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JP6113717B2 - 抗ｃｄｈ３（ｐ−カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート - Google Patents

抗ｃｄｈ３（ｐ−カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート Download PDF

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Description

本発明は、抗ＣＤＨ３抗体の薬剤コンジュゲートに関する。本発明はさらに抗ＣＤＨ３抗体の薬剤コンジュゲートの使用方法に関する。
癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
その標的のひとつとして細胞表面抗原であるＣＤＨ３が同定される。ＣＤＨ３はカルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｔａｋｅｉｃｈｉ, Ｃｅｌｌ ２８：２１７ー２２４,１９８２）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピートを持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、ＣＤＨ３はその主要メンバーに属する。
ある種の癌細胞においてはＣＤＨ３の発現上昇例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのＣＤＨ３の発現が高い癌細胞に対して抗体を用いた癌治療が検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報）。
分子標的薬としては、すでに多くの抗体医薬が実際に上市され、その多くは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を主な作用機序としている。しかしながら、その薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を目指した技術開発も同時に進められている。
抗体の抗腫瘍能を増強する有効な手段の一つとして抗体と強力な毒性を有する薬剤（毒素）との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結することにより、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合している状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原に結合すると細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、毒素を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれ、細胞内で分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。
ＡＤＣに用いられる薬剤成分には、ジフテリア毒素などの細菌性タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、アウリスタチン、メイタンシノイド、カリキアマイシンなどの低分子毒素及びその誘導体が含まれる。
ＡＤＣにおいて、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積した後に薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出（抗体からの離脱）は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後に抗体から離脱する設計が好ましい。近年ジェネンテック社は、このような観点からトラスツズマブに非開裂型リンカー（ＳＭＣＣ）を介して毒素を結合した薬剤（Ｔ−ＤＭ１）を開発、臨床試験がすすめられ、非常に高い臨床効果を示している。また、開裂性リンカーを介して薬剤成分と連結した抗体薬剤コンジュゲートも開発される。例えば、ＮＣＡＭ抗原を発現する癌を対象に、ジスルフィドリンカー（ＳＰＰ）を介して薬剤とＨｕＮ９０１抗体を結合させた抗体薬剤コンジュゲートの開発がＩｍｍｕｎｏＧｅｎ社により進められている。
上記の通り、ＡＤＣにより癌を治療するというコンセプトは公知である。当分野では、肺がん、大腸がんといった様々な癌を治療するための更なる薬剤に対する需要がある。この目的のために特に有用な薬剤に、有意に毒性が低いが有益な治療的有効性がある抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートが含まれる。これら及び他の制限ないし過去の問題点は本発明によって解決されうる。
ＷＯ２００２／０９７３９５号公報 ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｔａｋｅｉｃｈｉ, Ｃｅｌｌ ２８：２１７ー２２４,１９８２
本発明は、ＣＤＨ３を発現する癌細胞を効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤＨ３に対する抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が、ＣＤＨ３を発現する癌細胞株に対して強力な細胞傷害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が提供される。
好ましくは、本発明の免疫複合体は、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片が、ＣＤＨ３を発現している細胞に対して細胞傷害能を示す。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体は、ＣＤＨ３またはＣＤＨ３を発現している細胞を免疫原として投与した免疫細胞から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である。
好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。
好ましくは、前記抗体はキメラ化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４８、５６及び６５に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び８６に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５２、６０及び７０に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９１に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５４、６２及び７２に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７４、８１及び９３に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５５、６３及び７３に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号８０、８５及び９４に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４９、６４及び６６に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７６、８４及び８９に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号４９、５８及び６８に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７９、８２及び９０に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５３、６１及び７１に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７５、８２及び９２に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５１、５７及び６７に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７８、８３及び８８に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、Ｈ鎖に配列番号５０、５９及び６９に記載されたアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖に配列番号７７、８３及び８７に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、上記した本発明の抗体のＨ鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖を有する。
好ましくは、ＣＤＨ３は哺乳類のＣＤＨ３である。
好ましくは、ＣＤＨ３は霊長類のＣＤＨ３から選択される。
好ましくは、ＣＤＨ３はヒトのＣＤＨ３から選択される。
好ましくは、ＣＤＨ３は、細胞の表面に発現されるＣＤＨ３である。
好ましくは、前記ＣＤＨ３結合能を有する抗体断片は、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2、又はｓｃＦｖである。
好ましくは、前記化学療法剤は、細胞障害性物質である。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、メイタンシノイド及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、アウリスタチン及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記メイタンシノイド及びその誘導体は、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４から選択される。
好ましくは、前記アウリスタチン及びその誘導体は、ＭＭＡＥあるいはＭＭＡＦから選択される。
好ましくは、前記細胞性障害剤は、ＤＭ１である。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり１〜10個のＤＭ１が結合している。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片１分子あたり3〜8個のＤＭ１が結合している。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合はリンカーを介してなる。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合を介してなる。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して結合したものである。
好ましくは、ＣＤＨ３に対する抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片と化学療法剤とを結合させるリンカーは、２価反応性架橋試薬である。
好ましくは、前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル（4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート（ＳＰＤＢ）から成る群より選択される。
好ましくは、前記リンカーは、プロテアーゼによって切断される。
好ましくは、前記リンカーはval-citを含む。
好ましくは、前記リンカーはＰＡＢＡを含む。
さらに本発明によれば、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための、本発明の免疫複合体を含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、抗がん作用を有する。
好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される。
