RU2738802C1 - Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула - Google Patents
Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула Download PDFInfo
- Publication number
- RU2738802C1 RU2738802C1 RU2019126380A RU2019126380A RU2738802C1 RU 2738802 C1 RU2738802 C1 RU 2738802C1 RU 2019126380 A RU2019126380 A RU 2019126380A RU 2019126380 A RU2019126380 A RU 2019126380A RU 2738802 C1 RU2738802 C1 RU 2738802C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- binding
- antigen
- seq
- cell
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 14
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 162
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 26
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 101100383038 Homo sapiens CD19 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006035 T cell-directed cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006296 mab medium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000036170 B-Cell Marginal Zone Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032568 B-cell prolymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 101710117995 B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 208000023611 Burkitt leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 206010061850 Extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT type) Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003791 MALT lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 206010036711 Primary mediastinal large B-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000035416 Prolymphocytic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 201000011649 lymphoblastic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000007919 lymphoplasmacytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 210000004214 philadelphia chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N probenecid Chemical compound CCCN(CCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003081 probenecid Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложена антигенсвязывающая молекула, способная связывать рецепторный комплекс CD3, содержащая вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, охарактеризованные аминокислотными последовательностями определяющих комплементарность участков (CDR). Кроме того, рассмотрено применение биспецифической антигенсвязывающей молекулы, способной связывать CD3 и CD19, для создания лекарственного средства для лечения злокачественных заболеваний В-клеточной природы или истощения В-клеток, в частности для лечения гематологических злокачественных заболеваний В-клеточной природы, таких как острый лимфобластный лейкоз и В-клеточные лимфомы, включая их рефрактерные или рецидивирующие формы. Благодаря способности связывать CD3 и активировать Т-клетки антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может быть использована при конструировании различных биспецифических терапевтических антител. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии, а также к созданию новых эффективных высокомолекулярных соединений, обладающих терапевтическими свойствами. Предложены варианты аминокислотных последовательностей определяющих комплементарность участков (CDR) антигенсвязывающих фрагментов белковой молекулы, специфичной к человеческому клеточному рецептору CD3. Указанные последовательности CDR, обеспечивающие связывание данных фрагментов с антигеном CD3, получили с помощью технологии фагового дисплея. Предложенные CDR могут быть использованы при конструировании различных антигенсвязывающих молекул, одной из неотъемлемых функций которых является специфическое взаимодействие с CD3-несущими клетками. При включении указанных CDR в состав антителоподобной молекулы, исходно связывающейся с рецептором CD 19, были также сконструированы биспецифические молекулы, которые специфично связываются с человеческими клеточными рецепторами CD3 и CD19. В одном из воплощений биспецифические молекулы состоят из двух полипептидных цепей, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи, специфичный к антигену CD3(VLCD3), вариабельный домен тяжелой цепи, специфичный к антигену CD19 (VHCD19), вариабельный домен легкой цепи, специфичный к антигену CD19 (VL CD19) и вариабельный домен тяжелой цепи, специфичный к антигену CD3 (VH CD3). Домены расположены в следующем порядке VL CD3 - VH CD19 - VL CD19 - VH CD3. Такое расположение вариабельных доменов в антиген-связывающей молекуле от N-конца к С-концу полипептида обеспечивает возможность одновременного связывания молекулы с двумя различными антигенами, что и определяет ее терапевтическую эффективность за счет селективного связывания с экстраклеточной частью человеческих рецепторов CD3 и CD19, экспрессируемых Т- и В-клетками, соответственно. При одновременном взаимодействии молекулы по изобретению с экстраклеточной частью рецепторов CD3 и CD19 происходит контакт Т- и В-клеток, что приводит к активации Т-клеток, образованию цитолитического синапса и высвобождению протеолитических ферментов, разрушающих CD19-позитивные клетки-мишени. Предложенная структура расположения антигенсвязывающих участков биспецифической молекулы позволяет сформировать молекулу, эффективно связывающую экстраклеточную частью рецепторов CD3 и CD19, экспрессируемых различными видами клеток. Подобная молекула активирует Т-клетки в ответ на взаимодействие с клетками-мишенями, экспрессирующими опухолевый антиген (CD19), что приводит к цитолизу последних. Группа изобретений позволяет на основе комбинации CDR, содержащейся в любом из предложенных четырнадцати антигенсвязывающих фрагментов, получить рекомбинантное моноклональное биспецифическое терапевтическое антитело, пригодное для создания лекарственного средства для лечения опухолевых заболеваний, в частности гематологических злокачественных заболеваний B-клеточной природы.
Сокращения и термины:
МКПК - Мононуклеарные клетки периферической крови
TDCC - Т-клеточно-зависимая цитотоксическая активность
БСАТ - биспецифическое антитело
MFI - mean fluorescence intensity, усредненная интенсивность флуоресценции
V - вариабельный домен
VL - вариабельный домен легкой цепи
VH - вариабельный домен тяжелой цепи
CDR - определяющий комплементарность участок
Fc-фрагмент - кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc, fragment crystallizable region, Fc region).
Антитело - молекула иммуноглобулина, для которого существует антиген.
Аффинность - термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия антигена и антитела; определяется по закону действующих масс как отношение концентрации комплекса антиген - антитело к произведению концентраций компонентов.
Авидность - характеристика общей стабильности комплекса антигена и антитела; определяется аффинностью антитела к антигену, количеством антигенсвязывающих центров в молекуле антитела и особенностями пространственной структуры антигена, создающими стерические препятствия для создания комплекса. В отличие от аффинности, которая является термодинамическим параметром, количественно описывающим силу единственного взаимодействия антигена и антитела, авидность описывает силу кооперативных аффинных взаимодействий.
Антигенсвязывающий участок антитела - часть антитела, распознающая эпитоп. Имеет несколько названий: активный или антигенсвязывающий центр антител, антидетерминанта или паратоп.
Биспецифические антитела - молекулы иммуноглобулина, которые объединяют антиген-связывающие участки для двух различных антигенов в одной молекуле. Биспецифическое антитело в состоянии связывать два антигена одновременно.
Злокачественные заболевания В-клеточной природы означают в настоящем изобретении:
- В-клеточные опухоли из клеток предшественников В-лимФоцитов
В-лимфобластная лимфома/лейкоз из клеток-предшественников (В-клеточный острый лимфобластный лейкоз из клеток-предшественников)
- В-клеточные опухоли с фенотипом зрелых лимфоцитов
1. Хронический лимфоцитарный лейкоз / лимфоцитарная лимфома
2. В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз
3. Лимфоплазмоцитарная лимфома
4. Селезеночная лимфома маргинальной зоны
5. Волосатоклеточный лейкоз
6. Миелома или плазмоцитома (солитарная и внекостная)
7. Экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT-лимфома)
8. Нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны (с или без моноцитоидными В-клетками)
9. Фолликулярная лимфома
10. Лимфома из клеток зоны мантии
11. Диффузная В-крупноклеточная лимфома
12. Медиастинальная В-крупноклеточная лимфома
13. Первичная лимфома серозных полостей
14. Лимфома/Лейкоз Беркитта
Истощение В-клеток - снижение числа клеток, экспрессирующих определенный антиген.
Комплементарность антитела - способность антитела к специфическому взаимодействию с антигеном. За редким исключением, антитело взаимодействуют только с тем антигеном, который индуцировал их образование и подходит к ним по пространственной структуре.
Определяющий комплементарность участок - гипервариабельный участок вариабельной цепи, образующий антигенсвязывающий центр молекулы антитела.
Опухолевые антигены - антигены, продуцируемые раковыми клетками и способные вызвать иммунный ответ организма. Являются результатом проявления измененного генома раковой клетки.
Острый лимфобластный лейкоз - злокачественное заболевание системы кроветворения, характеризующееся неконтролируемой пролиферацией незрелых лимфоидных клеток (лимфобластов).
В-клеточная лимфома - разновидность неходжкинских новообразований. Заболевание возникает на фоне бесконтрольного деления В-лимфоцитов, принимающих клетки и ткани организма за чужеродные.
Специфичность - способность антитела проявлять различную аффинность по отношению к различным антигенам.
Эпитоп, или антигенная детерминанта - часть макромолекулы антигена, небольшой участок молекулы антигена, который взаимодействует со специфичным к нему антителом. Этот участок распознается клетками или молекулами иммунной системы (антителами, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами).
CD3 (англ. Cluster of Differentiation 3) - мультипротеиновый комплекс на поверхности Т-лимфоцитов, у млекопитающих образован 4 субъеденицами: CD3γ, CD3δ и двумя CD3ε.
CD19, или В-лимфоцитарный антиген CD19 - белок, расположенный на поверхности В-лимфоцитов.
Все термины и сокращения, используемые в настоящей заявке, употребляются в том же значении, как это принято в данной области техники, и понятны специалистам. Приведенные выше определения даны для устранения каких-либо разночтений.
Описание чертежей.
