヒトＣＤ３に結合し、配列番号１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２、３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８、４２０−４２２−４２４−４２８−４３０−４３２、４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６、５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８、及び７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、請求項３に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  5. 表面プラズモン共鳴アッセイで抗原捕捉形式で２５℃にて測定して、１０分より長い解離半減期（ｔ1／2）でヒトＣＤ３に結合し、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−２８−３０−３２、３６−３８−４０−４４−４６−４８、５２−５４−５６−６０−６２−６４、６８−７０−７２−７６−７８−８０、８４−８６−８８−９２−９４−９６、１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４、１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０、１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６、１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２、１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８、２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４、２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６、２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２、２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８、２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４、３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０、３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６、３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２、３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８、３８８−３９０−３９２−３９６−３９８−４００、４０４−４０６−４０８−４１２−４１４−４１６、４２０−４２２−４２４−４２８−４３０−４３２、４３６−４３８−４４０−４４４−４４６−４４８、４６８−４７０−４７２−４７６−４７８−４８０、４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６、５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８、５９６−５９８−６００−６０４−６０６−６０８、６１２−６１４−６１６−６２０−６２２−６２４、６２８−６３０−６３２−６３６−６３８−６４０、７２４−７２６−７２８−７３２−７３４−７３６、７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４、７８８−７９０−７９２−７９６−７９８−８００、８０４−８０６−８０８−８１２−８１４−８１６、８５２−８５４−８５６−８６０−８６２−８６４、８８４−８８６−８８８−８９２−８９４−８９６、９００−９０２−９０４−９０８−９１０−９１２、９３２−９３４−９３６−９４０−９４２−９４４、９４８−９５０−９５２−９５６−９５８−９６０、１０４４−１０４６−１０４８−１２３６−１２３８−１２４０、１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０、１０６８−１０７０−１０７２−１２３６−１２３８−１２４０、１０７６−１０７８−１０８０−１２３６−１２３８−１２４０、１１００−１１０２−１１０４−１２３６−１２３８−１２４０、１１０８−１１１０−１１１２−１２３６−１２３８−１２４０、１１１６−１１１８−１１２０−１２３６−１２３８−１２４０、１１２４−１１２６−１１２８−１２３６−１２３８−１２４０、１１４０−１１４２−１１４４−１２３６−１２３８−１２４０、１１４８−１１５０−１１５２−１２３６−１２３８−１２４０、１１６４−１１６６−１１６８−１２３６−１２３８−１２４０、及び１１８０−１１８２−１１８４−１２３６−１２３８−１２４０からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  6. 表面プラズモン共鳴アッセイで抗原捕捉形式で２５℃にて測定して、１００分より長いｔ1／2でヒトＣＤ３に結合し、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−２８−３０−３２、５２−５４−５６−６０−６２−６４、８４−８６−８８−９２−９４−９６、１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４、３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２、３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８、４６８−４７０−４７２−４７６−４７８−４８０、４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６、５１６−５１８−５２０−５２４−５２６−５２８、６１２−６１４−６１６−６２０−６２２−６２４、７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４、１０４４−１０４６−１０４８−１２３６−１２３８−１２４０、１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０、１０６８−１０７０−１０７２−１２３６−１２３８−１２４０、及び１１００−１１０２−１１０４−１２３６−１２３８−１２４０からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、請求項５に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  7. インビトロでのヒトＴ細胞増殖及び／又はサルＴ細胞増殖を誘導し、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８、７２４−７２６−７２８−７３２−７３４−７３６、７７２−７７４−７７６−７８０−７８２−７８４、７８８−７９０−７９２−７９６−７９８−８００、８０４−８０６−８０８−８１２−８１４−８１６、１０４４−１０４６−１０４８−１２３６−１２３８−１２４０、１０５２−１０５４−１０５６−１２３６−１２３８−１２４０、１０６８−１０７０−１０７２−１２３６−１２３８−１２４０、１０７６−１０７８−１０８０−１２３６−１２３８−１２４０、１１００−１１０２−１１０４−１２３６−１２３８−１２４０、１１０８−１１１０−１１１２−１２３６−１２３８−１２４０、１１１６−１１１８−１１２０−１２３６−１２３８−１２４０、１１２４−１１２６−１１２８−１２３６−１２３８−１２４０、１１４０−１１４２−１１４４−１２３６−１２３８−１２４０、１１４８−１１５０−１１５２−１２３６−１２３８−１２４０、１１６４−１１６６−１１６８−１２３６−１２３８−１２４０、及び１１８０−１１８２−１１８４−１２３６−１２３８−１２４０からなる群よりそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３の６つの相補性決定領域を含む、請求項１に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  8. 配列番号２／１０、１１４／１２２、７２２／７３０、７７０／７７８、７８６／７９４、８０２／８１０、１０４２／１２３４、１０５０／１２３４、１０６６／１２３４、１０７４／１２３４、１０９８／１２３４、１１０６／１２３４、１１１４／１２３４、１１２２／１２３４、１１３８／１２３４、１１４６／１２３４、１１６２／１２３４、及び１１７８／１２３４からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項７に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト抗体又は抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
  10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト抗体を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. それを必要とする被験体において腫瘍を処置するための医薬の製造における、請求項９又は１０に記載の医薬組成物の使用。
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