本発明で提供される抗ＣＤＨ３抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、化学療法剤を結合しない抗体と比較して、ＣＤＨ３を発現する癌細胞株に、より強力な細胞傷害活性を示す。従って、本発明の免疫複合体は、ＣＤＨ３を発現する癌細胞を有する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の免疫複合体は、抗癌剤として有用である。
図１は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０.０１ｍｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍＬ 図２は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８。ａ：抗ＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍＬ、ｂ：抗ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍＬ、ｃ：抗ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍＬ。 図３は、各種腫瘍組織のＣＤＨ３のｍＲＮＡの発現結果を示す。Ａ：正常組織、Ｂ：各種癌組織、Ｃ：膵臓癌分化度 図４は、各種ヒト腫瘍組織でのＣＤＨ３の発現結果を示す。 図５は、各ＣＤＨ３キメラ抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８ 図６は、ＤＭ１ＳＭｅの構造を示す。 図７は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートの細胞傷害性試験結果を示す。ＡＤＣ：ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲート、Ｎａｋｅｄ：薬剤未結合ＣＤＨ３抗体。 図８は、ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートを用いた動物試験結果を示す。ＡＤＣ：ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲート、Ｎａｋｅｄ：薬剤未結合ＣＤＨ３抗体。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の免疫複合体は、癌細胞を効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３抗体薬剤コンジュゲートとして提供される。
本発明の抗体を作成するための抗原としては、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明で使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばＳａｍｂｒｏｏｋ, Ｊ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照]。
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製するためには、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、ＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6〜１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5〜２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、ＣＤＨ３と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ2濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
宿主細胞系として、好ましくはｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである（Ｕｒｌａｎｄ， Ｇ． ら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｍｍａ ｒａｙｓ ａｔ ｔｈｅ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｌｏｃｕｓ： ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｖｏｌ． １２， １９８６， ｐ５５５５-５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ら、Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ． ２７６， １９７８， ｐ２６９-２７０ をそれぞれ参照のこと）。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。
宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、それらに限定されない（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ９ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を参照のこと）。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７,ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２,ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６,ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７,ＷＯ９２／２０７９１, ＷＯ９３／０６２１３,ＷＯ９３／１１２３６,ＷＯ９３／１９１７２,ＷＯ９５／０１４３８,ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
また、これらの抗体は、ＣＤＨ３を認識する限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
これらの抗体に、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子を結合して使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
本発明の免疫複合体においては、上記の抗体に、更に化学療法剤を結合して、細胞傷害剤として使用することができる。本発明の免疫複合体は、例えばＣＤＨ３を発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
本発明の免疫複合体の好ましい態様としては、抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合したいわゆるＡＤＣをあげることができる。
本発明で用いられる化学療法剤の例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
本発明におけるＡＤＣは、前記の化学療法剤と抗体とを結合し、公知の方法により作製できる。抗体と化学療法剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
化学療法剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
抗体と化学療法剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または化学療法剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、,マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
リンカーの例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル（4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート（ＳＰＤＢ）等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン(ａｌａ−ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
化学療法剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素（トキシン）を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
本発明の免疫複合体は、高い細胞傷害活性を示すことから、細胞傷害剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体は、ＣＤＨ３高発現疾患の治療薬として使用することができる。本発明の細胞傷害剤及びＣＤＨ３高発現疾患の治療薬は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。ヒトＣＤＨ３高発現疾患としては、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などがあげられる。
本発明の免疫複合体は、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜組み合わせることによって、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１ ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図１に示す。
実施例２ 可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１−６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号３：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ）とリバースプライマー （配列番号４：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃−１５秒、５５℃−３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。
その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
実施例３ 抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４あるいはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。
すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト細気管支肺胞上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８との典型的な反応結果を図２に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ−Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。
実施例４ 正常組織および癌組織でのＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現
正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ各１０ｎｇをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ−１３３Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＣＤＨ３は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった（図３Ａ、Ｂ）。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた（図３Ｃ）。