Фиг. 1. Эффективность связывания препарата БСАТ с человеческими CD19-позитивными клеточными линиями. А) клеточная линия Namalwa (АТСС® CRL-1432™); Б) клеточная линия Daudi (АТСС® CCL-213™); В) клеточная линия NALM6 (АТСС® CRL-3273™); Г) клеточная линия Ramos (АТСС® CRL-1596™); Д) клеточная линия Toledo (АТСС® CRL-2631™); Е) клеточная линия Raji (АТСС® CCL-86™).
Фиг. 2. Эффективность связывания препарата БСАТ с CD3-позитивными клеточными линиями. А) клеточная линия HUT78 (АТСС® TIB-161™); Б) клеточная линия CCRF-CEM (АТСС® CCL-119™); В) клеточная линия Jurkat (АТСС® TIB-152™).
Фиг. 3. Взаимодействие CD19-позитивных РВМС условно здоровых доноров с конъюгированным с FITC антителом к экстраклеточной части человеческого рецептора CD 19 (клон HD37) (Millipore milli-mark, кат. № FCMAB184F) в присутствии препарата БСАТ в разных концентрациях.
Фиг. 4. Взаимодействие БСАТ с CD3-позитивными РВМС условно здоровых доноров.
Фиг. 5. Эффективность цитолиза CD19-позитивных клеток человеческой линии Raji препаратом БСАТ при использовании в качестве эффекторных клеток активированных МКПК условно здоровых доноров.
Фиг. 6. Способность БСАТ одновременно связывать CD3 и CD19 при использовании клеток человеческой линии Raji и эффекторных клеток коммерческой репортерной линии Jurkat-LUCIA-NFAT (Promega).
Фиг. 7. Оценка активности и специфичности биспецифических IgG-подобных молекул в ходе анализа активации клеток линии Jurkat. IgG-подобные молекулы титровали и оценивали их способность активировать транскрипцию NFAT в репортерных клетках линии Jurkat. Синими линиями обозначена активация эффекторных клеток (модифицированных путем генной инженерии клеток линии Jurkat) в присутствии клеток-мишеней (клеток линии Raji), красными линиями обозначена активация эффекторных клеток в отсутствие клеток-мишеней. Нумерация клонов справа налево и сверху вниз: 309_ 01_А02; 309_01_G04; 309_01_G12; 309_02_А08; 309_02_F01; 309_04_А04; 309_05_В08; контроль 1; контроль 2; 400_01_D06; 400_03_Н07; 410_01_С03; 410_01_С09; 418_01_С05; 418_03_Е12; 418_03_Н01; отрицательный контроль.
Фиг. 8. Анализ связывания IgG-подобных антител к CD3 с клетками линии Jurkat методом проточной цитометрии. По оси у представлена средняя интенсивность флуоресценции, по оси х - логарифм концентрации биспецифической IgG-подобной молекулы. Данные, полученные в независимых экспериментах, представлены отдельно (верхняя и нижняя панели). Обозначения: MFI (FU)- Средняя интенсивность флуоресценции (единицы флуоресценции). IBC Generium BiM - биспецифическая IgG-подобная молекула, положительный контроль и BiM - биспецифическая IgG-подобная молекула, отрицательный контроль
Фиг. 9. Сравнительная способность биспецифического антитела по изобретению 309-02-F08 и терапевтического антитела BIMSA2 одновременно связывать CD3 и CD19 с использованием клеток человеческой линии Raji и эффекторных клеток коммерческой репортерной линии Jurkat-LUCIA-NFAT (Promega).
Фиг. 10, А-Е. Эффективность цитолиза CD19-позитивных клеток человеческой линии Raji препаратами различных вариантов БСАТ при использовании в качестве эффекторных клеток активированных МКПК условно здоровых доноров. А: клон 309_01_G04, Б: клон 309_01_А02, В: клон 309_02_F01, Г: клон 309_01_G12, Д: клон 309_02_А08, Е: клон 309_05_В08.
Фиг. 11. Схема возможного фолдинга БСАТ.
Антитела, или иммуноглобулины (Ig), - это растворимые гликопротеины крови и тканевой жидкости. Классические антитела представляют собой мультимерные белки, объединяющие две идентичные тяжелые (Н) цепи и две идентичные легкие (L) цепи. Н-цепи, в свою очередь, состоят из вариабельного домена (VH) и трех константных (СН1, СН2, СН3) доменов, а также шарнирного участка между СН1 и СН2 доменами. L-цепи состоят из вариабельного, VL, и константного, CL, доменов. Четыре цепи объединяются в молекулу посредством нековалентных и ковалентных (дисульфидных) связей. Комбинация антигенсвязывающих участков (CDR-Complementarity Determining Regions) вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи формирует участок связывания антигена, в то время как каркасные регионы вариабельных доменов (FR - Framework Regions) и константные домены антител непосредственно не участвуют в распознавании антигена. Вариабельные области, хотя и находятся на большом отдалении друг от друга в первичной структуре легкой цепи, при образовании трехмерной структуры оказываются расположенными в непосредственной близости друг к другу. В пространственной структуре вариабельных доменов гипервариабельные последовательности расположены в зоне изгибов полипептидной цепи, направленной навстречу соответствующим участкам V-домена другой цепи (т.е. CDR легкой и тяжелой цепей направлены навстречу друг другу). В результате взаимодействия вариабельного домена Н- и L-цепей формируется антигенсвязывающий участок (активный центр) иммуноглобулина. Пространственная структура этой полости, обусловленная строением гипервариабельных участков, определяет способность антител распознавать и связывать конкретные молекулы на основе пространственного соответствия (специфичность антител). Гипервариабельные участки V-доменов входят в состав активного центра не полностью - поверхность антигенсвязывающего участка захватывает только около 30% CDR. Специфически взаимодействуют с эпитопами антигена отдельные аминокислотные остатки в CDRh.
Минимизированной производной антигенсвязывающего фрагмента классических антител является одноцепочечная конструкция, в которой вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены линкерной последовательностью (scFv). Участок связывания антигена имеет разную пространственную конфигурацию для каждой антигенной специфичности антитела. Когда антиген вступает в контакт с антителом, многочисленные простетические группы антигена как зеркальное изображение соответствуют таким же группам антитела, благодаря чему между антителом и антигеном осуществляется быстрое и плотное связывание. Если антитело высокоспецифично, сцепление между антителом и антигеном может происходить посредством сразу нескольких форм взаимодействия: гидрофобных связей; водородных связей; ионного притягивания; Ван-дер-Ваальсовых сил. Антитело, имеющее два вариабельных участка для прикрепления антигена, называют бивалентным. Биспецифическое антитело в состоянии связывать два различных антигена одновременно. В зависимости от практической задачи исследователи могут изменять размер антител, их специфичность, аффинность, валентность, уменьшать иммуногенность, оптимизировать фармакокинетические свойства и эффекторные функции. В дополнение к этому, антитела получают в виде рекомбинантных составных белков, включающих антитела другой специфичности, цитокины, белковые токсины и радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные белки (см. Деев С.М., and Лебеденко Е.Н. "Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения" Acta Naturae (русскоязычная версия), vol. 1, no. 1, 2009, pp. 32-50). Каждое антитело обладает уникальной специфичностью и высоким сродством, или аффинностью (KD 10-8-10-11 М) к своему антигену, которое обеспечивается комплементарностью антигенсвязывающего участка антитела определенному участку молекулы антигена (эпитопу). Различные антитела способны одновременно связывать один, два и более антигенов. Аффинность антител, применяемых для терапии в настоящее время, лежит в пределах наномолярных концентраций (от 10-8 до 10-10 М), которые являются оптимальными для большинства задач. Размер молекул терапевтического антитела является важным фактором, определяющим возможность их вывода через почки и, соответственно, быстроту выведения из организма. Время полувыведения белков через почки коррелирует с размером молекулы. Оптимальным поверхностным зарядом для терапевтических антител является интервал их изоэлектрических точек от 5 до 9. Увеличение как положительного, так и отрицательного заряда ухудшает связывание антитела с клетками-мишенями.
Свойства предложенных по изобретению 14 функциональных антител, способных к связыванию рецепторного комплекса CD3 на поверхности экспрессирующих его клеток, даны в таблице 1. Антитело «ОКТ3» включено в качестве стандартного контроля. Антитела содержат одну из комбинаций CDR, предложенных по изобретению, а также антигенсвязывающий фрагмент для рецептора CD19. В таблице представлена информация о характеризующих антитело последовательностях CDR3 легкой и тяжелой цепи, активности по данным анализа взаимодействия с клетками и индикаторе пригодности к промышленному производству, такому как продуктивность экспрессии. Последовательности всех антител характеризуются уникальными комбинациями последовательностей CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи и способностью активировать клетки линии Jurkat (с репортерным геном, регулируемым ядерным фактором активированных Т-клеток (NFAT)) в ответ на взаимодействие с клетками-мишенями, экспрессирующими CD19. В отсутствие клеток-мишеней неспецифическая активация клеток линии Jurkat была низкой или не обнаруживалась (при концентрациях биспецифических JgG-подобных молекул ≥ 1 нМ). Данные об активности в отношении активации клеток линии Jurkat приведены в таблице 1. Связывание с нативным CD3 на поверхности клеток линии Jurkat измеряли путем проточной цитометрии.
При одновременном взаимодействии биспецифической молекулы с экстраклеточной частью рецепторов CD3 и CD19 происходит контакт Т- и В-клеток, что приводит к активации Т-клеток, образованию цитолитического синапса и высвобождению протеолитических ферментов, разрушающих CD19-позитивные клетки-мишени. CD3-CD19 - направленные биспецифические антитела в настоящее время разрабатываются преимущественно для терапии злокачественных В-клеточных заболеваний или для истощения В-клеток, например, для терапии неходжкинской лимфомы, острого лимфобластного лейкоза и др. Биспецифические антитела (БСАТ) выполняют функцию адаптеров, которые физически соединяют Т-клетки с опухолевыми CD 19-позитивными клетками-мишенями и запускают их цитолиз. CD3 является пан-Т-клеточным рецептором, то есть он представлен на всех Т-лимфоцитах, поэтому при применении биспецифического антитела к опухолевым клеткам будут привлекаться различные субпопуляции Т-клеток. Рецептор CD19 устойчиво и равномерно экспрессируется только клетками В-лимфоцитарного ряда (в том числе и опухолевыми). CD19 практически нигде, кроме В-клеток, более не синтезируется и, соответственно, получаемая терапия специфична. БСАТ соединяет Т-клетку и раковую клетку за счет одновременного связывания с CD3 и с антигеном-мишенью. В этом случае происходит активация и пролиферация Т-клеток, образование цитолитического синапса с высвобождением цитотоксических гранул и секреция цитокинов. Направленный лизис раковых клеток включает в себя перфорацию мембраны клетки-мишени с участием перфорина и последующий апоптоз, индуцированный гранзимами. Связывание БСАТ только с Т-клеткой в отсутствие клетки-мишени не вызывает Т-клеточную активацию.
Примеры биспецифических антител, известных из уровня техники (Blood, (ASH Annual Meeting Abstracts), 2009, 114:840), свидетельствуют о том, что эффективная терапевтическая концентрация препаратов, полученных на основе использования мультивалентных антител, существенно ниже по сравнению с классическими антительными противораковыми препаратами. Это способствует хорошей переносимости, возможности осуществления длительных курсов лечения и уменьшению риска побочных эффектов.
В настоящее время известны различные полипептиды, специфичные в отношении CD19 и CD3, и их применение в качестве компонента лекарственного средства для истощения В-клеток и лечения В-клеточных заболеваний. Изобретение, раскрытое в RU 2228202, раскрывает одноцепочечный многофункциональный полипептид, специфичный в отношении С19 и CD3 антигенов формулы: VLCD19 - VHCD19 - VHCD3 - VLCDS, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, экспрессирующий вектор, штамм культуры клеток, способ получения полипептида, фармацевтическую композицию для лечения злокачественных заболеваний В-клеток, диагностическую композицию, способ выявления активаторов или ингибиторов Т-клеточной активации или стимуляции, способ приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения злокачественных заболеваний В-клеток, способ лечения злокачественных заболеваний В-клеток или истощения В-клеток и способ замедления развития патологического состояния. Из патента RU 2651776 известно рекомбинантное моноклональное биспецифическое антитело, включающее две соединенных дисульфидными связями цепи, каждая из которых состоит из следующих доменов: VL(CD3)-L1-VH(CD19)-L2-VL(CD19)-L3-VH(CD3)-H-CH2-CH3(IgG2), где VL (CD3) и VH(CD3). Антитело может быть использовано для лечения гематологических злокачественных заболеваний В-клеточной природы.
Известна также димерная антиген-связывающая молекула тандемного диатела для одновременного связывания с двумя различными антигенами, раскрытая в документе RU 2613368. Молекула состоит из двух идентичных полипептидных цепей.
В заявленном изобретении каждую полипептидную цепь биспецифической молекулы составляют первый домен VL CD3, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к CD3; второй домен VH CD19, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к CD19; третий домен VL CD19, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к CD19; и четвертый домен VH CD3, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к CD3. Указанные домены расположены в каждой из полипептидных цепей в следующем порядке: VLCD3-VHCD19-VLCD19-VHCD3 от N-конца к С-концу. Первый домен VLCD3 связан со вторым доменом VHCD19 посредством первого линкера L1, второй домен VHCD19 связан с третьим доменом VLCD19 посредством второго линкера L2, и третий домен VLCD19 связан с четвертым доменом VHCD3 посредством третьего линкера L3. Линкер L2 состоит из 15 или менее аминокислотных остатков. При формировании биспецифической молекулы первый домен VLCD3 первой полипептидной цепи оказывается связан с четвертым доменом VHCD3 первой полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для CD3; второй домен VHCD19 первой полипептидной цепи связан с третьим доменом VLCD19 первой полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для CD19 (Фиг. 11). На схеме для наглядности CD3-связывающий домен обозначен символом A, CD19-связывающий домен обозначен символом В. Добавление Fc-области к молекуле продлевает время ее пребывания в кровотоке за счет связывания с неонатальным рецептором FcRn, увеличивая, таким образом, период полувыведения лекарственного препарата (Hmila I., et al.. Mol. Immunol. England, 2008, Vol. 45, no. 14, pp. 3847-3856). Образование полной молекулы из двух цепей происходит в результате классического процесса фолдинга антител. В процессе формирования третичной структуры антитела между константными регионами тяжелых цепей образуются дисульфидные связи. Одна цепь является полностью функциональной. Димер является более стабильным по сравнению с мономером, и большая молекулярная масса позволяет ему дольше циркулировать в крови.
Термин "линкер", используемый в соответствии с настоящим изобретением, относится к пептидным линкерам. Длина и/или последовательность линкера влияет на стабильность и/или растворимость биспецифической молекулы. Линкер может повысить гибкость полученной связывающей молекулы и/или может улучшить связывание ее с антигеном-мишенью путем уменьшения стерических помех. Длина и последовательность линкера зависит от последовательности и длины связываемых последовательностей. Специалисту хорошо известны способы тестирования пригодности различных линкеров. Например, свойства связывающей молекулы можно легко протестировать путем анализа ее аффинности связывания при использовании различных типов линкеров. Стабильность полученной молекулы можно измерить способами, известными в данной области техники, такими как, например, высокоэффективная жидкостная храматография, разделяющая исследуемый белковый материал на фракции, в зависимости от молекулярной массы белка и гидродинамических характеристик.
Особенно предпочтительными являются линкеры, которые представляют собой пептиды, состоящие по меньшей мере на 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% из небольших аминокислот, таких как глицин, серии и аланин. Особенно предпочтительными являются линкеры, состоящие только из молекул глицина и серина. Предпочтительно линкерные последовательности по изобретению состоят из 5-15 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы линкеры LI, L2, L3 антитела против CD3*CD19 по изобретению были выбраны из следующих последовательностей:
LI : (XXS)k, где k=2-3, L2: (XXS)n, где n=4-5, L3: (XXS)m, где m=2-3, X=G.
В одном из воплощений в антителе по изобретению LI, L2, L3 могут быть представлены последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19.
В одном из воплощений посредством короткого шарнирного участка каждая из указанных цепей присоединена к Fc-последовательности IgG2 человека. Биспецифическая молекула в отсутствие FC фрагмента и шарнирной области также связывается с CD3 и CD19 антигенами, вследствие малой молекулярной массы не взаимодействует с Fc-рецепторами и поэтому быстро выводится из кровотока.
Шарнирная область представляет собой последовательность, которая в природном иммуноглобулине связывает СН1 -домен с областью СН2-СН3 Fc-фрагмента. Шарнирная область, используемая в антителе по изобретению предпочтительно гомологична природной области иммуноглобулина и обычно включает цистеиновые остатки, связывающие две тяжелые цепи посредством дисульфидных связей, как в природных иммуноглобулинах. Типичные последовательности шарнирных областей иммуноглобулинов человека и мыши можно найти в ANTIBODY ENGINEERING, а PRACTICAL GUIDE, (Borrebaeck, ed., W.H. Freeman and Co., 1992). Подходящие шарнирные области по настоящему изобретению могут происходить от IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и других изотипов иммуноглобулинов. В представленном воплощении в конструкции антитела по изобретению использована шарнирная область IgG1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15.