実施例５ 免疫組織化学染色による癌組織でのＣＤＨ３タンパク質の発現
癌臨床検体でのＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｕｔｄｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄ．）製の、膵癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）および大腸癌（腺癌）を使用した。
各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、１０ｍＭＴｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐH９．０）で９５℃４０分賦活化を行った。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ社）付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、およびネガティブコントロールとして抗ＨＢｓ抗体Ｈｙｂ−３４２３と５μｇ／ｍLの濃度で４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属のポリマー二次抗体試薬と室温３０分間反応させた。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
図４に結果を示す。癌細胞は抗ＣＤＨ３抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
実施例６ ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
ＣＤＨ３抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するＲＮＡをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988)により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0を用いた）に従って単離した。具体的な操作方法としては、５ｘ１０ｅ６個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; 1%(w/v) SDS; 10 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ、Ｃａｔ Ｎｏ． ９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５〜２マイクログラム／マイクロリットルになるように１０〜５０マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
実施例７ ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５〜３マイクログラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ， ｐＨ ８．３（室温）； ７５ｍＭ ＫＣｌ； ３ｍＭ ＭｇＣｌ2； １０ｍＭ ＤＴＴ、１００ナノグラムのランダムプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０マイクロリットル反応混合液を調製し、４２°Ｃで５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。
実施例８ 抗ＣＤＨ３抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
Ａ．マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＤＮＡプライマーと３'末端においてマウスＬ鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー（１）、あるいは、５' 末端においてＬ鎖シグナル部分（７セットプライマー）と３'末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）と相同性を有するプライマーセット（２）の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＬ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
（１） マウスＬ鎖可変域クローニング４セットセンスプライマー
「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ −Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ- ， Ｂａｒｂａｓ Ｂｕｒｔｏｎ Ｓｃｏｔｔ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」 ＰＲＯＴＯＣＯＬ ９．５を参考にＳｅｎｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ １７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を北海道システムサイエンスで合成した。
ＶＫセンス（ＦＲ１部分）下記１７のプライマーの混合物をＶＫセンスプライマーとして使用した。
５'-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号５
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号９
５'-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１０
５'-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１１
５'-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３'（縮重度４）：配列番号１２
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３'（縮重度４）：配列番号１３
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３'（縮重度８）：配列番号１４
５'-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１５
５'-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３'（縮重度１６）：配列番号１６
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３'（縮重度１２）：配列番号１７
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３'（縮重度４）：配列番号１８
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３'（縮重度４）：配列番号１９
５'-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３'（縮重度２）：配列番号２０
５'-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３'（縮重度２）：配列番号２１
Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１ ／ Ｊ２アンチセンスプライマー （１）
５'-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３'（縮重度：８）：配列番号２２
Ｊ４アンチセンスプライマー （２）
５'-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３'：配列番号２３
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
５'-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３' ：配列番号２４
Ｊ１ ／ Ｊ２， Ｊ４， Ｊ５アンチセンスプライマー混合物 （４）
（２） マウスＬ鎖可変域クローニング７セットプライマー
ＶＫセンス（シグナルペプチド部分）
このプライマーはノバジェン社のマウスＩｇ-プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ； Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６９８３１-３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
Ａセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３' ：配列番号２５
Ｂセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３' ：配列番号２６
Ｃセットセンスプライマー
５'-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３' ：配列番号２７
Ｄセットセンスプライマー（下記２種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３' ：配列番号２８
５'-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３' ：配列番号２９
Ｅセットセンスプライマー（下記３種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３'：配列番号３０
５'-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３'：配列番号３１
５'- ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ -３'：配列番号３２
Ｆセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３'：配列番号３３
５'-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３'：配列番号３４
５'-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３'：配列番号３５
５'-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３'：配列番号３６
Ｇセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
５'-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３'：配列番号３７
５'-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３'：配列番号３８
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３'：配列番号３９
５'-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３'：配列番号４０
ＫＶＬアンチセンスプライマー
５'-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３'：配列番号４１
Ｂ．マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５' 末端においてマウスＨ鎖シグナル部分（４セットプライマー）と相同性を有するプライマーと３'末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３' 末端においてマウスＨ鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＨ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
（３） マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