Fc фрагмент представляет собой концевую часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей иммуноглобулины подразделяют на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. В соответствии с константными областями тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов называют [альфа], [дельта], [эпсилон], [гамма] и [мю], соответственно. Четыре изотипа человеческого IgG связывают различные рецепторы, такие как неонатальный Fc-рецептор, активирующие Fc-рецепторы гамма, FcgRI, FcgRJIa и FcgRIIIa, ингибирующий рецептор FcgRIIb и Clq с различной аффинностью, получая разные виды активности. Однако термин "Fc-последовательность" в рамках настоящего изобретения относится, в том числе, к Fc-последовательностям, модифицированным для изменения сродства к соответствующему рецептору. Антитело по настоящему изобретению содержит Fc-часть, чтобы продлить период полураспада. Такая Fc-последовательность имеет предпочтительно человеческое происхождение, более предпочтительно, представляет собой человеческую Fc- последовательность антитела IgG, более предпочтительно IgG2. В одном из предпочтительных воплощений последовательность соответствует SEQ ID NO: 16. При этом выбор Fc-последовательности типа IgG2 позволяет обеспечить снижение эффекторной нагрузки, обусловленной Fc-последовательностью и снизить таким образом направленную токсичность антитела по изобретению.
Таким образом, молекула, включающая предложенные по изобретению новые антиген-связывающие участки CD3 антигена, конструируется на основе единого каркаса, где вариабельные домены легкой и тяжелой цепей для связывания CD3 и CD19 антигенов соединены тремя линкерными участками в определенном порядке. Дополнительные функциональные свойства молекуле добавляет присоединение к ней Fc фрагмента посредством шарнирной области.
На основании предложенных CD3-антигенсвязывающих фрагментов авторы изобретения получили набор антител, имеющих различные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепи для связывания CD3, соединенных в биспецифическую молекулу согласно указанной выше единой схеме. Был получен ряд антителоподобных молекул, полные последовательности которых приведены в списке последовательностей, №№1-14. Последовательности CDR для связывания CD19 воссозданы на основании известного антитела HD37, являются общими для всех биспецифических антител и представляют собой для тяжелой цепи:
CDRH1: GYAFSSY
CDRH2: WIGQIWPGDGDTNYNGKFKG
CDRH3: RETTTVGRYYYAMDY
Для легкой цепи:
CDRL1: KASQSVDYDGDSYLN
CDRL2: DASNLVS
CDRL3: QQSTEDPWT
Последовательности CDR, обеспечивающие связывание молекулы с антигенами CD3, для каждого из антител приведены в таблице 2.
Активность и специфичность полученных антител подтверждена рядом примеров.
Функционально активные биспецифические IgG-подобные молекулы были подвергнуты скринингу на предмет связывания с эндогенным белком CD3, присутствующим на поверхности клеток линии Jurkat в составе Т-клеточного рецепторного комплекса. Сначала связывание с клетками линии Jurkat оценивали путем проточной цитометрии для одной концентрации биспецифических IgG-подобных молекул 100 нМ; все 14 биспецифических IgG-подобных молекул демонстрировали связывание с клетками. Для дальнейшего определения профиля связывания с клетками каждого клона биспецифические IgG-подобные молекулы-кандидаты титровали и оценивали зависимое от концентрации связывание с клетками линии Jurkat (результаты представлены на Фиг. 8). Эти эксперименты были проведены отдельно для двух независимых серий клонов антител к CD3. Для сравнения приведены данные для применявшихся в качестве положительных контролей двух биспецифических IgG-подобных молекул, содержащих ОКТ3 в роли связывающегося с CD3 фрагмента и HD37, связывающегося с CD19. В качестве негативного контроля использовали BiM8_D1.3, в котором одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела к CD3 замещен на одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела к лизоциму (D1.3). Все антитела к CD3 оказались способными связываться с нативным CD3 на поверхности клеток, хотя максимальные сигналы и активность существенно варьировались между клонами. Как и ожидалось, контрольный BiM_D1.3 не связывался с клетками ни в одной из исследованных концентраций.
Фиг. 9. демонстрирует сравнительную способность биспецифического антитела по изобретению и терапевтического антитела по патенту RU2651776 одновременно связывать CD3 и CD19 с использованием клеток человеческой линии Raji и эффекторных репортерных клеток.
Весь набор антител, имеющих заявленную структуру, был протестирован на цитолитическую активность в отношении CD19-позитивных клеток-мишеней в репортерном TDCC-тесте. Эффективность цитолиза CD19-позитивных клеток человеческой линии Raji препаратами различных вариантов предложенных БСАТ при использовании в качестве эффекторных клеток активированных МКПК условно здоровых доноров продемонстрирована на Фиг. 10.
Была подтверждена способность биспецифических антител вызывать активацию и пролиферацию CD3-позитивных клеток в ответ на контакт с CD19-позитивными клетками-мишенями и вызывать выброс провоспалительных цитокинов Т клетками.
Таким образом, приведенные данные показывают, что молекулы, созданные с использованием предложенных вариантов CDR, могут быть с высокой эффективностью продуцированы в культуре клеток, обладают функциональными свойствами, не уступающими известным биспецифическим CD3-CD19 направленным молекулам и, следовательно, могут быть использованы при разработке лекарственных препаратов, применяемых при лечении В-клеточных заболеваний.
Препарат на основе биспецифической молекулы, связывание которых с антигеном CD3 обеспечивается включением в состав указанной молекулы вариантов легкой и тяжелой цепи, содержащих CDR, перечисленные в таблице 2, может быть применен для терапии пре-В-клеточного отрицательного по филадельфийской хромосоме рецидивирующего или рефрактерного острого лимфобластного лейкоза. Механизм действия обеспечивается связыванием БСАТ с CD19-рецептором на поверхности В-лимфоцитов и с CD3-рецептором на поверхности эффекторных Т-лимфоцитов и инициирует активацию Т клеток, которая приводит к лизису CD19-позитивных В-клеток.
Для указанных антител была определена специфичность и эффективность взаимодействия с CD3- и CD19-позитивными человеческими клеточными линиями с использованием проточной цитометрии. Предложенные молекулы специфично связываются с CD3-позитивными клеточными линиями (Jurkat, HUT-78, CCRF-CEM) и CD19-позитивными клеточными линиями (Raji, NALM6, Daudi, Namalwa, Ramos и др.). Эксперименты in vitro доказывают, что молекулы по настоящему изобретению могут демонстрировать в 7 раз более высокую цитотоксическую активностью в сравнении с молекулами, обладающими альтернативной доменной структурой.
Подтверждением физиологической активности предложенной молекулы послужили следующие эксперименты: была определена концентрация препарата, при которой 50% CD3- и CD19- рецепторов находятся в комплексе с биспецифической молекулой с использованием МКПК условно здоровых доноров; определена Т-клеточно-опосредованная цитолитическая активность препарата в отношении CD19-позитивных клеток-мишеней опухолевых линий человека при использовании в качестве эффекторных клеток активированных МКПК условно здоровых доноров. Способность одновременно связывать CD3 и CD19 подтверждена с помощью клеток линии Raji и клеток коммерческой репортерной линии Jurkat-LUCIA-NFAT (Promega).
Примеры 1-4 показывают, что антитело по изобретению имеет высокое сродство к таргетным CD3- и CD19-позитивным человеческим клеточным линиям в субнаномолярном диапазоне. Концентрация, при которой выявляли 50% свободных CD3-рецепторов при инкубации с РВМС условно здоровых доноров, варьировала от 52,1 до 66,5 nM. Концентрация, при которой выявляли 50% свободных CD19-рецепторов, варьировала от 0,02 до 0,06 nM в зависимости от донора. Препарат БСАТ проявлял Т-опосредованную цитолитическую активность в отношении CD19-позитивных клеток-мишеней человеческой линии Raji при использовании в качестве эффекторных клеток МКПК условно здоровых доноров. ЕС50 варьировала от 1,3 рМ до 3,1 рМ, а процент максимального лизиса клеток-мишеней - от 41 до 100, в зависимости от донора. В репортерном тесте ЕС50 составила 2,3 рМ. Оба метода подтверждают одновременное связывание препарата 309_02_А08 по изобретению с CD3- и CD19- позитивными клетками.
Все молекулы по настоящему изобретению могут быть получены с использованием рутинных методов, применяемых в настоящее время для получения терапевтических белковых молекул с известной первичной структурой. Ген, кодирующий полипептидную цепь, имеющую любую из предложенных аминокислотных последовательностей, получают путем отжига перекрывающихся химически синтезированных олигонуклеотидов и затем клонируют в экспрессионный вектор рМТ1638. Полученный вектор рМТ1638 верифицируется рестрикционным картированием и секвенированием. После этого проводят трансфекцию с последующей селекцией по резистентности к пуромицину с использованием стандартных методов. Трансфекцию проводят с использованием коммерчески доступного штамма СНО-K1, адаптированного к суспензионному росту. Выбор линии клеток-продуцентов обусловлен необходимостью формирования оптимального профиля гликозилирования при синтезе человеческих белков, а также их стабильностью, безопасностью и возможностью применения суспензионных условий культивирования данной линии клеток, что является важнейшими параметрами для производства терапевтических антител. Культивирование продуцента проводится в режиме fed-batch с использованием питательной среды BalanCD СНО Growth A (Irvine Scientific) и нутриентной добавки BalanCD® СНО Feed 4 (Irvine Scientific) в течение 11 суток при температуре 37°С (1-6 сутки), 32°С (7-11 сутки) и 5% CO2 в газовой фазе инкубатора. После культивирования культуральная жидкость осветляется центрифугированием.
Для выделения и очистки целевого продукта из культуральной жидкости могут быть применены различные известные методы очистки антител. Может быть использована, например, схема, включающая аффинную стадию с использованием сорбента на основе протеина А и катионообменную хроматографию на сорбенте высокого разрешения, обеспечивающую эффективное разделение целевой формы белка и его олигомерных форм.
Пример 1. Определение специфичности и эффективности взаимодействия молекулы БСАТ с CD3- и CD19-позитивными клетками человека.
Клеточные суспензии CD19-позитивных клеточных линий (NALM6 (АТСС® CRL-3273™), Toledo (АТСС® CRL-2631™), Namalwa (АТСС® CRL-1432™), Daudi (АТСС® CCL-213™), Ramos (RA 1) (АТСС® CRL-1596™), Raji (АТСС® CCL-86™)) и CD3-позитивных клеточных линий (HuT78 (АТСС® TIB-161™), CCRF-CEM (АТСС® CCL-119™), Jurkat (АТСС® TIB-152™)) с концентрацией 2*106 клеток в мл вносили по 30 мкл в 96-луночный планшет с V-образным дном (Corning Inc, кат. №3894). Вносили в лунки с клетками по 30 мкл раствора БСАТ клон 309_02_А08 в последовательных 3-кратных разведениях от 200 nM до 0,003 nM (финальные концентрации от 100 nM до 0,0016 nM). Инкубировали 60 мин на льду. По окончанию инкубации дважды отмывали клетки FACS буфером, осаждая клетки центрифугированием при 1000 об/мин (4±2)°С. К осадку клеток добавляли по 30 мкл раствора антител к человеческому IgG, меченных FITC, (Donkey F(ab)2 Anti-Human IgG, Abcam, кат. № Ab102437) в разведении 1:200. Инкубировали 30 мин на льду в темноте с последующей трехкратной отмывкой FACS буфером. После отмывки клетки фиксировали, ресуспендируя клеточный осадок в каждой лунке в 150 мкл FIX-буфера (фосфатно-солевой буфер с 1% раствором формалина). Интенсивность флуоресценции клеток в FITC-канале измеряли на цитометре Canto II.
Показано, что БСАТ специфично связывается с CD19- и CD3- позитивными клеточными линиями с субнаномолярным аффинитетом. Результаты экспериментов продемонстрированы на фигурах 1 и 2 и в таблице 3.
Пример 2. Определение концентрации препарата БСАТ, при которой 50% CD3- и CD19- рецепторов находятся в комплексе с антителом, с использованием МКПК условно здоровых доноров
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
Кровь условно здоровых доноров стерильно отбирали в вакутейнеры с гепарином (Greiner Bio-One, кат. №455084). Кровь разбавляли равным объемом фосфатно-солевого буфера (ЭКО сервис, кат. № В-60201), наслаивали на градиент плотности фиколла (ρ=1,077 г/см3) («ПанЭко», кат. № Р052) и центрифугировали в течение 30 минут при 800 g при температуре (20±2)°С. Собирали МКПК на границе фаз и дважды отмывали клетки изотоническим фосфатно-солевым буферным раствором. Осадок клеток ресуспендировали в 15 мл среды ДМЕМ/Ф12 (Sigma, кат. № D8900-10L) с 10% фетальной бычьей сыворотки (GE Healthcare, кат. № SV30160) и инкубировали 4 часа в культуральном флаконе (SPL Life Sciences Со, кат. №70075) при температуре (37±2)°С для прикрепления моноцитов. По окончанию инкубации собирали неприкрепленные клетки, клеточную суспензию центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в FACS буфере с добавлением раствора Fc Blook в разведении 1:100 (BD Pharmingen™, кат. №564220) для ингибирования неспецифичного связывания Fc-рецепторов, экспонированных на мембране В-клеток. Приготовленную суспензию МКПК с концентрацией клеток 4*106/мл вносили по 50 мкл (2*105 клеток на лунку) в 96-луночный планшет с V-образным дном (Corning Inc, кат. №3894).
Связывание БСАТ с CD19-позитивными мононуклеарными клетками периферической крови условно здоровых доноров.
К клеткам добавляли по 50 мкл раствора БСАТ клон 309_02_А08 в последовательных 3-кратных разведениях в FACS буфере с добавлением Fc Block 1:100 от 200 nM до 0,003 nM (финальные концентрации - от 100 до 0,0016 nM). Инкубировали 60 минут при температуре (37±2)°С. По окончанию инкубации дважды отмывали клетки ледяным FACS буфером, осаждая клетки центрифугированием в течение 10 мин при 1300 об/мин и температуре (5±3)°С. После этого осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл FACS буфера и добавляли антитела к экстраклеточной части человеческого рецептора CD19 (клон HD37), меченные FITC (Millipore milli-mark, кат. № FCMAB184F) в объеме 10 мкл, конечное разведение 1:150, инкубировали 30 минут при температуре (5±3)°C с последующей трехкратной отмывкой. Клетки фиксировали ресуспендированием в 250 мкл FIX-буфера (фосфатно-солевой буферный раствор с 1% раствором формалина). Интенсивность флуоресценции клеток в FITC-канале измеряли на цитометре Canto II. Для достоверности получаемых данных собирали не менее 50000 событий.
Связывание препарата БСАТ с CD3-позитивными мононуклеарными клетками периферической крови условно здоровых доноров
К клеткам добавляли по 50 мкл раствора БСАТ клон 309_02_А08 в последовательных 3-кратных разведениях в FACS буфере с добавлением Fc Block (1:100) от 8700 nM до 0,04 nM (финальные концентрации - от 2900 nM до 0,01 nM). Затем готовили раствор биотинилированного БСАТ с концентрацией 300 nM и вносили в лунки с клетками по 50 мкл (финальная концентрация препарата 100 nM). Инкубировали 60 минут при температуре (37±2)°С. По окончанию инкубации клетки дважды отмывали клетки ледяным FACS буфером, осаждая клетки центрифугированием в течение 10 мин при 1300 об/мин и температуре (5±3)°С. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл FACS буфера и добавляли конъюгат PE-Streptavidin (BD Pharmingen, кат. №554061) в объеме 10 мкл (конечное разведение 1:200), инкубировали 30 минут при температуре (5±3)°C с последующей трехкратной отмывкой. Клетки фиксировали ресуспендированием в 250 мкл FIX-буфера (фосфатно-солевой буферный раствор с 1% раствором формалина). Интенсивность флуоресценции клеток в РЕ-канале измеряли на цитометре Canto II. Для достоверности получаемых данных собирали не менее 50000 событий.
Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo, Excel и GraphPad Prism 6.0 с использованием 4-х параметрической логистической функции дозозависимого ингибирования, и функции "constrain - shared value" для значений верхней и нижней асимптот и угла наклона сигмоидной кривой (hill slope). Определяли дозу полумаксимального ингибирования (IC50) и коэффициент достоверности аппроксимации функции (R2).
Результаты.
Концентрация БСАТ, при которой выявляли 50% свободных CD19-рецепторов, и соответственно, 50% CD19-рецепторов находились в комплексе с антителом, варьировала от 0,02 до 0,06 nM в зависимости от донора (фигура 3).
Концентрация БСАТ, при которой выявляли 50% свободных CD3-рецепторов, и соответственно, 50% CD3-рецепторов находились в комплексе с антителом, варьировала от 52,1 до 66,5 nM в зависимости от донора (фигура 4).
Пример 3. Определение Т-клеточно опосредованной цитолитической активности БСАТ в отношении CD19-позитивных клеток-мишеней опухолевых линий человека при использовании в качестве эффекторных клеток активированных МКПК условно здоровых доноров
Выделение и активация мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
Выделяли МКПК условно здоровых доноров проводили, как описано в примере 2. К 5 мл суспензии РВМС с концентрацией 2*106 кл/мл в среде ДМЕМ/Ф12 (Sigma, кат. № D8900-10L) с 10% фетальной бычьей сыворотки (GE Healthcare, кат. № SV30160) добавляли IL-2 (Abcam, кат. № ab155694) до конечной концентрации 5 нг/мл и магнитные частицы Dynabeads с иммобилизованными на них антителами к человеческим рецепторам CD3 и CD28 для активации Т-лимфоцитов человека (Gibco, кат. №11131D) в объеме 65 мкл. Клетки инкубировали в течение 5-7 дней при температуре (37±2)°С в атмосфере (5,0±0,5)% СО2 с ежедневным подсчетом количества клеток, при необходимости добавляли среду ДМЕМ/Ф12 (Sigma, кат. № D8900-10L), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (GE Healthcare, кат. № SV30160) и IL-2 в концентрации 5 нг/мл.