ＶＨセンス（シグナル部分：４セットプライマー）
このプライマーはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）， Ｕｎｉｔ ２．１２ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖ ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ ２．１２．２を参考にした。
５'-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３'（縮重度：３２）：配列番号４２
５'-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３'（縮重度：８）：配列番号４３
５'-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３'：配列番号４４
５'-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３'（縮重度：３２）：配列番号４５
（４） マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
ＶＨセンス（ＦＲ１部分）
このプライマーはＴａｎら、“Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
５'-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３'（縮重度：２５６）：配列番号４６
ＶＨアンチセンス（３， ４に共通のアンチセンスプライマー）
マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
５'-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３'（縮重度：６）：配列番号４７
実施例９ キメラ抗ＣＤＨ３免疫グロブリンの一過性発現ベクターの作製
発現プラスミドの作製： ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ， ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｂｉｏ-Ｒａｄ） を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖それぞれの可変領域を実施例８に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ（プロメガ社）に組み込んで、このベクターのＴ７，ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
その際に決定された塩基配列のうち、ＣＤＲに相当する部分をアミノ酸に変換した配列を表１に示す。
キメラ抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖、および、Ｈ鎖の可変域塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ-ＱＵＥＳＴ Ｓｅａｒｃｈ ｐａｇｅ （ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ） で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。次に、クローン化された抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラＬ鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラＨ鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらＬ鎖、Ｈ鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。その際、ＣＨＯ生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化 （Ｋｉｍら、Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ-ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ （ＥＰＯ） ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ， Ｇｅｎｅ， １９９， １９９７， ｐ２９３-３０１の方法に従った） をおこなった。具体的には、Ｌ鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．， Ａｔ ｌｅａｓｔ ｓｉｘ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ ｔｈｅ ＡＵＧ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｄｏｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６， ｐ９４７-９５０， １９８７）、マウスＩＧＫＶ（k鎖可変領域）遺伝子のシグナルペプチド、抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖のＶ領域、ヒトＫＣ（k鎖定常域）の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位（５' 側にＮｈｅＩ， ３' 側にＥｃｏＲＩ）を付加した。キメラＨ鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ＣＤＨ３キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ， Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨを得た。
実施例１０ キメラ抗ＣＤＨ３免疫グロブリンの安定発現ベクターの作製
遺伝子操作された抗体遺伝子をＣＨＯ細胞を用いて高レベルで発現させるために、ＣＭＶプロモーター配列に連結し、ポリＡシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫに、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルを有したｄｈｆｒ遺伝子を組み込むことである。ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列をもつマウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡシグナルをそれぞれＰＣＲ法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をＰＣＲ法で接続するとともに両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＣＭＶプロモーター-Ｋｏｚａｋ-ｄｈｆｒ-ポリＡ-ＨｉｎｄＩＩＩという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、あるいは、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んでｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をＣＡＧプロモーターで、ｄｈｆｒ遺伝子をＣＭＶプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。
実施例１１ キメラ抗ＣＤＨ３生産ＣＨＯ細胞株の樹立
ＣＨＯ ｄｈｆｒ（-）細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980)を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、キメラ抗ＣＤＨ３Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクター、および、キメラ抗ＣＤＨ３Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０ｅ３ 細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えてパルスを与えた。
エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ， ヒポキサンチン ： Ｔ， チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ-グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０〜１００ｍｇのキメラＣＤＨ３抗体を生産する細胞株を樹立できた。
実施例１２ 酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ抗体の定量
遺伝子導入したＣＨＯ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡＱＩ， Ｃａｔ Ａ-１１０ＵＤ）でコートした。ブロックした後、抗ＣＤＨ３キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧを用いた。
実施例１３ キメラ抗体の結合活性
実施例１０、１１に示した方法で表２に示した組み合わせのＣＤＲ配列を持つ抗体を作製し、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
反応対象となる各細胞株（ＣＨＯ細胞、ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３の高発現が確認されているＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株）を２ｍＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、精製したキメラ抗体を１０ｕｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で６０分間反応させた。ＦＡＣＳ溶液（１５０μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）４μｇ/ｍｌを加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。その結果、キメラ抗体はＣＤＨ３発現細胞株への強い反応性が認められた（図５）。
ＣＤＲ−Ｈ1、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ各抗体Ｈ鎖を、ＣＤＲ−Ｌ1、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ各抗体Ｌ鎖を構成するＣＤＲ配列を示す。
実施例１４ 薬剤の合成
ＤＭ１ＳＭｅ（図６）は、米国特許第５，２０８，０２０号および６，３３３，４１０Ｂ１号に以前に記載されたように調製した。
実施例１５ 薬剤結合抗体の調製
１．結合薬剤の還元処理
ＥｔＯＨ３００ｕＬで溶解した０．７８ｍｇのＤＭ１ＳＭｅと５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５)１８０ｕＬ、ＴＣＥＰ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）２０ｕＬを混合し、窒素雰囲気下、室温で３０分以上反応させ、薬剤を還元した。
還元薬剤はＨＰＬＣを使用して精製した後に溶媒留去後、１０ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
２．マレイミド化抗体の調製
１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤＨ３キメラ抗体にモル比３０倍過剰となる量のsulfo-SMCC(PIERCE社)を加え、３０℃、１時間反応させた。
過剰な架橋剤を除くため、50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理（ＺｅｂａＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、 サーモフィッシャーサイエンティフィック社)した。
３．薬剤による抗体の修飾
１ｍｇ／ｍＬのマレイミド化した抗ＣＤＨ３キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の１．７倍に相当する還元薬剤とを５０ｍＭリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)中で、室温にて一晩反応させた。その後、過剰な薬剤をゲルろ過操作により除いた。
実施例１６ 抗体薬剤結合量の定量
抗体当たりの薬剤結合数は、252nm及び280nmの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献（Widdison,W.C.,Wilhelm,S.D.,Cavanagh,E.E.,et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J.Med.Chem.,49,4392-4408）に記載の吸光係数εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1を利用した。
実施例１７ 細胞障害試験
薬剤結合抗体の細胞傷害性と特異性はWST-8を発色基質とした細胞増殖測定試薬(同仁化学研究所社,Cell counting assay kit-8)を使用して評価した。
即ち、ＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４と薬剤結合抗体（ＡＤＣ）あるいは薬剤を結合していない抗体（Ｎａｋｅｄ）を任意の量共存させ、３７度で３日間、、５%CO2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した（図７）。なお、図中に用いられた抗体は、抗体番号０６７−１７Ｃを使用し、ＡＤＣについては、実施例１６に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体１分子辺り４．０５個の薬剤が導入されていると見積もられた。
実施例１８ 細胞障害試験（抗体毎の比較）
取得した複数の抗ＣＤＨ３抗体を用いて薬剤結合抗体の細胞傷害性を評価した。
測定は、実施例１７に記載した方法に準じた。即ち、ヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４と薬剤結合抗体（ＡＤＣ）を共存させ、３７度で３日間、５%CO2環境下でインキュベートした。その際のＡＤＣ濃度は、０．０１ｕｇ／ｍＬとした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した。各抗体抗体１分子辺りの薬剤数は、実施例１６に記載した方法で見積もった（表３）。
陰性対照抗体は、ＨＣＣ１９５４と反応しないことが確認されている抗体が使用された。
実施例１９ 動物試験
薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロGM1抗体（WAKO 014-09801）を、大塚蒸留水1ｍＬで溶解後、大塚生理食塩水4mLを加えて全量５ｍＬとした後、この溶液を、マウス1匹あたり１００ｕＬ腹腔内投与。ＨＣＣ１９５４は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に５ｘ１０6個/マウスになるように移植した。
インビボ試験は各群５匹とし、15mg/ｋｇを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が100-150mm3となった時点で開始し、１週間後に更に同量、計２回行なった。
図中に用いられた抗体は、抗体番号０６７−１２Ｃ、０６７−２３Ｃ及び０６７−２７Ｃを使用し、ＡＤＣについては、実施例１６に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体１分子辺り３〜４個の薬剤が導入されていると見積もられた。
腫瘍サイズの推移を図８に示す。

Claims (13)

  1. ＣＤＨ３に対するモノクローナル抗体又はＣＤＨ３結合能を有するその断片とＤＭ１とをＮ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーで連結して成る免疫複合体。
  2. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号４８を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号５６を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号６５を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７５を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８２を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号８６を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  3. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５２を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号６０を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号７０を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７５を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８２を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号９１を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  4. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５４を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号６２を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号７２を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７４を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８１を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号９３を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  5. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５５を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号６３を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号７３を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号８０を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８５を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号９４を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  6. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号４９を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号６４を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号６６を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７６を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８４を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号８９を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  7. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号４９を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号５８を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号６８を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７９を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８２を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号９０を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  8. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５３を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号６１を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号７１を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７５を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８２を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号９２を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  9. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５１を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号５７を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号６７を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７８を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８３を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号８８を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  10. 前記抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１に配列番号５０を含み、ＣＤＲ−Ｈ２に配列番号５９を含み、ＣＤＲ−Ｈ３に配列番号６９を含み、ＣＤＲ−Ｌ１に配列番号７７を含み、ＣＤＲ−Ｌ２に配列番号８３を含み、ＣＤＲ−Ｌ３に配列番号８７を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  11. ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための請求項１から１０の何れか１項に記載の免疫複合体を含む、医薬組成物。
  12. 抗がん作用を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
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