Постановка метода.
Клетки-мишени человеческой линии Raji (АТСС® CCL-86™) дважды отмывали от культуральной среды изотоническим фосфатно-солевым буферным раствором, осаждая клетки центрифугированием в течение 10 минут при 1300 об/мин и температуре (22±2)°С. Осадок клеток ресуспендировали в изотоническом фосфатно-солевом буферном растворе и добавляли 10 мкл 1 mM раствор кальцеина (Molecular Probes, кат. № С3100МР) из расчета 10 мкл раствора кальцеина на 1 млн клеток и инкубировали в течение 40 минут. По окончанию инкубации клетки трижды отмывали от свободного кальцеина изотоническим фосфатно-солевым буферным раствором. Доводили плотность клеточной суспензии до 2×105 клеток в мл средой ADCF-Mab (GE Healthcare Life Sciences, кат. № SH30349.02) и добавляли 1/100 объема 100Х раствора пробенецида (Sigma-Aldrich, кат. № P8761-25G).
Активированные IL-2/CD3/CD28 Т-клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1300 об/мин и температуре (22±2)°С, однократно промывали изотоническим фосфатно-солевым буферным раствором. Осадок клеток ресуспендировали в среде ADCF-Mab и доводили клеточную суспензию до концентрации 4×106 клеток в мл.
Делали 12 последовательных 3-кратных разведения БСАТ клон 309_02_А08 от 100 до 0,0005 рМ и каждый раствор вносили в трипликатах по 50 мкл в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (Corning Inc, кат. №3599). Затем в лунки планшета с препаратом вносили по 50 мкл активированных IL-2/CD3/CD28 Т-клеток и по 50 мкл клеток Raji (соотношение Т-клеток к клеткам Raji 10:1). В лунки планшета вносили также 1) клетки-мишени, меченные кальцеином (контроль спонтанного выхода кальцеина); 2) клетки-мишени, меченные кальцеином, с эффекторными клетками (лизис клеток, обусловленный цитолитической активностью эффекторных клеток без добавления препарата 309_02_А08); 3) клетки-мишени, меченные кальцеином, для последующей обработки раствором тритона X100 (Sigma-Aldrich, кат. № X100-1L). Инкубировали 3 часа при температуре (37±2)°С.
Через 3 часа в лунки с клетками Raji, меченными кальцеином, вносили по 20 мкл 10% раствора Тритона X100, для полного лизиса клеток (MFI_max) и инкубировали 1 час при температуре (37±2)°С.
По окончанию инкубации планшет центрифугировали 5 минут при 1300 об/мин и с помощью многоканальной пипетки аккуратно, чтобы не захватить клетки, переносили по 120 мкл супернатанта из каждой лунки в планшеты из непрозрачного белого пластика (Corning Inc, кат. №3912) для измерения флуоресценции. Флуоресценцию измеряли на планшетном спектрофотометре Tecan Infinite М200 при длине возбуждения 488 нм и эмиссии при 518 нм. Полученные данные экспортировали в программу Excel и рассчитывали эффективность лизиса в каждой экспериментальной лунке по формуле:
% специфичного лизиса = (MFIexp-MFI_min)/(MFI_max-MFI_min)*100%.
Дальнейшую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0 с использованием 4-х параметрической логистической функции и функции "constrain - shared value" для значений верхней и нижней асимптот и угла наклона сигмоидной кривой (hill slope). Определяли полумаксимальную эффективную дозу (ЕС50) и коэффициент достоверности аппроксимации функции (R2).
Результаты.
Препарат БСАТ проявлял цитолитическую активность в отношении CD19-позитивных клеток-мишеней человеческой линии Raji при использовании в качестве эффекторных клеток МКПК условно здоровых доноров. ЕС50 варьировала от 1,3 рМ до 3,1 рМ, а процент максимального лизиса клеток-мишеней - от 41 до 100, в зависимости от донора. Результаты экспериментов представлены на фигуре 5.
Пример 4. Определение Т-клеточно опосредованной активности БСАТ с использованием клеток коммерческой репортерной линии Jurkat-LUCIA-NFAT (Promega) в качестве эффекторных клеток
Описание метода.
Клеточную линию Raji (ATCC®CCL-86™) культивировали согласно рекомендациям производителя. Клетки-мишени человеческой линии Raji (АТСС® CCL-86™) дважды отмывали от культуральной среды изотоническим фосфатно-солевым буферным раствором, осаждая клетки центрифугированием в течение 10 минут при 1300 об/мин и температуре (22±2)°С. Осадок клеток ресуспендировали в среде для выполнения теста (RPMI-1640 без фенолового красного (Lonza, кат № BE12918F) с 5% фетальной бычьей сыворотки (GE Healthcare, кат. № SV30160)). Готовили 5 мл клеточной суспензии с концентрацией 2×105 клеток в мл.
Клеточную линию Jurkat-Luc-NFAT (эффекторные клетки) (Promega, кат. №jktl-nfat) размораживали на водяной бане при температуре (37±2)°С. Содержимое ампулы переносили в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл среды для выполнения теста, и центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в среде для выполнения теста. Делали 5 мл клеточной суспензии с концентрацией 2,5×106 клеток/мл.
Готовили 11 последовательных 3-кратных разведений БСАТ клон 309_02_А08 от 1200 рМ до 0,02 рМ (финальные концентрации - от 400 до 0,007 рМ) в среде для выполнения теста.
В лунки А2-Н12, U-образного 96-луночного культурального планшета (Corning Inc, кат. №3799) вносили растворы препарата в трипликатах по 40 мкл, начиная с минимальной концентрации. В лунки А1-Н1 вносили по 40 мкл среды. Смешивали подготовленные суспензии клеток Raji и Jurkat-Luc-NFAT и вносили по 80 мкл во все лунки (А1-Н12) планшета. Планшет инкубировали 18 часов при температуре (37±2)°С.
По окончанию инкубации содержимое лунок планшета ресуспендировали и переносили по 40 мкл суспензии в лунки 96-луночного плоскодонного планшета из белого непрозрачного пластика (Corning Inc, кат. №3912). Затем в каждую лунку вносили по 25 мкл подогретого до комнатной температуры (20±5)°С субстрата QUANTI-Luc™ Lucia™ (Invivogen, кат. № rep-qlc1, rep-qlc2). Содержимое лунок аккуратно перемешивали. Интенсивность хемилюминесценции измеряли на планшетном спектрофотометре Tecan Infinite М200.
Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0. Зависимость уровня хемилюминесценции от десятичного логарифма концентрации препарата БСАТ аппроксимировали уравнением 4-параметрической логарифмической функции. Автоматически определяли ЕС50 и R2.
Результаты.
При совместном культивировании клеточной линии Raji с клетками Jurkat-Luc-NFAT в присутствии БСАТ наблюдали дозозависимое увеличение сигнала хемилюминесценции, ЕС50 составила 2,3 рМ. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 6.
Пример 5. Оценка функциональной активности и специфичности биспецифических антител путем анализа активации клеток линии Jurkat
Активацию Т-клеток измеряли с использованием клеток линии Jurkat с репортерным геном, закупленных у компании Promega. Данные об активности (ЕС50) 14 биспецифических IgG-подобных антител к CD3 приведены в таблице 1, а полные кривые зависимости доза-ответ представлены на Фиг. 7. Исследуемые биспецифические IgG-подобные молекулы титровали и оценивали их способность индуцировать транскрипцию NFAT в эффекторных клетках линии Jurkat в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих CD19 (т.е. оценивали мишень-зависимую и мишень-независимую активацию). Все биспецифические IgG-подобные молекулы демонстрировали высокую мишень-зависимую активность в этом анализе. Также приведены данные для применявшихся в качестве положительных контролен двух различных биспецифических IgG-подобных молекул, в которых ОКТ3 используется как связывающийся с CD3 фрагмент (коетроли 1 и 2). В качестве негативного контроля использовали BiM8_D1.3 (в котором одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела к CD3 замещен на аналогичный фрагмент антитела к лизоциму куриного яйца D1.3). Для этого анализа используются модифицированные путем генной инженерии клетки линии Jurkat, стабильно экспрессирующие репортерный ген люциферазы, регулируемый элементом ответа ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT). Совместное культивирование этих репортерных клеток с экспрессирующими CD19 клетками линии Raji в присутствии функциональных биспецифических антител к CD3/CD19 приводит к активации Т-клеточного рецепторного комплекса и увеличению активности люциферазы, обусловленному активацией элемента ответа NFAT.
Готовые к использованию после размораживания клетки линии GloResponse™ NFAT-Re-luc2 Jurkat (каталожный номер компании Promega CS176403) были разморожены в течение 2 минут на водяной бане при температуре 37°С и осторожно перенесены в предварительно нагретую среду для анализа RPMI 1640 (каталожный номер компании Gibco 22400) объемом 4 мл с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (каталожный номер компании HyClone SH30070.03). По 25 мкл ресуспендированных клеток было помещено в каждую лунку белого 96-луночного планшета для анализа (каталожный номер компании Costar 3917), итоговое количество клеток линии Jurkat в каждой лунке составило 1×105. Суспензия клеток линии Raji была приготовлена в концентрации 2×106/мл в среде для анализа, и по 25 мкл суспензии было добавлено в лунки, содержащие репортерные клетки линии Jurkat (количество клеток линии Raji в каждой лунке составило 5×104). Было добавлено по 5,5 мкл исследуемой биспецифической IgG-подобной молекулы (или используемого в качестве контроля растворителя, если применимо), и образцы инкубировали при температуре 37°С в течение 5 часов (статический инкубатор, 5% CO2). По завершении инкубации планшеты для анализа были оставлены при комнатной температуре (21°С) на 15 минут, после чего в лунки было добавлено по 55 мкл реагента Bio-Glo (каталожный номер компании Promega G7940, реагент был растворен в соответствии с инструкцией производителя). Наконец, планшеты инкубировали в течение 5 минут (21°С), и измеряли люминесценцию при помощи прибора BMG Pherastar.
Низкий уровень мишень-независимой активации клеток линии Jurkat является многообещающим свойством всех клонов предложенных биспецифических IgG-подобных молекул.
Перечень последовательностей
Пискунов А.А., Аббасова С.Г., Морозов А.Н., Шустер А.М., Петер Славни, Даниел Гриффитс, Изабеле Касзинска, Джон МcCафферти, Михаел Дайсон
Определяющие комплементарность участки для связывания CD3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула.
SEQ ID NO:1 (>309_01_A02)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVESGG
GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSRIQAGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASN
FMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGTIASTYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGS
IDSSSNSASLTISGLKTEDAADYFCQSYDSNNRVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSG
AELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKAT
LTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:2 (>309_01_G04)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVESGG
GVVQPGRSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTTSR
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCAKEDYYGGYFDYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGA
SNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFS
GSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQAVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQLQ
QSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKG
KATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVE
CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:3 (>309_01_G12)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVQSGA
EVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNSGGTNYAQKFQGRVT
MTRDTSISTAYMELSRLRSDDAAVYYCARPSRYSNYVDWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGG
ASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYDDDQRPSGVPDR
FSGSIDRSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNTNPWVFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQVQL
QQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFK
GKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAA
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:4 (>309_02_A08)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLVQSGA
EVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTM
TRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARTGKNYYYYGMDAWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSG
GGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIARNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVP
DRFSASIDSSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDTSNHVVFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQV
QLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGK
FKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASA
AVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:5 (>309_02_F01)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVQSGA
EVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVT
MTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDKRYSSGWYENWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSG
GGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASKYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVP
DRFSGSIDISSNSASLTISGLKTEDEADYFCQSYDSSSVIFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQVQLQ
QSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKG
KATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVE
CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:6 (>309_04_A04)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLQQWG
AGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEISRSGTTNYNSSLKSRVTISVDTS
KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARATRNGVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFM
LTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPSTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID
SSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSGVVFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSGAELV
RPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTAD
ESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPPCPAP
PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF
NSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:7 (>309_05_B08)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLLESGGG
LVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDN
SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAISTVTRPDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNF
MLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIARNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSI
DSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQRVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSG
AELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKAT
LTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:8 (>400_01_D06)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLVQSGA
EVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITAD
ESTSTAYMEVRSLRSDDTAVYYCVRDRGDYGDITYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGG
ASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTIVIYEDNHRPSGVPDR
FSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSDRVVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQL
QQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFK
GKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAA
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:9 (>400_03_H07)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLVESGG
GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGIAAAGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASN
FMLTQPHSVSESPGKTVTISCARSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNRRPSGVPDRFSGS
FDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNRVFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSG
AELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKAT
LTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10 (>410_01_C03)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLQQWG
AGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTS
KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARATRNGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFM
LTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGRIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSID
SSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNVVFGGGTQLTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSGAE
LVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLT
ADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPPC
PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:11 (>410_01_C09)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVQSGA
EVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWMGRINPNSGGTNYAQKFQGRVT
MTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPSRYSNYVDWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGG
ASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDR
FSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSRWIWVSGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQL
QQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFK
GKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAA
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:12 (>418_01_C05)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAEVQLVESGG
GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSYINSRSSTIYYADSVKGRFTISRD
NAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKDKPLSGYAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGAS
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNFVQWYQQRPGRAPTIVIFDDDQRPSGVPDRFS
GSIDRSSDSASLSISGLKTEDEADYYCQSYATRTQGVVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQLQ
QSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKG
KATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVE
CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS
REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:13 (>418_03_E12)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLVESGG
GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCARRSFSSVFADYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNF
MLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSRGSIASNYVQWYQQRPGRAPTIVIFDDDQRPSGVPDRFSGSI
DRSSDSASLRISGLKTEDEADYYCQSYATRSQSVVFGGGTKLTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQS
GAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKA
TLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECP
PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:14 (>418_03_H01)
DIQLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRF
SGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGSGGAMAQVQLQQWG
AGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSRYYWSWIRQSPGKGLEWIGEIKHRGRTNYNPSLKSRVTMSVDT
SKNQFSLQLRSVTAADTAVYYCARVYSSGWFSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNF
MLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIARNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSI
DSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDGSNWVFGGGTKVTVLGQPAAAGGGGSQVQLQQSG
AELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKAT
LTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSSASAAVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:15 (шарнирная область)
VECPPCP
SEQ ID NO:16 (Fc-фрагмент IgG2 человека)
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 17 (линкер 1)
GGSGGAMA
SEQ ID NO: 18 (линкер 2)
GGGGSGGGGSGGGAS
SEQ ID NO: 19 (линкер 3)
AAAGGGGS
Claims (26)
1. Антигенсвязывающая молекула, способная связывать рецепторный комплекс CD3, содержащая по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, включающий вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, отличающаяся тем, что аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и определяющих комплементарность участков легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в составе указанной молекулы выбраны из одного из следующих вариантов сочетаний последовательностей для определяющих комплементарность участков:
а) GFTFSSYSMN, SISSSSSYIYYADSVKG, SSRIQAGMDV, TRSSGTIASTYVQ, EDNQRPS, QSYDSNNRV;
б) GFTVSSNYMS, SAISGSGGSTYYADSVKG, EDYYGGYFDY, TRSSGSIASNYVQ, EDNQRPS, QSYDSSNQAV;
в) GYTFTGYYMH, RINPNSGGTNYAQKFQG, PSRYSNYVD, TRSSGSIASNYVQ, DDDQRPS, QSYDNTNPWV;
г) GYTFTGYYMH, IINPSGGSTSYAQKFQG, TGKNYYYYGMDA, TRSSGSIARNYVQ, EDNQRPS, QSYDTSNHVV;
д) GYTFTGYYMH, WINPNSGGTNYAQKFQG, DKRYSSGWYEN, TRSSGSIASKYVQ, EDNQRPS, QSYDSSSVI;
е) GGSFSGYYWS, EISRSGTTNYNSSLKS, ATRNGVFDY, TRSSGSIASNYVQ, EDNQRPS, QSYDSGVV;
ж) GFTFSSYAMS, AISGSGGSTYYADSVKG, STVTRPDFDY, TRSSGSIARNYVQ, EDNQRPS, QSYDSSNQR;
з) GGTFSSYAIS, GIIPIFGTANYAQKFQ, DRGDYGDITYFDY, TGSSGSIASNYVQ, EDNHRPS, QSYDSSDRVV;
и) GFTFSSYSMN, SISSSSSYIYYADSVKG, SGIAAAGFDY, ARSSGSIASNYVQ, EDNRRPS, QSYDSSNRV;
к) GGSFSGYYWS, EINHSGSTNYNPSLKS, ATRNGAFDY, TRSSGRIASNYVQ, EDNQRPS, QSYDSSNVV;
л) GYTFTSYYMY, RINPNSGGTNYAQKFQG, PSRYSNYVD, TRSSGSIASNYVQ, EDNQRPS, QSYDSRWIWV;
м) GFTFSSYGMH, YINSRSSTIYYADSVKG, KPLSGYAFDI, TRSSGSIASNFVQ, DDDQRPS, QSYATRTQGVV;
н) GFTFSSYGMH, SISSSSSYIYYADSVKG, RSFSSVFADY, TRSRGSIASNYVQ, DDDQRPS, QSYATRSQSVV;
о) GGSFSRYYWS, EIKHRGRTNYNPSLKS, VYSSGWFSY, TRSSGSIARNYVQ, EDNQRPS, QSYDGSNWV.
2. Молекула по п. 1, которая моновалентно и специфически связывает CD3, расположенный на Т-лимфоцитах человека.
3. Молекула по любому из пп. 1, 2, которая является частью биспецифической антигенсвязывающей молекулы.
4. Молекула по любому из пп. 1-3, которая содержит вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая моновалентно и специфически связывает CD19, расположенный на В-лимфоцитах человека.
5. Молекула по любому из пп. 1-4, последовательность которой включает (а) первый домен, включающий антигенсвязывающий участок молекулы по любому из пп. 1-5, и (б) второй домен, содержащий антигенсвязывающий участок цепи иммуноглобулина или антитела, который специфически распознает антиген CD19 В-клеток человека, причем домены, формирующие антигенсвязывающие участки, расположены в следующем порядке: VLCD3-VHCD19-VHCD19-VLCD3.
6. Молекула по любому из пп. 1-5, которая дополнительно содержит Fc фрагмент.
7. Молекула по любому из пп. 1-6, которая способна индуцировать активацию Т-клеток в формате биспецифического антитела.
8. Молекула по любому из пп. 1-7, аминокислотная последовательность которой включает в себя последовательности, выбранные из списка SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14.
9. Применение молекулы по любому из пп. 4, 5, 8 для создания лекарственного средства для лечения злокачественных заболеваний В-клеточной природы или истощения В- клеток.
10. Применение по п. 9, где лекарственное средство включает молекулу по любому из пп. 4, 5, 8 в эффективном количестве, и необязательные нейтральные носители из круга традиционно применяющихся в композициях этого назначения.
11. Применение по п. 10, где злокачественное заболевание В-клеточной природы выбрано из острого лимфобластного лейкоза и В-клеточных лимфом.
12. Применение по п. 11, где заболевание проходит в рефрактерной или рецидивирующей форме.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019126380A RU2738802C1 (ru) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула |
| EP20855201.8A EP4036115A4 (en) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | COMPLEMENTARITY-DETERMINING REGIONS FOR BINDING CD3 AND BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING SAID CDR |
| CN202080059164.5A CN114364698B (zh) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | 结合cd3的互补决定区和含所述cdr的双特异性抗原结合分子 |
| JP2022512437A JP7366242B2 (ja) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子 |
| PCT/RU2020/050195 WO2021034227A1 (ru) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула |
| CA3149929A CA3149929A1 (en) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs |
| US17/632,647 US20230212288A1 (en) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs |
| AU2020334700A AU2020334700A1 (en) | 2019-08-21 | 2020-08-20 | Complementarity-determining regions for binding CD3, and bispecific antigen-binding molecule containing said CDRs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019126380A RU2738802C1 (ru) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2738802C1 true RU2738802C1 (ru) | 2020-12-17 |
Family
ID=73834967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019126380A RU2738802C1 (ru) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230212288A1 (ru) |
| EP (1) | EP4036115A4 (ru) |
| JP (1) | JP7366242B2 (ru) |
| CN (1) | CN114364698B (ru) |
| AU (1) | AU2020334700A1 (ru) |
| CA (1) | CA3149929A1 (ru) |
| RU (1) | RU2738802C1 (ru) |
| WO (1) | WO2021034227A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021226695A1 (pt) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Fundação Universidade Federal Do Abc - Ufabc | Anticorpos recombinantes humanos para inibição da calicreína tecidual humana 7 (klk7) e uso em doenças relacionadas ao processo de descamação da pele |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2179862C1 (ru) * | 2000-12-26 | 2002-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" | Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки |
| EP2640416A1 (en) * | 2010-11-15 | 2013-09-25 | MedImmune, LLC | Combination therapy for b cell lymphomas |
| WO2014047231A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof |
| EP3256493A1 (en) * | 2015-02-12 | 2017-12-20 | Seattle Genetics, Inc. | Combination therapy using a cd19-adc and vincristine |
| EP2686347B1 (en) * | 2011-03-16 | 2018-05-02 | argenx BVBA | Antibodies to cd70 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999054440A1 (en) * | 1998-04-21 | 1999-10-28 | Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh | CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF |
| ES2283368T3 (es) | 2001-11-14 | 2007-11-01 | Affimed Therapeutics Ag | Anticuerpos biespecificos anti-cd19 y anti-cd16 y usos de los mismos. |
| CN102250245B (zh) * | 2010-05-27 | 2014-05-14 | 四川大学 | 抗b细胞淋巴瘤的双特异性抗体及其用途 |
| SMT201700250T1 (it) | 2010-11-10 | 2017-07-18 | Amgen Res Munich Gmbh | Prevenzione di effetti avversi provocati da domini leganti cd3 specifici |
| MX347829B (es) | 2011-07-22 | 2017-05-15 | Affimed Therapeutics Ag | Molécula fv de unión a antígeno multivalente. |
| GB201412659D0 (en) | 2014-07-16 | 2014-08-27 | Ucb Biopharma Sprl | Molecules |
| MX377344B (es) | 2014-07-31 | 2025-03-07 | Amgen Res Munich Gmbh | Constructos de anticuerpos de cadena sencilla biespecífica específicos para especies cruzadas optimizadas. |
| CN104592393B (zh) * | 2015-01-21 | 2018-09-28 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种双特异性抗体cd19×cd3的构建及应用 |
| RU2651776C2 (ru) * | 2015-12-01 | 2018-04-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Биспецифические антитела против cd3*cd19 |
| CN107903324B (zh) * | 2017-11-15 | 2021-01-29 | 北京绿竹生物技术股份有限公司 | 一种结合人cd19和cd3的双特异性抗体 |
-
2019
- 2019-08-21 RU RU2019126380A patent/RU2738802C1/ru active
-
2020
- 2020-08-20 CA CA3149929A patent/CA3149929A1/en active Pending
- 2020-08-20 AU AU2020334700A patent/AU2020334700A1/en not_active Abandoned
- 2020-08-20 EP EP20855201.8A patent/EP4036115A4/en active Pending
- 2020-08-20 JP JP2022512437A patent/JP7366242B2/ja active Active
- 2020-08-20 US US17/632,647 patent/US20230212288A1/en not_active Abandoned
- 2020-08-20 CN CN202080059164.5A patent/CN114364698B/zh active Active
- 2020-08-20 WO PCT/RU2020/050195 patent/WO2021034227A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2179862C1 (ru) * | 2000-12-26 | 2002-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" | Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки |
| EP2640416A1 (en) * | 2010-11-15 | 2013-09-25 | MedImmune, LLC | Combination therapy for b cell lymphomas |
| EP2686347B1 (en) * | 2011-03-16 | 2018-05-02 | argenx BVBA | Antibodies to cd70 |
| WO2014047231A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof |
| EP3256493A1 (en) * | 2015-02-12 | 2017-12-20 | Seattle Genetics, Inc. | Combination therapy using a cd19-adc and vincristine |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| REUSCH U. et al. "A tetravalent bispecific TandAb (CD19/CD3), AFM11, efficiently recruits T cells for the potent lysis of CD19+ tumor cells". MAbs, Taylor & Francis, 2015, 7 (3): 584-604. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021226695A1 (pt) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Fundação Universidade Federal Do Abc - Ufabc | Anticorpos recombinantes humanos para inibição da calicreína tecidual humana 7 (klk7) e uso em doenças relacionadas ao processo de descamação da pele |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7366242B2 (ja) | 2023-10-20 |
| CN114364698A (zh) | 2022-04-15 |
| CN114364698B (zh) | 2024-05-28 |
| WO2021034227A1 (ru) | 2021-02-25 |
| CA3149929A1 (en) | 2021-02-25 |
| US20230212288A1 (en) | 2023-07-06 |
| EP4036115A4 (en) | 2023-11-08 |
| EP4036115A1 (en) | 2022-08-03 |
| JP2022545041A (ja) | 2022-10-24 |
| AU2020334700A1 (en) | 2022-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200385471A1 (en) | Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma for use in treatment of diseases | |
| US10604576B2 (en) | Antibodies and immunocytokines | |
| JP7118332B2 (ja) | Ｖｉｓｔａ抗原結合性分子 | |
| US12304951B2 (en) | Anti-TSPAN8/anti-CD3 bispecific antibody and anti-TSPAN8 antibody | |
| US20250154272A1 (en) | Anti-cldn4/anti-cd137 bispecific antibody | |
| EP3941940A1 (en) | Antibodies having specificity for btn2 and uses thereof | |
| CN119278213A (zh) | 针对ctla-4的抗体及其使用方法 | |
| RU2738802C1 (ru) | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула | |
| CN120152735A (zh) | Adgre2嵌合受体nk细胞组合物和使用方法 | |
| EA043994B1 (ru) | Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула | |
| HK40069492B (zh) | 结合cd3的互补决定区和含所述cdr的双特异性抗原结合分子 | |
| HK40069492A (en) | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs | |
| WO2025077741A1 (zh) | 抗pd-1单克隆抗体及其应用 | |
| HK40102072A (en) | Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma for use in treatment of diseases | |
| HK40104280A (en) | Anti-cldn4/anti-cd137 bispecific antibody | |
| HK1244491A1 (en) | Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma for use in treatment of diseases | |
| HK1244491B (en) | Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma for use in treatment of diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20220228 |